JPH05149949A - 新規な微量物質測定法 - Google Patents
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- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、検体中の検出すべき微量物質をこの物質と特
異的結合性を示す物質と反応させ、この特異的結合性物
質は核酸によって標識されており、この標識核酸をＤＮ
ＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅
し、増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡ量から検体中の微量
物質を検出・定量することからなる高感度検出法に関す
る。
異的結合性を示す物質と反応させ、この特異的結合性物
質は核酸によって標識されており、この標識核酸をＤＮ
ＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅
し、増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡ量から検体中の微量
物質を検出・定量することからなる高感度検出法に関す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細菌、ウイルス、寄生
虫等の感染疾患の診断、自己免疫疾患等の診断、組織適
合抗原の検出、ホルモンの検出、ホルモン異常の診断、
癌診断、食品中の細菌毒素の検出等において微量の検体
試料から微量物質を検出・定量する微量物質の高感度検
出法に関する。
虫等の感染疾患の診断、自己免疫疾患等の診断、組織適
合抗原の検出、ホルモンの検出、ホルモン異常の診断、
癌診断、食品中の細菌毒素の検出等において微量の検体
試料から微量物質を検出・定量する微量物質の高感度検
出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、微量生体物質の検出や測定には、
免疫測定法、レセプター・アッセイ法等のように、生体
物質と生体物質に対する特異的結合性物質との反応が好
んで用いられている。これらの方法では、目的物質もし
くはそれに対する特異的結合性物質、または特異的結合
性物質に対する第３の結合性物質など、反応にかかわる
成分の一つを放射性物質や酵素などで標識し、最終的に
反応した標識物を検出及び測定することにより、目的物
質の検出及び定量を行うが、標識物の検出限界が目的物
質の検出、測定の感度を定める最大要因となっている。
これらの方法で通常用いられる標識物の検出限界は、例
えば放射性物質の3Ｈで１fmol，125Ｉで１０amolであ
り、酵素のβ−ガラクトシダーゼで０.２amol(１２０分
子）である。これらの事は、検出及び測定の感度に理論
的に限界があることを示している。しかも上記の検出限
界は、例外的に感度の高い場合であって、実際にはある
物質とそれに対する特異的結合性物質との親和性が、必
ずしも満足できる程に高いとは限らないことが多い。
免疫測定法、レセプター・アッセイ法等のように、生体
物質と生体物質に対する特異的結合性物質との反応が好
んで用いられている。これらの方法では、目的物質もし
くはそれに対する特異的結合性物質、または特異的結合
性物質に対する第３の結合性物質など、反応にかかわる
成分の一つを放射性物質や酵素などで標識し、最終的に
反応した標識物を検出及び測定することにより、目的物
質の検出及び定量を行うが、標識物の検出限界が目的物
質の検出、測定の感度を定める最大要因となっている。
これらの方法で通常用いられる標識物の検出限界は、例
えば放射性物質の3Ｈで１fmol，125Ｉで１０amolであ
り、酵素のβ−ガラクトシダーゼで０.２amol(１２０分
子）である。これらの事は、検出及び測定の感度に理論
的に限界があることを示している。しかも上記の検出限
界は、例外的に感度の高い場合であって、実際にはある
物質とそれに対する特異的結合性物質との親和性が、必
ずしも満足できる程に高いとは限らないことが多い。
【０００３】酵素免疫測定法では、アビジン・ビオチン
系を用いた増幅方法が一般的であるが、ビオチン化ある
いはアビジン化した標識物の非特異的な結合によるバッ
クグラウンドが高くなり、感度が悪くなるという欠点が
ある。高感度化の操作に特異性が非常に高い方法を採用
することによって、バックグラウンドの干渉を抑えるこ
とが求められるところである。
系を用いた増幅方法が一般的であるが、ビオチン化ある
いはアビジン化した標識物の非特異的な結合によるバッ
クグラウンドが高くなり、感度が悪くなるという欠点が
ある。高感度化の操作に特異性が非常に高い方法を採用
することによって、バックグラウンドの干渉を抑えるこ
とが求められるところである。
【０００４】一方ポリメラーゼ・連鎖反応（ＰＣＲ法）
は、鋳型となる特定のＤＮＡ領域に対して、その領域を
挟むように２つのプライマーをアニールさせ、ＤＮＡポ
リメラーゼを用いた反応を繰り返すことによって、鋳型
の領域を特異的に増幅する方法である（特開昭６１−２
７４６９７号）。この方法を利用すれば、特定領域を１
０万〜１００万倍に増幅をする事が可能であり、試験中
の１ＤＮＡ分子の存在でも検出が行える事が報告されて
いる〔リ（Ｈ．Ｌｉ）らネイチャー（Nature、第３３５
巻４１４〜４１７頁、１９８８）〕。そこで微量検体を
用いた遺伝子診断、ウイルス診断、微生物検出等の利用
が考案されている。しかし、ＰＣＲ法はＤＮＡやＲＮＡ
のような核酸を検出する目的には非常に優れた方法であ
るが、核酸以外の物質を増幅することは不可能であり、
これらの検出には適用されないといった欠点がある。
は、鋳型となる特定のＤＮＡ領域に対して、その領域を
挟むように２つのプライマーをアニールさせ、ＤＮＡポ
リメラーゼを用いた反応を繰り返すことによって、鋳型
の領域を特異的に増幅する方法である（特開昭６１−２
７４６９７号）。この方法を利用すれば、特定領域を１
０万〜１００万倍に増幅をする事が可能であり、試験中
の１ＤＮＡ分子の存在でも検出が行える事が報告されて
いる〔リ（Ｈ．Ｌｉ）らネイチャー（Nature、第３３５
巻４１４〜４１７頁、１９８８）〕。そこで微量検体を
用いた遺伝子診断、ウイルス診断、微生物検出等の利用
が考案されている。しかし、ＰＣＲ法はＤＮＡやＲＮＡ
のような核酸を検出する目的には非常に優れた方法であ
るが、核酸以外の物質を増幅することは不可能であり、
これらの検出には適用されないといった欠点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このような状況におい
て、従来の方法では極めて微量の生体物質特に核酸以外
の物質を検出及び定量するのに感度が不十分であると考
えられていたものに対して高感度の測定法を提供するこ
とが本発明の課題である。
て、従来の方法では極めて微量の生体物質特に核酸以外
の物質を検出及び定量するのに感度が不十分であると考
えられていたものに対して高感度の測定法を提供するこ
とが本発明の課題である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、新規な検出法
および測定法に関するものであり、検出および測定の限
界を飛躍的に向上させ、標識物の検出限界に由来する問
題に、最終的な解決を与えるものである。即ち、標識物
として核酸を用い、目的とする物質に対して特異的に結
合する物質を核酸で標識化し、これを目的物質と結合さ
せた後に核酸を酵素的に増幅することを特徴とする簡便
かつ迅速な高感度検出法である。本発明の技術は、標識
物を用いた技術の全てに適用されうるものであり、従来
のいかなる標識物質の検出および定量による微量の生体
物質の測定法の代わりに用いることが出来るものであ
る。
および測定法に関するものであり、検出および測定の限
界を飛躍的に向上させ、標識物の検出限界に由来する問
題に、最終的な解決を与えるものである。即ち、標識物
として核酸を用い、目的とする物質に対して特異的に結
合する物質を核酸で標識化し、これを目的物質と結合さ
せた後に核酸を酵素的に増幅することを特徴とする簡便
かつ迅速な高感度検出法である。本発明の技術は、標識
物を用いた技術の全てに適用されうるものであり、従来
のいかなる標識物質の検出および定量による微量の生体
物質の測定法の代わりに用いることが出来るものであ
る。
【０００７】すなわち、本発明は検出すべき物質をその
物質に対して特異的な親和性を有する特異的結合性物質
であって核酸で標識化されたものと反応させるか、また
は検出すべき物質と特異的結合性物質との複合体を形成
した後にこの複合体を核酸で標識化するかして、検出す
べき物質−特異的結合性物質−核酸の複合体を形成さ
せ、そしてこの複合体中の標識核酸をＤＮＡポリメラー
ゼまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、この増幅
したＤＮＡまたはＲＮＡを検出することにより検体中の
物質を検出・定量することを特徴とする方法に関するも
のである。
物質に対して特異的な親和性を有する特異的結合性物質
であって核酸で標識化されたものと反応させるか、また
は検出すべき物質と特異的結合性物質との複合体を形成
した後にこの複合体を核酸で標識化するかして、検出す
べき物質−特異的結合性物質−核酸の複合体を形成さ
せ、そしてこの複合体中の標識核酸をＤＮＡポリメラー
ゼまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、この増幅
したＤＮＡまたはＲＮＡを検出することにより検体中の
物質を検出・定量することを特徴とする方法に関するも
のである。
【０００８】本発明をさらに説明すれば、本発明は抗原
と抗体、基質もしくは補酵素と酵素、リガンドと受容
体、糖鎖とレクチン、並びにホルモンと特異結合タンパ
ク質等の特異的な結合性を利用しており、被検液中の目
的物質をマイクロプレート、ビーズ、ディスク片、ゲル
等に固相化して単離した後、該目的物質に対して同様な
特異的結合性を有する物質であって核酸で標識されたも
のを前記固相化した目的物質と結合させるか、被検液中
の目的物質と該物質に対して特異的結合性を有し核酸で
標識された物質との複合体を形成せしめた後に固相化す
るか、または該目的物質と特異的結合性物質との複合体
を固相化した後に核酸で標識する方法を選択することが
でき、そして、固相化された標識核酸をＤＮＡポリメラ
ーゼまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、増幅さ
れたＤＮＡまたはＲＮＡ量から被検液中の目的物質を検
出・定量する方法に関するものである。ここにおいて、
検出あるいは定量される該物質が、核酸を持っているか
持っていないかは問題とならない。該目的物質が核酸を
含んでいる場合には、その核酸中に含まれない塩基配列
を標識に用いれば良い。いずれの場合であっても、標識
に用いた核酸は、オリゴヌクレオチドからキロ塩基単位
の大きさのものまで利用可能であるが、被標識物質と目
的物質との特異的結合を妨害しない程度の大きさである
ことが望ましい。
と抗体、基質もしくは補酵素と酵素、リガンドと受容
体、糖鎖とレクチン、並びにホルモンと特異結合タンパ
ク質等の特異的な結合性を利用しており、被検液中の目
的物質をマイクロプレート、ビーズ、ディスク片、ゲル
等に固相化して単離した後、該目的物質に対して同様な
特異的結合性を有する物質であって核酸で標識されたも
のを前記固相化した目的物質と結合させるか、被検液中
の目的物質と該物質に対して特異的結合性を有し核酸で
標識された物質との複合体を形成せしめた後に固相化す
るか、または該目的物質と特異的結合性物質との複合体
を固相化した後に核酸で標識する方法を選択することが
でき、そして、固相化された標識核酸をＤＮＡポリメラ
ーゼまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、増幅さ
れたＤＮＡまたはＲＮＡ量から被検液中の目的物質を検
出・定量する方法に関するものである。ここにおいて、
検出あるいは定量される該物質が、核酸を持っているか
持っていないかは問題とならない。該目的物質が核酸を
含んでいる場合には、その核酸中に含まれない塩基配列
を標識に用いれば良い。いずれの場合であっても、標識
に用いた核酸は、オリゴヌクレオチドからキロ塩基単位
の大きさのものまで利用可能であるが、被標識物質と目
的物質との特異的結合を妨害しない程度の大きさである
ことが望ましい。
【０００９】標識に用いる核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡで
もよく、さらには一本鎖でも二本鎖でもよい。しかし一
本鎖のＲＮＡは、被検液中あるいは増幅反応液中のＲＮ
ａｓｅ活性により、容易に分解されるので、一本鎖で用
いる場合は一般的にＤＮＡを使用するか、あるいは修飾
ヌクレオチドで合成したＲＮａｓｅ耐性のあるＲＮＡの
必要がある。二本鎖の場合は、いずれでもよい。
もよく、さらには一本鎖でも二本鎖でもよい。しかし一
本鎖のＲＮＡは、被検液中あるいは増幅反応液中のＲＮ
ａｓｅ活性により、容易に分解されるので、一本鎖で用
いる場合は一般的にＤＮＡを使用するか、あるいは修飾
ヌクレオチドで合成したＲＮａｓｅ耐性のあるＲＮＡの
必要がある。二本鎖の場合は、いずれでもよい。
【００１０】標識の方法は、標識核酸を合成する際に、
タンパク質、脂質、糖等の生物学的成分と結合し得るよ
うに、予め修飾を加えておき、次に該標識物と被標識物
を反応させて結合することにより行われる。例えば、核
酸の５′末端にＳＨ基を導入し、予めタンパク質に導入
しておいたマレイミド基と反応させることにより標識す
る方法が知られている（PCR Protocols，著者Innis
ら，Academic Press, １９９０）。あるいは、上記ＳＨ
基と生物学的成分のＳＨ基を酸化することにより、ジス
ルフィド結合を形成させることも可能である。この結合
は、後述するように、還元剤を用いて可逆的に切断され
るので増幅反応の際に便利である。
タンパク質、脂質、糖等の生物学的成分と結合し得るよ
うに、予め修飾を加えておき、次に該標識物と被標識物
を反応させて結合することにより行われる。例えば、核
酸の５′末端にＳＨ基を導入し、予めタンパク質に導入
しておいたマレイミド基と反応させることにより標識す
る方法が知られている（PCR Protocols，著者Innis
ら，Academic Press, １９９０）。あるいは、上記ＳＨ
基と生物学的成分のＳＨ基を酸化することにより、ジス
ルフィド結合を形成させることも可能である。この結合
は、後述するように、還元剤を用いて可逆的に切断され
るので増幅反応の際に便利である。
【００１１】アビジン・ビオチンのような特異的かつ強
い結合性を利用して、間接的に核酸を結合することも可
能である。例えば、まず検出するべき目的物質に対する
特異的結合性物質をビオチン化しておき、次にこの標識
ビオチンに対して過剰のアビジンを結合させる。１分子
のアビジンは４分子のビオチンと結合し得るが、アビジ
ン過剰の条件下においては、標識ビオチンとアビジンが
１対１の量比で結合し、被標識物質に結合したアビジン
は、さらにビオチン３分子との結合能力を保持してい
る。次に、Milligen／Biosearch 社、Pharmacia 社等か
ら市販されているキットを用いて、予めビオチン化した
核酸を反応させることによって、アビジンを介して核酸
による標識が行える。この方法では、目的物質とそれに
対して特異的な親和性を持つ特異的結合性物質が複合体
を形成した後に、核酸による標識化が可能であるので、
複合体の形成にほとんど影響を与えないで、大きな核酸
分子でも標識として用いることが出来る。
い結合性を利用して、間接的に核酸を結合することも可
能である。例えば、まず検出するべき目的物質に対する
特異的結合性物質をビオチン化しておき、次にこの標識
ビオチンに対して過剰のアビジンを結合させる。１分子
のアビジンは４分子のビオチンと結合し得るが、アビジ
ン過剰の条件下においては、標識ビオチンとアビジンが
１対１の量比で結合し、被標識物質に結合したアビジン
は、さらにビオチン３分子との結合能力を保持してい
る。次に、Milligen／Biosearch 社、Pharmacia 社等か
ら市販されているキットを用いて、予めビオチン化した
核酸を反応させることによって、アビジンを介して核酸
による標識が行える。この方法では、目的物質とそれに
対して特異的な親和性を持つ特異的結合性物質が複合体
を形成した後に、核酸による標識化が可能であるので、
複合体の形成にほとんど影響を与えないで、大きな核酸
分子でも標識として用いることが出来る。
【００１２】標識核酸の増幅は、クレノウ（Klenow）Ｄ
ＮＡポリメラーゼまたはＴａｑポリメラーゼを用いて公
知のＰＣＲ法（Saiki ら，１９８５，Science，２３
０，１３５０−１３４５および Saiki ら，１９８８，S
cience，２３９，４８７−４９１）で行うことが出来
る。この方法では、鋳型となる核酸とプライマーを適当
に選択することによってバックグラウンドに影響を与え
ることなく感度の増幅が可能となる。ＤＮＡポリメラー
ゼ反応は１回の反応でＤＮＡ領域を倍化することができ
ｎ回のサイクルにより原理的には２のｎ乗倍にＤＮＡを
増幅できることになる。従って反応を繰り返すことによ
りＤＮＡ領域を十万倍から百万倍にも増幅することがで
き、反応に用いるプローブの量及び反応の回数を適当に
選ぶことによって、被験液中に存在する微量のＤＮＡ量
を定量することが可能で、１分子のＤＮＡでさえ検出す
ることができる。
ＮＡポリメラーゼまたはＴａｑポリメラーゼを用いて公
知のＰＣＲ法（Saiki ら，１９８５，Science，２３
０，１３５０−１３４５および Saiki ら，１９８８，S
cience，２３９，４８７−４９１）で行うことが出来
る。この方法では、鋳型となる核酸とプライマーを適当
に選択することによってバックグラウンドに影響を与え
ることなく感度の増幅が可能となる。ＤＮＡポリメラー
ゼ反応は１回の反応でＤＮＡ領域を倍化することができ
ｎ回のサイクルにより原理的には２のｎ乗倍にＤＮＡを
増幅できることになる。従って反応を繰り返すことによ
りＤＮＡ領域を十万倍から百万倍にも増幅することがで
き、反応に用いるプローブの量及び反応の回数を適当に
選ぶことによって、被験液中に存在する微量のＤＮＡ量
を定量することが可能で、１分子のＤＮＡでさえ検出す
ることができる。
【００１３】あるいは、標識ＤＮＡにＲＮＡポリメラー
ゼによって転写される配列を入れておけば、ＲＮＡポリ
メラーゼを用いてＲＮＡに転写することによる増幅も可
能である。
ゼによって転写される配列を入れておけば、ＲＮＡポリ
メラーゼを用いてＲＮＡに転写することによる増幅も可
能である。
【００１４】標識核酸が必ずしも鋳型として直接増幅さ
れる必要はない。例えば、標識には一本鎖のオリゴヌク
レオチドを用い、鋳型となるより大きな核酸をハイブリ
ダイズさせてこれを増幅することも可能である。この場
合標識は、ハイブリダイゼーションが行える程度の塩基
数（十数個から数十個）があれば十分である。ハイブリ
ッドを形成した鋳型をＰＣＲ法で増幅する。あるいは、
特開平２−１３１５９９に示されたように、ＲＮＡポリ
メラーゼで転写される信号増幅ＤＮＡをハイブリダイズ
させる方法も可能である。
れる必要はない。例えば、標識には一本鎖のオリゴヌク
レオチドを用い、鋳型となるより大きな核酸をハイブリ
ダイズさせてこれを増幅することも可能である。この場
合標識は、ハイブリダイゼーションが行える程度の塩基
数（十数個から数十個）があれば十分である。ハイブリ
ッドを形成した鋳型をＰＣＲ法で増幅する。あるいは、
特開平２−１３１５９９に示されたように、ＲＮＡポリ
メラーゼで転写される信号増幅ＤＮＡをハイブリダイズ
させる方法も可能である。
【００１５】固相化された目的物質と標識特異的結合性
物質が複合体を形成することによって固体担体に固相化
された状態で、増幅を行ってもよいし、または、プロナ
ーゼ及びプロティナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を用
いて消化して、鋳型となる核酸を遊離してから行うこと
も可能である。遊離させる方法としては、ドデシル硫酸
ナトリウム、サルコシン及びトライトンのような界面活
性剤、もしくはチオシアン酸イオン及びカルシウムイオ
ン等のカオトロピックイオンを用いるか、熱、酸及びア
ルカリ処理を行うか、またはジチオスレイトールやβ−
メルカプトエタノール等の還元剤を用いて遊離すること
も出来る。
物質が複合体を形成することによって固体担体に固相化
された状態で、増幅を行ってもよいし、または、プロナ
ーゼ及びプロティナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を用
いて消化して、鋳型となる核酸を遊離してから行うこと
も可能である。遊離させる方法としては、ドデシル硫酸
ナトリウム、サルコシン及びトライトンのような界面活
性剤、もしくはチオシアン酸イオン及びカルシウムイオ
ン等のカオトロピックイオンを用いるか、熱、酸及びア
ルカリ処理を行うか、またはジチオスレイトールやβ−
メルカプトエタノール等の還元剤を用いて遊離すること
も出来る。
【００１６】増幅された核酸の検出は、それ自体公知の
方法で、例えば放射性同位元素、酵素及び蛍光物質等を
用いて行われる。検出方法としては増幅反応中に標識プ
ライマーを使用するか、または反応液中の前駆物質に標
識されたものを使用して、直接検出・定量する方法及び
増幅核酸にハイブリダイズ、または特異的親和性を持つ
標識物を使用する間接的方法がある。
方法で、例えば放射性同位元素、酵素及び蛍光物質等を
用いて行われる。検出方法としては増幅反応中に標識プ
ライマーを使用するか、または反応液中の前駆物質に標
識されたものを使用して、直接検出・定量する方法及び
増幅核酸にハイブリダイズ、または特異的親和性を持つ
標識物を使用する間接的方法がある。
【００１７】実施例１ ＤＮＡ標識抗体を用いる方法 工程１． 抗グリセンチン抗体へのマレイミド基の導入 グリセンチンＮ末（１−３２）に対するポリクローナル
抗体（ウサギ抗血清のＩｇＧ画分）１０mgをグリセンチ
ンをリガンドとしたアフィニティクロマトを行い、抗グ
リセンチン抗体を精製した。精製した抗体を２０mMリン
酸ナトリウム（ｐＨ７.２）で１mg／０.３mlの濃度に調
製した。これに３０μｌのＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドに溶かしたマレイミド試薬（Ｎ−（マレイミドメチ
ル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩）０.１mgを
加え、３０℃で１時間反応させた。反応後、１０分間遠
心して、不溶物を取り除き、０.１Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ６.０）で平衡化したＮＡＰ−２５カラム（Pharm
acia 社）を用いてゲルろ過を行い未反応のマレイミド
試薬を取り除いた。０.５mlずつ分画した各画分の２８
０nmの吸収を測定しピーク画分を集めた。
抗体（ウサギ抗血清のＩｇＧ画分）１０mgをグリセンチ
ンをリガンドとしたアフィニティクロマトを行い、抗グ
リセンチン抗体を精製した。精製した抗体を２０mMリン
酸ナトリウム（ｐＨ７.２）で１mg／０.３mlの濃度に調
製した。これに３０μｌのＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドに溶かしたマレイミド試薬（Ｎ−（マレイミドメチ
ル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩）０.１mgを
加え、３０℃で１時間反応させた。反応後、１０分間遠
心して、不溶物を取り除き、０.１Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ６.０）で平衡化したＮＡＰ−２５カラム（Pharm
acia 社）を用いてゲルろ過を行い未反応のマレイミド
試薬を取り除いた。０.５mlずつ分画した各画分の２８
０nmの吸収を測定しピーク画分を集めた。
【００１８】工程２． 標識ＤＮＡの調製 ＤＮＡの合成は、全自動ＤＮＡ合成機 Gene Assembler
（Pharmacia 社）を用いて、β−シアノエチル−ホスフ
ァアミダイト法により行った。合成ＤＮＡの５′末端へ
のＳＨ基の導入には、Ｃ６−Thiolmodifier（Amersham
社）を用い、ＤＮＡの合成の最後の段階で導入した。合
成したＤＮＡの配列は、以下に示すが、どの様な配列で
も選択し得る。
（Pharmacia 社）を用いて、β−シアノエチル−ホスフ
ァアミダイト法により行った。合成ＤＮＡの５′末端へ
のＳＨ基の導入には、Ｃ６−Thiolmodifier（Amersham
社）を用い、ＤＮＡの合成の最後の段階で導入した。合
成したＤＮＡの配列は、以下に示すが、どの様な配列で
も選択し得る。
【００１９】５′SH-CCGTGTATTC TATAGTGTCA CCTAAATCG
T ATGTGTATGA TACATAAGGT TATGTATTAA TTGTAGCCGC CGTTCT-OH ３′ 引続き、ＤＮＡの支持体よりの切り出し、脱保護基の処
理、及び合成ＤＮＡの精製は、合成機供給者の指示する
方法で行った。精製したＤＮＡを０.１Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ６.０）で平衡化したＮＡＰ−１０カラム（P
harmacia 社製）を用いてゲルろ過を行い、１.５mlの
０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６.０）溶液とした。
T ATGTGTATGA TACATAAGGT TATGTATTAA TTGTAGCCGC CGTTCT-OH ３′ 引続き、ＤＮＡの支持体よりの切り出し、脱保護基の処
理、及び合成ＤＮＡの精製は、合成機供給者の指示する
方法で行った。精製したＤＮＡを０.１Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ６.０）で平衡化したＮＡＰ−１０カラム（P
harmacia 社製）を用いてゲルろ過を行い、１.５mlの
０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６.０）溶液とした。
【００２０】工程３． ＤＮＡ標識抗体の調製 工程１の蛋白画分と工程２のＤＮＡ溶液を、それぞれ
１.５mlずつ混合し、４℃で終夜反応してＤＮＡ−抗体
の複合体（核酸標識抗体）を形成させた。次に、１０分
間遠心して不溶物を除いた後、MonoQ カラム（Pharmaci
a 社製）を用いてイオン交換カラムクロマトグラフィー
を行い、未反応のＤＮＡと抗体を除去した。２mlずつ分
取して該複合体を集めた。該複合体が抗体活性を保持し
ていることは、通例の方法でグリセンチンを固相化した
マイクロプレートを用いた酵素抗体法により確認した。
該複合体がＤＮＡを保持していることは、以下の方法に
よって確認した。上記ＤＮＡの５′末端近傍と同配列の
プライマー５′−GTATTCTATAGTGTCAACCTA−３′と、上
記ＤＮＡの３′末端に相補的なプライマー５′−AGAACG
GCGGCTACAATTAAT−３′を用いて、通常の方法にしたが
ってＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡをゲル電気泳
動にてプライマーと分離し、エチジウムブロマイド染色
を行い、増幅されたＤＮＡを検出した。
１.５mlずつ混合し、４℃で終夜反応してＤＮＡ−抗体
の複合体（核酸標識抗体）を形成させた。次に、１０分
間遠心して不溶物を除いた後、MonoQ カラム（Pharmaci
a 社製）を用いてイオン交換カラムクロマトグラフィー
を行い、未反応のＤＮＡと抗体を除去した。２mlずつ分
取して該複合体を集めた。該複合体が抗体活性を保持し
ていることは、通例の方法でグリセンチンを固相化した
マイクロプレートを用いた酵素抗体法により確認した。
該複合体がＤＮＡを保持していることは、以下の方法に
よって確認した。上記ＤＮＡの５′末端近傍と同配列の
プライマー５′−GTATTCTATAGTGTCAACCTA−３′と、上
記ＤＮＡの３′末端に相補的なプライマー５′−AGAACG
GCGGCTACAATTAAT−３′を用いて、通常の方法にしたが
ってＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡをゲル電気泳
動にてプライマーと分離し、エチジウムブロマイド染色
を行い、増幅されたＤＮＡを検出した。
【００２１】工程４． １次抗体の固相化 ポリスチレンビーズを、５０mMリン酸ナトリウム ｐＨ
７.０で１０μｇ／mlの濃度に希釈したグリセンチンＣ
末端に対するマウスモノクローナル抗体と混合し、４℃
２０時間撹拌して抗体を固相化した。次に、同リン酸バ
ッファーにて４倍希釈したブロックエース（大日本製薬
社製）を用いて、該ビーズのブロッキングを行った。Ｐ
ＢＳ（１０mMリン酸ナトリウム ｐＨ７.２，０.１５Ｍ
塩化ナトリウム）で洗浄後、該ビーズは使用するまでＰ
ＢＳ中に保存した。
７.０で１０μｇ／mlの濃度に希釈したグリセンチンＣ
末端に対するマウスモノクローナル抗体と混合し、４℃
２０時間撹拌して抗体を固相化した。次に、同リン酸バ
ッファーにて４倍希釈したブロックエース（大日本製薬
社製）を用いて、該ビーズのブロッキングを行った。Ｐ
ＢＳ（１０mMリン酸ナトリウム ｐＨ７.２，０.１５Ｍ
塩化ナトリウム）で洗浄後、該ビーズは使用するまでＰ
ＢＳ中に保存した。
【００２２】測定 通例のサンドイッチＥＩＡ法（酵素免疫測定法、第３
版、石川栄治ら著）と同様の操作を行い、被検出物質で
あるグリセンチンと標識抗体を、工程４において調製し
たビーズに固相化した。即ち、シリコナイズしたガラス
試験管に該ビーズと組換え型ヒトグリセンチン１pgを加
えて反応させた。０.０５％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで
該ビーズを洗浄後、２次抗体として工程３で得られた複
合体を用いて反応させた。次に、該ビーズを洗浄して未
反応の標識抗体を除去した後、該ビーズをポリプロピレ
ン微量遠心チューブに移し、Molecular Cloning ２版
（Sambrook ら著）に記載の公知の方法に従って、３０
回ＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡは、ゲル電気
泳動を行い、エチジウムブロマイド染色にて確認され
た。
版、石川栄治ら著）と同様の操作を行い、被検出物質で
あるグリセンチンと標識抗体を、工程４において調製し
たビーズに固相化した。即ち、シリコナイズしたガラス
試験管に該ビーズと組換え型ヒトグリセンチン１pgを加
えて反応させた。０.０５％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで
該ビーズを洗浄後、２次抗体として工程３で得られた複
合体を用いて反応させた。次に、該ビーズを洗浄して未
反応の標識抗体を除去した後、該ビーズをポリプロピレ
ン微量遠心チューブに移し、Molecular Cloning ２版
（Sambrook ら著）に記載の公知の方法に従って、３０
回ＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡは、ゲル電気
泳動を行い、エチジウムブロマイド染色にて確認され
た。
【００２３】この結果は図１に示される。この図１は １ ＤＮＡサイズマーカー（φ×１７４ ＤＮＡ／Hinf
Ｉ） ２ ＰＣＲに用いるプライマー対 ３ グリセンチン非添加検出系 ４ グリセンチン ｌpg 添加した検出系 ５ 標識に用いたＤＮＡ の夫々についてＰＣＲ増幅後にその反応生産物の1／10
量について４％アガロースゲル電気泳動を行いエチジウ
ムブロマイド染色した場合の、この試剤により染色され
た夫々のバンドを写真で示すものである。写真中矢印で
示されるバンドはＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを示
す。
Ｉ） ２ ＰＣＲに用いるプライマー対 ３ グリセンチン非添加検出系 ４ グリセンチン ｌpg 添加した検出系 ５ 標識に用いたＤＮＡ の夫々についてＰＣＲ増幅後にその反応生産物の1／10
量について４％アガロースゲル電気泳動を行いエチジウ
ムブロマイド染色した場合の、この試剤により染色され
た夫々のバンドを写真で示すものである。写真中矢印で
示されるバンドはＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを示
す。
【００２４】このことから、ＥＩＡ法では検出されなか
った微量グリセンチンの検出が可能となった。
った微量グリセンチンの検出が可能となった。
【００２５】実施例２ ５′ビオチン化ＤＮＡを用いた標識方法 工程１． ビオチン化プライマーの合成 全自動ＤＮＡ合成機 Gene Assembler（Pharmacia 社）
を用いて、ＤＮＡプライマーの合成を行った。塩基配列
は、５′−ATCGTCCATTCCGACAGCAT−３′で示され、市販
のベクターｐＢＲ３２２の制限酵素ＥｃｏＲ Ｖの切断
部位から下流方向へ２０塩基の長さと同じである。ビオ
チン化のためのアミノ基には、Ｎ−ＭＭＴ−Hexanolami
ne linker（Milligen／Biosearch 社）を用い、ＤＮＡ
の合成の最後の段階で、合成ＤＮＡの５′末端へ導入し
た。５′末端のアミノ基のビオチン化は以下のようにし
て行った。NHS-Biotin（Pierce社）５mgを４５０μｌの
ＤＭＦ(ジメチルホルムアミド）に溶かし、合成ＤＮＡ
１２０μｇ／４５０μｌと混合して室温で１夜反応させ
た。未反応のビオチンは２０％エタノールで平衡化した
ＮＡＰ−１０およびＮＡＰ−２５カラム（Pharmacia
社）を通すことにより除いた。
を用いて、ＤＮＡプライマーの合成を行った。塩基配列
は、５′−ATCGTCCATTCCGACAGCAT−３′で示され、市販
のベクターｐＢＲ３２２の制限酵素ＥｃｏＲ Ｖの切断
部位から下流方向へ２０塩基の長さと同じである。ビオ
チン化のためのアミノ基には、Ｎ−ＭＭＴ−Hexanolami
ne linker（Milligen／Biosearch 社）を用い、ＤＮＡ
の合成の最後の段階で、合成ＤＮＡの５′末端へ導入し
た。５′末端のアミノ基のビオチン化は以下のようにし
て行った。NHS-Biotin（Pierce社）５mgを４５０μｌの
ＤＭＦ(ジメチルホルムアミド）に溶かし、合成ＤＮＡ
１２０μｇ／４５０μｌと混合して室温で１夜反応させ
た。未反応のビオチンは２０％エタノールで平衡化した
ＮＡＰ−１０およびＮＡＰ−２５カラム（Pharmacia
社）を通すことにより除いた。
【００２６】工程２． ビオチン化標識ＤＮＡの調製 標識用ビオチン化ＤＮＡは、以下に述べる方法で調製し
た。制限酵素ＥｃｏＲＶと ＢａｍＨ Ｉで切り出された
市販のベクターｐＢＲ３２２の１９２塩基対の断片を鋳
型とし、工程１で調製したＥｃｏＲ Ｖ側のプライマー
１００pmolと、塩基配列が５′−GATCCACAGGACGGGTGTGG
−３′であるＢａｍＨ Ｉ側のプライマー５pmolを用い
て１００μｌのＴａｑポリメラーゼ・バッファー中、
２.５単位の耐熱性ＤＮＡ合成酵素（宝酒造社製）を用
い、ＰＣＲ反応を行った。増幅ＤＮＡの確認は、１％ア
ガロースゲル電気泳動により行った。電気泳動後、ゲル
中のＤＮＡをイモビロンＮ（Millipore社製）にサザン
ブロッティングし、次にアビジン−ＨＲＰ（西洋わさび
パーオキシダーゼ）とインキュベートして、ビオチン化
ＤＮＡと結合させた。次に、ＨＲＰの基質であるＯＰＤ
（オルト−フェニレンジアミン）を加え、発色させるこ
とによりビオチン化ＤＮＡを持つ増幅ＤＮＡを検出し
た。
た。制限酵素ＥｃｏＲＶと ＢａｍＨ Ｉで切り出された
市販のベクターｐＢＲ３２２の１９２塩基対の断片を鋳
型とし、工程１で調製したＥｃｏＲ Ｖ側のプライマー
１００pmolと、塩基配列が５′−GATCCACAGGACGGGTGTGG
−３′であるＢａｍＨ Ｉ側のプライマー５pmolを用い
て１００μｌのＴａｑポリメラーゼ・バッファー中、
２.５単位の耐熱性ＤＮＡ合成酵素（宝酒造社製）を用
い、ＰＣＲ反応を行った。増幅ＤＮＡの確認は、１％ア
ガロースゲル電気泳動により行った。電気泳動後、ゲル
中のＤＮＡをイモビロンＮ（Millipore社製）にサザン
ブロッティングし、次にアビジン−ＨＲＰ（西洋わさび
パーオキシダーゼ）とインキュベートして、ビオチン化
ＤＮＡと結合させた。次に、ＨＲＰの基質であるＯＰＤ
（オルト−フェニレンジアミン）を加え、発色させるこ
とによりビオチン化ＤＮＡを持つ増幅ＤＮＡを検出し
た。
【００２７】測定 ビーズに固相化する抗体には、インシュリン様成長因子
結合タンパク質に対する抗体を用い、検出すべきインシ
ュリン様成長因子結合タンパク質と、ビオチン化キット
（Amersham社製）を用いて供給者の指示に従い予めビオ
チン化したインシュリン様成長因子とを実施例１の測定
方法と同様の操作にて反応させた。このようにして抗体
−検出すべき物質−特異的結合性物質の複合体を形成さ
せた後、ビーズを洗浄して未反応のビオチン化インシュ
リン様成長因子を除去した。次にＰＢＳで４０００倍に
希釈したアビジンＤを加え、ビーズに固相化されている
ビオチン化インシュリン様成長因子と結合させた。結合
しなかったアビジンＤを除去した後、標識として上記ビ
オチン化ＤＮＡを加えた。ビーズを十分に洗浄した後、
実施例１で述べた同様の方法にてＤＮＡを増幅して検出
操作を行った。
結合タンパク質に対する抗体を用い、検出すべきインシ
ュリン様成長因子結合タンパク質と、ビオチン化キット
（Amersham社製）を用いて供給者の指示に従い予めビオ
チン化したインシュリン様成長因子とを実施例１の測定
方法と同様の操作にて反応させた。このようにして抗体
−検出すべき物質−特異的結合性物質の複合体を形成さ
せた後、ビーズを洗浄して未反応のビオチン化インシュ
リン様成長因子を除去した。次にＰＢＳで４０００倍に
希釈したアビジンＤを加え、ビーズに固相化されている
ビオチン化インシュリン様成長因子と結合させた。結合
しなかったアビジンＤを除去した後、標識として上記ビ
オチン化ＤＮＡを加えた。ビーズを十分に洗浄した後、
実施例１で述べた同様の方法にてＤＮＡを増幅して検出
操作を行った。
【００２８】この結果は図２に示される。この図２は １および２ インシュリン様成長因子結合タンパク質非
添加検出系 ３および４ インシュリン様成長因子結合タンパク質５
０pg添加検出系 の夫々についてＰＣＲ増幅後にその反応生産物の1／10
量について４％アガロースゲル電気泳動を行いエチジウ
ムブロマイド染色した場合の、この試剤により染色され
た夫々のバンドを写真で示すものである。写真中矢印で
示されたバンドはＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを示
す。
添加検出系 ３および４ インシュリン様成長因子結合タンパク質５
０pg添加検出系 の夫々についてＰＣＲ増幅後にその反応生産物の1／10
量について４％アガロースゲル電気泳動を行いエチジウ
ムブロマイド染色した場合の、この試剤により染色され
た夫々のバンドを写真で示すものである。写真中矢印で
示されたバンドはＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを示
す。
【００２９】このことから、ホルモンとそれに対する特
異結合タンパク質との結合のように、抗原と抗体の結合
以外の特異的な結合性を用いた場合であっても、実施例
１と同様に微量物質を検出することが可能であることが
分かった。さらに、複合体を形成せしめた後に核酸標識
を行った場合にも検出が可能である。
異結合タンパク質との結合のように、抗原と抗体の結合
以外の特異的な結合性を用いた場合であっても、実施例
１と同様に微量物質を検出することが可能であることが
分かった。さらに、複合体を形成せしめた後に核酸標識
を行った場合にも検出が可能である。
【００３０】実施例３ ＤＮＡ標識Ｆａｂ′を用いた定量 工程１． 抗アルカリホスファターゼＦａｂ′断片の調
製 特開昭６３−２０９５９７に開示したアルカリホスファ
ターゼに対する抗血清から、プロテインＡカラム（BioR
ad 社製）を用いて、供給者の指示にしたがってＩｇＧ
を精製した。１０mgのＩｇＧを用いて、公知の方法（酵
素免疫測定法、第３版、石川栄治ら著）に従って、Ｆａ
ｂ′断片を調製した。
製 特開昭６３−２０９５９７に開示したアルカリホスファ
ターゼに対する抗血清から、プロテインＡカラム（BioR
ad 社製）を用いて、供給者の指示にしたがってＩｇＧ
を精製した。１０mgのＩｇＧを用いて、公知の方法（酵
素免疫測定法、第３版、石川栄治ら著）に従って、Ｆａ
ｂ′断片を調製した。
【００３１】工程２． ＤＮＡ標識Ｆａｂ′の調製 調製したＦａｂ′と、実施例１に記載の方法で調製した
５′末端にＳＨ基を持つＤＮＡを等モル量混合し、室温
で２０時間反応させてＤＮＡ−Ｆａｂ′複合体を形成さ
せた。該複合体は、実施例１と同様の方法で精製した。
該複合体の確認は次のように行った。予めポリスチレン
ビーズに固相化したアルカリホスファターゼと該複合体
とを反応させた。次に、ＰＣＲ反応を行って、ＤＮＡが
増幅されることを確認した。
５′末端にＳＨ基を持つＤＮＡを等モル量混合し、室温
で２０時間反応させてＤＮＡ−Ｆａｂ′複合体を形成さ
せた。該複合体は、実施例１と同様の方法で精製した。
該複合体の確認は次のように行った。予めポリスチレン
ビーズに固相化したアルカリホスファターゼと該複合体
とを反応させた。次に、ＰＣＲ反応を行って、ＤＮＡが
増幅されることを確認した。
【００３２】測定 固相化１次抗体は、抗アルカリホスファターゼ・モノク
ローナル抗体Ｎｏ.２１を、２次抗体には、ＤＮＡで標
識された抗アルカリホスファターゼ・ポリクローナル抗
体のＦａｂ′断片を用いて、実施例１の工程４と同様の
操作を行った。ビーズを洗浄後、１mMジチオスレイトー
ルを含むＴａｑポリメラーゼ・バッファー中で、３７℃
１時間反応してＤＮＡを遊離させた。次に、ラジオアイ
ソトープを用いて、牧野の方法（実験医学、第９巻、
ｐ.１０３−１０６，１９９１）に従ってＰＣＲ増幅を
行ったところ、増幅されたＤＮＡの定量が可能となっ
た。
ローナル抗体Ｎｏ.２１を、２次抗体には、ＤＮＡで標
識された抗アルカリホスファターゼ・ポリクローナル抗
体のＦａｂ′断片を用いて、実施例１の工程４と同様の
操作を行った。ビーズを洗浄後、１mMジチオスレイトー
ルを含むＴａｑポリメラーゼ・バッファー中で、３７℃
１時間反応してＤＮＡを遊離させた。次に、ラジオアイ
ソトープを用いて、牧野の方法（実験医学、第９巻、
ｐ.１０３−１０６，１９９１）に従ってＰＣＲ増幅を
行ったところ、増幅されたＤＮＡの定量が可能となっ
た。
【００３３】
【発明の効果】本発明は従来検出限界の問題のために検
出あるいは定量されなかった微量物質に対して検出・定
量を可能にする高感度の測定方法を提供するものであ
る。
出あるいは定量されなかった微量物質に対して検出・定
量を可能にする高感度の測定方法を提供するものであ
る。
【図１】実施例１における試料のＰＣＲ増幅後の反応生
産物の1／10量について４％アガロースゲル電気泳動を
行い、エチジウムブロマイド染色した場合のこの試剤に
より染色された夫々のバンドを示す写真である。
産物の1／10量について４％アガロースゲル電気泳動を
行い、エチジウムブロマイド染色した場合のこの試剤に
より染色された夫々のバンドを示す写真である。
【図２】実施例２における試料の同様の染色された夫々
のバンドを示す写真である。
のバンドを示す写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年８月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】従来、微量生体物質の検出や測定には、
免疫測定法、レセプター・アッセイ法等のように、生体
物質と生体物質に対する特異的結合性物質との反応が好
んで用いられている。これらの方法では、目的物質もし
くはそれに対する特異的結合性物質、または特異的結合
性物質に対する第３の結合性物質など、反応にかかわる
成分の一つを放射性物質や酵素などで標識し、最終的に
反応した標識物を検出及び測定することにより、目的物
質の検出及び定量を行うが、標識物の検出限界が目的物
質の検出、測定の感度を定める最大要因となっている。
これらの方法で通常用いられる標識物の検出限界は、例
えば放射性物質の3Ｈで１fmol，125Ｉで１０amolであ
り、酵素のβ−ガラクトシダーゼで０.０００２amol(１
２０分子）である。これらの事は、検出及び測定の感度
に理論的に限界があることを示している。しかも上記の
検出限界は、例外的に感度の高い場合であって、実際に
はある物質とそれに対する特異的結合性物質との親和性
が、必ずしも満足できる程に高いとは限らないことが多
い。
免疫測定法、レセプター・アッセイ法等のように、生体
物質と生体物質に対する特異的結合性物質との反応が好
んで用いられている。これらの方法では、目的物質もし
くはそれに対する特異的結合性物質、または特異的結合
性物質に対する第３の結合性物質など、反応にかかわる
成分の一つを放射性物質や酵素などで標識し、最終的に
反応した標識物を検出及び測定することにより、目的物
質の検出及び定量を行うが、標識物の検出限界が目的物
質の検出、測定の感度を定める最大要因となっている。
これらの方法で通常用いられる標識物の検出限界は、例
えば放射性物質の3Ｈで１fmol，125Ｉで１０amolであ
り、酵素のβ−ガラクトシダーゼで０.０００２amol(１
２０分子）である。これらの事は、検出及び測定の感度
に理論的に限界があることを示している。しかも上記の
検出限界は、例外的に感度の高い場合であって、実際に
はある物質とそれに対する特異的結合性物質との親和性
が、必ずしも満足できる程に高いとは限らないことが多
い。
Claims (1)
- 【請求項１】 検出すべき物質をその物質に対して特異
的な親和性を有する特異的結合性物質であって核酸で標
識化されたものと反応させるか、または検出すべき物質
と特異的結合性物質との複合体を形成した後にこの複合
体を核酸で標識化するかし、そしてこの標識核酸をＤＮ
ＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅
し、この増幅したＤＮＡまたはＲＮＡを検出することに
より検体中の物質を検出・定量することを特徴とする方
法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33558091A JPH05149949A (ja) | 1991-11-26 | 1991-11-26 | 新規な微量物質測定法 |
| EP92119952A EP0544212A1 (en) | 1991-11-26 | 1992-11-24 | Method for the detection or quantitation of trace substances |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33558091A JPH05149949A (ja) | 1991-11-26 | 1991-11-26 | 新規な微量物質測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05149949A true JPH05149949A (ja) | 1993-06-15 |
Family
ID=18290174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33558091A Pending JPH05149949A (ja) | 1991-11-26 | 1991-11-26 | 新規な微量物質測定法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0544212A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05149949A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007527995A (ja) * | 2004-02-20 | 2007-10-04 | ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア | 分子上のエピトープの免疫検出のための試薬、キット及び方法 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69326685T2 (de) * | 1992-02-04 | 2000-06-08 | Nen Life Science Products, Inc.(N.D.Ges.Des Staates Delaware) | Amplifikation von test reporters durch nukleinsäure replikation |
| US5985548A (en) * | 1993-02-04 | 1999-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
| AU6913394A (en) * | 1993-05-13 | 1994-12-12 | United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Nucleic acid tagged immunoassay |
| US5648213A (en) * | 1994-08-30 | 1997-07-15 | Beckman Instruments, Inc. | Compositions and methods for use in detection of analytes |
| AUPN283195A0 (en) * | 1995-05-05 | 1995-06-01 | Australian Water Technologies Pty Ltd | Method for the detection of viable cryptosporidium parvum cells |
| IT1291913B1 (it) * | 1997-05-22 | 1999-01-21 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Metodo che prevede l'uso di batteriofagi per la rivelazione della presenza di molecole di interesse in campioni biologici |
| US7524628B2 (en) * | 2000-07-25 | 2009-04-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for detecting molecules expressing a selected epitope via fluorescent dyes |
| US6743592B1 (en) | 2000-07-25 | 2004-06-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods, systems and kits for immuno-detection of epitopes expressed on molecules |
| US7341831B2 (en) | 2001-07-18 | 2008-03-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for immuno-detection of epitopes |
| AU2004232976B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-02-10 | Becton, Dickinson And Company | Immuno-amplification |
| US20060035242A1 (en) | 2004-08-13 | 2006-02-16 | Michelitsch Melissa D | Prion-specific peptide reagents |
| EP2496947A1 (en) | 2009-11-04 | 2012-09-12 | Novartis AG | Positively charged species as binding reagents in the separation of protein aggregates from monomers |
| CZ2014527A3 (cs) | 2014-08-05 | 2016-02-17 | Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I. | Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů |
| CN105445256A (zh) * | 2014-09-02 | 2016-03-30 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 促黄体生成素lh定量测定试剂盒及其制备方法与检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0544212A1 (en) | 1993-06-02 |
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