ES2657837T3 - Microorganismos de Corynebacterium con productividad mejorada de ácido 5'-inosínico, y procedimiento de producción de ácidos nucleicos usando los mismos - Google Patents

Abstract

Un microorganismo Corynebacterium ammoniagenes transformado que produce ácido 5'-inosínico y depositado en el "Korean Culture Center of Microorganisms" el 19 de febrero de 2009 bajo el número de acceso de depósito KCCM 10992P.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismos de Corynebacterium con productividad mejorada de ácido 5’-inosínico, y procedimiento de producción de ácidos nucleicos usando los mismos

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención 5

El presente documento describe un microorganismo perteneciente al género Corynebacterium y que produce ácido 5’-inosínico, en el cual la expresión de genes codificadores de enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina se incrementa más que la expresión intrínseca, y un procedimiento para producir ácido 5’-inosínico, que comprende cultivar el microorganismo del género Corynebacterium con productividad mejorada de ácido 5’-inosínico.

2. Descripción de la técnica relacionada 10

Uno de los compuestos de nucleótidos, el ácido 5’-inosínico es un material intermedio del sistema metabólico de la biosíntesis de nucleótidos, el cual se usa en una diversidad de campos tales como alimentos, medicinas y otras diversas áreas médicas y sirve para jugar un importante papel en la fisiología animal y vegetal. En particular, el ácido 5’-inosónico es un condimento de nucleótido, el cual ha despertado mucha atención como condimento sabroso, debido a que tiene efectos sinérgicos cuando se usa con glutamato monosódico (GMS). 15

Por ahora, los procesos bien conocidos para producir ácido 5’-inosónico incluyen un proceso de descomposición de manera enzimática de ácido ribonucleico extraído de células de levadura (Solicitud de Patente Examinada Publicada Japonesa Nº 1614/1957, etc.), un proceso de fosforilación de manera química de inosina producido por fermentación (Agric. Biol. Chem., 36, 1.511(1972), etc.) y un proceso de cultivo de un microorganismo capaz de producir ácido 5’-inosónico y recuperación de monofosfato de inosina (MFI) acumulado en el medio. Actualmente, los procesos de 20 producción del ácido 5’-inosónico usando microorganismos son los más usados. Las cepas del género Corynebacterium se usan mucho como microorganismos para la producción del ácido 5’-inosónico y, por ejemplo, se ha descrito un procedimiento para producir ácido 5’-inosónico cultivando Corynebacterium ammoniagenes (Publicación de Patente Coreana Nº 2003-0042972).

Para mejorar el rendimiento de producción del ácido 5’-inosínico por un microorganismo, se han realizado estudios 25 para desarrollar cepas incrementando o disminuyendo la actividad o la expresión de las enzimas implicadas en la ruta biosintética o degradativa del ácido 5’-inosínico. La Patente Coreana Nº 785248 describe un microorganismo en el que un gen purC codificador de fosforibosilaminoimidazol succinocarboxamida sintetasa se sobreexpresa en la ruta biosintética de purina y un procedimiento para producir ácido 5’-inosínico usando el mismo. Además, el documento de la Patente Coreana Nº 857379 describe una cepa de Corynebacterium ammoniagenes en la que la 30 fosforibosilaminoimidazol carboxilasa codificada por purKE se sobreexpresa y un procedimiento para producir alta concentración de MFI en un alto rendimiento usando la mismo.

Sin embargo, todavía hay una necesidad de desarrollar una cepa capaz de producir ácido 5’-inosínico en un rendimiento mayor y un procedimiento para producir ácido 5’-inosínico usando la misma.

Por lo tanto, los presentes inventores han dirigido estudios para desarrollar una cepa capaz de producir ácido 5’-35 inosínico con alta productividad. Como resultado, encontraron que la productividad del ácido 5’-inosínico se puede mejorar incrementando simultáneamente las actividades de las enzimas fundamentales implicadas en la ruta de la biosíntesis de purina más que la actividad intrínseca.

Compendio de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un microorganismo Corynebacterium ammoniagenes 40 transformado que produce ácido 5’-inosínico y depositado en el “Korean Culture Center of Microorganisms” el 19 de febrero de 2009 bajo el número de depósito KCCM 10992P.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para producir ácido 5’-inosínico que comprende cultivar dicho Corynebacterium ammoniagenes transformado, y recuperar el ácido 5’-inosínico del medio de cultivo.

Breve descripción de los dibujos 45

La Figura 1 muestra un vector pDZ para la inserción cromosómica en el microorganismo del género Corynebacterium.

La Figura 2 muestra un vector pDZ-2purFM para la inserción cromosómica en el microorganismo del género Corynebacterium.

La Figura 3 muestra un vector pDZ-2purNH para la inserción cromosómica en el microorganismo del género 50 Corynebacterium.

La Figura 4 muestra un vector pDZ-2purSL para la inserción cromosómica en el microorganismo del género Corynebacterium.

La Figura 5 muestra un vector pDZ-2purKE para la inserción cromosómica en el microorganismo del género

Corynebacterium.

La Figura 6 muestra un vector pDZ-2purC para la inserción cromosómica en el microorganismo del género Corynebacterium.

La Figura 7 muestra un vector pDZ-2prs para la inserción cromosómica en el microorganismo del género Corynebacterium. 5

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

En el presente documento se describe un microorganismo perteneciente al género Corynebacterium y que produce ácido 5’-inosínico, en el cual la expresión de los genes codificadores de enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina se incrementa más que la expresión intrínseca.

El microorganismo del género Corynebacterium descrito en el presente documento ha mejorado la productividad del 10 ácido 5’-inosínico en comparación con la cepa parental, debido a que la expresión de los genes codificadores de enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina se incrementa más que la expresión intrínseca.

Como se usa en el presente documento, el término “enzima relacionada con la biosíntesis de purina” significa una enzima que cataliza la reacción implicada en la ruta de la biosíntesis de purina que produce una base de purina como producto final, e incluye fosforibosilpirofosfato amidotransferasa, fosforibosilglicinamida farmiltransferasa, 15 fosforibosilformilglicinamidina sintetasa, fosforibosilformilglicinamidina sintetasa II, fosforibosilaminoimidazol sintetasa, fosforibosilaminoimidazol carboxilasa, fosforibosil aminoimidazol succinocarboxamida sintetasa, ácido inosínico ciclohidrolasa, ribosafosfato pirofosfoquinasa o similares.

Las enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina pueden ser una combinación de una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en fosforibosilpirofosfato amidotransferasa, fosforibosilglicinamida 20 formiltransferasa, fosforibosilformilglicinamidina sintetasa, fosforibosilformilglicinamidina sintetasa II, fosforibosilaminoimidazol sintetasa, fosforibosilaminoimidazol carboxilasa, fosforibosil aminoimidazol succinocarboxamida sintetasa y ácido inosínico ciclohidrolasa, y ribosafosfato pirofosfoquinasa.

Los genes codificadores de enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina, cuya expresión se incrementa más que la expresión intrínseca, pueden ser una combinación de un gen purN de SEQ ID NO. 36, el cual codifica 25 fosforibosilglicinamida formiltransferasa, un gen purS de SEQ ID NO. 37, el cual codifica fosforibosilformilglicinamidina sintetasa, un gen purL de SEQ ID NO. 38, el cual codifica fosforibosilformilglicinamidina sintetasa II, un gen purKE de SEQ ID NO. 40, el cual codifica fosforibosilaminoimidazol carboxilasa, un gen purC de SEQ ID NO. 41, el cual codifica fosforibosil aminoimidazol succinocarboxamida sintetasa, un gen purH de SEQ ID NO. 42, el cual codifica ácido inosínico ciclohidrolasa, y un gen prs de SEQ ID 30 NO. 43, el cual codifica ribosafosfato pirofosfoquinasa.

Los genes codificadores de enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina, cuya expresión se incrementa más que la expresión intrínseca, pueden ser una combinación de un gen purF de SEQ ID NO. 35, el cual codifica fosforibosilpirofosfato amidotransferasa, un gen purN de SEQ ID NO. 36, el cual codifica fosforibosilglicinamida formiltransferasa, un gen purS de SEQ ID NO. 37, el cual codifica fosforibosilformilglicinamidina sintetasa, un gen 35 purL de SEQ ID NO. 38, el cual codifica fosforibosilformilglicinamidina sintetasa II, un gen purM de SEQ ID NO. 39, el cual codifica fosforibosilaminoimidazol sintetasa, un gen purKE de SEQ ID NO. 40, el cual codifica fosforibosilaminoimidazol carboxilasa, un gen purC de SEQ ID NO. 41, el cual codifica fosforibosil aminoimidazol succinocarboxamida sintetasa, un gen purH de SEQ ID NO. 42, el cual codifica ácido inosínico ciclohidrolasa, y un gen prs de SEQ ID NO. 43, el cual codifica ribosafosfato pirofosfoquinasa. 40

Como se usa en el presente documento, el término “incrementada más que la expresión intrínseca” significa que el nivel de expresión del gen es mayor que el expresado de manera natural en un microorganismo o mayor que el expresado en una cepa parental, e incluye un incremento en el número (número de copia) de los genes codificadores de la correspondiente enzima y de ese modo el nivel de expresión incrementado o un incremento en el nivel de expresión mediante mutación o un incremento en el nivel de expresión por ambos. 45

Un incremento en el nivel de expresión de un gen codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina incluye, pero no se limita a, un incremento en el número de copia del gen introduciendo además el correspondiente gen ajeno en una cepa o amplificando el gen intrínseco, o un incremento en la eficacia de trascripción o la eficacia de traducción mediante mutación en la secuencia reguladora de la trascripción o traducción. La amplificación del gen intrínseco se puede realizar fácilmente mediante un procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante 50 cultivo bajo una presión de selección adecuada.

El nivel de expresión del gen codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina se puede incrementar introduciendo además el gen codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina en una célula o amplificando el gen intrínseco codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina.

El gen codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina, cuyo nivel de expresión se incrementa más 55 que la expresión intrínseca, puede existir como dos o más copias en un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico al introducir una o más copias en una

célula, además del correspondiente gen intrínseco.

El gen codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina se introduce en un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico mediante transformación usando un vector recombinante que contiene dos copias del correspondiente gen que se colocan consecutivamente.

El vector recombinante usado para la preparación de un microorganismo del género Corynebacterium que tiene 5 productividad mejorada de ácido 5’-inosínico se puede seleccionar del grupo que consiste en los vectores recombinantes pDZ-2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, y pDZ-2prs, que tienen los mapas de escisión de las Figuras 2 a 7 respectivamente, dependiendo de los genes introducidos.

Un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico puede ser derivado de los microorganismos Corynebacterium capaces de producir ácido 5’-inosínico. Por ejemplo, se puede 10 derivar un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico a partir de Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, y cepas preparadas a partir de los mismos.

Un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico puede 15 incluir dos o más copias del gen codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina.

Un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico puede ser Corynebacterium ammoniagenes, y más preferiblemente un Corynebacterium ammoniagenes transformado, en el cual la actividad de una combinación del gen prs y uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en purF, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, y purH se incrementa para producir alta concentración de ácido 5’-inosínico. 20

Un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico puede ser una cepa, en la cual la cepa de Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 (KCCM-10610) productora de ácido 5’-inosínico es sometida a introducción de cada uno de los vectores recombinantes pDZ-2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, y pDZ-2prs que tienen los mapas de escisión de las Figuras 2, 3, 4, 5, 6 y 7 en orden o en combinación, y una de dos copias de los genes purF, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purH y prs 25 introducidos se sustituyen por los correspondientes genes intrínsecos por recombinación homóloga y, por tanto, cada dos copias de los genes purF, purN, purS, purL, purM, purKE, purC, purH, y prs se insertan en la cepa.

Un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico puede ser Corynebacterium ammoniagenes que contiene dos copias de los genes codificadores de las enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina que son una combinación del gen purN de SEQ ID NO. 36, el cual codifica 30 fosforibosilglicinamida formiltransferasa, el gen purS de SEQ ID NO. 37, el cual codifica fosforibosilformilglicinamidina sintetasa, el gen purL de SEQ ID NO. 38, el cual codifica fosforibosilformilglicinamidina sintetasa II, el gen purKE de SEQ ID NO. 40, el cual codifica fosforibosilaminoimidazol carboxilasa, el purC de SEQ ID NO. 41, el cual codifica fosforibosil aminoimidazol succinocarboxamida sintetasa, el gen purH de SEQ ID NO. 42, el cual codifica ácido inosínico ciclohidrolasa, y el gen prs de SEQ ID NO. 43, el cual codifica ribosafosfato 35 pirofosfoquinasa, y preferiblemente Corynebacterium ammoniagenes CN01-0120.

Un microorganismo del género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico puede ser Corynebacterium ammoniagenes que contiene dos copias de los genes codificadores de las enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina que son una combinación del purF de SEQ ID NO. 35, el cual codifica fosfofosilpirofosfato amidotransferasa, el gen purN de SEQ ID NO. 36, el cual codifica fosforibosilglicinamida 40 formiltransferasa, el gen purS de SEQ ID NO. 37, el cual codifica fosforibosilformilglicinamidin sintetasa, el gen purL de SEQ ID NO. 38, el cual codifica fosforibosilformilglicinamidina sintetasa II, el purM de SEQ ID NO. 39, el cual codifica fosforibosilaminoimidazol sintetasa, el gen purKE de SEQ ID NO. 40, el cual codifica fosforibosilaminoimidazol carboxilasa, el purC de SEQ ID NO. 41, el cual codifica fosforibosil aminoimidazol succinocarboxamida sintetasa, el gen purH de SEQ ID NO. 42, el cual codifica ácido inosínico ciclohidrolasa, y el 45 gen prs de SEQ ID NO. 43, el cual codifica ribosafosfato pirofosfoquinasa. La presente invención proporciona dicho microorganismo que es Corynebacterium ammoniagenes CN01-0316 (KCCM 10992P).

El presente documento también describe un procedimiento para producir ácido 5’-inosínico, que comprende las etapas de cultivar un microorganismo perteneciente al género Corynebacterium y que produce ácido 5’-inosínico, en el cual la expresión de un gen codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina se incrementa más 50 que la expresión intrínseca, y recuperar el ácido 5’-inosínico del medio de cultivo.

En el procedimiento para producir ácido 5’-inosínico, el medio y otras condiciones de cultivo usadas para el cultivo del microorganismo del género Corynebacterium que produce ácido 5’-inosínico pueden ser los mismos que los usados normalmente en el cultivo de un microorganismo del género Corynebacterium, y fácilmente seleccionados y ajustados por los expertos en la técnica. Además, el cultivo se puede realizar usando cualquier procedimiento de 55 cultivo conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, cultivo en lote, continuo y semicontinuo, pero no se limita a los mismos.

El microorganismo perteneciente al género Corynebacterium que produce ácido 5’-inosínico puede ser Corynebacterium ammoniagenes.

El microorganismo perteneciente al género Corynebacterium y que produce ácido 5’-inosínico puede ser Corynebacterium ammoniagenes CN01-0120 o Corynebacterium ammoniagenes CN01-0316 (KCCM 10992P). En el procedimiento para producir ácido 5’-inosínico según la presente invención, el microorganismo es Corynebacterium 5 ammoniagenes CN01-0316 (KCCM 10992P).

El cultivo del microorganismo del género Corynebacterium se realiza cultivando la cepa en un medio convencional que contiene adecuadas fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, aminoácidos, vitaminas o similares bajo condiciones aeróbicas ajustando la temperatura, el pH o similares.

Como fuentes de carbono, se pueden usar carbohidratos tales como glucosa y fructosa. Como fuente de nitrógeno, 10 se pueden usar diversas fuentes de nitrógeno inorgánico tales como amoníaco, cloruro de amonio y sulfato de amonio, y se pueden usar fuentes de nitrógeno orgánico tales como peptona, NZ-amina, extracto de carne de vaca, extracto de levadura, agua de macerado de maíz, hidrolisato de caseína, pescado o harina de pescado, y torta de soja desgrasada o harina. Ejemplos de los compuestos inorgánicos incluyen monohidrógeno fosfato de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, sulfato de magnesio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso y carbonato de calcio. 15 Cuando se necesita, se pueden usar vitaminas y bases auxótrofas.

El cultivo se realiza bajo condiciones aeróbicas, por ejemplo, sacudiendo el cultivo o agitando el cultivo, preferiblemente a una temperatura de 28 a 36 ºC. Durante el cultivo, el pH preferiblemente se mantiene dentro del intervalo de pH 6 a 8. El cultivo se puede realizar durante 4 a 6 días.

A continuación, la presente invención se describirá a más detalles en referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos 20 Ejemplos son solamente con propósitos ilustrativos, y la invención no pretende estar limitada por estos Ejemplos.

Ejemplo 1. Inserción de genes codificadores de las enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina usando el vector (pDZ) para la inserción cromosómica y de ese modo desarrollo de la cepa que produce alto rendimiento de ácido 5’-inosínico

Para insertar un gen ajeno en el cromosoma de la cepa de Corynebacterium ammoniagenes, se usó un vector 25 recombinante basado en pDZ que contenía dos copias consecutivas del gen correspondiente. El vector pDZ es un vector para la inserción cromosómica en el microorganismo del género Corynebacterium, y se preparó por el procedimiento descrito en la Publicación de Patente Coreana Nº 2008-0025355. La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra la estructura del vector pDZ.

Como se describe en las siguientes secciones (1) a (6), se prepararon vectores recombinantes, en los que los 30 vectores recombinantes sirven para insertar el gen codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis de purina en el cromosoma del microorganismo del género Corynebacterium para obtener dos copias de cada gen. La transformación por cada vector recombinante y la selección de los transformantes se realizó como sigue.

La cepa productora de ácido 5’-inosínico, Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 (KCCM-10610), se transformó con el vector recombinante pDZ que contenía el gen deseado codificador de la enzima relacionada con la biosíntesis 35 de purina por electroporación y, a continuación, se seleccionaron las cepas, en las cuales el gen portado por el vector está insertado en su cromosoma por recombinación homóloga, en un medio de selección que contenía 25 mg/l de kanamicina. La inserción cromosómica con éxito del vector se confirmó por el color de las colonias en un medio sólido (extracto de carne de vaca al 1 %, extracto de levadura al 1 %, peptona al 1 %, cloruro de sodio al 0,25 %, adenina al 1 %, guanina al 1 %, agarosa al 1, 5%) que contenía X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosido). 40 Es decir, se seleccionaron las colonias azules como un transformante, en el cual el vector estaba insertado en el cromosoma, La cepa, en la cual se insertó el vector en su cromosoma por un primer cruce, se cultivó con agitación (30 ºC, 8 horas) en un medio nutriente (glucosa al 1 %, extracto de carne de vaca al 1 %, extracto de levadura al 1 %, peptona al 1 %, cloruro de sodio al 0,25 %, adenina al 1 %, guanina al 1 %). A continuación, la cepa cultivada se diluyó en serie desde 10-4 a 10-10 y el cultivo diluido se sembró en placas con un medio sólido que contenía x-gal. La 45 mayoría de las colonias presentaron color azul, pero las colonias blancas también existieron a un nivel bajo. Seleccionando las colonias blancas, se seleccionaron las cepas en las que la secuencia del vector se separó del cromosoma por un segundo cruce. La cepa seleccionada se identificó como una cepa final por un ensayo de susceptibilidad para kanamicina y un análisis de secuencia de gen por PCR.

(1) Clonación del gen purFM y construcción del vector recombinante (pDZ-2purFM) 50

Los genes purF y purM están localizados cerca uno de otro en el cromosoma del microorganismo del género Corynebacterium y, por tanto, se construyó un vector purFM que contenía ambos genes y la región promotora para expresar ambos genes al mismo tiempo.

El cromosoma se aisló de Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 que produce ácido 5’-inosínico, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el cromosoma como molde para obtener purFM, concretamente, 55 un fragmento que contenía purF y purM consecutivamente colocados. Se usó ADN Polimerasa de alta fidelidad

PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa con 30 ciclos de desnaturalización a 96 ºC durante 30 s, emparejamiento a 53 ºC durante 30 s, y polimerización a 72 ºC durante 2 min. Como resultado, se obtuvieron dos genes purFM que contenían la región promotora (purFM-A, purFM-B). El purFM-A se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO. 1 y 2, y el purFM-B se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO 3 y 4. Los productos de amplificación se clonaron en un vector de E. coli pCR2.1 usando un kit de 5 clonación TOPO (Invitrogen) para obtener los vectores pCR-purFM-A y pCR-purFM-B, respectivamente. Los vectores pCR se trataron con enzimas de restricción contenidas en cada extremo del purFM-A y purFM-B (purFM-A: EcoRI+XbaI, purFM-B: XbaI+HindIII), y cada gen purFM se separó de los vectores pCR. Después de eso, el vector pDZ tratado con enzimas de restricción, EcoRI y HindIII se clonó por ligación de 3 trozos para construir un vector recombinante pDZ-2purFM en el que los dos genes purFM se clonan consecutivamente. La Figura 2 muestra un 10 vector pDZ-2purFM para la inserción cromosómica en Corynebacterium.

La cepa productora de ácido 5’-inosínico, Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 se transformó con el vector pDZ-2purFM por electroporación, y un gen purFM se insertó además cerca del gen purFM intrínseco en el cromosoma por un segundo cruce, para obtener una cepa que tenía total dos copias. Los genes purFM consecutivamente insertados se identificaron por PCR usando los cebadores de SEQ ID NO 5 y 6 que son capaces 15 de amplificar las regiones de conexión de dos genes purFM.

(2) Clonación del gen purNH y construcción del vector recombinante (pDZ-2purNH), preparación de la cepa insertada con purNH

Los genes purN y purH están localizados cerca uno de otro en el cromosoma del microorganismo del género Corynebacterium y, por tanto, se construyó un vector purNH que contenía la región promotora para expresar ambos 20 genes al mismo tiempo.

El cromosoma se aisló de Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 que produce ácido 5’-inosínico, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el cromosoma como molde para obtener purNH, concretamente, un fragmento que contenía purN y purH consecutivamente colocados. Se usó ADN Polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa con 30 ciclos de 25 desnaturalización a 96 ºC durante 30 s, emparejamiento a 53 ºC durante 30 s, y polimerización a 72 ºC durante 2 min. Como resultado, se obtuvieron dos genes purNH que contenían la región promotora (purNH-A, purNH-B). El purNH-A se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO. 7 y 8, y el purNH-B se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO 8 y 9. Los productos de amplificación se clonaron en un vector de E. coli pCR2.1 usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen) para obtener los vectores pCR-purNH-A y pCR-purNH-B, respectivamente. Los 30 vectores pCR se trataron con enzimas de restricción contenidas en cada extremo del purNH-A y purNH-B (purNH-A: BamHI+SalI, purNH-B: SalI), y cada gen purNH se separó de los vectores pCR. Después de eso, el vector pDZ tratado con enzimas de restricción, BamHI y SalI se clonó por ligación de 3 trozos para construir un vector recombinante pDZ-2purNH en el que los genes purNH se clonan consecutivamente. La Figura 3 muestra un vector pDZ-2purNH para la inserción cromosómica en Corynebacterium. 35

La cepa productora de ácido 5’-inosínico, Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 se transformó con el vector pDZ-2purNH por electroporación, y un gen purNH se insertó además cerca del gen purNH intrínseco en el cromosoma por un segundo cruce, para obtener una cepa que tiene total dos copias. Los genes purNH consecutivamente insertados se identificaron por PCR usando los cebadores de SEQ ID NO 10 y 11 que son capaces de amplificar las regiones de conexión de dos genes purNH. 40

(3) Clonación del gen purSL y construcción del vector recombinante (pDZ-2purSL), preparación de la cepa insertada con purSL

Los genes purS y purL están localizados cerca uno de otro en el cromosoma del microorganismo del género Corynebacterium y, por tanto, se construyó un vector purSL que contenía la región promotora para expresar ambos genes al mismo tiempo. 45

El cromosoma se aisló de Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 que produce ácido 5’-inosínico, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el cromosoma como modelo para obtener purSL, concretamente, un fragmento que contenía purS y purL consecutivamente colocados. Se usó ADN Polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa con 30 ciclos de desnaturalización a 96 ºC durante 30 s, emparejamiento a 53 ºC durante 30 s, y polimerización a 72 ºC 50 durante 2 min. Como resultado, se obtuvieron dos genes purSL que contenían la región promotora (purSL-A, purSL-B). El purSL-A se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO. 12 y 13, y el purSL-B se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO 14 y 15. Los productos de amplificación se clonaron en un vector de E. coli pCR2.1 usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen) para obtener los vectores pCR-purSL-A y pCR-purSL-B, respectivamente. Los vectores pCR se trataron con enzimas de restricción contenidas en cada extremo del purSL-A 55 y purSL-B (purSL-A: BamHI+SalI, purSL-B: SalI+BamHI), y cada gen purSL se separó de los vectores pCR. Después de eso, el vector pDZ tratado con enzima de restricción, BamHI se clonó por ligación de 3 trozos para construir un vector recombinante pDZ-2purSL en el que los genes purSL se clonan consecutivamente. La Figura 4 muestra un vector pDZ-2purSL para la inserción cromosómica en Corynebacterium.

La cepa productora de ácido 5’-inosínico, Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 se transformó con el vector pDZ-2purSL por electroporación, y un gen purSL se insertó además cerca del gen purSL intrínseco en el cromosoma por un segundo cruce, para obtener una cepa que tiene total dos copias. Los genes purSL consecutivamente insertados se identificaron por PCR usando los cebadores de SEQ ID NO 16 y 17 que son capaces de amplificar las regiones de conexión de dos genes purSL. 5

(4) Clonación del gen purKE y construcción del vector recombinante (pDZ-2purKE), preparación de la cepa insertada con purKE

Los genes purK y purE están localizados cerca uno de otro en el cromosoma del microorganismo del género Corynebacterium y, por tanto, se construyó un vector purKE que contenía la región promotora para expresar ambos genes al mismo tiempo. 10

El cromosoma se aisló de Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 que produce ácido 5’-inosínico, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el cromosoma como molde para obtener purKE, concretamente, un fragmento que contenía purK y purE consecutivamente colocados. Se usó ADN Polimerasa PfuUltra™ de alta fidelidad (Stratagene) como polimerasa, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa con 30 ciclos de desnaturalización a 96 ºC durante 30 s, emparejamiento a 53 ºC durante 30 s, y polimerización a 72 ºC durante 2 15 min. Como resultado, se obtuvieron dos genes purKE que contenían la región promotora (purKE-A, purKE-B). El purKE-A se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO. 18 y 19, y el purKE-B se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO 20 y 21. Los productos de amplificación se clonaron en un vector de E. coli pCR2.1 usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen) para obtener los vectores pCR-purKE-A y pCR-purKE-B, respectivamente. Los vectores pCR se trataron con enzimas de restricción contenidas en cada extremo del purKE-A y purKE-B (purKE-A: 20 BamHI+KpnI, purKE-B: KpnI+XbaI), y cada gen purKE se separó de los vectores pCR. Después de eso, el vector pDZ tratado con enzimas de restricción, BamHI y XbaI se clonó por ligación de 3 trozos para construir un vector recombinante pDZ-2purKE en el que los genes purKE se clonan consecutivamente. La Figura 5 muestra un vector pDZ-2purKE para la inserción cromosómica en Corynebacterium.

La cepa productora de ácido 5’-inosínico, Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 se transformó con el vector 25 pDZ-2purKE por electroporación, y un gen purKE se insertó además cerca del gen purKE intrínseco en el cromosoma por un segundo cruce, para obtener una cepa que tiene total dos copias. Los genes purKE consecutivamente insertados se identificaron por PCR usando los cebadores de SEQ ID NO 22 y 23 que son capaces de amplificar las regiones de conexión de dos genes purKE.

(5) Clonación del gen purC y construcción del vector recombinante (pDZ-2purC), preparación de la cepa insertada 30 con purC

El cromosoma se aisló de Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el cromosoma como molde para obtener purC. Se usó ADN Polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa con 30 ciclos de desnaturalización a 96 ºC durante 30 s, emparejamiento a 53 ºC durante 30 s, y polimerización a 72 ºC durante 2 35 min. Como resultado, se obtuvieron dos genes purC que contenían la región promotora (purC-A, purC-B). El purC-A se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO. 24 y 25, y el purC-B se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO 25 y 26. Los productos de amplificación se clonaron en un vector de E. coli pCR2.1 usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen) para obtener los vectores pCR-purC-A y pCR-purC-B, respectivamente. Los vectores pCR se trataron con enzimas de restricción contenidas en cada extremo del purC-A y purC-B (purC-A: BamHI+Sall, 40 purC-B: Sall), y cada gen purC se separó de los vectores pCR. Después de eso, el vector pDZ tratado con enzimas de restricción, BamHI y Sall se clonó por ligación de 3 trozos para construir un vector recombinante pDZ-2purC en el que los genes purC se clonan consecutivamente. La Figura 6 muestra un vector pDZ-2purC para la inserción cromosómica en Corynebacterium.

La cepa productora de ácido 5’-inosínico, Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 se transformó con el vector 45 pDZ-2purC por electroporación, y un gen purC se insertó además cerca del gen purC intrínseco en el cromosoma por un segundo cruce, para obtener una cepa que tiene total dos copias. Los genes purC consecutivamente insertados se identificaron por PCR usando los cebadores de las SEQ ID NO 27 y 28 que son capaces de amplificar las regiones de conexión de dos genes purC.

(6) Clonación del gen prs y construcción del vector recombinante (pDZ-2prs), preparación de la cepa insertada con 50 prs

El cromosoma se aisló de Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el cromosoma como molde para obtener prs. Se usó ADN Polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (Stratagene) como polimerasa, y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa con 30 ciclos de desnaturalización a 96 ºC durante 30 s, emparejamiento a 53 ºC durante 30 s, y polimerización a 72 ºC durante 2 55 min. Como resultado, se obtuvieron dos genes prs que contenían la región promotora (prs-A, prs-B). El prs-A se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO. 29 y 30, y el prs-B se amplificó usando los cebadores de SEQ ID NO 31 y 32. Los productos de amplificación se clonaron en un vector de E. coli pCR2.1 usando un kit de clonación

TOPO para obtener los vectores pCR-prs-A y pCR-prs-B, respectivamente. Los vectores pCR se trataron con enzimas de restricción contenidas en cada extremo del prs-A y prs-B (prs-A: BamHI+Spel, prs-B: Spel+Pstl), y cada gen prs se separó de los vectores pCR. Después de eso, el vector pDZ tratado con enzimas de restricción, BamHI y Pstl se clonó por ligación de 3 trozos para construir un vector recombinante pDZ-2prs en el que los genes prs se clonan consecutivamente. La Figura 7 muestra un vector pDZ-2prs para la inserción cromosómica en 5 Corynebacterium.

La cepa productora de ácido 5’-inosínico, Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 se transformó con el vector pDZ-2prs por electroporación, y un gen prs se insertó además cerca del gen prs intrínseco en el cromosoma por un segundo cruce, para obtener una cepa que tiene total dos copias. Los genes prs consecutivamente insertados se identificaron por PCR usando los cebadores de SEQ ID NO 33 y 34 que son capaces de amplificar las regiones de 10 conexión de dos genes prs.

(7) Desarrollo de la cepa productora de alto rendimiento de ácido 5’-ionísico por aumento de la biosíntesis de purina

Se introdujeron combinaciones de los vectores pDZ-2purFM, pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, y pDZ-2prs construidos en (1) a (6) en el Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 que produce ácido 5’-inosínico. El orden de introducción de los vectores se seleccionó al azar, y los procedimientos de introducción e identificación 15 usados eran los mismos que los anteriores.

Se usó el Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401 como cepa parental, y se transformó con una combinación de pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, y pDZ-2prs, y una combinación de pDZ-2purNH, pDZ-2purSL, pDZ-2purKE, pDZ-2purC, pDZ-2purFM y pDZ-2prs para obtener Corynebacterium ammoniagenes CN01-0120 (2purNH + 2purSL + 2purKE + 2purC + 2prs) y Corynebacterium ammoniagenes CN01-0316 (2purNH + 2purSL + 20 2purKE + 2purC + 2purFM + 2prs), que contenía dos copias de los genes codificadores de las enzimas fundamentales implicadas en la ruta biosintética de purina.

Ejemplo 2. Titulación de fermentación de Corynebacterium ammoniagenes recombinante

Se distribuyeron alícuotas de 3 ml del medio de siembra con la siguiente composición en tubos de ensayo que tenían un diámetro de 18 mm, y se esterilizaron bajo presión. A continuación, se inocularon la cepa parental de 25 Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401, y el Corynebacterium ammoniagenes CN01-0120 y Corynebacterium ammoniagenes CN01-0316 preparados en el Ejemplo 1, y se cultivaron con agitación a 30 ºC durante 24 horas para usarse como cultivo de siembra. Alícuotas de 27 ml del medio de fermentación con la siguiente composición se distribuyeron en matraces de agitación Erlenmeyer de 500 ml y se esterilizaron bajo presión a 120 ºC durante 10 minutos, y se inocularon alícuotas de 3 ml del cultivo de siembra en los mismos y se cultivaron con agitación durante 30 5 a 6 días. El cultivo se llevó a cabo bajo las condiciones de 200 rpm, 32 ºC y pH 7,2.

El medio de siembra y el medio de fermentación usados tienen las siguientes composiciones.

Medio de siembra: glucosa al 1 %, peptona al 1 %, extracto de carne de vaca al 1 %, extracto de levadura al 1 %, cloruro de sodio al 0,25 %, 100 mg/l de adenina, 100 mg/l de guanina, pH 7,2.

Medio de fermentación en matraz: glutamato sódico al 0,1 %, cloruro de amonio al 1 %, sulfato de magnesio al 1,2 35 %, cloruro de calcio al 0,01 %, 200 mg/l de sulfato de hierro, 20 mg/l de sulfato de manganeso, 20 mg/l de sulfato de zinc, 5 mg/l de sulfato de cobre, 23 mg/l de L-cisteína, 24 mg/l de alanina, 8 mg/l de ácido nicotínico, 45 µg/l de biotina, 5 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 30 mg/l de adenina, ácido fosfórico al 1,9 % (85 %), glucosa al 4,2 % y azúcar puro al 2,4 %.

Después del término del cultivo, se midió la productividad de ácido 5’-inosínico por HPLC, y la cantidad de 40 acumulación de ácido 5’-inosínico en el medio de cultivo se muestra en la siguiente Tabla.

Tabla 1

Nombre cepa

DO celular (5 días después del cultivo) Productividad (g/l/h) (5 días después del cultivo)

Grupo control (CJIP2401)

31,2 0,136

CN01-0120

31,8 0,155

CN01-0316

31,3 0,149

La cantidad de acumulación de ácido 5’-inosínico en el medio de cultivo se comparó con la de la cepa parental, Corynebacterium ammoniagenes CJIP2401. Como resultado, en Corynebacterium ammoniagenes CN01-0120 y 45 Corynebacterium ammoniagenes CN01-0316, su productividad de ácido 5’-inosínico por hora se encontró que se incrementó a 10,9 a 11,4 % bajo las mismas condiciones, en comparación con la cepa parental, Corynebacterium

ammoniagenes CJIP2401.

El Corynebacterium ammoniagenes CN01-0316 que tenía productividad mejorada de ácido 5’-inosínico mediante el incremento de la actividad de las enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina se depositó en el “Korean Culture Center of Microorganisms” (KCCM) localizado en Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Nº de referencia KCCM 10992P el 19 de febrero de 2009 bajo el tratado de Budapest. 5

Efecto de la invención

El microorganismo perteneciente al género Corynebacterium que produce ácido 5’-inosínico según la presente invención, en el cual se incrementa la expresión del gen codificador de las enzimas relacionadas con la biosíntesis de purina más que la expresión intrínseca, se puede usar para producir ácido 5’-inosínico en una alta concentración y un alto rendimiento, reduciendo de ese modo los costes de producción. 10

<110> CJ CheilJedang Coroporation

<120> Microorganismo perteneciente al género Corynebacterium que tiene productividad mejorada de ácido 5’-inosínico y método para producir ácido 5’-inosínico usando el mismo

<160> 43 15

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 30 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para purFM 25

<400> 1

cgacgagaat tccccgaccc gcatgagatg 30

<210> 2 30

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35

<223> Cebador para purFM

<400> 2

gtatcgtcta gagcggtagc ggtggcttcg 30

40

<210> 3

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

45

<220>

<223> Cebador para purFM

<400> 3

cgacgatcta gacccgaccc gcatgagatg 30 50

<210> 4

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 55

<220>

<223> Cebador para purFM

<400> 4 60

gtatcgaagc ttgcggtagc ggtggcttcg 30

<210> 5

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5

<223> Cebador para 2purFM

<400> 5

gctatcgttt cccctgaa 18

10

<210> 6

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Cebador para 2purFM

<400> 6

tgattctact aagtttgc 18 20

<210> 7

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Cebador para purNH

<400> 7 30

cgggatcccg aggcgaagac gatattgagg acag 34

<210> 8

<211> 32

<212> ADN 35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para purNH

40

<400> 8

acgcgtcgac gtgggaaacg cagacgagaa ca 32

<210> 9

<211> 35 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para purNH 50

<400> 9

acgcgtcgac gaggcgaaga cgatattgag gacag 35

<210> 10 55

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 60

<223> Cebador para 2purNH

<400> 10

tcgatgcctg catcttgg 18

65

<210> 11

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5

<223> Cebador para 2purNH

<400> 11

ggcgataagg cttcgagt 18

10

<210> 12

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Cebador para purSL

<400> 12

gctcggatcc gcgatactca gccccagcaa cagcagaaaa tgaagc 46 20

<210> 13

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Cebador para purSL

<400> 13 30

cagcgtcgac gcagccgtcg caggcaccat cgcagcagt 39

<210> 14

<211> 46

<212> ADN 35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para purSL

40

<400> 14

cagcgtcgac gcgatactca gccccagcaa cagcagaaaa tgaagc 46

<210> 15

<211> 39 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para purSL 50

<400> 15

gctcggatcc gcagccgtcg caggcaccat cgcagcagt 39

<210> 16 55

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 60

<223> Cebador para 2purSL

<400> 16

acttgacctc cagcccta 18

65

<210> 17

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5

<223> Cebador para 2purSL

<400> 17

aagaacaacg tcggcgtc 18

10

<210> 18

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Cebador para purKE

<400> 18

acgtcaggat cccctatcgt gctttgctgt 30 20

<210> 19

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Cebador para purKE

<400> 19 30

ctctaaggta ccattggtac tagtagccgc 30

<210> 20

<211> 30

<212> ADN 35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para purKE

40

<400> 20

acgtcaggta cccctatcgt gctttgctgt 30

<210> 21

<211> 30 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para purKE 50

<400> 21

ctctaatcta gaattggtac tagtagccgc 30

<210> 22 55

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 60

<223> Cebador para 2purKE

<400> 22

ccagctgggg ttccggtt 18

65

<210> 23

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5

<223> Cebador para 2purKE

<400> 23

tttcgatgcg cttcgttt 18

10

<210> 24

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Cebador para purC

<400> 24

gctcggatcc cgcagtggct gttgcgctga acatgcg 37 20

<210> 25

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Cebador para purC

<400> 25 30

gcaggtcgac cacggacata tcggtttgct tcacgcggg 39

<210> 26

<211> 37

<212> ADN 35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para purC

40

<400> 26

gcaggtcgac cgcagtggct gttgcgctga acatgcg 37

<210> 27

<211> 24 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para 2purC 50

<400> 27

gagcgcttgt ccggcaagcg tttc 24

<210> 28 55

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 60

<223> Cebador para 2purC

<400> 28

ggtggttgcg gtaagaaccc ggcc 24

65

<210> 29

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5

<223> Cebador para prs

<400> 29

gctcggatcc ggattcccaa gcttgcttcc ggg 33

10

<210> 30

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Cebador para prs

<400> 30

cagcactagt ggcagctacc acctccgcgg ctgctg 36 20

<210> 31

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Cebador para prs

<400> 31 30

cagcactagt ggattcccaa gcttgcttcc ggg 33

<210> 32

<211> 37

<212> ADN 35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para prs

40

<400> 32

caattctgca gggcagctac cacctccgcg gctgctg 37

<210> 33

<211> 23 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador para 2prs 50

<400> 33

cgtacgattc atgagatctt cga 23

<210> 34 55

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 60

<223> Cebador para 2prs

<400> 34

caaagtcacg ggcggtggta g 21

65

<210> 35

<211> 1500

<212> ADN

<213> Corynebacterium ammoniagens

<220> 5

<221> gen

<222> (1)..(1500)

<223> purF

<400> 35 10

<210> 36

<211> 606 15

<212> ADN

<213> Corynebacterium ammoniagens

<220>

<221> gen

<222> (1)..(606)

<223> purN

5

<400> 36

<210> 37

<211> 243 10

<212> ADN

<213> Corynebacterium ammoniagens

<220>

<221> gen 15

<222> (1)..(243)

<223> purS

<400> 37

20

<210> 38

<211> 2277

<212> ADN 25

<213> Corynebacterium ammoniagens

<220>

<221> gen

<222> (1)..(2277) 30

<223> purL

<400> 38

<210> 39

<211> 1056

<212> ADN 5

<213> Corynebacterium ammoniagens

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1056) 10

<223> purM

<400> 39

15

<210> 40

<211> 1779

<212> ADN

<213> Corynebacterium ammoniagens 20

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1779)

<223> purKE

<400> 40 5

<210> 41

<211> 888

<212> ADN

<213> Corynebacterium ammoniagens

<220> 5

<221> gen

<222> (1)..(888)

<223> purC

<400> 41 10

<210> 42

<211> 1551 15

<212> ADN

<213> Corynebacterium ammoniagens

<220>

<221> gen 20

<222> (1)..(1551)

<223> purH

<400> 42

25

<210> 43

<211> 1020

<212> ADN 5

<213> Corynebacterium ammoniagens

<400> 43

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un microorganismo Corynebacterium ammoniagenes transformado que produce ácido 5’-inosínico y depositado en el “Korean Culture Center of Microorganisms” el 19 de febrero de 2009 bajo el número de acceso de depósito KCCM 10992P.
2. 2. Un procedimiento de producción de ácido 5’-inosínico que comprende cultivar el microorganismo Corynebacterium 5 ammoniagenes según la reivindicación 1, y recuperar el ácido 5’-inosínico del medio de cultivo.