ES2324948T3 - Vector virico adeno-asociado para realizar un salto de exones en un gen que codifica una proteina con campos prescindibles. - Google Patents

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Abstract

Vector vírico adeno-asociado, que comprende: - una secuencia ARNsn modificada de tipo U7; - el promotor nativo de U7; - por lo menos una secuencia antisentido dirigida contra por lo menos un sitio de corte y empalme de por lo menos un exón, codificando dicho exón un dominio prescindible de la distrofina.

Description

Vector vírico adeno-asociado para realizar un salto de exones en un gen que codifica una proteína con campos prescindibles.
La presente invención se refiere al uso de vectores víricos adeno-asociados o vector AAV, para suministrar a unas células dianas, unas secuencias antisentido dirigidas contra unos sitios de corte y empalme de un gen que codifica una proteína de campos prescindibles, así como a sus aplicaciones terapéuticas, en particular en el tratamiento de la enfermedad de Duchenne.
Así, unas secuencias seleccionadas de forma juiciosa introducidas en un vector según la invención son capaces de dar lugar a unos transcritos que producen una proteína distrofina más corta, pero funcional, que corrige ciertas formas de la enfermedad de Duchenne.
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética contenida en el cromosoma X y que afecta aproximadamente a 1 joven de cada 3.500. Esta enfermedad se caracteriza por la ausencia de una proteína de 427 kilodaltons, la distrofina citoesquelética, lo que tiene por consecuencia la muerte de las fibras musculares, correlacionada con un deterioro muscular severo y progresivo.
La distrofina es una proteína modular que presenta una región central compuesta por 24 dominios repetidos de tipo "spectrin-like". Unas proteínas desprovistas de algunas de estas secuencias repetidas pueden sin embargo ser perfectamente funcionales o por lo menos sólo parcialmente defectivas, tal como se observa en las formas atenuadas (Becker) de DMD.
Por el contrario, la mayoría de las mutaciones graves del gen de la distrofina consiste en unas deleciones de uno o más exones que perturban el cuadro de lectura del mensaje final o bien unas mutaciones puntuales, presentes en las regiones codificantes o exones, que introducen unos codones stop o unos desajustes de la fase de lectura. En los dos casos, estas mutaciones se traducen por la ausencia de distrofina.
A título ilustrativo, un gran número de casos clínicos de la enfermedad de Duchenne está relacionado con unas deleciones multiexónicas (genotipos DMD severos: \Delta45-50; \Delta47-50; \Delta48-50A 49-50: \Delta50; \Delta) cuyo cuadro de lectura podría ser restablecido mediante la supresión del exón 51 (genotipos BMD ligeros: \Delta45-51; \Delta47-51; \Delta48-51A; 49-51 \Delta 51-52).
Se han previsto diferentes estrategias y técnicas para intentar "reparar" los genes mutados de la distrofina.
La sustitución del gen de la distrofina en las fibras musculares enfermas, o la compensación mediante unos injertos de células sanas de las células necrosadas, reveló unas dificultades considerables.
La tercera vía prevista, actualmente la más usada, consiste en intentar reparar el ADN mutado gracias al uso de oligonucleótidos antisentido (o AON) que permiten saltar ciertos exones y conseguir así la expresión de una proteína truncada pero funcionalmente eficaz. Esta técnica denominada "salto de exón" o "exon skipping" preconiza el uso de oligonucleótidos complementarios de unas secuencias implicadas en el corte y empalme de los exones a
enmascarar.
Los estudios actualmente llevados a cabo sobre esta vía están realizados esencialmente en unos ratones mdx que padecen dicha enfermedad, debido a una mutación no-sentido que introduce un codón stop en el exón 23 del gen murino de la distrofina.
La principal dificultad de esta tecnología consiste en introducir de manera estable y duradera un oligonucleótido (AON) no degradado en las fibras musculares enfermas, en particular in vivo.
En un primer tiempo, se ha previsto inyectar directamente dichos oligonucleótidos, eventualmente en asociación con un detergente sintético tal como el agente F127. Así, unas secuencias ventajosas a administrar por esta vía para enmascarar el exón 19 ó 45 del gen humano de la distrofina se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patente EP 1 054 058 y EP 1 191 098, respectivamente. Sin embargo, a la vista de la corta duración de vida de estos oligonucleótidos en el músculo, este modo de tratamiento necesita unas inyecciones regulares, relativamente apremiantes.
Por otro lado, se ha intentado introducir estas secuencias en unos vectores para vehicularlos en las células diana. En la actualidad, sólo se han realizado unos ensayos in vitro: las construcciones usadas se basan en el uso de retrovirus y se ensayan únicamente sobre unos cultivos celulares. Los resultados reportados resultan ser poco concluyentes, o por lo menos insuficientes para prever una transcripción in vivo.
Por ejemplo, el documento WO 02/24906 ilustra el uso de estos dos métodos distintos para excluir el exón 46 en unas células humanas.
\newpage
El conjunto de los trabajos realizados sobre la transferencia vectorial de los AON ha revelado principalmente que:
i)
la presencia de pequeñas secuencias de tipo ARNsn (smal nuclear RNA) permite una mejor translocación a nivel del núcleo de las células diana y una mejor transcripción de las secuencias. Así, el documento WO 03/095647preconiza la selección ventajosa de los ARNsn de tipo U2 y U3;
ii)
la presencia simultánea de dos secuencias diana implicadas en el corte y empalme de un mismo exón mejora la eficacia del salto de dicho exón (1, 2).
Sin embargo, en la actualidad, no se ha propuesto ninguna solución para realizar salto de exones in vivo, salvo la inyección de oligonucleótidos con los inconvenientes mencionados anteriormente.
Por primera vez, los inventores proponen una construcción que proporciona unos resultados in vivo notables en cuanto a la restauración de la actividad de la proteína distrofina en el contexto de la enfermedad de Duchenne.
Con este fin, la invención propone construir un vector vírico adeno-asociado que comprende:
-
una secuencia ARNsn modificada de tipo U7;
-
el promotor nativo de U7;
-
por lo menos una secuencia antisentido dirigida contra por lo menos un sitio de corte y empalme de por lo menos un exón, codificando dicho exón un dominio prescindible de la distrofina.
En la continuación de la descripción, el conjunto constituido por estas tres entidades (secuencia ARNsn/promotor U7/secuencia(s) antisentido(s)) se denomina "casete U7".
Entre la multitud de vectores disponibles, el solicitante ha seleccionado ventajosamente un vector de origen vírico, a saber, un derivado de los virus adeno-asociados o AAV.
Entre los 8 estereotipos identificados, el AAV usado en el contexto particular de la DMD es preferentemente un AAV1, es decir, que está compuesto por una cápside del serotipo 1. En efecto, el AAV1 parece transducir más eficazmente las células musculares.
Por el contrario, las secuencias de origen viral, en particular las ITR, asociadas al transgén proceden ventajosamente de AAV2. Resulta de ello que el vector viral adeno-asociado final es, según un modo ventajoso de realización, un pseudotipo 2/1.
Dicho vector contiene además una secuencia ARNsn modificada. Los ARNsn o small nuclear RNA son unos ARN de tamaño pequeño, presentes en el núcleo de las células e implicados en ciertas etapas de maduración de los pre-ARNm. Se denominan U1, U2...U10.
Entre estos diferentes tipos de ARNsn, el del tipo U7 implicado normalmente en la maduración de los ARN premensajeros que codifican las histonas se usa preferentemente como vehículo.
El ARNsn en cuestión puede ser tanto de origen humano como murino, en la medida en que estas pequeñas secuencias están altamente conservadas entre las diferentes especies. Preferentemente, el ARNsn usado en la invención es el de ratón.
Mediante la expresión "ARNsn modificado" se entiende un ARN en el que las secuencias implicadas en la función inicial del ARNsn están desactivadas. Estas secuencias pueden ser asimismo modificadas de manera que aumentan el nivel de expresión de dicho ARNsn.
Por ejemplo, en el caso de U7, la secuencia del sitio de fijación de la "small nuclear ribonucleoproteine" (o Sm proteine) se modifica de manera que desactiva la maduración de los ARN premensajeros que codifican las histonas y paralelamente que aumenta la concentración nuclear en U7ARNsn. Por otro lado, la secuencia de 18 nucleótidos complementarios del sitio 3' de maduración de los ARN premensajeros que codifican las histonas se sustituye por las secuencias antisentido de interés.
En la práctica, estas modificaciones se pueden introducir mediante la mutagénesis dirigida por PCR.
El gen ARNsn así modificado se clona a continuación en el vector AAV, preferentemente entre sus dos secuencias ITR.
La presente invención podría realizarse asimismo con unas secuencias U1 o U2, pero por medio de más modificaciones y para una eficacia menor.
\newpage
Un vector según la invención comprende asimismo un promotor que permite expresar las secuencias antisentido a un nivel suficiente para asegurar su actividad biológica y terapéutica. Numerosos promotores susceptibles de ser utilizados en el contexto de los AAV son conocidos por el experto en la materia. Sin embargo, según un modo privilegiado de realización, la expresión de las secuencias antisentido se dispone bajo el control del promotor nativo del ARNsn usado en la construcción. En el caso en el que se prefiere el U7, es por lo tanto el promotor de U7 quien asegura la transcripción de las secuencias antisentido.
El vector según la invención comprende asimismo por lo menos una secuencia antisentido dirigida contra por lo menos un sitio de corte y empalme de por lo menos un exón, es decir, capaz de interferir con el corte y empalme de dicho exón. La secuencia antisentido es preferentemente una secuencia complementaria de por lo menos una secuencia seleccionada de entre el grupo siguiente: sitio de corte y empalme 5' (donante); sitio de corte y empalme 3' (aceptor); secuencia intrónica BP (Branching Point); y eventualmente unas regiones internas ricas en purina, más específicamente unos ESE (Exon-internal Splicing Enhancer).
Ventajosamente, para asegurar la exclusión de un mismo exón, dos secuencias antisentido que tienen unas dianas distintas, preferentemente el sitio 5' donante y la secuencia BP, se introducen en un mismo vector recombinante según la invención.
Asimismo, se pueden asociar en una misma construcción unas secuencias antisentido dirigidas contra unos sitios de corte y empalme de por lo menos dos exones distintos.
Alternativamente, es posible usar varias construcciones, conteniendo cada una una secuencia antisentido distinta, siendo dichas secuencias dirigidas contra uno o más exones.
En la práctica, cuando se asocian varias secuencias antisentido (dirigidas contra el mismo exón o varios exones distintos), se pueden presentar los diferentes casos de figura siguientes:
-
las secuencias antisentido están integradas en un mismo casete U7, contenido por un único vector AAV; o
-
las secuencias antisentido están integradas en diferentes casetes U7, contenidos por un único vector AAV; o
-
las secuencias antisentido están integradas en diferentes casetes U7; cada uno contenido por un vector AAV.
En el marco de la invención, las secuencias antisentido son específicas de los diferentes sitios de corte y empalme de los exones que constituyen el gen de la distrofina, sea cual sea su origen.
El gen murino de la distrofina presenta un interés evidente puesto que el ratón constituye un modelo animal experimental de calidad. Así, un ratón mdx, que contiene una mutación en el exón 23 del gen murino de la distrofina y que produce una proteína truncada desactivada, presenta los síntomas de la DMD. En este contexto, las secuencias antisentido están por lo tanto dirigidas contra las secuencias implicadas en el corte y empalme del exón 23.
Más particularmente, un vector según la invención comprende una secuencia SEC ID nº 1 que comprende un gen U7ARNsn modificado tal como se ha descrito anteriormente, y que integra unas secuencias antisentido dirigidas contra el sitio 5' donante (SEC ID nº 2) y la secuencia BP (SEC ID nº 3) del exón 23 del gen murino de la distrofina dispuestas bajo el control del promotor U7, introducido entre las 2 secuencias ITR del vector AAV.
De manera muy interesante, la funcionalidad de dichos vectores ha sido validada por el solicitante en un animal de gran tamaño, a saber, el perro. En efecto, existen unos perros que padecen naturalmente miopatías debido a una mutación en el sitio aceptor de corte y empalme del intrón 6 de manera que no tener en cuenta del exón 7 en el ARNm final anula el cuadro de lectura, no estando los exones 6 y 8 en fase. El salto simultáneo de los exones 6 y 8 permite teóricamente restaurar un cuadro de lectura operacional, estando entonces el ARNm final desprovisto de los exones 6, 7 y 8. Así, la asociación de vectores según la invención, que comprende las secuencias antisentido SEC ID 27 y 28, dirigidas contra unas regiones ESE de los exones 6 y 8, respectivamente, resultó eficaz.
Con vistas a la terapia humana, las secuencias antisentido seleccionadas son dirigidas contra por lo menos un sitio de corte y empalme de por lo menos un exón del gen humano de la distrofina, cuya exclusión genera una proteína truncada pero activa.
Tal como se ha expuesto anteriormente, el exón 51 del gen humano de la distrofina, y más particularmente las secuencias implicadas en su corte y empalme, son unas dianas ventajosas en el marco de la invención. Así, su exclusión del transcrito que codifica la distrofina podría ser beneficiosa en el tratamiento de aproximadamente 20% de los casos clínicos genotipados de la enfermedad de Duchenne catalogados en la actualidad.
Así, los inventores han demostrado que una construcción adaptada en el marco de la invención comprendía la secuencia SEC ID nº 4, que asocia dos secuencias antisentido SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6 dirigidas contra unas regiones internas ricas en purinas del exón 51 del gen humano de la distrofina, en lugar de las secuencias SEC ID nº 2 y nº 3 en la secuencia SEC ID nº 1.
Otras secuencias antisentido humanas, que se pueden utilizar en el marco de la invención, son las siguientes:
-
DA5' de secuencia SEC ID nº 7 dirigida contra el sitio 5' del exón 51;
-
DA3' de secuencia SEC ID nº 8 dirigida contra el sitio 3' del exón 51;
-
G5' de secuencia SEC ID nº 9 dirigida contra el sitio 5' del exón 51;
-
GBP de secuencia SEC ID nº 10 dirigida contra el sitio BP del exón 51;
-
ESE4, ESE16 y ESE28 de secuencias SEC ID nº 11, nº 12, y nº 13, respectivamente, dirigidas contra unos sitios de tipo ESE del exón 51;
-
Ex51AONlong1 de secuencia SEC ID nº 25;
-
Ex51AONlong2 de secuencia SEC ID nº 26.
Estas secuencias están preferentemente asociadas en tándem en un vector según la invención. Preferentemente, se asocian DA5' (SEC ID nº 7) y DA3' (SEC ID nº 8) o G5' (SEC ID nº 9) y GBP (SEC ID nº 10).
Las secuencias SEC ID nº 25 y SEC ID nº 26 corresponden a las secuencias SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6 más largas. Preferentemente, éstas se asocian. Debido a su gran tamaño, cada una está ventajosamente integrada en un casete U7 contenido o bien por el mismo vector AAV, o bien por dos vectores AAV distintos para usar en tándem.
Por lo tanto, forma parte asimismo de la invención cualquier tipo de célula transfectada por el vector recombinante, y en particular unas células musculares, en particular de tipo fibras musculares (miotubos), precursores musculares (mioblastos) o cualquier célula capaz de diferenciación muscular. No están previstas por la presente invención las células cepas humanas embrionarias y su uso.
Un tejido muscular o un organismo no humano transfectado por dicho vector están asimismo comprendidos en el alcance de la protección buscada. Entre los organismos no humanos, se prefieren los animales, en particular los ratones.
La presente solicitud describe por primera vez un potencial terapéutico para los vectores reivindicados. La presente invención se refiere por lo tanto asimismo a unas composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo por lo menos un vector tal como se define en la presente solicitud, así como al uso de este vector como medicamento. Además, tal como se ha mencionado anteriormente en lo referente a los vectores lentivíricos, unas células transfectadas pueden asimismo tener un potencial terapéutico en el ámbito de injertos.
Una composición farmacéutica según la invención contiene el vector o las células reivindicados, asociados con un vehículo farmacéuticamente aceptable e inerte.
Cuando los vectores según la invención son para inyectar a nivel de los músculos enfermos, la composición farmacéutica se presenta preferentemente en forma líquida. La concentración en vector, la cantidad a inyectar y la frecuencia de las inyecciones son fácilmente determinadas por el experto en la materia.
A la vista de los efectos notables observados in vivo sobre la restauración de la distrofina en las fibras musculares que padecen DMD, se reivindica asimismo el uso del vector o de las células según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de Duchenne.
Excepto el mal funcionamiento de la distrofina asociado a la enfermedad de Duchenne ilustrado en este caso, algunas miopatías están relacionadas por ejemplo con un mal funcionamiento de la proteína de campos prescindibles que es la disferlina y por lo tanto pueden ser tratadas con un vector según la invención.
En su uso in vivo, unos vectores según la invención resultaron ser estables, tener una localización subcelular específica y producir unas cantidades terapéuticamente activas y permanentes de antisentido.
Más generalmente, la presente solicitud demuestra el potencial del sistema AAV-U7ARNsn como herramienta para la desactivación o la modificación de ARNm en los animales.
La invención y las ventajas que se desprenden de la misma se pondrán más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos de realización siguientes con el apoyo de las figuras adjuntas.
Figura 1
(A)
El diagrama de arriba muestra una ilustración esquemática de la estructura de la distrofina intacta (427 kDa). Está compuesta por varios dominios: un dominio de unión a la actina (ABD) en N-terminal, un dominio central en forma de bastoncillo constituido por 24 motivos repetidos "spectrine-like" (R) así como 4 segmentos charnela (H) capaces de conferir flexibilidad, y un dominio rico en cisteínas (CR) que fija el \beta-distroglicano y otros elementos del complejo asociado a la distrofina, en la proximidad del extremo C-terminal. El diagrama del centro representa el ARNm de la distrofina (aproximadamente 14.000 bases) constituido por 79 exones. En los ratones mdx, la sustitución de una citosina por una timidina en el exón 23 en la posición 3185 de la secuencia codificante crea un codón stop prematuro. El diagrama de abajo muestra las secuencias diana a nivel de la secuencia BP (branch point; PB22; SEC ID nº 3) corriente arriba del exón 23 y corriente abajo del sitio donante de corte y empalme (SD23; SEC ID nº 2) para forzar la maquinaria encargada del corte y empalme a saltar el exón mutado manteniendo al mismo tiempo un cuadro de lectura abierto.
(B)
Estructura del vector AAV(U7-SD23/BP22). El casete U7-SD23/BP22 está constituido por el promotor U7 (posición -267 a +1, caja rayada), la secuencia U7 ARNsn modificada (caja gris y secuencia correspondiente por debajo) y las secuencias corriente abajo de la posición 116 (caja abierta). Este casete ha sido dispuesto entre dos secuencias invertidas repetidas terminales (ITR) de AAV2 (SEC ID nº 1).
Figura 2
(A)
Detección del ARNsn modificado U7-SD23/BP22 (a) y del ARNsn U7 endógeno (b) tras la inyección intramuscular del vector AAV. Se analizaron unas muestras de ARN totales a 0, 15 y 30 días (columna 1, 2 y 3, respectivamente) por RT-PCR. Los productos correspondientes de 60 pb han sido visualizados sobre gel de agarosa. Detección del ARNm de la distrofina con el salto del exón 23. Unas muestras de ARN totales han sido analizadas a 0, 15 y 30 días mediante RT-PCR anidada, usando unos pares de cebadores en el exón 20 y 26. La banda de 901 pb que corresponde al ARNm sin salto (*) es la única especie detectada el día 0 (columna 1), y está progresivamente sustituida por un fragmento de 688 pb (**) que corresponde al ARNm que ha perdido el exón 23.
(B)
Secuencia en ADN de la banda de 688 pb después de la purificación sobre gel.
(C)
Inmunodetección de las proteínas totales extraídas de los músculos tibiales anteriores, teñidas con unos anticuerpos monoclonales anti-distrofina Dysl (las flechas indican la distrofina completa de 427 kDa: columna 1, mdx, no inyectado; columna 2, mdx, 2 semanas después de la inyección; columna 3, mdx, 1 mes después de la inyección; columna 4, C57B16). Cada columna se cargó con una cantidad total de proteína de 40 gg. Se ha observado el mismo perfil con unos anticuerpos Dys2 (resultados no mostrados).
Figura 3: Restauración de la distrofina en unos ratones mdx después de la administración de AAV(U7-SD23/BP22). Coloración inmunológica con Dys2-Ab de secciones transversales completas del compartimiento "hind limb anterior" (músculo tibial anterior = TA y extensor digitorum longus* = EDL) de (A) C57B 16 normal, (B) mdx no tratados, (C-E) ratones mdx después de 2, 4 y 12 semanas tras la inyección intramuscular, y (F) mdx 4 semanas después de la liberación vectorial intraarterial. Escalas (A-D): 0,5 mm; (E-F): 1 mm.
Figura 4: Restauración del complejo proteico asociado a la distrofina en unos músculos mdx tratados. Las columnas de la izquierda, central y de la derecha muestran unas secciones del músculo tibial anterior de C57B 16 normal, mdx no tratados y ratones mdx después del tratamiento, respectivamente. Las secciones han sido inmunoteñidas frente a la distrofina (A, B, C), el \alpha-sarcoglicano (D, E, F), el \beta-sarcoglicano (G, H, I) y el \beta-distroglicano (J, K, L). El mismo lote de fibras inversoras (*), que presentan una distrofina así como el complejo proteico asociado, se muestra en las series de secciones de los ratones no tratados.
Figura 5: La restauración de la distrofina en unos músculos mdx tratados restablece la susceptibilidad normal al daño inducido por el ejercicio. (A) Registros superpuestos de la tensión producida por los músculos EDL de a) C57B16, b) mdx no tratados y c) ratones mdx: después de 45 días de tratamiento, durante 5 contracciones tónicas con extensión forzada. Los músculos aislados han sido sometidos a unas estimulaciones repetitivas (125 Hz) durante 360 ms, en unos intervalos de 3 min. Durante los primeros 160 ms, la tensión se desarrolla isométricamente, y después una extensión forzada que corresponde a 10% de la longitud L_{0} para la cual el músculo produce una fuerza máxima se ha impuesto a una velocidad de 1 longitud de fibra por segundo. Después de la relajación, el músculo ha vuelto a su longitud de reposo. La caída de la fuerza ha sido cuantificada por (F_{1}-F_{5})/F_{1}, representando F_{1} la fuerza isométrica desarrollada justo antes de la extensión en el primer tétanos, y F_{5} la del quinto. La caída de la fuerza alcanzó como media 15% para unos músculos C57B16 contra 65% en mdx. Para los mdx mostrados en c), la reducción de la caída de la fuerza ha sido de 17%, lo que indica una plena readquisición de las propiedades mecánicas de las fibras musculares. (B y C) Detección con azul de Evans de las fibras musculares dañadas por el ejercicio en los tibiales anteriores de las patas no tratadas (B) o tratadas (C) de un solo animal mdx, 60 días después de la administración del tratamiento. Las fibras dañadas incorporan el azul de Evans, cuya fluorescencia se detecta en el canal rojo. La distrofina ha sido teñida inmunológicamente con Ab-dys2 (verde).
Figura 6
(A)
Secuencia de la región intrón 5-intrón 8 en el perro GRMD. La mutación responsable del fenótipo está identificada.
(B)
Esquema del corte y empalme del ARNm en el perro GRMD.
(C)
Esquema de la interrupción de la fase de lectura al final del exón 6 que llega a una distrofina atrofiada.
Figura 7
(A)
Localización de las secuencias dianas situadas en las secuencias ESE del exón 6 (C6ESE2; SEC ID nº 27) y del exón 8 (C8ESE1; SEC ID nº 28).
(B)
Esquema del corte y empalme del ARNm en el perro GMRD, después del salto de exones múltiples realizado con las secuencias antisentido C6ESE2 y C8ESE1.
(C)
Esquema de la secuencia proteica de la distrofina sintetizada tras el salto de exones múltiples.
Figura 8: Restauración de la distrofina en unos perros GRMD adultos, obtenida 2 meses después de una única inyección intramuscular de una preparación que contiene los vectores AAV(U7-ex6) que integran la secuencia antisentido SEC ID nº 27 y AAV(U7-ex8) que integran la secuencia antisentido SEC ID nº 28. Coloración inmunológica con Dys2-Ab de secciones transversales completas. Escala 1 mm.
Figura 9: Inmunodetección de las proteínas totales extraídas de los músculos tibiales anteriores, teñidas con unos anticuerpos monoclonales anti-distrofina Dys2: columna 1, distrofina humana en sujeto sano; Columna 2, distrofina en perro sano; columna 3, perro GRMD 2 meses después del tratamiento; columna 4, perro GRMD no tratado. Cada columna ha sido cargada con una cantidad total de proteína de 40 \mug.
Figura 10
(A)
Localización de las secuencias dianas que permiten el salto del exón 51 en el gen humano de la distrofina: la secuencia antisentido H51a tiene la secuencia SEC ID nº 6 y la secuencia antisentido H51b tiene la secuencia SEC ID nº 5. Las secuencias antisentido AS y DS son tal como se describen por DeAngelis (1).
(B)
Esquema de la integración del casete U7 en el vector lentiviral.
(C)
Detección del ARNm de la distrofina humana con el salto del exón 51. Las muestras de ARN totales han sido analizadas por RT-PCR anidada. La flecha negra corresponde al ARNm sin salto (*), mientras que la flecha blanca indica el ARNm desprovisto del exón 51.
Figura 11: Restauración de la distrofina en unos ratones SCID-mdx, obtenida 1 mes y medio después de la inyección en los músculos tibiales anteriores de células cepas delta 49-50 transducidas por el vector Lent(U7-H51ab) que integra las secuencias antisentido SEC ID nº 5 y nº 6. Coloración inmunológica con Dys3.
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A- Estudio experimental en el ratón I) Material y métodos 1. Construcciones
El gen completo U7 ARNsn (445 pb) ha sido obtenido por PCR sobre el ADN genómico del ratón con los oligonucleótidos: 5'-TAACAACATAGGAGCTGTG-3' (SEC ID nº 14) y 5'-CAGATACGCGTTTCCTAGGA-3' (SEC ID nº 15). El dominio Sm (AATTTGTCTAG; SEC ID nº 16) ha sido optimizado en smOPT (AATTTTTGGAG; SEC ID nº 17), tal como se ha descrito anteriormente (3), y la región del U7 capaz de enlazarse con el pre-ARNm ha sido intercambiada con una secuencia de 44 nucleótidos complementarios al mismo tiempo de la región que cubre la secuencia BP (branch point) corriente arriba del exón 23 del gen de la distrofina (BP22: 5'-AAATAGAAGTT
CATTTACACTAAC-3'; SEC ID nº 3) y la región corriente abajo del sitio donante de corte y empalme (SD23: 5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCT-3'; SEC ID nº 2). El fragmento resultante U7smOPT-SD23/BP22 se insertó a continuación entre 2 secuencias invertidas repetidas terminales de AAV2 (SEC ID nº 1).
2. Vectores
Se han preparado unos vectores recombinantes pseudotipados AAV2/1 en unas células 293, tal como ya se ha descrito (4), cotransfectando 3 plásmidos: pAAV2 (U7smOPT-SD23/BP22) que codifican el genoma rAAV2, pXX6 que ostenta las funciones "adenovirus helper" y pAAV1plTRC02 que suplen los genes rep y cap de AAV1. Los títulos en vectores han variado entre 10^{12} y 10^{13} genomas de vector (vg) ml^{-1}.
3. Animales y métodos de suministro
Todos los procedimientos animales han sido ejecutados según el protocolo aprobado por la institución y en unas condiciones estrictas de confinamiento biológico. Un primer grupo de ratones mdx (de 8 semanas de edad) ha recibido mediante inyección 50 \mul de PBS (tampón salino fosfato) que contiene 10^{12} (vg) AAV(U7-SD23/BP22) en los músculos tibiales anteriores de las patas posteriores derechas. Los músculos contra-laterales han sido usados como controles. Un segundo grupo de ratones mdx de la misma edad han sido sometidos a una perfusión intra-arterial de 2x10^{-3} vectores a través de la arteria femoral. Los ratones han sido sacrificados en tiempos determinados, los músculos han sido congelados en isopentano enfriado con nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC.
4. Histología
Unos cortes transversales (8 \mum) en serie, realizados a intervalos de 200 \mum sobre la longitud del músculo, han sido examinados para la distrofina (NCL-DYS2; anticuerpos monoclonales murinos contra el dominio C-terminal; NovoCastra) y las proteínas asociadas a la distrofina \beta-distroglicano, \alpha y \beta-sarcoglicano; Novocastra) mediante detección inmunológica, según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos monoclonales han sido detectados con la ayuda de anticuerpos biotinilados seguidos por avidina-FITC (M.O.M. kit, Vector Laboratories). Los cortes preparados han sido analizados mediante miscroscopía confocal con láser (Leica). Los tejidos intermedios han sido recolectados para unos análisis ulteriores de proteínas y de ARN.
5. Análisis mediante detección inmunológica
Las secciones de las capas intermedias han sido recolectadas y extraídas con un tampón de lisis que contiene 4% de SDS, 125 mM de Tris-HCl, pH 6,4, 4 M de urea, 10% de \beta-mercaptoetanol, 10% de glicerol, 0,001% de azul de bromofenol. Después de la separación mediante centrifugación, el contenido en proteínas se midió con la ayuda del ensayo Bio-Rad "Protein Assay". Las muestras, ajustadas a 40 \mug de proteínas, han sido cargadas sobre unos geles de poliacrilamida al 6%, sometidas a electroforesis y transferidas sobre unas membranas de nitrocelulosa que han sido incubadas con NCL-DYS1 (anticuerpos monoclonales murinos contra la secuencia repetida R8 del dominio "spectrine-like" en bastoncillo de la distrofina; NovoCastra) o NCL-DYS2, diluido al 1:100, seguido de una incubación con unos anticuerpos secundarios de rábano picante conjugados con la peroxidasa (1:1000) y un sistema de análisis "ECL Analisis System" (Amersham).
6. Análisis de ARN
Los ARN totales han sido aislados de un pool de cortes intermedios usando el agente reactivo TRIZOL (Life Technologies). Para detectar U7 y U7smOPT-SD23/BP22, se ha realizado la transcripción inversa en primer lugar sobre los ARN totales con Supercript II reverse transcriptase en presencia de hexámeros aleatorios (In vitrogen). Después, los ADNc han sido amplificados gracias a la Taq polimerasa (Promega) con 5'-AAGTGTTACAGCTCTTTTAG-3' (SEC ID nº 18 localizada en el U7 salvaje) o 5'-AAGGCCAAACCTCGGCTTAC-3' (SEC ID nº 19 localizada en el U7smOPT-SD23/BP22) y 5'-AGGGGTTTTCCGACCGAAG-3' (SEC ID nº 20) para 30 ciclos (94ºC/30 s; 55ºC/30 s; 72ºC/30 s). Los productos de PCR han sido analizados sobre geles de agarosa al 2%. Para detectar el ARNm de la distrofina, se ha realizado una RT-PCR anidada con 200 ng de ARN totales. La primera reacción tuvo lugar con los cebadores Ex20ext (SEC ID nº 21; 5'-CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG-3') y Ex26ext (SEC ID nº 22; 5'-TTCTT
CAGCTTGTGTCATCC-3') durante 30 ciclos (94ºC/30 s; 55ºC/1 min; 72ºC/2 min). Después, se han amplificado 2 \mul de la primera reacción durante 23 ciclos con Ex20int (SEC ID nº 23; 5'-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3') y Ex26int (SEC ID nº 24; 5'-CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3'). Los productos de PCR han sido analizados sobre unos geles de agarosa al 2%, y se han purificado unas bandas específicas para el análisis de secuencia.
7. Fisiología del músculo
Los músculos extensor digitorum longus (EDL) de ratones de control o tratados han sido disecados para evaluar las propiedades contráctiles/mecánicas. Los músculos aislados han sido conectados por un lado a un arrastrador electromagnético y por el otro lado a un sensor de fuerza, y han sido estimulados mediante electrodos dispuestos paralelamente al músculo. Las contracciones isométricas tónicas y unidas a una sacudida breve (125 Hz; 360 ms, separadas por unos tiempos de reposo de 3 min) han sido estudiadas a L_{0} (longitud a la que se observa la fuerza tónica isométrica máxima). La tensión isométrica se ha calculado dividiendo la fuerza por la superficie estimada de la sección (cross-sectional area: CSA) del músculo. Suponiendo que los músculos tienen una forma cilíndrica y una densidad de 1,06 mg.mm^{-3}, la CSA corresponde al peso húmedo del músculo dividido por su longitud de fibras (5). Las concentraciones excéntricas inducen de manera característica unos daños musculares correlacionados con una ruptura de membrana. Aparecen cuando un músculo contraído al máximo se estira con fuerza, lo que provoca una caída de fuerza. En este caso, los músculos han sido alargados 10% de la longitud L_{0} para la cual el músculo produce una fuerza máxima a una velocidad de 1 longitud de fibra por segundo. Cinco contracciones excéntricas han sido aplicadas a unos intervalos de 3 min. La caída acumulada de la fuerza isométrica ha sido cuantificada tal como se ha descrito anteriormente
(5).
II) Resultados
Se ha modificado un ARN de tipo U7 con el fin de introducir en el mismo unas secuencias antisentido, apropiadas para interferir con el proceso de maduración de los ARN mensajeros (ARNm), en el núcleo. La secuencia del U7ARNsn ha sido optimizada de manera que transporta unas secuencias antisentido dirigidas contra los intrones 22 y 23 del gen murino de la distrofina. Las secuencias en el intrón 22 han sido seleccionadas de manera que entran en competición con la fijación del U2ARNsn a nivel del sitio de corte y empalme BP (Branching Point) (BP22; SEC ID nº 3), y de las secuencias en el intrón 23 que corresponde al sitio de fijación de U1 a nivel del sitio donante (SD23; SEC ID nº 2) (Figura 1). Estas secuencias han sido usadas en una estrategia de doble diana, tal como lo preconiza Brun et al., (2).
El gen U7 modificado, que comprende al mismo tiempo el promotor y los elementos 3', ha sido dispuesto en una construcción basada en AAV-2, que se introdujo en la cápside AAV-1 para obtener una alta eficacia de la transferencia de genes a los músculos esqueléticos. Unos ratones mdx adultos (de 8 semanas de edad) han recibido en inyección en el músculo tibial anterior una única dosis de 10^{10} genomas de vector y han sido analizados en diferentes tiempos, entre 2 y 16 semanas. El análisis molecular del salto del exón 23 se ha realizado mediante RT-PCR anidada sobre los ARN totales preparados a partir de los músculos que han recibido la inyección. Se ha detectado un transcrito más corto, en el ejemplo desprovisto del exón 23. Presentaba de 5 a 10% del material amplificado, 2 semanas después de la inyección y se volvía la especie mayoritaria después de un mes (Figuras 2B y 2C). Esta lenta acumulación de los transcritos que han sufrido el salto de exón no ha resultado de la expresión progresiva del transgén durante las primeras semanas tras la transferencia de genes mediada por AAV, puesto que los niveles del U7 modificado, medidos a 2 y 4 semanas, resultaron equivalentes y representaban 5 veces el nivel del U7ARNsn endógeno (Figura 2A). Esto sugiere más bien una disponibilidad limitada del pre-ARNm y una rotación lenta del ARNm maduro de la distrofina en las fibras musculares.
De acuerdo con la generación de transcritos que han sufrido el salto de exón, la proteína distrofina se ha detectado al mismo tiempo mediante inmunodetección en unos extractos musculares, pero también mediante inmunofluorescencia sobre unas secciones tisulares (Figura 3). Los niveles de distrofina reflejaban los de los ARNm producidos (de 0,5 a 20% del nivel normal a 2 y 4 semanas, respectivamente). El salto de exón ha generado unas especies proteicas inmunorreactivas del tamaño esperado, sin ninguna evidencia de la presencia de múltiples productos de degradación. Se debe observar que la diferencia en peso molecular entre la proteína salvaje y la truncada no se puede resolver sobre el gel mostrado. Virtualmente, todas las fibras del músculo que han recibido la inyección han sido detectadas positivamente a partir de 4 semanas después de la inyección, y la proteína estaba típicamente localizada en la periferia de las fibras. Unos cortes histológicos de los músculos tratados han mostrado de forma distinta la desaparición del fenotipo distrófico, con unas fibras que han recuperado su forma poligonal normal y la ausencia de células inflamatorias.
Un grupo de animales mdx ha recibido el vector AAV-U7 mediante perfusión intra-arterial de alta presión en la pata inferior. Esto provoca, después de un mes, la restauración eficaz de la distrofina en la mayoría de las fibras, en todos los músculos de la pata perfundida, incluyendo TA y EDL (Figura 3F). Además de la distrofina, las proteínas asociadas que incluyen el \alpha-sarcoglicano, el \beta-sarcoglicano y el \beta-distroglicano han sido detectadas en la periferia de las fibras de los animales tratados (Figura 4). Esto confirmó que el producto del ARNm que ha sufrido el salto de exón contiene un dominio C-terminal de fijación del distroglicano que es esencial para la función de anclaje a la membrana de la distrofina.
La susceptibilidad a los daños inducidos por el ejercicio se ha evaluado en los animales tratados, midiendo la resistencia a las contracciones tónicas seguidas de una elongación forzada. Para este experimento, los ratones han recibido una única dosis de AAV-U7 en el músculo EDL y han sido analizados después de 45 días. Mientras que los músculos de los animales mdx eran incapaces de soportar unas elongaciones repetidas, los músculos tratados que expresan una distrofina restablecida en más del 70% de sus fibras presentaban unos rendimientos esencialmente equivalentes a los músculos normales con una caída de fuerza de 17% según 5 estímulos, comparado con el 15% para los salvajes (Figura 5A). Los daños inducidos por el ejercicio han sido evaluados asimismo sometiendo a los ratones mdx inyectados en el músculo tibial anterior a una carrera de gran envergadura, seguida de una inyección con azul de Evans, un colorante impermeable a las células. Las lesiones musculares, demostradas por la entrada del colorante en las fibras, eran significativas en el músculo tratado (Figura 5B) y ausentes en el músculo contra-lateral no tratado del mismo animal (Figura 5C).
B- Estudio in vivo en el perro
Los resultados obtenidos en el ratón han podido ser extrapolados a un animal de gran tamaño, a saber, el perro GRMD. El perro GRMD presenta una mutación puntual en el sitio aceptor de corte y empalme del intrón 6 (AG transformado en GG; Fig. 6A), lo que impide la inclusión del exón 7 en el ARNm de la distrofina (Fig. 6B). El ARNm así formado (delta exón 7) presenta un desajuste del cuadro de lectura relacionado con el desfase de los exones 6 y 8 (Fig. 6B y C).
Dos ARN de tipo U7 han sido modificados con el fin de introducir en los mismos unas secuencias antisentido, apropiadas para interferir con la maquinaria de corte y empalme en la proximidad de los exones 6 y 8 (Fig. 7A), de manera que los exones 6, 7 y 8 no se tengan en cuenta en el ARNm final (multi-skipping; Fig. 7B). Este ARNm, cuyo cuadro de lectura está restaurado, permite la producción de una proteína ligeramente truncada en el dominio ABD (Fig. 7C), pero en teoría perfectamente funcional.
La eficacia de los vectores AAV(U7-ex6) que integran la secuencia antisentido SEC ID nº 27 y AAV(U7-ex8) que integran la secuencia antisentido SEC ID nº 28 ha sido ensayada in vivo mediante inyección loco-regional en unos sujetos GRMD adultos. La figura 8 ilustra el nivel de distrofina obtenido 2 meses después de una única inyección intramuscular de una preparación de 500 \mul que contiene una mezcla de dos vectores (\sim10^{11} partículas víricas). Esta distrofina es detectable asimismo mediante transferencia Western (figura 9). Tal como en el ratón, el complejo de proteínas asociadas a la distrofina es asimismo restaurado, lo que sugiere indirectamente el buen funcionamiento de la "casi-distrofina" inducida por salto multi-exón.
C- Estudio in vitro en el ser humano
Los inventores han desarrollado un enfoque que permite combinar los enfoques de terapia celular y de salto de exón en unas poblaciones de células capaces de participar en la regeneración muscular in vivo. Para ello, los inventores han desarrollado unos vectores lentivíricos que vehiculan unos casetes U7 susceptibles de inducir unos saltos terapéuticos (modelos murino, canino y humano).
A título de ejemplo, se presentará a continuación la restauración de distrofina en unas células de un paciente DMD que presenta una deleción de los exones 49-50.
Se han generado diferentes vectores Lenti(U7ex51 humanos), conteniendo uno de ellos las secuencias descritas anteriormente por DeAngelis (1) (Fig. 10A y B). Los resultados muestran, en unas condiciones de transducción, de cultivo y de análisis idénticos, que las secuencias dianas publicadas anteriormente (U7-ASDS) funcionan sólo muy modestamente y no permiten la restitución de un nivel de distrofina compatible con un racional terapéutico (Fig. 10C). Por el contrario, el vector (U7-H51ab), que integra las secuencias antisentido SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, resulta extremadamente eficaz y permite la modificación casi completa de los ARNm distrofina que están en este caso todos liberados del exón 51 apuntado por el vector (Fig. 10C). Unas células cepas AC133+ circulantes (20 x 10^{4}) recientemente extraídas en un paciente DMD (delta 49-50) han sido transducidas por el vector Lent(U7-H51ab) que integra las secuencias antisentido SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, y rápidamente reinyectadas en los músculos tibiales anteriores de ratones SCID-mdx con el objetivo de demostrar la posibilidad de un salto de exón terapéutico in vivo a partir de células de pacientes DMD.
El análisis histológico, después de un mes y medio, demuestra de manera concluyente la restauración de distrofina humana (revelación por anticuerpo DYS3 que no se cruza con la distrofina murina) en numerosas fibras musculares posiblemente quimeras hombre/ratón (Fig. 11).
Bibliografía
1) De Angelis FG, Sthandier O, Berarducci B, Toso S, Galluzzi G, Ricci E, Cossu G, Bozzoni I, "Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells", PNAS U.S.A. jul de. 2002 9;9(14): 9456-61.
2) Brun C, Suter D, Pauli C, Dunant P, Lochmuller H, Burgunder JM, Schumperli D, Weis J, "U7 snRNAs induce correction of mutated dystrophin pre-mRNA by exon skipping", Cell Mol Life Sci. mar. de 2003; 60(3):557-66.
3) Gorman L, Suter D, Emerick V, Schumperli D, Kole R, "Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNA5", PNAS U.S.A. 1998; 95:4929-34.
4) Snyder RO et al., -"Efficient and stable adeno-associated virus-mediated transduction in the skeletal muscle of adult immunocompetent mice", Hum Gene Ther 1997; 8:1891-900.
5) Fougerousse F, Gonin P, Durand M, Richard I, Raymackers JM, "Force impairment in calpain 3-deficient mice is not correlated with mechanical disruption", Muscle Nerve 2003; 27: 616-23.
<110> GENETHON
Centre National de la Recherche Scientifique
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<120> VECTOR VÍRICO ADENO-ASOCIADO PARA REALIZAR UN SALTO DE EXONES EN UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTEÍNA
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CON CAMPOS PRESCINDIBLES 
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<130> G143-B-21235 PCT
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<150> FRG4.51861
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<151> 17-08-2004
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<160> 28
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 960
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> ESE16
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<400> 12
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\hskip1cm
12 
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<210> 13
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> ESE28
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<400> 13
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\hskip1cm
13 
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<210> 14
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> U7-1 murino
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<400> 14
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\hskip1cm
14 
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<210> 15
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> U7-2 murino
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<400> 15
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\hskip1cm
15 
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<210> 16
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sm
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<400> 16
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\hskip1cm
16 
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<210> 17
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> smoPT
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<400> 17
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17 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> primer U7
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18 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> primer u7 smOPT-5D23/BP22
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<400> 19
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19 
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<210> 20
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador común u7
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<400> 20
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20 
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<210> 21
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Ex20ext
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<400> 21
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21 
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<210> 22
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Ex26ext
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<400> 22
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22 
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<210> 23
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Ex2Oint
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<400> 23
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23 
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<210> 24
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Ex26int
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24 
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<210> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> ex51AONIong1
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25 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> ex51AONIong2
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<400> 26
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\hskip1cm
26 
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<210> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> C6ESE2
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<400> 27
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27 
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<210> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> C8ESE1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
28

Claims (22)

1. Vector vírico adeno-asociado, que comprende:
-
una secuencia ARNsn modificada de tipo U7;
-
el promotor nativo de U7;
-
por lo menos una secuencia antisentido dirigida contra por lo menos un sitio de corte y empalme de por lo menos un exón, codificando dicho exón un dominio prescindible de la distrofina.
2. Vector según la reivindicación 1, caracterizado porque el vector AAV está compuesto por una cápside del serotipo 1.
3. Vector según la reivindicación 2, caracterizado porque el vector AAV es un pseudotipo 2/1.
4. Vector según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el sitio de corte y empalme se selecciona de entre el grupo constituido por el sitio 5' donante, el sitio 3' aceptor, la secuencia BP ("Branch Point") y las secuencias ESE.
5. Vector según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el vector comprende dos secuencias antisentido.
6. Vector según la reivindicación 5, caracterizado porque las secuencias antisentido están dirigidas contra el sitio 5' donante y la secuencia BP, respectivamente.
7. Vector según la reivindicación 6, caracterizado porque las secuencias antisentido tienen una secuencia SEC ID nº 2 y SEC ID nº 3, respectivamente.
8. Vector según la reivindicación 7, caracterizado porque comprende la secuencia SEC ID nº 1.
9. Vector según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende una secuencia antisentido dirigida contra una secuencia ESE del exón 6 y/o del exón 8 del gen canino de la distrofina, preferentemente de secuencia SEC ID nº 27 y/o SEC ID nº 28.
10. Vector según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque por lo menos una secuencia antisentido está dirigida contra por lo menos un sitio de corte y empalme de por lo menos un exón del gen humano de la distrofina.
11. Vector según la reivindicación 10, caracterizado porque por lo menos un exón es el exón 51.
12. Vector según la reivindicación 11, caracterizado porque las secuencias antisentido tienen una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 26.
13. Vector según la reivindicación 12, caracterizado porque comprende las secuencias SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, o SEC ID nº 7 y SEC ID nº 8, o SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10, o SEC ID nº 25 y SEC ID nº 26, respectivamente.
14. Vector según la reivindicación 13, caracterizado porque comprende la secuencia SEC ID nº 14.
15. Vector según una de las reivindicaciones 1 a 5 y 9 a 10, caracterizado porque las secuencias antisentido están dirigidas contra unos sitios de corte y empalme de por lo menos dos exones distintos.
16. Célula aislada transfectada por un vector según una de las reivindicaciones 1 a 15, con la exclusión de una célula cepa humana embrionaria.
17. Célula según la reivindicación 16, caracterizada porque se trata de una célula muscular.
18. Célula según la reivindicación 17, caracterizada porque se trata de un mioblasto o de una célula capaz de diferenciación muscular.
19. Tejido muscular aislado transfectado por un vector según una de las reivindicaciones 1 a 15.
20. Organismo no humano transfectado por un vector según una de las reivindicaciones 1 a 15.
21. Composición farmacéutica que comprende un vector según una de las reivindicaciones 1 a 15 o unas células según una de las reivindicaciones 16 a 18.
22. Uso de un vector según una de las reivindicaciones 1 a 15, o de células según una de las reivindicaciones 16 a 18, para la preparación de un medicamento destinado a tratar la enfermedad de Duchenne.
ES05797742T 2004-08-17 2005-08-02 Vector virico adeno-asociado para realizar un salto de exones en un gen que codifica una proteina con campos prescindibles. Expired - Lifetime ES2324948T3 (es)

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