ES2324966T3 - Derivados de acido oleanolico sustituido con ciano como inhibidores dela produccion de no. - Google Patents

Derivados de acido oleanolico sustituido con ciano como inhibidores dela produccion de no. Download PDF

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Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula ** ver fórmula** y la denominación ácido 2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oico (CDDO).

Description

Derivados de ácido oleanólico sustituido con ciano como inhibidores de la producción de NO.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a compuestos que se han encontrado útiles para la prevención o tratamiento de enfermedades tales como cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, y otras enfermedades inflamatorias.
Una de las mayores necesidades en la prevención del cáncer es el desarrollo de nuevos agentes eficaces y seguros para la quimioprevención. En particular, hay una necesidad de agentes quimiopreventivos dirigidos a mecanismos que se sabe que están implicados en el procedimiento de carcinogénesis. En los últimos años, ha resurgido el interés en el estudio de mecanismos de inflamación que están relacionados con la carcinogénesis y en el uso de dichos mecanismos como la base para el desarrollo de nuevos agentes quimiopreventivos.
El concepto de que la inflamación y la carcinogénesis son fenómenos relacionados ha sido el tema de muchos estudios que han intentado relacionar estos dos procedimientos de una manera mecanística (Sporn y Roberts, 1986; Ohshima y Bartsch, 1994). Las enzimas que median la síntesis constitutiva de NO y prostaglandinas a partir de arginina y araquidonato, respectivamente, tienen una significancia relativamente pequeña para cualquiera de inflamación o carcinogénesis. En contraste, la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la ciclooxigenasa inducible (COX-2) tienen ambas papeles críticos en la respuesta de los tejidos a heridas o agentes infecciosos (Moncada et al., 1991; Nathan y Xie, 1994; Siebert y Masferrer, 1994; Tamir y Tannebaum, 1996). Estas enzimas inducibles son componentes esenciales del procedimiento inflamatorio, la reparación final de las heridas y la carcinogénesis. Aunque la actividad fisiológica de iNOS y COX-2 puede proporcionar un beneficio definitivo al organismo, la expresión aberrante o excesiva de cualquiera de iNOS o COX-2 se ha visto implicada en la patogénesis de muchos procedimientos de enfermedad, particularmente en la degeneración crónica del sistema nervioso central, carcinogénesis, choque séptico, cardiomiopatía, y artritis reumatoide.
Los triterpenoides, biosintetizados en plantas mediante la ciclación de escualeno, se usan para propósitos medicinales en muchos países asiáticos; y algunos, tales como los ácido ursólico y oleanólico, se sabe que son anti-inflamatorios y anti-carcinogénicos (Huang et al., 1994; Nishino et al., 1988). Sin embargo, la actividad biológica de estas moléculas de origen natural es relativamente débil y, por lo tanto, se emprendió la síntesis de nuevos análogos para potenciar su potencia (Honda et al., 1997; Honda et al., 1998). Anteriormente se había informado de que diversos análogos sintéticos podían suprimir la formación de novo de iNOS y COX-2 en macrófagos que se han estimulado mediante IFN-\gamma o LPS (Suh et, al., 1998). El papel de ambas iNOS y COX-2 como potenciadores de la carcinogénesis en muchos órganos está recibiendo una atención cada vez mayor (Ohshima et al., 1994; Tamir et al., 1996; Takahashi et al., 1997; Ambs et al., 1998; Tsujii et al., 1998; Oshima et al., 1996; Hida et al., 1998; Huang et al., 1998); la supresión de cualquiera de la síntesis o la actividad de estas enzimas es, por lo tanto, una diana para la quimioprevención (Oshima et al., 1998; Kawamori et al., 1998). Los agentes que inducen la diferenciación o suprimen la proliferación de las células premalignas o malignas representan otro procedimiento mecanístico más para la quimioprevención, así como para la quimioterapia, del cáncer.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona compuestos como se definen en las reivindicaciones 1 y 2 y el uso de estos compuestos para la prevención o tratamiento de enfermedades tales como cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y esclerosis múltiple.
Por consiguiente, en una realización las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para la prevención o tratamiento de trastornos tales como cáncer; enfermedades neurodegenerativas (END) tales como enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Alzheimer (EA), esclerosis múltiple (EM), y esclerosis lateral amiotrófica (ELA); enfermedades inflamatorias, por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; y artritis reumatoide (AR). Los compuestos de la invención pueden usarse terapéuticamente para presentar o tratar dichas afecciones en un sujeto. Se ha encontrado que los compuestos suprimen la transcripción o traducción de los genes de iNOS y COX-2, cuya sobreexpresión está relacionada con una formación en exceso de NO y/o prostaglandina.
Los compuestos de la invención son eficaces para modular la producción de NO inducida por interferón-\gamma (IFN-\gamma) en macrófagos, teniendo dicha composición un valor de CI_{50} de al menos menor de 0,6 \muM, preferiblemente menor de 0,001 \muM.
Los compuestos de la invención son útiles para la prevención y tratamiento de trastornos caracterizados por la sobreexpresión de los genes de iNOS o COX-2 y pueden administrarse a un sujeto. Dichos trastornos incluyen cáncer; enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y esclerosis lateral amiotrófica; y artritis reumatoide.
\newpage
Los compuestos de la invención son útiles igualmente para modular la transcripción o traducción de los genes de iNOS o COX-2 en un sujeto. La transcripción o traducción de los genes de iNOS o COX-2 está modulada por los compuestos.
Los compuestos de la invención son útiles también para modular la formación excesiva de óxido nítrico o prostaglandina en un sujeto. La formación de óxido nítrico o prostaglandina está modulada por los compuestos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra la eficacia de una composición de la invención, ácido 2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oico (CDDO) (denotado "TP-151"), para suprimir la expresión de COX-2 inducida por interleuquina-1\beta (IL-1\beta) y prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) en células ^{18}Co de miofibroblastos de colon humanos;
La Figura 2 es una comparación de la eficacia de diversos compuestos sobre la producción de NO inducida por lipopolisacárido (LPS) en células microgliales de rata (células macrófagas del cerebro), que muestra la actividad de TP 151 favorable respecto a la de dexametasona, un glucocorticoide, indicando así cómo una composición de la invención puede usarse para prevenir o tratar una enfermedad neurodegenerativa. "TP-82" se refiere a ácido 3,11-dioxoolean-1,9-dien-28-oico;
La Figura 3 ilustra la eficacia de TP151 para proteger las neuronas del hipocampo de rata contra la toxicidad inducida por el péptido \beta-amiloide, que está implicado en la enfermedad de Alzheimer;
La Figura 4 ilustra, en relación con la prevención o tratamiento del cáncer de próstata, la eficacia de TP151 para inhibir el crecimiento de células de próstata de rata normales (NRP152);
La Figura 5 ilustra la eficacia de TP151 para modular la expresión de la proteína iNOS en células de próstata de rata normales (NRP152);
La Figura 6 ilustra, en relación con la prevención o tratamiento del cáncer de mama, una comparación de la eficacia de diversos compuestos incluyendo TP151 para inhibir el crecimiento estimulado por estrógenos en células MCF-7 (línea celular de cáncer de mama);
La Figura 7 ilustra, en relación con la prevención o tratamiento de afecciones con un componente inflamatorio, una comparación de la eficacia de diversos compuestos sobre la inhibición de la producción de NO inducida por LPS e IFN-\gamma en macrófagos primarios de ratón, que muestran actividad de TP151 favorable respecto a la de dexametasona;
La Figura 8 es una comparación de la eficacia de diversos compuestos sobre la inhibición de la producción de NO inducida por IFN-\gamma en macrófagos primarios de ratón;
La Figura 9 ilustra una comparación de la eficacia de diversos compuestos sobre la inhibición de la producción de PGE_{2} inducida por LPS e IFN-\gamma en macrófagos primarios de ratón;
La Figura 10 ilustra una comparación de la eficacia de diversos compuestos sobre la supresión de la expresión de iNOS y COX-2 inducida por IFN-\gamma y LPS en macrófagos primarios de ratón;
Las Figuras 11 (A)-(J) muestran inducción de diferenciación por CDDO en células de leucemia LCDB (A-D), y en células PC12 (E-H);
Las Figuras 12A y 12B muestran inducción de diferenciación por CDDO en fibroblastos 3T3-L1.
La Figura 13 ilustra curvas de dosis-respuesta para suprimir el crecimiento celular en células NRP-152 y MCF-7 por CDDO (\blacksquare), TP-82 (\medcirc), y ácido oleanólico (\medbullet).
Las Figuras 14A-E muestran efectos inhibidores de triterpenoides sobre la inducción de iNOS y COX-2 en macrófagos de ratón y fibroblastos de colon humanos.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir adicionalmente la invención, se recogen aquí ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas, por comodidad.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, el término "resto orgánico" pretende incluir grupos funcionales basados en carbono tales como alquilo, alquilamino, alcoxi, arilo, aralquilo, ariloxi, alquiltio, y alquilcarboxilo.
Como se usa en el presente documento, el término "resto inorgánico" pretende incluir grupos no basados en carbono o elementos tales como hidrógeno, halo, amino, nitro, tiol, e hidroxi.
Como se usa en el presente documento, el término "resto aceptor de electrones" se conoce en la técnica, y se refiere a un grupo que tiene una mayor aceptación de electrones que el hidrógeno. Se conocen diversos grupos aceptores de electrones, e incluyen halógenos (por ejemplo, grupos fluoro, cloro, bromo, y yodo), nitro, ciano, -NR_{3}^{+}, -SR_{2}^{+},
-NH_{3}^{+}, -SO_{2}R, -SO_{2}Ar, -COOH, -OAr, -COOR, -OR, -COR, -SH, -SR, -OH, -Ar, y -CH=CR_{2}, donde Ar es arilo, y R representa cualquier resto orgánico o inorgánico apropiado y, preferiblemente, un resto alquilo.
Como se usa en el presente documento, el término "restos alquilo halosustituidos" pretende incluir restos alquilo que tienen restos halógeno en lugar de al menos un hidrógeno.
Como se usa en el presente documento, el término "amino" significa -NH_{2}; el término "nitro" significa -NO_{2}; el término "halógeno" designa -F, -Cl, -Br o -I; el término "tiol" significa SH; y el término "hidroxilo" significa -OH. De esta manera, el término "alquilamino" como se usa en el presente documento significa un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, que tiene un grupo amino unido al mismo. El término "alquiltio" se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, que tiene un grupo sulfhidrilo unido al mismo. El término "alquilcarboxilo" como se usa en el presente documento significa un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, que tiene un grupo carboxilo unido al mismo.
El término "grupo aromático" pretende incluir hidrocarburos cíclicos insaturados que contienen uno o más anillos. Los grupos aromáticos incluyen grupos de un solo anillo de 5 y 6 miembros que pueden incluir desde cero hasta cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares. El anillo aromático puede estar sustituido en una o más posiciones del anillo, por ejemplo, con un halógeno, un alquilo inferior, un alquenilo inferior, un alcoxi inferior, un alquiltio inferior, un alquilamino inferior, un alquilcarboxilo inferior, un nitro, un hidroxilo, -CF_{3}, -CN, o similares.
El término "alquilo" se refiere a grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclicos), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo, y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo.
Además, el término "alquilo" (incluyendo "alquilo inferior") como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones pretende incluir tanto "alquilos no sustituidos" como "alquilos sustituidos", refiriéndose estos últimos a restos alquilo que tienen restos que sustituyen a un hidrógeno en uno o más carbonos de la estructura básica del hidrocarburo. Dichos restos pueden incluir, por ejemplo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino, y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfato, sulfonato, sulfamoílo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, aralquilo, o un resto aromático o heteroaromático. Los especialistas en la técnica entenderán que los restos sustituidos en la cadena de hidrocarburo pueden estar sustituidos ellos mismos, si fuera apropiado. Los cicloalquilos pueden estar sustituidos adicionalmente, por ejemplo, con los restos descritos anteriormente. Un resto "aralquilo" es un alquilo sustituido con un arilo (por ejemplo, fenilmetil (bencilo)).
El término "alcoxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto que tiene la estructura -O-alquilo, en la que el resto alquilo es como se ha descrito anteriormente.
El término "arilo" como se usa en el presente documento incluye grupos aromáticos de un solo anillo de 5 y 6 miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno no sustituido o sustituido, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares. Los grupos arilo incluyen también grupos aromáticos policíclicos condensados tales como naftilo, quinolilo, indolilo, y similares. El anillo aromático puede estar sustituido en una o más posiciones del anillo con dichos restos, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente para los grupos alquilo. Los grupos arilo preferidos incluyen grupos fenilo no sustituidos y sustituidos.
El término "ariloxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que tiene la estructura -O-arilo, en el que el resto arilo es como se ha definido anteriormente.
El término "amino", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto no sustituido o sustituido de fórmula -NR_{a}R_{b}, en la que cada uno de R_{a} y R_{b} es, independientemente, hidrógeno, alquilo, arilo, o heterociclilo, o R_{a} y R_{b}, tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un resto cíclico que tiene de 3 a 8 átomos en el anillo. De esta manera, el término "amino" pretende incluir restos amino cíclicos tales como grupos piperidinilo o pirrolidinilo, a menos que se indique otra cosa. Un "grupo amino sustituido con amino" se refiere a un grupo amino en el que al menos uno de R_{a} y R_{b}, está sustituido adicionalmente con un grupo amino.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que pueden darse ciertas afecciones como se revela en el presente documento. Los ejemplos incluyen seres humanos, monos, vacas, ovejas, cabras, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. En una realización preferida, el sujeto es un primate. En una realización aún más preferida, el primate es un ser humano. Otros ejemplos de sujetos incluyen animales experimentales tales como ratones, ratas, perros, gatos, cabras, ovejas, cercos y vacas. El animal experimental puede ser un modelo animal para un trastorno, por ejemplo, un ratón transgénico con una neuropatología de tipo Alzheimer. Un sujeto puede ser un ser humano que padece una enfermedad neurodegenerativa, tal como la enfermedad de Alzheimer, o la enfermedad de Parkinson.
Como se usa en el presente documento, el término "CI_{50}" se refiere a una dosis inhibidora que es el 50% de la respuesta máxima obtenida.
Otras abreviaturas usadas en el presente documento son las siguientes: CDDO, ácido 2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oico; DMSO, dimetil sulfóxido; iNOS, óxido nítrico sintasa inducible; COX-2, ciclooxigenasa-2; NGF, factor de crecimiento nervioso; IBMX, isobutilmetilxantina; FBS, suero bovino fetal; GPDH, glicerol 3-fosfato deshidrogenasa; RXR, receptor del retinoide X, TGF-\beta, factor de crecimiento transformante-\beta; IFN-\gamma, interferón-\gamma; LPS, lipopolisacárido endotóxico bacteriano; TNF-\alpha, factor de necrosis tumoral-\alpha; IL-1\beta, interleuquina-1\beta; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; MTT, bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; TCA, ácido tricloroacético.
Los compuestos pueden administrarse, por ejemplo, por vía oral o por administración subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, etc. (por ejemplo, por inyección). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo puede recubrirse en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar al compuesto.
Para administrar el compuesto terapéutico por una vía distinta de la administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, el compuesto terapéutico puede administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua-en-aceite-en-agua así como liposomas convencionales (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
El compuesto terapéutico puede administrarse también por vía parenteral, intraperitoneal, intraespinal, o intracerebral. Las dispersiones pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que tenga una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, usando un revestimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el case de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, o polialcoholes tales como manitol y sorbitol, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ocasionarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto terapéutico en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización con filtrado. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto terapéutico en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquéllos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado al vacío y secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo (es decir, el compuesto terapéutico) más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución filtrada en condiciones estériles previamente del mismo.
El compuesto terapéutico puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto terapéutico y otros ingredientes pueden encerrarse también en una cápsula de gelatina de carcasa dura o blanda, comprimirse en comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración oral terapéutica, el compuesto terapéutico puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. El porcentaje del compuesto terapéutico en las composiciones y preparaciones, por supuesto, puede variarse. La cantidad del compuesto terapéutico en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada.
Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto terapéutico que se calcula que produce el efecto terapéutico deseado junto con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención están dictadas por y son directamente dependientes de (a) las características excepcionales del compuesto terapéutico y el efecto terapéutico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de preparar un compuesto terapéutico para el tratamiento de una afección seleccionada en un sujeto.
Los compuestos activos se administran a una dosificación terapéuticamente eficaz suficiente para tratar una afección asociada con una afección en un sujeto. Una "dosificación terapéuticamente eficaz" preferiblemente reduce la cantidad de síntomas de la afección en el sujeto infectado al menos en aproximadamente un 20%, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 40%, aún más preferiblemente en al menos aproximadamente un 60%, y aún más preferiblemente en al menos aproximadamente un 80% respecto a los sujetos no tratados. Por ejemplo, la eficacia de un compuesto puede evaluarse en un sistema de modelo animal que puede predecir la eficacia de tratamiento de la enfermedad en seres humanos, tal como los sistemas de modelo mostrados en el Ejemplo y las Figuras.
Los compuestos de la invención son eficaces para modular la producción de NO inducida por IFN-\gamma en macrófagos, teniendo dichos compuestos un valor de CI_{50} de al menos menor de 0,6 \muM, más preferiblemente menor de 0,001 \muM.
Los compuestos de la invención son útiles para prevenir o tratar un trastorno caracterizado por la sobreexpresión de los genes de iNOS o COX-2. En una realización preferida, el trastorno incluye cáncer, enfermedades neurodegenerativas, y artritis reumatoide. En otra realización preferida más, la enfermedad neurodegenerativa incluye la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y esclerosis lateral amiotrófica. El cáncer puede incluir cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer cerebral, y cáncer de huesos.
Los compuestos de la invención son útiles para modular una formación excesiva de óxido nítrico o prostaglandina en un sujeto.
Los compuestos de la invención son útiles para modular la transcripción o traducción de los genes de iNOS o COX-2 en un sujeto.
Los compuestos de la invención son útiles para prevenir o tratar una enfermedad neurodegenerativa. En una realización preferida, la enfermedad neurodegenerativa incluye la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y esclerosis lateral amiotrófica.
Los compuestos de la presente invención son compuestos basados en la estructura de cinco anillos mostrada en la fórmula (I) a continuación:
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1 
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en la que las variables son como se definen en las reivindicaciones 1 y 2, preferiblemente hidroxilo. Los triterpenoides, tales como los esteroides, se forman en la naturaleza por la ciclación de escualeno, con la retención de los 30 átomos de carbono en moléculas tales como ácido ursólico (AU) y ácido oleanólico (AO). Aunque se sabe que AO y AU tienen numerosas actividades farmacológicas, la potencia de estas moléculas de origen natural es relativamente débil. Los derivados de AO y AU como se revela en el presente documento, sin embargo, son más potentes que AO y AU.
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En particular, el compuesto de la reivindicación 1 es un derivado de ácido oleanólico. En una realización particularmente preferida, los derivados de AO, es decir, ácido 2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oico (CDDO):
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que se ha encontrado que es eficaz en la supresión del crecimiento de las células de cáncer de mama humano, y muy potente en muchos sistemas de ensayo in vitro tales como: supresión de la producción de óxido nítrico y prostaglandina en macrófagos, inhibición del crecimiento de células de cáncer de mama humano, supresión de la formación de óxido nítrico en células de próstata de rata, y supresión de la formación de prostaglandina en fibroblastos de colon humano, como se detalla en las Figuras.
Estos compuestos de la invención tienen utilidad para la prevención y el tratamiento de cáncer, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, y todas las demás enfermedades cuya patogénesis se cree que implica una producción excesiva de cualquiera de óxido nítrico o de prostaglandinas.
La expresión aberrante o excesiva de cualquiera de iNOS o COX-2 se ha visto implicada en la patogénesis de muchos procedimientos de enfermedad, incluyendo carcinogénesis en el colon. De esta manera, la sobreexpresión del gen para COX-2 es un acontecimiento prematuro y central en la carcinogénesis del colon (Prescott y White, 1996; Dubois et al., 1996). Los ratones con defectos en el gen de la APC (poliposis adenomatosa del colon) desarrollan un gran número de pólipos intestinales a una edad temprana, y se han encontrado notables aumentos en los niveles de enzima COX-2 en estos pólipos. Estos hallazgos en animales están correlacionados con el hallazgo de niveles elevados de ARNm y proteína de COX-2 en muchos cánceres de colon primarios humanos y en líneas celulares de cáncer de colon (Prescott y White, 1996), y se cree que este aumento en COX-2 conduce a una supresión de la apoptosis, que habitualmente conduciría a la muerte de las células preneoplásicas (Tsujii y DuBois, 1996). La pertinencia funcional de COX-2 para la oncogénesis intestinal se ha demostrado mediante la eliminación del gen de COX-2 y el posterior apareamiento de los ratones que llevan esta eliminación con ratones que llevan lesiones formadoras de pólipos en el gen de APC; la eliminación de COX-2 provocaba una disminución drástica en el número de pólipos en la prole (Oshima et al., 1996). Adicionalmente, el tratamiento de los animales experimentales con inhibidores selectivos de COX-2 o inhibidores no selectivos de COX-1/COX-2 se ha presentado como un procedimiento potente para la quimioprevención del cáncer intestinal (Marnett, 1992; Oshima et al., 1996; Boolbol et al., 1996; Reddy et al., 1996; Sheng et al., 1997). Como para el papel de iNOS en carcinogénesis, está claro que NO es un mutágeno potente (Tamir y Tannebaum, 1996), y que el óxido nítrico puede activar también COX-2 (Salvemini et al., 1993, 1994). Adicionalmente, hay un aumento notable de iNOS en la tasa de tumores de colon inducidos por el carcinógeno, azoximetano (Takahashi et al., 1997).
Se sabe que la EM es una afección inflamatoria del sistema nervioso central (Williams, Ulvestad y Hickey, 1994; Merrill y Beneviste, 1996; Genain y Nauser, 1997). En la patogénesis de EM, EA, EP, y ELA pueden estar implicados mecanismos inflamatorios, oxidativos o inmunes (Bagasra et al., 1995; Griffin et al., 1995; McGeer y McGeer, 1995; Good et al., 1996; Simonian y Coile, 1996; Kaltschmidt et al., 1997). Tanto los astrocitos reactivos como las células microgliales activadas se han visto implicados en la provocación de END/NID; ha habido un énfasis particular sobre las células microgliales como las células que sintetizan tanto NO como prostaglandinas como productos de las enzimas respectivas, iNOS y COX-2. La formación de novo de estas enzimas pueden dirigirla citoquinas inflamatorias tales como interferón-gamma o interleuquina-1. A su vez, la producción excesiva de NO puede conducir a cascadas inflamatorias y/o daño oxidativo en las células y tejidos de muchos órganos, incluyendo neuronas y oligodendrocitos del sistema nervioso, con la consiguiente manifestación en EA y EM, y posible EP y ELA (Coyle y Puttfarcken, 1993; Goodwin et al., 1995; Beal, 1996; Good et al., 1996; Merrill y Benvenist, 1996; Simonian y Coyle, 1996; Vodovotz et al., 1996). Los datos epidemiológicos indican que el uso crónico de AINE que bloquea la síntesis de prostaglandinas a partir de araquidonato, reducen notablemente el riesgo de desarrollar EA (McGeer et al., 1996; Stewart et al., 1997). De esta manera, los agentes que bloquean la formación de NO y prostaglandinas, pueden usarse en enfoques para prevención y tratamiento de la END.
En el presente documento se revela adicionalmente la síntesis y las actividades biológicas de un nuevo oleanano triterpenoide sintético, CDDO, que tiene tres importantes propiedades: 1) es un agente potente para inducir la diferenciación en células tanto malignas como no malignas, 2) es activo a niveles nanomolares como un inhibidor de la proliferación de muchas células malignas o premalignas; y 3) es de 100 a 500 veces más potente que cualquiera de los triterpenoides anteriores para suprimir la síntesis de novo de las enzimas inflamatorias, iNOS y COX-2. Estas tres acciones son importantes para el desarrollo de un nuevo agente quimiopreventivo útil, y también son pertinentes para la terapia de la propia malignidad.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de las especialidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., ed. por Sambrook, J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); Short Protocols in Molecular Biology, 3ª Ed., ed. Por Ausubel, F. et al. (Wiley, NY (1995)); ADN Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. (1984)); Mullis et al. Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); el tratado, Metods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Metods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker. eds., Academic Press, Londres (1987)); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds. (1986)); y Miller, J. Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972)).
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Una demostración de la eficacia de los compuestos terapéuticos de la presente invención en el modelo o modelos descritos en los Ejemplos y Figuras es predictiva de la eficacia en seres humanos.
Ejemplo 1
Los compuestos se sintetizaron como se muestra a continuación:
Esquema 1
3 
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Esquema 2
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El Compuesto 10 se preparó por formilación de AO (Compuesto 9) (Simonsen y Ross, 1957) con formiato de etilo en presencia de metóxido sódico en THF (Clinton et al., 1961). El Compuesto 7 se obtuvo por introducción de un doble enlace en el C-1 del Compuesto 10 con cloruro de fenilselenenilo en acetato de etilo y adición secuencial de peróxido de hidrógeno al 30% (Sharpless et al., 1973). El Compuesto 11 se sintetizó a partir del Compuesto 10 por adición de hidroxilamina en etanol acuoso; la escisión del Compuesto 11 con metóxido sódico dio el Compuesto 12 (Johnson y Shelberg, 1945). El Compuesto 14 se preparó a partir del Compuesto 13 (Picard et al., 1939) por hidrólisis alcalina seguida de oxidación de Jones. El Compuesto 15 se preparó por formilación del Compuesto 14 con formiato de etilo en presencia de metóxido sódico en benceno. El Compuesto 16 se sintetizó a partir del Compuesto 15 por adición de hidroxilamina. La escisión de 16 con metóxido sódico dio el Compuesto 17. El Compuesto 6 (CDDO) se preparó por introducción de un doble enlace en C-1 del Compuesto 17 con cloruro de fenilselenenilo en acetato de etilo y adición secuencial de peróxido de hidrógeno al 30%, seguido de halogenolisis con yoduro de litio en DMF (Dean, P.D.G., 1965).
Las actividades inhibidoras de estos compuestos y dexametasona sobre la producción de NO inducida por IFN-\gamma en macrófagos de ratón se muestran a continuación en la Tabla 1. Se usó el siguiente procedimiento para la enzima. Los macrófagos se recolectaron de ratones hembra a los que se había inyectado por vía intraperitoneal cuatro días antes tioglicolato al 4%. Estas células se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y se incubaron con 4 ng/ml de IFN-\gamma en presencia o ausencia de compuestos de ensayo inhibidores. Después de 48 horas se determinó la producción de NO (medido como nitrito mediante la reacción de Griess). Los detalles completos de la enzima se dan en Ding et al., 1990; Bogdan et al., 1992. El Compuesto 6 (CDDO) mostró una actividad inhibidora excelente (CI_{50}, 1 nM) similar a la de dexametasona.
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TABLA 1 Valores de CI_{50} (\muM)^{a} para Inhibir la Producción de NO Inducida por IFN-\gamma en Macrofases de Ratón
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Todos los compuestos 6-8 presentaban datos espectrales satisfactorios incluyendo espectros de masas de alta resolución y análisis elemental.
Para los siguientes ejemplos, se prepararon soluciones madre de CDDO (0,01 M) en DMSO y se congelaron alícuotas a -20ºC. Se prepararon diluciones en serie en DMSO antes de la adición a los medios de cultivo celulares. Las neuronas microgliales primarias e hipocampo de rata se aislaron y cultivaron como se revela en Flaris et al., 1993 y Ren y Flanders, 1996.
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Ejemplo 2 Inducción de la Diferenciación en Células de Leucemia Mielogenosa, Células de Feocromocitoma PC12 y Fibroblastos 3T3-L1
El CDDO induce la diferenciación monocítica en la línea celular de leucemia mielogenosa aguda LCDB poco diferenciada, procedente de un paciente resistente a quimioterapia en la Rama de Oncología Pediátrica de NCl. La Figura 11 ilustra células LCDB sembradas en RPMI 1640/FBS al 2%, en solitario (11 A), con 2,5 ng/ml TGF-p1 (11B), con CDDO 10^{-8} M (11C), o con ambos TGF-\beta1 y CDDO (11D). Después de 48 h, se prepararon preparaciones de citospin para portaobjetos y se tiñeron para la actividad de \alpha-naftil acetato esterasa (kit de Sigma). Las células PC12 se cultivaron durante 5 días en placas cuadriculadas en DMEM/FBS al 10% y suero de caballo al 5% (Smith et al., 1997), en solitario (11E), con 100 ng/ml de 75 NGF (11F), con CDDO 10^{-6} M (11G), o tanto con NGF como con CDDO (11H). Las células se sembraron en placas después por triplicado, y para cada tratamiento se observaron resultados similares en al menos dos capas diferentes de células. Se han descrito los procedimientos para análisis cuantitativo por imagen del tamaño de las células y neuritas (De la Torre et al., 1997). Las células de control en la Figura 11E son de aproximadamente 10 \mum de diámetro. Las células 3T3-L1 se cultivaron hasta confluencia en DMEM/suero de ternera al 5%, y después se trataron una vez con CDDO en DMEM/FBS al 10% (Figura 12A) o con CDDO y/o LG100268 en DMEM/FBS al 10% (Figura 12B). Cada dos días posteriormente, el medio se cambió a DMEM/FBS al 10%, sin añadir CDDO o LG100268. Las células se recolectaron en los días 8 (Figura 12A) o días 6 (Figura 12B), y se midió GPDH en los lisados, usando una enzima convencional para consumo de NADH a 340 nm (Wise y Green, 1979). Estas células no expresan el marcador de monocito/macrófago, \alpha-naftil esterasa (Figura 11 A). Sin embargo, en 48 h, CDDO (10^{-8} M) indujo la actividad de esta enzima, como se determina histoquímicamente (Figura 11C). El tratamiento de las células LCDB con TGF-\beta1 (2,5 ng/ml) inducía también la actividad de \alpha-naftil esterasa (Figura 11B), y había un efecto aditivo cuando se usan ambos agentes (Figura 11D). Se ha demostrado que CDDO tiene efectos diferenciadores, por sí mismo o en combinación con TGF-\beta1, sobre la línea de leucemia monocítica humana, THP-1, y la línea de leucemia promielocítica humana, NB4 (datos no mostrados).
La línea celular de feocromocitoma de rata, PC12, se ha usado ampliamente para estudiar el desarrollo y la diferenciación neuronal. Se sabe que el tratamiento de estas células tumorales con NGF induce un fenotipo neuronal, con crecimiento extensivo de neuritas hacia el exterior (Greene y Rischler, 1976; Guroff 1985). CDDO potencia notablemente estos efectos de NGF. Las Figuras 11E y F muestran la inducción del crecimiento hacia el exterior de las neuritas mediante NGF (100 ng/ml). Aunque CDDO (10^{-6} M) por sí mismo no induce la formación de neuritas, provoca que las células adopten una morfología más grande y más plana (Figura 11G). Cuando se usa en combinación con NGF, CDDO (Figura 11 H) casi dobla el número de neuritas primarias/células (de 1,2 \pm 0,2 S.E.M. a 2,1 \pm 0,1, p<0,001), y provoca un aumento mayor de 3 veces en la longitud de las neuritas (de 28 \pm 6 a 99 \pm 9 micrómetros, p <0,001), y un aumento de 5 veces en la ramificación de neuritas/célula (de 0,23 \pm 0,06 a 1,13 \pm 0,08, p<0,001). De esta manera, CDDO potencia la diferenciación neuronal de las células PC12 aumentando el tamaño celular, así como la extensión y complejidad de la arborización de las neuritas.
Un tercer tipo de célula en el que CDDO induce diferenciación es el fibroblasto 3T3-L1. Estos fibroblastos no neoplásicos se inducen clásicamente para formar adipocitos mediante la combinación de insulina, dexametasona, e IBMX (Green y Kehinde, 1974; Bernlohr et al., 1984). El tratamiento con CDDO (Figura 12A) a dosis tan bajas como 10^{-8} M (en ausencia de insulina, dexametasona, e IBMX añadidas) provocaba la diferenciación adipogénica, según se mide por inducción del marcador, GPDH (Wise y Green, 1979), que se sabe que es una enzima clave en la síntesis de triglicéridos. Los resultados con el ensayo enzimático se han confirmado mediante la tinción con rojo aceite O para gotas de grasa (datos no mostrados). Adicionalmente, CDDO actúa sinérgicamente con el retinoide selectivo de RXR, LG100268 (Boehm et al., 1995) para promover la diferenciación adipogénica (Figura 12B).
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Ejemplo 3 CDDO Inhibe la Proliferación de Muchas Células Malignas o Premalignas
Se sabe que los inhibidores de la proliferación celular son agentes quimiopreventivos y quimioterapéuticos útiles. CDDO se ensayó contra una amplia variedad de células procedentes de leucemias y carcinomas altamente agresivos, así como a partir de tejidos no neoplásicos. Las células NRP-152 se cultivaron como se revela en Danielpour et al. 1994. Las células MCF-7 se cultivaron en RPMI sin rojo de fenol 1640/FBS separado en carbón al 10% con 17-\beta-estradiol añadido (10 pM). Los triterpenoides se añadieron en el momento de la siembra en las placas, y 72 h después se añadióH-timidina (1 \muCi/pocillo) durante las 2 h finales de incubación. La incorporación de timidina se midió después de que las células se hicieran precipitar con TCA (10%), se lavaran y se solubilizaran. Los símbolos usados en la Figura 13 son CDDO, \blacksquare; TP-82, \medcirc; y ácido oleanólico, \medbullet.
Las curvas de dosis-respuesta típicas se muestran en la Figura 13 para dos tipos de célula, carcinoma de mama MCF-7 humano y epitelio de próstata no maligno NRP-152 de rata (Danielpour et al., 1994). CDDO es muy activo en el intervalo nanomolar para suprimir la incorporación de timidina en estas células, mientras que TP-82 es notablemente menos activo, y el ácido oleanólico, prácticamente no tiene actividad a concentraciones de 1 \muM o menor.
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Los resultados obtenidos con otras células cancerosas se muestran en la Tabla 2. Obsérvese que: (1) diversas líneas de células de cáncer de mama negativas al receptor de estrógeno son sensibles a CDDO, así como las células MCF-7 positivas al receptor de estrógeno; (2) incluso si las células tumorales tienen una mutación Smad-4/DPC4 y, por lo tanto, no son sensibles a las acciones de inhibición del crecimiento de TGF-\beta (Schutte et al., 1996; Zhou et al., 1998; Heldin et al., 1997), aún pueden responder a CDDO, como puede observarse en el caso de carcinoma de ovario SW626, CAPAN-1 y carcinoma pancreático AsPc-1, y células de carcinoma de mama MDA-MB-468; (3) muchas células de leucemia, especialmente del linaje mieloide, son muy sensibles a CDDO.
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TABLA 2 Inhibición de la proliferación celular mediante CDDO
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Ejemplo 4 CDDO Bloquea la Síntesis De Novo de iNOS y COX-2
El CDDO es muy activo en el bloqueo de la capacidad de diversas citoquinas inflamatorias para inducir la formación de novo de las enzimas, iNOS y COX-2 (Figura 14). La Figura 14(A) ilustra transferencias de Western; se añadieron macrófagos primarios de ratón; IFN-\gamma, 10 ng/ml; LPS, 2 ng/ml a los cultivos junto con triterpenoides o dexametasona (concentraciones mostradas en \muM); las células se recolectaron a las 12 h. La Figura 14(B) ilustra transferencias de Northern de línea celular de tipo macrófago RAW 264.7. Se añadieron IFN-\gamma, 10 ng/ml; LPS, 1 ng/ml; TNF-\alpha, 10 ng/ml, a los cultivos junto con CDDO o dexametasona. El ARN se prepara después de 12 h; se usó GAPDH como un control de carga. La Figura 14(C) ilustra la supresión de la producción de NO y PGE_{2} en macrófagos primarios. Para estudios sobre NO, las células se trataron con IFN-\gamma, 10 ng/ml, junto con CDDO (\blacksquare), dexametasona (\medcirc), TP-82 (\boxempty): o ácido oleanólico (\ding{115}). Después de 48 h, los sobrenadantes se analizaron para NO mediante la reacción de Griess. Para estudios sobre PGE_{2}, las células se trataron con IFN-\gamma, 5 ng/ml, y LPS, 5 ng/ml, junto con el mismo conjunto de inhibidores. Después de 48 h, se midió el PGE_{2} en los sobrenadantes mediante inmunoenzima. Los valores de control (sin inhibición) para NO y PGE_{2} fueron de 4,7 nmol/2 x 10^{5} células y 2,2 ng/ml/2 x 10^{5} células, respectivamente. Las Figuras (14D) y (14E) ilustran células ^{18}Co (miofibroblastos de colon humanos) cultivadas en MEM/FBS al 10%; otros procedimientos son iguales que los presentados anteriormente para macrófagos. La Figura 14(D) ilustra transferencias de Northern que muestran curvas de dosis-respuesta para la supresión del ARNm de COX-2 después de la inducción con IL-1\beta (30 pg/ml). CDDO se añadió junto con IL-1. En la Figura (14E), las transferencias de Western muestran la supresión de la proteína COX-2; CDDO se añadió junto con IL-1\beta (30 pg/ml). Se muestra también la supresión de la producción acumulativa de PGE_{2} en los sobrenadantes celulares por CDDO.
Estos efectos de CDDO se han observado en macrófagos primarios de ratón, una línea celular de tumor de tipo macrófago de ratón (RAW 264.7), y en fibroblastos no neoplásicos de colon humanos. La Figura 14A muestra transferencias de Western para la expresión de las proteínas iNOS y COX-2 en macrófagos primarios. No puede detectarse la expresión de iNOS ni de COX-2 en estas células hasta que se estimulan mediante un mediador inflamatorio tal como IFN-\gamma o LPS. CDDO a concentraciones de 1 \muM o menores bloquea la expresión de ambas proteínas iNOS y COX-2. La importancia de la función nitrilo en el C-2 de CDDO, como se ha visto anteriormente en la Figura 13, se muestra de nuevo en la Figura 14A. La Figura 14B muestra transferencias de Northern que indican que CDDO (10^{-6} M) reducía los niveles de la expresión de ARNm para ambas iNOS y COX-2 en células RAW 264.7 en más del 75%. Los efectos anteriores sobre iNOS y COX-2 se reflejan también en la producción acumulativa de sus productos enzimáticos respectivos, NO y PGE_{2}, como se mide en macrófagos primarios (Figura 14C). La inhibición significativa mediante CDDO se encontró a niveles tan bajos como 10^{-9} M y, de nuevo, era notablemente más activo que TP-82 o el ácido oleanólico. Sin embargo, CDDO no es un inhibidor directo de la actividad enzimática de cualquiera de iNOS o COX-2, ya que no tiene un efecto inmediato sobre la producción de NO o prostaglandina si se añade a las células RAW en las que la síntesis de estas dos enzimas ya se había inducido (datos no mostrados). Análogamente, el antagonista de glucocorticoide no bloquea las acciones de CDDO, RU-486, que se sabe que se une al receptor de glucocorticoides (datos no mostrados). Respecto a esto, CDDO es idéntico a los otros derivados de ácido oleanólico estudiados previamente (Suh et al., 1998).
Un segundo tipo de células en el que CDDO es un inhibidor altamente eficaz de la formación de novo de COX-2 es el miofibroblasto de colon. Estas células se seleccionaron debido a la importancia de la célula estromal COX-2 en la carcinogénesis de colon (Oshima et al., 1996). CDDO bloqueaba la inducción del ARNm de COX-2 y proteína causada por el tratamiento de célulasCo no neoplásicas con IL-1 (Figuras 14D, E); de nuevo, esta acción se reflejaba en una reducción de los niveles de PGE_{2} en el medio de cultivo. Aunque CDDO bloquea eficazmente la inducción de COX-2 mediante agentes tales como IFN-\gamma, LPS, TNF-\alpha, y IL-1. CDDO es ineficaz cuando se usa TPA como el inductor de COX-2. Esto se ha observado en células ^{18}Co, así como en la línea celular del epitelio de mama humano, 184B5/HER (Zhai et al., 1993).
Ejemplo 5 CDDO Suprime iNOS y Protege Contra la Destrucción Celular en Células de Cerebro de Ratas
Los papeles de los mediadores inflamatorios, así como programas aberrantes para supervivencia y apoptosis celular, en la génesis de cáncer y enfermedad de Alzheimer están experimentando ahora una gran investigación (McGeer y McGeer, 1995; Merrill y Benveniste, 1996; Afama et al., 1998). CDDO se ensayó en este ejemplo como un supresor de la formación de novo de iNOS en células microgliales cultivadas (los macrófagos residentes del cerebro), así como su capacidad para proteger las neuronas del hipocampo cultivadas de la muerte celular inducida por \beta-amiloide. Se encontró que CDDO actúa en cultivos microgliales primarios de una manera similar a la presentada anteriormente para los macrófagos peritoneales primarios. De esta manera, LPS (5 ng/ml) inducía iNOS en cultivos microgliales primarios y provocaba un aumento de 27 veces en la producción de NO en 18 h. El tratamiento concomitante de estos cultivos con CDDO a 10^{-6} o 10^{-7} M inhibía esta inducción en un 73% y 52%, respectivamente. Se ha explorado también la posibilidad de que CDDO pueda proteger las neuronas del hipocampo cultivadas de la destrucción celular inducida por el péptido \beta-amiloide, puesto que el NO se ha visto implicado (Akama et al., 1998) en las acciones neurotóxicas de este péptido que es fundamental para la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (Selkoe, 1997). Las neuronas del hipocampo se aislaron y cultivaron a partir de embriones de rata de 16 días y después se trataron con CDDO durante 24 h antes de añadir el fragmento del péptido \beta-amiloide, los aminoácidos 25-35, a una concentración final de 10 \muM. Esta dosificación de \beta-amiloide solo provocaba la destrucción de más de la mitad de las neuronas en el cultivo en 24 h, según se mide mediante la enzima MTT. Sin embargo, el pre-tratamiento de los cultivos neuronal con CDDO (10^{-8} y 10^{-7} M) evitaba totalmente esta destrucción celular, y se encontró alguna actividad protectora de CDDO a dosis tan bajas como 10^{-10} M.
Sumario
Como se ha observado anteriormente, los compuestos de la invención tales como CDDO son moléculas multifuncionales potentes que tienen un amplio intervalo de acciones, muchas de las cuales son potencialmente útiles para la prevención o tratamiento de enfermedades tales como cáncer. Se inhibe la proliferación de muchas líneas celulares de tumor humanas, incluyendo aquellas derivadas de carcinomas de mama positivos y negativos al receptor de estrógeno, leucemias mieloides, y diversos carcinomas que llevan una mutación Smad-4. Se suprime la capacidad de diversas citoquinas inflamatorias, tales como interferón-\gamma, interleuquina-1, o factor de necrosis tumoral-\alpha para inducir la formación de novo de las enzimas, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) o ciclooxigenasa inducible (COX-2) en macrófagos peritoneales de ratón, células microgliales de cerebro de rata, o fibroblastos de colon humanos. También, las neuronas del hipocampo del cerebro se protegen de la destrucción celular inducida por \beta-amiloide. Lo anterior indica que los compuestos de la invención, por ejemplo, CDDO, son útiles in vivo, para la quimioprevención o para la quimioterapia de malignidades, así como para la neuroprotección.

Claims (6)

1. Un compuesto que tiene la fórmula
8
y la denominación ácido 2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oico (CDDO).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto que tiene la fórmula
9
3. El compuesto de la reivindicación 1 ó 2 para su uso en la prevención o tratamiento de un trastorno seleccionado entre cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades inflamatorias del intestino, y artritis reumatoide.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en el que dicho cáncer se selecciona entre el grupo constituido por cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer cerebral, y cáncer de huesos.
5. El compuesto de la reivindicación 3, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa se selecciona entre el grupo constituido por enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y esclerosis lateral amiotrófica.
6. El compuesto de la reivindicación 3, en el que dicha enfermedad inflamatoria del intestino se selecciona entre el grupo constituido por enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
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