ES2325190T3 - Mutantes recombinantes inactivos de la parte cenral de la estreptavidina. - Google Patents
Mutantes recombinantes inactivos de la parte cenral de la estreptavidina. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A MUTEINAS DE AVIDINA Y ESTREPTAVIDINA CON UNA MENOR AFINIDAD DE UNION A BIOTINA ASI COMO SU UTILIZACION COMO REACTIVOS PARA ELIMINACION DE INTERFERENCIAS EN PROCEDIMIENTOS DE DETERMINACION DE UN ANALITO, P. EJ. EN PRUEBAS DIAGNOSTICAS COMO INMUNOENSAYOS Y ENSAYOS DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS. ADEMAS LA INVENCION SE REFIERE A LA UTILIZACION DE MUTEINAS DE AVIDINA Y ESTREPTAVIDINA COMO SISTEMAS REGENERABLES PARA LA UNION DE BIOTINA, P.EJ. PARA EL ANALISIS DE MOLECULAS BIOTINADAS, LA INVESTIGACION DE INTERACCIONES RECEPTORLIGANDO Y LA PURIFICACION POR AFINIDAD DE MOLECULAS BIOTINADAS.
Description
Mutantes recombinantes inactivos de la parte
central de la estreptavidina.
La presente invención se refiere a las muteínas
de estreptavidina con una afinidad de unión disminuida para la
biotina, así como su empleo como reactivos para la eliminación de
perturbaciones en procedimientos para la determinación de un
analito, por ejemplo en ensayos diagnósticos como por ejemplo en
ensayos inmunológicos y en ensayos de hibridación de ácidos
nucleicos. Además se refiere la invención al empleo de las muteínas
de la estreptavidina como sistemas regenerables para la unión de la
biotina, por ejemplo para el análisis de moléculas biotiniladas,
para la investigación de las acciones recíprocas
receptor-ligando así como para las moléculas
biotiniladas para la purificación por afinidad.
En el procedimiento de detección para la
determinación de analitos como por ejemplo en ensayos inmunológicos
y ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, tiene lugar la
determinación del analito a menudo mediante una acción recíproca de
alta afinidad entre los socios de un par específico de unión. Un
ejemplo típico de un par específico de unión lo constituyen el
complejo avidina/estreptavidina-biotina. En el
empleo de un par de unión
avidina/estreptavidina-biotina se aprovecha su alta
afinidad de unión. A este respecto se emplea por ejemplo una fase
sólida recubierta con avidina/estreptavidina, a la cual se puede
unir un complejo biotinilado del analito y el receptor específico.
En otros formatos de ensayo puede emplearse también la
avidina/estreptavidina en forma soluble.
Junto a las acciones recíprocas específicas
tienen lugar a menudo también reacciones secundarias, como por
ejemplo las reacciones recíprocas indeseables y reacciones de unión
no específicas entre los componentes del ensayo y otros componentes
existentes en la muestra o en la fase sólida. En particular se unen
a la avidina y estreptavidina inmovilizada o en solución, a menudo
otras substancias existentes en la muestra de ensayo y ocasionan
por este motivo resultados de ensayo falsamente positivos o
falsamente negativos. Además estas acciones recíprocas pueden
causar también un aumento de la señal de fondo y una mayor extensión
de las señales, a causa de lo cual la sensibilidad y la
especificidad de los ensayos en cuestión, disminuyen.
Se han efectuado diferentes ensayos para reducir
estas acciones recíprocas no específicas. Por ejemplo es conocido
que, diferentes componentes de hidratos de carbono y diferentes
proteínas, mezclas de proteínas o fracciones de proteínas, así como
sus hidrolizados, pueden disminuir las acciones recíprocas no
específicas entre los componentes del ensayo y el analito en
ensayos inmunológicos (Robertson et al., J. of Immun. Med.
26 (1985) 195; EP-A- 260 903;
US-A-4. 931.385). El empleo de tales
componentes de hidratos de carbono y proteínas, tiene sin embargo
la desventaja, de que a causa de los componentes en ellos contenidos
pueden aparecer de nuevo otras perturbaciones del ensayo. Los
hidrolizados obtenidos enzimáticamente pueden además estar
impurificados por las proteasas empleadas en la obtención y por
regla general no presentan ninguna cualidad homogénea, por lo cual
la separación puede controlarse sólo difícilmente. Dichas impurezas
de las proteasas pueden actuar sobre los componentes del ensayo y
ya en pequeñas cantidades conducen a un desajuste de las funciones
del ensayo y a la estabilidad de almacenamiento.
Además, también se ha descrito para la
disminución de acciones recíprocas no específicas, el empleo de
proteínas químicamente modificadas, en particular, de proteínas
succiniladas o acetiladas
(US-A-5.0521.356;
EP-A-0 525 916). Con estas
substancias no se pueden evitar sin embargo, muchos de los
resultados falsamente positivos o falsamente negativos de los
ensayos sobre los anticuerpos del suero.
Para evitar las acciones recíprocas no
específicas se propuso además añadir los reactivos de ensayo en
partículas ultra finas con un tamaño medio máximo de 0,2 \mum,
los cuales están concebidos de manera que se unen a los componentes
perturbadores y los capturan (EP 0 163 312). Para ello sin embargo
es necesario una especial preparación de estas partículas
ultrafinas, y además debe ser conocida la clase de factores no
específicos existentes en la
muestra.
muestra.
En las patentes
DE-A-44 07 423 y
DE-A-44 34 093, se
pro-puso capturar mediante una reacción previa las
perturbaciones que aparecen a causa de acciones recíprocas no
específicas entre los componentes de la muestra y una fase sólida
recubierta con estreptavidina. La reacción previa se efectúa de
forma adecuada en una fase sólida, la cual es lo más similar
posible a la fase sólida activa recubierta con estreptavidina, a la
cual sin embargo las moléculas de muestra no pueden unirse
específicamente. Los componentes no específicos se unen por el
contrario también a la fase sólida inactiva y pueden por esta razón
ser eliminados.
Según la patente
DE-A-44 07 423, la estreptavidina
puede inactivarse mediante derivatización covalente o modificación
covalente. Sin embargo, es desventajoso para ello que sea necesaria
una modificación química adicional costosa. Además se puede alterar
mediante una derivatización química la zona alrededor de un centro
activo de la estreptavidina nativa de forma no deseada, con lo cual
pueden perjudicarse las acciones desperturbadoras e incluso pueden
aparecer adicionalmente acciones recíprocas perturbadoras. Acciones
recíprocas no específicas que aparecen en la bolsa de unión de la
biotina pueden no eliminarse mediante modificaciones covalentes.
El sistema
avidina/estreptavidina-biotina es, a causa de la
fuerte afinidad no covalente del socio de unión (K_{A}
aproximadamente 10^{15} l/mol), objeto de numerosas
investigaciones. La alta afinidad de unión se atribuyó ante todo a
las acciones recíprocas entre los radicales de triptófano de la
estreptavidina y la biotina. Mediante el cambio de los radicales de
triptófano (Chilkoti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92
(1995) 1754-1758, Sano y Cantor, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92 (1995) 3180-3184) pudo sin embargo
lograrse una significativa disminución de la afinidad de unión de
las variantes de estreptavidina a la iminobiotina. Por el
contrario, no pudo lograrse una comprobación más clara para la
disminución de la afinidad de unión con la biotina (ver Chilkoti
et al., supra, fig. 1A y B). Para un empleo como
reactivos de eliminación de perturbaciones, tales variantes son
inadecuadas, puesto que a causa de la afinidad de unión todavía muy
alta, pueden producirse también reacciones específicas con los
componentes biotinilados del ensayo.
Ha sido por consiguiente, un objetivo de la
presente invención, la preparación de un reactivo mediante el cual
pudiera disminuirse la influencia perturbadora sobre el
procedimiento de detección para la determinación de un analito, por
ejemplo los ensayos inmunológicos o de hibridación de ácidos
nucleicos.
Esta tarea se soluciona según la invención,
mediante un polipéptido capaz de unirse a la biotina, escogido de
las muteínas de estreptavidina, en donde la muteína (a) se
diferencia de la SEQ ID No 2 por lo menos en un aminoácido del
polipéptido nativo, en donde por lo menos uno de los aminoácidos en
las posiciones Leu25, Thr90, Leu110 o/y Asp128 es intercambiado por
otro aminoácido, y (b) presenta una afinidad de unión a la biotina
inferior a 10^{10} l/mol. La afinidad de unión para la
reacción:
Complejo
estreptavidina/biotina
\hskip0.3cm\leftrightarrow
\hskip0.3cmestreptavidina + biotina
es aproximadamente de 10^{15}
l/mol. El sistema estreptavidina/biotina empleado como sistema
captador, dispone con ello de una de las más potentes reacciones
recíprocas no covalentes entre una proteína y un ligando.
Sorprendentemente, se comprobó que mediante el intercambio de uno o
varios aminoácidos en las posiciones Leu25, Thr90, Leu110 o/y Asp128
de la estreptavidina de la SEQ ID No 2, se obtiene un polipéptido,
que por una parte en la obtención recombinante es renaturalizable,
y por otra parte puede disminuirse una disminuida afinidad de
unión a la biotina a < 10^{10} l/mol, con lo cual la muteína
de la invención de preferencia presenta además una estructura la
cual corresponde a la estructura del polipéptido activo. La muteína
según la invención muestra de preferencia una alta actividad
cruzada inmunológica con el polipéptido nativo. Además, se prefiere
que sean capaces de dimerización o respectivamente de
tetramerización. Sorprendentemente, las muteínas poseen a pesar de
la disminuida afinidad de unión a la biotina, como la
estreptavidina nativa, la posibilidad de unión a los componentes
perturbadores de la muestra, como puede ocurrir en las muestras
biológicas, por ejemplo, en los líquidos corporales como suero,
plasma, sangre entera,
etc.
Debido a sus particulares propiedades, las
muteínas según la invención pueden emplearse para diferentes
aplicaciones. Una disminución de la afinidad de unión es
equivalente a una disminución de las acciones recíprocas entre la
biotina y las muteínas. Según la invención, las muteínas pueden
estar configuradas de tal forma que prácticamente no se unen a la
biotina, o bien se unen a ella con una débil unión relativamente
reversible. Puesto que la estructura espacial de las muteínas en
comparación de preferencia con el polipéptido nativo, no ha cambiado
significativamente, las acciones recíprocas con otras substancias
no son influidas. De esta forma se obtiene un reactivo que en su
estructura espacial y sus propiedades de unión corresponde a la
estreptavidina nativa, con excepción de la modificada capacidad de
unión a la biotina.
Como muestras de ensayo pueden emplearse en
general muestras acuosas. En particular, se emplean muestras
biológicas como por ejemplo, líquidos corporales como la sangre
entera, el plasma sanguíneo, el suero, la saliva, líquidos de
tejidos, humores del organismo u orina.
El intercambio de determinados aminoácidos por
mutagénesis, permite una definida obtención de las muteínas.
Contrariamente a otras modificaciones de la estreptavidina, como por
ejemplo la derivatización química, se conserva la estructura de las
muteínas según la invención. Con ello no pueden aparecer ningunas
acciones recíprocas perturbadoras entre los reactivos de
derivatización introducidos adicionalmente y los componentes de las
muestras que se ensayan.
La afinidad de unión de las muteínas según la
invención a la biotina es de preferencia < 10^{9} l/mol, con
mayor preferencia < 10^{8} l/mol, todavía con mayor
preferencia, < 10^{7} l/mol, con particular preferencia <
10^{6} l/mol, y con la máxima preferencia < 10^{5} l/mol.
De preferencia muestran las muteínas de
estreptavidina según la invención, una regenerabilidad en la
inmovilización sobre la superficie de un chip sensor, por ejemplo
una superficie BIAcore.
En las muteínas de estreptavidina según la
invención se intercambian uno o varios aminoácidos en las posiciones
Leu25, Ser27, Tyr43, Ser45, Val47, Gly48, Ser88, Thr90, Leu110 o/y
Asp128 por otro aminoácido. Mediante el intercambio de un
aminoácido con un radical pequeño por otro aminoácido con un radical
más grande, puede lograrse una disminución de la capacidad de unión
de la biotina, por ejemplo por intercambio del Leu ó Ser por Trp,
Arg, Tyr, Phe ó His. Además la capacidad de unión de la biotina
puede disminuir o quedar bloqueada mediante un puente de disulfuro
introducido adicionalmente, el cual disminuye la accesibilidad a la
bolsa de unión de la biotina. Puede formarse por ejemplo un puente
de disulfuro adicional por el intercambio de dos aminoácidos por
dos cisteínas a una distancia espacial adecuada. También es posible
disminuir la capacidad de unión a la biotina mediante acciones
recíprocas iónicas adicionales. Para ello se puede introducir por
ejemplo un aminoácido cargado positivamente como el Arg ó Lys, el
cual forma con el Asp128 acciones iónicas recíprocas. Por otro
lado, puede introducirse también un aminoácido cargado positivamente
y un aminoácido cargado negativamente, los cuales forman entre sí
un puente salino y con ello pueden bloquear la bolsa de unión a la
biotina. De preferencia se intercambian pequeños aminoácidos y
localizados en la superficie, como por ejemplo Leu25, Ser27, Ser 45
ó/y Leu110, por voluminosos aminoácidos, como por ejemplo Arg, Trp,
Tyr, Phe ó His.
Para lograr la deseada afinidad de unión pueden
también formarse muteínas de estreptavidina, en las cuales se
intercambian por lo menos dos aminoácidos. Se prefiere intercambiar
por lo menos dos de los aminoácidos Leu25, Ser27, Ser45 y Leu119,
por ejemplo los pares de aminoácidos Leu25 y Ser45, Ser27 y Ser45
así como Ser45 y Leu110, mediante aminoácidos adecuados, en
particular aminoácidos voluminosos como Arg, Trp, Tyr, Phe ó His.
Particularmente preferidos son los intercambios de Leu25 por Trp y
Ser45 por Arg, el Ser27 por Arg y el Ser45 por Arg, el Ser45 por
Trp y el Leu110 por Trp ó el Ser45 por Tyr y el Leu110 por Trp.
También el intercambio de más de dos aminoácidos
conduce en la estreptavidina a muteínas según la invención. De
preferencia se intercambian en dichos múltiples mutantes de
estreptavidina por lo menos tres de los aminoácidos Leu25, Ser27,
Ser45 y Leu110, de preferencia por aminoácidos voluminosos como se
ha definido anteriormente. En ejemplos específicos para mutantes de
combinaciones triples se intercambian Leu25 por Trp, Ser45 por Trp
y Leu110 por Trp ó Leu25 por Trp, Ser45 por Tyr y Leu110 por
Trp.
En otro mutante preferido de combinación
múltiple, se mutagenizan por lo menos dos de los aminoácidos Leu25,
Ser27, Ser45 y Leu110 así como adicionalmente Trp120. Un ejemplo
específico para un mutante triple de este tipo contiene
intercambios de Ser27 por Arg, Ser45 por Arg y Trp120 por Ala.
La secuencia de ADN que codifica la
estreptavidina nativa, está representada en la SEQ ID NO. 1. La
correspondiente secuencia de proteínas está representada en SEQ ID
NO. 2. Los números de aminoácidos que se citan se refieren a esta
secuencia. La secuencia de ácidos nucleicos de la avidina nativa
está representada para la comparación en la SEQ ID NO. 3. La SEQ ID
NO. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la avidina. La
numeración de los aminoácidos se efectúa correspondientemente con
esta secuencia. Las muteínas de la avidina no son objeto de la
invención.
Según la invención, puede obtenerse también
muteínas de variantes de estreptavidina, las cuales en su forma
original son capaces de unirse con la biotina. Son preferidas según
la invención, las muteínas de una estreptavidina acortada (parte
central de la estreptavidina recombinante). Esta parte central de la
estreptavidina está codificada de preferencia por la secuencia de
nucleótidos mencionada SEQ ID NO. 15, y contiene en la secuencia ID
NO. 16 la secuencia de aminoácidos mostrada. La obtención de esta
parte central de la estreptavidina está descrita en la patente WO
93/09144. Las muteínas de la parte central de la estreptavidina
contienen mutaciones, como ya ha sido descrito para la
estreptavidina nativa.
Otro objeto de la presente invención es un ácido
nucleico que codifica unas muteínas de estreptavidina. Este ácido
nucleico puede obtenerse por ejemplo in vitro mediante
mutagénesis específica en el sitio, de un ácido nucleico según la
SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 ó SEQ ID NO. 15. El ácido nucleico según
la invención, puede estar localizado sobre un vector, por ejemplo
sobre un plásmido procariótico, de preferencia un plásmido
replicable en E. coli. El ácido nucleico se encuentra sobre
el vector de preferencia en una ligazón operativa con un promotor,
el cual permite una expresión en cualquier organismo anfitrión.
Todavía otro objeto de la invención es una
célula la cual se transforma mediante un vector que contiene un gen
de muteína de estreptavidina. De preferencia, la célula es una
célula procariótica en particular una célula bacteriana
gram-negativa, por ejemplo una célula de E.
coli.
Las muteínas se obtienen preferentemente
mediante la expresión recombinante en una célula anfitriona
adecuada, en particular una célula anfitriona procariótica como por
ejemplo la E. coli. A este respecto las muteínas se
encuentran habitualmente en forma de cuerpos de inclusión inactivos,
los cuales en condiciones apropiadas pueden ser
renaturalizados.
Las muteínas pueden emplearse después de la
renaturalización y purificación, sin más tratamiento, en forma
soluble o después de la inmovilización sobre una fase sólida, como
reactivo para la eliminación de perturbaciones. Además pueden
emplearse también las muteínas en forma de un conjugado polimérico
soluble o inmovilizado. Este tipo de conjugados poliméricos pueden
obtenerse mediante copulación química de varias moléculas de
muteínas entre sí o mediante copulación con otras macromoléculas
como por ejemplo poli-péptidos, proteínas, hidratos
de carbono, etc.
Son preferidos, los conjugados de muteínas con
otro polipéptido o proteína. Particularmente preferido es un
conjugado con una albúmina, por ejemplo albúmina de suero bovino. La
obtención de conjugados poliméricos de las muteínas y eventualmente
otras macromoléculas puede lograrse por métodos ya conocidos (ver
por ejemplo, la patente EP-A-0 269
092).
Además, la invención se refiere al empleo de una
de las muteínas anteriormente descritas como reactivo para la
eliminación de perturbaciones para ensayos para la detección de un
analito, en los cuales el par de unión
estreptavidina-biotina está contenido como
componente del ensayo. A este respecto, las muteínas pueden
emplearse en forma disuelta o/y inmovilizada. En una versión, las
muteínas pueden emplearse juntamente con una fase sólida de
estreptavidina no modificada en un ensayo heterogéneo, por ejemplo
un ensayo inmunológico o/y ensayo de hibridación. A este respecto,
las muteínas pueden añadirse a la preparación de ensayo en forma
soluble o/y inmovilizada, por ejemplo en forma de una fase sólida
separada.
El ensayo puede efectuarse como un procedimiento
de un paso o de dos pasos, es decir la muestra a determinar puede
ser puesta en contacto con muteínas y con estreptavidina no
modificada, a la vez, o en pasos de reacción separados.
Además, pueden emplearse las muteínas según la
invención también en otros formatos de ensayo, por ejemplo en
ensayos homogéneos, ensayos de aglutinación, etc, en tanto que como
componentes del ensayo, está presente el par de unión
estreptavidina/-avidina-biotina. En esta conexión,
el término "biotina" comprende tanto la biotina en forma libre
como también en forma de substancias biotiniladas, como por ejemplo
ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos, péptidos o
polipéptidos biotinilados. Además, el término comprende también los
análogos y derivados de la biotina, como por ejemplo la
iminobiotina, destiobiotina y péptidos de afinidad a la
estreptavidina.
Otro objeto de la invención es un reactivo para
eliminar las perturbaciones para la disminución o/y supresión de
acciones recíprocas no específicas en un procedimiento para la
determinación de un analito, en donde el reactivo para eliminar
perturbaciones contiene una de las muteínas descritas más arriba.
Este reactivo para eliminar perturbaciones puede estar presente en
forma soluble o/y inmovilizado en una fase sólida, de preferencia
en una membrana, una placa de microtitulación, un recipiente de
microreactivo, o microperlas. Mediante el reactivo para eliminar
perturbaciones pueden captarse substancias, que producen reacciones
recíprocas no específicas con los componentes del ensayo, con lo
cual se logra una mejora de la sensibilidad del ensayo. El reactivo
para eliminar perturbaciones presenta, en comparación con la avidina
o respectivamente la estreptavidina no modificadas, una capacidad
de unión esencialmente invariable frente a los componentes
perturbadores, de forma que los componentes perturbadores de la
muestra de ensayo son captados eficazmente. Contrariamente a la
avidina o respectivamente la estreptavidina nativas, el reactivo
para eliminar perturbaciones, presenta prácticamente sin embargo,
una afinidad nula a la biotina para el ensayo, por lo cual la
detección del analito en la muestra de ensayo no resulta
esencialmente influida.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para la detección cualitativa y/o cuantitativa de un analito en una
muestra de ensayo, que comprende el empleo de un par de unión
específico estreptavidina-biotina, en donde se
añade como reactivo para eliminar perturbaciones, una muteína de
estreptavidina según la invención, con una afinidad de unión a la
biotina < 10^{10} l/mol.
En una versión de la presente invención, el
procedimiento es un ensayo heterogéneo, en el cual la determinación
del analito tiene lugar mediante la unión a una fase sólida, en
donde la estreptavidina forma parte del par de unión en esta unión
a la fase sólida.
En una versión preferida de este formato de
ensayo, se emplea una fase sólida, que está recubierta con
estreptavidina y a la cual debe unirse un componente de ensayo
biotinilado. A un formato de ensayo de este tipo puede añadirse el
reactivo para eliminar perturbaciones según la invención, en forma
soluble o/y inmovilizada. Un reactivo para eliminar perturbaciones
inmovilizado se añade de preferencia en forma de una fase sólida
inactiva separada, en donde la muestra de ensayo se pone en
contacto, o bien primeramente con la fase sólida inactiva sola, y
más tarde solamente con la fase sólida activa, o bien se pone en
contacto simultáneamente con la fase sólida activa y la fase sólida
inactiva.
Cuando se emplea un reactivo soluble para
eliminar perturbaciones, se prefiere un ensayo de un solo paso, en
el cual el reactivo para eliminar perturbaciones está presente
juntamente con todos los otros componentes del ensayo en el líquido
de muestra.
También, cuando se emplea una fase sólida
biotinilada y estreptavidina soluble, como componentes del ensayo,
puede emplearse con éxito el reactivo para eliminar perturbaciones
según la invención, por ejemplo en forma soluble o en forma de una
fase sólida inactiva separada.
La detección del analito en el procedimiento
según la invención puede efectuarse en forma de por sí ya conocida
mediante una marca indirecta o directa. Con reactivos de detección
directamente marcados tiene lugar la detección porque el reactivo
de detección por ejemplo se une al analito y forma un complejo
detectable, el cual lleva la marca, o se une competitivamente al
analito en un sitio específico de unión. Los reactivos de detección
con una marca indirecta comprenden varios componentes, en donde el
componente que se une al analito está sin marcar y Este es capaz de
unirse a otro componente que lleva una marca.
Marcas adecuadas ya son conocidas por el
experto. Pueden emplearse por ejemplo, marcas radiactivas,
marcadores de quimioluminiscencia, fluorescencia o
electroquimioluminiscencia, partículas coloreadas como por ejemplo
partículas de metalsol, o látex de color o incoloro. La marca puede
suministrar también una señal indirecta como por ejemplo en las
marcas enzimáticas con enzimas como la peroxidasa,
\beta-galactosidasa, o la fosfatasa alcalina.
Otro objeto de la invención es un kit de ensayo
para la detección cualitativa o/y cuantitativa de un analito en una
muestra de ensayo la cual contiene un polipéptido capaz de unirse
con la biotina así como otros componentes del ensayo en cuestión y
un reactivo para eliminar perturbaciones, el cual comprende una
muteína según la invención. El reactivo para eliminar
perturbaciones puede estar presente en forma soluble o bien
inmovilizado sobre una fase sólida, en particular sobre una placa
de microtitulación, un recipiente para microrreactivo, una membrana
o sobre microperlas.
Otro objeto de la invención es el empleo de
muteínas de estreptavidina, en las cuales por lo menos uno de los
aminoácidos en las posiciones Leu25, Ser27, Tyr43, Ser45, Val47,
Gly48, Ser88, Thr90, Leu110 o/y Asp128 del polipéptido nativo de la
SEQ ID NO. 2, se intercambia con otro aminoácido, y presenta una
afinidad de unión a la biotina en el margen de 10^{3} a 10^{11}
l/mol, como sistema regenerable para la unión de substancias
biotiniladas. De preferencia se emplean muteínas con una afinidad de
unión a la biotina en el margen de 10^{5} a 10^{10} l/mol y en
particular de 10^{5} a 10^{8} l/mol.
El sistema regenerable para la unión de
substancias biotiniladas comprende de preferencia una fase sólida
sobre la cual se inmovilizan las muteínas de estreptavidina. Por
ejemplo, son fases sólidas apropiadas los chips sensores (por
ejemplo el sistema Biacore de la firma Kabi Pharmacia), recipientes
de reacción como por ejemplo tubitos o cubetas de poliestireno,
placas de microtitulación, microperlas, partículas de látex y
materiales de soporte para columnas de afinidad. Bajo la
denominación "substancias biotiniladas" se comprenden en
particular conjugados de biotina y análogos de biotina, en donde los
análogos de biotina son aquellas substancias que con la bolsa de
unión de la biotina de la estreptavidina (nativa) forman un complejo
como por ejemplo la iminobiotina, destiobiotina y péptidos de
afinidad con la estreptavidina.
La ventaja de las fases sólidas regenerables
según la invención frente a una fase sólida recubierta con
estreptavidina nativa, consiste en que por un lado existe una
suficientemente alta afinidad de unión para la biotina (en forma de
biotina libre o substancias biotiniladas), de manera que la fase
sólida puede emplearse en ensayos para la detección de analitos,
para la investigación de acciones recíprocas
receptor-ligando, y para la purificación o
respectivamente análisis de substancias biotiniladas. Por otro lado
la afinidad de unión de la fase sólida a la biotina o a una
substancia biotinilada es suficientemente pequeña para que sea
posible una regeneración de la fase sólida, es decir una separación
de la biotina. Esta separación tiene lugar de preferencia mediante
la disminución del valor del pH a un pH < 4,5 o/y mediante la
adición de substancias caotrópicas, es decir substancias que
perturban la formación de enlaces de puentes de hidrógeno.
Alternativamente puede tener lugar la separación para el
aislamiento de las substancias biotiniladas también mediante la
adición de biotina libre o/y análogos de la biotina. Es
particularmente preferida la elución por gradiente.
En una versión preferida, se emplea la fase
sólida regenerable como matriz de afinidad. Esta matriz de afinidad
sirve para la purificación de substancias biotiniladas por ejemplo
anticuerpos biotinilados o respectivamente para la separación de
dichas substancias según el número de radicales de biotina unidos
por molécula. Cuando se emplean como matriz la estreptavidina o
avidina modificada, las substancias puestas en contacto con la
matriz, debido a la alta afinidad de unión, prácticamente no pueden
ser liberadas de nuevo. En el estado actual de la técnica se ha
investigado solucionar este problema transformando la avidina en sus
monómeros mediante tratamiento con urea, o respectivamente
empleando la iminobiotina en lugar de la biotina para disminuir la
afinidad de unión. Estos procedimientos son sin embargo costosos y
conllevan problemas adicionales. Cuando se emplean las muteínas
según la invención pueden obtenerse matrices de afinidad con
afinidades de unión a la biotina, las cuales hacen posible una
unión reversible y con ello una recuperación del analito.
Además, se prefiere emplear la fase sólida
regenerable según la invención, para la determinación de las
acciones recíprocas receptor/ligando, por ejemplo como un chip
sensor recubierto. La unión de moléculas a esta superficie puede
investigarse por ejemplo, mediante la espectroscopia de resonancia
de los plasmones de superficie.
Los plásmidos y microorganismos mencionados en
la presente solicitud fueron registrados en la Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ("Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH") (DSM),
Mascheroderweg 1B, D-30300 Braunschweig, según las
determinaciones del Tratado de Budapest, con los siguientes números
de registro:
- E. coli K12RM82:
- DSM 5445 el 2 de Octubre de 1991
- pUBS500:
- DSM 6720 el 20 de Septiembre de 1991
\vskip1.000000\baselineskip
En el listado de secuencias figura:
- SEQ ID NO. 1
- secuencia de nucleótidos que codifican la estreptavidina, incluida la secuencia codificadora del péptido de señalización,
- SEQ ID NO. 2
- secuencia de aminoácidos de la estreptavidina, incluida la secuencia señalizadora
- SEQ ID NO. 3
- secuencia de nucleótidos que codifican la avidina, incluida la secuencia que codifica el péptido de señalización,
- SEQ ID NO. 4
- secuencia de proteínas de la avidina incluida la secuencia de señalización
- SEQ ID NO. 5
- secuencia de nucleótidos del cebador N1,
- SEQ ID NO. 6
- secuencia de nucleótidos del cebador N2,
- SEQ ID NO. 7
- secuencia de nucleótidos del cebador N3,
- SEQ ID NO. 8
- secuencia de nucleótidos del cebador N4,
- SEQ ID NO. 9
- secuencia de nucleótidos del cebador N5,
- SEQ ID NO. 10
- secuencia de nucleótidos del cebador N6,
- SEQ ID NO. 11
- secuencia de nucleótidos del cebador N7,
- SEQ ID NO. 12
- secuencia de nucleótidos del cebador N8,
- SEQ ID NO. 13
- secuencia de nucleótidos del cebador N9,
- SEQ ID NO. 14
- secuencia de nucleótidos del cebador N10,
- SEQ ID NO. 15
- secuencia de nucleótidos que codifican la estreptavidina de la parte central según la patente WO 93/019144, y
- SEQ ID NO. 16
- secuencia de aminoácidos de la estreptavidina de la parte central.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 muestra el mapa del plásmido del
plásmido de expresión de la estreptavidina de la parte central,
pSAM-Core.
Los siguientes ejemplos aclaran con más detalle
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pSAM-core se preparó
de acuerdo con la patente WO 93/09144.
La región del ADN corriente arriba y corriente
abajo de la mutación a introducir, se eliminó hasta el sitio de
corte de la endonucleasa de restricción singular más próximo en el
vector de expresión del pSAM-Core, y se substituyó
mediante un correspondiente segmento de ADN, obtenido químicamente,
con la mutación deseada (adaptador de ADN). La manipulación del ADN
se efectuó a este respecto con métodos estándar como está descrito
en Sambrook et al., en: Molecular Cloning. A Laboratory
Manual ("Clonacion Molecular. Un Manual de Laboratorio"), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York,
1989. Los reactivos molecularbiológicos empleados se utilizaron de
acuerdo con las indicaciones del fabricante.
Las concentraciones de proteínas de las
proteínas y péptidos de fusión, se determinaron a partir de la
densidad óptica (OD) a 280 nm mediante el empleo de secuencias de
aminoácidos calculando los coeficientes molares de extinción (por
ejemplo para Core-SA: \varepsilon = 41820
cm^{2}/mol).
Para la construcción del gen mutante Leu25Trp
CORE-SA se digirió el plásmido
pSAM-CORE con las endonucleasas de restricción de
corte singular NcoI y SalI, y se ligó el fragmento de vector
NcoI/SalI-pSAM-CORE de
aproximadamente 2,9 kBp de longitud, después del aislamiento,
mediante electroforesis con gel de agarosa con el adaptador
Leu25Trp. El adaptador Leu25Trp se obtuvo mediante hibridación de
los oligonucleótidos complementarios N1 y N2 (tampón de reacción:
12,5 mmoles/l de Tris-HCl, pH 7,0 y 12,5 mmoles/l de
MgCl_{2}; concentración de N: en cada caso 1 pmol/60 \mul). N1
y N2 fueron proyectados en cada caso de manera que después de la
hibridación aparezcan los colgantes NcoI ó respectivamente SalI,
importantes para la clonación.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Leu25Trp fue mapeado por restricción (supresión
de los puestos de corte por la endonucleasa de restricción BanI,
mediante la mutación silenciosa en el adaptador Leu25Trp) y la
secuencia de ADN de la región del adaptador se comprobó mediante la
secuenciación del ADN.
Para la obtención del gen mutante Ser27Arg
CORE-SA, se digirió el plásmido
pSAM-CORE con las endonucleasas de restricción de
corte singular NcoI y HindIII, y se aisló el fragmento de
estreptavidina de aproximadamente 400 Bp de longitud, así como el
fragmento de vector pSAM-CORE de aproximadamente 2,5
kBp, mediante electroforesis sobre gel de agarosa. La mutación
deseada Ser27Arg se introdujo mediante la técnica de la PCR por
amplificación del fragmento de 400 Bp de longitud con el
correspondiente cebador de mutagénesis N3 aplicado en 5'. El
producto de la PCR así obtenido se cortó a continuación con NcoI y
HindIII, se purificó mediante electroforesis sobre gel de agarosa,
y se ligó con el fragmento de vector de 2,5 kBp de
pSAM-CORE aislado como se ha citado más arriba.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Ser27Arg se mapeó por restricción (supresión del
lugar de corte de la nucleasa de restricción SalI mediante la
introducción de la mutación Ser27Arg), y la secuencia mutada de ADN
de la región 5' se comprobó por secuenciación del ADN.
La PCR se efectuó con el cebador 5' de
mutagénesis N3 (posee la deseada mutación Ser27Arg) y el cebador 3'
de estreptavidina N4 (secuencia frente al pSAM-CORE
sin modificar).
Para la construcción del gen mutante Ser45Arg
CORE-SA, se digirió el plásmido
pSAM-CORE con las endonucleasas de restricción de
corte singular SacI y HindIII, y se aisló el fragmento de
estreptavidina de aproximadamente 300 Bp de longitud así como el
fragmento de vector del pSAM-CORE de aproximadamente
2,6 kBp, mediante electroforesis sobre gel de agarosa. La deseada
mutación Ser45Arg se introdujo mediante la técnica de la PCR
mediante amplificación del fragmento de aproximadamente 300 Bp de
longitud con el correspondiente cebador 5' de mutagénesis N5
aplicado. El producto de la PCR así obtenido fue cortado a
continuación con SacI y HindIII, se purificó mediante electroforesis
sobre gel de agarosa y se ligó con el fragmento de vector 2,6 kBp
pSAM-CORE aislado como se ha descrito más
arriba.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Ser45Arg se mapeó por restricción (punto de
corte por endonucleasa de restricción AvaII adicional mediante
mutación silenciosa en el cebador mutagénesis N5), y la secuencia de
ADN mutada de la región 5' se comprobó por secuenciación del
ADN.
La PCR se efectuó con el cebador N5 de
mutagénesis 5', (posee la mutación deseada Ser45Arg) y el cebador N4
de estreptavidina 3', (secuencia inalterada frente al
pSAM-CORE).
Para la construcción del gen del mutante
Trp120Ala CORE-SA se digirió el plásmido
pSAM-CORE con las endonucleasas de restricción de
corte singular, NsiI y SpeI, y el fragmento de vector
NsiI/SpeI-pSAM-CORE de
aproximadamente 2,9 kBp de longitud se ligó después del aislamiento
mediante electroforesis sobre gel de agarosa con el adaptador
Trp120Ala. El adaptador Trp120Ala se obtuvo mediante hibridación de
los oligonucleótidos complementarios N9 y N10 (tampón de reacción:
12,5 mmol/l de Tris-HCl, pH 7,0 und 12,5 mmol/l de
MgCl_{2}; concentración de N: en cada caso 1 pmol/60 \mul). Los
N9 y N10 se aplicaron en cada caso de tal manera que después de la
hibridación aparecen los colgantes NsiI ó respectivamente SpeI de
importancia para la clonación.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Trp120Ala se confirmó mediante mapeado por
restricción (supresión del lugar de corte de la endonucleas de
restricción NsiI mediante la mutación deseada en el adaptador
Trp120Ala) y la secuencia de ADN de la región del adaptador
mediante la secuenciación del ADN.
Para la construcción del gen del mutante
Leu25Trp/ Ser45Arg CORE-SA, se digirieron los
plásmidos pSA-Leu25Trp y
pSA-Ser45Arg con las endonucleasas de restricción de
corte singular NcoI y SacI, y se aisló el fragmento de 82 Bp de
longitud del pSA-Leu25Trp así como el fragmento de
vector de aproximadamente 2,8 kBp de longitud, del
pSA-Ser45Arg, mediante electroforesis sobre gel de
agarosa. A continuación se ligaron ambos fragmentos entre sí.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Leu25Trp/Ser45Arg se comprobó mediante un
mapeado de restricción (faltaba el lugar de corte de la
endonucleasa de restricción BanI, de pSA-Leu25Trp
adicionalmente el lugar de corte de la endonucleasa de restricción
AvaII de pSA-Ser45Arg) y se comprobó la secuencia de
ADN mediante secuenciación del ADN en la región 5'.
Para la construcción del gen mutante del
Ser27Arg/ Ser45Arg CORE-SA, se digirieron los
plásmidos pSA-Ser27Arg y
pSA-Ser45Arg con las endonucleasas de restricción de
corte singular NcoI y SacI, y se aisló el fragmento de 82 Bp de
longitud del pSA-Ser27Arg, así como el fragmento de
vector de aproximadamente 2,8 kBp de longitud del
pSA-Ser45Arg, mediante electroforesis sobre gel de
agarosa. A continuación se ligaron ambos fragmentos entre sí.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Ser27Arg/Ser45Arg se comprobó mediante el
mapeado de restricción (faltaba el lugar de corte de la
endonucleasa de restricción SalI del pSA-Ser27Arg y
adicionalmente el lugar de corte de la endonucleasa de restricción
AvaII del pSA-Ser45Arg) y la secuencia de ADN
mediante la secuenciación del ADN en la región 5'.
Para la construcción del gen del mutante
Ser45Trp/ Leu110Trp CORE-SA, se digirió el plásmido
pSA-Ser45Arg con las endonucleasas de restricción
de corte singular SacI y NsiI, y se aisló el fragmento de
estreptavidina de 243 Bp de longitud, así como el fragmento de
vector pSA-Ser45Arg de aproximadamente 2,7 kBp de
longitud, mediante electroforesis sobre gel de agarosa. Las
deseadas mutaciones Ser45Trp/Leu110Trp fueron introducidas a
continuación mediante la técnica de la PCR mediante amplificación
del fragmento de 243 Bp de longitud, con el correspondiente cebador
N6 de mutagénesis 5' proyectado, y el correspondiente cebador N7 de
mutagénesis 3' proyectado. El producto de la PCR así obtenido se
cortó a continuación con SacI y NsiI, se purificó mediante
electroforesis sobre gel de agarosa, y se ligó con el fragmento de
vector pSA-Ser45Arg de aproximadamente 2,7 kBp
aislado como se ha descrito más arriba.
El plásmido de nueva aparición se confirmó
mediante un mapeado de restricción (supresión del lugar de corte
AvaII introducido por mutación silenciosa en el
pSA-Ser45Arg, adicionalmente por nueva mutación en
la secuencia original, así como supresión del sitio HindII mediante
la mutación Leu110Trp), y las deseadas mutaciones de ADN, mediante
la secuenciación del ADN.
La PCR se efectuó con el cebador N6 de
mutagénesis 5', (posee la mutación deseada Ser45Trp y el lugar de
corte de la endonucleasa de restricción SacI), y con el cebador N7
de mutagénesis 3', (posee la mutación deseada Leu110Trp y el lugar
de corte de la endonucleasa de restricción NsiI)
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción del gen del mutante
Ser45Tyr/ Leu110Trp CORE-SA se digirió el plásmido
pSA-Ser45Arg con las endonucleasas de restricción
de corte singular SacI y NsiI, y se aisló el fragmento de
estreptavidina de 243 Bp de longitud, así como el fragmento de
vector pSA-Ser45Arg de aproximadamente 2,7 kBp de
longitud, mediante electroforesis sobre gel de agarosa. Las
mutaciones deseadas Ser45Tyr/Leu110Trp se introdujeron a
continuación mediante la técnica de la PCR ó amplificación de los
fragmento de 243 Bp de longitud con el correspondiente cebador N8
de mutagénesis 5' proyectado, y el correspondiente cebador N7 de
mutagénesis 3' proyectado. El producto de la PCR así obtenido se
cortó a continuación con SacI y NsiI, se purificó mediante
electroforesis sobre gel de agarosa y se ligó con el fragmento de
vector pSA-Ser45Arg de aproximadamente 2,7 kBp,
aislado como se ha descrito más arriba.
El plásmido de nueva aparición se confirmó
mediante un mapeado de restricción (supresión del lugar del corte
de la AvaII, introducido mediante mutación silenciosa adicionalmente
en el pSA-Ser45Arg, mediante nueva mutación en la
secuencia original, así como supresión del sitio HindII mediante la
mutación Leu110Trp), y las deseadas mutaciones de ADN, mediante la
secuenciación del ADN.
La PCR se efectuó con el cebador N8 de
mutagénesis 5' (posee la mutación deseada Ser45Tyr y el lugar de
corte de la endonucleasa de restricción SacI), y el cebador N7 de
mutagénesis 3' (posee la mutación deseada Leu110Trp, y el lugar de
corte de la endonucleasa de restricción NsiI)
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción del gen del mutante
Leu25Trp/ Ser45Trp/Leu110Trp CORE-SA, se digirieron
los plásmidos pSA-Leu25Trp y
pSA-Ser45Trp/Leu110Trp con las endonucleasas de
restricción del corte singular SalI y HindIII, y se aisló el
fragmento de 352 Bp de longitud del
pSA-Ser45Trp/Leu110Trp, así como el fragmento de
vector de 2,6 kBp de longitud del pSA-Leu25Trp,
mediante electroforesis sobre gel de agarosa. A continuación se
ligaron ambos fragmentos entre sí.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Leu25Trp/Ser45Trp/ Leu110Trp se comprobó
mediante un mapeado de restricción (falta el lugar de corte de la
endonucleasa de restricción HindII, de
pSA-Ser45Trp/Leu110Trp y falta el lugar de corte de
la endonucleasa de restricción BanI, de
pSA-Leu25Trp), y mediante la secuenciación del
ADN.
Para la construcción del gen del mutante
Leu25Trp/ Ser45Tyr/Leu110Trp CORE-SA, se digirieron
los plásmidos pSA-Leu25Trp y
pSA-Ser45Tyr/Leu110Trp con las endonucleasas de
restricción de corte singular SalI y HindIII, y se aisló el
fragmento de 352 Bp de longitud del
pSA-Ser45Tyr/Leu110Trp, así como el fragmento de
vector de aproximadamente 2,6 kBp de longitud, del
pSA-Leu25Trp, mediante electroforesis sobre gel de
agarosa. A continuación, se ligaron ambos fragmentos entre sí.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Leu25Trp/Ser45Trp/ Leu110Trp fue confirmado
mediante un mapeado de restricción (falta el lugar de corte de la
endonucleasa de restricción HindII, del
pSA-Ser45Trp/Leu110Trp, y falta el lugar de corte
de la endonucleasa de restricción BanI, del
pSA-Leu25Trp), y se confirmó la secuencia de ADN,
mediante secuenciación del ADN.
Para la construcción del gen del mutante
Ser27Arg/ Ser45Arg/Leu110Trp CORE-SA se digirieron
los plásmidos pSA-Ser27Arg/Ser45Arg y
pSA-Ser45Trp/Leu110Trp con las endonucleasas de
restricción de corte singular KpnI y HindIII, y se aislaron el
fragmento de 218 Bp de longitud, del
pSA-Ser45Trp/Leu110Trp, así como el fragmento de
vector de aproximadamente 2,7 kBp de longitud, del
pSA-Ser27Arg/ Ser45Arg, mediante electroforesis
sobre gel de agarosa. A continuación se ligaron ambos fragmentos
entre sí.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Ser27Arg/Ser45Arg/ Leu110Trp, se confirmó
mediante un mapeado de restricción (faltan los lugares de corte de
la endonucleasa de restricción HindII, del
pSA-Ser27Arg/Ser45Arg y
pSA-Ser45Trp/Leu110Trp y adicionalmente un lugar de
corte de la endonucleasa de restricción AvaII del
pSA-Ser27Arg/Ser45Arg), y la secuencia de ADN
mediante la secuenciación del ADN.
Para la construcción del gen del mutante
Ser27Arg/
Ser45Arg/Trp120Ala-CORE-SA, se
digirió el plásmido pSA-Ser27Arg/Ser45Arg con las
endonucleasas de restricción de corte singular NsiI y SpeI, y se
ligó el fragmento de vector de aproximadamente 2,9 kBp de longitud,
NsiI/SpeI-pSAM-CORE, después de
aislamiento mediante electroforesis sobre gel de agarosa con el
adaptador Trp120Ala. El adaptador Trp120Ala se obtuvo mediante
hibridación de los oligonucleótidos complementarios N9 y N10
(tampón de reacción: 12,5 mmoles/l de Tris-HCl, pH
7,0 y 12,5 mmoles/l de MgCl_{2}; concentración de N: en cada caso
1 pmoles/60 \mul). N9 y N10 se proyectaron cada vez de manera que
después de la hibridación aparecieron los colgantes NsiI ó
respectivamente SpeI, de importancia para la clonación.
El plásmido de nueva aparición
pSA-Ser27Arg/Ser45Arg/Trp120Ala, se confirmó
mediante un mapeado de restricción (supresión del lugar de corte de
la endonucleasa de restricción NsiI mediante la deseada mutación en
el adaptador Trp120Ala) y la secuencia de ADN de la región del
adaptador mediante secuenciación del ADN.
La expresión de las muteínas de estreptavidina
de la parte central en E. coli, el análisis de la expresión,
la preparación así como la purificación de las muteínas de
estreptavidina de la parte central inactivas naturalizadas se
efectuó como está descrito en la patente
EP-A-0 612 325 para la
estreptavidina de la parte central, recombinante. En el mutante
doble SA-Ser27Arg/Ser45Arg y en el mutante triple
SA-Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp, se empleó para la
purificación, en lugar de la Q-sefarosa, una
S-sefarosa equilibrada en 20 mM de acetato de Na, de
pH 5,0. La elución tuvo lugar en 20 mM de acetato de Na, de pH 5,0,
con 350 mM de NaCl.
El mutante SA, Trp120Ala, mostró frente a los
otros mutantes una disminuida estabilidad a los ácidos, lo cual
indicaba un inadecuado plegado estructural así como perturbaciones
de la columna vertebral de la proteína.
Se investigó la homogeneidad y pureza de las
muteínas de estreptavidina de la parte central inactivas purificadas
naturalizadas, mediante SDS-PAGE (Laemmli, Nature
227 (1970) 680-685) y enfoque isoeléctrico (Bark
et al., J. Forensic Sci. Soc. 16 (1976)
115-120).
Las muteínas de estreptavidina de la parte
central inactivas purificadas naturalizadas se encontraban en forma
homogénea (una sola banda) en el SDS-PAGE (peso
molecular aproximadamente 13500 Da), y en los geles IF, con una
pureza > 98%.
\vskip1.000000\baselineskip
La afinidad de las muteínas de estreptavidina
para los derivados de la biotina (constantes \kappa_{on},
\kappa_{off}, \kappa_{A}), se determinó con el sistema
BIAcore de la firma Pharmacia, en comparación a la estreptavidina
de la parte central (estreptavidina tipo salvaje). Para ello se
inmovilizaron las correspondientes muestras de estreptavidina en la
superficie de un chip - biosensor (bio sensor CM5). La carga de la
superficie se escogió de tal forma que se produjera una señal de
medición de 500 a 2000 unidades de resonancia (rU). Las genéticas
de asociación fueron determinadas a 25ºC y 6 concentraciones (12,5,
25, 50, 100, 200 y 400 nmoles/l) de un fragmento de anticuerpo Fab'
monobiotinilado, durante 3 minutos cada vez. Para investigar la
influencia de la nueva unión del anticuerpo, se compararon las
genéticas de disociación en ausencia y presencia de 10 \mug/ml de
estreptavidina de la parte central. La especificidad de la unión se
mostró mediante una prueba con el mismo anticuerpo en forma no
biotinilada (control negativo).
Se determinaron las constantes de unión de las
muteínas de estreptavidina purificadas, también de las muteínas de
estreptavidina reticuladas a un polímero (conjugado muteínas de
estreptavidina-termo-albúmina de
suero bovino, obtención: patente
EP-A-O 269 092). Los resultados del
experimento figuran en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuó un ensayo enzimático sobre el
anticuerpo anti-HCV, y se determinó la reducción de
las perturbaciones del ensayo mediante la adición de las muteínas de
estreptavidina SA-Ser27Arg/Ser45Arg (1),
SA-Ser45Trp/Leu110Trp (2) y
SA-Ser45Tyr/Leu110Trp (3).
El ensayo se efectuó como un ensayo sandwich de
dos pasos con una fase sólida de estreptavidina. En el primer paso,
se añadieron los péptidos de HCV biotinilados (ver las patentes
EP-A-0 582 243,
EP-A-0 484 787), ó respectivamente
los polipéptidos (ver patente EP-A-0
696 640) más la muestra. Como segundo paso se efectuó una reacción
del anticuerpo unido a las fases sólidas, con un conjugado IgG
antihumano-peroxidasa. A continuación se efectuó
una reacción indicadora con ABTS como substrato.
\newpage
La realización del ensayo se efectuó como
sigue:
- Tampón de incubación:
- Fosfato de Na 40 mmoles/l, pH: 7,4
- \quad
- NaCl 7,1 g/L
- \quad
- Conservante (por ejemplo, cloracetamida)
- \quad
- Base diagnóstico de plasma 200 g/L (Armour Pharmaceuticals Company, USA)
- \quad
- + Péptido HCV de la parte central, región NS4 y NS3, y polipéptido NS3 recombinante (biotinilado)
- \quad
- \pm 25 \mug/ml de muteína de estreptavidina no conjugada o respectivamente 75 \mug/ml como conjugado con termo-RSA \pm 25 \mug/ml de estreptavidina de la parte central (en peso)
- Tampón Conjugado
- Fosfato de Na 40 mmoles/l pH: 7,4
- \quad
- NaCl 7,1 g/l
- \quad
- Conservante (por ejemplo cloracetamida)
- \quad
- Albúmina de suero bovino 1 g/L
- \quad
- IgG bovino 4 g/L
- \quad
- Triton X 100 1 g/L
- \quad
- IgG antihumano POD 15 U/L
- Tiempos de incubación
- 1^{er} paso: 1 hora (muestra + tampón de incubación)
- \quad
- 2º paso: 1 hora (+ tampón de conjugado)
- \quad
- 3^{er} paso: 1 hora (reacción del substrato con ABTS)
- \quad
- Realización del ensayo en ES 600 a 25ºC
- \quad
- Medición de la solución del substrato a 422 nm
- Muestras:
- 5 muestras negativas anti-HCV (muestras perturbadoras) falsamente positivas
- \quad
- 6 muestras positivas anti HCV (control)
- Volúmenes
- Muestras de 20 \mul, todos los otros reactivos, cada vez 500 \mul
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores de extinción medidos en el aparato
de análisis ES 600 a 422 nm, están indicados en las siguientes
tablas 2 y 3. Los resultados muestran que la adición de muteínas de
estreptavidina da por resultado una disminución muy fuerte de la
señal en las muestras de suero negativas, pero ninguna, o sólo una
muy pequeña, disminución de la señal en las muestras de suero
positivas. La muteína de estreptavidina es por lo tanto
magníficamente apropiada como reactivo para eliminar las
perturbaciones.
El Spherosil-NH_{2}
(Boehringer Mannheim, nº de catálogo 576590) se activó con la
cantidad triple del 10% (p/v) de glutaraldehido, y a continuación,
se lavó con 7 volúmenes de agua destilada. La muteína de
estreptavidina se copuló a los grupos de aldehído libres aparecidos
mediante sus grupos amino libres. La concentración de
SA-muteína empleada fue de 2 mg de muteína de
estreptavidina por ml de gel Spherosil-NH_{2}
activado. La muteína no unida al Spherosil se lavó y separó con el
tampón de PBS (50 mM de fosfato de K, pH 7,5, 150 mM de NaCl.
A continuación, se cargó el adsorbente con
substancias biotiniladas. Las substancias no biotiniladas no se
unieron y de esta forma pudieron separarse fácilmente de las
substancias biotiniladas. También pudo efectuarse una separación de
las substancias biotiniladas correspondientemente al grado de
biotinilización (número de grupos de biotina por molécula).
Las substancias biotiniladas unidas a la columna
pueden eluirse con un tampón pH < 4,5 o/y mediante la adición de
substancias caotrópicas, como por ejemplo, el hidrocloruro de
guanidinio o/y mediante la adición de biotina o análogos de la
biotina. La separación de substancias biotiniladas
correspondientemente al grado de biotinilización, se efectuó de
preferencia mediante un gradiente de biotina o de un análogo de la
biotina.
Es posible una fijación de las muteínas de
estreptavidina a otros materiales de cromatografía mediante todos
los procedimientos conocidos para la estreptavidina nativa.
El adsorbedor Spherosil-NH_{2}
SA-muteína obtenido en el ejemplo 5.1., se equilibró
en tampón PBS (50 mM de fosfato de K, pH 7,5, 150 mM de NaCl), y
se transfirió a una columna de cromatografía. A continuación, se
aplicaron 2 mg de Bi-RSA en PBS por ml del
adsorbedor de SA-muteína. La proteína no unida se
lavó y separó con 2 volúmenes de columna de PBS. La elución se
efectuó en 50 mM de acetato de amonio 50 mM, pH 3,0 o/y un
gradiente de O a 10 mM de iminobiotina o biotina.
El adsorbedor de SA-muteína
obtenido en el ejemplo 5.1. se equilibró en tampón PBS con 500 mM de
sulfato de amonio (PBS + tampón de AS), y se transfirió a una
columna de cromatografía. A continuación, se aplicaron 2 mg de
fragmento de anticuerpo por ml de adsorbedor de
SA-muteína en PBS + tampón de AS. La proteína no
unida se lavó y separó con 2 volúmenes de columna de tampón de
PB+AS. La elución se efectuó con tampón de PBS, pH 7,2 y un
gradiente de 0 a 10 mM de biotina.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhofer Str. 112-132
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ALEMANIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- LISTA DE CORREOS: 68305
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Muteína de estreptavidina de la parte central recombinante inactiva
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MODALIDAD LEIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0,
\vskip0.500000\baselineskip
-
\hskip2.1cm
Versión #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 638 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix):
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 50..598
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido_sig
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 50..121
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido_mat
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 122..598
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 183 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 604 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 44..499
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido_sig
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 44..115
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido_mat
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 116..499
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 152 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIE: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 384 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1..384
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 128 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Polipéptido capaz de unirse a la biotina,
escogido entre las muteínas de la estreptavidina,
caracterizado porque,
la muteína (a) se diferencia por lo menos en un
aminoácido del polipéptido nativo, en donde por lo menos uno de los
aminoácidos en las posiciones Leu25, Ser27, Tyr43, Ser45, Val47,
Gly48, Ser88, Thr90, Leu110 o/y Asp 128, se ha reemplazado por otro
aminoácido, y (b), presenta una afinidad de unión a la biotina
inferior a 10^{10} l/mol.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polipéptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque,
por lo menos uno de los aminoácidos Leu25,
Ser27, Ser45 y Leu110 está reemplazado por un aminoácido escogido
entre Arg, Trp, Tyr, Phe y His.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Polipéptido según una de las reivindicaciones
precedentes,
caracterizado porque,
está presente como polímero conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Polipéptido según una de las reivindicaciones
precedentes,
caracterizado porque,
la muteína presenta la capacidad de formar
dímeros o/y tetrámeros.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Ácidos nucleicos,
caracterizados porque,
codifican un polipéptido según una de las
reivindicaciones 1 a 4.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Vector,
caracterizado porque,
contiene por lo menos una copia de un ácido
nucleico según la reivindicación 5.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Célula,
caracterizada porque,
se transforman con un vector según la
reivindicación 6, y los ácidos nucleicos se expresan según la
reivindicación 5.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Empleo de un polipéptido según una de las
reivindicaciones 1 a 4, como reactivo para eliminar perturbaciones
para ensayos, que contienen el par de unión estreptavidinabiotina
como componentes del ensayo.
9. Reactivo para eliminar perturbaciones para la
disminución o/y la evitación de acciones recíprocas inespecíficas,
en un procedimiento para la detección de un analito,
caracterizado porque,
contiene una muteína según una de las
reivindicaciones 1-4.
10. Procedimiento para la detección cualitativa
o/y cuantitativa de un analito en una muestra de ensayo, el cual
procedimiento comprende el empleo del par de unión específico
estreptavidina-biotina, añadiendo a la muestra de
ensayo un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4.
11. Kit de ensayo para la detección cualitativa
o/y cuantitativa de un analito en una muestra de ensayo que
contiene un polipéptido capaz de unirse a la biotina, así como otros
componentes del ensayo en cuestión y adicionalmente un reactivo
para eliminar las perturbaciones según la reivindicación 9.
12. Empleo de un polipéptido capaz de unirse con
la biotina, escogido de las muteínas de la estreptavidina, como
sistema regenerable para la unión de la biotina,
caracterizado porque,
la muteína (a) se diferencia por lo menos en un
aminoácido del péptido nativo de la SEQ ID NO 2, en donde por lo
menos uno de los aminoácidos, en las posiciones Leu25, Ser 27,
Tyr43, Ser45, Val47, Gly48, Ser88, Thr90, Leu110 o/y Asp128, está
reemplazado por otro aminoácido, y (b), presenta una afinidad de
unión a la biotina de 10^{5} - 10^{11} l/mol.
13. Empleo según la reivindicación 12,
caracterizado porque,
la regeneración del sistema tiene lugar mediante
la disminución del valor del pH < 4,5 o/y mediante la adición de
una substancia caotrópica.
14. Fase sólida regenerable capaz de unirse a la
biotina,
caracterizada porque,
está recubierta con una muteína de
estreptavidina, la cual (a) se diferencia por lo menos en un
aminoácido del polipéptido nativo de la SEQ ID NO: 2, en donde se
ha reemplazado por lo menos uno de los aminoácidos en las
posiciones Leu25, Ser27, Tyr43, Ser45, Val47, Gly48, Ser88, Thr90,
Leu110 o/y Asp128, y (b), presenta un afinidad de unión a la
biotina inferior a 10^{10} l/mol.
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| US6737524B2 (en) * | 2002-03-25 | 2004-05-18 | Paul K. Smith | Activated polyethylene glycol compounds |
| US7144989B2 (en) * | 2002-03-25 | 2006-12-05 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Pegylated non-hypertensive hemoglobins, methods of preparing same, and uses thereof |
| US20040067532A1 (en) | 2002-08-12 | 2004-04-08 | Genetastix Corporation | High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody |
| US7265205B2 (en) * | 2005-02-11 | 2007-09-04 | Uti Limited Partnership | Monomeric streptavidin muteins |
| US7704708B2 (en) * | 2006-02-13 | 2010-04-27 | Uti Limited Partnership | Monomeric streptavidin muteins |
| AU2007353319A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-11-20 | Invitrogen Dynal As | Methods for reversibly binding a biotin compound to a support |
| EP3124497B1 (en) | 2007-09-14 | 2020-04-15 | Adimab, LLC | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
| US8877688B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-11-04 | Adimab, Llc | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
| US12529164B2 (en) | 2007-09-14 | 2026-01-20 | Adimab, Llc | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
| JP5848501B2 (ja) * | 2009-06-24 | 2016-01-27 | 日本たばこ産業株式会社 | 改変型ビオチン結合タンパク質 |
| CN102803485A (zh) | 2009-06-24 | 2012-11-28 | 日本烟草产业株式会社 | 修饰型生物素结合蛋白 |
| JP5686098B2 (ja) | 2009-09-17 | 2015-03-18 | Jsr株式会社 | アビジンとビオチン誘導体の解離方法及び解離剤 |
| WO2013018836A1 (ja) * | 2011-08-01 | 2013-02-07 | 日本たばこ産業株式会社 | 生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法、当該方法に使用するための剤 |
| US8822640B2 (en) | 2011-08-02 | 2014-09-02 | Uti Limited Partnership | Tetrameric streptavidin mutein with reversible biotin binding capability |
| US9353161B2 (en) | 2011-09-13 | 2016-05-31 | Uti Limited Partnership | Streptavidin mutein exhibiting reversible binding for biotin and streptavidin binding peptide tagged proteins |
| ES3011307T3 (en) | 2012-02-23 | 2025-04-07 | Juno Therapeutics Gmbh | Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials |
| CN105073770B (zh) * | 2012-11-16 | 2019-08-06 | Iba股份有限公司 | 链霉亲和素突变蛋白及其使用方法 |
| JP6178586B2 (ja) * | 2013-02-20 | 2017-08-09 | サヴィッド・セラピューティックス株式会社 | ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用 |
| JP6979941B2 (ja) | 2015-08-20 | 2021-12-15 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | Ｐｅｇ化分析物特異的結合剤を用いた粒子に基づくイムノアッセイ |
| BR112018003594A2 (pt) | 2015-09-25 | 2018-09-25 | Hoffmann La Roche | cadeia pesada de imunoglobulina recombinante, anticorpos, método de produção de conjugado e conjugados |
| MX2018004875A (es) | 2015-10-22 | 2018-08-01 | Juno Therapeutics Gmbh | Metodos para cultivar celulas y kits y aparatos para ello. |
| EP3365453A2 (en) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics GmbH | Methods, kits, agents and apparatuses for transduction |
| JP7174951B2 (ja) * | 2017-02-17 | 2022-11-18 | 三井化学株式会社 | 抗体医薬の開発に資する創薬標的タンパク質の同定方法及び標的タンパク質に対する抗体の製造方法 |
| JP7339160B2 (ja) | 2017-04-27 | 2023-09-05 | ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー | オリゴマー粒子試薬およびその使用方法 |
| US10655168B2 (en) * | 2017-12-22 | 2020-05-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Modified biotin-binding proteins for immobilization |
| JP7245907B2 (ja) | 2018-09-25 | 2023-03-24 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | 共役分子トラップを使用して、アッセイからビオチン干渉を取り除く方法および組成物 |
| SG11202104355SA (en) | 2018-10-31 | 2021-05-28 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for selection and stimulation of cells and apparatus for same |
| CN116773793A (zh) * | 2023-03-16 | 2023-09-19 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 一种链霉亲和素阻断剂和检测试剂盒 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60256057A (ja) | 1984-06-01 | 1985-12-17 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 免疫学的測定法 |
| US4931385A (en) | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
| US4818686A (en) | 1986-09-15 | 1989-04-04 | Coulter Corporation | Chemical blocking agent against non-specific binding or staining of an antibody specific for terminal deoxynucleotidyl transferase in biological specimens during immunoassay |
| DE3640412A1 (de) | 1986-11-26 | 1988-06-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| US5041378A (en) * | 1987-08-11 | 1991-08-20 | Cetus Corporation | Procaryotic xylose isomerase muteins |
| US5077198A (en) | 1988-04-14 | 1991-12-31 | Eastman Kodak Company | Diagnostic kit and method for rapid detection of antibodies |
| US5051356A (en) | 1988-06-13 | 1991-09-24 | Eastman Kodak Company | Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use |
| ATE318309T1 (de) | 1990-11-03 | 2006-03-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | Hcv-spezifische peptide, mittel dazu und ihre verwendung |
| DE4135543A1 (de) * | 1991-10-28 | 1993-04-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes core-streptavidin |
| US5686268A (en) * | 1992-06-19 | 1997-11-11 | Pfizer Inc. | Fused proteins |
| DE4240980A1 (de) | 1992-08-07 | 1994-02-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV |
| DE4407423A1 (de) | 1994-03-05 | 1995-09-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Entstörmittel zum Einsatz bei Immunoassays |
| US5728803A (en) * | 1994-06-03 | 1998-03-17 | Genentech, Inc. | Pantropic neurotrophic factors |
| DE4428705A1 (de) | 1994-08-12 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
| DE4434093A1 (de) | 1994-09-23 | 1996-03-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis einer zu bestimmenden Substanz |
| AU708375B2 (en) * | 1995-02-09 | 1999-08-05 | University Of Washington | Modified-affinity streptavidin |
| IL114149A0 (en) | 1995-06-14 | 1995-10-31 | Yeda Res & Dev | Modified avidin and streptavidin molecules and use thereof |
| DE19637718A1 (de) * | 1996-04-01 | 1997-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten |
| DE19641876B4 (de) * | 1996-10-10 | 2011-09-29 | Iba Gmbh | Streptavidinmuteine |
-
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