ES2324462T3 - Metodo de deteccion de ligando. - Google Patents

Metodo de deteccion de ligando. Download PDF

Info

Publication number
ES2324462T3
ES2324462T3 ES01999671T ES01999671T ES2324462T3 ES 2324462 T3 ES2324462 T3 ES 2324462T3 ES 01999671 T ES01999671 T ES 01999671T ES 01999671 T ES01999671 T ES 01999671T ES 2324462 T3 ES2324462 T3 ES 2324462T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nucleic acid
sample
binding
ligand
receptors
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01999671T
Other languages
English (en)
Inventor
Frank Karlsen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Norchip AS
Original Assignee
Norchip AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Norchip AS filed Critical Norchip AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2324462T3 publication Critical patent/ES2324462T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un método para la detección de un ligando en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con reactivos capaces de formar un complejo reactivo, comprendiendo dicho complejo reactivo un receptor capaz de unirse específicamente a dicho ligando y a una molécula de ácido nucleico parcial o completamente monocatenaria; y (b) detectar cualquier complejo formado mediante la unión de la parte receptora de dicho complejo reactivo al ligando presente en la muestra, detectando específicamente la presencia de la molécula de ácido nucleico mediante la amplificación de una región del ácido nucleico usando una técnica de amplificación isotérmica y la detección de manera simultánea de los productos de la reacción de amplificación en tiempo real.

Description

Método de detección de ligando.
Campo de la invención
La invención se refiere a un método sensible para la detección específica de ligandos.
Antecedentes de la invención
La detección inmunológica es actualmente el método de elección para la detección de ligandos en el campo del diagnóstico. Sin embargo, los métodos de detección inmunológicos tradicionales, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), adolecen de una falta de sensibilidad y/o especificidad cuando se trata de la detección de ligandos presentes a una concentración muy baja. El ELISA convencional tiene una sensibilidad máxima de aproximadamente 10.000 células o copias de diana por unidad. Normalmente la sensibilidad no supera las 100.000 células o dianas. La concentración de proteínas mediante métodos inmunomagnéticos puede dar como resultado un aumento de la sensibilidad para detectar hasta una sola célula humana en estudios de investigación, pero esto se debe en gran medida al gran tamaño de las células humanas. La sensibilidad máxima para la detección de células bacterianas sigue siendo del orden de 1.000 células, incluso con el uso de métodos inmunomagnéticos de anticuerpos. Por lo tanto sigue habiendo una necesidad de métodos de detección inmunológica más sensibles.
El documento US 5.665.539 describe un método de "inmuno-reacción en cadena de la polimerasa" para la detección inmunológica. Este método se basa en el uso de un anticuerpo específico conjugado con una molécula de ADN bicatenaria. Los complejos formados por la unión del conjugado de anticuerpo a un antígeno se detectan amplificando primero una región del ADN bicatenario usando PCR y después detectando los productos de amplificación.
Los presentes inventores han desarrollado un método alternativo para la detección sensible de un antígeno (ligando) que se basa en la amplificación en tiempo real de un marcador de ácido nucleico. Este método combina la especificidad de las reacciones inmunológicas con la sensibilidad de la amplificación de ácidos nucleicos y puede usarse para la medición cuantitativa en tiempo real.
Descripción de la invención
En un primer aspecto la invención proporciona un método para la detección de un ligando en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de:
(a) poner en contacto la muestra con reactivos capaces de formar un complejo reactivo, comprendiendo dicho complejo reactivo un receptor capaz de unirse específicamente a dicho ligando y una molécula de ácido nucleico; y
(b) detectar cualquier complejo formado mediante la unión de la parte receptora de dicho complejo reactivo al ligando presente en la muestra, detectando específicamente la presencia de la molécula de ácido nucleico mediante la amplificación de una región del ácido nucleico y la detección de manera simultánea de los productos de la reacción de amplificación en tiempo real.
La invención se basa en la combinación de una reacción de unión específica de ligando/receptor y una etapa de detección que implica la detección de un marcador de ácido nucleico mediante la amplificación y la detección en tiempo real de los productos de amplificación. La primera parte del método de la invención es, por tanto, análoga a un ensayo de unión de ligando/receptor convencional, tal como, por ejemplo, un inmunoensayo.
El receptor puede ser esencialmente cualquier molécula que muestre especificidad de unión por el ligando en cuestión. Se prefieren particularmente anticuerpos, también fragmentos de anticuerpos, que conserven la especificidad de unión a antígeno, por ejemplo fragmentos F(ab')_{2}. Otros receptores adecuados incluyen enzimas, receptores de hormonas, lectinas, etc. Esta lista no pretende ser exhaustiva.
La molécula de ácido nucleico se usa como un marcador para permitir la detección de la unión específica de ligando/receptor. Más preferiblemente, el marcador de ácido nucleico es parcial o completamente monocatenario. El uso de un marcador de ácido nucleico proporciona ventajas significativas sobre marcadores más convencionales, tales como marcadores enzimáticos o fluorescentes, ya que la etapa de detección del ácido nucleico puede implicar una reacción de amplificación. La etapa de amplificación aumenta sustancialmente la sensibilidad del método de
detección.
El marcador de ácido nucleico es más preferiblemente un ADN monocatenario pero también pueden usarse marcadores de ARN monocatenarios. La invención también contempla el uso de análogos sintéticos de ARN y ADN, tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos que incorporan bases no naturales o derivatizadas y enlaces estructurales no naturales.
Es esencial que la molécula de ácido nucleico se una a la molécula receptora para que la cantidad de ácido nucleico presente pueda tomarse como un indicio de la cantidad de receptores unidos a ligando en la muestra. El ácido nucleico monocatenario puede unirse directamente al receptor pero más habitualmente se unirá indirectamente al receptor mediante una o más moléculas de unión. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico monocatenario puede unirse al receptor mediante un receptor secundario que se une específicamente al receptor de unión a ligando. Además, el ácido nucleico monocatenario puede unirse al receptor de unión a ligando o al receptor secundario mediante la conjugación con componentes de un par de unión biológico, tal como biotina/avidina o biotina/estreptavidina. El término "enlace" incluye por lo tanto el enlace mediante interacciones de unión.
En una realización, el receptor y la molécula de ácido nucleico monocatenaria pueden unirse para dar un complejo de reactivo en una etapa distinta, anterior al comienzo del procedimiento de detección. En una realización preferida, el ácido nucleico puede unirse al receptor de unión a ligando mediante la formación de un conjugado que comprende los receptores de unión a ligando, el ácido nucleico y una macromolécula de soporte. Las moléculas de soporte adecuadas incluyen polímeros solubles en agua, más preferiblemente polisacáridos naturales o sintéticos tales como, por ejemplo, dextranos. Se describen métodos adecuados para la unión de oligonucleótidos a macromoléculas de soporte en los documentos WO 98/22620 y US-A-6.207.385.
En una realización adicional el enlace entre el receptor y la molécula de ácido nucleico monocatenaria puede formarse durante el transcurso del procedimiento de detección mediante la formación de un "complejo reactivo" que contiene el receptor, ácido nucleico monocatenario y cualquier molécula de unión necesaria para unir el receptor con el ácido nucleico.
Los componentes que componen el complejo reactivo pueden añadirse de manera simultánea o secuencialmente durante el procedimiento de detección. Es bien conocido en el campo de los inmunoensayos que los reactivos pueden añadirse secuencialmente con lavados entre cada adición o simultáneamente con una etapa de lavado final para retirar los reactivos no unidos antes de la detección de la unión específica. La adición "simultánea" de reactivos no sólo incluye la adición de reactivos al mismo tiempo, sino también la situación en la que los reactivos se añaden uno tras otro pero sin etapas de lavado intermedias. La adición secuencial de reactivos con lavado entre cada adición puede proporcionar una mayor sensibilidad pero la adición simultánea de reactivos requiere menos manipulaciones y es por tanto más susceptible de automatización para aplicaciones de diagnóstico de alto rendimiento.
En una realización específica del método de la invención los receptores específicos para el ligando diana se añaden primero a la muestra a ensayar. Los receptores se conjugan con un primer componente de un par de unión biológico. La muestra se incuba para permitir la unión de receptor/ligando y después se lava para retirar los receptores no unidos. Después se añaden moléculas de ácido nucleico conjugadas con el segundo componente del par de unión biológico, la muestra se incuba para permitir que el ácido nucleico se una con el receptor mediante la unión del primer y segundo componente del par de unión biológico, después se lava para retirar el ácido nucleico no unido. Después se realiza la detección del ácido nucleico monocatenario. Un ejemplo de un par de unión biológico es biotina/avidina o biotina/estreptavidina. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico monocatenaria se conjugará con biotina y el receptor con avidina o estreptavidina. La etapa de lavado entre la adición de receptores y ácido nucleico puede suprimirse, o pueden añadirse al mismo tiempo los dos reactivos.
En otra realización específica, se añaden primero receptores específicos para el ligando diana a la muestra a ensayar. Después se incuba la muestra para permitir la unión de receptor/ligando y después se lava para retirar los receptores no unidos. Después se añaden a la muestra receptores secundarios capaces de unirse a los primeros receptores, estando unidos estos receptores secundarios a moléculas marcadoras de ácido nucleico monocatenario. Después se incuba la muestra para permitir la unión de los receptores secundarios a los primeros receptores y se lava para retirar los receptores secundarios no unidos. La detección del ácido nucleico se realiza después como se describe a continuación. Un ejemplo específico de esta realización es el uso de un anticuerpo como el primer receptor, es decir el receptor que se une específicamente al ligando, y un anticuerpo anti-isotipo como el receptor secundario. La etapa de lavado entre la adición de los receptores y receptores secundarios puede suprimirse, o pueden añadirse al mismo tiempo los dos reactivos.
En una variación de esta realización, las moléculas de ácido nucleico pueden unirse a los receptores secundarios usando la reacción entre un par de unión biológico. Por ejemplo, el receptor secundario puede conjugarse con avidina o estreptavidina y la molécula de ácido nucleico con biotina. La unión de los receptores secundarios a las moléculas de ácido nucleico mediante la unión de biotina/avidina o biotina/estreptavidina puede efectuarse después mediante la adición de los receptores secundarios y moléculas de ácido nucleico a la muestra del ensayo como reactivos separados, opcionalmente con una etapa de lavado entre la adición de los dos reactivos. De manera alternativa, los receptores secundarios pueden unirse a las moléculas de ácido nucleico en una etapa distinta y el reactivo unido añadirse a la muestra de ensayo.
En una realización específica adicional, primero se añaden receptores específicos para el ligando diana a la muestra a ensayar. Después se incuba la muestra para permitir la unión de receptor/ligando y después se lava para retirar los receptores no unidos. Después se añaden a la muestra receptores secundarios capaces de unirse a los primeros receptores, estando conjugados los receptores secundarios con la primera mitad de un par de unión biológico. Después, se incuba la muestra para permitir la unión de los receptores secundarios a los primeros receptores y se lava para retirar los receptores secundarios no unidos. Después la muestra se pone en contacto primero con moléculas de ácido nucleico que están conjugadas tanto con la primera mitad del par de unión biológico en un primer extremo de la cadena de ácido nucleico como con la segunda mitad del par de unión biológico en un segundo extremo de la cadena de ácido nucleico y, después, con moléculas de ácido nucleico conjugadas únicamente con la segunda mitad del par de unión biológico. Después de una etapa de lavado final, el ácido nucleico se detecta como se describe a continuación.
Un ejemplo específico de esta realización utiliza receptores secundarios conjugados con estreptavidina, un primer tipo de moléculas de ácido nucleico conjugadas con biotina en un extremo de la cadena de ácido nucleico y estreptavidina en el otro extremo de la cadena de ácido nucleico y un segundo tipo de moléculas de ácido nucleico conjugadas únicamente con biotina. Se prefiere añadir de manera secuencial los dos tipos de moléculas de ácido nucleico con una etapa de lavado intermedia, incluso si el resto de las adiciones de reactivos se realizan de manera simultánea, es decir sin etapas de lavado intermedias. En esta realización, el uso de los dos tipos de moléculas de ácido nucleico proporciona una ronda de amplificación adicional, como se ilustra en las Figuras adjuntas.
Varias de las realizaciones específicas enumeradas anteriormente utilizan un "par de unión biológico" para unir entre sí componentes del complejo reactivo. Los pares de unión biológicos adecuados incluyen biotina/avidina y biotina/estreptavidina. Se conocen bien en la técnica procedimientos para la conjugación de proteínas y ácidos nucleicos con biotina, estreptavidina y avidina. Además, están disponibles en el mercado varios conjugados útiles.
Los componentes del complejo reactivo también pueden unirse por medio de unión específica, siendo un ejemplo el uso de receptores secundarios que se unen directamente a receptores de unión a ligando. Los componentes también pueden unirse con el uso de moléculas enlazadoras bi-específicas. Un ejemplo de un enlazador bi-específico es una proteína quimérica recombinante de proteína A/estreptavidina, descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 5.328.985. Esta molécula quimérica es capaz de unirse tanto a un anticuerpo, mediante el dominio de proteína A, como a una molécula biotinilada, mediante el dominio de estreptavidina.
Una vez completada la parte de la reacción de unión del método, se detecta la presencia de complejos de ligando/receptor específicos mediante la detección de las moléculas marcadoras de ácido nucleico.
En una realización preferida, la detección del ácido nucleico se realiza amplificando una secuencia del ácido nucleico y detectando los productos de amplificación. Más preferiblemente, la amplificación se realiza usando una técnica de amplificación isotérmica.
La técnica de amplificación más preferida es la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (abreviada NASBA) pero pueden usarse otras técnicas de amplificación isotérmica tales como, por ejemplo, amplificación mediada por transcripción, amplificación mediada por señal de tecnología del ARN, reacción de amplificación de un promotor dividido, y amplificación isotérmica en fase de solución. La técnica de NASBA es bien conocida en la técnica, como se describe por Compton, J. Nature. 350: 91-92 (1991) y Davey et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.409.818). NASBA se usa generalmente con un marcador de ARN monocatenario y los productos de amplificación son ARN monocatenario. Sin embargo, en la presente invención la diana es, preferiblemente, ADN monocatenario que proporciona productos de amplificación ARN monocatenarios.
La NASBA es un procedimiento eficaz para generar grandes cantidades de ARN que corresponden a una secuencia de ácido nucleico diana in vitro, permitiendo la detección de secuencias diana que están presentes en muy bajas concentraciones en la muestra de ensayo original. El método NASBA se basa en el uso de un cebador que está modificado con una secuencia promotora, por ejemplo, un promotor T7. Se ha demostrado que la sensibilidad y especificidad de la amplificación por NASBA es la misma que para la PCR y mejor que la mayoría de protocolos de RT-PCR.
En una realización más preferida, la detección del ácido nucleico se realiza por amplificación de una región del ácido nucleico y detección en tiempo real de los productos de amplificación. Más preferiblemente, la detección del ácido nucleico se realizará por NASBA en tiempo real. La reacción de NASBA da como resultado la generación de productos de amplificación, siendo el principal producto de amplificación ARN monocatenario antisentido que corresponde a una región del ácido nucleico diana. La NASBA en tiempo real implica la detección de los productos de amplificación al mismo tiempo que la amplificación de diana. Esto es posible con el uso de la tecnología de "sondas fluorescentes" en combinación con la amplificación por NASBA convencional, como se describe por Leone et al., Nucleic Acids Research. 26: 2150-2155 (1998).
Una combinación de una reacción de amplificación isotérmica con detección en tiempo real de los productos de amplificación proporciona una enorme sensibilidad. Esta sensibilidad mejorada permite, por ejemplo, la realización de la detección in situ de niveles muy bajos de analitos diana, por ejemplo, proteínas o anticuerpos. Además, es posible realizar una detección cuantitativa precisa directamente, incluso de niveles muy bajos del analito diana.
Se apreciará que la naturaleza exacta de la molécula marcadora de ácido nucleico, es decir, su secuencia, no es pertinente a la invención. Si se va a usar la NASBA para la detección de un marcador de ARN monocatenario generalmente es preferible evitar secuencias de ARN que conducirían a la formación de una amplia estructura secundaria que puede interferir con la eficacia de la reacción de amplificación.
El método de la invención tiene una ventaja principal sobre la técnica de inmuno-PCR previamente conocida en el sentido de que es posible realizar una amplificación sustancialmente isotérmica de ácidos nucleicos monocatenarios, por ejemplo, usando la reacción de NASBA, y que no es necesario calentar a altas temperaturas de \sim 95ºC durante la reacción de amplificación. Las altas temperaturas necesarias para la desnaturalización del ADN bicatenario en la etapa de desnaturalización del ciclo de PCR son una desventaja cuando se trata de la detección por inmuno-PCR de antígenos inmovilizados, ya que las altas temperaturas pueden conducir a la degradación del antígeno y/o del anticuerpo usado en la detección inmunológica. Este problema se evita mediante la detección de una diana de ácido nucleico monocatenario mediante una reacción de NASBA isotérmica.
El método de la invención encuentra utilidad en el campo de la detección inmunológica, especialmente en el campo del diagnóstico. En particular, el método puede adaptarse para realizar un inmunoensayo análogo a un ensayo de ELISA de tipo sándwich convencional. Un ELISA de tipo sándwich generalmente requiere dos anticuerpos que están dirigidos contra un antígeno en particular. Un anticuerpo se adsorbe de manera pasiva (se recubre) sobre la superficie de los pocillos de una placa de ensayo de microtitulación. Después se bloquean los pocillos con un agente de bloqueo inespecífico para reducir la unión inespecífica de fondo de los reactivos de ensayo. Después se añaden a los pocillos muestras de ensayo que se sospecha que contienen el antígeno (ligando) deseado y se incuban durante un tiempo suficiente para permitir que el antígeno se una al anticuerpo inmovilizado en la superficie de la placa. Después de lavar para retirar los reactivos no unidos se añade a los pocillos un segundo anticuerpo (receptor). Este segundo anticuerpo se une al antígeno inmovilizado completando el sándwich. Después, se realiza la unión del segundo anticuerpo (el receptor) al antígeno (el ligando) usando el método de la invención, es decir, mediante la formación de un complejo reactivo que une el segundo anticuerpo (receptor) a un ácido nucleico que se detecta después en la etapa de detección del ensayo.
En otros tipos de ELISA la muestra de ensayo puede añadirse directamente a los pocillos de la placa de microtitulación e incubarse para permitir que el antígeno (ligando) presente en la muestra se una a la superficie de los pocillos. Este tipo de ensayo es similar al ensayo de tipo sándwich pero no requiere el primer anticuerpo, en lugar de ello el antígeno se recubre directamente sobre en la superficie de la placa de microtitulación.
La "muestra de ensayo" a ensayar para determinar la presencia de un ligando en particular puede ser básicamente cualquier material que se desee ensayar para determinar la presencia de un ligando. Puede ser una muestra de fluido, tal como una muestra clínica, un fluido ambiental, etc. Por ejemplo, en el campo del diagnóstico la muestra de ensayo puede comprender fluidos corporales tales como sangre completa, suero, plasma, linfa, lágrimas, orina, etc. La muestra de ensayo también puede ser una muestra sólida tal como, por ejemplo, una sección de tejido, células fijadas o un frotis celular, como se trata más adelante. La naturaleza exacta de la muestra de ensayo no es pertinente a la invención.
El método de la invención también puede adaptarse para el uso en inmunohistoquímica, por ejemplo, la detección de un ligando in situ en una muestra de tejido fijado y seccionado, y la palabra "muestra" como se usa en las reivindicaciones ha de interpretarse, por consiguiente, que incorpora muestras y secciones de tejidos, células fijadas, frotis celulares, etc. Cuando el método de la invención se usa para la detección de ligandos in situ en una muestra de tejido se prefiere usar la amplificación por NASBA para la detección de la molécula marcadora de ácido nucleico, más preferiblemente un marcador de ARN monocatenario. Los objetivos principales del análisis in situ son determinar la localización del antígeno, proteger y no degradar la diana y mantener la morfología del tejido. El uso de inmuno-PCR para detectar antígenos in situ puede dar como resultado la degradación del antígeno o del anticuerpo usados en el ensayo y daños en la morfología subyacente del tejido debido a la necesidad de incluir una etapa de temperatura elevada en el ciclo de reacción de PCR. El uso de NASBA para detectar un marcador de ARN de acuerdo con el método de la invención evita estos problemas ya que la NASBA es una técnica de amplificación básicamente isotérmica y puede realizarse a una temperatura constante de aproximadamente 42ºC (Davey et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.409.818). De esta manera no son necesarias etapas de desnaturalización de elevada temperatura.
Un ejemplo específico de la aplicación del método de la invención para la detección del antígeno in situ es en la detección de diferentes niveles de la proteína supresora de tumores p53 en el carcinoma ovárico como un marcador de pronóstico. Usando un anticuerpo monoclonal altamente específico contra el antígeno p53 localizado in situ en una sección de tejido tumoral en combinación con un anticuerpo secundario marcado con estreptavidina unido a un marcador de ácido nucleico marcado con biotina, tal como un marcador de ADN o ARN, puede ser posible detectar cambios en el nivel de expresión de p53 por debajo de 10 proteínas. La detección del marcador de ácido nucleico unido al anticuerpo secundario (mediante la unión de biotina/estreptavidina) se lleva a cabo preferiblemente realizando una NASBA usando un par de cebadores ideales y una sonda fluorescente ideal. La señal fluorescente de la sonda fluorescente unida puede detectarse usando un microscopio fluorescente normal equipado con una cámara CCD y un programa informático.
Ahora se describirán realizaciones de la presente invención, únicamente a modo de ejemplo, con relación a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 es una representación esquemática de conjugados usados en reacciones de detección de ligandos de acuerdo con la invención.
La Figura 2 es una representación esquemática de ejemplos de diferentes enlazadores (avidina/biotina, estreptavidina/biotina, dextrano o conjugación directa mediante enlaces químicos) que pueden usarse como un puente entre el segundo receptor y el oligonucleótido. Después se amplifica el oligonucleótido monocatenario mediante NASBA utilizando cebadores y sondas fluorescentes para la detección en tiempo real como se indica más detalladamente en los siguientes ejemplos.
La Figura 3 es una representación esquemática de diversos conjugados que incluyen diferentes enlazadores que pueden utilizarse en reacciones de detección de ligandos de acuerdo con la invención.
La Figura 4 es una ilustración general de la reacción de detección de ligandos utilizando amplificación por NASBA y tecnología de sondas fluorescentes de acuerdo con la invención.
En la reacción de detección de ligandos general descrita e ilustrada en las Figuras, el ligando diana (antígeno) inmovilizado en una superficie sólida se une mediante un primer anticuerpo que tiene especificidad por el antígeno. Un segundo anticuerpo que tiene especificidad por el primer anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-isotipo) se une después al primer anticuerpo. El segundo anticuerpo se conjuga con el oligonucleótido de ADN monocatenario mediante uno de varios enlazadores diferentes, como se indica en las Figuras 2 y 3. Después se amplifica el oligonucleótido de ADN monocatenario mediante NASBA utilizando cebadores y sondas fluorescentes para la detección en tiempo real como se muestra en la Figura 4 y se indica más detalladamente en los siguientes ejemplos.
La invención se entenderá adicionalmente con relación a los siguientes ejemplos experimentales:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Inmuno-amplificación por NASBA en tiempo real Materiales y reactivos
Microplacas: Greiner nº 650161, 96 pocillos, fondo en U
Microtubos: MCT-150-C 1,5 ml transparentes (Axygen Scientific nº 311-08-051)
Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato (PBS): 0,01 M pH 7,4 (Sigma P-4417)
Solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST): 0,01 M pH 7,4 (Sigma P-3563)
Tampón de bloqueo: Albúmina de Suero Bovino (BSA) 0,25 mg/ml en PBS (Sigma B-6917)
Tampón de Dilución de Anticuerpos: PBS 0,01 M
Anticuerpo Primario (1): de cabra anti-Salmonella (Europa Bioproducts Ltd., CR7100GAP)
10 \mug/ml en PBS
Cultivo de bacterias (antígeno):
Salmonella cholerasuis subs. cholerasuis
Diluido 1:100; 1:100 y 1:10.000 en PBS
DSM nº 4883 (DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
Anticuerpo Primario (2): de conejo anti-Salmonella
(Europa Bioproducts Ltd., CR7100RP)
1 \mug/ml en PBS
Anticuerpo Secundario (ELISA): Conjugado de cabra anti-conejo con fosfatasa alcalina (AP) (Zymed Laboratories Inc., 81-6122)
1:2000 en PBS
PNPP (100X)-Sustrato para Fosfatasa Alc.:
(Zymed Laboratories Inc., 00-2201)
Diluido 1:100 en Tampón de Sustrato (10X) para PNPP
Tampón de Sustrato (10X) para PNPP:
(Zymed Laboratories Inc., 00-2208)
Diluido 1:10 con agua destilada
Conjugado IMRAMP:
Estructura de dextrano con IgG de cabra anti-conejo y oligonucleótido sintético (véase a continuación para la especificación de secuencia). Se han usado dos oligonucleótidos diferentes en el protocolo (Immb5 e Imkort).
Tampón de Dilución Conjugado IMRAMP: Tris/HCl 0,1 M pH 7,2
Reactivos de Aislamiento Automatizado:
Nuclisens Nasba Diagnostics nº 84044 (Organon Teknika)
Partículas de sílice
Tampón de lisis (pH normal)
Oligonucleótido sintético, (MWG Biotech AG) Secuencias:
1
Kit básico (Reacciones de amplificación):
Nuclisens Nasba Diagnostics nº 84121 (Organon Teknika)
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolos Placas de recubrimiento
1. Recubrir los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos con 100 \mul de anticuerpo primario 10 \mug/ml (1). Incubar durante una noche a 41ºC.
2. Desechar los anticuerpos primarios no recubiertos (1); lavar los pocillos recubiertos al menos tres veces con PBST y una vez con PBS.
3. Bloquear los sitios activos restantes incubando la placa con 200 \mul de BSA 0,25 mg/ml durante dos horas a 20ºC.
4. Desechar el BSA no bloqueado; lavar los pocillos recubiertos al menos tres veces con PBST y una vez con PBS.
Ahora la microplaca está lista para usarse en ELISA o amplificaciones IMRAMP, como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
ELISA de tipo sándwich (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas) (Funciona como un control en las etapas 1-8 en IMRAMP)
5. Añadir a los pocillos 70 \mul de la concentración apropiada de un cultivo reciente de Salmonella. Incubar 1 hora a 20ºC con agitación (40 rev/min).
6. Desechar las bacterias no unidas; lavar los pocillos recubiertos al menos tres veces con PBST y una vez con PBS.
7. Preparar una dilución apropiada de anticuerpo primario (2) en PBS. Añadir 70 \mul a los pocillos e incubar durante 1 hora a 20ºC con agitación (40 rev/min).
8. Desechar el anticuerpo primario no unido (2); lavar los pocillos recubiertos al menos tres veces con PBST y una vez con PBS.
9. Preparar la dilución apropiada del conjugado de anticuerpo secundario con fosfatasa alcalina (AP). Añadir 70 \mul a los pocillos e incubar durante 1 hora a 20ºC con agitación (40 rev/min).
10. Desechar el anticuerpo secundario no unido; lavar los pocillos recubiertos al menos tres veces con PBST y una vez con PBS.
11. Preparar el sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) para la fosfatasa alcalina (AP) en tampón de sustrato PNPP (10X).
12. En las muestras positivas se produce un desarrollo de color amarillo. Las muestras negativas aparecen transparentes/no muestran desarrollo de color.
\vskip1.000000\baselineskip
Inmuno-Amplificación en Tiempo Real (IMRAMP)
5. Añadir 70 \mul de la concentración apropiada de un cultivo reciente de Salmonella a los pocillos. Incubar 1 hora a 20ºC con agitación.
6. Desechar las bacterias no unidas; lavar los pocillos recubiertos al menos tres veces con PBST y una vez con PBS.
7. Preparar la dilución apropiada de anticuerpo primario (2) en PBS. Añadir 70 \mul a los pocillos e incubar durante 1 hora a 20ºC con agitación (40 rev/min).
8. Desechar el anticuerpo primario (2) no unido; lavar los pocillos recubiertos al menos tres veces con PBST y una vez con PBS.
9. Preparar la dilución apropiada de conjugado de IMRAMP en Tris/HCl, (descripción del conjugado proporcionada anteriormente). Añadir 70 \mul a los pocillos e incubar durante 1 hora a 20ºC con agitación (40 rev/min).
10. Desechar el conjugado de IMRAMP no unido; lavar los pocillos recubiertos al menos tres veces con PBST y una vez con PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ahora la microplaca está lista para usarse en la aplicación (A) o (B), como se describen a continuación:
(A) IMRAMP con amplificación por NASBA y Detección de Sondas Fluorescentes Molecular Beacon (Figura 4)
1. Preparar la mezcla madre: Seguir las instrucciones del kit de amplificación Nuclisens.
Añadir las siguientes soluciones a la mezcla madre:
2,5 \mul de sondas fluorescentes (Pmb2) 20 \muM contra el oligonucleótido sintético.
5 \mul de un cebador 1 de Nasba 10 \muM contra el oligonucleótido sintético.
5 \mul de un cebador 2 de Nasba 10 \muM contra el oligonucleótido sintético
60 \mul de solución de enzimas (ARN polimerasa; ARNasa H; Transcriptasa Inversa).
2. Añadir 20 \mul de PBS a los pocillos
3. Añadir 15 \mul de mezcla madre a los pocillos (véase anteriormente)
4. Añadir ARNsin al pocillo a una concentración final: 1U/microlitro
5. Dejar que se desarrolle la amplificación y la detección a 41ºC en un lector de placas por fluorescencia BIO-TEK FL600 durante 2 horas.
Configuración del lector de placas:
Sensibilidad: 75
Excitación: 485/40
Emisión: 530/25
\vskip1.000000\baselineskip
(B) IMRAMP con extracción: Amplificación por NASBA y Detección de Sondas Fluorescentes
1. Añadir 100 \mul de tampón de lisis a los pocillos e incubar durante 20 min a 37ºC.
2. Transferir todo el material de los pocillos a tubos separados que contienen 0,9 ml de tampón de lisis. Incubar 10 min a 37ºC.
3. Añadir 50 \mul de partículas de sílice a cada tubo e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Mezclar los tubos cada 2 minutos.
4. Desechar todo el material del tubo en un cartucho distinto para usar en el Extractor Nuclisens.
5. Seguir el manual para el método: "Extracción de 1 ml de plasma".
6. Se usarán 5 \mul de extracto en el método de amplificación por NASBA (descrito en A).
Nota:
El tampón de lisis se añade a los pocillos después de la incubación con el conjugado de IMRAMP y antes del método de extracción habitual (Nuclisens).
Probablemente el tampón de lisis destruye la estructura de dextrano, y por tanto reduce posibles impedimentos estéricos para la ARN polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Amplificación de oligonucleótidos en conjugados que contienen una estructura de dextrano con ADNmc y anticuerpo usando diferentes tamaños de dextrano
Se prepararon los siguientes conjugados:
2 
\newpage
Amplificación
Mezcla madre:
esferas de reactivo 2x
\quad
160 \mul de diluyente
\quad
27 de agua para nasba
\quad
28 de KCl
\quad
120 de enzima 
\hskip1cm
se divide en 2 y se añade:
1)
2,5 de Pnasba2, (cebador 2 de NASBA) 10 \muM
\quad
2,5 de Immkort 0,1 \muM (usado como cebador 1 de NASBA)
\quad
1,25 de Pmb2ny, (sonda fluorescente) 20 \muM
2)
15 \mul de mezcla de cebadores P nasba 1 + P nasba 2, 10 \muM
Se cargaron 15 \mul de la mezcla madre en cada pocillo. Se añadieron las muestras y conjugados y se detectaron los productos en un lector de placas por fluorescencia BIO-TEK FL 6000.
Los resultados (no mostrados) indican que los dextranos de menor peso molecular son los más apropiados para la detección por NASBA
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Extracción y amplificación de conjugados
Extracción de muestras:
Se añadieron 100 \mul de conjugado a 900 \mul de tampón de lisis (NucliSens, pH normal)
Se incubó en un baño de agua durante 10 minutos a 37ºC.
Se añadió conjugado en tampón de lisis a 50 \mul de sílice y se incubó durante 10 minutos invirtiendo los tubos cada 2 minutos.
Se cargaron las muestras sobre el extractor Nuclisens y se extrajo el ARN/ADN usando métodos convencionales.
Resultados de la amplificación por NASBA
3
Los resultados de la amplificación (no mostrados) indican que puede conseguirse una amplificación con éxito usando conjugados con dextrano extraídos. Los conjugados que contienen EDTA, ARNsin y DMSO son los más apropiados para la amplificación por NASBA en IMRAMP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Amplificación con/sin ARNsin
Amplificación del oligonucleótido, Psek2 y del conjugado F320401.
F320401 consiste en Immb3 (oligonucleótido), dextrano y GAR (anticuerpo).
Mezcla madre:
1 Esfera de reactivo
80 \mul de diluyente de esfera de reactivo
13,5 \mul de agua para nasba
14 \mul de KCl
5 \mul de cebador Pnasba 1
5 \mul de cebador Pnasba 2
2,5 \mul de Pmb2 (sonda fluorescente)
60 \mul de enzima
Se dividió la mezcla madre en dos mitades. A una mitad se le añadió ARNsin con una concentración final de 1 U/\mul.
Se cargaron 15 \mul de la mezcla madre en cada pocillo y se añadieron 5 \mul.
Muestras:
1)
Psek2 (1:100)
2)
Psek2 (1:10.000) mezcla madre sin ARNsin
3)
F320401
4)
Psek2 (1:100)
5)
Psek2 (1:10.000) mezcla madre con ARNsin
6)
F320401
Los resultados (no mostrados) indican que el ARNsin promueve la amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Amplificación con/sin calentamiento
Amplificación del oligonucleótido artificial, Psek2 y de los conjugados, F620301 y F650301-2.
F620301 consiste en Immb5 (oligonucleótido) en dextrano.
F650301-2 consiste en Immb5 en dextrano y GAR (anticuerpo).
Los conjugados se disolvieron en Tris/HCl y NaCl.
Mezcla madre:
2 esferas de reactivo
160 \mul de diluyente de esfera de reactivo
27 \mul de agua para nasba
28 \mul de KCl
10 \mul de cebador 1 de nasba: Pnasba1
10 \mul de cebador 2 de nasba: Pnasba2
5 \mul de sondas fluorescentes: Pmb2
En cada uno de 20 pocillos se cargaron 10 \mul de la mezcla madre y se añadieron 5 \mul de muestra: oligonucleótido o conjugado en dos grupos. En el grupo 1 la enzima se añadió directamente (sin precalentamiento). En el grupo 2, la mezcla madre se precalentó a 65ºC durante 4 minutos y se enfrió hasta 41º antes de añadir la enzima. Se amplificaron ambos grupos de muestras y se detectaron a 41ºC durante 2 horas.
Los resultados (no se muestran) confirmaron que la amplificación por NASBA del oligonucleótido artificial se realiza mejor sin precalentamiento de la mezcla madre.

Claims (14)

1. Un método para la detección de un ligando en una muestra, comprendiendo dicho método las etapas de:
(a) poner en contacto la muestra con reactivos capaces de formar un complejo reactivo, comprendiendo dicho complejo reactivo un receptor capaz de unirse específicamente a dicho ligando y a una molécula de ácido nucleico parcial o completamente monocatenaria; y
(b) detectar cualquier complejo formado mediante la unión de la parte receptora de dicho complejo reactivo al ligando presente en la muestra, detectando específicamente la presencia de la molécula de ácido nucleico mediante la amplificación de una región del ácido nucleico usando una técnica de amplificación isotérmica y la detección de manera simultánea de los productos de la reacción de amplificación en tiempo real.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende la amplificación de una región del ácido nucleico usando una amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA).
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la etapa (a) comprende poner en contacto la muestra con receptores capaces de unirse a dicho ligando, estando dichos receptores unidos a moléculas de ácido nucleico.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la etapa (a) comprende las etapas secuenciales o simultáneas de:
(i) poner en contacto la muestra con receptores capaces de unirse a dicho ligando, estando dichos receptores conjugados con un primer componente de un par de unión biológico; y
(ii) poner en contacto la muestra con moléculas de ácido nucleico conjugadas con un segundo componente de un par de unión biológico.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la etapa (a) comprende las etapas secuenciales o simultáneas de:
(i) poner en contacto la muestra con receptores capaces de unirse a dicho ligando; y
(ii) poner en contacto la muestra con receptores secundarios capaces de unirse a los receptores de la parte (i), estando unidos dichos receptores secundarios a moléculas de ácido nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la etapa (a) comprende las etapas secuenciales o simultáneas de:
(i) poner en contacto la muestra con receptores capaces de unirse a dicho ligando;
(ii) poner en contacto la muestra con receptores secundarios capaces de unirse a los receptores de la parte (i), estando conjugados dichos receptores secundarios con un primer miembro de un par de unión biológico; y
(iii) poner en contacto la muestra con moléculas de ácido nucleico monocatenario conjugadas con un segundo miembro de un par de unión biológico.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la etapa (a) comprende las etapas secuenciales o simultáneas de:
(i) poner en contacto la muestra con receptores capaces de unirse a dicho ligando;
(ii) poner en contacto la muestra con receptores secundarios capaces de unirse a los receptores de la parte (i), estando conjugados dichos receptores secundarios con un primer miembro de un par de unión biológico; y
(iii) poner en contacto la muestra con moléculas de ácido nucleico conjugadas con un primer miembro de un par de unión biológico en un extremo y con un segundo miembro de un par de unión biológico en el otro extremo de la cadena del ácido nucleico; y
(iv) poner en contacto la muestra con moléculas de ácido nucleico conjugadas únicamente con un segundo miembro del par de unión biológico.
\newpage
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 5, 6 ó 7 en el que el primer y segundo componentes del par de unión biológico son estreptavidina o avidina y biotina o viceversa.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho receptor secundario está unido a dichas moléculas de ácido nucleico mediante un enlace químico directo.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la etapa (a) comprende la adición de un complejo reactivo que es un conjugado que comprende receptores capaces de unirse al ligando, moléculas de ácido nucleico y una macromolécula de soporte.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la macromolécula de soporte es un dextrano.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que los receptores capaces de unirse a dicho ligando son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo.
13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el ácido nucleico es parcial o completamente monocatenario.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el ácido nucleico es un ADN o ARN monocatenario.
ES01999671T 2000-12-05 2001-12-05 Metodo de deteccion de ligando. Expired - Lifetime ES2324462T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0029617 2000-12-05
GBGB0029617.8A GB0029617D0 (en) 2000-12-05 2000-12-05 Ligand detection method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2324462T3 true ES2324462T3 (es) 2009-08-07

Family

ID=9904463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01999671T Expired - Lifetime ES2324462T3 (es) 2000-12-05 2001-12-05 Metodo de deteccion de ligando.

Country Status (14)

Country Link
US (1) US7910294B2 (es)
EP (1) EP1364057B1 (es)
JP (1) JP4266634B2 (es)
AR (1) AR031631A1 (es)
AT (1) ATE429510T1 (es)
AU (1) AU2002220898A1 (es)
CA (1) CA2437043C (es)
CY (1) CY1109246T1 (es)
DE (1) DE60138486D1 (es)
DK (1) DK1364057T3 (es)
ES (1) ES2324462T3 (es)
GB (2) GB0029617D0 (es)
PT (1) PT1364057E (es)
WO (1) WO2002046464A2 (es)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2286750T3 (es) * 1998-05-01 2007-12-01 Gen-Probe Incorporated Dispositivo para agitar el contenido liquido de un contenedor.
US8337753B2 (en) 1998-05-01 2012-12-25 Gen-Probe Incorporated Temperature-controlled incubator having a receptacle mixing mechanism
EP1602733A1 (en) * 2004-06-02 2005-12-07 Keygene N.V. Detection of target nucleotide sequences using an asymmetric oligonucleotide ligation assay
US8808991B2 (en) 2003-09-02 2014-08-19 Keygene N.V. Ola-based methods for the detection of target nucleic avid sequences
US20060199194A1 (en) * 2003-11-10 2006-09-07 Q-Rna, Inc. Methods of detection using immuno-Q-Amp technology
US20050214805A1 (en) * 2003-11-10 2005-09-29 Q-Rna, Inc. Methods of detection employing immuno-Q-Amp technology
JP4949038B2 (ja) * 2003-12-01 2012-06-06 ダコ デンマーク アクティーゼルスカブ 免疫組織化学的検出のための方法および組成物
US7964413B2 (en) 2005-03-10 2011-06-21 Gen-Probe Incorporated Method for continuous mode processing of multiple reaction receptacles in a real-time amplification assay
EP1930730B1 (en) * 2005-03-10 2019-08-14 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes
DE102008062372B3 (de) * 2008-12-17 2010-06-17 Medizinische Hochschule Hannover Nachweiskonjugat und Verfahren zur Analyse
EP2752668A3 (en) 2010-07-23 2014-10-15 Beckman Coulter, Inc. System Or Method Of Including Analytical Units
US9046507B2 (en) 2010-07-29 2015-06-02 Gen-Probe Incorporated Method, system and apparatus for incorporating capacitive proximity sensing in an automated fluid transfer procedure
AU2012222178B2 (en) 2011-02-24 2014-12-18 Gen-Probe Incorporated Systems and methods for distinguishing optical signals of different modulation frequencies in an optical signal detector
CN104040357B (zh) 2011-11-07 2016-11-23 贝克曼考尔特公司 等分器系统以及工作流
ES2778054T3 (es) 2011-11-07 2020-08-07 Beckman Coulter Inc Sistema y método para transportar recipientes de muestras
KR20140091032A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 수송 시스템의 자기 감쇠
US9446418B2 (en) 2011-11-07 2016-09-20 Beckman Coulter, Inc. Robotic arm
KR20140091033A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 컨테이너 검출
WO2013070755A2 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Beckman Coulter, Inc. Centrifuge system and workflow
AU2013334189B2 (en) 2012-10-24 2018-08-02 Genmark Diagnostics, Inc. Integrated multiplex target analysis
US20140322706A1 (en) 2012-10-24 2014-10-30 Jon Faiz Kayyem Integrated multipelx target analysis
EP3964839B1 (en) 2013-03-15 2024-04-10 Abbott Laboratories Automated diagnostic analyzers having rear accessible track systems and related methods
CN109358202B (zh) 2013-03-15 2023-04-07 雅培制药有限公司 具有竖直布置的圆盘传送带的自动化诊断分析仪及相关方法
JP6351702B2 (ja) 2013-03-15 2018-07-04 ジェンマーク ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 変形可能流体容器を操作するためのシステム、方法、および装置
CN105190317B (zh) 2013-03-15 2018-05-04 雅培制药有限公司 具有预处理转盘的诊断分析机及相关方法
US9498778B2 (en) 2014-11-11 2016-11-22 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
USD881409S1 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Genmark Diagnostics, Inc. Biochip cartridge
US10005080B2 (en) 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
US9598722B2 (en) 2014-11-11 2017-03-21 Genmark Diagnostics, Inc. Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
CN106932590A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 复旦大学 一种定量检测低丰度蛋白及其后修饰蛋白的方法
US10427162B2 (en) 2016-12-21 2019-10-01 Quandx Inc. Systems and methods for molecular diagnostics
WO2019200326A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Rarecyte, Inc. Kits for labeling of biomarkers and methods of using the same
US20230138285A1 (en) * 2021-11-04 2023-05-04 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Bright and releasable labels for cell staining based on the conjugates with several sites of fluorophore release

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5656731A (en) * 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
US6083689A (en) 1990-10-16 2000-07-04 Bayer Corporation Sensitive immunoassays utilizing antibody conjugates with replicable DNA templates
DK0594772T3 (es) * 1991-07-04 1997-02-24 Immunodex K S
US5665539A (en) * 1991-07-12 1997-09-09 The Regents Of The University Of California Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection
WO1994026932A1 (en) * 1993-05-13 1994-11-24 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nucleic acid tagged immunoassay
WO1995008626A1 (en) * 1993-09-20 1995-03-30 The Regents Of The University Of Colorado Strategy for the production of rna from immobilized templates
DE69519783T2 (de) * 1994-04-29 2001-06-07 Perkin-Elmer Corp., Foster City Verfahren und vorrichtung zur echtzeiterfassung der produkte von nukleinsäureamplifikation
US5854033A (en) * 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
WO1997032044A1 (en) * 1996-03-01 1997-09-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company A method for the amplification and detection of a nucleic acid fragment of interest
US6117631A (en) * 1996-10-29 2000-09-12 Polyprobe, Inc. Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates
WO1998020148A1 (en) * 1996-11-04 1998-05-14 The Regents Of The University Of California Method for detection of pathogens in food
US6255060B1 (en) * 1996-11-21 2001-07-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of detecting protein by immuno RNA
US5922553A (en) * 1996-11-21 1999-07-13 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of detecting protein by immuno RNA
AT407160B (de) * 1998-06-04 2001-01-25 Immuno Ag Verfahren zur bestimmung von antigenen
DE19915141C2 (de) * 1999-03-26 2002-11-21 Artus Ges Fuer Molekularbiolog Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten
DE60028233T2 (de) * 1999-10-27 2007-03-08 Universite De Liege Immuno-real-time-pcr unter verwendung einer chimären dna als amplifikationsmarker

Also Published As

Publication number Publication date
PT1364057E (pt) 2009-07-06
AR031631A1 (es) 2003-09-24
CA2437043C (en) 2011-10-11
DE60138486D1 (de) 2009-06-04
EP1364057B1 (en) 2009-04-22
JP4266634B2 (ja) 2009-05-20
ATE429510T1 (de) 2009-05-15
US20040076983A1 (en) 2004-04-22
WO2002046464A3 (en) 2003-09-12
DK1364057T3 (da) 2009-08-03
US7910294B2 (en) 2011-03-22
GB2375822A (en) 2002-11-27
GB0029617D0 (en) 2001-01-17
WO2002046464A2 (en) 2002-06-13
EP1364057A2 (en) 2003-11-26
GB0129143D0 (en) 2002-01-23
CA2437043A1 (en) 2002-06-13
CY1109246T1 (el) 2014-07-02
AU2002220898A1 (en) 2002-06-18
GB2375822B (en) 2005-04-06
JP2004520574A (ja) 2004-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2324462T3 (es) Metodo de deteccion de ligando.
ES2424269T3 (es) Inmuno-PCR sándwich por desplazamiento
JP5188808B2 (ja) 同種の分析物検出
ES2434958T3 (es) Método para detectar cáncer ginecológico
JP2025133108A5 (es)
EP0163220B1 (en) Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies
EP0528870B1 (en) Protein-nucleic acid probes and immunoassays using same
US9255142B2 (en) Blood markers for diagnosing epithelium derived cancers and monoclonal antibodies thereof
US20080020391A1 (en) Lateral flow methods and devices for detection of nucleic acid binding proteins
CN101988920A (zh) 抗原检测试剂盒和方法
KR102601323B1 (ko) 페길화 분석물-특이적 결합제를 사용하는 입자-기반 면역어세이
CN103154266A (zh) 阻断试剂及其使用方法
CN113528611A (zh) 一种蛋白检测试剂盒及检测方法
EP1552008A4 (en) MICROPARTICLE-BASED SIGNAL AMPLIFICATION FOR ANALYTE DETECTION
WO2001012840B1 (en) Anti-epha2 antibodies as a cancer diagnostic
CN113195722B (zh) 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途
KR102885598B1 (ko) 세균성 질염 진단법
ES2244477T3 (es) Deteccion de la isoenzima de la piruvato cinasa en las heces.
JPH05149949A (ja) 新規な微量物質測定法
EP2189539B1 (en) Conjugate complexes for analyte detection
AU773046B2 (en) Test system for detecting different markers, and production and use thereof
CN113624724A (zh) 一种适配体分子信标对靶分子的多元检测分析方法
ES2291857T3 (es) Uso de un virus que expresa un fragmento de union para medir analitos en una muestra.
JP2006518469A (ja) 代替抗体の集合を用いてスクリーニングするための組成物及び方法
JP2020506386A (ja) 少なくとも２種のペグ化された分析物特異的結合剤を使用する免疫アッセイ