JPH03504729A

JPH03504729A - マルトースに対して親和性のある物質（ＭａｌＥ）と、ＨＩＶウイルスに対する中和特性を有するＣＤ４タンパク質フラグメントとの融合によって生じた融合ＣＤ４ポリペプチド

Info

Publication number: JPH03504729A
Application number: JP2505325A
Authority: JP
Inventors: クルマン，ジヤン‐マリー; オフヌン，モーリス; スメルクマン，セベ
Original assignee: アンステイテユ・パストウール
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-03-16
Publication date: 1991-10-17
Also published as: FR2644463A1; WO1990011360A1; EP0426787A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】マルトースに対して親和性のある物質（ＭａｌＥ）と、）ＩＴＶウィル゛スに対する中和特性を有するτＭ−グメントとの融合によって生じた融合ＣＤ４ポリペプチド本発明は、ＣＤ４（Ｔ４とも称する）分子の少なくとも一部分、より特定的にはＨｒＶウィルス固定部位を含むＮ末端近傍領域からなる部分と、マルトースに対して親和性のある細菌ペリプラズムタンパク質（ＭａｌＥ）との融合の結果生じるポリペプチドに係わる０本発明はより特定的には、このタイプのハイブリッドポリペプチド、更にはこれらのハイブリッドポリペプチドがら分離したＣＤ４分子の前記部分に係わる。

より特定的には、これらは、種々の前記ハイブリッドポリペプチドが適当な調整エレメントの制御下における対応するＤＮＡ配列の大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）内発現産物がらなり、これらの発現産物が細菌ペリプラズムに輸送され、抽出され、且つ好ましく　ｉ、ｔアフィニティカラムにより単一ステップで精製され、必要であれば、ＣＤ４タンパク質又はＣＤ４タンパク質の前記部分の配列を基本配列とするポリペプチドが前記ハイブリッドポリペプチドがら切断・回収されるように選択したプロテアーゼで処理されたものである。

本明細書中の旧Ｖという略号は、宿主特にヒトの体内で一エイズ（ＡＩＤＳ）を誘発し得る総てのレトロウィルスを意味する。従って、ＨＩＶはＩＩＩＶＩ、ｌ！ＩＶ２又はこれらのウィルスの総ての病原性変異株を指す、尚、括弧内の数字は本明細書に添付した文献リストの番号である。

タンパク質ＣＤ４はＴリンパ球（ヘルパー／インデューサー）膜内在性糖タンパク質である。外側部分（Ｎ末端側に位置する）はイムノグロブリンのし鎖のドメインに想似した４つのドメインからなる。この外側部分にはトランスメンブラン部分及び細胞質部分が続いている（１）、このタンパク質はウィルスタンパク質ｇｐ１２０との相互作用によりＩＩＩＶウィルス（エイズ誘発ウィルス）のレセプターとして機能する（２）。

最初の２つのドメイン（グリコジル化部位を含まない）はｇｐ１２０結合部位を含む他に、ウィルス怒染を中和する能力がある抗ＣＤ４モノクローナル抗体１０Ｔ４及び０ＫＴ４＾の結合部位も含むことが判明した（３）、（４）、（５）、これら２つのドメインを含み真核細胞によって分泌される切断タンパク質は、１ｎｖｉｔｒｏテスト（３）、（４）、（６）、（７）、（８）、（９）及びアカゲザル（１０）でウィルス怒染阻害能力を示した。

マルトース及びマルトデキストリンに対して親和性を示すべりプラズム細菌タンパク質ＭａｌＥと融合したＣ［１４機能レセプターを大腸菌中に発現させる方法は、例えば１９８９年１月１８日に公開された欧州特許出願第２９９，８１０号に開示されている。この方法はＭａｌＥ遺伝子と既に実現されている他の細菌遺伝子（１１）、（１２）とを融合させるものである。この方法で得られるハイブリッドタンパク質は前記２つの成分の機能を保持している。これらのタンパク質はまた。ペリプラズム中に輸送することができる。

前記ハイブリッドタンパク質は、融合したＭｉｌＥ遺伝子及びＣＤ４遺伝子を真核細胞に固有の転写シグナル（例えばＳＶ４０ウィルスの複製起点及びポリアデニル化シグナル）に組合わせた構造によってトランスフェクションすれば、Ｃ１１０２株（ハムスターの胎児性線維芽細Ｊ１２りのような真核細胞中で発現させることもできる。この操作には、当業者に公知の方法が使用される。

前記先行特許出願明細書に記載の方法は、短時間で簡単に精製できる前記タイプのハイブリッドタンパク質を産生せしめる。実際、前記ハイブリッドタンパク質はタンパク質ＭａｌＥと同様に大量に産生ずることができ、アミロースカラムで中性ｐＨのマルトースにより溶離する単一のステップで精製することができる。

本発明は、この環境がダラム陰性菌特に大腸菌中で、ＣＤ４、より特定的にはＣＤ４のＮ末端部分の生物学的活性にとって重要なジスルフィド架橋の樹立を促進するらしいという事実、しかもこれが特に、ＣＤ４に由来し且つポリペプチド中に存在する配列がＣＤ４のＣ末端領域をもたない場合に閏著であるらしいという事実を利用する。

本発明で明らかにするように、この方法は、ハイブリ・ンド状懇のＣＤ４タンパク質の治療能力の評価を可能にし、且つ例えば特性（安定性、ウィルスとの相互作用）が変化したＣＤ４突然変異体の選択というような研究への手掛かりにもなる。また、ＣＤ４分子のＣ末端部分がないと、宿主細胞特に大腸菌中でのハイブリッドタンパク質の産生率が著しく増加する。

本発明はより特定的には、Ｎ末端の上流で第１の配列と融合し、且つ場合によってはＣ末端の下流でも第２の配列と融合したＣＤ４タンパク質から誘導したペプチド鎖を含むハイブリッドポリペプチドに係わる。前記第１の配列及び任意的な第２の配列は夫々ＭａｌＥタンパク質に由来する。本発明のハイブリッドポリペプチドはより特定的には、−ＣＤ４タンパク質から誘導したペプチド鎖が該タンパク。

質の少なくとも一部分、即ち旧Ｖつ・イルス固定部位を含むＮ末端領域部分を含み、且つ −ＭａｌＥに由来する前記第１の配列、そして場合によっては第２の配列の長さは、遺伝子工学による製造方法でハイブリッドタンパク質を産生ずる場合、使用されているトランフェクションされた微生物特に大腸菌内における細胞質外への輸送及び該微生物のペリプラズム中への移行（排出）に関するＭａｌＥタンパク質の特性と、マルトースもしくはアミロースに対するＭＪＩＩＥの特異的親和性とがハイブリッドポリペプチドによって同時に保持されるほど十分に長いことを特徴とする。

本発明の好ましいハイブリッドポリペプチドはＭａ□ＩＥに由来する前記第２配列を含まない、実際、これらのハイブリッドポリペプチドを産生ずる培養細菌は、ＣＤ４に由来する配列がＭａｌＥの前記２つの配列の間に挿入されているハイブリッドポリペプチドに対してよりも前記タイプのハイブリッドポリペプチドに対してより大きい耐性を示す。別の注目すべき点として、ＣＤ４タンパク質を旧Ｖタイプのウィルスとの固定部位に近いＮ末端のレベルでＭａｌＥ由来の鎖と融合しても、該ＣＤ４タンパク質に固有の活性が保持される。

特に、本発明のハイブリッドポリペプチドは少なくともＣＤ４タンパク質のＶｌ領域を含み、更には■２領域も含む６本発明のハイブリッドポリペプチドはより特定的にはＣＤ４のｖ３領域及びｖ４領域を含まない。

本発明はより特定的には、前述の条件で大腸菌のようなグラム陰性菌中で産生された前記タイプのハイブリッドポリペプチド、又はＭａｌＨに由来する配列を含む鎖を分離して誘導したポリペプチドにも係わる。

本発明のポリペプチドは特に、前出の欧州特許出願第２９９．８１０号に記載の方法で産生じ得る。後述の実施例ではこれらの方法を使用した。本発明の他の特徴は、添付図面を参照しながら行うこれら実施例の説明で明らかにされよう。

添付図面のうち、 −第１図はＣＤ４タンパク質の本質的部分と、一般に該タンパク質を担持しているリンパ球の膜に対する前記部分の関係とを簡単に示す説明図である。

−第２図は本発明のポリペプチドと、大腸菌中でこれらのポリペプチドを産生せしめる対応プラスミドの構造とを簡単に示す説明図である。

ＣＤ４タンパク質のペプチド配列及びこれらのアミノ酸の番号付については、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｃｌ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖｏｌ、８４．ｐｐ。

９１５５−９１５９．１９８７年１２月、　ｆｍｕｎｏｌｏｇｙに記載のＰ、Ｊ、Ｍａｄｄｏｎらの論文と−Ｃｅ１ｌ　５５，５４１．１９８８に記載のＬｉｔｔ＋ｎａｎらによる補正とを参照されたい。本明細書ではこの番号付をそのまま使用する。

特に、本発明のポリペプチドはＣＤ４タンパク質のＮ末端部分のアミノ酸１と１７７との間に延びる下記の領域を含む：ｐｎｅ　Ｌｅｕ　ｔｈｒ　ｌｙｓ　ｇｌｙ　ｐｒｏ　ｓｅｒ　ｌｙｓ　ｌ＠ｕ　ａｓｎ　ａｓｐ　ａｒｇ　ａｌａ　ａｓｐｇｌｕ　ｖａｌ　ｇｌｕ　ａｓｐ　ｇｉｎ　ｌｙｓ　ｇｌｕ　ｇｌｕ　ｖａＬ　ｇｌｎ　ｌａｕ　ｌａｕ　ｖａｌ　ｐｈａｓｅｒ　ｌａｕ　ｔｈｒ　ｌａｕ　ｔｈｒ　ｌａｕ　ｇｌｕ　ｓａｒ　ｐｒｏ　ｐｒｏ　ｇｌｙ　ｓａｒ　ｓａｒ　ｐｒ。

本発明は、アミンｗ１１〜１７７の配列を一部分しか含まないが、この配列のように、ハイブリッドポリペプチドを細胞質の外に出すのに適している前記タイプの総てのハイブリッドポリペプチドに係わる。

本発明のハイブリッドタンパク質は、ｖ１タンパク質の不在下で、ＣＤ４の少なくとも１５番目のアミノ酸から８５番目のアミノ酸まで延びるアミノ酸配列（Ｖｌ領域）を含むのが好ましい。本発明のハイブリッドタンパク質はまた、前記配列の１５番目のアミノ酸と１６０６０番目ミノ酸との間に延びる配列ｍ及びｖ２領域）を含み得る。

勿論、対応する核酸配列がら発現されたハイブリッドタンパク質を運び出すＭａｌＨの能力に影響しない限り、アミノ酸配列に局部的な欠失又は置換操作を施すこともできる。

従って本発明では、ＣＤ４のＮ末端領域内で選択したアミノ酸配列と、ＭａｌＥタンパク質との間で形成され沙なくとも哺乳動物（ＣＨＯ）の細胞中で産生された可溶性ＣＤ４分子と同じ活性レベルを有するハイブリッドポリペプチドを得ることができる。前述のごとき活性レベルの相似性は下記の事項によって評価できるニーＣＤ４分子に対する結合又はモノクローナル抗体を形成する能力。

−ＣＤ４へのＨＩＶＩタンパク質ｇｐ１６０の固定な阻害する性質。

−Ｃａ２株のリンパ細胞へのＩＩＩＶＩウィルス粒子の固定を阻害する能力。

後述のハイブリッドタンパク質ＣＩＭＥＲに関して特に注目すべきこととして、上記の３つのテストでは、ＣＨＯ細胞中で産生された可溶性ＣＤ４分子との有意な活性差は認められなかった。

ＣＤ４タンパク質の全体的構造は第１図に簡単に示す通りである。この図では、 −太線で示されている（）ＩＩＶから矢印が向けられている）部分が固定部位に対応する。本明細書の説明は、より特定的には、この部位を参照して行う。

−このタンパク質の簡単な構造説明図の右側に記されている符号は、該タンパク質の種々の部分（Ｖｌ、ｖ２、ｖ３及びＶ４）並びにこの図中に示したモノクローナル抗体によって認識されるＣＤ４タンパク質の部位の位置を表す。

−文字ＧはＣＤ４タンパク質の通常グリコジル化されている部位を示す。

−文字Ｅ、Ｍ及びＣは夫々ＣＤ４タンパク質の細胞外領域（Ｅ）、股領域＜Ｍ）及び細胞質領域（Ｃ）を表す。

び１　・番キメラ遺伝子（第１区）を担持する２つり発現ベクターな形成した。第１のベクターは、ＣＤ４のＮ末端部分の１７７個のアミノ酸がＭａｌＥ（アミノ酸３６９個）のＣ末端と融合しているハイブリッドタンパク質（ＣＩＭＥＲ）を規定する。第２のベクターは、ＭａｌＥタンパク質のＮ末端と融合した前記と同じＣＤ４フラグメントを含むハイブリッドタンパク質（ＣＩＳＲＥＭ＞をコードする。後者の場合は、ペリプラズムへの移行を容易にすべく、ＣＤ４のＮ末端部分をＭａｌＨのシグナルペプチドと融合した。従って、ＣＤ４の可溶部分はＭａｌＥのシグナルペプチドと成熟タンパク質（第１図参照）との開に存在する。

これらの構造を第２図に簡単に示した。以下は、（第２図に基づく）これらの構造の主要特性の説明である。

ＭａｌＥ−ＣＤ４　　ム＝　ＣＩＭＥＲＣＤ４遺伝子のコドン−４〜＋１７７を含むＤＮ＾フラグメント（Ｆｎｕ４Ｈ−Ｎｃｌｅｌ）を、アンピシリン及びテトラサイクリンに対して耐性の遺伝子と、１ａｅｌ遺伝子と、ｔａｃプロモータ（ＩＰＴにで誘導し得る）の制御下におかれたＭａｌＥ遺伝子とを担持するプラスミド（ｐＢＲ３２２誘導体）中に挿入した。　ＭａｌＥの遠位端部にアダプターを挿入して、ＣＤ４の挿入がＭａｌＨの最終コドンのレベルに同位相で存在するようにした。このタンパク質の構造をプラスミドの構造説明図の上に示した。

ＣＤ４−Ｍａ　ｌ　Ｅ　　Δ＝　ＣＴＳＲＥＭ先ず、前記と同じＣＤ４フラグメントをＭａｌＥシグナル配列の下流（成熟タンパク質の２７番目のコドンの後）に挿入した。

次に、ＭａｌＥ全体（コドン−２〜＋３７０）をＣＤ４の１７７番目のコドンの後に同位相で挿入した。プラスミドの残り（アンビシリン及びテトラサイクリンに耐性の遺伝子、ｆａｃｔ遺伝子及びｔａｃプロモータ）はＩｊＭＥＲの場合と同じである。このタンパク質の構造をプラスミドの構造説明図の上に示した。

どちらの場合も、キメラ遺伝子の転写はｔａｃプロモータの制御下にある（１３）、この転写は、カタボライトリプレッションの影響を受けず、ＩＰＴに（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）の添加によって随意に誘導し得る。プラスミド上に（ｔａｃプロモータに結合するリプレッサーを決定する）レベルの発現が得られる。

安定なタンパク質の産生な促進するために、夫々細胞質プロテアーゼ及びペリプラズムプロテアーゼを不活性化する突然変異体Ｉｏｎ−及びｄｅｇＰを担持する大脳菌株を使用した（１４）、（１５）。発現ベクター担持細胞が３０℃で３世代又は４世代の間に誘導される場合は、これらの細胞によって、ペリプラズム中に大部分が送り出されるタンパク質（ＣＩＭＥＲ）又は一部分が送り出されるタンパク質（ＣＩＳＲＥＭ）が産生される。

このタンパク質は、その大きさく６０ＫＤ）と、その抗原性決定基ＭａｌＥ及びＣＤ４に対して特異的な抗体とによって同定できる。

完全ハイブリッドタンパク質とＭａｌＥタンパク質との間の中間の大きさを有する合成分子フラクションはおそらく変質又は不稔的発現の産物であり、産生されたハイブリッドタンパク質の少しの部分しが占めていながった。

低レベル発現（非誘導レベル）条件では、融合タンパク質がＭａｌＨに関して欠失様を補完できる（マルトースを唯一の炭素源として含む合成培地で普通に増殖する）。完全誘導条件では、ＣＣｌ５ＲＥの過剰産生は細菌にとって有毒になるが、ＣＩＭＥＨの過剰産生は有毒にならない。このタンパク質ＣＩＭＥＲをＮ製して、その特性を調べた。

その結果、精製したハイブリッドタンパク質、より特定的にはアミロースカラムで精製したタンノくり質ＣＩＭＥＲの２うの楕成成分は、夫々の機能を保持することが判明した。

ｌ　　−ＭａｌＥ　　　はマルトース　びマルト−ストリン：η：韻市しビ頂３１擾− ペリプラズムの内容物をアミロースカラムに通す（浸透ショック）と、ペリプラズムタンパク質の一部分がアミロースに特異的に固定される。この部分（フラクション）はマルトースによってカラムから溶離することにより、単一ステップで精製できる。収率は、細菌１ｇ当たり約５００μｇのハイブリッドタンパク質である。

アミロース及びマルトースに対して親和性を示すこの分子集団は、ボアクリルアミド−５ＤＳゲル上でハイブリッドタンパク質に適した６０ｋＤの見掛は分子量を示し、且つ抗ＭａｌＥポリクローナル抗体及び抗ＣＤ４モノクローナル抗体によって認識される。前記分子Ｊｉ　６０ｋＤは、＾ｍｅｒｓｈａｎ　ＲＡＩＮＢＯ−高分子量キットの使用に関して記述されている条件に従い、当該ハイブリッドタンパク質と基準用の公知の高分子量タンパク質のゲル上での移動距離を比較することによって評価した。基準タンパク質としては下記のタンパク質を使用したニー　　９２，５００ダルトンのホスホリラーゼ、＝４６，０００ダルトンのオバルブミン、−６９，ＱＯＯダルトンのウシ血清アルブミン、−１４，３００ダルトンのりゾチーム。

２−　゛せハイブリッドタンパク　のＣＤ４ｏ１　　はエンベロープ　ンバク　　１２０−シて旧■ウィルス立　を　ム　るζＬ九又１ニーｉ、「中和作用のある」モノクローナル抗体を使用した実験では、これらのモノクローナル抗体（前記１０Ｔ４及び０ＫＴ４＾）が、ＥＬＩＳ＾テストか又は哺乳動物細胞から精製した可溶性ＣＤ４と同じ濃度での免疫沈降によって、当該ハイブリッドタンパク質と反応することが立証された。

ｉｉ、当該ハイブリッドタンパク質とＨＩＶＩ精製タンパク質８ｐ１２０もしくはｇｐ１６０との間の直接的相互作用が、同時免疫沈降及びイムノトランスファーによって立証された。

ｉｉｉ、ハイブリッドタンパク質をウィルス粒子と共に存在させるとウィルス粒子が「中和される」、これは、リンパ球株ＣＥＨの細胞に対する）ＩＩＶＩウィルスの怒染力を逆転写酵素の活性と細胞毒性とによって測定する試験で明らかである。

ウィルスを濃度１μｇ／ｍｌのＣＩＭＥＲと共に予めインキュベートすると、アジドチミジン（即ちΔＺＴ、ｆ＆も広く使用されて１）る抗旧Ｖ物質の１つ）を濃度１０ｎＭで使用した場合と同じ中和能が得られる。ＣＩＭＥＲ濃度を１０１１ｇ／ｍｌより高くするとウィルス阻害率が９０％を越える。これらの結果は、別の方法で産生じた可溶性ＣＤ４に関する結果と合致する（３）、（７）、（８）、（９）。

これらの一致したデータは総て、当該ハイブリ・ンドタンパク質のＣＤ４成分が完全ウィルス粒子と結合できる構造を保持していたことを示すものである。特に、ＣＤ４のジスルフィド架橋は正確に形成されたと思われる。

欧州特許出願第２９９，８１０号に記載のＭａｌＥ−７４構造を用いたところ、アミロースカラムへの親和性によって、音波処理した細菌又は浸透ショックから単一ステップで精製できる発現ハイブリッドタンパク質ＭａｌＥ−７４が下記の特性を有することも判明した：１）このタンパク質はＭａｌＥに対するポリクローナル抗体とＣＤ４（別名Ｔ４）に対するモノクローナル抗体（ＩＯＴ４．０ＫＴ４．０ＫＴ４＾）とによって認識される。

２）このタンパク質は、ウィルスタンパク質Ｂｐ１２０及びｇｐ１６０と相互作用する。これは、下記の３つの方法で立証された。

ａ）「ドツトプロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）」（天然型タンパク質）の実験。

ｂ　）　ＭａｌＥ又はｇｐ１６０に対するポリクローナル抗体によるＭａｌＥ− Ｔ４：ｇｐ１６０（天然型タンパク質）複合体の同時免疫沈降。

Ｃ）ニトロセルロースに固定したく「変性」）ハイブリッドタンパク質によるｇｐ１６０の保持（ｇｐ１６０と共にインキュベートし且つｇρ１６０に対する抗体で厘在化した「ウェスタンプロット」）。

３）このタンパク質はｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験で旧■１ウィルスを不活性化することができる。この融合タンパク質の濃度を上げながら（０，２，２０及び５０ｕｇ／…１）前記ウィルスと共に予めインキュベートすると、ＣＥＭ株細胞中で複製されるというウィルスの能力の阻害率が増加する（０．５５．９０及び１００％、これらの数値は１５日後の逆転写酵素活性の阻害率を示す）。

同じ条件で精製し且つ使用したタンパク質ＭａｌＥはウィルスの複製を全く阻害しなかった。

細菌ＭａｌＥ遺伝子とヒトＣＤ４遺伝子のフラクションとの間の融合によって生じ且つ大腸菌中に発現されるハイブリットタンバク質は従って、前記２つの成分の特性と保持し、中でもＨＩＶウィルス、特に旧ｖ１ウィルスに対するＣＤ４の中和能力を保持する。

そこで本発明は、選択した投与方法、特に非経口投与に適した医薬用ベヒクルと組合わせた状悪で、ＨＩＶ類に属するレトロウィルスをｉｎ　ｖｉｖｏで中和するのに有効な量の前述のごときＭａｌＥ−ＣＤ４ハイブリツドポリペプチド、又は開裂及びＭａｌＥ配列の分離によって前記ハイブリッドポリペプチドから誘導した可溶性ペプチドＣＤ４を含むｉｎ　ｖｉｖｏ治療に使用するための組成物も提供する。非限定的ではあるが、この組成物の一日当たりの用量は１００１．１ｇ〜１０ｇ、例えば約１ｇが適当である。

本発明のハイブリッドタンパク質は大量に産生ずることができる。ＣＤ４発現物質として大腸菌を使用するため、ＣＤ４遺伝子レベルに修飾を導入することも考えられ、またより効果的な突然変異体を単離するための選択方法の開発も考えられる。本発明のハイブリッドタンパク質は更に、例えばＸ線によるＣＤ４構造の研究も可能にする。これらのハイブリッドタンパク質はまた、アフィニティ力ラム、特に重合マルトース又はアミロースをベースとするカラムに固定して、培養培地中に含まれた旧Ｖウィルスの精製にも使用が接触した時のウィルスの選択的保持に基づく。

本発明は、生物学的試料中にＨＩＶウィルス又は該ウィルスの抗原が存在するか否かを調べるｉｎ　ｖｉｖｏ検出方法にも係わる。この方法は、ＨｒＶ又はＨＩＶ抗原が存在していればこれらのＨＩＶ又は）ＩＩＶ抗原に前述のごときハイブリッド又は非ハイブリッドポリペプチドが固定するという条件で生物学的試料を前記ポリペプチドと接触させ、その結果複合体が産生されたか否かを検出することからなる。

区」Ｌ去ｌ」二［１］　　Ｍｉｄｄｏｎ、　ＰＪ、、Ｌｉｔｍｕｎ、　Ｄ、Ｒ，、Ｇｏｄｆｒｅｙ、　Ｍ、、　Ｍｍｄｏｎ、　Ｄ、Ｅ、、　Ｃｈｅｓｓ、　k　ｅｔ　Ｒ，Ａｘｅｌ。

Ｃｅｕ　４２　（１９８５）　９３−１０４゜［２］　　Ｍｃ　Ｄｏｕｇａｌ、　Ｊ、Ｓ、、　Ｋｅｎｎｅｄｙ、　Ｍ、Ｓ、、　Ｓｌｉｇｈ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｃａｒｔ、　Ｓ、　Ｐ、、　lａｗｌｅ、　Ａ、　ｅｔ　Ｊ、に、Ａ。

Ｎ１ｃｈｏｌｓｏｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３１　（１９８６）　３８２−３８５゜［３］　　　Ｔｒｉｕｎｅｃｋｅｒ、Ａ、Ｌ（ｌｃｋｅ、Ｗ、ｅｔ　Ｋ、Ｋｘうａｌ、１ｎｅｎ、Ｎａｍｒ：３３１　（１９８ｇ）８４−８U゜［４］　　Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｅ、Ａ、、　Ｆｕｅｒｓｔ、　Ｔ、Ｒ，、ｅｔ　Ｂ、　Ｍｏ５ｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎｚ山Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、@ｔＪｓＡ　８５　（１９８ｇ）２３５７−２３６１゜［５］　　Ｒ４ｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｎ、Ｅ、、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｎ、Ｒ，、）Ｉｕｓｓｅｙ、　Ｒ，Ｅ、、　Ｖａｉｄ、　Ａ、、　Ｍａｔ狽■■翌刀A　Ｔ、Ｊ、。

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５ｉｃｉｌｉａｎｏ、Ｒ，Ｆ、、Ｄｏｒｆｍａｎ、Ｔ、、Ｗａｌｋｅｒ、Ｂ、、５ｏｄｒｏｓｋｉ、Ｊ、ｅｔ　Ｅｌ　Ｒｅ１ｎｈｅｎｚ　Ｎ≠狽浮窒■R３１（１９８ｇ）　７ｇ−８１゜（９］　　Ｄｅｅｎ、　ＬＣ，、Ｍｅ　Ｄｏｕｇｄｌ、　Ｊ、Ｓ、、　Ｉｎ＠ｃｋｅｒ、’　Ｒ，、Ｆｏｌｅ＋ｚａ−Ｗａｓｓｅｒｍａｎ、@Ｇ、、　Ａｒｔｈｏｓ、　Ｊ、。

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ、、　Ｍａｄｄｏｎ、　ＰＪ、、人ｘｅｌ、　Ｒ，ｅｔ　Ｒ，Ｓ、　ＳｗｅｅＬＮａｔｕｒｅ　３３１　（１’１W）　ｇ２−ｇｓ− ［１０］　　Ｗａｕｎａｂｅ、　Ｍ、、　Ｒｅ１ｒ＋ｕｎｎ、　Ｋ、＾、、　Ｄｅ　Ｌｏｎｇ、　Ｐ、Ａ、、　ｕｕ、　Ｔ、、　Ｆｉｓｈｅ秩A　ＬＡ、　ａｔ　Ｎ、　Ｌｅｒｖｉｎ。

［１１］　　Ｂ６ｄｏｕｅｌｌｅ、　Ｈ，、Ｄｕｐｌａｙ　Ｐ、　ｅｔ　　Ｍ、　Ｈｏｆｎｕｎｇ、　ＣＩ’Ｌ、　Ａｃａ己ＳｃＬ　Ｐａｒ奄刀@３０５　（１９８７）６２３−６２６゜［１２］　　Ｂ６ｄｏｕｅ１１ｅ、Ｈ，ｅｔＰ、Ｄｕｐｌａｙ、ＥｕｒＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７１（１９８ｇ）５４１−５４９［１３］　　Ａｍｍ、Ｅ、、Ｂｒｏｓｉｕｓ、Ｊ、ｅｔＭ、Ｐｔａｓｈｎｅ、Ｇｅｎｅ２４（１９ｇ３）１６７ −１７１［１４］　　Ｈｏｗａｒｄ−Ｆｌａｎｄｅｒｓ、　Ｐ、、　５１ｍ５ｏｎ、　Ｅ、　ａｔ　Ｌ、Ｔｂｃｘ’ｒｏｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４９@（１９６４）　２３７−２４６゜［１５］　　５ｔｒａｕｃｈ　Ｋ　Ｌ　ｅｔ　Ｊ、　Ｂｅｃｋｗｉｔｈ、　Ｆ’ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、　ＳＣＬ　ＵＳＡ　Ｎ５　i１９８ｇ）　１５７６−１５８０゜Ｆ電、１１　　　　　　Ｎ　Ｉ　　　ＨｒＶ国際調査報告国際調査報告ＦＲ９０００１８２Ｓ＾　　　３５７７８

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｎ末端の上流で第１の配列と融合し、場合によってはＣ末端の下流でも第２の配列と融合したＣＤ４タンパク質から誘導したペプチド鎖を含むハイブリッドポリペプチドであって、前記第１の配列及び任意的な第２の配列が夫々ＭａｌＥタンパク質に由来し、このハイブリッドポリペプチドがより特定的には、 −ＣＤ４タンパク質から誘導したペプチド鎖が該タンパク質のＮ末端領域の少なくとも一部分、即ちＨＩＶウイルス固定部位を含む部分を含み、且つ −ＭａｌＥに由来する前記第１の配列、そして場合によっては第２の配列の長さが、遺伝子工学による製造技術でハイブリッドタンパク質を産生する場合、使用されているトランツユクションされた微生物特に大腸菌内における細胞質外への輸送及び該微生物のペリプラズム中への移行に関するＭａｌＥタンパク質の特性と同時にマルトースもしくはアミロースに対するＭａＩＥの特異的親和性をハイブリッドポリペプチドが保持するほど十分に長いことを特徴とするハイブリッドポリペプチド。
２．前記第２の配列を含まないことを特徴とする請求項１に記載のハイブリッドポリペプチド。
３．タンパク質ＣＤ４の可溶性部分、特にタンパク質ＣＤ４のＮ末端領域を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のハイブリッドポリペプチド。
４．タンパク質ＣＤ４のＶ３領域及びＶ４領域を含まないことを特徴とする請求項３に記載のハイブリッドポリペプチド。
５．タンパク質ＣＤ４のＶ１領域は含むがＶ２領域は含まないことを特徴とする請求項４に記載のハイブリッドポリペプチド。
６．タンパク質ＣＤ４のＶ１領域及びＶ２領域、特に下記のアミノ酸配列１〜１７７：【配列があります】を含み、ＣＤ４の他の領域は含まないことを特徴とする請求項３に記載のハイブリッドポリペプチド。
７．真核細胞又はグラム陰性菌例えば大腸菌のような宿主中での発現産物からなるポリペプチドであって、この発現産物が該ポリペプチドをコードする核酸配列と、該核酸配列に結合した調整エレメントであって細菌を培養した時に前記ポリペプチドを宿主中に発現させる調整エレメントとを含む組換え体核酸で形質転換されており、この発現産物が、大腸菌から予め抽出した前記ポリペプチドをα（１−４）グルコース又はアミロースの不溶性ポリマーと接触させ且つ該ポリマーに固定した前記ポリペプチドを非固定物質から分離して回収することにより精製したものであることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
８．タンパク質ＣＤ４に由来するペプチド鎖のみを含み、このペプチド鎖が開裂とＭａｌＥ由来配列の分離後に得られるものであることを特徴とする請求項７に記載のポリペプチドから誘導したポリペプチド。
９．ＨＩＶウイルスをｉｎ　ｖｉｖｏで中和するのに適した組成物であって、該組成物を投与する宿主に対して生理学的に許容し得るベヒクルと組合わせた状態で、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチドを該組成物に前記中和適性を与えるのに有効な量だけ含む組成物。
１０．生物学的試料中にＨＩＶ又はＨＩＶ抗原特にエンベロープ糖タンパク質が含まれているか否かをｉｎ　ｖｉｔｒｏで検出するための方法であって、ＨＩＶ又はＨＩＶ抗原が存在する場合にはこれにポリペプチドが固定するような条件で生物学的試料を請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させ、且つ場合により形成された複合体を検出することからなることを特徴とする検出方法。