ES2324481T3

ES2324481T3 - Tratamiento de infecciones bacterianas.

Info

Publication number: ES2324481T3
Application number: ES05717847T
Authority: ES
Inventors: Curtis Dobson; Keith Alan Crutcher
Original assignee: Ai2 Ltd
Current assignee: Ai2 Ltd
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2009-08-07
Anticipated expiration: 2025-02-28
Also published as: WO2005082399A2; EP1718325B1; AU2005216703A1; CA2554486A1; AU2005216703B2; WO2005082399A3; GB0404374D0; DE602005013648D1; JP2007524420A; CN1925866B; ATE427116T1; JP5270150B2; EP1718325A2; CN1925866A; AU2005216703A2; US8524861B2; JP2013051965A; US20090169598A1; CA2554486C

Abstract

Uso de un polipéptido, o un derivado o análogo del mismo, que comprende repeticiones de un péptido derivado de una región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de una apolipoproteína para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana, en el que el polipéptido, derivado o análogo del mismo, comprende al menos dos repeticiones con un motivo RKR.

Description

Tratamiento de infecciones bacterianas.

La presente invención se refiere a polipéptidos, derivados o análogos de los mismos, que comprenden al menos dos repeticiones con un motivo RKR con actividad antibacteriana, y a ácidos nucleicos que codifican los mismos. La invención proporciona además el uso de tales polipéptidos, derivados, análogos o ácidos nucleicos como medicamentos, y también en procedimientos de tratamiento. La invención se extiende además a objetos revestidos con los polipéptidos.

Los péptidos antimicrobianos son un componente clave del sistema inmunitario innato, conteniendo generalmente 20-40 aminoácidos, teniendo una carga positiva neta y habiéndose identificado la mayoría hasta la fecha en especies no mamíferas. Esto último limita su utilidad como agentes terapéuticos en seres humanos o mamíferos, tanto debido a dificultades en la producción comercial de tales péptidos grandes, como debido al riesgo de efectos adversos de estos péptidos debido a su origen no humano. Hacia 2003, de las aproximadamente 800 secuencias enumeradas en la base de datos internacional de péptidos antimicrobianos de Trieste (http://www.bbcm.units.it/\simtossi/amsdb.html), sólo 33 eran de origen humano, y de éstas sólo 3 tenían menos de 20 aminoácidos de longitud. También se han desarrollado algunos péptidos antimicrobianos sintéticos cortos. Sin embargo, éstos tienen la desventaja de los riesgos asociados de efectos antigénicos o tóxicos debidos a su origen no humano.

Tales péptidos se han caracterizado en seis grupos (Bradshaw, J.P., Biodrugs, 2003: 17: 235-240), siendo las más estudiadas las siguientes tres clases (Bowman H.G., Journal of Internal Medicine, 2003: 254:197-215):

(i) Péptidos lineales que carecen de cisteínas y a menudo con una estructura anfipática de hélice \alpha en disolución, por ejemplo, LL-37 humano (SEC ID Nº 19): LLGDFFRKSKEKIGKEFKRI VQRIKDFLRN LVPRTES;

(ii) Péptidos con 3 enlaces disulfuro, dando péptidos con una lámina beta dimérica plana, por ejemplo, \alpha-defensina humana: HNP-1 (SEC ID Nº 20)

100

(iii) Péptidos con polarización inusual en ciertos aminoácidos tales como prolina, arginina, triptófano o histidina, por ejemplo, PR-39 de cerdo (SEC ID Nº 21): RRRPRPPYLP RPRPPPFFPP RLPPRIPPGF PPRFPPRFP; o indolicidina de vaca (SEC ID Nº 22): ILPWKWPWWP WRR.

Muchos péptidos antimicrobianos tienen la capacidad de lisar bacterias. Sin embargo, no está claro si la lisis celular es el mecanismo responsable de tales efectos antimicrobianos (Bowman citado anteriormente). Además, muchos péptidos antibacterianos tienen una carga positiva neta y tienen un elemento de anfipaticidad con una bisagra que podría ayudar al péptido a saltar dentro de una membrana bacteriana. Sin embargo, ambas de estas características son comunes para muchos péptidos, incluyendo, por ejemplo, hormonas de polipéptido (Bowman citado anteriormente). Así, en la actualidad, no se entiende por completo el mecanismo mediante el cual los péptidos antimicrobianos confieren su función antimicrobiana. Aunque se ha descubierto que algunos ejercen también una acción antiviral, esto se considera que es un efecto secundario menor de cualquier acción de perturbación de membrana de estos péptidos (Bowman citado anteriormente).

Varios péptidos antibacterianos que se han descrito en la bibliografía científica tienen un fuerte carácter catiónico y a menudo están constituidos por residuos de arginina y lisina. Sin embargo, no todos los péptidos que contienen arginina y lisina tienen actividad antimicrobiana. Por ejemplo, Azuma et al. (Peptides, 21: 327-330 (2000)) notificaron que un péptido monomérico de 30-meros (30 aminoácidos de longitud) que está constituido por apoE_{133-162} (LRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVY; SEC ID Nº 47) tenía actividad antimicrobiana, que era comparable con la del antibiótico gentamicina. Sin embargo, los autores descubrieron que la sustitución de argininas individuales en las posiciones 136, 142, 147 y 150 del péptido disminuía la actividad antibacteriana, pareciendo ser los residuos en las posiciones 142 y 147 los más cruciales. Además, cuando Azuma designaba péptidos más cortos aproximándose a esta región, se reducía la actividad antibacteriana. Por ejemplo, el péptido de Azuma apoE_{134-151} (18 aminoácidos de longitud) no tenía actividad en absoluto a pesar de contener argininas en ambas posiciones 142 y 147. De manera similar, Azuma demostró que el péptido apoE_{134-155} (22 aminoácidos de longitud) tenía una actividad antibacteriana muy baja y que el péptido apoE_{134-159} (26 aminoácidos de longitud) tenía una actividad antibacteriana enormemente reducida. Así, Azuma demostró que la reducción de la longitud del péptido desde 30 aminoácidos hasta 26 aminoácidos y 22 aminoácidos, respectivamente, daba como resultado una reducción considerable en la eficacia antibacteriana del péptido. También descubrieron que la reducción de la longitud del péptido todavía más hasta 18 aminoácidos daba como resultado la pérdida total de eficacia antibacteriana. Finalmente, Azuma et al. sólo investigaron la actividad antibacteriana de los péptidos derivados de apoE y no evaluaron ningún otro efecto antimicrobiano.

Por tanto, parece que Azuma et. al. no tuvieron los medios para aprovechar la posible actividad antibacteriana de su péptido apoE_{133-162}, y demostraron que simplemente construyendo un péptido, que era catiónico, no se garantizaba necesariamente que fuera a mostrar eficacia antibacteriana. Así, no quedó claro en absoluto el mecanismo mediante el cual el péptido de Azuma confería su naturaleza antibacteriana.

Uno de los inventores de la presente invención había establecido previamente que ciertos polipéptidos tienen actividad antiviral. Los resultados de su investigación se describen en los documento PCT/GB2004/005438 (WO 2005/061539) y PCT/GB2004/005360 (WO 2005/058959). Estos polipéptidos antivirales comprenden repeticiones en tándem, y variantes de las mismas, de los péptidos: apoE_{141-149} (LRKLRKRLL - SEC ID Nº 1) y apoB_{3359-3367} (RLTRKRGLK - SEC ID Nº 2) así como repeticiones de modificaciones estrechamente relacionadas de SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2. Estos péptidos o bien se derivan de o bien comprenden la región de unión al receptor de HSPG/receptor de LDL de estas apolipoproteínas E y B. Aunque los inventores no quieren quedar adheridos a ninguna hipótesis, consideran que es probable que estos polipéptidos antivirales ejerzan sus acciones antivirales mediante varios mecanismos, estando particularmente favorecidos los que afectan a la unión viral. Los inventores sugieren que la dimerización de péptidos derivados de la región de unión al receptor de HSPG/receptor de LDL de estas apolipoproteínas (como una repetición en tándem o variantes de la misma) es importante para un efecto antiviral.

A pesar del hecho de que los agentes antivirales no están relacionados con los agentes antibacterianos debido a sus diferentes modos de acción sobre virus y bacterias, respectivamente, los inventores decidieron investigar si los polipéptidos, basándose en los péptidos antivirales tratados anteriormente, tenían algunas propiedades antibacterianas. Para este fin, investigaron si los efectos líticos u otros efectos mostrados por tales péptidos son posibles con bacterias, aunque estos parecieron no producirse cuando se investigaron virus. Específicamente, los inventores se preguntaban si la construcción de una repetición (por ejemplo, repeticiones en tándem) de péptidos derivados de la región de unión al receptor de HPSG/receptor de LDL de estas apolipoproteínas puede tener efectos antibacterianos. En particular, se preguntaban si las repeticiones de la región de apoE_{141-149} podría permitir inesperadamente que se volviesen a capturar las propiedades antibacterianas de apoE_{133-162} (dadas a conocer en Azuma et. al. citado anteriormente) dentro de un polipéptido mucho más corto. Para su sorpresa, descubrieron que los polipéptidos, según se define más adelante, muestran actividad antibacteriana.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un polipéptido, o un derivado o análogo del mismo, que comprende repeticiones de un péptido derivado de una región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de una apolipoproteína para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana o contaminación en el que el polipéptido, derivado o análogo del mismo comprende al menos dos motivos RKR.

Por la expresión "derivado o análogo del mismo", se quiere decir un polipéptido dentro del que se reemplazan residuos de aminoácidos por residuos (ya sean aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales o miméticos de aminoácido) con cadenas laterales o propiedades de la estructura principal del péptido similares. Adicionalmente, o bien uno o bien ambos extremos terminales de tales péptidos pueden protegerse mediante grupos protectores de los extremos N- y C-terminal, por ejemplo, grupos con propiedades similares a grupos acetilo o amida. Se apreciará que el aminoácido secuenciado puede variarse, truncarse o modificarse una vez que se forma el polipéptido final o durante el desarrollo de los péptidos repetidos (por ejemplo, el 9-mero).

El polipéptido de la invención comprende al menos dos repeticiones de un péptido derivado de una región de unión al receptor de HSPG de una apolipoproteína. Se apreciará que el polipéptido puede comprender repeticiones del mismo péptido (es decir, un homodímero o polímero del mismo péptido). Como alternativa, el polipéptido puede comprender una repetición de dos o más péptidos relacionados (es decir, un heterodímero o un polímero que comprende dos o más tipos peptídicos de monómero peptídico). Si el polipéptido comprende diferentes péptidos, se apreciará que tales péptidos compartirán las características de que son, o se derivan de, una región de unión al receptor de HSPG de una apolipoproteína. Los polipéptidos según la invención deben comprender dímeros o polímeros de tales péptidos unidos por el extremo N-terminal al C-terminal de un modo que conocería un experto en la técnica como una repetición en tándem. En consecuencia, a menos que el contexto dicte lo contrario, cuando se hace referencia a "repeticiones en tándem" en el presente documento se quiere decir una repetición de péptidos que son, o se derivan de, una región de unión al receptor de HSPG de una apolipoproteína. Tales repeticiones en tándem pueden ser homodímeros (o polímeros de un único péptido) o pueden comprender un heterodímero (o polímero de péptidos relacionados) según se trató anteriormente.

La expresión "péptidos derivados de" según se usa en el presente documento pretende describir o incluir péptidos de la región de unión al receptor de HSPG de una apolipoproteína que se han modificado. La modificación adecuada puede incluir sustitución, adición o deleción de aminoácidos. El péptido derivado o péptido modificado se dispone como una repetición en tándem según el primer aspecto de la invención. Sorprendentemente, los polipéptidos, derivados o análogos de los mismos según el primer aspecto de la invención han mostrado que presentan actividad antibacteriana.

Cuando en el presente documento se usa la expresión "un truncamiento de los mismos", se quiere decir que el polipéptido según la invención o el péptido constituyente se reducen en tamaño mediante la eliminación o la deleción de aminoácidos. La reducción de aminoácidos puede ser mediante la eliminación de residuos del extremo C- o N-terminal del polipéptido, o puede ser mediante la deleción de uno o más aminoácidos de los péptidos constituyentes.

Los inventores han descubierto que los polipéptidos según se definieron anteriormente tienen actividad antiviral. Para sorpresa de los inventores, cuando los polipéptidos según el primer aspecto se sometieron a prueba con bacterias, también mostraron eficacia antibacteriana, según se muestra en los ejemplos. Así, los inventores creen, por tanto, que han mostrado una nueva indicación médica para estos polipéptidos.

Cuando el polipéptido se usa para tratar infecciones bacterianas puede administrarse a un sujeto. Cuando ese sujeto es un ser humano, se prefiere que el polipéptido se base en repeticiones derivadas de apolipoproteínas humanas.

El medicamento puede usarse para el tratamiento de una variedad de infecciones bacterianas, incluyendo: queratitis microbiana; conjuntivitis; infecciones broncopulmonares, por ejemplo, neumonía; infecciones de las vías urinarias, por ejemplo, cistitis, pielonefritis; infecciones de oído, nariz y garganta, por ejemplo, otitis media, sinusitis, laringitis, difteria; infecciones cutáneas incluyendo celulitis, impétigo, infecciones de heridas, botulismo, gonorrea; septicemia; úlcera péptica y duodenal; gastritis; infecciones por Campylobacter; infecciones por Proteus mirabilis; meningitis; osteomielitis; y salmonelosis.

En general, los agentes antivirales, tales como aciclovir, ribavirina o enfuvirtida (T-20), rara vez son útiles frente a infecciones bacterianas debido a sus modos de acción completamente diferentes. De manera similar, los agentes antibacterianos, tales como antibióticos, rara vez son útiles frente a infecciones virales. En consecuencia, los inventores se sorprendieron mucho de que los polipéptidos según el primer aspecto mostraban eficacia tanto antiviral como antibacteriana, ya que esto era completamente inesperado.

Los inventores han descubierto que algunos de los polipéptidos específicos descritos en el presente documento sólo tienen actividad antibacteriana. Sin embargo, la mayoría de los polipéptidos según la invención eran sorprendentemente activos como agentes antibacterianos y también como agentes antivirales. Así, lo más preferido es que los polipéptidos según el primer aspecto muestren tanto actividad antibacteriana como, además, actividad antiviral. Resultará evidente que esta doble actividad mostrada por los polipéptidos es lo más ventajoso, ya que pueden usarse para combatir o tratar tanto infecciones virales como infecciones bacterianas, preferiblemente, de manera simultánea. Por tanto, tendrán una gran utilidad, por ejemplo, para su uso en hospitales, quirófanos y para uso doméstico en el hogar.

Los polipéptidos según el primer aspecto de la invención pueden comprender repeticiones de péptidos derivados de una región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de apolipoproteína B o apolipoproteína E. Se prefiere que el polipéptido según el primer aspecto de la invención comprenda una repetición en tándem (según se definió anteriormente) de péptidos derivados de una agrupación B de dominios de unión al receptor de LDL de apolipoproteína B, según se definió por Law y Scott (J. Lipid Res. 1990, 31:1109-20), o como alternativa, de una agrupación B de dominios de unión al receptor de LDL de apolipoproteína E (J. Lipid Res. 1995, 36:1905-1918). La agrupación B de dominios de unión al receptor de LDL de apolipoproteína B puede estar ubicada dentro de una región de unión al receptor de HSPG de apolipoproteína B, y la agrupación B de dominios de unión al receptor de LDL de apolipoproteína E de apolipoproteína E puede estar ubicada dentro de un dominio de unión a HSPG de apolipoproteína E.

Los inventores llevaron a cabo experimentos exhaustivos para evaluar la actividad antibacteriana de péptidos procedentes de apolipoproteínas y derivados de los mismos. Los péptidos y derivados de apoE y apoB fueron de especial interés. Los inventores descubrieron que la secuencia monomérica de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1) y la apoB_{3359-3367} (SEC ID Nº 2) y la apoB_{3359-3367} modificada (SEC ID Nº 96) no tenían actividad antibacteriana detectable. Además, para sorpresa de los inventores, descubrieron que un gran número de otros péptidos relacionados tenían poco o ningún efecto antibacteriano (véase el ejemplo 1, tablas 5 y 6). Sin embargo, sorprendentemente, los inventores descubrieron que las repeticiones de tales péptidos (es decir, polipéptidos según el primer aspecto de la presente invención), sí que muestran actividad antibacteriana. El ejemplo 1 ilustra la eficacia de los polipéptidos según la invención en comparación con apoE_{141-149} y apoB_{3359-3367} (es decir, repeticiones que no son en tándem) y otros péptidos derivados de apolipoproteínas.

Aunque los inventores no quieren quedar adheridos a ninguna hipótesis, los inventores creen que los residuos de aminoácido catiónicos en los péptidos apoE_{141-149} (basados en SEC ID Nº 1) y en los péptidos apoB_{3359-3367} (basados en SEC ID Nº 2) y en los péptidos apoB_{3359-3367} modificados (basados en SEC ID Nº 96) cuando están en forma de repeticiones en tándem permiten una actividad antibacteriana comparable a la notificada para el péptido de Azuma grande (apoE_{133-162}, al que se hizo referencia anteriormente). Los inventores también han establecido que ciertos derivados de estos péptidos también tienen actividad antibacteriana, incluyendo modificaciones y truncamientos de las secuencias de los péptidos.

Los inventores llevaron a cabo cierto análisis detallado de polipéptidos con actividad antibacteriana y en particular los basados en las repeticiones de péptidos derivados de la región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de apolipoproteína B o apolipoproteína E. Los inventores produjeron una alineación de secuencias entre los aminoácidos de apoE_{141-149} (es decir, el 9-mero de SEC ID Nº 1), alineados con los aminoácidos de apoB_{3359-3367} (es decir, el 9-mero de SEC ID Nº 2) y también la forma modificada de apoB_{3359-3367} (es decir, el 9-mero de SEC ID Nº 96). La alineación de secuencias se muestra en la tabla 1. Se apreciará que estos tres 9-meros, o derivados de los mismos, se repiten en los polipéptidos según la presente invención para formar al menos un 18-mero, que puede truncarse opcionalmente.

TABLA 1 Análisis de secuencias de péptidos eficaces que muestran propiedades antibacterianas

1

A la luz de estos datos de alineación, los inventores se dieron cuenta de que había un motivo de aminoácidos recurrente (conservado) en cada uno de los péptidos antibacterianos que comprenden repeticiones en tándem de un péptido derivado de una región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de apolipoproteína B (apoB_{3359-3367} (SEC ID Nº 2)), o la apolipoproteína B modificada (apoB_{3359-3367} (SEC ID Nº 96)), o la apolipoproteína E (apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1)), o un truncamiento de las mismas. Este motivo corresponde a un tripéptido: arginina-lisina-arginina (RKR), que se encuentra en los residuos de aminoácido designados: 4, 5, 6 de SEC ID. Nº 1 y SEC ID Nº 96 y SEC ID Nº 2. Los inventores se dieron cuenta de que todos los polipéptidos según la invención que muestran actividad antibacteriana comprenden estos motivos RKR.

Por tanto, el polipéptido según la invención comprende al menos dos motivos RKR (es decir, el polipéptido comprende una repetición en tándem de péptidos que comprenden motivos RKR).

Se apreciará que los polipéptidos según la presente invención comprenden al menos dos o más motivos RKR (es decir, un motivo RKR por repetición). En situaciones en las que el polipéptido comprende una repetición de trímero (3x), o una repetición de tetrámero (4x), o un número incluso mayor de repeticiones, el polipéptido comprende preferiblemente al menos tres, o al menos cuatro motivos RKR, respectivamente.

En una realización de la invención, el polipéptido según el primer aspecto puede tener preferiblemente la fórmula I:

\{abcRKRxyz\}\ +\ \{a'b'c'RKRx'y'z'\}

en la que a, b, c, a', b', c', x, y, z, x', y', z' son residuos de aminoácido, y en la que el polipéptido comprende un péptido abcRKRxyz y un péptido a'b'c'RKRx'y'z' que son repeticiones de SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, o SEC ID Nº 96 y derivados de las mismas. Tales derivados comprenden SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 96 en los que al menos un residuo de aminoácido de ese péptido, distinto de los motivos RKR, puede reemplazarse por una arginina (R), tirosina (Y), metionina (M), isoleucina (I), fenilalanina (F), triptófano (W) o un derivado de los mismos. El péptido también puede comprender una sustitución de histidina (H), y preferiblemente, está constituido por sólo una sustitución de H.

Los péptidos GIN2, GIN11 y MU24 (SEC ID Nº 3, 4 y 80) no se reivindican per se, sino para usos antibacterianos; véase el documento WO 2005/058959.

De manera adecuada, uno o más, de manera más adecuada, dos o más, e incluso de manera más adecuada, tres o más residuos de aminoácido pueden reemplazarse por una arginina (R), tirosina (Y), metionina (M), isoleucina (I), fenilalanina (F), triptófano (W) o derivado de los mismos. Preferiblemente, cuatro o más, más preferiblemente, cinco o más, e incluso más preferiblemente, seis o más residuos de aminoácido pueden reemplazarse por estos aminoácidos o un derivado de los mismos. Preferiblemente, el residuo reemplazado o sustituido es el primer, segundo, tercer, séptimo, octavo, noveno, décimo, undécimo, duodécimo, decimosexto, decimoséptimo o decimoctavo residuo del péptido definido por la fórmula I. Las sustituciones de aminoácidos más preferidas son con un residuo de fenilalanina (F) o un residuo de triptófano (W) o un derivado de los mismos.

El polipéptido según la invención puede comprender 18 aminoácidos (o derivados de los mismos), y de ese modo corresponder a la secuencia definida por la fórmula I con o sin las sustituciones tratadas anteriormente. En este caso, la posición de aminoácido 1 corresponde a a; la posición 2 corresponde a b; la posición 3 corresponde a c, la posición 4 corresponde al aminoácido R (del motivo RKR), etcétera.

Sin embargo, los inventores han descubierto sorprendentemente que los polipéptidos truncados basados en la fórmula I también tienen eficacia como agentes antibacterianos. En consecuencia, los polipéptidos preferidos o derivados de los mismos pueden tener menos de 18 aminoácidos. Por ejemplo, algunos polipéptidos según el primer aspecto de la invención pueden ser de 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos aminoácidos de longitud. Las deleciones se realizan preferiblemente en las posiciones 1, 2, 8, 9, 10, 11, 17 y/o 18 del polipéptido definido por la fórmula I.

El inventor también ha descubierto sorprendentemente que los polipéptidos basados en la fórmula I pero que tienen residuos de aminoácido adicionales, también tienen eficacia como agentes antibacterianos. En consecuencia, los polipéptidos preferidos o derivados de los mismos pueden tener más de 18 aminoácidos. Por ejemplo, algunos polipéptidos según el primer aspecto de la invención pueden ser de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o más aminoácidos de longitud. Pueden realizarse adiciones al extremo N- o C-terminal o en el núcleo del polipéptido. Pueden realizarse adiciones o bien antes del residuo "a" (es decir, en el extremo N-terminal del polipéptido), o bien antes de "a" (es decir, en el núcleo del polipéptido), según se define en la fórmula I. Pueden realizarse adiciones o bien tras el residuo "z" (es decir, en el núcleo del péptido) o bien tras "z" (en el extremo C-terminal del péptido), según se define en la fórmula I.

Sin embargo, la adición se realiza preferiblemente en la posición 0, 1, 2, 8, 9, 10, 11, 17 y/o 18 del péptido definido por la fórmula I. Lo más preferiblemente, se realizan las adiciones antes de la posición 0 del péptido, es decir, se añaden aminoácidos al extremo N-terminal antes del primer aminoácido en el residuo "a" definido por la fórmula I.

El polipéptido según fórmula I puede comprender preferiblemente los siguientes aminoácidos:

\quad: a y a' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o están delecionados;

\quad: b y b' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); o están delecionados;

\quad: c y c' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o treonina (T); o están delecionados;

\quad: x y x' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o glicina (G); o están delecionados;

\quad: y e y' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o están delecionados;

\quad: z y z' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o están delecionados.

El polipéptido de fórmula I puede comprender al menos un aminoácido adicional, que puede seleccionarse independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H). Preferiblemente, el aminoácido adicional se añade antes del aminoácido en las posiciones "a" en el péptido de fórmula I, es decir, al extremo N-terminal.

Así, se apreciará que el polipéptido según la invención puede comprender un 18-mero de {abcRKRxyz} y
{a'b'c'RKRx'y'z'}, en el que abc, a'b'c', xyz y x'y'z' se definen como anteriormente, o un truncamiento de los mismos. Se apreciará que, por ejemplo, a puede ser diferente de a', y b puede ser diferente de b', y c puede ser diferente de c', etcétera.

El polipéptido según el primer aspecto también puede tener preferiblemente la fórmula II:

\{abcRKRxyz\}\ +\ \{abcRKRxyz\}

en la que

a = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o está delecionado;

b = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); o está delecionado;

c = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o treonina (T); o está delecionado;

x = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o glicina (G); o está delecionado;

y = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o está delecionado;

z = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o está delecionado.

Como con el polipéptido de fórmula I, el polipéptido de fórmula II puede comprender al menos un aminoácido adicional, que puede seleccionarse independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H). Preferiblemente, el aminoácido adicional se añade antes del aminoácido en la posición "a" en el péptido de fórmula II, es decir, al extremo N-terminal.

Así, se apreciará que el polipéptido según la invención comprende un 18-mero de {abcRKRxyz} y {abcRKRxyz}, en el que abc y xyz se definen como anteriormente, o un truncamiento de los mismos.

El polipéptido definido por la fórmula II comprende preferiblemente los siguientes aminoácidos:

\quad: a = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); o está delecionado;

\quad: b = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); o está delecionado;

\quad: c = se selecciona independientemente de fenilalanina (F); o triptófano (W); o está delecionado;

\quad: x = se selecciona independientemente de fenilalanina (F); triptófano (W); o está delecionado;

\quad: y = se selecciona independientemente de fenilalanina (F); triptófano (W); o está delecionado;

\quad: z = se selecciona independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); o está delecionado.

Estos polipéptidos preferidos pueden comprender al menos un aminoácido adicional, que puede ser o bien fenilalanina (F) o triptófano (W) o bien leucina (L). Preferiblemente, el aminoácido adicional se añade antes del aminoácido en la posición "a" en el polipéptido de fórmula II es decir, al extremo N-terminal.

Los inventores también han apreciado que según la invención pueden emplearse polipéptidos que comprenden más de sólo una repetición de dímero (2x) en tándem de un péptido derivado de una región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de apolipoproteína B o apolipoproteína E, o un truncamiento de las mismas. Por ejemplo, los polipéptidos que comprenden una repetición de trímero (3x), o repetición de tetrámero (4x), o un número incluso mayor de repeticiones de un péptido derivado de una región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de apolipoproteína B o apolipoproteína E pueden emplearse como agentes antibacterianos útiles.

En consecuencia, se prefiere que el polipéptido pueda tener la fórmula III:

\{abcRKRxyz\}^{n}

en la que a, b, c, x, y, y z son según se definieron anteriormente con referencia a la fórmula I o II, y en la que n es igual a 2, 3, 4 ó 5, o más.

Otros polipéptidos preferidos pueden comprender repeticiones del péptido de 18-meros (o un truncamiento de las mismas) definido por la fórmula I (por ejemplo, repeticiones de un heterodímero de los 9-meros que comprenden el péptido de fórmula I).

Los polipéptidos, y derivados de los mismos, según la invención preferiblemente tienen una eficacia para inhibir el crecimiento bacteriano de manera que su valor de CI_{50} es de aproximadamente 40 \muM o inferior. Se prefiere que el valor de CI_{50} sea de aproximadamente 30 \muM o inferior, más preferiblemente, de aproximadamente 20 \muM o inferior, y lo más preferido de aproximadamente 10 \muM o inferior. El experto apreciará cómo pueden calcularse los valores de CI_{50}.

Lo más preferido es que el polipéptido según el primer aspecto puede comprender una repetición de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1), o derivados y truncamientos del mismo.

Así, en un segundo aspecto, se proporciona el uso de un polipéptido, derivado o análogo del mismo que comprende una repetición del péptido apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1) y truncamientos del mismo, o una repetición de variantes del péptido apoE_{141-149} en las que al menos un residuo de leucina (L) se reemplaza por triptófano (W), arginina (R), lisina (K), tirosina (Y) o fenilalanina (F), para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana en el que el truncamiento o la variante comprende al menos un motivo RKR.

Por "una repetición del péptido apoE_{141-149}" se quiere decir un polipéptido que comprende una repetición de la secuencia del péptido: LRKLRKRLL (SEC ID Nº 1), es decir, un 9-mero. El polipéptido comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos: LRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 6), es decir, un 18-mero que es un dímero de repetición en tándem de SEC ID Nº 1. También se hace referencia a SEC ID Nº 6 en el presente documento como GIN 1 o GIN1p (en el que p significa protección del extremo N-terminal (por ejemplo, mediante un grupo acetilo), y protección del extremo C-terminal (por ejemplo, mediante un grupo amida). También se hace referencia a GIN 1p en el presente documento como MU 10.

Por "un truncamiento de la misma", se quiere decir que la repetición (por ejemplo, el 18-mero de SEC ID Nº 6) se reduce en tamaño mediante la eliminación de aminoácidos. La reducción de aminoácidos puede ser mediante la eliminación de residuos del extremo C- y/o N-terminal, o puede ser mediante la deleción de uno o más aminoácidos del núcleo del polipéptido (por ejemplo, aminoácidos 2-17 de SEC ID Nº 6).

El inventor ha identificado que pueden sustituirse triptófano (W), arginina (R), lisina (K), tirosina (Y) o fenilalanina (F) por leucina en repeticiones en tándem de apoE_{141-149}, y que tales polipéptidos tienen una sorprendente actividad antibacteriana.

Lo más preferido es que los polipéptidos según el segundo aspecto de la invención comprendan un polipéptido, derivado o análogo del mismo que comprende una repetición de dímero de apoE_{141-149} o un truncamiento de la misma; caracterizado porque al menos un residuo de leucina (L) del dímero (SEC ID Nº 6) se reemplaza por un residuo de triptófano (W) o de fenilalanina (F).

Según se trata con más detalle a continuación, la SEC ID Nº 6 puede manipularse con varias sustituciones y deleciones diferentes para preparar polipéptidos con actividad antibacteriana. Se prefiere que el polipéptido según el segundo aspecto de la invención tenga al menos dos sustituciones seleccionadas independientemente de: sustituciones de triptófano (W), arginina (R), lisina (K), tirosina (Y) o fenilalanina (F), y más preferiblemente tres o más sustituciones de triptófano (W), arginina (R), lisina (K), tirosina (Y) o fenilalanina (F).

Además de una o más sustituciones de L por K, R, Y, F o W, se prefiere que al menos se reemplace un aminoácido adicional (preferiblemente al menos un residuo adicional de leucina) por arginina (R), tirosina (Y), metionina (M), isoleucina (I), fenilalanina (F) o triptófano (W). Se prefiere particularmente que tal sustitución adicional sea F o W.

El inventor también ha apreciado que según la invención pueden emplearse polipéptidos que comprenden más de sólo una repetición en tándem de dímero de apoE_{141-149} o un truncamiento o una variante de la misma. Por ejemplo, puede emplearse un trímero o tetrámero o número mayor de repeticiones como agentes antibacterianos.

Los polipéptidos según el segundo aspecto pueden sintetizarse de manera que se añaden aminoácidos adicionales a los mismos. Por ejemplo, pueden añadirse uno, dos, tres o más aminoácidos a los extremos C- o N-terminales de un péptido derivado de SEC ID Nº 6. Como alternativa, el polipéptido puede comprender una repetición en tándem de un péptido que es mayor que los nueve aminoácidos de SEC ID Nº 1. Tales péptidos pueden tener aminoácidos añadidos al extremo N-terminal, extremo C-terminal y/o entre los aminoácidos 9º y 10º de SEC ID Nº 6. Lo más preferido es que el aminoácido se añada al extremo C-terminal y también entre los aminoácidos 9º y 10º de SEC ID Nº 6. Se apreciará que tales péptidos pueden entonces modificarse según se describió anteriormente para los polipéptidos derivados de SEC ID Nº 6.

El polipéptido sustituido puede comprender 18 aminoácidos (o derivados de los mismos) y de ese modo corresponder a la longitud completa de SEC ID Nº 6. Sin embargo, los inventores han descubierto sorprendentemente que algunos polipéptidos truncados seleccionados basados en SEC ID Nº 6 también tienen eficacia como agentes antibacterianos. En consecuencia, los polipéptidos preferidos o derivados de los mismos pueden tener menos de 18 aminoácidos. Por ejemplo, algunos polipéptidos según el segundo aspecto de la invención pueden ser de 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos aminoácidos de longitud.

Se apreciará que pueden sustituirse formas modificadas de W o Y o R o K o F en la repetición en tándem de apoE_{141-149} con varias variantes de aminoácido que pueden conocer los expertos en la técnica. Tales polipéptidos tendrán todavía actividad antibacteriana siempre que la modificación no altere significativamente sus características químicas. Por ejemplo, pueden reemplazarse los hidrógenos en las aminas de cadena lateral de R o K por grupos metileno (-NH_{2} \rightarrow NH(Me) o -N(Me)_{2}).

Otros polipéptidos preferidos según el segundo aspecto de la invención (que comprenden repeticiones en tándem de péptidos derivados de apoE_{141-149}) pueden comprender una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

(a): WRKWRKRWWWRKWRKRWW (SEC ID Nº 7). Este polipéptido corresponde a una repetición de dímero en tándem de longitud completa de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 6) con todas las leucinas sustituidas por residuos de triptófano. Este polipéptido se denomina GIN 7 o MU 4 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(b): WRKWRKRWRKWRKR (SEC ID Nº 8). Este polipéptido corresponde a la repetición de dímero en tándem de longitud completa de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 6) con todas las leucinas sustituidas por residuos de triptófano y truncada mediante la escisión de los aminoácidos 9, 10, 17 y 18, es decir, es un 14-mero. Este polipéptido se denomina GIN 32 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(c): WRKWRKRWWLRKLRKRLL (SEC ID Nº 9). Este polipéptido corresponde a la repetición de dímero en tándem de longitud completa de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 6) con un subconjunto de leucinas sustituidas por residuos de triptófano, es decir, es un 18-mero. Este polipéptido se denomina GIN 34 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(d): YRKYRKRYYYRKYRKRYY (SEC ID Nº 10). Este polipéptido corresponde a la repetición de dímero en tándem de longitud completa de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 6) con todas las leucinas sustituidas por residuos de tirosina, es decir, es un 18-mero. Este polipéptido se denomina GIN 41 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(e): LRKLRKRLRKLRKR (SEC ID Nº 11). Este polipéptido corresponde a la repetición de dímero en tándem de longitud completa de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 6) truncada mediante la escisión de los aminoácidos 9, 10, 17 y 18, es decir, es un 14-mero. Este polipéptido se denomina GIN 8 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(f): LRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 3). Este polipéptido corresponde a la repetición de dímero en tándem de longitud completa de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 6) truncada mediante la escisión de aminoácidos 1, 2 y 3, es decir, es un 15-mero. Este polipéptido se denomina GIN 2 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(g): FRKFRKRFFFRKFRKRFF (SEC ID Nº 48). Este polipéptido se denomina MU 7 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(h): WRKWRKRWWRKWRKRWW (SEC ID Nº 63). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 7 con el residuo de W en la posición 9 delecionado. Este polipéptido se denomina MU 58 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(i): WRKWRKRWRKWRKRW (SEC ID Nº 64). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 7 con los residuos de W en la posición 9, 10 y 18 delecionados. Este polipéptido se denomina MU 59 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(j): WRKWRKRWWFRKWRKRWW (SEC ID Nº 65). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 7 con el residuo de W en la posición 10 sustituido por una F. Este polipéptido se denomina MU 60 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(k): WRKWRKRFFWRKWRKRFF (SEC ID Nº 66). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 7 con los residuos de W en las posiciones 9, 10, 17 y 18 sustituidos por residuos de F. Este polipéptido se denomina MU 61 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(l): WRKRWWRWRKRWWR (SEC ID Nº 67). Este polipéptido se denomina MU 81 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(m): LRKLRKRLLRLRKLRKRLLR (SEC ID Nº 68). Este polipéptido se denomina MU 82 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(n): WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR (SEC ID Nº 69). Este polipéptido se denomina MU 83 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(o): LRKLRKRLLWRKWRKRWW (SEC ID Nº 70). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 6 con los residuos L en las posiciones 10, 13, 17 y 18 sustituidos por residuos de W. Este polipéptido se denomina MU 111 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(p): LRKLRKRLLLRKLRKRWW (SEC ID Nº 71). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 6 con los residuos L en las posiciones 17 y 18 sustituidos por residuos de W. Este polipéptido se denomina MU 112 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(q): LRKLRKRLLWRKWRKRLL (SEC ID Nº 72). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 6 con los residuos L en las posiciones 10 y 13 sustituidos por residuos de W. Este polipéptido se denomina MU 113 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(r): WRKWRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 73). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 6 con los residuos L en las posiciones 1 y 4 sustituidos por residuos de W. Este polipéptido se denomina MU 114 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(s): WRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 74). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 6 con el residuo de L en la posición 1 sustituido por residuos de W. Este polipéptido se denomina MU 115 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(t): WRKWRKFFFRKWRKRWW (SEC ID Nº 75). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 7 con los residuos de W en las posiciones 8, 9 y 10 sustituidos por residuos de F y el residuo de R en la posición 7 delecionado. Este polipéptido se denomina MU 116 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(u): WRKWRKRWWFRKFRKRFF (SEC ID Nº 76). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 7 con los residuos de W en las posiciones 10, 13, 17 y 18 sustituidos por residuos de F. Este polipéptido se denomina MU 117 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

(v): LRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 3). Este polipéptido corresponde a SEC ID Nº 12 truncada mediante la escisión de los aminoácidos 1, 2 ó 3. Este péptido se denomina GIN2 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

Algunos de los polipéptidos más preferidos según el primer aspecto de la invención comprenden repeticiones de péptidos derivados de una región de unión al receptor de HSPG de apolipoproteína B, o una variante o un truncamiento de la misma.

Así, en un tercer aspecto, se proporciona el uso de un polipéptido, o un derivado o análogo del mismo, que comprende repeticiones de un péptido derivado de una región de unión al receptor de HSPG de apolipoproteína B, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana en el que el polipéptido o derivado o análogo del mismo comprende al menos dos motivos RKR.

Preferiblemente, el polipéptido, derivado o análogo del mismo comprende una repetición que se deriva de una agrupación B de dominios de unión al receptor de LDL de apolipoproteína B. Preferiblemente, el polipéptido, derivado o análogo del mismo comprende una repetición del péptido apoB_{3359-3367} (SEC ID Nº 2) o un truncamiento o una variante de la misma.

El polipéptido según el tercer aspecto de la invención puede ser una repetición de dímero en tándem de apoB_{3359-3367} (SEC ID Nº 2) con la secuencia de aminoácidos: RLTRKRGLKRLTRKRGLK, es decir, un 18-mero (SEC ID Nº 12).

Los péptidos según el tercer aspecto de la invención también pueden truncarse según se define en el presente documento. La reducción de aminoácidos puede ser mediante la eliminación de residuos del extremo C- o N-terminal, o puede ser mediante la deleción de uno o más aminoácidos del núcleo del péptido (es decir, aminoácidos 2-17 de SEC ID Nº 12).

Los polipéptidos según el tercer aspecto comprenden al menos dos motivos RKR, o pueden comprender más si el polipéptido es un trímero, o tetrámero, etcétera.

Los polipéptidos preferidos según el tercer aspecto comprenden la repetición de dímero en tándem del péptido apoB_{3359-3367} (es decir, el polipéptido de SEC ID Nº 12) o un truncamiento de la misma, caracterizados porque al menos un residuo de aminoácido, distinto de los motivos RKR, se ha reemplazado por un residuo de glicina (G), treonina (T), histidina (H), triptófano (W), arginina (R) o leucina (L) o derivados de los mismos.

De manera adecuada, uno o más, de manera más adecuada, dos o más, e incluso de manera más adecuada, tres o más residuos de aminoácido pueden reemplazarse por un residuo de glicina (G), treonina (T), histidina (H), triptófano (W), arginina (R) o leucina (L) o derivado de los mismos. Preferiblemente, cuatro o más, más preferiblemente, cinco o más, e incluso más preferiblemente, seis o más residuos de aminoácido pueden reemplazarse por estos aminoácidos o derivado de los mismos. Preferiblemente, el residuo reemplazado o sustituido es el primer, segundo, tercer, séptimo, octavo, noveno, décimo, undécimo,

\hbox{duodécimo, decimosexto,
decimoséptimo o decimoctavo residuo  de SEC ID Nº 12.}

Preferiblemente, el polipéptido según el tercer aspecto comprende el polipéptido de SEC ID Nº 12 o un truncamiento del mismo, caracterizado porque al menos un residuo de aminoácido se ha reemplazado por un residuo de triptófano (W), arginina (R) o leucina (L) o derivado de los mismos.

De manera adecuada, uno o más, de manera más adecuada, dos o más, e incluso de manera más adecuada, tres o más residuos de aminoácido pueden reemplazarse por un residuo de triptófano (W), arginina (R) o leucina (L) o derivado de los mismos. Preferiblemente, cuatro o más, más preferiblemente, cinco o más, e incluso más preferiblemente, seis o más residuos de aminoácido pueden reemplazarse por un residuo de triptófano (W), arginina (R) o leucina (L) o derivado de los mismos. Preferiblemente, el residuo reemplazado o sustituido es el primer, segundo, tercer, séptimo, octavo y/o noveno residuo de la secuencia de aminoácidos repetida de apoB_{3359-3367}, o combinaciones de la misma.

El polipéptido según la invención puede comprender 18 aminoácidos (o derivados de los mismos) y de ese modo corresponder a la longitud completa de SEC ID Nº 12 con o sin las sustituciones tratadas anteriormente. Sin embargo, los inventores han descubierto sorprendentemente que polipéptidos truncados basados en SEC ID Nº 12 también tienen eficacia como agentes antibacterianos. En consecuencia, los polipéptidos preferidos o derivados de los mismos pueden tener menos de 18 aminoácidos. Por ejemplo, algunos polipéptidos según el tercer aspecto de la invención pueden ser de 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos aminoácidos de longitud. Las deleciones se realizan preferiblemente en las posiciones 1, 2, 8, 9, 10, 11, 17 y/o 18 de SEC ID Nº 12.

En una realización preferida, el polipéptido según el tercer aspecto puede tener preferiblemente la fórmula IV:

\{abcRKRxyz\}\ +\ \{a'b'c'RKRx'y'z'\}

en la que

a y a' = se seleccionan independientemente de un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de o bien arginina (R) o bien lisina (K) o histidina (H); leucina (L); triptófano (W); o están delecionados;

b y b' = se seleccionan independientemente de leucina (L); arginina (R); lisina (K); o están delecionados;

c y c' = se seleccionan independientemente de treonina (T); triptófano (W); o un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H);

x y x' = se seleccionan independientemente de glicina (G); triptófano (W); leucina (L); o un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H);

y e y' = se seleccionan independientemente de leucina (L); un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H); o están delecionados;

z y z' = se seleccionan independientemente de un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H); o leucina; o están delecionados.

El polipéptido según el tercer aspecto también puede tener preferiblemente la fórmula V:

\{abcRKRxyz\}\ +\ \{abcRKRxyz\}

en la que

a = se selecciona independientemente de un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de o bien arginina (R) o bien lisina (K) o histidina (H); leucina (L); triptófano (W); o está delecionado;

b = se selecciona independientemente de leucina (L); arginina (R); lisina (K); o está delecionado;

c = se selecciona independientemente de treonina (T); triptófano (W); o un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H);

x = se selecciona independientemente de glicina (G); triptófano (W); leucina (L); o un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H);

y = se selecciona independientemente de leucina (L); un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H); o está delecionado;

z = se selecciona independientemente de un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H); o leucina (L); o está delecionado.

El polipéptido de fórmula V puede comprender más preferiblemente los siguientes aminoácidos:

a = se selecciona independientemente de triptófano (W); arginina (R); leucina (L); o está delecionado;

b = se selecciona independientemente de leucina (L); arginina (R) o lisina (K); o está delecionado;

c = se selecciona independientemente de triptófano (W); treonina (T); lisina (K);

x = se selecciona independientemente de triptófano (W); glicina (G); leucina (L); arginina (R);

y = se selecciona independientemente de leucina (L); un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H); o está truncado en este caso;

z = se selecciona independientemente de un residuo cargado positivamente, que puede seleccionarse de arginina (R) o lisina (K) o histidina (H); o leucina (L); o está truncado en este caso.

Los inventores también han apreciado que según la invención pueden emplearse polipéptidos que comprenden más de sólo una repetición de dímero en tándem de apoB_{3359-3367} (SEC ID Nº 12) o una variante o un truncamiento de la misma. Por ejemplo, los polipéptidos que comprenden un trímero, o tetrámero, o incluso un número mayor de repeticiones de SEC ID Nº 2 pueden emplearse como agentes antibacterianos útiles.

En consecuencia, se prefiere que el polipéptido pueda tener preferiblemente la fórmula VI:

\{abcRKRxyz\}^{n}

en la que a, b, c, x, y, y z son según se definieron anteriormente con referencia a la fórmula IV o V, y en la que n es igual a 2, 3, 4 ó 5, o más. Se apreciará que los péptidos monoméricos {abcRKRxyz} pueden ser idénticos o pueden variar según se definió anteriormente.

Otros polipéptidos preferidos pueden comprender repeticiones del 18-mero (o truncamientos de las mismas) definidos por la fórmula IV o V (por ejemplo, repeticiones de un heterodímero de los péptidos de 9-meros definidos por la fórmula IV).

Otros polipéptidos preferidos según el tercer aspecto de la invención pueden comprender una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

(a): RTRKRGRRTRKRGR (SEC ID Nº 13). Este polipéptido se denomina GIN 36 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(b): LRKRKRLLRKRKRL (SEC ID Nº 14). Este polipéptido se denomina GIN 37 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(c): LRKRKRLRKLRKRKRLRK (SEC ID Nº 15). Este polipéptido se denomina GIN 38 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(d): WRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 16). Este polipéptido se denomina GIN 33 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(e): LLRKRLKRLLLRKRLKRL (SEC ID Nº 80). Este polipéptido se denomina MU 24 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(f): RRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 83). Este polipéptido se denomina MU 28 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(g): KRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 84). Este polipéptido se denomina MU 29 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(h): LRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 85). Este polipéptido se denomina MU 30 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(i): HRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 86). Este polipéptido se denomina MU 31 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(j): RWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 87). Este polipéptido se denomina MU 32 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(k): RRWRKRWRKRRWRKRWRK (SEC ID Nº 88). Este polipéptido se denomina MU 33 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(l): LRWRKRWRKLRWRKRWRK (SEC ID Nº 89). Este polipéptido se denomina MU 35 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(m): HRWRKRWRKHRWRKRWRK (SEC ID Nº 90). Este polipéptido se denomina MU 36 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(n): RWRKRWRKRWRKRWRK (SEC ID Nº 91). Este polipéptido se denomina MU 37 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(o): RWRKRGRKRWRKRGRK (SEC ID Nº 92). Este polipéptido se denomina MU 69 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

(p): RWRKRWRKRWRKRWRK (SEC ID Nº 93). Este polipéptido se denomina MU 71 cuando se hace referencia a él en el presente documento;

\newpage

\global\parskip0.940000\baselineskip

(q): RKRGWKWRKRGWKW (SEC ID Nº 94). Este polipéptido se denomina MU 73 cuando se hace referencia a él en el presente documento; y

(r): RLTRKRGRLTRKRG (SEC ID Nº 95). Este polipéptido se denomina MU 74 cuando se hace referencia a él en el presente documento.

Durante su trabajo de desarrollo (que se basó en parte en los polipéptidos antivirales identificados previamente), los inventores manipularon adicionalmente los polipéptidos según los aspectos primero, segundo y tercero, y generaron polipéptidos desconocidos previamente, y clases de los mismos, que también mostraron actividad antibacteriana.

Por tanto, según un cuarto aspecto, se proporciona un polipéptido, que comprende una repetición del péptido apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1) caracterizado porque al menos un residuo de leucina (L) de SEC ID Nº 1 se reemplaza por tirosina (Y) o fenilalanina (F).

Los inventores también investigaron la eficacia antibacteriana de otros varios polipéptidos que se sintetizaron para el trabajo descrito en el presente documento. Los inventores creen que estos polipéptidos son nuevos y según aspectos adicionales, se proporcionan polipéptidos, derivados o análogos de los mismos, que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº 67 (MU 81); SEC ID Nº 68 (MU 82); SEC ID Nº S0 (MU 24); SEC ID Nº 94 (MU 73) o SEC ID Nº 95 (MU 74).

Estos polipéptidos se describen con más detalle en los ejemplos.

Según aspectos todavía adicionales de la presente invención, se proporciona un polipéptido, derivado o análogo del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 67 (MU 81); SEC ID Nº 68 (MU 82); SEC ID Nº 80 (MU 24); SEC ID Nº 94 (MU 73) o SEC ID Nº 95 (MU 74) para su uso como medicamento.

Además, según un aspecto todavía adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un polipéptido, derivado o análogo del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 67 (MU 81); SEC ID Nº 68 (MU 82); SEC ID Nº 80 (MU 24); SEC ID Nº 94 (MU 73) o SEC ID Nº 95 (MU 74) o un truncamiento de las mismas, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana.

En un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido según cualquier aspecto previo, para su uso como medicamento.

En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un polipéptido según cualquier aspecto previo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana.

Debido a su actividad biológica aumentada, los polipéptidos, derivados o análogos según la invención son de utilidad como agentes antibacterianos.

Los polipéptidos, derivados o análogos según la invención pueden usarse en el tratamiento frente a cualquier bacteria o infección bacteriana. La bacteria puede ser una bacteria Gram positiva o Gram negativa.

Por ejemplo, las bacterias frente a las que los péptidos según la invención son eficaces pueden incluir Firmicutes, que pueden ser Bacilli o Clostridia, por ejemplo Clostridium botulinum.

En una realización preferida, las bacterias frente a las que los polipéptidos según la invención son eficaces pueden incluir Bacillales, preferiblemente, Staphylococcus, por ejemplo, Staphylococcus aureus. Bacillales adicionales con que los péptidos según la invención son eficaces incluyen Streptococci, por ejemplo, Streptococcus pyogenes o Streptococcus pneumoniae.

Otros ejemplos de las bacterias frente a las que los polipéptidos según la invención son eficaces pueden incluir Pseudomonadales, preferiblemente, Pseudomonas aeruginosa. Otros ejemplos de las bacterias frente a las que los polipéptidos según la invención son eficaces pueden incluir Gammaproteobacteria, que pueden seleccionarse independientemente de un grupo que está constituido por Enterobacteriales, Proteus, Serratai, Pasteurellales y Vibrionales. Enterobacteriales preferidos incluyen Escherichia. Proteus preferidos incluyen Proteus mirabilis. Serratai preferidos incluyen Serratia marcescens. Pasteurellales preferidos incluyen Haemophilus influenzae. Vibrionales preferidos incluyen Vibrio cholerae.

Otros ejemplos de las bacterias frente a las que los polipéptidos según la invención son eficaces pueden incluir Betaproteobacteria, incluyendo Neisseriales, por ejemplo, Neisseria gonorrhoeae. Otros ejemplos de las bacterias frente a las que los polipéptidos según la invención son eficaces pueden incluir las subdivisiones delta/épsilon de Proteobacteria, incluyendo Campylobacterales, por ejemplo Helicobacter pylori. Otros ejemplos de las bacterias frente a las que los polipéptidos según la invención son eficaces pueden incluir Actinobacteria, por ejemplo Mycobacterium tuberculosis y Nocardia asteroides.

Los inventores llevaron a cabo experimentos para determinar cuál de los polipéptidos dados a conocer en el presente documento mostraban actividad antibacteriana frente a las bacterias de prueba Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus pneumoniae. La actividad de los polipéptidos según la invención puede observarse en las tablas 5, 6, 7 y 8. Preferiblemente, los polipéptidos según la invención muestran actividad antibacteriana frente a al menos uno, preferiblemente al menos dos, y más preferiblemente, todos de S. aureus, P. aeruginosa y S. pneumoniae. Preferiblemente, los polipéptidos según la invención muestran actividad antibacteriana frente a tanto S. aureus como P. aeruginosa. Sin embargo, los inventores han descubierto que GIN 7, MU 58, MU 114, MU 61, MU 60 y GIN 41 (SEC ID Nº 10) son particularmente activos frente a Staphylococcus, y en particular, frente a S. aureus. Además, los inventores han descubierto que GIN1p, MU 61, MU 82, MU 113, MU 114, MU 115, GIN 34, GIN 8 (SEC ID Nº 11), GIN 2 (SEC ID Nº 3) y GIN 11 (SEC ID Nº 4) son particularmente eficaces frente a Pseudomonadales, y en particular, frente a P. aeruginosa. Además, los inventores descubrieron que GIN 7 (MU 4 - SEC ID Nº 7), GIN 34 (SEC ID Nº 9), GIN 2 (SEC ID Nº 3) y MU 37 (SEC ID Nº 91) son particularmente eficaces (valores de CI_{50} inferiores a 30 \muM) frente a Streptococcus, y en particular, frente a S. pneumoniae.

Los polipéptidos, derivados o análogos según la invención pueden usarse para tratar infecciones bacterianas como monoterapia (es decir, el uso del polipéptido o ácido nucleico solo) o en combinación con otros compuestos o tratamientos usados en la terapia antibacteriana. Por ejemplo, los antibióticos convencionales incluyen amikacina, amoxicilina, aztreonam, cefazolina, cefepima, ceftazidima, ciprofloxacino, gentamicina, imipenem, linezolid, nafcilina, piperacilina, quinopristina-dalfopristina, ticarcilina, tobramicina y vancomicina.

Aunque los inventores no quieren quedar adheridos a ninguna hipótesis, han sugerido que el mecanismo de acción antibacteriano mediante los polipéptidos según la invención, puede implicar un efecto de daño directo a la bacteria, o bien mediado a través de la membrana bacteriana, o bien a través del transporte dirigido a un sitio dentro de la bacteria. Es posiblemente por este motivo que sólo se ha encontrado que son eficaces frente a las bacterias un número sorprendentemente pequeño de secuencias de péptidos.

Pueden usarse derivados, según se definió anteriormente, de los polipéptidos según la invención para tratar infecciones bacterianas. Tales derivados pueden aumentar o disminuir la semivida del polipéptido in vivo. Los ejemplos de derivados que pueden aumentar la semivida de los polipéptidos según la invención incluyen derivados peptoides de los polipéptidos, derivados de D-aminoácido de los polipéptidos e híbridos de péptido-peptoide.

Los polipéptidos según la invención pueden estar sometidos a degradación por varios medios (tales como actividad proteasa en sistemas biológicos). Tal degradación puede limitar la biodisponibilidad de los polipéptidos y así la capacidad de los polipéptidos para lograr su función biológica. Hay una amplia variedad de técnicas bien establecidas mediante las cuales pueden diseñarse y producirse derivados que tienen estabilidad mejorada en contextos biológicos. Tales derivados de polipéptido pueden tener una biodisponibilidad mejorada como resultado de un aumento de la resistencia a la degradación mediada por proteasas. Preferiblemente, un derivado o análogo adecuado para su uso según la invención es más resistente a las proteasas que el péptido del que se deriva.

Preferiblemente, el polipéptido puede hacerse más resistente a las proteasas protegiendo el extremo N- y/o C-terminal. Por ejemplo, el extremo N-terminal puede protegerse mediante un grupo acetilo, o mediante un grupo alquilo o arilo, o un grupo alquil-CO- o aril-CO, pudiendo estar cada uno de ellos opcionalmente sustituido. El extremo C-terminal puede protegerse mediante un grupo amida o mediante un grupo amida sustituido.

La resistencia a las proteasas de un derivado de polipéptido y del polipéptido del que se deriva puede evaluarse por medio de ensayos de degradación de proteínas bien conocidos. Pueden compararse entonces los valores relativos de la resistencia a las proteasas para el derivado de polipéptido y el polipéptido.

Pueden diseñarse fácilmente derivados peptoides de los polipéptidos de la invención a partir del conocimiento de la estructura del polipéptido según el primer, segundo y tercer aspecto de la invención. Pueden usarse programas disponibles comercialmente para desarrollar derivados peptoides según protocolos bien establecidos.

Los retropeptoides, (en los que se reemplazan todos los aminoácidos por residuos peptoides en orden inverso) también pueden imitar a los polipéptidos antibacterianos derivados de apolipoproteínas. Se espera que un retropeptoide se una en sentido opuesto en el surco de unión a ligandos, en comparación con un péptido o híbrido de peptoide-péptido que contiene un residuo peptoide. Como resultado, las cadenas laterales de los residuos peptoides pueden apuntar en el mismo sentido que las cadenas laterales en el péptido original.

Una realización adicional de una forma modificada del polipéptido según la invención comprende formas de D-aminoácido del polipéptido. La preparación de péptidos usando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos disminuye enormemente cualquier descomposición no deseada de tal agente por procesos metabólicos normales, disminuyendo las cantidades de agente que es necesario administrar, junto con la frecuencia de su administración.

Los polipéptidos, análogos, o derivados de la invención representan productos que pueden expresarse ventajosamente por células biológicas.

La presente invención también proporciona, en un aspecto adicional, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, derivado o análogo según la invención.

Los ácidos nucleicos preferidos según el aspecto adicional de la invención pueden incluir SEC ID Nº 23 (cttcg
taaacttcgtaaacgtcttctt), SEC ID Nº 24 (cgtcttactc gtaaacgtggtcttaaa), SEC ID Nº 25 (cttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcg
taaacgtcttctt), SEC ID Nº 26 (caatctactgaagaacttcgtgttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt), SEC ID Nº 27 (cttcgtg
ttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcgtgatgctgatgatcttcaaaaacgtct tgctgtttatcttcgtgttcgtcttgctagtcatcttcgtaaacttcg
taaacgtcttcttcgtgatgctgatgatcttcaaaaacgtc ttgctgtttat), SEC ID Nº 28 (cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcttcttcgtaaacttcgtaaacgtctt
ctt), SEC ID Nº 29 (tggcgtaaatggcgtaaacgttggtggtggcgtaaatggcgtaaacgttggtgg), SEC ID Nº 30 (tggcgtaaatggcgtaaacgtt
ggtggcgtaaatggcgtaaacgttgg), SEC ID Nº 31 (tggcgtaaat ggcgtaaacgttggtggcttcgtaaacttcgtaaacgtcttctt), SEC ID Nº 32 (tatcgtaaatatcgtaaacg ttattattatcgtaaatatcgtaaacgttattat), SEC ID Nº 33 (cttcgtaaacttcgtaaacgtcttcgtaaacttcgtaaacgt), SEC ID Nº 34 (cgtcttactcgtaaacgtgg tcttaaacgtcttactcgtaaacgtggtcttaaa), SEC ID Nº 35 (cgtactcgtaaacgtggtcgtcgtactcgt aaacgtggtcgt), SEC ID Nº 36 (cttcgtaaacgtaaacgtcttcttcgtaaacgtaaacgtctt), SEC ID Nº 37 (cttcgtaaacgtaaacgtcttcg
taaacttcgtaaacgtaaacgtcttcgtaaa) y SEC ID Nº 38 (tggcgttggcgtaaacgttggcgtaaatggcgttggcgtaaacgttggcgtaaa).

Los ácidos nucleicos preferidos incluyen además las moléculas de ADN correspondientes que codifican cualquiera de los polipéptidos preferidos según la invención.

Se apreciará que, debido a la redundancia del código genético, una secuencia de acido nucleico según la invención puede variar de la secuencia que se produce en la naturaleza (por ejemplo, en los genes de apoB o apoE) proporcionando un codón que codifica un polipéptido, derivado o análogo del mismo según el primer, segundo o tercer aspecto de la invención.

También se prevén otras modificaciones en las secuencias de polipéptido y están dentro de la invención reivindicada, es decir, las que se producen durante o tras la traducción, por ejemplo, mediante acetilación, amidación, carboxilación, fosforilación, escisión proteolítica o enlace a un ligando.

Se apreciará que los derivados de polipéptidos según la presente invención pueden usarse en monoterapia (es decir, el uso de los polipéptidos, o derivados según la invención solos para prevenir y/o tratar una infección bacteriana). Como alternativa, los polipéptidos, o derivados según la invención pueden usarse como adyuvante, o en combinación con terapias conocidas.

Los polipéptidos o derivados según la invención pueden combinarse en composiciones o compuestos que tienen varias formas diferentes dependiendo, en particular, de la manera en que vaya a usarse la composición. Por tanto, por ejemplo, la composición puede estar en forma de un polvo, comprimido, cápsula, líquido, pomada, crema, gel, hidrogel, aerosol, pulverización, micela, parche transdérmico, liposoma o cualquier otra forma adecuada que pueda administrarse a una persona o animal. Se apreciará que el vehículo de la composición de la invención debe ser uno que se tolere bien por el sujeto a quien se le administra, y preferiblemente que permita el suministro de los polipéptidos o derivados al cerebro. Se prefiere que los polipéptidos o derivados según la invención se formulen de manera que permita su paso a través de la barrera hematoencefálica.

Las composiciones que comprenden polipéptidos o derivados según la invención pueden usarse de varias maneras. Por ejemplo, puede requerirse la administración oral en cuyo caso el compuesto puede estar contenido dentro de una composición que puede, por ejemplo, ingerirse por vía oral en forma de un comprimido, cápsula o líquido. Como alternativa, la composición puede administrarse sistémicamente mediante inyección en el torrente sanguíneo. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusión) o subcutáneas (bolo o infusión). Los compuestos pueden administrarse mediante inhalación (por ejemplo, por vía intranasal).

Las composiciones que comprenden polipéptidos o derivados según la invención pueden administrarse por vía oral o administrarse sistémicamente. Además, las composiciones pueden administrarse mediante aerosol, por ejemplo, usando un nebulizador, que puede administrarse por vía nasal, o mediante un inhalador a través de los pulmones. Como alternativa, las composiciones pueden aplicarse tópicamente, por ejemplo, en forma de una crema o un gel. La administración tópica es útil cuando un sujeto que va a tratarse tiene una infección cutánea bacteriana. La composición puede aplicarse por vía intravaginal (por ejemplo, si se requiere proteger al sujeto frente a enfermedades de transmisión sexual) o por vía rectal.

Los polipéptidos o derivados también pueden incorporarse dentro de un dispositivo de liberación lenta o retardada. Tales dispositivos pueden insertarse, por ejemplo, sobre o bajo la piel, y el compuesto puede liberarse durante semanas o incluso meses. Tales dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se requiere el tratamiento a largo plazo con un polipéptido, agente, ácido nucleico o derivado según la invención y que normalmente requeriría la administración frecuente (por ejemplo, al menos una inyección diaria).

Se apreciará que la cantidad de un polipéptido o derivado que se requiere está determinada por su actividad biológica y biodisponibilidad que, a su vez, depende del modo de administración, de las propiedades fisicoquímicas del polipéptido o derivado empleado y si el polipéptido o derivado se está usando como monoterapia o en terapia de combinación. La frecuencia de administración también se verá influida por los factores mencionados anteriormente y particularmente por la semivida del polipéptido o derivado dentro del sujeto que se está tratando.

Los expertos en la técnica pueden determinar dosificaciones óptimas para administrarse y variarán con el polipéptido o derivado particular en uso, con la concentración de la preparación, con el modo de administración y con el avance del estado patológico. Factores adicionales que dependen del sujeto particular que se esté tratando darán como resultado una necesidad de ajustar las dosificaciones, incluyendo la edad, el peso, el sexo, la dieta del sujeto y momento de la administración.

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Pueden usarse procedimientos conocidos, tales como los empleados de manera convencional por la industria farmacéutica (por ejemplo, experimentación in vivo, ensayos clínicos, etc.), para establecer formulaciones específicas de los polipéptidos o derivados según la invención y regímenes terapéuticos precisos (tales como dosis diarias de los polipéptidos o derivados y la frecuencia de administración).

Generalmente, puede usarse una dosis diaria de entre 0,01 \mug/kg de peso corporal y 0,5 g/kg de peso corporal de los polipéptidos o derivados según la invención para la prevención y/o el tratamiento de una infección viral, dependiendo de qué polipéptido o derivado específico se use. Más preferiblemente, la dosis diaria es de entre 0,01 mg/kg de peso corporal y 200 mg/kg de peso corporal, y lo más preferiblemente, entre aproximadamente 1 mg/kg y 100 mg/kg.

Pueden administrarse las dosis diarias como una administración única (por ejemplo, una única inyección diaria). Como alternativa, el polipéptido o derivado usado puede requerir la administración dos veces o más veces durante un día. Como ejemplo, los polipéptidos o derivados según la invención pueden administrarse como dos dosis diarias (o más dependiendo de la gravedad del estado) de entre 25 mg y 7000 mg (es decir, suponiendo un peso corporal de 70 kg). Un paciente que recibe el tratamiento puede tomar una primera dosis al despertarse y luego una segunda dosis por la noche (si está en un régimen de dos dosis) o a intervalos de 3 ó 4 horas posteriormente. Como alternativa, puede utilizarse un dispositivo de liberación retardada para proporcionar dosis óptimas a un paciente sin la necesidad de administrar dosis repetidas.

Esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido o derivado según la invención y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la cantidad del polipéptido o derivado es una cantidad desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 800 mg. En otra realización, la cantidad del polipéptido o derivado es una cantidad desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 500 mg. En otra realización, la cantidad del polipéptido o derivado es una cantidad desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 250 mg. En otra realización, la cantidad del polipéptido o derivado es una cantidad desde aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 60 mg. En otra realización, la cantidad del polipéptido o derivado es una cantidad desde aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 20 mg.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es cualquier cantidad de un polipéptido o derivado según la invención que, cuando se administra a un sujeto proporciona la prevención y/o el tratamiento de una infección viral. Un "sujeto" es un vertebrado, mamífero, animal doméstico o ser humano.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se hace referencia a él en el presente documento es cualquier vehículo fisiológico conocido para los expertos en la técnica útil en la formulación de composiciones farmacéuticas.

En una realización preferida, el vehículo farmacéutico es un líquido y la composición farmacéutica está en forma de una disolución. En otra realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un sólido y la composición está en forma de un polvo o comprimido. En una realización adicional, el vehículo farmacéutico es un gel y la composición está en forma de una crema o similar.

Un vehículo sólido puede incluir una o más sustancias, que también pueden actuar como agentes aromatizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, cargas, deslizantes, adyuvantes para compresión, aglutinantes o agentes disgregantes de comprimidos; también puede ser un material de encapsulación. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que está en mezcla con el polipéptido, agente, ácido nucleico o derivado activo finamente dividido. En los comprimidos, el polipéptido, agente, ácido nucleico o derivado activo se mezcla con un vehículo que tiene las propiedades de compresión necesarias en las proporciones adecuadas y se compactan en la forma y el tamaño deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferiblemente hasta el 99% del polipéptido, agente, ácido nucleico o derivado activo. Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidona, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico.

Se usan vehículos líquidos en la preparación de disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones a presión. El polipéptido o derivado activo puede disolverse o suspenderse en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizantes u osmorreguladores. Ejemplos adecuados de vehículos líquidos para la administración oral y parenteral incluyen agua (aditivos que la contienen parcialmente como anteriormente, por ejemplo, derivados de celulosa, preferiblemente disolución de carboximetilcelulosa sódica), alcoholes (incluyendo alcoholes monohidroxilados y alcoholes polihidroxilados, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de cacahuete y aceite de coco fraccionado). Para la administración parenteral, el vehículo también puede ser un éster oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos estériles son útiles en composiciones en forma líquida estériles para la administración parenteral. El vehículo líquido para composiciones a presión puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmacéuticamente
aceptable.

Las composiciones farmacéuticas líquidas que son disoluciones o suspensiones estériles pueden utilizarse, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa y particularmente subcutánea, intracerebral o intracerebroventricular. El polipéptido o derivado puede prepararse como una composición sólida estéril que puede disolverse o suspenderse en el momento de la administración usando agua estéril, solución salina u otro medio inyectable estéril apropiado. Los vehículos pretenden incluir aglutinantes, agentes de suspensión, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes, conservantes, colorantes y revestimientos necesarios e inertes.

Los polipéptidos o derivados según la invención pueden administrarse por vía oral en forma de una disolución o suspensión estéril que contiene otros solutos o agentes de suspensión (por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para hacer la disolución isotónica), sales biliares, goma arábiga, gelatina, monooleato de sorbitano, polisorbato 80 (ésteres de oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares.

Los polipéptidos o derivados según la invención también pueden administrarse por vía oral en forma de composición o bien líquida o bien sólida. Las composiciones adecuadas para la administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, cápsulas, gránulos, comprimidos y polvos, y formas líquidas, tales como disoluciones, jarabes, elixires y suspensiones. Las formas útiles para la administración parenteral incluyen disoluciones, emulsiones y suspensiones estériles.

Los polipéptidos o derivados pueden usarse para tratar cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, ganado, mascotas, y pueden usarse en otras aplicaciones veterinarias.

Los inventores se han dado cuenta de que los polipéptidos según la invención pueden usarse como medicamento pero también pueden aplicarse a otros usos antimicrobianos varios (si se está en un contexto clínico o de otro tipo). Por ejemplo, además de administrar dichos polipéptidos o derivados según la invención a un paciente, pueden usarse para revestir superficies y objetos para prevenir o tratar una contaminación bacteriana.

Por tanto, en un aspecto adicional se proporciona un procedimiento de prevención y/o tratamiento de una contaminación bacteriana de una superficie o un objeto inanimado que comprende revestir la superficie o el objeto que lo necesita con una cantidad de un polipéptido según el primer, segundo o tercer aspecto de la invención, que es eficaz para destruir o prevenir el crecimiento de bacterias.

Se apreciará que el polipéptido puede ser particularmente útil para revestir superficies u objetos que se requiere que sean asépticos. Según se trató anteriormente, muchos de los polipéptidos tienen la ventaja de que son tanto antivirales como antibacterianos. En consecuencia, el polipéptido tendrá un amplio efecto antimicrobiano. Además, según se trata con más detalle a continuación, los polipéptidos pueden adherirse a superficies y de ese modo son eficaces durante periodos de tiempo más prolongados.

Los polipéptidos pueden usarse para revestir cualquier objeto o dispositivo que se usa en una situación biológica o médica, tal como un dispositivo médico, y para el que puede ser importante prevenir una contaminación bacteriana que puede conducir a cualquier infección en un paciente. Los ejemplos de dispositivos médicos que pueden revestirse según la invención incluyen lentes, lentes de contacto, catéteres, endoprótesis, apósitos para la cicatrización de heridas, anticonceptivos, implantes quirúrgicos y articulaciones de sustitución.

Los polipéptidos son particularmente útiles para revestir biomateriales y objetos y dispositivos fabricados a partir de los mismos. La contaminación/infección bacteriana de biomateriales puede ser particularmente problemática debido a que la bacteria puede usar tal material como sustrato para su crecimiento. Pueden usarse biomateriales (por ejemplo, colágenos y otros polímeros biológicos) para revestir la superficie de articulaciones artificiales. Como alternativa, ciertos implantes pueden comprender sustancialmente tales biomateriales.

Los polipéptidos pueden usarse para revestir superficies en entornos que se requiere que sean asépticos. Por ejemplo, los polipéptidos pueden usarse en entornos médicos. Los polipéptidos pueden usarse para mantener limpias salas de hospital. Pueden usarse para limpiar superficies de equipos (por ejemplo, mesas de operación) en quirófanos así como suelos y paredes de los quirófanos. Los inventores creen que los polipéptidos serán útiles para mejorar la esterilidad en general y también para tratar la propagación de MRSA en particular (los inventores creen que MRSA pueden destruirlo los polipéptidos de la invención).

Los polipéptidos pueden formularse en disoluciones para la limpieza de objetos y superficies. Por ejemplo, pueden ser un constituyente rutinario de disoluciones fisiológicas (por ejemplo como constituyente de solución salina fisiológica).

El ejemplo 3 ilustra cómo de bien se adhieren los polipéptidos según la invención a lentes de contacto. Además, el ejemplo 2 ilustra que los péptidos pueden retener sorprendentemente su actividad antibacteriana incluso tras tratamiento en autoclave. Este es lo más ventajoso cuando se usan los péptidos para revestir objetos que, en uso, experimentan altas temperaturas y presiones. Además, se apreciará que es necesario esterilizar muchos dispositivos médicos tales como instrumentos quirúrgicos, entre usos, normalmente mediante tratamiento en autoclave. Así, los péptidos según la invención son muy útiles ya que (i) se adhieren a una superficie; y (ii) retienen su actividad antibacteriana tras la esterilización.

Se apreciará que la lista anterior de objetos y superficies a los que pueden aplicarse los polipéptidos según la invención no es exhaustiva. Así, los polipéptidos pueden administrarse a cualquier superficie, que sea propensa a una contaminación bacteriana, por ejemplo, superficies y productos de la cocina y el cuarto de baño, tales como el asiento del inodoro o el propio inodoro.

En una realización preferida, los polipéptidos pueden incluirse en solución salina usada para guardar lentes de contacto.

Los polipéptidos preferidos según la invención están sumamente cargados positivamente. Esto los hace particularmente adecuados para revestir superficies y objetos para prevenir el crecimiento de amplias categorías de bacterias. El ejemplo 3 y las figuras 8 y 9, ilustran claramente lo bien que se adhieren los polipéptidos según la invención a una gama de superficies diferentes, es decir, vidrio (cubreobjetos), vidrio revestido previamente con el biomaterial poli(lactida-co-glicolida) (PLGA) y lentes de contacto.

Preferiblemente, el revestimiento del objeto o superficie puede llevarse a cabo preparando una disolución acuosa a un pH y una temperatura apropiados para dichos polipéptidos según la invención. El objeto o la superficie se exponen a dicha disolución durante un tiempo suficiente como para permitir la inmovilización o absorción de una cantidad adecuada de los polipéptidos a la superficie de la misma o para permitir un tiempo suficiente para destruir la
bacteria.

En una realización preferida, se prepara una disolución suficientemente concentrada de un polipéptido según la invención y se pone en contacto con el objeto que va a revestirse durante un periodo de tiempo adecuado. El técnico experto apreciará cómo obtener una disolución de polipéptido de la concentración requerida, ya que esto dependerá del polipéptido particular que se está usando y de las bacterias que van a tratarse y de la superficie que se está revistiendo. Por ejemplo, el objeto puede insertarse en la disolución (por ejemplo, que comprende aproximadamente 40 \muM del polipéptido) y dejarse durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 20ºC. Tras la exposición al polipéptido, el objeto puede lavarse, por ejemplo, en un tampón adecuado, tal como, PBS. Puede requerirse dejar el objeto en el tampón de lavado durante la noche. Tras el lavado, el polipéptido se ha adherido entonces al objeto, y el objeto, revestido con el polipéptido protector, está listo para su uso.

Además, los inventores han descubierto que las lentes de contacto, cuando se incuban previamente con los polipéptidos según la invención, se vuelven resistentes a la infección bacteriana, tal como se ilustra en la figuras 2, 3 y 4.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una lente de contacto al menos parcialmente revestida con un polipéptido según el primer, el segundo o el tercer aspectos de la invención.

El polipéptido aplicado a la superficie de la lente de contacto previene que se produzca una contaminación bacteriana que puede dar como resultado infecciones que se producen en los ojos del usuario.

En una realización, la lente puede ser una lente desechable diaria (es decir, que se lleva puesta durante un día y luego se desecha), en cuyo caso, se evita una contaminación bacteriana antes de que se use la lente y también cuando se extrae de su envase. En consecuencia, la lente puede pretratarse con el polipéptido y/o puede envasarse en una disolución que contiene el polipéptido. La lente revestida con el polipéptido reduce la posibilidad de que pueda producirse una infección bacteriana en el usuario mientras está llevando puesta la lente de contacto.

Como alternativa, puede llevarse puesta repetidamente una lente de manera diaria durante varios meses o años, pero extraerse y lavarse y guardarse en disolución durante la noche. Cuando éste es el caso, un polipéptido que reviste la lente (antes del primer uso) y/o preferiblemente el uso de los polipéptidos en las disoluciones de lavado de lentes, reducirá significativamente la posibilidad de que se produzca una infección bacteriana del usuario mientras que está llevando puesta la lente, o que se contamine la lente mientras se está guardando y lavando durante la noche.

En otra realización, la lente puede ser una lente de uso prolongado, que se lleva puesta constantemente en el ojo durante periodos prolongados de tiempo, por ejemplo, más de un día, varios días, una semana o incluso un mes o más. Los usuarios de tales lentes de contacto tienen un alto riesgo de desarrollar una infección bacteriana. Así, en este caso, el polipéptido puede usarse para revestir la lente antes de que se use por primera vez. El uso de una lente revestida de este tipo reducirá enormemente la posibilidad de que se produzca una infección bacteriana mientras que se está llevando puesta la lente durante tales periodos de tiempo prolongados.

En una realización preferida, se reviste una lente de contacto con un polipéptido según la invención, y cuando sea apropiado, se almacena y/o se lava en una disolución que comprende el polipéptido.

Los inventores han establecido además que pueden combinarse y usarse varios polipéptidos o derivados según la invención para prevenir o tratar una amplia variedad de infecciones/contaminaciones bacterianas (así como infecciones/contaminaciones virales). Por ejemplo, puede preferirse tratar una infección/contaminación bacteriana con una combinación de polipéptidos según uno cualquiera del primer, el segundo o el tercer aspectos, tal como un polipéptido seleccionado independientemente de un grupo que está constituido por GIN 1p, GIN 7, GIN 32, GIN 33 y GIN 34. Sin embargo, se apreciará que pueden usarse diferentes combinaciones de polipéptidos para tratar diferentes infecciones bacterianas.

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Además, los polipéptidos o derivados según la invención pueden usarse para minimizar, prevenir o tratar una contaminación bacteriana o un crecimiento bacteriano, mediante el uso como, o conjuntamente con, un conservante. Así, los polipéptidos o derivados pueden usarse como conservante en productos alimenticios. Además, los polipéptidos o derivados pueden usarse para minimizar o prevenir el crecimiento bacteriano en cultivos, por ejemplo, en trabajo de cultivo tisular, o bien para complementar, o bien para reemplazar a los antibióticos. Además, los polipéptidos pueden usarse como agentes selectivos como agente de diagnóstico, por ejemplo, para el crecimiento bacteriano en medios de cultivo. Por ejemplo, puede añadirse un primer polipéptido a los medios, que es particularmente activo frente a una primera bacteria, y puede añadirse un segundo polipéptido a los medios, que es particularmente activo frente a una segunda bacteria.

Ahora se describirán adicionalmente las realizaciones de la invención, a modo de ejemplo únicamente, con referencia a los siguientes ejemplos y figuras en las que:

la figura 1 ilustra el nivel de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa tras la exposición de un inóculo bacteriano a diversas concentraciones del péptido GIN 1p según la presente invención, o de una dilución simulada de PBSA;

la figura 2 es un gráfico de barras que ilustra el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa durante la noche sobre lentes de contacto Acuvue de Johnson and Johnson tras

\hbox{el pretratamiento con el péptido GIN 1p, o un 
tratamiento control;}

la figura 3 es una fotografía que muestra el aspecto de dos lentes de contacto tratadas con GIN1p y dos tratadas con control colocadas en cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos tras la incubación durante la noche;

la figura 4 es una micrografía óptica que muestra el aspecto de la superficie de una (i) lente de contacto tratada con control o una (ii) tratada con GIN1p tras la incubación durante la noche;

la figura 5 ilustra la reducción de MTT en células tratadas con diversos niveles de péptidos GIN durante 48 horas;

las figuras 6A, 6B y 6C ilustran la falta de efectos genotóxicos de los péptidos GIN 1p, GIN 33 y GIN 34, respectivamente, tal como se indica mediante un ensayo de genotoxicidad en levaduras;

la figura 7 ilustra el nivel de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa tras la exposición de un inóculo bacteriano a diversas concentraciones del péptido GIN 1p según la presente invención, que se ha sometido o no a tratamiento en autoclave, expresado como un % de crecimiento para las bacterias no tratadas;

la figura 8 ilustra lentes de contacto Acuvue de Johnson and Johnson, que se han tratado durante 15 min con GIN1p 40 \muM (que se había sintetizado con la adición de un residuo de cisteína que tenía un marcador fluorescente), se han lavado luego 4 veces, incluyendo un remojo durante la noche en 25 ml de PBS;

la figura 9 ilustra cubreobjetos de vidrio (BG), o cubreobjetos revestidos previamente con el biomaterial poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), que se habían tratado durante 15 min con GIN1p 40 \muM (que se había sintetizado con un marcador fluorescente), se han lavado luego 4 veces, incluyendo un remojo durante la noche en 25 ml de PBS;

la figura 10 muestra datos típicos de espectrometría de masas para GIN1p e ilustra que el péptido tenía una pureza >95%; y

la figura 11 muestra datos típicos de HPLC para GIN1p e ilustra que el péptido tenía una pureza >95%.

Ejemplos

Los inventores llevaron a cabo varios experimentos para investigar la actividad antibacteriana de los polipéptidos según la invención. Se investigó la actividad de los polipéptidos frente a Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus pneumoniae, así como la actividad antibacteriana de los polipéptidos sobre lentes de contacto. Además, los inventores llevaron a cabo pruebas de toxicidad y genotoxicidad, y también investigaron si los polipéptidos retenían su actividad antibacteriana tras la exposición a altas temperaturas, es decir, tras tratamiento en autoclave. Además, los inventores investigaron la capacidad de los polipéptidos para adherirse a una variedad de superficies, por ejemplo, lentes de contacto, vidrio y superficies revestidas con el biomaterial "PLGA".

Ejemplo 1

Evaluación de la eficacia antibacteriana

Disoluciones madre bacterianas - Se obtuvieron bacterias en disoluciones madre derivadas de ATCC de Oxoid Limited. Pseudomonas aeruginosa (cepa ATCC 9027) o Staphylococcus aureus (cepa ATCC 6538P) se obtuvieron en formato "Cultiloop". Se prepararon las disoluciones madre mediante la inoculación de 20 ml de caldo LB con un único Cultiloop e incubando durante la noche a 37ºC. Las células presentes tras la incubación durante la noche se recogieron eliminando los agregados de mayor tamaño mediante centrifugación (3000 g, 10 minutos) y retirando 16 ml del sobrenadante, que era probable que contuviera principalmente bacterias planctónicas. A esto se añadieron 4 ml de glicerol estéril (habiéndose esterilizado este último mediante tratamiento en autoclave). La suspensión resultante se dividió entre 15 x crioviales de 1 ml antes de congelar a -85ºC.

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Ensayo antibacteriano

Se llevaron a cabo experimentos preliminares para estimar la cantidad para diluir disoluciones madre bacterianas que con la adición de 25 \mul de disolución madre diluida a 100 \mul de caldo LB recién preparado darían como resultado bacterias en crecimiento en fase logarítmica tras la incubación durante la noche a 37ºC. Se encontró que esto correspondía a aproximadamente 40.000 ufc por pocillo en la inoculación.

Péptidos

Los péptidos (incluyendo los polipéptidos según la invención) se obtuvieron en forma liofilizada de un proveedor comercial (AltaBioscience, Universidad de Birmingham) y se produjeron a escala de 5 micromoles. El técnico experto conocerá las técnicas convencionales que están disponibles para sintetizar péptidos, una vez que se ha facilitado la secuencia de aminoácidos del péptido. Los extremos N-terminales se protegieron mediante la adición de un grupo acetilo y los extremos C-terminales se protegieron mediante la adición de un grupo amida. Se pesaron pequeñas cantidades del péptido en tubos Eppendorf estériles, antes de la adición de PBSA suficiente para producir disolución madre 0,4 mM, que se congeló a -85ºC en alícuotas.

El peso molecular de los péptidos se confirmó mediante espectrometría de masas por desorción láser usando un analizador de masas en tiempo de vuelo-MALDI Finnigan LASERMAT 2000 o un espectrómetro de masas MALDI-TOF de Scientific Analysis Group. Se realizó la purificación de los péptidos por HPLC usando una columna de fase inversa C-4 analítica Vydac, usando TFA al 0,1% y TFA al 0,1%/acetonitrilo al 80% como disolventes, o para algunos péptidos una columna de fase inversa C18 ACE, usando TFA al 0,05% y acetonitrilo al 60% como disolventes. En las figuras 10 y 11 se muestran los datos típicos de espectrometría de masas y perfiles de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) (pureza >95%) para el péptido GIN1p.

(a) Eficacia antibacteriana frente a Staphylococcus aureus

Se examinaron los péptidos para determinar la eficacia antibacteriana frente a Staphylococcus aureus. Los resultados se muestran en la tabla 5. Para someter a prueba la eficacia de los péptidos, se prepararon diluciones de los péptidos de prueba o PBS (para su uso como control) en caldo LB y se colocaron alícuotas de 100 \mul de las mismas en placas de 96 pocillos. Se descongeló un vial de disolución madre bacteriana planctónica en un incubador a 37ºC y se diluyó hasta el nivel que se había determinado previamente que produciría crecimiento en fase logarítmica tras la incubación durante la noche (véase anteriormente). Entonces se añadieron 25 \mul de esta dilución bacteriana a los pocillos de prueba (algunos pocillos que contenían caldo LB sin péptido se dejaron sin ninguna inoculación bacteriana, usándose estos como blanco). Tras el crecimiento durante la noche, se evaluó la concentración de bacterias en los pocillos individuales mediante la medición de la absorbancia a 620 nm, en un espectrofotómetro para microplacas. Se calculó la absorbancia promedio de los pocillos para concentraciones de péptidos específicas y a partir de esto también se calculó el porcentaje de inhibición (con respecto a los pocillos no tratados) y se representó gráficamente frente a la concentración (junto con una estimación de error con respecto a ese % de inhibición). Finalmente se estimó la concentración del péptido aproximada que inhibía el crecimiento bacteriano en un 50% a partir de esta figura para calcular el valor de CI_{50}.

En la tabla 5 se muestra la eficacia de los péptidos sometidos a prueba. Cualquier péptido con un valor de CI_{50} inferior a o igual a aproximadamente 40 \muM se consideró ineficaz.

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TABLA 5 Actividad de péptidos derivados de apoE frente a Staphylococcus aureus

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La tabla 5 ilustra que los polipéptidos según el primer, segundo o tercer aspecto de la invención tenían buena eficacia antibacteriana, mientras que los péptidos que caen fuera del alcance de la invención (por ejemplo, GIN 6, 22 ó 39) no eran eficaces.

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(b) Eficacia antibacteriana frente a Pseudomonas aeruginosa

Los péptidos según la invención también se examinaron para determinar la eficacia antibacteriana frente a Pseudomonas aeruginosa usando la misma técnica descrita anteriormente para calcular los valores de CI_{50}. En la tabla 6 se muestran los péptidos según la invención que se sometieron a prueba.

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TABLA 6 Actividad de péptidos derivados de apoE frente a Pseudomonas aeruginosa

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La tabla 6 ilustra además que los polipéptidos según el primer, segundo o tercer aspecto de la invención tenían buena eficacia antibacteriana, mientras que los péptidos que caen fuera del alcance de la invención (por ejemplo, GIN 6, 10, 12, 22, 28, 39 ó 43) no eran eficaces.

En referencia a la figura 1, se muestra el nivel de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa tras la exposición de un inóculo bacteriano a diversas concentraciones de GIN 1p (un polipéptido según la presente invención), o de una dilución simulada de PBSA. Los puntos se obtuvieron dividiendo el promedio para seis pocillos tratados entre el promedio para seis pocillos no tratados, y las barras muestran una estimación del error para estos valores calculados. La figura 1 muestra claramente la eficacia antibacteriana de GIN 1p (SEC ID Nº 6) a una concentración de aproximadamente 4 \muM e indica que GIN 1p tiene una concentración CI_{50} de aproximadamente 3 \muM.

En resumen, los polipéptidos según la invención muestran actividad antibacteriana tanto frente a S. aureus como frente a P. aeruginosa.

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(c) Revestimiento con polipéptidos antibacterianos

Los polipéptidos según la invención pueden usarse para revestir dispositivos médicos propensos a contaminación con bacterias. Los ejemplos de tales dispositivos médicos incluyen lentes, catéteres, endoprótesis, apósitos para la cicatrización de heridas y dispositivos anticonceptivos. Los polipéptidos también pueden aplicarse a superficies en entornos médicos, incluyendo superficies de equipos para su uso en quirófanos.

El revestimiento de una superficie puede llevarse a cabo preparando una disolución acuosa concentrada del polipéptido (por ejemplo, 200 \muM) a un pH apropiado (por ejemplo, pH 7,4) para el polipéptido específico. Entonces, la superficie se expone a la disolución acuosa a una temperatura adecuada (por ejemplo, 37ºC) durante un tiempo suficiente (por ejemplo, 2 horas) para permitir la inmovilización o absorción de una cantidad adecuada del polipéptido a la superficie de la misma.

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(d) Experimento para someter a prueba la eficacia antibacteriana en lentes de contacto

Los inventores han descubierto que las lentes de contacto, cuando se incuban previamente con disoluciones de los polipéptidos según la invención, se vuelven resistentes a la infección bacteriana. En referencia a la figura 2, se muestra un gráfico de barras que ilustra el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa durante la noche sobre lentes de contacto Acuvue de Johnson and Johnson tras el pretratamiento con el polipéptido GIN 1p, o un tratamiento control. El crecimiento se midió mediante examen al microscopio óptico o mediante la evaluación de la actividad metabólica de cualquier bacteria presente usando reducción de MTT. Los datos ilustran la eficacia de la naturaleza antibacteriana de los péptidos según la invención cuando se aplican a lentes de contacto. La actividad antibacteriana se evaluó midiendo la reducción de MTT.

Se colocaron las lentes en placas de 24 pocillos antes del tratamiento con 75 \mul de GIN-1p 250 \muM en PBS (pH 7,4) o con 75 \mul de PBS y se incubaron durante 2 horas a 37ºC, antes de la eliminación de estas disoluciones de la lente mediante aspiración. Entonces se añadió un 1 ml de PBS adicional a los pocillos para eliminar mediante lavado cualquier péptido unido de manera débil, antes de la aspiración de esta disolución de lavado. Finalmente, se añadió 1 ml de caldo LB al 20% (v/v) en PBS a cada pocillo, conteniendo este último 10^{4} microorganismos de exposición (una cantidad que se aproxima al nivel de exposición probable que resultaría apropiado para el ojo). Los cálculos sugieren que incluso si no fuera completa la aspiración de la disolución de polipéptido inicial o la disolución de lavado, la concentración de polipéptido transferida y todavía presente en el sistema en disolución (es decir, simplemente como una dilución de la disolución madre del péptido original) sería inferior a 200 nM, lo que sería demasiado bajo por sí mismo para inhibir la infección bacteriana.

Las placas se devolvieron al incubador a 37ºC durante la noche. Tras incubación durante aproximadamente 15 h, algunas de las lentes se expusieron a disolución de MTT a 2 mg/ml y se incubaron durante una hora adicional a 37ºC. Las lentes restantes se examinaron tanto usando un microscopio óptico (Olympus IX70) como sin ampliación. Las lentes tratadas con MTT se extrajeron de la disolución de MTT tras la incubación adicional y se colocaron en 1 ml de DMSO para solubilizar cualquier cristal azul de formazán producido debido a la actividad metabólica de cualquier bacteria presente. El grado de producción de formazán se evaluó midiendo la absorbancia a 540 nm para alícuotas de estas disoluciones; estos valores se muestran en la figura 2 y representan el promedio para cuatro lentes, mostrando las barras la desviación estándar.

En referencia a la figura 3, se muestra una fotografía que muestra el aspecto de dos lentes de contacto tratadas con GIN1p (lado derecho de la figura 3) y dos lentes de contacto tratadas con control (lado izquierdo de la figura 3) colocadas en cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos tras la incubación durante la noche. La figura muestra claramente que las dos lentes de contacto tratadas con GIN1p son menos propensas a desarrollar una infección bacteriana. La disolución de reacción que contiene las dos lentes control, que no se pretrataron con un polipéptido según la invención, son turbias, lo que indica que las bacterias están creciendo en ellas. Sin embargo, las disoluciones que contienen las dos lentes de contacto pretratadas con GIN1p son incoloras, lo que indica que se ha minimizado la mayor parte de cualquier crecimiento bacteriano.

En referencia a la figura 4, se muestra una micrografía óptica que muestra el aspecto de la superficie de (i) la lente de contacto tratada con control y (ii) la lente de contacto tratada con GIN1p tras la incubación durante la noche. La figura 4 muestra claramente que la lente tratada con control está cubierta de crecimiento bacteriano, mientras que la lente tratada con GIN1p muestra un crecimiento bacteriano mínimo. Así, el polipéptido GIN1p, según la invención, muestra claramente actividad antibacteriana.

Así, los inventores sugieren que cualquier procedimiento de inmovilización de estos polipéptidos sobre las lentes en una forma antimicrobiana activa reducirá el riesgo de reacciones adversas relacionadas con microbios en usuarios de lentes de contacto, tal como la queratitis microbiana.

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(e) Ensayos de toxicidad

En referencia a la figura 5, se muestra la reducción de MTT en células tratadas con diversos niveles de GIN1p y GIN 16 durante 48 horas.

Se mantuvieron células de riñón de mono verde africano (Vero) en medio esencial mínimo de Eagle con sal de Earle (EMEM) y se complementaron con el 10% suero bovino fetal (inactivado con calor), L-glutamina 4 mM y el 1% (v/v) de aminoácidos no esenciales, más penicilina y estreptomicina (100 U.I./mg y 100 mg/ml, respectivamente) (medio de mantenimiento denominado en lo sucesivo EMEM al 10%). Se incubaron las células a 37ºC en una atmósfera humidificada de aire con el 5% de CO_{2}. En la recogida, se lavaron las monocapas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se desplazaron mediante la incubación con tripsina en PBS durante 30 min, antes de inactivar la tripsina mediante la adición de un volumen igual de EMEM al 10% y la centrifugación a 500 g (5 min, 4ºC).

Se sembraron las células Vero en placas de 96 pocillos a 30.000 células por pocillo en 100 \mul de EMEM al 10%. Tras el crecimiento durante la noche, se aspiró suavemente el medio y se reemplazó por EMEM al 10% que contenía diversas concentraciones de péptidos o en algunos casos sólo EMEM al 10%. Se devolvieron las células al incubador durante 48 h antes de la adición de 25 \mul de disolución de MTT 1,5 mg/ml (preparada en EMEM al 0,5%, luego filtrada a través de un filtro estéril de 0,22 \mum). Entonces se devolvieron las placas al incubador durante una hora. Finalmente, se eliminó el medio de los pocillos y se solubilizó cualquier cristal azul de formazán mediante la adición de 100 \mul de dimetilsulfóxido (DMSO). Entonces se midió la absorbancia de las disoluciones resultantes a 570 nm y el efecto tóxico se expresó como un porcentaje del valor control para cada concentración de péptido. Cuando fue posible, se calculó la CE_{50} a partir de representaciones gráficas del efecto tóxico frente a la concentración de péptido. Afortunadamente, no se encontró evidencia de toxicidad para la línea celular sometida a prueba usando el péptido a 40 \muM expuesto a las células durante 2 días.

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(f) Genotoxicidad

Adicionalmente, los inventores han descubierto que a pesar del alto número de cargas positivas en estos péptidos, tienen poca o ninguna actividad genotóxica, tal como se reveló mediante el ensayo de genotoxicidad GreenScreen GC de Gentronix (Gentronix Ltd., 72 Sackville St, Manchester, M60 1QD, RU), que se usó para someter a prueba los péptidos GIN1p, GIN 33 y GIN 34, y tal como se resume en las figuras 6A-6C.

Se usa un robot de manipulación de líquidos para producir una serie de diluciones en serie de cada compuesto de prueba en una microplaca negra de 96 pocillos con una base ópticamente transparente. Cada dilución del compuesto de prueba se combina con un volumen igual de un medio de crecimiento especializado que contiene células de levadura de Saccharomyces cerevisiae (cepa GenT01: véase Mutation Research, 2000, 464 297-308 para más detalles sobre las propiedades de estas cepas modificadas) para dar una concentración y un volumen finales fijos de células. Además, se desarrolla una serie de patrones genotóxicos y citotóxicos y controles no tóxicos para proporcionar un control de calidad interno. Las placas se cubren con una membrana transpirable y se incuban durante la noche, sin agitación, a 25ºC.

Tras la incubación, se destapan las microplacas y se recogen los datos usando un lector de microplacas Tecan Ultra 384. Este instrumento proporciona mediciones de fluorescencia y absorbancia de la luz en microplacas; se usa un juego de filtros con fluoresceína convencionales (excitación 485/25 y emisión 535/25). La absorbancia se lee a 620 nm y es proporcional a la proliferación celular (que está disminuida por los analitos tóxicos). La fluorescencia es proporcional a la actividad del sistema de reparación del ADN (aumentada por los analitos genotóxicos). Los cultivos de levaduras usados son una cepa modificada genéticamente que expresa una proteína fluorescente verde siempre que las células llevan a cabo la reparación del daño en el ADN. La fluorescencia se normaliza para la señal de absorbancia para corregir la variación en el rendimiento celular producido por cualquier actividad citolítica de los compuestos de prueba frente a las células de levadura. Esto produce una medición de la "fluorescencia por célula" denominada "brillo". Además de la cepa de levadura del ensayo Gentronix (GenT01), también se usa una cepa control de Saccharomyces cerevisiae (GenC01) que es idéntica excepto porque su capacidad para producir proteína fluorescente verde está desactivada. Esta cepa se usa para proporcionar un control para permitir la corrección para sustancias que o bien pueden ser autofluorescentes por sí mismas o bien inducen una autofluorescencia en las células de levadura. Los datos recogidos se transfieren simplemente a una plantilla de Excel en la que se producen automáticamente hojas de evaluación de resultados. Las hojas contienen los resultados procesados tanto en formato gráfico como tabulado, con una evaluación automática del resultado, es decir, positivo o negativo, y el cálculo de la menor concentración eficaz (LEC), tanto para la genotoxicidad como para la citotoxicidad.

En referencia a la figuras 6A-6C, se muestra un ensayo de genotoxicidad en levaduras obtenido para los polipéptidos GIN 1p, GIN 33 y GIN34, respectivamente. La cepa control (GenC01) se comportó tal como se esperaba siendo evidente poca autofluorescencia en esta cepa en presencia de los polipéptidos, aunque no obstante los datos obtenidos usando la cepa de prueba (GenT01) se corrigieron para tener en cuenta este fondo mínimo. La figuras 6A-6C muestran que ninguno de los tres polipéptidos produjo ninguna respuesta genotóxica en la cepa de levadura de prueba (GenT01), con valores para las concentraciones del polipéptido de hasta e incluyendo 100 \muM, lo que no alcanza claramente el umbral requerido para que se indique la genotoxicidad.

En conclusión, los resultados indican la eficacia antibacteriana de los polipéptidos según la presente invención. En particular, los polipéptidos GIN 34 (SEC ID Nº 12), GIN 33 (SEC ID Nº 16), GIN 32 (SEC ID Nº 8), GIN 1p (SEC ID Nº 6), GIN 7 (SEC ID Nº 7), GIN 41 (SEC ID Nº 10), GIN 2 (SEC ID Nº 3), GIN 8 (SEC ID Nº 11) y GIN 11 (SEC ID Nº 4) mostraron actividad antibacteriana sin ningún efecto adverso sobre la genotoxicidad.

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Ejemplo 2

Los polipéptidos retienen su eficacia tras tratamiento en autoclave

Para someter a prueba el efecto del tratamiento de los polipéptidos según la invención mediante el autoclave, se preparó una disolución madre 400 \muM de GIN1p en PBS y se colocaron alícuotas de 420 \mul en cuatro tubos Eppendorf (con tapas de rosca). Tras asegurar las tapas, se cargaron dos de los tubos en una gradilla metálica contenida dentro de un vaso de precipitados de Pyrex y se colocaron en un autoclave Prestige Medical Clinical. Los dos tubos restantes se dejaron sin tratar, como control. Entonces se activó el autoclave y realizaron dos ciclos de autoclave, implicando cada uno la exposición de las disoluciones de péptido a 126ºC durante 11 min. Finalmente, se sometió a prueba la eficacia de las dos muestras de péptido tratadas en autoclave y control frente a P. aeruginosa tal como se describió anteriormente.

En referencia a la figura 7, se muestra el nivel de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa tras la exposición de un inóculo bacteriano a diversas concentraciones de GIN 1p (apolipéptido según la presente invención) que se había sometido o no a tratamiento en autoclave, expresado como un % de crecimiento para las bacterias no tratadas. Tal como puede observarse, los valores de CI_{50} para las cuatro muestras fueron idénticos (alrededor de 2 \muM, tal como se muestra en la figura 7). En consecuencia, los polipéptidos según la invención son por tanto adecuados para su uso con productos que normalmente se esterilizarían sometiendo a tratamiento en autoclave durante el procedimiento de fabricación.

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Ejemplo 3

Los polipéptidos se adhieren a lentes de contacto, a vidrio y a superficies revestidas con el biomaterial "PLGA"

Para someter a prueba si los péptidos según la invención podrían inmovilizarse sobre un biomaterial u otras superficies, los inventores obtuvieron una forma marcada de manera fluorescente de GIN1p (Advanced Biomedical, Oldham, RU). Se preparó una disolución madre 40 \muM en PBS de este polipéptido marcado y se introdujeron alícuotas de 250 \mul en los pocillos de una microplaca de 24 pocillos. Los inventores colocaron entonces varios materiales en estas disoluciones de péptido, siendo éstas: (i) lentes de contacto Acuvue de Johnson and Johnson; (ii) cubreobjetos de vidrio en bruto; o (iii) cubreobjetos revestidos previamente con el biomaterial poli(lactida-co-glicolida) (PLGA: portaobjetos proporcionados por el catedrático Jian Lu, Departamento de Física, Universidad de
Manchester).

Tras la incubación a 20ºC durante 15 min en las disoluciones de péptido, se retiraron los materiales y luego se lavaron colocándolos en 1 ml de PBS. Entonces se examinaron los materiales mediante microscopía de fluorescencia (usando un microscopio de inversión Olympus IX70 equipado con un juego de filtros Chroma 35002v2) y los resultados se registraron mediante fotografía. Entonces se lavaron los materiales dos veces más en 1 ml de PBS y luego se dejaron en remojo finalmente durante la noche a 37ºC en 25 ml de PBS. Se observó el nivel de fluorescencia y se registró tras cada lavado, de nuevo mediante observación al microscopio y fotografía, tal como se describió anteriormente.

En referencia a la figura 8, se muestran lentes de contacto Acuvue de Johnson and Johnson que se habían tratado durante 15 min con GIN1p 40 \muM (que se había sintetizado con un marcador fluorescente), luego se lavaron 4 veces, incluyendo un remojo durante la noche en 25 ml de PBS. La figura 8(a) muestra una lente no tratada y una lente tratada con GIN1p (tras 4 lavados), bajo iluminación con luz blanca, o fluorescencia de GFP, usando un microscopio Olympus IX70. Así, incluso tras el lavado repetido, la lente retiene una cantidad significativa de péptido, de manera que es visible la fluorescencia incluso a simple vista, tal como se muestra en la figura 8(b). Las imágenes se capturaron usando una cámara digital Canon EOS300D, usando un ajuste de película de ISO1600 y con un tiempo de exposición de 0,3 s para las imágenes fluorescentes.

En referencia a la figura 9, se muestran cubreobjetos de vidrio (BG), o cubreobjetos revestidos previamente con el biomaterial poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), que se habían tratado durante 15 min con GIN1p 40 \muM (que se había sintetizado con un marcador fluorescente), luego se lavaron 4 veces, incluyendo un remojo durante la noche en 25 ml de PBS. El nivel de fluorescencia se observó usando un microscopio Olympus IX70 para las muestras tras cada lavado (W1, W2, W3 y W4). Así, puede observarse que el nivel de fluorescencia no disminuyó notablemente tras ninguno de los lavados, lo que sugiere que el polipéptido se adhiere firmemente a una variedad de superficies. Las imágenes se capturaron usando una cámara digital Canon EOS300D, con un tiempo de exposición de 5 s usando un ajuste de película de ISO1600.

En consecuencia, las figuras 8 y 9 muestran que los tres tipos de material parecían retener niveles similares de GIN1p a pesar del lavado exhaustivo, lo que sugiere que el polipéptido es adecuado para revestir diversas superficies (tal como se muestra en la figura 8a y en la figura 9). En particular, se encontró que las lentes de contacto absorbían cantidades significativas del polipéptido (presumiblemente debido a su gran área superficial), de manera que la fluorescencia era claramente visible a simple vista, incluso tras el cuarto lavado durante la noche, tal como se muestra en la figura 8b.

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Ejemplo 4

Eficacia antibacteriana frente a P. aeruginosa, S. aureus y S. pneumoniae

El inventor construyó una biblioteca ampliada de péptidos derivados de o bien apolipoproteína B o bien apolipoproteína E con el fin de evaluar adicionalmente los polipéptidos según la invención. Luego se realizaron experimentos adicionales para investigar la actividad antibacteriana de esta biblioteca de péptidos frente a las bacterias P. aeruginosa, S. aureus y S. pneumoniae. Los procedimientos usados para determinar los valores de CI_{50} para cada péptido fueron tal como se describe en el ejemplo 1. A diferencia de los valores de CI_{50} medidos en el ejemplo 1, los valores medidos en el ejemplo 4 fueron inferiores o iguales a aproximadamente 60 \muM.

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La tabla 7 proporciona los datos para péptidos que se derivan de apoE.

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TABLA 7 Péptidos derivados de apolipoproteína E

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A partir de la tabla 7 se observará que los polipéptidos según la presente invención muestran actividad antibacteriana frente a al menos una, si no dos y si no las tres, de las tres cepas bacterianas diferentes evaluadas. En particular, MU 4, MU 7, MU 10, MU 43, MU 58, MU 59, MU 60, MU 61, MU 82, MU 83, MU 112, MU 115 y GIN34 son particularmente eficaces. Puede observarse que son ineficaces una variedad de péptidos, que caen fuera de la definición de los polipéptidos según la invención.

Se observará que la actividad antibacteriana del polipéptido MU 10 (repetición en tándem) es mucho mayor que la de MU43 (monómero), lo que ilustra la sorprendente propiedad de que las repeticiones en tándem según la invención son agentes antibacterianos eficaces. Los péptidos, que no muestran actividad antibacteriana caen fuera del alcance de la invención, por ejemplo, MU 3, MU 12, MU 19, GIN 5.

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La tabla 8 presenta los datos para péptidos que are se derivan de apoB.

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TABLA 8 Péptidos derivados de apolipoproteína B

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A partir de la tabla 8 se observará que los péptidos según la presente invención muestran actividad antibacteriana frente a al menos una, si no dos y si no las tres, de las tres cepas bacterianas diferentes evaluadas. En particular, MU 24, MU 28, MU 37, MU 73, MU 30 y MU 32 son todas particularmente eficaces.

Se apreciará que los que péptidos que no muestran actividad antibacteriana o bien: (i) no son repeticiones en tándem; (ii) no comprenden al menos dos motivos RKR; o bien (iii) están constituidos por sustituciones de aminoácidos que no se permiten o se proporcionan en las fórmulas facilitadas en el presente documento.

MU 84 es un ejemplo de un trímero, es decir, una repetición en tándem que comprende tres monómeros.

Claims

1. Uso de un polipéptido, o un derivado o análogo del mismo, que comprende repeticiones de un péptido derivado de una región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de una apolipoproteína para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana, en el que el polipéptido, derivado o análogo del mismo, comprende al menos dos repeticiones con un motivo RKR.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el péptido se deriva de una región de unión al receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) de apolipoproteína B o apolipoproteína E.

3. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el péptido se deriva de una agrupación B de dominios de unión al receptor de LDL de apolipoproteína B, o de una agrupación B de dominios de unión al receptor de LDL de apolipoproteína E.

4. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido comprende una repetición de dímero en tándem de: SEC ID Nº 1; SEC ID Nº 2; SEC ID Nº 96; o un derivado de la misma en el que al menos un residuo de aminoácido, distinto de los motivos RKR, se reemplaza por una arginina (R), tirosina (Y), metionina (M), isoleucina (I), fenilalanina (F), triptófano (W) o un derivado de los mismos.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que el residuo reemplazado o sustituido es el primer, segundo, tercer, séptimo, octavo, noveno, décimo, undécimo, duodécimo, decimosexto, decimoséptimo o decimoctavo residuo del polipéptido.

6. Uso según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que la al menos una sustitución de aminoácido es un residuo de fenilalanina (F) o un residuo de triptófano (W) o un derivado de los mismos.

7. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido tiene la fórmula:

(fórmula I)\{abcRKRxyz\}\ +\ \{a'b'c'RKRx'y'z'\}

en la que

a y a' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o están delecionados;

b y b' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); o están delecionados;

c y c' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o treonina (T); o están delecionados;

x y x' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o glicina (G); o están delecionados;

y e y' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o están delecionados;

z y z' = se seleccionan independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H); o están delecionados.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el polipéptido comprende al menos un aminoácido adicional, que puede seleccionarse independientemente de arginina (R); tirosina (Y); metionina (M); isoleucina (I); fenilalanina (F); triptófano (W); leucina (L); lisina (K); histidina (H), y ese aminoácido adicional se añade antes del aminoácido en la posición "a" en el péptido de fórmula I en el extremo N-terminal.

9. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido comprende: una repetición del péptido apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1) o un truncamiento de la misma; o una repetición de una variante del péptido apoE_{141-149} en la que al menos un residuo de leucina (L) se reemplaza por triptófano (W), arginina (R), lisina (K), tirosina (Y) o fenilalanina (F).

10. Uso de un polipéptido que comprende: una repetición del péptido apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1) o un truncamiento de la misma; o una repetición de una variante del péptido apoE_{141-149} en la que al menos un residuo de leucina (L) se reemplaza por triptófano (W), arginina (R), lisina (K), tirosina (Y) o fenilalanina (F), para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana, en el que el truncamiento o la variante comprende al menos un motivo RKR.

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11. Uso según la reivindicación 10, en el que el polipéptido comprende una repetición de apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1) o un truncamiento de la misma, caracterizado porque al menos un residuo de leucina (L) se reemplaza por un residuo de triptófano (W) o de fenilalanina (F).

12. Uso según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que la repetición en tándem comprende al menos dos sustituciones seleccionadas independientemente de sustituciones de triptófano (W), arginina (R), lisina (K), tirosina (Y) o fenilalanina (F).

13. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos: LRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 3); LRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 6); WRKWRKRWWWRKWRKR
WW (SEC ID Nº 7); WRKWRKRWRKWRKR (SEC ID Nº 8); WRKWRKRWWLRKLRKRLL (SEC ID Nº 9); YRKYRKRYYYRKYRKRYY (SEC ID Nº 10); LRKLRKRLRKLRKR (SEC ID Nº 11); LRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 3); FRKFRKRFFFRKFRKRFF (SEC ID Nº 48); WRKWRKRWWRKWRKRWW (SEC ID Nº 63); WRKWRKRWRKWRKRW (SEC ID Nº 64); WRKWRKRWWFRKWRKRWW (SEC ID Nº 65); WRKWRKRFFWR
KWRKRFF (SEC ID Nº 66); WRKRWWRWRKRWWR (SEC ID Nº 67); LRKLRKRLLRLRKLRKRLLR (SEC ID Nº 68); WRKWRKRWWRWRKWRKRWWR (SEC ID Nº 69); LRKLRKRLLWRKWRKRWW (SEC ID Nº 70); LRKLRKRLLLRKLRKRWW (SEC ID Nº 71); LRKLRKRLLWRKWRKRLL (SEC ID Nº 72); WRKWRKR
LLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 73); WRKLRKRLLLRKLRKRLL (SEC ID Nº 74); WRKWRKFFFRKWRKRWW (SEC ID Nº 75); o WRKWRKRWWFRKFRKRFF (SEC ID Nº 76).

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el polipéptido comprende repeticiones de un péptido derivado de una región de unión al receptor de HSPG de apoB.

15. Uso de un polipéptido, o un derivado o análogo del mismo, que comprende repeticiones de un péptido derivado de una región de unión al receptor de HSPG de apolipoproteína B para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana, en el que el polipéptido o derivado o análogo del mismo comprende al menos dos repeticiones con un motivo RKR.

16. Uso según la reivindicación 14 ó 15, en el que el polipéptido se deriva de una agrupación B de dominios de unión al receptor de LDL de apolipoproteína B.

17. Uso según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que el polipéptido comprende una repetición de apoB_{3359-3367} (SEC ID Nº 2) o un truncamiento o una variante de la misma.

18. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el polipéptido tiene la secuencia de RLTRKCRGLKRLTRKRGLK (SEC ID Nº 12) o un truncamiento de la misma, en el que al menos un residuo de aminoácido, distinto de los motivos RKR, se ha reemplazado por un residuo de glicina (G), treonina (T), histidina (H), triptófano (W), arginina (R) o leucina (L) o derivados de los mismos.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que el al menos un residuo de aminoácido se ha reemplazado por un residuo de triptófano (W), arginina (R) o leucina (L) o derivados de los mismos.

20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que el polipéptido tiene la fórmula:

(fórmula IV)\{abcRKRxyz\}\ +\ \{a'b'c'RKRx'y'z'\}

en la que

21. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que el polipéptido es: RTRKRGRRTRKRGR (SEC ID Nº 13); LRKRKRLLRKRKRL (SEC ID Nº 14); LRKRKRLRKLRKRKRLRK (SEC ID Nº 15); WRWRKRW
RKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 16); LLRKRLKRLLLRKRLKRL (SEC ID Nº 80); RRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 83); KRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 84); LRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 85); HRWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 86); RWRKRWRKWRWRKRWRK (SEC ID Nº 87); RRWRKRWRK
RRWRKRWRK (SEC ID Nº 88); LRWRKRWRKLRWRKRWRK (SEC ID Nº 89); HRWRKRWRKHRWRKRWRK (SEC ID Nº 90); RWRKRWRKRWRKRWRK (SEC ID Nº 91); RWRKRGRKRWRKRGRK (SEC ID Nº 92); RWRKR
WRKRWRKRWRK (SEC ID Nº 93); RKRGWKWRKRGWKW (SEC ID Nº 94); o RLTRKRGRLTRKRG (SEC ID Nº 95).

22. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el polipéptido tiene la secuencia de RLTRKRGLKRLTRKRGLK (SEC ID Nº 12).

23. Un polipéptido que comprende una repetición del péptido apoE_{141-149} (SEC ID Nº 1), caracterizado porque al menos un residuo de leucina (L) se reemplaza por tirosina (Y) o fenilalanina (F).

24. Un polipéptido que está constituido por una secuencia de aminoácidos de: SEC ID Nº 67 (MU 81); SEC ID Nº 94 (MU 73) o SEC ID Nº 95 (MU 74).

25. Polipéptidos según la reivindicación 23 ó 24, para su uso como medicamentos.

26. Uso de polipéptidos según la reivindicación 25 o la SEC ID Nº 80 (MU 24), para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana.

27. Uso de polipéptidos según cualquier reivindicación anterior para tratar infecciones por Staphylococcus, Pseudomonadales o Streptococci.

28. Un polipéptido, o un derivado o análogo del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-27, para su uso como medicamento para tratar una infección bacteriana.

29. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24.

30. Un procedimiento de prevención y/o tratamiento de una contaminación bacteriana de una superficie o un objeto inanimado que comprende revestir la superficie o el objeto que lo necesita con una cantidad de un polipéptido según cualquier reivindicación anterior que es eficaz para destruir o prevenir el crecimiento de bacterias.

31. Un procedimiento según la reivindicación 30, en el que se reviste un objeto y se selecciona de: dispositivos médicos, lentes, lentes de contacto, catéteres, endoprótesis, apósitos para la cicatrización de heridas, anticonceptivos, implantes quirúrgicos y articulaciones de sustitución.

32. Un procedimiento según la reivindicación 30, en el que se reviste una superficie y la superficie se selecciona de: superficies de salas de hospital, superficies de quirófanos, superficies de la cocina y superficies de sanitarios.

33. Una lente de contacto al menos parcialmente revestida con un péptido, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-27.