ES2324899T3 - Microorganismo productor de acido 5'-inosinico y proceso para producir acido 5'-inosinico usando el mismo. - Google Patents
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Abstract
Un Corynebacterium ammoniagenes CJIP009 que tiene el número de acceso KCCM-10226, caracterizado por que acumula ácido 5''-inosínico en una alta concentración y rendimiento mediante una fermentación directa y tiene resistencia a análogos de L-glutamina seleccionados de azaserina o 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) y resistencia a análogos de L-prolina seleccionados de 3,4-deshidroprolina, ácido L-azetidin-2-carboxílico, ácido L-tiazolidin-4-carboxílico, ácido (S)2,2-dimetil-4-oxazolidocarboxílico, ácido (S)-5,5-dimetil-4-tiazolidocarboxílico, ácido (4S, 2RS)- 2-etil-4-tiazolin-carboxílico, ácido (2S, 4S)-4-hidroxi-2-pirrolin-carboxílico, ácido 2-piperidincarboxílico o 2,5-pirrolidindiona.
Description
Microorganismo productor de ácido
5'-inosínico y proceso para producir ácido
5'-inosínico usando el mismo.
La presente invención se refiere a un nuevo
microorganismo que produce ácido 5'-inosínico y a un
proceso para producir ácido 5'-inosínico usando el
mismo.
El ácido 5'-inosínico es un
material intermedio del sistema metabólico de la biosíntesis de
ácidos nucleicos que se usa en una diversidad de campos, como
alimentos y medicinas, y en diversas clases de áreas médicas, y
tiene un significado fisiológicamente importante en animales y
plantas y, en particular, es uno de los condimentos de tipo ácido
nucleico que se destacan como condimentos saborizantes que tienen un
efecto sinérgico cuando se usan con glutamato sódico.
Se han conocido en este campo los procesos para
producir ácido 5'-inosínico mediante una
fermentación directa y la clave importante en los aspectos
económicos era producir ácido 5'-inosínico en una
alta concentración y rendimiento.
Tomita K et al. (1991, Agricultural and
Biological Chemistry 55 (9): 2221-2225) describe el
efecto de L-prolina sobre la producción de ácido
5'-inosínico a partir de una cepa mutante de
Corynebacterium ammoniagenesis, KY10895.
El documento
EP-A-0 816 491 describe una proteína
que tiene actividad inosina-guanosina quinasa. El
documento D2 describe adicionalmente un método para producir ácido
5'-inosínico o ácido 5'-guanílico
empleando un microorganismo capaz de reproducir ATP y transformado
con un gen que codifica la inosina-guanosina
quinasa.
El documento
JP-A-2 312 595 describe cepas
mutantes de Corynebacterium ammoniagenes y su uso en la
producción de ácido 5'-inosínico.
Los presentes inventores realizaron estudios
exhaustivos para desarrollar una nueva cepa capaz de lograr los
propósitos mencionados anteriormente y, como resultado, descubrieron
un nuevo microorganismo que producía ácido
5'-inosínico mediante una fermentación directa en
una alta concentración y rendimiento.
La presente invención proporciona un
Corynebacterium ammoniagenes CJIP009
(KCCM-10226) caracterizado por que acumula ácido
5'-inosínico en una alta concentración y rendimiento
mediante una fermentación directa y por que tiene resistencia a
análogos de L-glutamina seleccionados de azaserina o
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON) y resistencia a análogos de L-prolina
seleccionados de 3,4-deshidroprolina, ácido
L-azetidin-2-carboxílico,
ácido
L-tiazolidin-4-carboxílico,
ácido
(S)-2,2-dimetil-4-oxazolidocarboxílico,
ácido
(S)-5,5-dimetil-4-tiazolidocarboxílico,
ácido
(4S,2RS)-2-etil-4-tiazolin-carboxílico,
ácido
(2S,4S)-4-hidroxi-2-pirrolin-carboxílico,
ácido 2-piperidincarboxílico o
2,5-pirrolidindiona.
La presente invención también proporciona un
proceso para producir ácido 5'-inosínico
caracterizado por el cultivo de Corynebacterium ammoniagenes
CJIP009 (KCCM-10226) seguido de recogida de las
sustancias cultivadas.
De acuerdo con la presente invención, un
microorganismo, un mutante de Corynebacterium ammoniagenes
(ATCC-6872), requiere adenina pero no requiere
xantina o guanina, aunque se facilita el crecimiento por adición de
los mismos, en comparación con un mutante parcial de adenina
convencional que produce ácido 5'-inosínico [Agr.
Bio. Chem., Vol 47 (5), págs. 1035\sim1041, 1983, (KY13102,
KY13171, KY13184, etc.)], o el microorganismo que requiere
simultáneamente adenina y xantina o guanina.
Además, el microorganismo de la presente
invención carece de ureasa para asimilar urea y tiene una alta
sensibilidad a lisozima, una enzima de degradación de la pared
celular, considerándose que su capacidad de síntesis de pared
celular está parcialmente perdida, de modo que se secretan
fácilmente fuera de la célula grandes cantidades de ácido
5'-inosínico producido intracelularmente.
Balabushevich, M. I. y Kazarinova, L. A., et
al (Prikl. Biokhim. Mikrobiol., 19 (5), 590\sim598,1983),
Rusia, han descubierto que la adición de estreptomicina y kanamicina
al medio mejora la permeabilidad y contribuye a la acumulación de
ácido 5'-inosínico en el medio. Considerando esto,
se contempló que se habría descubierto un mutante capaz de producir
ácido 5'-inosínico en una alta concentración y
rendimiento por introducción de la resistencia a estreptomicina en
una cepa conocida para aumentar la permeabilidad de membrana del
microorganismo. Después, se contempló que podía evitarse la
contaminación que se produce con frecuencia en la fermentación
usando el mutante anterior y añadiendo la estreptomicina al medio.
Por lo tanto, los presentes inventores obtuvieron una cepa que
tiene resistencia a una alta concentración de estreptomicina y
estudiaron las propiedades de la cepa. En la práctica, se identificó
que la introducción de la resistencia a estreptomicina en una alta
concentración en la cepa evita eficazmente la contaminación que se
produce durante la fermentación.
En la mayoría de las bacterias se acumulan ión
calcio y solutos orgánicos, es decir, osmolitos, mediante el método
de mejora de la presión osmótica intracelular de bacterias para
evitar la deshidratación osmótica bajo presión osmótica extracelular
de bacterias. Como dichos osmolitos, se han conocido
L-prolina, L-glutamato, azúcar,
derivados de aminoácidos N-metilados, etc. Entre
ellos, se ha sabido que la L-prolina es un factor
importante de osmorregulación y se ha descrito que en
Brevibacterium typhimurium [Agr. Bio. Chem., Vol 53 (9),
págs. 2475-2479, 1989] se acumulaba
intracelularmente L-prolina al aumentar la actividad
de la pirrolin-5-carboxilato
reductasa, que es la enzima importante de la ruta de biosíntesis de
la prolina, en la condición osmótica de ácido
5'-inosínico extracelular aumentado. Aparte, se
describió [J, Bacteriol., Vol 163, pág. 296, 1985] que se acumulaba
intracelularmente L-prolina en Escherichia coli,
Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, etc. y se regulaba
por la presión osmótica extracelular.
Por consiguiente, se contempla que para un
microorganismo capaz de producir ácido 5'-inosínico
en una alta concentración y rendimiento, es importante prevenir la
inhibición del crecimiento y de procesos metabólicos bioquímicos por
aumento de la síntesis intracelular de L-prolina, y
que es importante reforzar las características de resistencia a
presión osmótica aumentando la capacidad sintética de
L-prolina.
Además, para producir ácido
5'-inosínico a partir de
5-fosforribosil-\alpha-1
-pirofosfato (PRPP), es decir, un material precursor de ácidos
nucleicos de tipo purina, son necesarias 2 moléculas de glutamina.
La glutamina sintetasa, que es la enzima que produce glutamina a
partir de glutamato sódico, está muy minuciosamente regulada por
aminoácidos tales como glicina, alanina, histidina, etc., y CTP,
AMP, etc. [Reitzer LJ y Magasanik B, Escherichia coli and
Salmonella typhimurium, 1987, págs. 362\sim320]. Por lo
tanto, es necesario un suministro armonioso de la glutamina para la
síntesis de ácido 5'-inosínico. Además, la glutamina
producida se usa ampliamente como precursor de diversas reacciones.
En la síntesis de ácido 5'-inosínico, dos enzimas
que son la PRPP amidotransferasa y la
5-fosforribosil-N-formilglicinamida
(FGAR) amidotransferasa, emplean glutamina como sustrato [Neuhard J
y Nygaard P, Escherichia coli and Salmonella
typhimurium, 1987, págs. 445\sim473]. Por lo tanto, para
lograr más eficazmente la síntesis de ácido
5'-inosínico, se considera que la síntesis armoniosa
de la glutamina es importante para aumentar la afinidad de la PRPP
amidotransferasa y de la FGAR amidotransferasa, relacionadas con la
síntesis de ácido 5'-inosínico, con la glutamina más
que con otras enzimas entre diversas reacciones que requieren
glutamina.
Por consiguiente, los presentes inventores
ensayaron cómo afectarían diversos aminoácidos a la síntesis del
ácido 5'-inosínico mediante una fermentación
directa. Como resultado, cuando se añadió
L-glutamina al medio de ácido
5'-inosínico, los inventores identificaron que la
concentración de fermentación de ácido 5'-inosínico
se aumentaba y que el suministro apropiado de
L-glutamina a la presente cepa es una etapa
limitante de velocidad en la síntesis del ácido
5'-inosínico.
Los inventores identificaron que los
microorganismos a los que se introducía resistencia a análogos de
L-glutamina, tales como azaserina o
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON) y resistencia a diversos análogos de
L-prolina, tales como
3,4-deshidroprolina, ácido
L-azetidin-2-carboxílico,
ácido
L-tiazolidin-4-carboxílico,
ácido
(S)-2,2-dimetil-4-oxazolidocarboxílico,
ácido
(S)-5,5-dimetil-4-tiazolidocarboxílico,
ácido
(4S,2RS)-2-etil-4-tiazolin-carboxílico,
ácido
(2S,4S)-4-hidroxi-2-pirrolin-2-carboxílico,
ácido 2-piperidincarboxílico o
2,5-pirrolidindiona pueden producir ácido
5'-inosínico mediante un método de fermentación
directa en una concentración y rendimiento superiores a los de cepas
conocidas. La presente invención se basa en dicho
descubrimiento.
A continuación en este documento, la presente
invención se explicará más específicamente.
En primer lugar, el microorganismo de la
presente invención, un mutante de Corynebacterium
ammoniagenes (ATCC-6872), requiere adenina pero
no requiere xantina o guanina, aunque se facilita el crecimiento por
adición de los mismos, y el microorganismo carece de ureasa para
asimilar urea y tiene una alta sensibilidad a lisozima, una enzima
de degradación de la pared celular, considerándose que su capacidad
de síntesis de pared celular está parcialmente perdida, de modo que
se secretan fácilmente fuera de la célula grandes cantidades de
ácido 5'-inosínico producido intracelularmente, y
tiene resistencia a estreptomicina para corresponder eficazmente a
una contaminación que se produzca durante la fermentación.
Una alta concentración de glucosa, otras fuentes
de carbono añadidas durante el periodo de cultivo y el ácido
5'-inosínico acumulado durante el último periodo de
cultivo conducen a un aumento en la presión osmótica extracelular de
microorganismos productores de ácido 5'-inosínico,
inhibiendo de este modo sus actividades fisiológicas normales y su
crecimiento celular. Por lo tanto, es deseable mejorar la
resistencia osmótica para evitar la reducción de la producción de
ácido 5'-inosínico.
Para aumentar la concentración intracelular de
prolina, que desempeña un papel importante en la osmorregulación a
una alta acumulación de solutos en el entorno extracelular, el
microorganismo de la presente invención tiene resistencia a análogos
de L-prolina, tales como
3,4-deshidroprolina, ácido
L-azetidin-2-carboxílico,
ácido
L-tiazolidin-4-carboxílico,
ácido
(S)-2,2-dimetil-4-oxazolidocarboxílico,
ácido
(S)-5,5-dimetil-4-tiazolidocarboxílico,
ácido
(4S,2RS)-2-etil-4-tiazolino-carboxílico,
ácido
(2S,4S)-4-hidroxi-2-pirrolin-carboxílico,
ácido 2-piperidincarboxílico o
2,5-pirrolindiona, excluyendo por lo tanto más
eficazmente el efecto de la presión osmótica.
Además, el microorganismo de la presente
invención tiene resistencia a análogos de
L-glutamina, tales como azaserina o
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON), esencialmente necesarios en el sistema de síntesis de tipo
purina logrando el suministro armonioso de glutamina para la
síntesis de ácido 5'-inosínico, dando como resultado
una acumulación directa de ácido 5'-inosínico en un
alto rendimiento y concentración.
El mutante de la presente invención obtuvo una
colonia del microorganismo (CJ112), que requiere adenina pero no
requiere xantina ni guanina, aunque se facilita su crecimiento por
adición de los mismos, y que carece de ureasa para asimilar urea,
como una cepa parenteral, tratándose con rayos X, rayos ultravioleta
y un mutágeno orgánico químico tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG), sulfato de dietilo, etilamina, etc., y suspendiéndose y
extendiéndose convenientemente en un medio mínimo (Medio 2) que
contiene agar al 1,7% y cada concentración de variantes. Después,
cada colonia se cultivó en un medio de nutrición (Medio 1) y después
se cultivó en un medio de siembra (Medio 3) durante 24 horas, y
después se cultivó en un medio de fermentación (Medio 4) durante
5-6 días para seleccionar de este modo un
microorganismo que pueda producir ácido 5'-inosínico
acumulado en el medio de cultivo en las mayores cantidades, etapa
por etapa. Después, los presentes inventores seleccionaron una cepa
que puede producir ácido 5'-inosínico acumulado en
el medio de cultivo a las mayores cantidades entre los
microorganismos en la etapa final. La cepa anterior se denominó
CJIP009. Se depositó el Corynebacterium ammoniagenes CJIP009
bajo el Tratado de Budapest en el Centro Coreano de Cultivo de
Microorganismos, cuya dirección es Hongje-dong,
Seodaemungu, Seúl, el 20 de noviembre de 2000 con el Nº de Acceso
KCCM-10226.
En concreto, la presente invención proporciona
un proceso para producir ácido 5'-inosínico
caracterizado por que un mutante de Corynebacterium
ammoniagenes CJIP009 (KCCM-10226) de acuerdo con
la reivindicación 1 se cultiva en un medio de siembra a 30ºC durante
24 horas, se cultiva y se activa en un medio de siembra fermentador
a 28-34ºC, 900 rpm y pH 7,2 durante
1-2 días, se cultiva en un medio principal
fermentador a 30ºC, 900 rpm y pH 7,2 durante 5-6
días y después, cuando el azúcar reductor es del 2% en la solución
de cultivo, el primer, segundo, tercer y cuarto azúcares adicionales
se mezclan con fructosa, glucosa y melazas y los azúcares finales
respectivos se añaden y se cultivan para que sean el 32%.
\vskip1.000000\baselineskip
Los medios de cultivo empleados en la presente
invención tienen las siguientes composiciones:
Medio
1
Peptona al 1%, extracto de ternera al 1%,
cloruro sódico (NaCl) al 0,25%, extracto de levadura al 1%, agar al
2%, pH 7,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio
2
Glucosa al 2,0%, sulfato de amonio
((NH_{4})_{2}SO_{4}) al 0,3%, dihidrogenofosfato
potásico (KH_{2}PO_{4}) al 0,1%, monohidrogenofosfato potásico
(K_{2}HPO_{4}) al 0,3%, sulfato de magnesio
(MgSO_{4}\cdot7H_{2}O) al 0,3%, cloruro de calcio (CaCl_{2})
10 mg/l, sulfato férrico (FeSO_{4}\cdot7H_{2}O) 10 mg/l,
sulfato de cinc (ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O) 1,0 mg/l, cloruro de
manganeso (MnCl_{2}-H_{2}O) 3,6 mg/l,
L-cisteína 20 mg/l, pantotenato de calcio 10 mg/l,
tiamina HCl 5,0 mg/l, biotina 30 \mug/l, adenina 20 mg/l, guanina
20 mg/l, pH 7,3.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio
3
Glucosa al 5%, peptona al 0,5%, extracto de
ternera al 0,5%, extracto de levadura al 1%, cloruro sódico (NaCl)
al 0,25%, adenina 100 mg/l, guanina 100 mg/l, pH 7,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio
4
Glutamato sódico al 0,1%, cloruro de amonio
(NH_{4}Cl) al 1,0%, sulfato de magnesio (MgSO_{4} 7H_{2}O) al
1,2%, cloruro de calcio (CaCl_{2}) al 0,01%, sulfato férrico
(FeSO_{4}\cdot7H_{2}O) 20 mg/l, sulfato de manganeso
(N_{b}SO_{4}-H_{2}O) 20 mg/l, sulfato de cinc
(ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O) 20 mg/l, sulfato cúprico
(CuSO_{4}-7H_{2}O) 5,0 mg/l,
L-cisteína 23 mg/l, alanina 24 mg/l, ácido
nicotínico 8,0 mg/l, biotina 45 \mug/l,
tiamina-HCl 5,0 mg/l, adenina 30 mg/l, ácido
fosfórico (H_{3}PO_{4}) (85%) al 1,9%, la mezcla de fructosa,
glucosa y melazas al 8% como azúcar reductor (pH 7,2).
\newpage
Medio
5
Glucosa al 5,4%, peptona al 1,0%, extracto de
levadura al 2,0%, dihidrogenofosfato potásico (KH_{2}PO_{4}) al
0,1%, monohidrogenofosfato potásico (K_{2}HPO_{4}) al 0,1%,
sulfato de magnesio (MgSO_{4}\cdot7H_{2}O) al 0,1%, sulfato de
amonio ((NH_{4})_{2}SO_{4}) al 0,5%, sulfato férrico
(FeSO_{4}\cdot7H_{2}O) 80 mg/l, sulfato de cinc
(ZnSO_{4}-7H_{2}O) 40 mg/l, sulfato de manganeso
(MnSO_{4}\cdotH_{2}O) 40 mg/l, L-cisteína 80
mg/l, pantotenato de calcio 60 mg/l, tiamina\cdotHCl 20 mg/l,
biotina 240 \mug/l, adenina 1200 mg/l, guanina 1200 mg/l (pH
7,2).
\vskip1.000000\baselineskip
Medio
6
Cloruro de calcio (CaCl_{2}) 120 mg/l, sulfato
cúprico (CUSO_{4}\cdot7H_{2}O) 8,0 mg/l, sulfato de magnesio
(MgSO_{4}\cdot7H_{2}O) al 1,5%, sulfato férrico
(FeSO_{4}\cdot7H_{2}O) 24 mg/l, sulfato de cinc
(ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O) 24 mg/l, sulfato de manganeso
(MnSO_{4}\cdot
H_{2}O) 24 mg/l, L-cisteína 26,4 mg/l, glutamato sódico al 0,12%, tiamina\cdotHCl 6,0 mg/l, biotina 40 \mug/l, ácido nicotínico 50 mg/l, alanina 145 mg/l, adenina 200 mg/l, ácido fosfórico (H_{3}PO_{4}) (85%) al 4,3%, la mezcla de fructosa, glucosa y melazas al 32% como azúcar reductor (pH 7,2).
H_{2}O) 24 mg/l, L-cisteína 26,4 mg/l, glutamato sódico al 0,12%, tiamina\cdotHCl 6,0 mg/l, biotina 40 \mug/l, ácido nicotínico 50 mg/l, alanina 145 mg/l, adenina 200 mg/l, ácido fosfórico (H_{3}PO_{4}) (85%) al 4,3%, la mezcla de fructosa, glucosa y melazas al 32% como azúcar reductor (pH 7,2).
Las propiedades bioquímicas de variantes
representativas de un nuevo mutante CJIP009 de acuerdo con la
presente invención se muestran en la siguiente Tabla 1. (Esta
invención no se limita a las siguientes propiedades).
El proceso de cultivo de ácido
5'-inosínico usado en la invención era el
siguiente.
Los microorganismos, que pertenecen al género
Corynebacterium y capaces de producir ácido
5'-inosínico, se cultivaron en el medio convencional
que contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, aminoácidos,
vitaminas, etc., en condiciones aerobias con temperatura, pH, etc.
regulados.
Se usarían como fuente de carbono glucosa,
fructosa, melazas pretratadas esterilizadas (melazas revertidas a
azúcar reductor) y similares. Entre las fuentes de nitrógeno
inorgánico tales como amoniaco, cloruro de amonio, sulfato de amonio
y fuentes de nitrógeno orgánico tales como, peptona,
NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura,
solución de digestión del maíz, hidrolizado de caseína, pescados o
productos de degradación de los mismos, torta de soja desgrasada o
productos de degradación de la misma y similares, cada una se usaría
como una fuente de nitrógeno orgánico. Se usarían dihidrogenofosfato
potásico (KH_{2}PO_{4}), monohidrogenofosfato potásico
(K_{2}HPO_{4}), sulfato de manganeso (MnSO4\cdotH_{2}O),
sulfato férrico (FeSO_{4}\cdot7H_{2}O), sulfato de magnesio
(MgSO_{4}\cdot7H_{2}O), carbonato de calcio (CaCO_{3}),
etc., como los compuestos inorgánicos. Si es necesario, se añadirían
vitaminas y bases, etc. El cultivo se realiza, por ejemplo, al
tiempo que se agita o se airea y se agita en condiciones aerobias,
preferiblemente a 20\sim40ºC durante 5-6 días. El
pH del medio permanece preferiblemente alrededor de la neutralidad.
El ácido 5'-inosínico acumulado mediante una
fermentación directa se analiza mediante el método convencional.
Esta invención se entenderá mejor a partir de
los siguientes ejemplos. Sin embargo, un especialista en la técnica
apreciará fácilmente que los materiales específicos y los resultados
descritos a continuación son simplemente ilustrativos de, y que no
pretenden ni deberían pretender limitar la invención que se describe
más completamente en las reivindicaciones que siguen a partir de
entonces.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El mutante del Ejemplo 1 se preparó a partir del
microorganismo (CJ112) de Brevibacterium ammoniagenes
(ATCC-6872), que requiere adenina, pero no requiere
xantina o guanina, aunque se facilita el crecimiento por adición de
los mismos, y que carece de ureasa para similar urea, como la cepa
parental. La cepa se suspendió a 10^{7}\sim10^{8} células/ml
en el tampón fosfato (pH 7,0) o tampón citrato (pH 5,5) y se indujo
mutación por adición de
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) a la concentración final de 10-50 \mug/ml a
temperatura ambiente o 32ºC durante 20-40 minutos, y
se lavó dos veces con solución salina al 0,85%. Se obtuvieron
colonias que estaban convenientemente suspendidas y extendidas en un
medio mínimo (Medio 2) que contenía agar al 1,7%. Después, cada
colonia se cogió con un palillo en el medio mínimo (Medio 2) que
contenía agar al 1,7% y en el medio mínimo (Medio 2) que contenía
agar al 1,7% y 40 \mug/ml de lisozima. En primer lugar, se
seleccionó el microorganismo que crecía en el medio mínimo que
contenía agar al 1,7% y no en el medio mínimo que contenía 40
\mug/ml de lisozima. El microorganismo iba a ser una cepa parental
e iba a inducirse continuamente la mutación anterior. En segundo
lugar, se seleccionó el microorganismo sensible que no crecía en el
medio mínimo que contenía 16 \mug/ml de lisozima. Por último, de
acuerdo con el método anterior, se seleccionó el microorganismo
altamente sensible que no crecía en el medio mínimo que contenía 8
\mug/ml de lisozima. La colonia del microorganismo altamente
sensible se cultivó en un medio de nutrición (Medio 1), después se
cultivó durante 24 horas en un medio de siembra (Medio 3), y se
cultivó durante 3-4 días en un medio de cultivo
(Medio 4) para seleccionar de este modo LY002, que puede producir
ácido 5'-inosínico acumulado en el medio de cultivo
a las mayores cantidades. La concentración de lisozima a la que el
microorganismo demuestra sensibilidad se enumera en la siguiente
Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En un mutante del ejemplo 2, se usó LY002 del
Ejemplo 1 como cepa parental. La cepa se suspendió a
10^{7}\sim10^{8} células/ml en el tampón fosfato (pH 7,0) o
tampón citrato (pH 5,5) y se indujo mutación por adición de NTG a la
concentración final de 10-50 \mug/ml a temperatura
ambiente o 32ºC durante 20-40 minutos, y se lavó dos
veces con solución salina al 0,85%. Se obtuvieron colonias que
estaban convenientemente suspendidas y extendidas en 3 medios
mínimos (Medio 2), conteniendo cada uno de ellos agar al 1,7% y
1.000 \mug/ml, 1.500 \mug/ml o 2.000 \mug/ml de
estreptomicina, respectivamente. Después, cada colonia se cultivó en
el medio de nutrición (Medio 1), después se cultivó durante 24 horas
en un medio de siembra (Medio 3), y se cultivó durante
3-4 días en un medio de cultivo (Medio 4) para
seleccionar de este modo CISM10, que puede producir ácido
5'-inosínico acumulado en el medio de cultivo a las
mayores cantidades. La concentración de estreptomicina a la que el
microorganismo demuestra resistencia se enumera en la siguiente
Tabla 3.
\newpage
Ejemplo
3
En un mutante del Ejemplo 3, se usó CISM10 del
Ejemplo 2 como cepa parental. La cepa se suspendió a
10^{7}\sim10^{8} células/ml en el tampón fosfato (pH 7,0) o
tampón citrato (pH 5,5) y se indujo mutación por adición de NTG a la
concentración final de 10-50 \mug/ml a temperatura
ambiente o 32ºC durante 20-40 minutos, y se lavó dos
veces con solución salina al 0,85%. Se obtuvieron colonias
suspendiendo y extendiendo convenientemente en 3 medios mínimos
(Medio 2), conteniendo cada uno agar al 1,7% y 1.500 \mug/ml,
2.500 \mug/ml o 3.500 \mug/ml de
3,4-deshidroprolina, respectivamente. Después, cada
colonia se cultivó en el medio de nutrición (Medio 1), después se
cultivó durante 24 horas en un medio de siembra (Medio 3) y se
cultivó durante 3-4 días en un medio de cultivo
(Medio 4) para seleccionar de este modo CIS104, que puede producir
ácido 5'-inosínico acumulado en el medio de cultivo
a las mayores cantidades. La concentración de
3,4-deshidroprolina a la que el microorganismo
demuestra resistencia se enumera en la siguiente Tabla 4.
Ejemplo
4
En un mutante del Ejemplo 4, el CS101 del
Ejemplo 3 iba a ser una cepa parental. La cepa se suspendió a
10^{7}-10^{8} células/ml en el tampón fosfato
(pH 7,0) o tampón citrato (pH 5,5) y se indujo mutación por adición
de NTG a la concentración final de 10-50 \mug/ml a
temperatura ambiente o 32ºC durante 20-40 minutos y
se lavó dos veces con solución salina al 0,85%. Se obtuvieron
colonias que estaban convenientemente suspendidas y extendidas en 3
medios mínimos (Medio 2), conteniendo cada uno de ellos agar al 1,7%
y 10 \mug/ml, 20 \mug/ml o 30 \mug/ml de ácido
L-azetidin-2-carboxílico,
respectivamente. Después, cada colonia se cultivó en el medio de
nutrición (Medio 1), después se cultivó durante 24 horas en un medio
de siembra (Medio 3) y se cultivó durante 3-4 días
en un medio de cultivo (Medio 4), para seleccionar de este modo
CIAC12, que puede producir ácido 5'-inosínico
acumulado en el medio de cultivo a las mayores cantidades. La
concentración de ácido
L-azetidin-2-carboxílico
a la que el microorganismo muestra resistencia se enumeró en la
siguiente Tabla 5.
Ejemplo
5
En un mutante del Ejemplo 5, el CIAC12 del
Ejemplo 4 iba a ser una cepa parental. La cepa se suspendió a
10^{7}-10^{8} células/ml en el tampón fosfato
(pH 7,0) o tampón citrato (pH 5,5) y se indujo mutación por adición
de NTG a la concentración final de 10-50 \mug/ml a
temperatura ambiente o 32ºC durante 20-40 minutos y
se lavó dos veces con solución salina al 0,85%. Se obtuvieron
colonias que estaban convenientemente suspendidas y extendidas en 3
medios mínimos (Medio 2), conteniendo cada uno de ellos agar al 1,7%
y 20 \mug/ml, 50 \mug/ml o 100 \mug/ml de ácido
L-tiazolidin-4-carboxílico,
respectivamente. Después, cada colonia se cultivó en el medio de
nutrición (Medio 1), después se cultivó durante 24 horas en un medio
de siembra (Medio 3) y se cultivó durante 3-4 días
en un medio de cultivo (Medio 4), para seleccionar de este modo
CITP13, que puede producir ácido 5'-inosínico
acumulado en el medio de cultivo a las mayores cantidades. La
concentración de ácido
L-tiazolidin-4-carboxílico
a la que el microorganismo muestra resistencia se enumeró en la
siguiente Tabla 6.
Ejemplo
6
En un mutante del Ejemplo 6, CITP 13 del Ejemplo
5 iba a ser una cepa parental. La cepa se suspendió a
10^{7}-10^{8} células/ml en el tampón fosfato
(pH 7,0) o tampón citrato (pH 5,5) y se indujo mutación por adición
de NTG a la concentración final de 10-50 \mug/ml a
temperatura ambiente o 32ºC durante 20-40 minutos y
se lavó dos veces con solución salina al 0,85%. Se obtuvieron
colonias que estaban convenientemente suspendidas y extendidas en 3
medios mínimos (Medio 2), conteniendo cada uno de ellos agar al 1,7%
y 50 \mug/ml, 75 \mug/ml o 100 \mug/ml de azaserina,
respectivamente. Después, cada colonia se cultivó en el medio de
nutrición (Medio 1), después se cultivó durante 24 horas en un medio
de siembra (Medio 3) y se cultivó durante 3-4 días
en un medio de cultivo (Medio 4) para seleccionar de este modo
CJIP009 (KCCM-10226), que puede producir ácido
5'-inosínico acumulado en el medio de cultivo a las
mayores cantidades. La concentración de azaserina a la que el
microorganismo muestra resistencia se enumeró en la siguiente Tabla
7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
CJIP009 (KCCM-10226).
Glucosa al 5%, peptona al 0,5%, extracto de
ternera al 0,5%, extracto de levadura al 1%, cloruro sódico (NaCl)
al 0,25%, adenina 100 mg/l, guanina 100 mg/l, pH 7,2.
Glutamato sódico al 0,1%, cloruro de amonio
(NH_{4}Cl) al 1,0%, sulfato de magnesio
(MgSO_{4}\cdot7H_{2}O) al 1,2%, cloruro cálcico (CaCl_{2})
al 0,01%, sulfato férrico (FeSO_{4}\cdot7H_{2}O) 20 mg/l,
sulfato de manganeso (MnSO_{4}\cdotH_{2}O) 20 mg/l, sulfato de
cinc (ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O) 20 mg/l, sulfato cúprico
(CuSO_{4}\cdot7H_{2}O) 5,0 mg/l, L-cisteína 23
mg/l, alanina 24 mg/l, ácido nicotínico 8,0 mg/l, biotina 45
\mug/l, tiamina\cdotHCl 5,0 mg/l, adenina 30 mg/l, ácido
fosfórico (H_{3}PO_{4}) (85%) al 1,9%, la mezcla de fructosa,
glucosa y melazas al 8% como azúcar reductor (pH 7,2).
Se introdujeron 3 ml del medio de siembra en un
tubo de ensayo de 18 mm de diámetro y se esterilizaron a presión
elevada por el método general. En el mismo se inoculó la cepa y se
cultivó al tiempo que se agitaba a 30ºC durante 24 horas para usarla
como el medio de siembra. Se introdujeron 27 ml de medio de
fermentación en 500 ml de matraz Erlenmeyer para agitación y se
esterilizaron a presión elevada a 120ºC durante 10 minutos. En el
mismo se inocularon 3 ml de cultivo de siembra y se cultivaron
durante 5-6 días. El matraz se agitó a 200 rpm a la
temperatura de 30ºC y un pH de 7,2. La cantidad acumulada de ácido
5'-inosínico era de 19,1 g/l.
Ejemplo
8
CJIP009 (KCCM-10226).
El mismo que en el Ejemplo 7.
Glucosa al 5,4%, peptona al 1,0%, extracto de
levadura al 2,0%, dihidrogenofosfato potásico (KH_{2}PO_{4}) al
0,1%, monohidrogenofosfato potásico (K_{2}HPO_{4}) al 0,1%,
sulfato de magnesio (MgSO_{4}\cdot7H_{2}O) al 0,1%, sulfato de
amonio (NH_{4})_{2}SO_{4}) al 0,5%, sulfato férrico
(FeSO_{4}\cdot7H_{2}O) 80 mg/l, sulfato de cinc
(ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O) 40 mg/l, sulfato de manganeso
(MnSO_{4}\cdot7H_{2}O) 40 mg/l, L-cisteína 80
mg/l, pantotenato de calcio 60 mg/l, tiamina\cdotHCl 20 mg/l,
biotina 240 \mug/l, adenina 1200 mg/l, guanina 1200 mg/l (pH
7,2).
Cloruro de calcio (CaCl_{2}) 120 mg/l, sulfato
cúprico (CuSO_{4}\cdot7H_{2}O) 8,0 mg/l, sulfato de magnesio
(MgSO_{4}-7H_{2}O) al 1,5%, sulfato férrico
(FeSO_{4}\cdot7H_{2}O) 24 mg/l, sulfato de cinc
(ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O) 24 mg/l, sulfato de manganeso
(MnSO_{4}\cdot
7H_{2}O) 24 mg/l, L-cisteína 26,4 mg/l, glutamato sódico al 0,12%, tiamina\cdotHCl 6,0 mg/l, biotina 40 \mug/l, ácido nicotínico 50 mg/l, alanina 145 mg/l, adenina 200 mg/l, ácido fosfórico (H_{3}PO_{4}) (85%) al 4,3%, la mezcla de fructosa, glucosa y melazas al 32% como azúcar reductor (pH 7,2).
7H_{2}O) 24 mg/l, L-cisteína 26,4 mg/l, glutamato sódico al 0,12%, tiamina\cdotHCl 6,0 mg/l, biotina 40 \mug/l, ácido nicotínico 50 mg/l, alanina 145 mg/l, adenina 200 mg/l, ácido fosfórico (H_{3}PO_{4}) (85%) al 4,3%, la mezcla de fructosa, glucosa y melazas al 32% como azúcar reductor (pH 7,2).
Se introdujeron 50 ml del medio de siembra en
500 ml de matraz Erlenmeyer para agitación y esterilizado a presión
elevada por el método general. En el mismo se inoculó la cepa, y se
cultivó mientras se agitaba a 30ºC durante 24 horas para usarlo como
el medio de siembra. Se añadieron 1000 ml del medio de siembra
fermentador a 2,5 l de fermentador esterilizado a presión elevada a
120ºC durante 15 minutos. En el mismo se inocularon 50 ml de cultivo
de siembra y después se cultivaron durante 1-2 días.
El matraz se agitó a 900 rpm a la temperatura de
28-34ºC y pH de 7,2. Además, se añadieron 1.250 ml
de medio principal fermentador a 5 l de fermentador esterilizado a
presión elevada a 120ºC durante 15 minutos. En el mismo se
inocularon 250 ml de cultivo de siembra y después se cultivó durante
1-2 días. Cuando el azúcar reductor en el cultivo
era del 2% durante el cultivo, se añadieron el 1º, 2º, 3º y 4º
azúcares adicionales, es decir, la mezcla de fructosa, glucosa y
melazas, de modo que cada azúcar del azúcar reductor final se
volviera el 32%. Después, la mezcla se cultivó durante
5-6 días. El matraz se agitó a 900 rpm a la
temperatura de 30ºC y pH de 7,2. La cantidad acumulada de ácido
5'-inosínico en el medio era de 70,3 g/l.
De acuerdo con la presente invención, puede
obtenerse ácido 5'-inosínico en una mayor
concentración y rendimiento que en la técnica anterior. De acuerdo
con la presente invención, puede obtenerse ácido
5'-inosínico más económicamente que en la técnica
anterior.
Claims (6)
1. Un Corynebacterium ammoniagenes
CJIP009 que tiene el número de acceso KCCM-10226,
caracterizado por que acumula ácido
5'-inosínico en una alta concentración y rendimiento
mediante una fermentación directa y tiene resistencia a análogos de
L-glutamina seleccionados de azaserina o
6-diazo-5-oxo-L-norleucina
(DON) y resistencia a análogos de L-prolina
seleccionados de 3,4-deshidroprolina, ácido
L-azetidin-2-carboxílico,
ácido
L-tiazolidin-4-carboxílico,
ácido
(S)2,2-dimetil-4-oxazolidocarboxílico,
ácido
(S)-5,5-dimetil-4-tiazolidocarboxílico,
ácido (4S,
2RS)-2-etil-4-tiazolin-carboxílico,
ácido (2S,
4S)-4-hidroxi-2-pirrolin-carboxílico,
ácido 2-piperidincarboxílico o
2,5-pirrolidindiona.
2. El Corynebacterium ammoniagenes de
acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el
Corynebacterium ammoniagenes es un tipo mutante parcial de
guanina o xantina o el microorganismo que requiere adenina.
3. El Corynebacterium ammoniagenes de
acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la
concentración de inhibición de crecimiento mínima de lisozima, una
enzima de degradación de la pared celular, es de 8 \mug/ml.
4. El Corynebacterium ammoniagenes de
acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que tiene
una resistencia a estreptomicina para evitar la contaminación que se
produce durante la fermentación.
5. Un proceso para producir ácido
5'-inosínico, caracterizado por el cultivo
del Corynebacterium ammoniagenes de acuerdo con la
reivindicación 1, seguido de la recogida de las sustancias
cultivadas.
6. El proceso de acuerdo con la reivindicación
5, caracterizado por que el Corynebacterium
ammoniagenes de acuerdo con la reivindicación 1, se cultiva en
un medio de siembra a 30ºC durante 24 horas, se cultiva y se activa
en un miembro de siembra fermentador a 28-34ºC, 900
rpm y pH 7,2 durante 1-2 días, se cultiva en un
medio principal fermentador a 30ºC, 900 rpm y pH 7,2 durante
5-6 días y después, cuando el azúcar reductor es del
2% en la solución de cultivo, el primer, segundo, tercer y cuarto
azúcares adicionales se mezclan con fructosa, glucosa y melazas y
los azúcares finales respectivos se añaden y se cultivan para que
sean el 32%.
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