ES2325165T3 - Polipeptidos y dna de xrec2. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo constituido por: (a) la secuencia de DNA de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4; y (c) una molécula de ácido nucleico aislada degenerada de SEQ ID NO: 2 como resultado del código genético.
Description
Polipéptidos y DNA de Xrec2.
La invención está orientada a nuevos
polipéptidos purificados y aislados Xrec2 y fragmentos de los
mismos, los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos,
procesos para producción de formas recombinantes de tales
polipéptidos, anticuerpos generados contra estos polipéptidos,
péptidos fragmentados derivados de estos polipéptidos, y usos de
los mismos.
La interleuquina-1
(IL-1) es un miembro de un gran grupo de citoquinas
cuya función primaria es mediar las respuestas inmunitarias e
inflamatorias. Existen cinco miembros conocidos de la familia
IL-1, que incluyen IL-1 alfa
(IL-1\alpha), IL-1 beta
(IL-1\beta), antagonista del receptor de
IL-1 (IL-1ra), IL-1
delta (IL-1\delta como se describe en WO
99/35268), e IL-18 (conocido previamente como IGIF y
a veces IL-1 gamma). La IL-1 que es
secretada por los macrófagos es realmente una mezcla de
principalmente IL-1\beta y algo de
IL-1\alpha (Abbas et al., 1994).
IL-1\alpha e IL-1\beta, que son
producidos primeramente como precursores de 33 kD que carecen de
una secuencia señal, son procesados ulteriormente por escisión
proteolítica para producir formas activas secretadas, de
aproximadamente 17 kD cada una. Adicionalmente, el precursor de 33
kD de IL-1\alpha es también activo. Ambas formas
de IL-1 son los productos de dos genes diferentes
localizados en el cromosoma 2. Aunque las dos formas tienen entre
sí una homología menor que 30 por ciento, ambas se fijan a los
mismos receptores y tienen actividades similares.
La familia IL-1 de ligandos se
fija a un receptor común compuesto de una cadena de fijación de
ligando, el receptor de IL-1 tipo I
(IL-1RI), y un componente de señalización requerido,
la proteína accesoria (AcP) IL-1R (Sims et
al., 1988; Greenfeder et al., 1995; Cullinan et
al., 1998). Un receptor de IL-1 tipo II
(IL-1RII) fija y secuestra el agonista de
IL-1 (especialmente IL-1\beta) sin
inducir respuesta alguna de señalización de sí mismo (McMahan et
al., 1991; Sims et al., 1993; Colotta et al.,
1993; Colotta et al., 1994). Los ligandos de
IL-1 pueden fijarse también a un fragmento
proteolítico soluble de IL-1RII
(sIL-1RII) (Colotta et al., 1993).
IL-1ra, una forma biológicamente
inactiva de IL-1, es estructuralmente homóloga a
IL-1. IL-1ra se produce con una
secuencia señal que permite la secreción eficiente en la región
extracelular (Abbas et al., 1994). Adicionalmente,
IL-1ra se fija al receptor de IL-1
tipo I pero falla en cuanto a la producción de la interacción
subsiguiente con AcP. Así, IL-1ra bloquea
IL-1RI e impide la acción del agonista de
IL-1 (Hannum et al., 1990; Eisenberg et
al., 1990).
La fuente principal de IL-1 es
el macrófago o fagocito mononuclear activado. Otras células que
producen IL-1 incluyen células epiteliales y
endoteliales (Abbas et al., 1994). La secreción de
IL-1 por los macrófagos ocurre después que el
macrófago encuentra e ingiere bacterias
gram-negativas. Tales bacterias contienen moléculas
de lipopolisacárido (LPS), conocidas también como endotoxina, en la
pared de la célula bacteriana. Las moléculas LPS son los
componentes activos que estimulan los macrófagos a producir factor
de necrosis tumoral (TNF) e IL-1. En este caso,
IL-1 se produce en respuesta a la producción de LPS
y TNF. A concentraciones bajas, LPS estimula los macrófagos y
activa las células B y otras respuestas del hospedador necesarias
para eliminar la infección bacteriana; en cambio, a concentraciones
elevadas, LPS puede causar deterioro grave de los tejidos, choque,
e incluso la muerte.
Las funciones biológicas de IL-1
incluyen activación de las células endoteliales vasculares y los
linfocitos, destrucción de tejido local, y fiebre (Janeway et
al., 1996). A niveles bajos, IL-1 estimula los
macrófagos y las células endoteliales vasculares para producir
IL-6, regula en sentido creciente moléculas en la
superficie de las células endoteliales vasculares a aumentar la
adhesión de los leucocitos, y activa indirectamente los leucocitos
inflamatorios por estimulación de los fagocitos mononucleares y
otras células producir ciertas quimioquinas que activan los
leucocitos inflamatorios. Adicionalmente, IL-1 está
implicada en otras respuestas inflamatorias tales como la inducción
de prostaglandinas, la sintetasa del óxido nítrico, y
metaloproteinasas. Estas funciones de IL-1 son
cruciales durante las infecciones microbianas de nivel bajo. No
obstante, si la infección microbiana aumenta de escala,
IL-1 actúa sistémicamente por inducción de fiebre,
estimulación de los fagocitos mononucleares a producir
IL-1 e IL-6, aumento de la
producción de proteínas del suero por los hepatocitos, y activación
del sistema de coagulación. Adicionalmente, IL-1 no
causa necrosis hemorrágica de los tumores, suprime la división de
las células madre de la médula ósea, e IL-1 es letal
para los humanos a concentraciones altas.
Dada la importante función de
IL-1, existe necesidad de identificar miembros
adicionales de la familia de ligandos de IL-1 y la
familia de receptores de IL-1. Adicionalmente,
teniendo en cuenta el interés continuo en la investigación de
proteínas y en el sistema inmunitario, el descubrimiento, la
identificación, y los papeles de nuevas proteínas y sus
inhibidores, se encuentran en la vanguardia de la biología molecular
y la bioquímica modernas. A pesar del acervo creciente de
conocimiento, existe todavía necesidad en la técnica de descubrir
la identidad y función de las proteínas implicadas en las respuestas
celulares e inmunológicas.
\newpage
En otro aspecto, la identificación de la
estructura primaria, o secuencia, de una proteína desconocida, es
la culminación de un proceso arduo de experimentación. A fin de
identificar una proteína desconocida, el investigador puede basarse
en una comparación de la proteína desconocida con péptidos conocidos
utilizando una diversidad de métodos conocidos por los expertos en
la técnica. Por ejemplo, las proteínas se analizan rutinariamente
utilizando técnicas tales como electroforesis, sedimentación,
cromatografía, secuenciación y espectrometría de masas.
En particular, la naturaleza singular de la
composición de una proteína con relación a sus aminoácidos
específicos constituyentes da como resultado un posicionamiento
singular de sitios de escisión dentro de la proteína. La
fragmentación específica de una proteína por escisión química o
enzimática da como resultado una "huella dactilar peptídica"
singular (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:
1102-1106, 1977; M. Brown et al., J. Gen.
Virol. 50: 309-316, 1980). Por consiguiente, la
escisión en sitios específicos da como resultado una fragmentación
reproducible de una proteína dada en péptidos de pesos moleculares
precisos. Adicionalmente, estos péptidos poseen características
singulares de carga que determinan el pH isoeléctrico del péptido.
Estas características singulares pueden aprovecharse utilizando una
diversidad de técnicas electroforéticas y de otros tipos (Brock
et al., Biology of Microorganisms, pp.
76-77, Prentice Hall, 6ª edición, 1991).
La fragmentación de las proteínas se emplea
adicionalmente para análisis de la composición de aminoácidos y
secuenciación de las proteínas (P. Matsudiara, J. Biol. Chem.
262: 10035-10038, 1987; C. Eckerskorn et
al., Electrophoresis 9: 830-838, 1988),
particularmente la producción de fragmentos de proteínas con un
término N "bloqueado". Adicionalmente, las proteínas
fragmentadas pueden utilizarse para inmunización, para selección de
afinidad (R.A. Brown, Patente U.S. No. 5.151.412), para
determinación de sitios de modificación (v.g.
fosforilación), para generación de compuestos biológicos activos
(Brock et al., Biology of Microorganisms, pp.
300-301, Prentice Hall, 6ª edición, 1991), y para
diferenciación de propiedades homólogas (M. Brown et al.,
J. Gen. Virol. 50: 309-316,
1980).
1980).
Adicionalmente, cuando se obtiene una huella
dactilar peptídica de una proteína desconocida, la misma pueda
compararse con una base de datos de proteínas conocidas para ayudar
a la identificación de la proteína desconocida utilizando
espectrometría de masas (W.J. Henzel et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:5011-5015, 1993; D. Fenyo
et al., Electrophoresis 19:998-1005,
1998). Una diversidad de programas de software de ordenador para
facilitar estas comparaciones están accesibles en Internet, tales
como Protein Prospector (sitio de Internet: prospector.uscf.edu),
Multi-Ident (sitio de Internet:
www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Internet síte:
www.mann.embl-heildelberg.de...deSearch(FR._PeptideSearch
Form.html), y ProFound (sitio de Internet:
www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-binf/protid-frag.html).
Estos programas permiten al usuario especificar el agente de
escisión y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados dentro
de una tolerancia especificada. Los programas comparan estos pesos
moleculares con información de pesos moleculares de proteínas
almacenados en bases de datos para facilitar la determinación de la
identidad de la proteína desconocida. Para una identificación
exacta se requiere información exacta concerniente al número de
péptidos fragmentados y el peso molecular preciso de dichos
péptidos. Por consiguiente, el aumento de la exactitud en la
determinación del número de péptidos fragmentados y su peso
molecular debería dar como resultado una mayor probabilidad de éxito
en la identificación de las proteínas desconocidas.
Adicionalmente, productos de digestión de
proteínas desconocidas pueden secuenciarse utilizando espectrometría
de masas en tándem (MS/MS) e investigarse la secuencia resultante
contra bases de datos (J.K. Eng et al., J. Am. Soc. Mass
Spec. 5:976-989, 1994; M. Mann et al.,
Anal. Chem. 66:4390-4399, 1994; J.A. Taylor
et al., Rapid Comm. Mass Spec.
11:1067-1075, 1997). Programas de búsqueda que
pueden utilizarse en este proceso existen en Internet, tales como
Lutefisk 97 (sitio de Internet: www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html), y
los programas Protein Prospector, Peptide Search y ProFound arriba
descritos. Por consiguiente, la adición de la secuencia de un gen y
su secuencia predicha de proteínas y fragmentos peptídicos a una
base de datos de secuencias puede contribuir a la identificación de
proteínas desconocidas utilizando espectrometría de masas en
tándem.
Así pues, existe también necesidad en la técnica
de polipéptidos adecuados para uso en estudios de fragmentación de
péptidos, para uso en determinaciones de peso molecular, y para uso
en secuenciación de proteínas utilizando espectrometría de masas en
tándem.
La presente invención proporciona moléculas de
ácido nucleico aisladas y polipéptidos codificados por las
moléculas de ácido nucleico para un receptor de la familia de
IL-1 denominado "Xrec2". Así, en un aspecto,
la invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada
seleccionada del grupo constituido por:
(a) la secuencia de DNA de SEQ ID NO: 2;
(b) una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de
SEQ ID NO: 4; y
(c) una molécula de ácido nucleico aislada
degenerada de SEQ ID NO: 2 como resultado del código genético.
\newpage
La invención proporciona también un vector
recombinante que dirige la expresión de la molécula de ácido
nucleico de la invención, y una célula hospedadora transfectada o
transducida con un vector de este tipo. Se proporciona también un
polipéptido aislado codificado por la molécula de ácido nucleico de
la invención, que puede encontrarse en forma no glicosilada. La
invención proporciona también un oligómero que comprende un
polipéptido de la
invención.
invención.
Se proporciona también un anticuerpo aislado que
se fija a un polipéptido de la invención, que puede ser un
anticuerpo monoclonal.
La invención proporciona adicionalmente un
método para la producción de un polipéptido Xrec2 que comprende
cultivar una célula hospedadora de la invención en condiciones que
promueven la expresión, y recuperar el polipéptido del medio de
cultivo. Están abarcadas por la invención moléculas de ácido
nucleico monocatenarias y bicatenarias tanto de RNA como de DNA.
Los ácidos nucleicos arriba indicados pueden utilizarse para
identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas que tienen
actividades asociadas con ligandos y receptores de la familia
IL-1. Así, la molécula de ácido nucleico de Xrec2
puede utilizarse para identificar el ligando Xrec2.
Adicionalmente, estos ácidos nucleicos pueden
utilizarse para identificar los cromosomas humanos con los cuales
están asociados los ácidos nucleicos. Así, los ácidos nucleicos de
Xrec2 pueden utilizarse para identificar el cromosoma X humano. De
acuerdo con ello, estos ácidos nucleicos pueden utilizarse también
para mapear genes en el cromosoma X humano; para identificar genes
asociados con ciertas enfermedades, síndromes, u otras afecciones
humanas asociadas con el cromosoma X humano; y para estudiar la
transducción de señales celulares y el sistema inmunitario.
Pueden utilizarse oligonucleótidos sentido o
antisentido de los ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 y 7
para inhibir la expresión del polinucleótido respectivo codificado
por los ácidos nucleicos.
La invención comprende adicionalmente métodos
para la producción de un polipéptido Xrec, que comprenden cultivar
una célula hospedadora de la invención en condiciones que promueven
la expresión, y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.
Especialmente la expresión de estos polipéptidos en bacterias,
levaduras, plantas, insectos, y células animales está abarcada en
la invención.
En general, los polipéptidos de la invención
pueden utilizarse para estudiar procesos celulares tales como
regulación inmunitaria, proliferación celular, muerte celular,
migración celular, interacción célula-célula, y
respuestas inflamatorias. Adicionalmente, estos polipéptidos pueden
utilizarse para identificar proteínas asociadas con receptores de
Xrec2.
Por otra parte, estos polipéptidos pueden
utilizarse en ensayos para cribado de inhibidores potenciales de la
actividad asociada con moléculas polipeptídicas contraestructura, y
como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades
mediadas por moléculas polipeptídicas contraestructura.
Adicionalmente, estos polipéptidos pueden utilizarse en el diseño
de inhibidores (v.g., receptores modificados por ingeniería genética
que actúan como inhibidores) de los mismos.
Las secuencias de ácido nucleico de Xrec2,
secuencias de aminoácidos predichas del polipéptido o fragmentos de
las mismas, o una combinación de las secuencias predichas de
aminoácidos del polipéptido de fragmentos de las mismas pueden
utilizarse en investigación de una base de datos electrónica para
ayudar a la identificación de ácidos nucleicos muestra y/o
proteínas. Los polipéptidos descritos en esta memoria pueden
utilizarse como controles para establecer la extensión de la
fragmentación de las proteínas.
Anticuerpos policlonales o monoclonales aislados
que se fijan a estos polipéptidos están abarcados también por la
invención. Estos anticuerpos pueden utilizarse para contribuir a la
purificación de los polipéptidos de la inven-
ción.
ción.
La Figura 1 representa diagramáticamente la
estructura genómica del locus IL-1 zeta.
La Figura 2 representa un modelo molecular que
muestra la estructura secundaria de IL-1 zeta, en la
cual las cadenas \beta se representan en amarillo, indicándose su
dirección por la punta de flecha; las vueltas \beta se muestran
en color azul; y las espirales se muestran en color verde. La
estructura de IL-1 zeta se presenta en dos vistas
dife-
rentes.
rentes.
\newpage
Las moléculas de ácido nucleico descritas en
esta memoria incluyen las secuencias de nucleótidos siguientes:
Nombre: IL-1 zeta (no abarcada
en la invención)
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre: Xrec2
Nombre: TDZ.1 (no abarcada en la invención)
Nombre: TDZ.2 (no abarcada en la invención)
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre: TDZ.3 (no abarcada en la invención)
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de aminoácidos de los
polipéptidos codificados por la secuencia de nucleótidos descrita en
esta memoria incluyen:
Nombre: IL-1 zeta (polipéptido)
(no abarcada en la invención)
\newpage
Nombre: Xrec2 (polipéptido)
Nombre: TDZ.1 (polipéptido) (no abarcada en la
invención)
Nombre: TDZ.2 (polipéptido) (no abarcada en la
invención)
Nombre: TDZ.3 (polipéptido) (no abarcada en la
invención)
El descubrimiento de la IL-1
zeta, las variantes de corte y empalme de IL-1 zeta
(TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3) y los ácidos nucleicos de Xrec2 permite la
construcción de vectores de expresión que comprenden secuencias de
ácido nucleico que codifican los polipéptidos respectivos y células
hospedadoras transfectadas o transformadas con los vectores de
expresión. Se hace posible también el aislamiento y la purificación
de IL-1 zeta biológicamente activa, las variantes
de corte y empalme de IL-1 zeta, y los polipéptidos
Xrec2 y fragmentos de los mismos. Los ácidos nucleicos u
oligonucleótidos de los mismos pueden utilizarse como sondas para
identificar ácido nucleico codificante de proteínas que tienen
actividades asociadas. Así, pueden utilizarse IL-1
zeta y las variantes de corte y empalme de IL-1
zeta para identificar actividades asociadas con ligandos de la
familia IL-1, y puede utilizarse Xrec2 para
identificar actividades asociadas con receptores de la familia
IL-1. Adicionalmente, los ácidos nucleicos u
oligonucleótidos de los mismos de IL-1 zeta TDZ.1,
TDZ.2, y TDZ.3 pueden utilizarse para identificar el cromosoma 2
humano, mientras que los de Xrec2 pueden utilizarse para identificar
el cromosoma X humano. Análogamente, estos ácidos nucleicos u
oligonucleótidos de los mismos pueden utilizarse para mapear genes
en los cromosomas humanos 2 y X, respectivamente, y para identificar
genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes u otras
afecciones humanas asociadas con los cromosomas humanos 2 y X. Así,
los ácidos nucleicos u oligonucleótidos de los mismos de
IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, y TDZ. 3 pueden utilizarse
para identificar glaucoma, displasia ectodérmica, diabetes mellitus
dependiente de insulina, síndrome de piel arrugada, leucemia/linfoma
de las células T, y distrofia muscular tibial, mientras que los
ácidos nucleicos u oligonucleótidos de los mismos de Xrec2 pueden
utilizarse para identificar retinosquisis, lisencefalia, heteropia
laminar subcortical, retardo mental, síndrome de Cowchock, síndrome
de Bazex, hipertricosis, síndrome linfoproliferativo,
inmunodeficiencia, displasia mesomélica de Langer, y leucemia.
Finalmente, los oligonucleótidos monocatenarios sentido o
antisentido de estos ácidos nucleicos pueden utilizarse para
inhibir la expresión de polinucleótidos codificados por los genes
de IL-1 zeta y Xrec2, respectivamente.
Adicionalmente, los polipéptidos
IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Xrec2 y fragmentos
solubles de los mismos pueden utilizarse para activar y/o inhibir
la activación de células endoteliales vasculares y linfocitos,
inducir y/o inhibir la inducción de la destrucción de tejido local y
fiebre (Janeway et al., 1996), inhibir y/o estimular los
macrófagos y las células endoteliales vasculares para producir
IL-6, inducir y/o inhibir la inducción de
prostaglandinas, sintetasa de óxido nítrico, y metaloproteinasas, y
regular en sentido creciente y/o inhibir la regulación creciente de
moléculas en la superficie de las células endoteliales vasculares.
Además, estos polipéptidos y péptidos fragmentados pueden utilizarse
también para inducir y/o inhibir la inducción de mediadores
inflamatorios tales como los factores de transcripción
LF-\kappaB y AP-1, las quinasas
MAP JNK y p38, COX-2, INOS, y la totalidad de las
actividades estimuladas por estas moléculas.
Adicionalmente, estos polipéptidos y péptidos
fragmentados pueden utilizarse como controles para fragmentación de
péptidos. Finalmente, estos polipéptidos y fragmentos de los mismos
pueden utilizarse para generar anticuerpos, los cuales pueden
utilizarse para purificar los polipéptidos IL-1 zeta
y Xrec2.
En una realización particular, la invención se
refiere a ciertas secuencias de nucleótidos aisladas que están
exentas de material contaminante endógeno. Una "secuencia de
nucleótidos" hace referencia a una molécula de polinucleótido en
la forma de un fragmento separado o como componente de una
construcción de ácido nucleico de mayor tamaño. La molécula de
ácido nucleico se ha derivado de DNA o RNA aislado al menos una vez
en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentración que
permita la identificación, manipulación, y recuperación de sus
secuencias de nucleótidos componentes por métodos bioquímicos
estándar (tales como los reseñados en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Tales
secuencias se proporcionan y/o construyen preferiblemente en la
forma de un marco de lectura abierto no interrumpido por secuencias
internas no traducidas, o intrones, que están presentes típicamente
en los genes eucariotas. Las secuencias de DNA no traducido pueden
estar presentes en posición 5' o 3' respecto a un marco de lectura
abierto, donde las mismas no interfieren con la manipulación o
expresión de la región codificante.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
incluyen DNA en forma tanto monocatenaria como bicatenaria, así
como el complemento de RNA del mismo. El DNA incluye, por ejemplo,
cDNA, DNA genómico, DNA sintetizado químicamente, DNA amplificado
por PCR, y combinaciones de los mismos. El DNA genómico puede
aislarse por técnicas convencionales, v.g., utilizando como sonda
el cDNA de SEQ ID NO: 2 o un fragmento adecuado del mismo.
Las moléculas de DNA de la invención incluyen
genes de longitud total así como polinucleótidos y fragmentos de
los mismos. El gen de longitud total puede incluir el péptido señal
N-terminal. Otras realizaciones incluyen DNA
codificante de una forma soluble, v.g., codificante del dominio
extracelular de la proteína, con o sin el péptido señal.
Los ácidos nucleicos de la invención se derivan
preferiblemente de secuencias humanas, pero la invención incluye
también los derivados de especies no humanas.
Las moléculas de ácido nucleico particularmente
preferidas de la invención son las que se muestran en SEQ ID NO: 2
para Xrec2. Clones de cDNA que tenían la secuencia de ácido nucleico
de SEQ ID NOs: 1 y 2 se aislaron como se describe en el Ejemplo 1.
Las secuencias de los aminoácidos de IL-1 zeta y
Xrec2 codificadas por los DNAs de SEQ ID NOs: 1 y 2 se muestran en
SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente. Clones de cDNA que tenían la
secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 5, 6 y 7 se aislaron como
se describe en el Ejemplo 8. Las secuencias de los aminoácidos de
TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3 codificadas por los DNAs de SEQ ID NOs: 5, 6 y
7 se muestran en SEQ ID NOs: 8, 9, y 10, respectivamente.
SEQ ID NOs: 1-4 identifican la
IL-1 zeta de SEQ ID NO: 3 como un miembro de la
familia IL-1 y el Xrec2 de SEQ ID No: 4 como un
miembro de la familia de receptores de IL-1. Las
homologías en las cuales se basa esto se indican en la Tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes de corte y empalme de
IL-1 zeta se descubrieron en un tramo de secuencia
de DNA genómico (X22304.gbn). Esta secuencia genómica contiene
también los diferentes exones de IL-1 zeta y otra
variante de corte y empalme conocida como Tango-77
(WO 99/06426). La comparación de las secuencias de cDNA de las
IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y
Tanto-77 clonadas con la secuencia genómica
proporciona información en cuanto a la generación de los sucesos de
corte y empalme. La Figura 1 muestra la estructura genómica del
locus de IL-1 zeta y los cDNAs generados por corte
y empalme alternativos. Los recuadros numerados indican los exones
individuales 1-6 y el tamaño aproximado de los
intrones interpuestos se indica en la parte superior. El asterisco
(*) indica la presencia de un codón de parada, en el extremo de la
secuencia codificante (exón 6) o como un codón de parada en marco
(exón 3). "M" indica una metionina de iniciación potencial
originada por el exón 1 o el exón 3. Tango-77 es la
estructura de cDNA descrita en WO 99/06426. Una característica
importante de IL-1 zeta y sus variantes de corte y
empalme es la presencia o la ausencia del exón 4. El exón 4 está
presente en IL-1 zeta, TDZ1 y TDZ.2, pero no en
Tango-77 o TDZ.3. La secuencia de aminoácidos
codificada por el exón 4 se alinea bien con las secuencias de
aminoácidos de otros miembros de la familia IL-1 en
el pequeño número de las primeras cadenas beta de los péptidos
maduros. En contraste, las secuencias de aminoácidos codificadas por
los exones 1 y 2 de Tango-77 y el exón 1 de los
cDNAs de TDZ.3, que reemplazan más bien que complementan el exón 4
de IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2, no se alinean bien con
otros miembros de la familia IL-1 en esta misma
región. IL-1 zeta, Tango-77, TDZ.1,
TDZ.2 y TDZ.3 se alinean bien todas ellas con las secuencias de
aminoácidos de otros miembros de la familia IL-1 en
los 2/3 del terminal C del péptido maduro (la región codificada por
los exones 5 y 6 que son comunes a todas estas isoformas de corte y
empalme). Así pues, los "péptidos maduros" codificados por los
DNAs de IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2 representan
probablemente moléculas funcionales afines a IL-1.
Esto contrasta con los polipéptidos codificados por los DNAs de
Tango-77 o TDZ.3 que tienen menor probabilidad de
representar una molécula funcional afín a
IL-1.
IL-1.
\newpage
Es probable que la totalidad de las isoformas de
corte y empalme, excepto TDZ.3, codifiquen proformas de una
citoquina afín a IL-1, dado que en la dirección
N-terminal los cDNAs se extienden más allá del
término N de las IL-1s maduras. Esta observación
predice que IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2 codifican el
mismo péptido maduro. En conexión con esta observación se
encuentran la prodominios (así como las UTRs 5') que difieren entre
IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2.
La Tabla III, que detalla la distribución
tisular de IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y
Tango-77, muestra que la expresión de
Tango-77 está más extendida que la de
IL-1 zeta. La Tabla III muestra también que la
expresión de TDZ.1 es comparable, y se superpone prácticamente por
completo, con la de Tango-77. Los datos de
distribución tisular combinados con la información de alineación de
la Figura 1 muestran que TDZ.1 es el único miembro de las variantes
de corte y empalme que se alinea bien con otros miembros de la
familia IL-1, y está muy extendida en su expresión.
Estas observaciones sugieren que TDZ.1 puede ser la más importante
de las variantes de corte y empalme en términos de relevancia para
las respuestas biológicas.
Debido a la conocida degeneración del código
genético, en donde más de un codón puede codificar el mismo
aminoácido, una secuencia de DNA puede variar respecto a la que se
muestra en SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, y 7 codificar sin embargo un
polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NOs: 3, 4, 8, 9 y 10, respectivamente. Dichas secuencias de DNA
variantes pueden ser resultado de mutaciones accidentales
(v.g., que ocurren durante la amplificación por PCR), o
pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia
nativa.
La invención proporciona secuencias aisladas de
DNA que codifican polipéptidos de la invención, seleccionadas de:
(a) DNA que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 2;
(b) DNA que codifica los polipéptidos de SEQ ID NO: 4; (c) DNA
susceptible de hibridación a un DNA de (a) o (b) en condiciones de
severidad moderada y que codifica los polipéptidos de la invención;
(d) DNA susceptible de hibridación a un DNA de (a) o (b) en
condiciones de severidad alta y que codifica los polipéptidos de la
invención, y (e) DNA que está degenerado, como resultado del código
genético, a un DNA definido en (a), (b), (c) o (d) y que codifica
los polipéptidos de la invención. Por supuesto, los polipéptidos
codificados por dichas secuencias de DNA están abarcados por la
invención.
Como se utiliza en esta memoria, las condiciones
de severidad moderada pueden ser determinadas fácilmente por
aquellas personas que poseen una experiencia ordinaria en la técnica
basándose, por ejemplo, en la longitud del DNA. Las condiciones
básicas se indican en Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2ª edición, vol. 1, pp.
1101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,
e incluyen el uso de una solución de prelavado para los filtros de
nitrocelulosa 5X SSC, 0,5% SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de
hibridación de aproximadamente 50% de formamida, 6X SSC a
aproximadamente 42ºC (u otra solución de hibridación similar, tal
como solución de Stark, en aproximadamente 50% formamida a
aproximadamente 42ºC), y condiciones de lavado de aproximadamente
60ºC, 0,5X SSC, 0,1% SDS. Condiciones de severidad alta pueden ser
determinadas también fácilmente por los profesionales expertos
basándose, por ejemplo, en la longitud del DNA. Generalmente, tales
condiciones se definen como condiciones de hibridación como se ha
indicado arriba, y con lavado a aproximadamente 68ºC, 0,2X SSC,
0,1% SDS. El técnico experto reconocerá que la temperatura y la
concentración de sales de la solución de lavado pueden ajustarse
según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud
de la sonda.
Se incluye también como una realización de la
invención DNA que codifica fragmentos de polipéptidos y polipéptidos
que comprenden uno o más sitios desactivados de
N-glicosilación, uno o más sitios desactivados de
procesamiento de proteasas, o una o más sustituciones conservadoras
de aminoácidos, como se describe más adelante.
En otra realización, las moléculas de ácido
nucleico de la invención pueden comprender secuencias de nucleótidos
que son idénticas al menos en un 80% a una secuencia nativa.
Se contemplan también realizaciones en las
cuales una molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que
es idéntica al menos en un 90%, idéntica al menos en un 95%,
idéntica al menos en un 98%, idéntica al menos en un 99%, o
idéntica al menos en un 99,9% a una secuencia nativa.
El porcentaje de identidad puede ser determinado
por inspección visual y cálculo matemático. Alternativamente, el
porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico puede
determinarse por comparación de la información de secuencias
utilizando el programa de ordenador GAP, versión 6.0, descrito por
Devereux et al., Nucl. Acids. Res. 12: 387, 1984, y
disponible del Grupo de Ordenadores de Genética de la Universidad de
Wisconsin (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el
programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación monaria (que
contiene un valor de 1 para identidades y 0 para
no-identidades) para nucleótidos, y la matriz de
comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids.
Res. 14: 6745, 1986, como ha sido descrito por Schwartz y
Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, pp.
353-358, National Biomedical Research Foundation,
1979; (2) una penalidad de 3.0 para cada laguna y una penalidad
adicional de 0,10 para cada símbolo en cada laguna; y (3) ausencia
de penalidad para las lagunas de los extremos. También pueden
utilizarse otros programas utilizados por un experto en la técnica
de comparación de secuencias.
La invención proporciona ácidos nucleicos
aislados útiles en la producción de polipéptidos. Tales polipéptidos
pueden prepararse por cualquiera de varias técnicas convencionales.
Una secuencia de DNA que codifica un polipéptido de la invención, o
un fragmento deseado del mismo puede subclonarse en un vector de
expresión para producción del polipéptido o fragmento. La secuencia
de DNA se fusiona ventajosamente a una secuencia que codifica un
lector o péptido señal adecuado. Alternativamente, el fragmento
deseado puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas
conocidas. Pueden producirse también fragmentos de DNA por digestión
con endonucleasas de restricción de una secuencia de DNA clonada de
longitud total, y aislarse por electroforesis en geles de agarosa.
En caso necesario, oligonucleótidos que reconstruyen el término 5'
o 3' hasta un punto deseado pueden ligarse a un fragmento de DNA
generado por digestión con enzimas de restricción. Tales
oligonucleótidos pueden contener adicionalmente un sitio de
escisión por endonucleasas de restricción aguas arriba de la
secuencia codificante deseada, y posicionar un codón de iniciación
(ATG) en el término N de la secuencia codificante.
El procedimiento bien conocido de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) puede emplearse también para aislar y
amplificar una secuencia de DNA que codifica un fragmento de
proteína deseado. Oligonucleótidos que definen los términos
deseados del fragmento de DNA se emplean como iniciadores 5' y 3'.
Los oligonucleótidos pueden contener adicionalmente sitios de
reconocimiento para endonucleasas de restricción, a fin de facilitar
la inserción del fragmento de DNA amplificado en un vector de
expresión. Técnicas PCR como se describen en Saiki et al.,
Science, 239.487, 1988; Wu et al., compiladores,
Recombinant DNA Methodology, pp. 1189-196,
Academic Press, Inc., San Diego, 1989; e Innis et al., eds.,
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic
Press, Inc., 1990.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención abarca polipéptidos y fragmentos de
los mismos en diversas formas, que incluyen aquéllos que existen
naturalmente o que se producen por diversas técnicas tales como
procedimientos que implican tecnología de DNA recombinante. Dichas
formas incluyen, pero sin carácter limitante, derivados, variantes,
y oligómeros, así como proteínas de fusión o fragmentos de las
mismas.
Los polipéptidos de la invención incluyen
proteínas de longitud total codificadas por las secuencias de ácido
nucleico de la invención. Polipéptidos particularmente preferidos de
Xrec2 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 10. Para
IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2 y TDZ.3 el término N no
codifica un péptido señal clásico, pero la longitud suplementaria
con relación a la forma madura de otros miembros de la familia
IL-1 sugiere que el término N puede actuar como
prodominio. Un sitio de escisión predicho es el punto en que
comienza la porción estructural conservada de la proteína. Datos de
modelización estructural respaldan esta hipótesis. Para
IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2, el sitio está en algún
lugar próximo al extremo N-terminal de la secuencia
de aminoácidos codificada por el exón 4. Así, el polipéptido de
IL-1 zeta, como se expone en SEQ ID NO: 3, incluye
un prodominio supuesto que se extiende desde los aminoácidos 1 a x,
donde x es un número entero de 20 a 50. Análogamente, TDZ.1 de SEQ
ID NO: 8 incluye un prodominio supuesto que se extiende desde los
aminoácidos 1 a x', donde x' es un número entero de 40 a 60 y muy
preferiblemente x' es aproximadamente 52. TDZ.2 de SEQ ID NO: 9
incluye un prodominio supuesto que se extiende desde los aminoácidos
1 a x'', donde x'' es un número entero de 20 a 40 y muy
preferiblemente X'' es 31.
Al contrario que IL-1 zeta y sus
variantes de corte y empalme, el polipéptido de Xrec 2, como se
indica en SEQ ID NO: 4, incluye una región hidrófoba
N-terminal que funciona como un péptido señal,
seguida por un dominio extracelular que comprende los aminoácidos
19 a 359, una región transmembranal que comprende los aminoácidos
360 a 378, y un dominio citoplásmico C-terminal que
comprende los aminoácidos 379 a 696. El análisis por ordenador
predice que el péptido señal corresponde a los residuos 1 a 19 de
SEQ ID NO: 4 (aunque los sitios próximos más probables de escisión
del péptido señal predichos por ordenador, en orden descendente, se
encuentran después de los aminoácidos 20 y 16 de SEQ ID NO: 4). La
escisión del péptido señal produciría por tanto una proteína madura
que comprende los aminoácidos 19 a 696 de SEQ ID NO: 4.
El técnico experto reconocerá que los límites
arriba descritos de tales regiones del polipéptido son aproximados.
Como ilustración, los límites de la región transmembranal (que
pueden predecirse utilizando programas de ordenador disponibles
para dicho propósito) pueden diferir de los arriba descritos.
Los polipéptidos de la invención pueden estar
fijados a la membrana o pueden secretarse y, por consiguiente, ser
solubles. Los polipéptidos solubles son susceptibles de ser
secretados por las células en las que se expresan. En general, los
polipéptidos solubles pueden identificarse (y distinguirse de sus
contrapartidas insolubles fijadas a la membrana) por separación de
células intactas que expresan el polipéptido deseado del medio de
cultivo, v.g., por centrifugación, y ensayo del medio
(sobrenadante) en cuanto a la presencia del polipéptido deseado. La
presencia del polipéptido en el medio indica que el polipéptido fue
secretado por las células y por tanto es una forma soluble de la
proteína.
En una realización, los polipéptidos solubles y
fragmentos de los mismos comprenden la totalidad o parte del
dominio extracelular, pero carecen de la región transmembranal que
podría causar la retención del polipéptido en una membrana celular.
Un polipéptido soluble puede incluir el dominio citoplásmico, o una
porción del mismo, con tal que el polipéptido sea secretado por la
célula en la que se produce.
En general, el uso de formas solubles es
ventajoso para ciertas aplicaciones. La purificación de los
polipéptidos respecto a las células hospedadoras recombinantes se
ve facilitada, dado que los polipéptidos solubles son secretados
por las células. Adicionalmente, los polipéptidos solubles son
generalmente más adecuados para administración intravenosa.
La invención proporciona también polipéptidos y
fragmentos del dominio extracelular que retienen una actividad
biológica deseada. Realizaciones particulares están dirigidas a
fragmentos polipeptídicos de SEQ ID NO: 10 que retienen la
capacidad para fijar los cognados nativos, sustratos o
contraestructura ("pareja de fijación"). Un fragmento de este
tipo puede ser un polipéptido soluble, como se ha descrito arriba.
En otra realización, los polipéptidos y fragmentos incluyen
ventajosamente regiones que se conservan en la familia de receptores
de IL-1 como se ha descrito arriba.
Los fragmentos polipeptídicos pueden comprender
al menos 20, o al menos 30, aminoácidos contiguos de las secuencias
de SEQ ID NOs: 3, 4, 8, 9, y 10. Fragmentos derivados del dominio
citoplásmico de Xrec 2 de SEQ ID NO: 4 encuentran utilidad en
estudios de transducción de señales, y en la regulación de procesos
celulares asociados con la transducción de señales biológicas. Los
fragmentos polipeptídicos pueden emplearse también como
inmunógenos, en la generación de anticuerpos.
En esta memoria se proporcionan variantes
existentes naturalmente así como variantes derivadas de los
polipéptidos y fragmentos.
Las variantes pueden exhibir secuencias de
aminoácidos que son idénticas al menos en un 80%. Se contemplan
también realizaciones en las cuales un polipéptido o fragmento
comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en
un 90%, idéntica al menos en un 95%, idéntica al menos en un 98%,
idéntica al menos en un 99%, o idéntica al menos en un 99,9% al
polipéptido preferido o fragmento del mismo. El porcentaje de
identidad puede determinarse por inspección visual y cálculo
matemático. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos
secuencias de proteína puede determinarse comparando la información
de secuencia con utilización del programa de ordenador GAP, basado
en el algoritmo de Needleman y Wunsch (J.Mol. Bio. 48: 443,
1970) y disponible del Grupo de Ordenadores de Genética de la
Universidad de Wisconsin (UWGCG). Los parámetros por defecto
preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de
registro, blosum62, como ha sido descrita por Henikoff et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915, 1992; (2) un
gravamen por laguna de 12; (3) un gravamen por longitud de laguna
de 4; y (4) sin penalidad por lagunas en los extremos. Pueden
utilizarse también otros programas de comparación de secuencias
utilizados por un experto en la técnica.
Las variantes de la invención incluyen, por
ejemplo, aquéllas que resultan de sucesos alternativos de corte y
empalme de mRNA o de escisión proteolítica. El corte y empalme
alternativo de mRNA puede producir, por ejemplo, una proteína
truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble de
la proteína existente naturalmente. Variaciones atribuibles a
proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los términos N o C
después de la expresión en tipos diferentes de células
hospedadoras, debidas a la eliminación proteolítica de uno o más
aminoácidos terminales de la proteína (generalmente de 1 a 5
aminoácidos terminales). Se contemplan también en esta memoria
proteínas en las cuales las diferencias de secuencia de aminoácidos
son atribuibles a polimorfismo genético (variación alélica entre
los individuos que producen la proteína).
Variantes adicionales dentro del alcance de la
invención incluyen polipéptidos que pueden modificarse para crear
derivados de los mismos por formación de conjugados covalentes o
agregativos con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo,
lípidos, fosfato, grupos acetilo y análogos. Derivados covalentes
pueden prepararse por enlace de los restos químicos a grupos
funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos o en el
término N o el término C de un polipéptido. Se contemplan en esta
memoria conjugados que comprenden agentes diagnósticos
(detectables) o terapéuticos unidos a ellos, como se expone con
mayor detalle más adelante.
Otros derivados incluyen conjugados covalentes o
agregativos de los polipéptidos con otras proteínas o polipéptidos,
por ejemplo por síntesis en cultivo recombinante como fusiones en el
terminal N o el terminal C. Ejemplos de proteínas de fusión se
exponen más adelante en conexión con los oligómeros. Adicionalmente,
las proteínas de fusión pueden comprender péptidos añadidos para
facilitar la purificación e identificación. Tales péptidos
incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de
identificación de antígenos descritos en la Patente U.S. No.
5.011.912 y en Hopp et al., Bio/Technology, 6:
1204-1988. Un péptido de este tipo es el péptido
FLAG®,
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(SEQ ID NO: 11), que es altamente antigénico y proporciona un
epítope unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal
específico, permitiendo el ensayo rápido y la purificación fácil de
una proteína expresada recombinante. Un hibridoma murino designado
4E11 produce un anticuerpo monoclonal que fija el péptido FLAG® en
presencia de ciertos cationes de metales divalentes, como se
describe en la Patente U.S. 5.011.912. La línea de células de
hibridoma 4E11 ha sido depositada con la Colección Americana de
Cultivos Tipo bajo el número de acceso HB 9259. Anticuerpos
monoclonales que fijan el péptido FLAG® están disponibles de
Eastman, Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven,
Connecticut.
Entre los polipéptidos variantes proporcionados
en esta invención se encuentran variantes de polipéptidos nativos
que retienen la actividad biológica nativa o el equivalente
sustancial de la misma. Un ejemplo es una variante que se fija
esencialmente con la misma afinidad de fijación que lo hace la forma
nativa. La afinidad de fijación puede medirse por procedimientos
convencionales, v.g., como se describe en la Patente U.S.
No. 5.512.457 y como se expone más adelante.
\newpage
Las variantes incluyen polipéptidos que son
sustancialmente homólogos a la forma nativa, pero que tienen una
secuencia de aminoácidos diferente de la de la forma nativa debido a
una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Realizaciones
particulares incluyen, pero sin carácter limitante, polipéptidos que
comprenden de una a diez deleciones, inserciones o sustituciones de
residuos de aminoácidos, cuando se comparan con una secuencia
nativa.
Un aminoácido dado puede reemplazarse, por
ejemplo, por un residuo que tenga características fisioquímicas
similares. Ejemplos de tales sustituciones conservadoras incluyen la
sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val,
Leu, o Ala uno por otro; sustituciones de un residuo polar por otro,
tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp, o Gln y Asn; o sustituciones
de un residuo aromático por otro, tal como Phe, Trp, o Tyr uno por
otro. Otras sustituciones conservadoras, v.g., que implican
sustituciones de regiones enteras que tienen características de
hidrofobicidad similares, son bien conocidas.
Análogamente, los DNAs de la invención incluyen
variantes que difieren de una secuencia de DNA nativa debido a una
o más deleciones, inserciones o sustituciones, pero que codifican un
polipéptido biológicamente activo.
La invención incluye adicionalmente polipéptidos
de la invención con o sin glicosilación asociada del patrón nativo.
Los polipéptidos expresados en levadura o sistemas de expresión de
mamífero (v.g., células COS-1 o
COS-7) pueden ser similares a o significativamente
diferentes de un polipéptido nativo en peso molecular y patrón de
glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión.
La expresión de los polipéptidos de la invención en sistemas de
expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona
moléculas no glicosiladas. Adicionalmente, una preparación dada
puede incluir especies múltiples de la proteína glicosiladas
diferencialmente. Los grupos glicosilo pueden eliminarse por
métodos convencionales, en particular los que utilizan
glicopeptidasa. En general, los polipéptidos glicosilados de la
invención pueden incubarse con un exceso molar de glicopeptidasa
(Boehringer
Mannheim).
Mannheim).
Correspondientemente, están abarcadas por la
invención construcciones similares de DNA que codifican diversas
adiciones o sustituciones de residuos o secuencias de aminoácidos, o
deleciones de residuos o secuencias terminales o internas. Por
ejemplo, los sitios de glicosilación en N en el dominio extracelular
del polipéptido pueden modificarse para excluir glicosilación,
permitiendo la expresión de un carbohidrato reducido análogo en
sistemas de expresión de mamíferos y levaduras. Los sitios de
glicosilación en N en polipéptidos eucariotas se caracterizan por
un triplete de amino-ácidos Asn-X-Y,
en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr.
Sustituciones, adiciones, o deleciones apropiadas a la secuencia de
nucleótidos que codifica estos tripletes darán como resultado la
prevención de la fijación de residuos carbohidrato en la cadena
lateral de Asn. La alteración de un solo nucleótido, seleccionado
de tal modo que Asn se reemplaza por un aminoácido diferente, por
ejemplo, es suficiente para desactivar un sitio de glicosilación en
N. Alternativamente, Ser o Thr puede ser reemplazado por otro
aminoácido, tal como Ala. Procedimientos conocidos para desactivar
sitios de glicosilación en N en las proteínas incluyen los
descritos en la Patente U.S. 5.071.972 y en EP 276.846.
En otro ejemplo de variantes, secuencias que
codifican residuos Cys que no son esenciales para la actividad
biológica pueden alterarse para hacer que los residuos Cys se
delecionen o sean reemplazados con otros aminoácidos, previniendo
la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos
después del plegado o la renaturalización.
Otras variantes se preparan por modificación de
residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes, a fin de mejorar la
expresión en sistemas de levadura en los cuales está presente la
actividad de la proteasa KEX2. EP212.914 describe el uso de
mutagénesis orientada para desactivar los sitios de procesamiento de
la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de la
proteasa KEX2 se desactivan por deleción, adición o sustitución de
residuos que alteran los pares Arg-Arg,
Arg-Lys, y Lys-Arg a fin de eliminar
la existencia de estos residuos básicos adyacentes. Los
apareamientos Lys-Lys son considerablemente menos
susceptibles a la escisión por KEX2, y la conversión de
Arg-Lys o Lys-Arg en
Lys-Lys representa un enfoque conservador y
preferido para desactivar los sitios KEX2.
La invención abarca oligómeros o proteínas de
fusión que contienen los polipéptidos Xrec2. Cuando el polipéptido
de la invención es una proteína de membrana tipo I, tal como Xrec2,
la pareja de fusión está enlazada al término C de la proteína de
membrana tipo I. Tales oligómeros pueden encontrarse en la forma de
multímeros enlazados covalentemente o enlazados no covalentemente,
con inclusión de dímeros, trímeros, u oligómeros superiores. Como
se ha indicado arriba, los polipéptidos preferidos son solubles y
por tanto estos oligómeros pueden comprender polipéptidos solubles.
En un aspecto de la invención, los oligómeros mantienen la capacidad
de fijación de los componentes del polipéptido y proporcionan por
ello sitios de fijación divalentes, trivalentes, etc.
Una realización de la invención está dirigida a
oligómeros que comprenden polipéptidos múltiples unidos por la vía
de interacciones covalentes o no covalentes entre los restos
peptídicos fusionados a los polipéptidos. Tales péptidos pueden ser
enlazados peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la
propiedad de promover oligomerización. Las cremalleras de leucina y
ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre
los péptidos que pueden promover oligomerización de los polipéptidos
unidos a ellos, como se describe con mayor detalle más
adelante.
Como una alternativa, se prepara un oligómero
utilizando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La
preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos
polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de
polipéptidos derivados de anticuerpos (con inclusión del dominio Fc)
ha sido descrita, v.g., por Ashkenazi et al., PNAS
USA 88:10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677,
1990; y Hollenbaugh y Aruffo, "Construction of Immunoglobulin
Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology,
Suppl. 4, pp. 10.19.1-10.19.11, 1992.
Una realización de la presente invención está
dirigida a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas
por fusión de un polipéptido de la invención a un polipéptido Fc
derivado de un anticuerpo. Una fusión de genes que codifica la
proteína de fusión polipéptido/Fc se inserta en un vector de
expresión apropiado. Las proteínas de fusión polipéptido/Fc se
expresan en células hospedadoras transformadas con el vector de
expresión recombinante, y pueden ensamblarse de modo muy similar a
las moléculas de anticuerpos, con de lo cual se forman enlaces
disulfuro intercatenarios entre los restos Fc para producir
moléculas bivalentes.
El término "polipéptido Fc", como se
utiliza en esta memoria, incluye formas nativas y formas de muteína
de los polipéptidos constituidos por la región Fc de un anticuerpo
que comprende cualquiera o la totalidad de los dominios CH de la
región Fc. Se incluyen también formas truncadas de tales
polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la
dimerización. Polipéptidos preferidos comprenden un polipéptido Fc
derivado de un anticuerpo humano IgG1.
Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la
solicitud PCT WO 93/10151, es un polipéptido monocatenario que se
extiende desde la región bisagra del terminal N al término C nativo
de la región Fc de un anticuerpo humano IgG1. Otro polipéptido Fc
útil es la muteína Fc descrita en la Patente U.S. 5.457.035 y en
Baum et al., EMBO J. 13: 3992-4001,
1994. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la
de la secuencia Fc nativa presentada en WO 93/10151, excepto que el
aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha
sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de
Gly a Ala. La muteína exhibe afinidad reducida para los receptores
de Fc.
Las proteínas de fusión arriba descritas que
comprenden restos Fc (y los oligómeros formados a partir de las
mismas) ofrecen la ventaja de purificación fácil por cromatografía
de afinidad en columnas de Proteína A o Proteína G.
En otras realizaciones, los polipéptidos de la
invención pueden emplearse en sustitución de la región variable de
una cadena pesada o ligera de anticuerpo. Si las proteínas de fusión
están formadas a la vez por cadenas pesada y ligera de un
anticuerpo, es posible formar un oligómero con tantas regiones
extracelulares polipeptídicas como
cuatro.
cuatro.
Alternativamente, el oligómero es una proteína
de fusión que comprende polipéptidos múltiples, con o sin
enlazadores peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los
enlazadores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las
Patentes U.S. 4.751.180 y 4.935.233. Una secuencia de DNA que
codifica un enlazador peptídico deseado puede insertarse entre, y
en el mismo marco de lectura que, las secuencias de DNA de la
invención, utilizando cualquier técnica convencional adecuada. Por
ejemplo, un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica
el enlazador puede ligarse entre las secuencias. En realizaciones
particulares, una proteína de fusión comprende de 2 a 4
polipéptidos solubles de la invención, separados por enlazadores
peptídicos.
Otro método para preparación de los oligómeros
de la invención implica el uso de una cremallera de leucina. Los
dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la
oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las
cremalleras de leucina fueron identificadas originalmente en varias
proteínas de fijación de DNA (Landschulz et al.,
Science 240: 1759, 1988), y se han encontrado desde entonces
en una diversidad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de
leucina conocidas se encuentran péptidos existentes naturalmente y
derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan.
El dominio de cremallera (al que se hace
referencia también en esta memoria como un dominio oligomerizante,
o formador de oligómeros) comprende una repetición de heptada
repetitiva, a menudo con cuatro o cinco residuos leucina
intercalados con otros aminoácidos. Ejemplos de dominios de
cremallera son los encontrados en el factor de transcripción de
levadura GCN4 y una proteína termoestable de fijación de DNA
encontrada en el hígado de rata (C/EBP; Landschulz et al.,
Science, 243: 1681, 1989). Dos proteínas transformantes
nucleares, fos y jun, exhiben también dominios de
cremallera, como lo hace el producto génico del
proto-oncogén murino, c-myc
(Landschulz et al., Science, 240: 1759, 1988). Los
productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden
dominios de cremallera que forman preferentemente heterodímeros
(O'Shea et al., Science, 245: 646, 1989; Turner et
al., Science, 243: 1689, 1989). El dominio de cremallera
es necesario para la actividad biológica (fijación de DNA) en estas
proteínas.
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Las proteínas fusogénicas de varios virus
diferentes, que incluyen paramixovirus, coronavirus, el virus del
sarampión y muchos retrovirus, poseen también dominios de cremallera
(Buckland et al., Nature, 338:547,1989; Britton,
Nature, 353:394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research
and Human Retroviruses, 6:703, 1990). Los dominios de
cremallera en estas proteínas virales fusogénicas se encuentran
cerca de la región transmembranal de las proteínas; se ha sugerido
que los dominios de cremallera podrían contribuir a la estructura
oligómera de las proteínas fusogénicas. La oligomerización de
proteínas fusogénicas virales está implicada en la formación de
poros de fusión (Spruce et al., Proc. Natl. Acad.Sci.
USA, 88: 3523, 1991). Se ha informado también recientemente que
los dominios de cremallera juegan un papel en la oligomerización de
factores de transcripción del choque térmico (Rabindran et
al., Science, 259: 230, 1993).
Los dominios de cremallera se pliegan como
espirales cortas paralelas enrolladas. (O'Shea et al.,
Science, 254: 539, 1991). La arquitectura general de la
espiral paralela enrollada ha sido bien caracterizada, con un
empaquetamiento del tipo de "botones en ojales" como fue
propuesto por Crick en 1953 (Crack, Acta Crystallogr. 6:
689, 1953). El dímero formado por un dominio de cremallera es
estabilizado por la repetición de heptada, designada
(abcdefg)_{n} de acuerdo con la notación de McLachlan y
Stewart, J.Mol. Biol. 98: 293, 1975, en la cual los residuos
a y d son generalmente residuos hidrófobos, siendo d
una leucina, que están alineados en la misma cara de una hélice.
Residuos con carga opuesta se encuentran comúnmente en las
posiciones g y e. Así, en una espiral enrollada paralela
formada por dos dominios cremallera helicoidales, los
"botones" formados por las cadenas laterales hidrófobas de la
primera hélice están empaquetados en los "ojales" formados
entre las cadenas laterales de la segunda hélice.
Los residuos en la posición d (a menudo
leucina) aportan grandes energías de estabilización hidrófobas, y
son importantes para la formación de oligómeros (Krystek et
al., Int. J. Peptide Res., 38: 229, 1991). Lovejoy et
al., Science 259: 1988, 1993, publicaron recientemente la
síntesis de un haz tri-catenario
\alpha-helicoidal en el cual las hélices discurren
en dirección arriba-arriba-abajo.
Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrófoba
proporciona la fuerza motriz principal para la formación de
espirales enrolladas a partir de monómeros helicoidales. Estos
estudios indican también que ciertas interacciones electrostáticas
contribuyen a la estequiometría y geometría de las espirales
enrolladas. Una discusión adicional de la estructura de las
cremalleras de leucina se encuentra en Harbury et al.,
Science, 262: 1401, 1993.
Ejemplos de dominios cremallera de leucina
adecuados para producir proteínas oligómeras solubles se describen
en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada
de la proteína D tensioactiva del pulmón (SPD) descrita en Hoppe
et al., FEBS Letters, 344: 191, 1994. El uso de una
cremallera de leucina modificada que permite la trimerización
estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe
en Fanslow et al., Semin. Immunol., 6:
267-278, 1994. Proteínas de fusión recombinantes que
comprenden un polipéptido soluble fusionado a un péptido de
cremallera de leucina se expresan en células hospedadoras adecuadas,
y el oligómero soluble que se forma se recupera del sobrenadante de
cultivo.
Ciertos restos de cremallera de leucina forman
preferentemente trímeros. Un ejemplo es una cremallera de leucina
derivada de la proteína D tensioactiva de pulmón (SPD), como se
describe en Hoppe et al., FEBS Letters, 344: 191,
1994, y en la Patente U.S. 5.716.805. Este péptido de cremallera de
leucina derivado de SPD de pulmón comprende la secuencia de
aminoácidos Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln
Gly Gln Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr (SEQ ID
NO:12).
Otro ejemplo de una cremallera de leucina que
promueve trimerización es un péptido que comprende la secuencia de
aminoácidos Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu lle Leu Ser
Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly
Glu Arg (SEQ ID NO:13), como se describe en la Patente U.S.
5.716.805. En una realización alternativa, se añade un residuo Asp
en el terminal N; en otra, el péptido carece del residuo Arg del
terminal
N.
N.
Pueden emplearse también fragmentos de los
péptidos de cremallera que anteceden, que retienen la propiedad de
promover la oligomerización. Ejemplos de tales fragmentos incluyen,
pero sin carácter limitante, péptidos que carecen de uno o dos de
los residuos del terminal N o el terminal C presentados en las
secuencias de aminoácidos que anteceden. Las cremalleras de leucina
pueden derivarse de péptidos de cremallera de leucina existentes
naturalmente, v.g., por la vía de una o más sustituciones
conservadoras en la secuencia de aminoácidos nativa, en donde se
retiene la capacidad del péptido para promover oligomerización.
Otros péptidos derivados de proteínas trímeras
existentes naturalmente pueden emplearse en la preparación de
oligómeros trímeros. Alternativamente, pueden emplearse péptidos
sintéticos que promueven oligomerización. En realizaciones
particulares, los residuos leucina en un resto de cremallera de
leucina están reemplazados por residuos isoleucina. Tales péptidos
que comprenden isoleucina pueden designarse como cremalleras de
isoleucina, pero están abarcados por el término "cremalleras de
leucina" tal como se emplea en esta memoria.
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La expresión, el aislamiento y la purificación
de los polipéptidos y fragmentos de la invención pueden realizarse
por cualquier técnica adecuada, con inclusión, pero sin carácter
limitante, de las siguientes:
La presente invención proporciona también
vectores recombinantes de clonación y expresión que contienen DNA,
así como células hospedadoras que contienen los vectores
recombinantes. Los vectores de expresión que comprenden DNA pueden
utilizarse para preparar los polipéptidos o fragmentos de la
invención codificados por el DNA. Un método para producir
polipéptidos comprende cultivar células hospedadoras transformadas
con un vector de expresión recombinante que codifica el
polipéptido, en condiciones que promueven la expresión del
polipéptido, y recuperar luego del cultivo los polipéptidos
expresados. El técnico experto reconocerá que el procedimiento para
purificar los polipéptidos expresados variará de acuerdo con
factores tales como el tipo de células hospedadoras empleado, y de
que el polipéptido esté fijado a la membrana o sea una forma soluble
que es secretada por la célula hospedadora.
Puede emplearse cualquier sistema de expresión
adecuado. Los vectores incluyen un DNA que codifica un polipéptido
o fragmento de la invención, enlazado operativamente a secuencias de
nucleótidos adecuadas reguladoras de la transcripción o la
traducción, tales como las derivadas de un gen de mamífero,
microbio, virus, o insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras
incluyen promotores de la transcripción, operadores, o
intensificadores, un sitio de fijación de ribosoma de mRNA, y
secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de
la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos
están enlazadas operativamente cuando la secuencia reguladora es
funcionalmente afín a la secuencia de DNA. Así, una secuencia
nucleotídica promotora está enlazada operativamente a una secuencia
de DNA si la secuencia nucleotídica del promotor controla la
transcripción de la secuencia de DNA. Un origen de replicación que
confiere la capacidad para replicarse en las células hospedadoras
deseadas, y un gen de selección por el cual se identifican los
transformantes, están incorporados generalmente en el vector de
expresión.
Adicionalmente, una secuencia que codifica un
péptido señal apropiado (nativo o heterólogo) puede incorporarse en
vectores de expresión. Una secuencia de DNA para un péptido señal
(conductor de la secreción) puede fusionarse en marco a la
secuencia de ácido nucleico de la invención de tal manera que el DNA
se transcribe inicialmente, y el mRNA se traduce, en una proteína
de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es
funcional en las células hospedadoras propuestas promueve la
secreción extracelular del polipéptido. El péptido señal se escinde
del polipéptido una vez secretado el polipéptido por la célula.
El profesional experto reconocerá también que la
o las posiciones en las cuales se escinde el péptido señal pueden
diferir de la predicha por un programa de ordenador, y pueden variar
de acuerdo con factores tales como el tipo de células hospedadoras
empleado en la expresión de un polipéptido recombinante. Una
preparación de proteína puede incluir una mezcla de moléculas de
proteína que tienen aminoácidos N-terminales
diferentes como resultado de la escisión del péptido señal en más
de un sitio. Ejemplos particulares de proteínas maduras
proporcionadas en esta memoria incluyen, pero sin carácter
limitante, proteínas que tienen el residuo en la posición 6, 23,
25, 26, 39, 41, o 48 de SEQ ID NO: 3 y en la posición 1 ó 19 de SEQ
ID NO: 4 como el aminoácido N-terminal.
Células hospedadoras adecuadas para la expresión
de polipéptidos incluyen células procariotas, levaduras o células
eucariotas superiores. Generalmente se prefieren células de mamífero
o de insecto para uso como células hospedadoras. Vectores
apropiados de clonación y expresión para uso con hospedadores
celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero se
describen, por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning
Vectors: A Laboratorv Manual, Elsevier, Nueva York, 1985.
Sistemas de traducción exentos de células podrían emplearse también
para producir polipéptidos utilizando RNAs derivados de las
construcciones de DNA descritas en esta memoria.
Los procariotas incluyen organismos
gram-negativos o gram-positivos.
Células hospedadoras procariotas adecuadas para transformación
incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis,
Salmonella typhimurium, y diversas otras especies dentro de los
géneros Pseudomonas, Streptomyces, y
Staphylococcus. En una célula hospedadora procariota, tal
como E. coli, un polipéptido puede incluir un residuo
metionina en el terminal N para facilitar la expresión del
polipéptido recombinante en la célula hospedadora procariota. La Met
del terminal N puede escindirse del polipéptido recombinante
expresado.
Los vectores de expresión para uso en células
hospedadoras procariotas comprenden generalmente uno o más genes
marcadores fenotípicos seleccionables. Un gen marcador fenotípico
seleccionable es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que
confiere resistencia a los antibióticos o que suministra un
requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión útiles
para células hospedadoras procariotas incluyen los derivados de
plásmidos disponibles comercialmente tales como el vector de
clonación pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes para
resistencia a ampicilina y tetraciclina, y proporciona por ello
medios simples para identificar células transformadas. Un promotor
apropiado y una secuencia de DNA se insertan en el vector pBR322.
Otros vectores disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo,
pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia)
y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Secuencias promotoras utilizadas comúnmente para
vectores de expresión recombinantes en células hospedadoras
procariotas incluyen \beta-lactamasa
(penicilinasa), el sistema promotor de lactosa (Chang et al.,
Nature, 275:615, 1978; y Goeddel et al.,
Nature, 281:544, 1979), el sistema promotor de triptófano
(trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8:4057,
1980; y EP-A-36776) y el promotor
tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p. 412, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1982). Un sistema de expresión
particularmente útil en células hospedadoras procariotas emplea un
promotor del fago \lambdaP_{L} y una secuencia represora
termolábil de cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles de la
American Type Culture Collection que incorporan derivados del
promotor \lambdaP_{L} incluyen el plásmido pHUB2 (residente en
la cepa JMB9 de E. coli, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en
E. coli RR1, ATCC
53082).
53082).
Alternativamente, los polipéptidos pueden
expresarse en células hospedadoras de levadura, preferiblemente del
género Saccharomyces (v.g., S. cerevisiae). Pueden
emplearse también otros géneros de levadura, tales como
Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura
contendrán a menudo una secuencia de origen de replicación de un
plásmido de levadura 2 \mu, una secuencia de replicación autónoma
(ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación,
secuencias para terminación de la transcripción, y un marcador
seleccionable. Secuencias promotoras adecuadas para vectores de
levadura incluyen, entre otras, promotores de metalotioneína,
3-fosfoglicerato-quinasa (Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., 255:2073, 1980) u otras
enzimas glucolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme
Reg., 7:149, 1968; y Holland et al., Biochem.
17:4900, 1978), tales como enolasa,
gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa,
hexoquinasa, piruvato-descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato-isomerasa,
3-fosfoglicerato-mutasa,
piruvato-quinasa,
triosafosfato-isomerasa,
fosfoglucosa-isomerasa, y glucoquinasa. Otros
vectores y promotores adecuados para uso en expresión de levadura
se describen adicionalmente en Hitzeman, EPA-73657.
Otra alternativa es el promotor ADH2 reprimible por glucosa,
descrito por Russell et al., J. Biol. Chem., 258:2674,
1982; y Beier et al., Nature, 300:724, 1982. Vectores
lanzadera replicables tanto en levadura como en E. coli
pueden construirse por inserción de secuencias de DNA de pBR322
para selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y
origen de replicación) en los vectores de levadura arriba
descritos.
La secuencia conductora del factor \alpha de
levadura puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido.
La secuencia conductora del factor \alpha se inserta a menudo
entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural.
(Kurjan et al., Cell, 30:933, 1982; y Bitter et
al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81:5330, 1984.) Otras
secuencias conductoras adecuadas para facilitar la secreción de
polipéptidos recombinantes por hospedadores de levadura son
conocidas por los expertos en la técnica. Una secuencia conductora
puede estar modificada cerca de su extremo 3' de modo que contenga
uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la
secuencia conductora al gen
estructural.
estructural.
Protocolos de transformación de levadura son
conocidos por los expertos en la técnica. Un protocolo de este tipo
ha sido descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75: 1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al.
selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo,
consistiendo el medio selectivo en 0,67% de base nitrogenada de
levadura, 0,5% de casamino-ácidos, 2% de glucosa, 10 mg/ml de
adenina y 20 mg/ml de uracilo.
Las células hospedadoras de levadura
transformadas por vectores que contienen una secuencia promotora
ADH2 pueden cultivarse para inducir la expresión en un medio
"rico". Un ejemplo de un medio rico es uno consistente en 1%
de extracto de levadura, 2% de peptona, y 1% de glucosa suplementado
con 80 mg/ml de adenina y 80 mg/ml de uracilo. La desrepresión del
promotor ADH2 se produce cuando se agota la glucosa en el medio.
Pueden emplearse también sistemas de cultivo de
células hospedadoras de mamífero o de insecto para expresar
polipéptidos recombinantes. Los sistemas de baculovirus para
producción de proteínas heterólogas en células de insecto han sido
revisados por Luckow et al. Bio/Technology, 6: 47,
1988. Pueden emplearse también líneas de células establecidas de
origen mamífero. Ejemplos de líneas de células hospedadoras de
mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de
células de riñón de mono (ATCC CRL1651) (Glutzman et al.,
Cell, 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3
(ATCC CCL163), células de ovario de hámster chino (CHO), células
HeLa, y la línea de células BHK (ATCC CRL 10), así como la línea de
células CV-1/EBNA derivada de la línea de células
de riñón de mono verde africano CV-1 (ATCC CCL 70)
como ha sido descrito por McMahan et al., EMBO J, 10:
2821,
1991.
1991.
Métodos establecidos para la introducción de DNA
en células de mamífero han sido descritos por Kaufman R.J.,
Large Scale Mammalian Cell Culture, pp.
15-69, 1990. Protocolos adicionales que utilizan
reactivos disponibles comercialmente, tales como el reactivo
lipídico Lypofectamine (Gibco/BRL) o el reactivo lipídico
Lipofectamine-Plus, pueden utilizarse para
transfectar células (Felgner et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 84: 7413-7417, 1987). Adicionalmente,
puede utilizarse electroporación para transfectar células de
mamífero utilizando procedimientos convencionales, tales como los
expuestos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989. La selección de transformantes estables
puede realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica, tales
como por ejemplo, resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et
al., Meth. in Enzymology, 185: 487-511,
1990, describe varios esquemas de selección, tales como la
resistencia a la dihidrofolato-reductasa (DHFR). Una
cepa hospedadora adecuada para selección de DHFR puede ser la cepa
DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:
4216-4220, 1980). Un plásmido que expresa cDNA de
DHFR puede introducirse en la cepa DX-B11, y
únicamente las células que contienen el plásmido pueden crecer en
el medio selectivo apropiado. Otros ejemplos de marcadores
seleccionables que pueden incorporarse en un vector de expresión
incluyen cDNAs que confieren resistencia a antibióticos, tales como
G418 e higromicina B. Las células que albergan el vector pueden
seleccionarse sobre la base de la resistencia a estos
compuestos.
Secuencias de control de la transcripción y la
traducción para vectores de expresión en células hospedadoras de
mamífero pueden ser escindidas de los genomas virales. Secuencias
promotoras y secuencias intensificadoras utilizadas comúnmente se
derivan del virus del polioma, adenovirus 2, el virus 40 de los
simios (SV40), y citomegalovirus humano. Pueden utilizarse
secuencias de DNA derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo,
el origen, el promotor temprano y tardío, intensificador, sitio de
corte y empalme, y sitios de poliadenilación de SV40 para
proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una
secuencia de gen estructural en una célula hospedadora de mamífero.
Los promotores virales tempranos y tardíos son particularmente
útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente a partir de un
genoma viral como un fragmento que puede contener también un origen
de replicación viral (Fiers et al., Nature, 273: 113,
1978; y Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Pueden
utilizarse también fragmentos de SV40 más pequeños o mayores, con
tal que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 pb que se
extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BglI
localizado en el origen de replicación viral de SV40.
Secuencias de control adicionales que se ha
demostrado mejoran la expresión de genes heterólogos originarios de
vectores de expresión de mamífero incluyen elementos tales como el
elemento de aumento de expresión de la secuencia (EASE) derivado de
células CHO (Morris et al., Animal Cell Technology,
pp. 529-534, 1997; y Solicitud PCT WO 97/25420) y
el conductor tripartito (TPL) y RNAs del gen VA del Adenovirus 2
(Gingeras et al., J. Biol. Chem., 257:
13475-13491, 1982). La secuencia del sitio de
entrada de ribosoma interno (IRES) de origen viral permite que los
mRNAs dicistrónicos se traduzcan eficientemente (Oh et al.,
Current Opinion in Genetics and Development, 3:
295-300, 1993; y Ramesh et al., Nucleic
Acids Research, 24: 2697-2700, 1996). Se ha
demostrado que la expresión de un cDNA heterólogo como parte de un
mRNA dicistrónico seguida por el gen para un marcador seleccionable
(v.g. DHFR) mejora la transfectabilidad del hospedador y la
expresión del cDNA heterólogo (Kauffman, Meth. in
Enzymology, 1990). Vectores de expresión ilustrativos que
emplean mRNAs dicistrónicos son pTR-BC/GFP descrito
por Mosser et al., Biotechniques, 22:
150-161, 1997, y p2A5I descrito por Morris et
al., Animal Cell Technology, pp.
529-534, 1997.
Un vector útil de expresión alta, pCAVNOT, ha
sido descrito por Mosley et al., Cell, 59:
335-348, 1989. Otros vectores de expresión para uso
en células hospedadoras de mamífero pueden construirse como ha sido
descrito por Okayama et al. (Mol. Cell. Biol., 3:
280, 1983). Un sistema útil para expresión estable de nivel alto de
cDNAs de mamífero en células epiteliales mamarias de murino C127
puede construirse sustancialmente como ha sido descrito por Cosman
et al., Mol. Immunol., 23: 935, 1986. Un vector útil
de alta expresión, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al.,
Nature, 312: 768, 1984, ha sido depositado como ATCC 39890.
Vectores de expresión de mamífero útiles adicionales se describen
en EP-A-0367566, y en WO 91/18982.
En otra alternativa, los vectores pueden derivarse de
retrovirus.
Puede utilizarse otro vector de expresión útil,
pFLAG®. La tecnología FLAG® está centrada en la fusión de un
péptido marcador FLAG® de peso molecular bajo (1 kD) hidrófilo, al
término N de una proteína recombinante expresada por vectores de
expresión pFLAG®. pDC311 es otro vector especializado utilizado para
expresión de proteínas en células CHO. pDC11 se caracteriza por una
secuencia bicistrónica que contiene el gen de interés y un gen de
dihidrofolato-reductasa (DHFR) con un sitio inerno
de fijación de ribosoma para traducción de DHFR, un elemento de
secuencia aumentadora de la expresión (EASE), el promotor humano
CMV, una secuencia conductora tripartita, y un sitio de
poliadenilación.
En relación con los péptidos señal que pueden
emplearse, el péptido señal nativo puede reemplazarse por un
péptido señal heterólogo o secuencia conductora, en caso deseado. La
elección del péptido señal o conductor puede depender de factores
tales como el tipo de células hospedadoras en las cuales debe
producirse el polipéptido recombinante. Para ilustración, ejemplos
de péptidos señal heterólogos que son funcionales en células
hospedadoras de mamífero incluyen la secuencia señal para
interleuquina-7 (IL-7) descrita en
la Patente de los Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal para
el receptor de interleuquina-2 descrita en Cosman
et al., Nature, 312: 768, 1984; el péptido señal de
receptor de interleuquina-4 descrito en EP 367.566;
el péptido señal del receptor de interleuquina-1
tipo I descrito en la Patente U.S. 4.968.607; y el péptido señal del
receptor de interleuquina-1 tipo II descrito en EP
460.846.
La invención incluye también métodos de
aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de los
mismos.
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Los polipéptidos "aislados" o fragmentos de
los mismos abarcados por esta invención son polipéptidos o
fragmentos que no se encuentran en un ambiente idéntico a un
ambiente en el cual aquél o aquéllos pueden encontrarse en la
naturaleza. Los polipéptidos "purificados" o fragmentos de los
mismos abarcados por esta invención están esencialmente exentos de
asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como
producto de purificación de sistemas de expresión recombinantes
tales como los arriba descritos o como un producto purificado de una
fuente no recombinante tal como células y/o tejidos existentes
naturalmente.
En una realización preferida, la purificación de
polipéptidos o fragmentos recombinantes puede realizarse utilizando
fusiones de polipéptidos o fragmentos de la invención a otro
polipéptido para ayudar a la purificación de los pollipéptidos o
fragmentos de la invención. Tales parejas de fusión pueden incluir
los péptidos poli-His u otros péptidos de
identificación de antígeno arriba descritos, así como los restos Fc
descritos anteriormente.
Con respecto a cualquier tipo de célula
hospedadora, como es conocido por el profesional experto, los
procedimientos para purificación de un polipéptido o fragmento
recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de
células hospedadoras empleado y de si el polipéptido o fragmento
recombinante se secreta o no en el medio de cultivo.
En general, el polipéptido o fragmento
recombinante puede aislarse de las células hospedadoras si no es
secretado, o del medio o sobrenadante si es soluble y secretado,
seguido por uno o más pasos de concentración, precipitación con
sal, intercambio iónico, interacción hidrófoba, purificación por
afinidad o cromatografía de exclusión de tamaños. En cuanto a vías
específicas para realizar estos pasos, el medio de cultivo puede
concentrarse primeramente utilizando un filtro de concentración de
proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de
ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después del paso de
concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de
purificación tal como un medio de filtración con gel.
Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio
aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos
dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser
acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados
comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente,
puede emplearse un paso de intercambio de catión. Cambiadores de
catión adecuados incluyen diversas matrices insolubles que
comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Adicionalmente,
puede emplearse un paso de cromatoenfoque. Alternativamente, puede
emplearse un paso de cromatografía de interacción hidrófoba.
Matrices adecuadas pueden ser restos fenilo u octilo unidos a
resinas. Puede emplearse tambíén cromatografía de afinidad con una
matriz que fija selectivamente la proteína recombinante. Ejemplos
de tales resinas empleadas son columnas de lectina, columnas de
tinte, y columnas de formación de quelatos metálicos. Finalmente,
pueden emplearse uno o más pasos de cromatografía líquida de alta
resolución en fase inversa (RP-HPLC) que emplean
medios RP-HPLC hidrófobos (v.g., gel de sílice o
resina de polímero que tenga grupos metilo, octilo, octildecilo u
otros grupos alifáticos colgantes) para purificar ulteriormente los
polipéptidos. Algunos o la totalidad de los pasos de purificación
que anteceden, en diversas combinaciones, son bien conocidos y
pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada
y purificada.
Es también posible utilizar una columna de
afinidad que comprende una proteína de fijación de polipéptidos de
la invención, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra los
polipéptidos de la invención, para purificar por afinidad los
polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden retirarse de la
columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, v.g., en un
tampón de elución rico en sal y dializarse luego en un tampón más
pobre en sal para uso o por cambio de pH u otros componentes
dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o pueden retirarse
competitivamente utilizando el sustrato existente naturalmente del
resto de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la
invención.
En este aspecto de la invención, las proteínas
de fijación de polipéptidos, tales como los anticuerpos
anti-polipéptidos de la invención u otras proteínas
que pueden interaccionar con el polipéptido de la invención, pueden
unirse a un soporte en fase sólida tal como una matriz de
cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado para
identificación, separación, o purificación de células que expresan
los polipéptidos de la invención en su superficie. La adherencia de
las proteínas de fijación de polipéptidos de la invención a una
superficie de contacto en fase sólida puede conseguirse por
cualquier medio. Por ejemplo, pueden recubrirse microesferas
magnéticas con estas proteínas de fijación de polipéptidos y
mantenerse en el recipiente de incubación mediante un campo
magnético. Suspensiones de mezclas de células se ponen en contacto
con la fase sólida que contiene tales proteínas de fijación de
polipéptidos. Las células que contienen en su superficie los
polipéptidos de la invención se unen a la proteína de fijación de
polipéptidos fijada y las células no fijadas se eliminan luego por
lavado. Este método de unión por afinidad es útil para purificación,
cribado, o separación de la solución de tales células que expresan
los polipéptidos. Métodos de liberación de células seleccionadas
positivamente de la fase sólida se conocen en la técnica y abarcan,
por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son preferiblemente
no tóxicas y no lesivas para las células y preferiblemente están
dirigidas a escindir la pareja de fijación de la superficie
celular.
Alternativamente, mezclas de células que se
sospecha contienen células expresantes de los polipéptidos de la
invención pueden incubarse primeramente con una proteína biotinilada
de fijación de polipéptidos de la invención. Los periodos de
incubación tienen típicamente al menos una hora de duración para
asegurar una fijación suficiente a los polipéptidos de la
invención. La mixtura resultante se hace pasar luego a través de una
columna empaquetada con cuentas recubiertas de avidina, con lo cual
la afinidad alta de la biotina por la avidina proporciona la unión
de las células de fijación de polipéptidos a las cuentas. El uso de
cuentas recubiertas de avidina se conoce en la técnica (Berenson
et al., J. Cell. Biochem., 10D: 239, 1986). El
lavado del material no fijado y la liberación de las células
fijadas se realizan utilizando métodos convencionales.
\newpage
El grado deseado de pureza depende del uso
propuesto de la proteína. Se desea un grado de pureza relativamente
alto cuando el polipéptido debe administrarse in vivo, por
ejemplo. En este caso, los polipéptidos se purifican de tal manera
que no sea detectable banda alguna de proteína correspondiente a
otras proteínas en el análisis por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Las
personas expertas en el campo pertinente reconocerán que bandas
múltiples correspondientes al polipéptido pueden ser visualizadas
por SDS-PAGE, debido a glicosilación diferencial,
procesamiento diferencial posterior a la traducción, y métodos
análogos. Muy preferiblemente, el polipéptido de la invención se
purifica hasta homogeneidad sustancial, como se indica por una sola
banda de proteína en el análisis por SDS-PAGE. La
banda de proteína puede ser visualizada por tinción con plata,
tinción con azul Coomassie, o (si la proteína está radiomarcada) por
autorradiografía.
Los polipéptidos purificados de la invención
(que incluyen proteínas, polipéptidos, fragmentos, variantes,
oligómeros, y otras formas) pueden testarse en cuanto a la aptitud
para unirse a la pareja de fijación en cualquier ensayo adecuado,
tal como un ensayo de fijación convencional. Para ilustración, el
polipéptido puede marcarse con un reactivo detectable (v.g., un
radionucleido, un cromóforo, una enzima que cataliza una reacción
colorimétrica o fluorométrica, etcétera). El polipéptido marcado se
pone en contacto con las células que expresan la pareja de
fijación. Las células se lavan luego para eliminar el polipéptido
marcado no fijado, y la presencia del marcador fijado a las células
se determina por una técnica adecuada, seleccionada de acuerdo con
la naturaleza del marcador.
Un ejemplo de un procedimiento de ensayo de
fijación es como sigue. Se construye un vector de expresión
recombinante que contiene el cDNA de la pareja de fijación,
utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Células
CV-1-EBNA-1 en
cápsulas de 10 cm^{2} se transfectan con el vector de expresión
recombinante. Las células
CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478)
expresan constitutivamente el antígeno-1 nuclear de
EBV dirigido por el intensificador/promotor de CMV
inmediato-temprano.
CV-1-EBNA-1 se
derivó de la línea de células CV-1 de riñón del Mono
Verde Africano (ATCC CRL70), como ha sido descrito por McMahan
et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991)
Las células transfectadas se cultivan durante 24
horas, y las células contenidas en cada cápsula se dividen luego en
una placa de 24 pocillos. Después de cultivo durante 48 horas más,
las células transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4}
células/pocillo) se lavan con BN-NFDM, que es el
medio de fijación (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de seroalbúmina
bovina, 2 mg/ml de azida de sodio, HEPES 20 mM de pH 7,2) al cual se
han añadido 50 mg/ml de leche desnatada en polvo. Las células se
incuban luego durante 1 hora a 37ºC con concentraciones variables
de, por ejemplo, una proteína de fusión polipéptido/Fc soluble
producida como se ha expuesto anteriormente. Las células se lavan
luego y se incuban con una concentración de saturación constante de
una IgG anti-humana ^{125}I de ratón en medio de
fijación, con agitación moderada durante 1 hora a 37ºC. Después de
lavado concienzudo, las células se liberan por tripsinización.
La IgG anti-humana de ratón
arriba empleada está dirigida contra la región Fc de IgG humana y
puede obtenerse de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West
Grove, PA. El anticuerpo se marca con yodo radiactivo utilizando el
método estándar de la cloramina T. El anticuerpo se fijará a la
porción Fc de cualquier polipéptido/proteína Fc que se ha fijado a
las células. En todos los ensayos, la fijación inespecífica del
anticuerpo marcado con ^{125}I se ensaya en ausencia de la
proteína de fusión Fc/Fc, así como en presencia de la proteína de
fusión de Fc y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo IgG
anti-humano sin marcar de ratón.
El anticuerpo ^{125}I fijado a las células se
cuantifica en un contador Packard Autogamma. Los cálculos de
afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51: 660, 1949) se
generan en RS/1 (BBN Software, Boston, MA) ejecutado en un
ordenador Microvax.
Otro tipo de ensayo de fijación adecuado es un
ensayo de fijación competitivo. Para ilustración, la actividad
biológica de una variante puede determinarse por ensayo de la
capacidad de la variante para competir con la proteína nativa
respecto a unión a la pareja de fijación.
Los ensayos competitivos de fijación pueden
realizarse por metodología convencional. Reactivos que pueden
emplearse en ensayos competitivos de fijación incluyen polipéptidos
radiomarcados de la invención y células intactas que expresan la
pareja de fijación (endógena o recombinante). Por ejemplo, puede
utilizarse un fragmento de IL-1 zeta soluble
radiomarcado para competir con una variante de IL-1
zeta soluble respecto a la fijación a los receptores de
IL-1 zeta de la superficie celular. En lugar de
células intactas, podría sustituirse una proteína de fusión pareja
de fijación/Fc soluble unida a una fase sólida por la interacción de
proteína A o proteína G (en la fase sólida) con el resto Fc.
Columnas cromatográficas que contienen Proteína A y Proteína G
incluyen las disponibles de Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway,
NJ.
Otro tipo de ensayo competitivo de fijación
utiliza parejas de fijación solubles radiomarcadas, tales como una
proteína de fusión receptor soluble de IL-1 zeta/Fc
o ligando Xrec2/Fc, y células intactas que expresan la pareja de
fijación. Pueden obtenerse resultados cuantitativos por ensayos
competitivos de fijación en placa autorradiográfica, mientras que
los gráficos Scatchard (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:
660, 1949) pueden utilizarse para generar resultados
cuantitativos.
Además de ser utilizados para expresar
polipéptidos como se ha descrito arriba, los ácidos nucleicos de
IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Xrec2, que
incluyen DNA, RNA, mRNA y oligonucleótidos pueden utilizarse:
- -
- como sondas para identificar ácido nucleico que codifica proteínas de las familias de ligandos y receptores de IL-1;
- -
- para identificar los cromosomas humanos 2 y X;
- -
- para mapear genes en los cromosomas humanos 2 y X;
- -
- para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes, u otras afecciones asociadas con los cromosomas humanos 2 y X;
- -
- como oligonucleótidos monocatenarios sentido o antisentido, para inhibir la expresión de polipéptidos codificados por los genes IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Xrec2;
- -
- para ayudar a la detección de genes defectuosos en un individuo; y
- -
- para terapia génica.
Entre los usos de los ácidos nucleicos descritos
en esta memoria se encuentra el uso de fragmentos como sondas o
iniciadores. Tales fragmentos comprenden por regla general al menos
aproximadamente 17 nucleótidos contiguos y una secuencia de DNA. En
otras realizaciones, un fragmento de DNA al menos 30, o al menos 60,
nucleótidos contiguos de una secuencia de DNA.
Dado que en esta memoria se contemplan homólogos
de SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 y 7 de otras especies de mamíferos,
pueden utilizarse sondas basadas en las secuencias de DNA humano de
SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 y 7 para cribar genotecas de cDNA derivadas
de otras especies de mamíferos, utilizando técnicas de hibridación
convencionales de especies cruzadas.
Utilizando el conocimiento del código genético
en combinación con las secuencias de aminoácidos arriba
identificadas, pueden prepararse series de oligonucleótidos
degenerados. Tales oligonucleótidos son útiles como iniciadores,
v.g., en reacciones en cadena de polimerasa (PCR), por las cuales se
aíslan y amplifican fragmentos de DNA.
La totalidad o una porción de los ácidos
nucleicos de IL-1 zeta de SEQ ID NO: 1 o variantes
de corte y empalme de IL-1 zeta de SEQ ID NOs: 5, 6
y 7, con inclusión de oligonucleótidos, pueden ser utilizados por
los expertos en la técnica empleando métodos bien conocidos para
identificar el cromosoma humano 2, así como el locus específico del
mismo, que contiene el DNA de miembros de la familia de ligandos de
IL-1. Adicionalmente, la totalidad o una porción de
los ácidos nucleicos de Xrec2 de SEQ ID NO: 2, con inclusión de
oligonucleótidos, pueden utilizarse para identificar el cromosoma
humano X, así como el locus específico del mismo que contiene el
DNA de miembros de la familia de receptores de IL-1.
Técnicas útiles incluyen, pero sin carácter limitante, la
utilización de la secuencia o porciones, con inclusión de
oligonucleótidos, como sonda en diversos métodos bien conocidos
tales como el mapeado de híbridos por radiación (resolución alta),
hibridación in situ a extensiones de cromosomas (resolución
moderada), e hibridación por transferencia Southern a líneas de
células híbridas que contienen cromosomas humanos individuales
(resolución baja).
Por ejemplo, los cromosomas pueden mapearse por
hibridación con radiación. La PCR se realiza utilizando el panel de
93 híbridos de radiación de Whitehead Institute/MIT Center for
Genome Research Genebridge 4 (http://www-genome.
wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/rhmap/genebridge4.html).
Se utilizan iniciadores que están situados dentro de un exón
supuesto del gen de interés y que amplifican un producto de DNA
genómico humano, pero no amplifican DNA genómico de hámster. Los
resultados de las PCRs se convierten en un vector de datos que se
somete al sitio Whitehead/MIT Radiation Mapping en Internet
(http://www-seq.wi.mit.edu). Los datos se registran
y se proporciona la asignación y la ubicación cromosómica relativas
a los marcadores conocidos Sequence Tag Site (STS) en el mapa del
híbrido de radiación. El sitio de la web siguiente proporciona
información adicional acerca del mapeado de híbridos con radiación:
http://www-genorne.wi.mit.edu/ftp/distribution/hurnan_STS_releases/july97/
07-97.INTRO.html).
Como se indica más adelante, los ácidos
nucleicos de IL-1 zeta de SEQ ID NO: 1 y las
variantes de corte y empalme de IL-1 zeta de SEQ ID
NOs: 5, 6 y 7 han sido mapeados por hibridación con radiación y
secuenciación por perdigonada de alta potencia a la región
2q11-12 del cromosoma humano 2. El cromosoma humano
2 está asociado con enfermedades específicas que incluyen, pero sin
carácter limitante, glaucoma, displasia ectodérmica, diabetes
mellitus dependiente de insulina, síndrome de piel arrugada,
leucemia/linfoma de células T, y distrofia tibial muscular. Los
ácidos nucleicos de Xrec 2 de SEQ ID NO: 2 se han mapeado por
hibridación con radiación y secuenciación por perdigonada de alta
potencia a la región Xp22 del cromosoma humano X. El cromosoma
humano X está asociado con retinosquisis, lisencefalia, heteropia
laminar subcortical, retardo mental, síndrome de Cowchock, síndrome
de Bazex, hipertricosis, síndrome linfoproliferativo,
inmunodeficiencia, displasia mesomélica de Langer, y leucemia. Así
pues, los ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 7, y 2 o un
fragmento de los mismos pueden ser utilizados por un experto en la
técnica empleando métodos bien conocidos para analizar anormalidades
asociadas con el mapeado de genes a los cromosomas 2 y X. Esto hace
posible diferenciar las condiciones en las cuales este marcador se
reordena o se deleciona. Adicionalmente, pueden utilizarse moléculas
de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, y 7 o un fragmento de
las mismas como marcador posicional para mapear otros genes de
localización
desconocida.
desconocida.
El DNA puede utilizarse en el desarrollo de
tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o
indirectamente) por cantidades defectuosas, o insuficientes de los
genes correspondientes a los ácidos nucleicos de la invención. La
descripción en esta memoria de secuencias nativas de nucleótidos
permite la detección de genes defectuosos, y el reemplazamiento de
los mismos con genes normales. Los genes defectuosos pueden
detectarse en ensayos de diagnóstico in vitro, y por
comparación de una secuencia nativa de nucleótidos descrita en esta
memoria con la de un gen derivado de una persona sospechosa de
albergar un defecto en este gen.
Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos
incluyen oligonucleótidos sentido o antisentido que comprenden una
secuencia monocatenaria de ácido nucleico (RNA o DNA) capaz de
fijarse a secuencias diana de mRNA (sentido) o DNA (sentido). Los
nucleótidos antisentido o sentido pueden comprender un fragmento del
DNA (SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 y 7). Un fragmento de este tipo
comprende por regla general al menos aproximadamente 14 nucleótidos,
con preferencia desde aproximadamente 14 a aproximadamente 30
nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido
antisentido o sentido, basado en una secuencia de cDNA que codifica
una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein et al.,
Cancer Res., 48: 2659, 1988; y van der Krol et al.,
BioTechniques, 6: 958-1988.
La unión de oligonucleótidos antisentido o
sentido a secuencias de ácido nucleico diana da como resultado la
formación de dúplex que bloquean o inhiben la expresión de proteínas
por uno de varios medios, que incluyen degradación aumentada del
mRNA por RNAsaH, inhibición de corte y empalme, terminación
prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los
oligonucleótidos antisentido pueden utilizarse así para bloquear la
expresión de proteínas. Los oligonucleótidos antisentido o sentido
comprenden adicionalmente oligonucleótidos que tienen cadenas
principales azúcar-fosfodiéster modificadas (u otros
enlaces azúcar, tales como los descritos en WO91/06629) y en donde
tales enlaces azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas.
Tales oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes son estables
in vivo (es decir capaces de resistir la degradación
enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia de modo que
son capaces de fijarse a secuencias de nucleótidos diana.
Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o
antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están enlazados
covalentemente a restos orgánicos, tales como los descritos en WO
90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad del
oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico diana, tal como
poli-(L-lisina). Y aún más, agentes de
intercalación, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos pueden unirse a los oligonucleótidos sentido o
antisentido para modificar especificidades de fijación del
oligonucleótido antisentido o sentido respecto a la secuencia del
nucleótido diana.
Los oligonucleótidos antisentido o sentido
pueden introducirse en una célula que contenga la secuencia de
ácido nucleico diana por cualquier método de transferencia génica,
con inclusión, por ejemplo, de lipofección, transfección de DNA
mediada por CaPO_{4}, electroporación, o por utilización de
vectores de transferencia de genes tales como el virus
Epstein-Barr.
Los oligonucleótidos sentido o antisentido
pueden introducirse también en una célula que contenga la secuencia
del nucleótido diana por formación de un conjugado con una molécula
de fijación de ligandos, como se describe en WO 91/04753. Moléculas
adecuadas de fijación de ligando incluyen, pero sin carácter
limitante, receptores de la superficie celular, factores de
crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se fijan a
receptores de la superficie celular. Con preferencia, la
conjugación de la molécula de fijación de ligando no interfiere
sustancialmente con la capacidad de la molécula de fijación de
ligandos para fijarse a su molécula o receptor correspondiente, o
bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su
versión conjugada en la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido sentido o
antisentido puede introducirse en una célula que contenga la
secuencia de ácido nucleico diana por formación de un complejo
oligonucleótido-lípido, como se describe en WO
90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o
antisentido-lípido es disociado preferiblemente
dentro de la célula por una lipasa endógena.
\newpage
Los usos incluyen, pero sin carácter limitante,
los siguientes:
- -
- Purificación de proteínas y medición de la actividad de las mismas
- -
- Agentes de suministro (sic)
- -
- Reactivos terapéuticos y de investigación
- -
- Control para fragmentación de péptidos
- -
- Identificación de proteínas desconocidas
- -
- Preparación de anticuerpos
Cada uno de los polipéptidos encuentra uso como
un reactivo de concentración de proteínas. Los polipéptidos pueden
estar unidos a un material soporte sólido y utilizarse para
purificar las proteínas parejas de fijación por cromatografía de
afinidad. En realizaciones particulares, un polipéptido (en
cualquier forma descrita en esta memoria que sea capaz de fijarse a
la pareja de fijación) está unido a un soporte sólido por
procedimientos convencionales. Como ejemplo, están disponibles
columnas cromatográficas que contienen grupos funcionales que
reaccionarán con los grupos funcionales de las cadenas laterales de
aminoácidos de las proteínas (Pharmacia Biotech., Inc., Piscataway,
NJ). En una alternativa, un polipéptido/proteína Fc (como se ha
expuesto anteriormente) se fija a columnas cromatográficas que
contienen proteína A o proteína G por interacción con el resto
Fc.
El polipéptido encuentra aplicación también en
la purificación o identificación de células que expresan la pareja
de fijación en la superficie celular. Los polipéptidos se fijan a
una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o
un sustrato similar adecuado. Por ejemplo, pueden recubrirse
microesferas magnéticas con los polipéptidos y mantenerse en un
recipiente de incubación mediante un campo magnético. Suspensiones
de mezclas de células que contienen las células que expresan la
pareja de fijación se ponen en contacto con la fase sólida que
contiene los polipéptidos. Las células que expresan la pareja de
fijación en la superficie celular se unen a los polipéptidos
fijados, y las células no unidas se eliminan luego por lavado.
Alternativamente, los polipéptidos pueden
conjugarse a un resto detectable, incubándose luego con las células
a testar respecto a la expresión de la pareja de fijación. Después
de la incubación, el material marcado no fijado se retira y se
determina la presencia o ausencia del resto detectable en las
células.
En otra alternativa, mezclas de células que se
sospecha contienen células que expresan la pareja de fijación se
incuban con polipéptidos biotinilados. Los periodos de incubación
son típicamente al menos de 1 hora de duración para asegurar una
fijación suficiente. La mezcla resultante se hace pasar luego a
través de una columna rellena con cuentas recubiertas de avidina,
con lo que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona
la unión de las células deseadas a las cuentas. Se conocen
procedimientos para utilización de cuentas recubiertas de avidina
(Berenson et al., J. Cell. Biochem., 10D: 239, 1986).
El lavado para eliminar el material no fijado, y la liberación de
las células fijadas, se realizan utilizando métodos
convencionales.
Los polipéptidos encuentran uso también en la
medición de la actividad biológica de la proteína pareja de
fijación en términos de su afinidad de fijación. Los polipéptidos
pueden ser empleados por tanto por quienes realizan estudios de
"aseguramiento de la calidad", v.g. para monitorizar la vida
útil y la estabilidad de las proteínas en condiciones diferentes.
Por ejemplo, los polipéptidos pueden emplearse en un estudio de
afinidad de fijación para medir la actividad biológica de una
proteína pareja de fijación que se ha mantenido a temperaturas
diferentes, o se ha producido en tipos de células diferentes. Las
proteínas pueden utilizarse también para determinar si se retiene
la actividad biológica después de la modificación de una proteína
pareja de fijación (v.g., modificación química, truncación,
mutación, etc.). La afinidad de fijación de la proteína pareja de
fijación modificada se compara con la de una proteína pareja de
fijación sin modificar para detectar cualquier impacto adverso de
las modificaciones en la actividad biológica de la pareja de
fijación. La actividad biológica de una proteína pareja de fijación
puede comprobarse así antes de utilizar la misma en un estudio de
investigación, por ejemplo.
Los polipéptidos encuentran uso también como
vehículos para suministro de agentes fijados a los mismos a células
que contienen la pareja de fijación. Los polipéptidos pueden
utilizarse por tanto para suministrar agentes diagnósticos o
terapéuticos a tales células (o a otros tipos de células que se ha
encontrado expresan la pareja de fijación en la superficie celular)
en procedimientos in vitro o in vivo.
Agentes detectables (diagnósticos) y
terapéuticos que pueden fijarse a un polipéptido incluyen, pero sin
carácter limitante, toxinas, otros agentes citotóxicos, fármacos,
radionucleidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción
colorimétrica o fluorométrica, y análogos, seleccionándose el agente
particular de acuerdo con la aplicación propuesta. Entre las
toxinas se encuentran ricina, abrina, toxina de la difteria,
exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas de
desactivación de ribosomas, micotoxinas tales como tricotecenos, y
derivados y fragmentos (v.g., cadenas simples) de las mismas.
Radionucleidos adecuados para uso diagnóstico incluyen, pero sin
carácter limitante, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}TC, ^{111}In y
^{76}Br. Ejemplos de radionucleidos adecuados para uso
terapéutico son ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re,
^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu, y
^{67}Cu.
Dichos agentes pueden fijarse al polipéptido por
cualquier procedimiento convencional adecuado. El polipéptido
comprende grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos que
pueden hacerse reaccionar con grupos funcionales en un agente
deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo.
Alternativamente, la proteína o agente puede derivatizarse para
generar o fijar un grupo funcional reactivo deseado. La
derivatización puede implicar la fijación de uno de los reactivos
de acoplamiento bifuncionales disponibles para fijación de diversas
moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois).
Se conocen varias técnicas para radiomarcación de proteínas. Por
ejemplo, pueden fijarse radionucleidos metálicos a polipéptidos
utilizando un agente adecuado de formación de quelatos
bifuncionales.
De este modo se preparan conjugados que
comprenden polipéptidos y un agente diagnóstico o terapéutico
adecuado (de modo preferible unido covalentemente),. Los conjugados
se administran o se emplean de cualquier otro modo en una cantidad
apropiada para la aplicación particular.
Los polipéptidos de la invención pueden
utilizarse en el desarrollo de tratamientos para cualquier trastorno
mediado (directa o indirectamente) por cantidades defectuosas, o
insuficientes de los polipéptidos. Estos polipéptidos pueden
administrarse un mamífero afligido con un trastorno de este
tipo.
Los polipéptidos pueden emplearse también en la
inhibición de una actividad biológica de la pareja de fijación, en
procedimientos in vitro o in vivo. Por ejemplo, un
polipéptido receptor de Xrec2 purificado puede utilizarse para
inhibir la fijación del ligando de Xrec2 a un receptor endógeno de
Xrec2 de la superficie celular, o puede utilizarse un polipéptido
IL-1 zeta purificado, o cualquiera de sus variantes
de corte y empalme para inhibir la fijación de IL-1
zeta endógena o variantes de corte y empalme a su receptor de la
superficie celular. De este modo se inhiben los efectos biológicos
que resultan de la fijación del ligando de Xrec2 a los receptores
endógenos de Xrec2.
Los polipéptidos de la invención pueden
administrarse a un mamífero para tratar un trastorno mediado por la
pareja de fijación. Tales trastornos mediados por la pareja de
fijación incluyen afecciones causadas (directa o indirectamente) o
exacerbadas por la pareja de fijación.
Las composiciones de la presente invención
pueden contener un polipéptido en cualquier forma descrita en esta
memoria, tal como proteínas nativas, variantes, derivados,
oligómeros, y fragmentos biológicamente activos. En realizaciones
particulares, la composición comprende un polipéptido soluble o un
oligómero que comprende polipéptidos solubles de la invención.
Regiones particulares de interés en el
polipéptido IL-1 zeta pueden derivarse del modelo
molecular proporcionado en la Figura 2, que representa la
estructura secundaria de la molécula. El modelo está basado en las
estructuras cristalinas de IL-1\beta e
IL-1ra. En la figura, las cadenas \beta se
muestran en color amarillo, indicándose su dirección por la punta
de flecha. Las vueltas \beta se muestran en color azul, y las
espirales se muestran en color verde. El modelo demuestra que es
posible superponer la estructura de IL-1 zeta sobre
la estructura de IL-1\beta e
IL-1ra sin deformar la molécula. El alto grado de
confianza en este modelo molecular permite utilizar el mismo en el
diseño racional de fármacos para generar moléculas terapéuticas
derivadas de IL-1 zeta.
En esta memoria se proporcionan composiciones
que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido de la presente
invención, en combinación con otros componentes tales como un
diluyente, vehículo, o excipiente fisiológicamente aceptable. Los
polipéptidos pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos
utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles.
Los mismos pueden combinarse en mezcla, sea como el material activo
único o con otros materiales activos conocidos adecuados para una
indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (v.g.,
solución salina, Tris-HCl, acetato, y soluciones
tamponadas con fosfato), conservantes (v.g., timerosal, alcohol
bencílico, parabenes), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o
vehículos. Formulaciones adecuadas para composiciones
farmacéuticas incluyen las descritas en Remington's
Pharmaceutical Sciences, edición 16ª, Mack Publishing Company,
Easton, PA, 1980.
Adicionalmente, tales composiciones pueden
complejarse con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o
incorporarse en compuestos polímeros tales como poli(ácido
acético), poli(ácido glicólico); hidrogeles, dextrano, etc., o
incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas
unilaminares o multilaminares, sombras de eritrocitos o
esferoblastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico,
la solubilidad, la estabilidad, la tasa de liberación in
vivo, y la tasa de aclaramiento in vivo, y se eligen por
tanto de acuerdo con la aplicación propuesta.
\global\parskip0.880000\baselineskip
Las composiciones de la invención pueden
administrarse de cualquier manera adecuada, v.g., por vías tópica,
parenteral, o por inhalación. El término "parenteral" incluye
inyección, v.g., por las rutas subcutánea, intravenosa, o
intramuscular, incluyendo también la administración localizada,
v.g., en un sitio de enfermedad o lesión. Se contempla también la
liberación sostenida por medio de implantes. Un experto en la
técnica pertinente reconocerá que las dosis adecuadas variarán,
dependiendo de factores tales como la naturaleza del trastorno a
tratar, el peso corporal del paciente, la edad, y el estado
general, así como la ruta de administración.
Las dosis preliminares pueden determinarse de
acuerdo con tests en animales, y la escalación de las dosis para
administración humana se realiza de acuerdo con prácticas aceptadas
en la técnica.
Se contemplan también composiciones que
comprenden ácidos nucleicos en formulaciones fisiológicamente
aceptables. El DNA puede formularse para inyección, por
ejemplo.
Otro uso de los polipéptidos descritos en esta
memoria es como herramienta de investigación para el estudio de los
efectos biológicos que son resultado de las interacciones de
IL-1 zeta, o cualquiera de sus variantes de corte y
empalme, con su pareja de fijación, y de Xrec2 con su pareja de
fijación, o de la inhibición de estas interacciones, en tipos de
células diferentes. Los polipéptidos pueden emplearse también en
ensayos in vitro para detección de IL-1
zeta, Xrec2, las parejas de fijación respectivas o las interacciones
de las mismas.
Los polipéptidos descritos en esta memoria
pueden utilizarse para estudiar la transducción de señales
celulares. Los ligandos y receptores de la familia
IL-1 juegan un papel fundamental en la protección
contra la infección y las respuestas inmunitarias de inflamación
que incluyen transducción de señales celulares, activación de
células endoteliales vasculares y linfocitos, inducción de
citoquinas inflamatorias, proteínas de fase aguda, hematopoyesis,
fiebre, resorción ósea, prostaglandinas, metaloproteinasas, y
moléculas de adhesión. Con el aumento continuado en el número de
miembros de la familia de IL-1 conocidos, un esquema
de clasificación adecuado es uno basado en la comparación de la
estructura y la función de los polipéptidos (activación y
propiedades reguladoras). Así pues, IL-1 zeta,
TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3, al igual que otros ligandos de la familia
IL-1 (IL-1\alpha,
IL-1\beta, e IL-18) y Xrec2, al
igual que otros receptores de la familia IL-1R
(IL-1R1, IL-1RII,
IL-1rp1, y AcPL), podrían estar implicados
probablemente en muchas de las funciones arriba indicadas así como
promover respuestas inflamatorias y estar implicados quizás por
consiguiente en la etiología y el mantenimiento de las enfermedades
inflamatorias y/o autoinmunes tales como artritis reumatoide,
enfermedad inflamatoria del intestino, y psoriasis. Como tales, las
alteraciones en la expresión y/o activación de los polipéptidos
descritos en esta memoria pueden tener efectos profundos sobre una
plétora de procesos multicelulares que incluyen, pero sin carácter
limitante, activación o inhibición de respuestas específicas de las
células y proliferación celular. La expresión de IL- zeta 1
clonada, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3, Xrec2, o de mutantes funcionalmente
inactivos de la misma puede utilizarse para identificar el papel
que juega una proteína particular en la mediación de sucesos de
señalización específicos.
La señalización celular implica a menudo una
cascada de activación molecular, durante la cual un receptor
propaga una señal mediada ligando-receptor por
activación específica de quinasas intracelulares que fosforilan
sustratos diana. Estos sustratos pueden ser a su vez quinasas que
llegan a activarse después de la fosforilación. Alternativamente,
aquéllos pueden ser moléculas adaptadoras que facilitan la
señalización aguas abajo por interacción
proteína-proteína subsiguiente a la fosforilación.
Cualquiera que sea la naturaleza de la o las moléculas sustrato,
versiones funcionalmente activas expresadas de Xrec2, variantes de
corte y empalme de IL-1 zeta, IL-2
zeta, y sus parejas de fijación pueden utilizarse para identificar
qué sustrato o sustratos han sido reconocidos y activados por los
polipéptidos de la invención. Como tales, estos nuevos polipéptidos
pueden ser utilizados como reactivos para identificar nuevas
moléculas implicadas en caminos de transducción de señales.
Una huella dactilar de péptido o polipéptido
puede introducirse en o compararse con una base de datos de
proteínas conocidas para ayudar a la identificación de la proteína
desconocida utilizando espectrometría de masas (W.J. Henzel et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5011, 5015, 1993;
Fenyo et al., Electrophoresis, 19:
998-1005, 1998). Una diversidad de programas de
software de ordenador para facilitar estas comparaciones están
accesibles en Internet, tales como Protein Prospector (sitio de
Internet: prospector.uscf.edu), Multildent (sitio de Internet:
www.expasy.ch/sprot/
multiident.html), PeptideSearch (sitio de Internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearch
Form.html), y ProFound (sitio de Internet: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html). Estos programas permiten al usuario especificar el agente de escisión y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados dentro de una tolerancia determinada. Los programas comparan los pesos moleculares observados con pesos moleculares de péptidos predichos derivados de bases de datos de secuencias para ayudar a la determinación de la identidad de la proteína desconocida.
multiident.html), PeptideSearch (sitio de Internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearch
Form.html), y ProFound (sitio de Internet: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html). Estos programas permiten al usuario especificar el agente de escisión y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados dentro de una tolerancia determinada. Los programas comparan los pesos moleculares observados con pesos moleculares de péptidos predichos derivados de bases de datos de secuencias para ayudar a la determinación de la identidad de la proteína desconocida.
Adicionalmente, un producto digerido de
polipéptido o péptido puede secuenciarse utilizando espectrometría
de masas en tándem (MS/MS) y la secuencia resultante puede
investigarse contra bases de datos (Eng et al., J. Am. Soc.
Mass Spec., 5:976-989, 1994; M. Mann et al.,
Anal. Chem., 66:4390-4399, 1994; y J.A. Taylor et
al., Rapid Comm. Mass Spec., 11:1067-1075,
1997). Programas de búsqueda que pueden utilizarse en este proceso
existen en Internet, tales como Lutefisk 97 (sitio de Internet:
www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html), y los programas Protein
Prospector, Peptide Search y ProFound descritos anteriormente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Por consiguiente, la adición de la secuencia de
un gen y su secuencia proteínica predicha y fragmentos peptídicos a
una base de datos de secuencias puede contribuir a la identificación
de proteínas desconocidas utilizando espectrometría de masas.
Se proporcionan en esta memoria anticuerpos que
son inmunorreactivos con los polipéptidos de la invención. Tales
anticuerpos se fijan específicamente a los polipéptidos por la vía
de los sitios de fijación de antígeno del anticuerpo (en oposición
a la fijación inespecífica). Así pues, los polipéptidos, fragmentos,
variantes, proteínas de fusión, etc., como se ha indicado arriba
pueden emplearse como "inmunógenos" en la producción de
anticuerpos inmunorreactivos con ellos. Más específicamente, los
polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc.,
contienen determinantes o epítopes antigénicos que suscitan la
formación de anticuerpos.
Estos determinantes antigénicos o epítopes
pueden ser lineales o de conformación (discontinuos). Los epítopes
lineales están compuestos de una sección simple de aminoácidos del
polipéptido, mientras que los epítopes de conformación o
discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de
diferentes regiones de la cadena del polipéptido que se sitúan en
proximidad estrecha después del plegado de la proteína (C.A.
Janeway, Jr. y P. Travers, ImmunoBiology, 3: 9, Garland
Publishing Inc., 2ª edición, 1996). Dado que las proteínas plegadas
tienen superficies complejas, el número de epítopes disponible es
muy numeroso; sin embargo, debido a la conformación de la proteína
y a impedimentos estéricos, el número de anticuerpos que se fijan
actualmente a los epítopes es menor que el número de epítopes
disponibles (C.A., Janeway, Jr. y P. Travers, ImmunoBiology,
2: 14, Garland Publishing Inc., 2ª edición, 1996). Los epítopes
pueden identificarse por cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica.
Los epítopes antigénicos de los polipéptidos de
la invención son útiles para generación de anticuerpos, en
particular anticuerpos monoclonales, como se describe con mayor
detalle más adelante. Adicionalmente, los epítopes de los
polipéptidos de la invención pueden utilizarse como reactivos de
investigación, en ensayos, y para purificación de anticuerpos
específicos de fijación de sustancias tales como sueros policlonales
o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tales epítopes o
variantes de los mismos pueden producirse utilizando métodos bien
conocidos en la técnica tales como síntesis en fase sólida, escisión
química o enzimática de un polipéptido, o utilización de tecnología
de DNA recombinante. En cuanto a los anticuerpos que pueden ser
provocados por los epítopes de los polipéptidos de la invención,
tanto si los epítopes han sido aislados como si forman parte de los
polipéptidos, pueden prepararse anticuerpos tanto policlonales como
monoclonales por técnicas convencionales. Véase, por ejemplo,
Kennet et al. (eds.), Monoclonal Antibodies, Hvbridomas:
A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Nueva
York, 1980; y Harlow y Land (eds.), Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1988.
Se contemplan también en esta memoria líneas de
células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales
específicos para los polipéptidos de la invención. Tales hibridomas
pueden producirse e identificarse por técnicas convencionales. Un
método para la producción de una línea de células de hibridoma de
este tipo comprende inmunizar un animal con un polipéptido;
cosechar células del bazo del animal inmunizado; fusionar dichas
células de bazo con una línea de células de mieloma, generando con
ello células de hibridoma; e identificar una línea de células de
hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se fija al
polipéptido. Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse por
técnicas convencionales.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención incluyen anticuerpos quiméricos, v.g., versiones
humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos
humanizados pueden prepararse por técnicas conocidas y ofrecen la
ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se
administran a humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal
humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o
precisamente el sitio de fijación de antígeno del mismo) y una
región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente,
un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de
fijación de antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un
fragmento de región variable (que carece del sitio de fijación de
antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Procedimientos para la
producción de anticuerpos quiméricos y otros anticuerpos
monoclonales modificados por ingeniería genética incluyen los
descritos en Riechmann et al., Nature, 322: 323, 1988;
Liu et al., PNAS, 84: 3439, 1987; Larrick et
al., Bio/Technology, 7: 934, 1989; y Winter et
al., TIPS, 14: 139, 1993. Procedimientos para generar
anticuerpos transgénicamente pueden encontrarse en GB 2.272.440, en
las Patentes US núms. 5.569.825 y 5.545.806, y patentes afines que
reivindican prioridad respecto a las mismas.
Están abarcados también por la presente
invención fragmentos de fijación de antígeno de los anticuerpos, que
pueden producirse por técnicas convencionales. Ejemplos de tales
fragmentos incluyen, pero sin carácter limitante, fragmentos Fab y
F(ab')_{2}. Se proporcionan también fragmentos de
anticuerpos y derivados producidos por técnicas de ingeniería
genética.
En una realización, los anticuerpos son
específicos para los polipéptidos de la presente invención y no
reaccionan de manera cruzada con otras proteínas. Procedimientos de
cribado por los cuales pueden identificarse tales anticuerpos son
bien conocidos, y pueden implicar cromatografía de inmunoafinidad,
por ejemplo.
Los anticuerpos de la invención pueden
utilizarse en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos
o fragmentos de la invención, sea in vitro o in vivo.
Los anticuerpos pueden emplearse también en la purificación de
polipéptidos o fragmentos de la invención por cromatografía de
inmunoafinidad.
Aquellos anticuerpos que pueden bloquear
adicionalmente la fijación de los polipéptidos de la invención a la
pareja de fijación pueden utilizarse para inhibir una actividad
biológica que sea resultado de dicha fijación. Tales anticuerpos
bloqueantes pueden identificarse utilizando cualquier procedimiento
de ensayo adecuado. Alternativamente, los anticuerpos bloqueantes
pueden identificarse en ensayos respecto a la capacidad de inhibir
un efecto biológico que es resultado de la fijación de los
polipéptidos de la invención a sus parejas de fijación a las
células diana. Los anticuerpos pueden ensayarse respecto a la
aptitud para inhibir la lisis celular mediada por
IL-1 zeta, mediada por Xrec2, o mediada por la
pareja de fijación, por ejemplo.
Un anticuerpo de este tipo puede emplearse en un
procedimiento in vitro, o administrarse in vivo para
inhibir una actividad biológica mediada por la entidad que generó el
anticuerpo. De este modo pueden tratarse trastornos causados o
exacerbados (directa o indirectamente) por la interacción de los
polipéptidos de la invención con la pareja de fijación. Un método
terapéutico implica la administración in vivo de un
anticuerpo bloqueante a un mamífero en una cantidad eficaz para
inhibir una actividad biológica mediada por una pareja de fijación.
Generalmente se prefieren anticuerpos monoclonales para uso en tales
métodos terapéuticos. En una realización, se emplea un fragmento de
anticuerpo de fijación de antígeno.
Los anticuerpos pueden cribarse respecto a
propiedades agonistas (es decir, mimetizadoras de ligandos). Tales
anticuerpos, después de la fijación a un receptor de la superficie
celular, inducen efectos biológicos (v.g., transducción de señales
biológicas) similares a los efectos biológicos inducidos cuando se
fija IL-1 a receptores de IL-1 en
la superficie celular. Los anticuerpos agonistas pueden utilizarse
para activar células endoteliales vasculares y linfocitos, inducir
destrucción de tejido local y fiebre (Janeway et al., 1996),
estimular los macrófagos y células endoteliales vasculares para
producir IL-6, y regular en sentido creciente
moléculas que se encuentran en la superficie de las células
endoteliales vasculares.
Se proporcionan en esta memoria composiciones
que comprenden un anticuerpo que está dirigido contra los
polipéptidos de la invención, y un diluyente, excipiente, o
vehículo fisiológicamente aceptable. Componentes adecuados de
dichas composiciones son como se ha descrito arriba para
composiciones que contienen los polipéptidos de la invención.
Se proporcionan también en esta memoria
conjugados que comprenden un agente detectable (v.g., diagnóstico)
o terapéutico, unido al anticuerpo. Ejemplos de tales agentes se han
presentado arriba. Los conjugados encuentran aplicación en
procedimientos tanto in vivo como in vitro.
Los ejemplos que siguen se proporcionan para
ilustrar adicionalmente realizaciones particulares de la invención,
y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente
invención. Debe indicarse que IL-1 zeta, TDZ.1,
TDZ.2 y TDZ.3 no caen dentro del alcance de la presente
invención.
La secuencia del ácido nucleico de
IL-1 zeta humana se obtuvo por secuenciación del
clon EST IMAGE, 1.628.761, acceso #AI014548) que codifica un marco
de lectura parcial abierto (ORF). Se cribaron varias genotecas de
cDNA con iniciadores internos para determinar el patrón de expresión
del polipéptido. Después de realizar la PCR utilizando dos
iniciadores internos de la secuencia de IL-1 zeta
humana, las genotecas de cDNA siguientes resultaron positivas
respecto a las secuencias de IL-1 zeta: estromal de
médula ósea, tumor pancreático humano, y Raji (línea de células D).
Los clones de IL-1 zeta se aislaron de las
secuencias DNA genómico humano, genotecas estromales de la médula
ósea y de tumor de páncreas humano, y se secuenciaron.
Se obtuvieron secuencias de Xrec2 humana por
secuenciación de alta potencia, PCR, y reacciones 5' RACE. La
secuenciación por perdigonada de alta potencia de la región
cromosómica Xp11 produjo secuencias para los exones
4-6 de Xrec2 (números de acceso a GenBank AL031466 y
AL031575). Análogamente, la secuencia de la región cromosómica
Xp2-164-166 (número de acceso a
GenBank AC005748) proporcionó secuencias para los exones
10-12 de Xrec2.
Se llevó a cabo una PCR (40 ciclos) sobre cDNA
monocatenario de cerebro humano utilizando iniciadores (10
picomoles/reacción) con los exones 5 y 11 y polimerasa Hotstar Taq)
(Qiagen, Valencia, CA), generando una secuencia para los exones
7-9. Las reacciones 5' RACE se llevaron a cabo luego
utilizando cDNA de testículos e iniciadores anidados dentro del
exón 4 para obtener las secuencias del exón 3 que contenían la
metionina iniciadora predicha. Tanto la PCR como las reacciones
RACE 5' se efectuaron utilizando protocolos estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubren diluciones seriadas de muestras que
contienen IL-1 zeta o Xrec2 (en NaHCO_{3} 50 mM,
llevado a pH 9 con NaOH), en placas de microtitulación
Linbro/Titertek de 96 pocillos con fondo plano E.I.A. (ICN
Biomedicals Inc., Aurora, OH) a 100:1/pocillo. Después de incubación
a 4ºC durante 16 horas, se lavan los pocillos 6 veces con PBS 200:1
que contiene 0,05% de Tween-20
(PBS-Tween). Los pocillos se incuban luego con la
pareja de fijación FLAG® a razón de 1 mg/ml en
PBS-Tween con 5% de suero de ternero fetal (FCS)
durante 90 minutos (100:1 por pocillo), seguido por lavado como
anteriormente. A continuación, se incuba cada pocillo con el
anti-FLAG® (anticuerpo monoclonal M2 a 1 mg/ml en
PBS-Tween que contiene 5% de FCS durante 90 minutos
(100:1 por pocillo), seguido por lavado como anteriormente. A
continuación, se incuban los pocillos con un anticuerpo policlonal
de cabra específico anti-IgG 1 conjugado a
peroxidasa de rábano picante) (una dilución 1:5000 del stock
comercial en PBS-Tween que contiene 5% de FCS)
durante 90 minutos (100:1 por pocillo). El anticuerpo conjugado a
HRP se obtiene de Southern Biotechnology Associates, Inc.,
Birmingham, Alabama. Los pocillos se lavan luego seis veces,
como
anteriormente.
anteriormente.
Para el desarrollo del ensayo ELISA, se añade a
los pocillos una mezcla de sustrato [100:1 por pocillo de una
premezcla 1:1 del Sustrato de Peroxidasa TNB y solución B de
peroxidasa (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg,
Maryland)]. Después de una reacción de color suficiente, la reacción
enzimática se termina por adición de H_{2}SO_{4} 2N (50:1 por
pocillo). La intensidad de color (que indica la fijación
ligando-receptor) se determina por medición de la
extinción a 450 nm en un lector de placas V Max (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de aminoácidos de
IL-1 zeta y Xrec2 se determinaron por traducción de
las secuencias nucleotídicas completas de SEQ ID NOs: 1 y 2,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácido nucleico de
IL-1 zeta y Xrec2 se determinaron por secuenciación
estándar bicatenaria de la secuencia compuesta de los clones EST
IMAGE (acceso #AI014548 (IL-1 zeta) y #AL031575 y
#AC005748 (Xrec-2)) y de secuencias adicionales
obtenidas de PCR y reacciones 5' RACE.
La secuencia de nucleótidos del DNA aislado de
IL-1 zeta y Xrec2 y la secuencia de aminoácidos
codificada por ella se presentan en SEQ ID NOs:
1-4. La secuencia del fragmento de DNA de
IL-1 zeta aislado por PCR corresponde a los
nucleótidos 1 a 579 de SEQ ID NO: 1, que codifican los aminoácidos 1
a 192 de SEQ ID NO: 3; y la secuencia del fragmento de DNA de Xrec2
aislado también por PCR corresponde a los nucleótidos 1 a 2088 de
SEQ ID NO: 2, que codifican los aminoácidos 1 a 698 de SEQ ID NO:
4.
Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y
4 contienen una homología importante con otros miembros conocidos
de la familia de ligandos y receptores de IL-1,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra un método para preparación
de anticuerpos monoclonales que fijan el polipéptido
IL-1 zeta. El mismo protocolo puede utilizarse para
producir anticuerpos monoclonales que fijan el polipéptido Xrec2.
Inmunógenos adecuados que pueden emplearse en la generación de tales
anticuerpos incluyen, pero sin carácter limitante, el polipéptido
purificado de IL-1 zeta o un fragmento inmunógeno
del mismo tal como el dominio extracelular, o proteínas de fusión
que contienen IL-1 zeta (v.g., una proteína de
fusión soluble IL-1 zeta/Fc).
El polipéptido IL-1 zeta
purificado puede utilizarse para generar anticuerpos monoclonales
inmunorreactivos con él, utilizando técnicas convencionales tales
como las descritas en la Patente U.S. 4.411.493. Resumidamente, se
inmunizan ratones con inmunógeno de IL-1 zeta
emulsionado en adyuvante de Freund completo, y se inyectan en
cantidades comprendidas entre 10 y 100 \mug por vía subcutánea o
intraperitoneal. Diez a veinte días más tarde, los animales
inmunizados se refuerzan con IL-1 zeta adicional
emulsionado en adyuvante de Freund incompleto. Los ratones se
refuerzan periódicamente después de ello de acuerdo con un protocolo
de inmunización semanal a bisemanal. Se toman periódicamente
muestras de suero por sangrado retro-orbital o
excisión en la punta de la cola para testar respecto a los
anticuerpos de IL-1 zeta por ensayo de transferencia
de puntos, ELISA (Ensayo de Inmunosorbente Unido a Enzima) o por
inhibición de la fijación del receptor de IL-1 zeta.
Después de la detección de un título de anticuerpos apropiado, se
proporciona a los animales positivos una última inyección
intravenosa de IL-1 zeta en solución salina. Tres a
cuatro días más tarde, se sacrifican los animales, se recogen
células del bazo, y se fusionan las células del bazo con una línea
de células de mieloma murino (v.g., NS1 o preferiblemente
P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de
hibridoma, que se extienden en placas de microtitulación múltiples
en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina)
para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos
de mieloma, e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridoma se criban por ELISA
respecto a la reactividad frente a IL-1 zeta
purificada por adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall
et al., Immunochem., 8: 871: 1971 y en la Patente U.S.
4.703.004. Una técnica de cribado preferida es la técnica de
captura de anticuerpos descrita en Beckmann et al., J.
Immunol., 144: 4212, 1990. Las células de hibridoma positivas
pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones BALB/c singénicos
para producir ascitis que contiene concentraciones altas de
anticuerpos monoclonales anti-IL-1
zeta. Alternativamente, las células de hibridoma pueden dejarse
cultivar in vitro en matraces o botellas rodantes por
diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en la
ascitis de ratón pueden purificarse por precipitación con sulfato
de amonio, seguida por cromatografía de exclusión con gel.
Alternativamente, puede utilizarse también cromatografía de afinidad
basada en la fijación del anticuerpo a Proteína A o Proteína G, al
igual que cromatografía de afinidad basada en la fijación a
IL-1 zeta.
\vskip1.000000\baselineskip
La distribución tisular de mRNA de Xrec2 se
investigó por análisis mediante transferencia Northern, como sigue.
Se añadió una parte alícuota de una ribosonda de Xrec2 a dos
transferencias Northern de tejido humano diferentes (Clontech, Palo
Alto, CA; Biochain, Palo Alto, CA). Las manchas se hibridaron en 10X
solución de Denhardt, Tris 50 mM de pH 7,5, NaCl 900 mM, 0,1%
pirofosfato de Na, 1% SDS, y 200 \mug/ml de DNA de esperma de
salmón. La hibridación se llevó a cabo durante una noche a 63ºC en
formamida al 50% como se ha descrito previamente (March et
al., Nature 315: 641-647, 1985). Se
lavaron luego las manchas con 2X SSC, 0,1% SDS a 68ºC durante 30
minutos. Las células y los tejidos con los niveles máximos de mRNA
de Xrec2 se determinaron por comparación con los controles,
sondando con una sonda específica de
\beta-actina.
Se detectó Xrec2 en los tejidos humanos de
cerebro y corazón, y en menor proporción en el ovario. En estos
tejidos, se detectaron dos mRNAs de Xrec2, un transcrito de 7,5 kb y
un transcrito de 10,0 kb. Se detectó un transcrito de Xrec2 de 8,0
kb en el músculo esquelético. El análisis PCR de un panel de cDNA de
tejidos humanos detectó mRNA de Xrec2 en corazón, cerebro y ovario
y en menor proporción en amígdala, hígado fetal, próstata,
testículos, intestino delgado y colon, pero no en bazo, ganglio
linfático, timo, médula ósea, leucocitos, placenta, pulmón, hígado,
músculo esquelético, riñón o páncreas.
Siguiendo los procedimientos arriba descritos,
se sondó con Xrec2 una transferencia Northern de RNA aislado de
células tumorales. Se detectó un transcrito de 8,0 kb que se
hibridaba débilmente a la sonda en SW480, una línea de células de
adenocarcinoma colorrectal. No se detectaron transcritos de Xrec2 en
HL-60 (leucemia promielocítica), S3 (células HeLa),
K-562 (leucemia mielógena crónica),
MOLT-4 (leucemia linfoblástica), Raji (linfoma de
Burkitt), A5 49 (carcinoma de pulmón) o G391 (células de
melanoma).
\vskip1.000000\baselineskip
Puede expresarse y testarse IL-1
zeta de longitud total respecto a la capacidad para fijarse a los
receptores de IL-1 zeta. El ensayo de fijación
puede realizarse como sigue.
Se emplea en el ensayo una proteína de fusión
que comprende un péptido de cremallera de leucina fusionado al
término N de un polipéptido soluble de IL-1 zeta
(LZ-IL-1-zeta). Se
prepara una construcción de expresión, esencialmente como se
describe para la preparación de la construcción de expresión FLAG®
(IL-1-zeta) en Wiley et al.,
Immunity, 3: 673-682, 1995), excepto que el
DNA codificante del péptido FLAG® se reemplazó con una secuencia
que codificaba una cremallera de leucina modificada que permite la
trimerización. La construcción, en el vector de expresión pDC409,
codifica una secuencia conductora derivada del citomegalovirus
humano, seguida por el resto de cremallera de leucina fusionado al
término N de un polipéptido soluble de IL-1 zeta. El
LZ-IL-1 zeta se expresa en células
CHO, y se purifica a partir del sobrenadante de cultivo.
El vector de expresión designado pDC409 es un
vector de expresión de mamífero derivado del vector pDC406 descrito
en McMahan et al. EMBO J., 10:
2821-2832, 1991). Características añadidas a pDC409
(comparado por pDC406) incluyen sitios de restricción singulares
adicionales en el sitio de clonación múltiple (mcs); tres codones
de parada (uno en cada marco de lectura) situados aguas abajo del
mcs; y un promotor de polimerasa T7, aguas abajo del mcs, que
facilita la secuenciación del DNA insertado en el mcs.
Para la expresión de la proteína
IL-1 zeta humana de longitud total, se amplifica la
región codificante entera (es decir, la secuencia de DNA presentada
en SEQ ID NO: 1) por la reacción en cadena de polimerasa (PCR). El
molde empleado en la PCR es el clon de cDNA aislado de una genoteca
de cDNA (de tumor pancreático), como se describe en el Ejemplo 1.
El DNA aislado y amplificado se inserta en el vector de expresión
pDC409, para producir una construcción designada
pDC409-IL-1-zeta.
El polipéptido
LZ-IL-1 zeta se emplea para testar
la capacidad de fijación a las células hospedadoras que expresan
receptores de Il-1 zeta recombinantes o endógenos,
como se ha expuesto anteriormente. Las células que expresan el
receptor de IL-1 zeta se cultivan en DMEM
suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina,
estreptomicina, y glutamina. Las células se incuban con
LZ-IL-1 zeta (5 mg/ml) durante
aproximadamente 1 hora. Después de la incubación, se lavan las
células para eliminar el LZ-IL-1
zeta no fijado y se incuban con un anticuerpo monoclonal
biotinilado anti-LZ (5 mg/ml) y estreptavidina
conjugada con ficoeritrina (1:400), antes del análisis por escaneo
de las células activado por fluorescencia (FACS). El análisis
citométrico se realiza en un FACscan (Becton Dickinson, San Jose,
CA).
Las células que expresan receptores de
IL-1 zeta exhibirán una fijación significativamente
incrementada de IL-1 zeta, comparadas con las
células de control que no expresan los receptores de
IL-1 zeta.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de IL-1 zeta en
diversos tejidos humanos se examinó por RT PCR con iniciadores
específicos de IL-1 zeta o por cribado de genotecas
de cDNA con una sonda radiomarcada de DNA derivada del EST de
IL-1 zeta descrito en el Ejemplo 1. Los resultados
se muestran en la Tabla 2.
En la Tabla 2, "-" indica que en estos
experimentos no se detectaba mRNA de IL-1 zeta en el
tejido o línea de células particular analizado(a). Dadas las
limitaciones de los ensayos utilizados, se reconocerá que el
"+" implica solamente que IL-1 zeta no era
detectado en un tejido particular en un experimento particular y no
implica que IL-1 zeta no se exprese nunca en dicho
tejido. Adicionalmente, los patrones de expresión variables podrían
explicarse por los diferentes lotes del material de procedencia del
RNA que se utilizó para generar los paneles de tejidos de cDNA.
Los resultados positivos se obtuvieron como
sigue: "a", por análisis PCR de un panel de cDNAs de la primera
cadena (Clontech); "b", por cribado de genotecas de cDNA;
"c", por la existencia de un EST; y "d", por análisis PCR
de un RNA individual. "e" indica que la expresión del gen se
incrementaba por adición de LPS a las células. En la columna de
procedencia para los tejidos, "agrupación" era una mezcla de
células de pulmón fetal, testículos y células B. En la columna de
procedencia para las líneas de células humanas,
"macrófago-1" era THP-1,
"macrófago-2" era U937; "estroma BM" era
una línea de células estromáticas de médula ósea no publicada,
IMTLH, obtenida de Immunex; "hemat. temprana" era la línea
hematopoyética precursora HL60; y "tumor panc." era
HPT-4.
Como se muestra en la Tabla, se detectó mRNA de
IL-1 zeta en ganglios linfáticos, timo, estroma de
médula ósea, pulmón, testículos y placenta humanos. Adicionalmente,
se detectó mRNA de IL-1 zeta en las líneas de
células de macrófagos humanas THP-1 y U937, la línea
de células hematopoyéticas precursoras HL60, y la línea de células
de tumor pancreático HPT-4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La distribución tisular de IL-1
zeta se comparó también con la distribución tisular de
Tango-77 (WO 99/06426), una forma cortada y
empalmada alternativamente de IL-1 zeta, utilizando
RT PCR. Los iniciadores utilizados en la RT PCR eran iniciadores 5'
específicos para el primer exón de Tango-77 (exón
(1) en la Figura 1) o el primer exón de IL-1 zeta
(exón (3) en la Figura 1) en combinación con un iniciador 3' común
derivado del exón terminal común (exón (6) en la Figura 1). Las
reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando cDNA de la primera
cadena de fuentes de tejido humano múltiples adquiridas de Clontech,
Palo Alto, CA. Se detectaron productos PCR del tamaño predicho así
como varios productos PCR adicionales de tamaño diferente. Tres
productos PCR de tamaños diferentes que el tamaño predicho se
aislaron y se utilizaron para obtener información de secuencia de
cDNAs de tejidos múltiples. El aislamiento y la caracterización de
estos productos PCR revelaron tres nuevas variantes de corte y
empalme de IL-1 zeta. Las secuencias de ácido
nucleico de estas variantes de corte y empalme se representan por
SEQ ID NO: 5, 6, y 7, que codifican las secuencias de aminoácido
representadas por SEQ ID NOs: 8, 9, y 10, respectivamente. La
organización y relación de estas variantes de corte y empalme se
muestra en la Figura 1.
Los variantes de corte y empalme se designaron
TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3 (Testis -Derived Zeta Variants), debido a que
se expresan todas ellas en el testículo. El testículo es un tejido
de expresión común; sin embargo, no es el único tejido de
expresión. La Tabla III muestra los resultados de un estudio de
expresión tisular para IL-1 zeta,
Tango-77, TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3. TDZ.1 y TDZ.2
contienen los exones 4, 5, y 6, representados en la Figura 1, que
corresponden a los tres últimos exones de IL-1 zeta
y corresponden al dominio estructural conservado de la molécula.
Cuando se alinean con otros miembros de la familia
IL-1, se demuestra que los exones 4, 5, y 6
contienen muchos residuos conservados dentro de motivos
estructurales conservados.
Se observa un polimorfismo de
Tango-77 en el exón (2) de la Figura 1. En los cDNAs
aislados, existe una valina en lugar de una glicina en el tercer
residuo del exón (2). En la secuencia de Tango-77,
la secuencia de aminoácidos es PAGSPLEP (SEQ ID NO: 14). En el
polimorfismo, la secuencia de PAVSPLEP (SEQ ID NO: 15).
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó Xrec2 de longitud total en el vector de
expresión pDC304. El vector resultante y un plásmido informador de
luciferasa dirigido por NF\kappaB se utilizaron para transfectar
células COS7 por el método DEAE-Dextrano como ha
sido descrito previamente en Born et al., J. Biol.
Chem., 273:29445-29450, 1998. Cuando las células
transfectadas se estimularon durante 4 horas con
IL-1\alpha (10 ng/ml), IL-1\beta
(10 ng/ml) o hIL-18 (40 ng/ml), no se detectó
actividad alguna de luciferasa.
Varios miembros conocidos de la familia
IL-1R son receptores huérfanos para los cuales no se
ha identificado todavía ningún ligando cognado conocido. Ejemplos
de tales receptores huérfanos incluyen IL-1Rrp2,
T1/ST2 y SIGIRR. Varios de estos receptores huérfanos pueden, sin
embargo, mediar la activación de la transcripción en respuesta a
IL-1, cuando se expresan como moléculas quiméricas
con los dominios de IL-1R extracelulares y
transmembranales (IL-1Rextm) fusionados al dominio
citoplásmico del receptor huérfano. Por ejemplo, una quimera
IL-1Rextm que contiene el dominio citoplásmico de
T1/ST2 es capaz de mediar la activación de la transcripción en
respuesta a la estimulación por IL-1, como se reseña
en Mitcham et al., J. Biol. Chem.,
271:5777-5783, 1996.
Para testar la aptitud de Xrec2 para mediar la
activación de la transcripción en respuesta a IL-1,
se expresó el dominio citoplásmico de Xrec2 (Xrec2cyto)
(aminoácidos 382-696 de SEQ ID NO: 4) como una
molécula quimérica con IL-1Rextm. El
IL-1Rextm-Xrec2cyto quimérico se
sobreexpresaba en células COS7 junto con un plásmido informador de
luciferasa impulsado por NF\kappaB, como se ha descrito arriba.
Después de la estimulación por IL-1 de estas
células, no se detectaba actividad alguna de luciferasa. Como
control, se sobreexpresó IL-1R de longitud total en
células COS7, y se observó una inducción de actividad de
transcripción en respuesta a la estimulación por
IL-1 en estas células.
El experimento se repitió utilizando un receptor
quimérico IL-1Rextm-Xrec2cyto con
una cola citoplásmica truncada (aminoácidos 382-573
de SEQ ID NO: 4). De nuevo, el receptor quimérico no era sensible a
IL-1 en estos ensayos, lo que indicaba que, al
contrario de algunas otros miembros de la familia
IL-1R, el dominio citoplásmico de Xrec2 no media la
transducción de señales por NF\kappaB.
Otros miembros de la familia de receptores de
IL-1 funcionan como subunidades accesorias,
similares a la IL-1R AcP, que es un componente de
señalización requerido de IL-1R del tipo I. Para
determinar si Xrec2 funciona como una subunidad accesoria del
receptor de IL-1, se crearon una serie de receptores
quiméricos. El dominio citoplásmico de cada miembro prototípico
identificado de la familia IL-1R se fusionó a los
dominios extracelular y transmembranal tanto de
IL-1R como de AcP, dando como resultado un panel de
siete quimeras IL-1R y siete quimeras AcP. Las
quimeras IL-1R y AcP se
co-expresaron en todas las combinaciones posibles en
una línea de células de linfoma de las células T murinas (S49.1)
por electroporación, junto con un plásmido informador de luciferasa
impulsado por NF\kappaB. Dos días después de la electroporación,
las células se estimularon con IL-1\alpha (10
ng/ml) o IL-1\beta (10 ng/ml) durante 4 horas, y
se evaluó la actividad de luciferasa, como se ha descrito
previamente en Born et al., J. Biol. Chem.,
273:29445-29450, 1998. Normalmente, las células
S49.1 no son sensibles a IL-1.
Sin embargo, por sobreexpresión transitoria
tanto de IL-1R como de AcP, las células S49.1 se
vuelven sensibles a IL-1. Mientras que otras
moléculas semejantes a AcP cooperaban en este sistema con otras
moléculas semejantes a IL-1R para conferir
sensibilidad de IL-1 a las células S49.1, Xrec2 no
lo hacía así, como una quimera IL-1R o como una
quimera AcP.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Sims. John E.
\hskip1cmBorn. Teresa L.
\hskip1cmSmith. Dirk E.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> IL-1 ZETA, VARIANTES
DE CORTE Y EMPALME DE IL-1 ZETA Y DNAS Y
POLIPÉPTIDOS DE XREC2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 03260.0088-00304
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/112.163
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-12-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/146.675
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-11-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2,0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2091
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 696
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 657
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: péptido antigénico utilizado en proteínas de fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: polipéptido de cremallera de leucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: polipéptido de cremallera de leucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia polimórfica del exón 2 de Tango 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia polimórfica del exón 2 de Tango 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (10)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada
seleccionada del grupo constituido por:
(a) la secuencia de DNA de SEQ ID NO: 2;
(b) una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de
SEQ ID NO: 4; y
(c) una molécula de ácido nucleico aislada
degenerada de SEQ ID NO: 2 como resultado del código genético.
2. Un vector recombinante que dirige la
expresión de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación
1.
3. Un polipéptido aislado codificado por la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
4. Un polipéptido aislado de acuerdo con la
reivindicación 3 en forma no glicosilada.
5. Un anticuerpo aislado que se fija a un
polipéptido de la reivindicación 3.
6. Un anticuerpo aislado de acuerdo con la
reivindicación 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
7. Una célula hospedadora transfectada o
transducida con el vector de la reivindicación 2.
8. Un método para la producción de un
polipéptido Xrec2, que comprende cultivar una célula hospedadora de
la reivindicación 7 en condiciones que promueven la expresión, y
recuperar el polipéptido del medio de cultivo.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la
célula hospedadora se selecciona del grupo constituido por células
bacterianas, células de levadura, células de plantas, y células
animales.
10. Un oligómero que comprende un polipéptido de
la reivindicación 3.
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