ES2325363T3

ES2325363T3 - Procedimiento y acidos nucleicos para el analisis de un trastorno proliferativo de celulas de colon.

Info

Publication number: ES2325363T3
Application number: ES03714760T
Authority: ES
Inventors: Peter Adorjan; Matthias Burger; Sabine Maier; Inko Nimmrich; Evelyne Becker; Ralf Lesche; Tamas Rujan; Armin Schmitt
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2009-09-02
Anticipated expiration: 2023-02-27
Also published as: DE60317045D1; ATE431429T1; US20050003463A1; EP1481095B1; US8691503B2; US9988683B2; AU2003210265A1; US20060246433A1; ES2295607T3; JP2005518220A; WO2003072812A3; US20110046005A1; US20150275312A1; EP1481095A2; WO2003072812A2; ATE376596T1; WO2003072820A2; AU2003248349B2; AU2003248349A1; EP1478778A2

Abstract

Un procedimiento para detectar y diferenciar entre los trastornos proliferativos de las células de colon que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra de fluido corporal que contiene ADN genómico, b) extraer dicho ADN genómico, c) convertir las bases de citosina de dicha muestra de ADN genómico que están desmetiladas en la posición 5, mediante tratamiento, en uracilo o en otra base que sea diferente de la citosina en términos del comportamiento en el apareamiento de bases y d) identificar el estado de metilación de una o más posiciones de citosina del gen TPEF y/o sus regiones reguladoras.

Description

Procedimiento y ácidos nucleicos para el análisis de un trastorno proliferativo de células de colon.

Campo de la invención

Los niveles de observación que han sido estudiados mediante los desarrollos metodológicos de los últimos años en Biología Molecular son los propios genes, la traducción de estos genes en ARN y las proteínas resultantes. La cuestión de qué gen es activado en un determinado momento del desarrollo de un individuo, y cómo se controlan la activación y la inhibición de genes específicos en células y tejidos específicos guarda correlación con el grado y el carácter de la metilación de los genes o del genoma. A este respecto, las condiciones patógenas se pueden manifestar en un patrón de metilación modificado de los genes o del genoma del individuo.

El cáncer colorrectal es la cuarta mayor causa de mortalidad por cáncer en hombres y mujeres, aunque figura como la tercera causa más frecuente en hombres y la segunda en mujeres. La tasa de supervivencia de 5 años es del 61% en todos los estadíos, siendo la detección temprana un requisito esencial para la terapia curativa de la enfermedad. Hasta el 95% de todos los cánceres colorrectales son adenocarcinomas de grados de diferenciación variables.

El cáncer de colon esporádico se desarrolla en un procedimiento de múltiples etapas que comienza con la transformación patológica del epitelio de colon normal en un genoma que progresa consecutivamente en un cáncer invasivo. La velocidad de progresión de los adenomas benignos de colon depende enormemente de su aparición histológica: mientras que es más raro que los adenomas de tipo tubular tiendan a progresar hacia tumores malignos, los adenomas vellosos, particularmente, si son de un diámetro mayor de 2 cm, tienen un significativo potencial maligno.

Durante la progresión de las lesiones proliferativas benignas a los neoplasmas malignos, tienen lugar varias alteraciones genéticas y epigenéticas. La mutación somática del gen APC parece ser uno de los hechos más tempranos en el 75 al 80% de los adenomas y carcinomas colorrectales. Se cree que la activación de K-RAS es una etapa de importancia fundamental en la progresión hacia el fenotipo maligno. Consecutivamente, se van acumulando las mutaciones en otros oncogenes, así como las alteraciones que conducen a la desactivación de los genes de supresión
tumoral.

La metilación anómala del ADN en las islas CpG se encuentra entre las alteraciones más tempranas y comunes en los tumores malignos humanos que conducen a la abrogación o la sobre-expresión de un amplio espectro de genes. Además, se ha demostrado que la metilación anormal tiene lugar en los elementos reguladores ricos en CpG en partes intrónicas y codificantes de los genes de ciertos tumores. Al contrario de la hipermetilación específica de genes de supresión tumoral, se puede observar una hipometilación global del ADN en las células tumorales. Esta disminución de la metilación global se puede detectar pronto, mucho antes del desarrollo de la manifestación del tumor. Además, se ha publicado la correlación entre la hipometilación y el aumento de la expresión génica para muchos oncogenes. En el cáncer de colon, la metilación anómala del ADN constituye una de las alteraciones más destacadas y desactiva muchos genes de supresión tumoral, tales como, p14ARF, p16INK4a, THBS1, MINT2 y MINT31, así como genes de reparación de apareamientos erróneos del ADN, tales como hMLH1.

En la evolución molecular del cáncer colorrectal, se ha sugerido que los errores de la metilación del ADN desempeñan dos papeles distintos. En las células de la mucosa de colon normal, los errores de la metilación se acumulan en función de la edad o de hechos que dependen del tiempo, predisponiendo estas células a la transformación neoplástica. Por ejemplo, se podría observar la hipermetilación de varios locus ya presente en adenomas, particularmente, en el subtipo tubulovelloso o velloso. En etapas posteriores, el aumento de la metilación del ADN de las islas CpG desempeña un importante papel en un subconjunto de tumores afectados por el denominado fenotipo metilador de islas CpG (CIMP). La mayoría de los tumores CIMP+, que constituyen aproximadamente el 15% de todos los cánceres colorrectales esporádicos, se caracteriza por la inestabilidad de los microsatélites (IM) debido a la hipermetilación del promotor hMLH1 y de otros genes de reparación de apareamientos erróneos del ADN. Por el contrario, los cánceres de colon CIMP- evolucionan por una ruta de inestabilidad genética más clásica (CIN), con una alta tasa de mutaciones de p53 y cambios cromosómicos.

Sin embargo, los subtipos moleculares no sólo muestran frecuencias variables respecto a las alteraciones moleculares. Según la presencia de bien inestabilidad de los microsatélites o anomalías cromosómicas, se puede subclasificar el cáncer de colon en dos clases, que también presentan diferencias clínicas significativas. Casi todos los tumores de IM se originan en el colon proximal (ascendente y transversal), mientras que el 70% de los tumores de CIN se localizan en el colon distal y en el recto. Esto ha sido atribuido a la prevalencia variable de los diferentes carcinógenos en las diferentes partes del colon. Se ha sugerido que los carcinógenos de metilación, que constituyen el carcinógeno prevaleciente en el colon proximal, desempeñan un papel en la patogénesis de los cánceres con IM, mientras que se cree que los tumores de CIN son causados más frecuentemente por los carcinógenos formadores de aductos, que tienen lugar con mayor frecuencia en partes distales del colon y del recto. Además, los tumores de IM tienen mejor pronóstico que los tumores con un fenotipo CIN, y responden mejor a la quimioterapia con adyuvantes.

La identificación de marcadores de la diferenciación del carcinoma de colon, así como la detección temprana son los objetivos principales de la investigación actual.

La 5-metilcitosina es la modificación de bases covalentes más frecuente en el ADN de las células eucariotas. Desempeña un papel en, por ejemplo, la regulación de la transcripción, en la huella genética y en la tumorigénesis. Por lo tanto, la identificación de la 5-metilcitosina como componente de la información genética es de un interés considerable. Sin embargo, no es posible identificar las posiciones de la 5-metilcitosina mediante la secuenciación, porque la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Además, la información epigenética portada por la 5-metilcitosina se pierde completamente durante la amplificación por PCR.

Un procedimiento relativamente nuevo y actualmente el más frecuentemente para el análisis de ADN para 5-metilcitosina se basa en la reacción específica de bisulfito con citosina que, tras la posterior hidrólisis alcalina, se convierte en uracilo que se corresponde con timidina en su comportamiento de apareamiento de bases. Sin embargo, la 5-metilcitosina permanece invariable en estas condiciones. Por consiguiente, el ADN original se convierte de tal manera que la metilcitosina, que originariamente no se podía distinguir de la citosina por su comportamiento de hibridación, ahora puede ser detectada como la única citosina restante usando técnicas biológicas moleculares "normales", por ejemplo, por amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas se basan en el apareamiento de bases que ahora se puede aprovechar completamente. En términos de sensibilidad, la técnica anterior está definida por un procedimiento que encierra el ADN por ser analizado en una matriz de agarosa, evitando así la difusión y la renaturalización del ADN (el bisulfito sólo reacciona con ADN monocatenario) y que reemplaza todas las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A., Oswald J., Walter J., "A Modified and Improved Method for Bisulphite Based Cytosine Methylation Analysis". Nucleic Acids Res. 15 de diciembre de 1996; 24(24): 5064-6). Usando este procedimiento, es posible analizar células individuales que ilustran el potencial del procedimiento. Sin embargo, actualmente, sólo se analizan regiones individuales de una longitud de hasta aproximadamente 3.000 pares de bases, no siendo posible un análisis global de las células para miles de posibles eventos de metilación. Sin embargo, este procedimiento tampoco puede analizar con fiabilidad fragmentos muy pequeños de cantidades de muestras pequeñas. Éstos se pierden a través de la matriz a pesar de la protección contra la difusión.

Es posible reunir una perspectiva general del resto de procedimientos conocidos para la detección de 5-metilcitosina en el siguiente artículo de una publicación: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Hasta la fecha, salvo unas pocas excepciones (p. ej., Zeschnigk M., Lich C., Buiting K., Doerfler W., Horsthemke B., "A Singletube PCR Test for the Diagnosis of Angelman and Prader-Willi Syndrome Based on Allelic Methylation Differences at the SNRPN", locus. Eur. J. Hum. Genet., Mar-Abr de 1997; 5(2):94-8), la técnica del bisulfito sólo se usa en investigación. Sin embargo, siempre se amplifican fragmentos específicos cortos de un gen conocido posteriormente a un tratamiento con bisulfito, y bien se secuencian completamente (Olek A., Walter J. "The Pre-implantation Ontogeny of the H19 Methylation", imprint. Nat Genet., noviembre de 1997; 17 (3):275-6) o se detectan las posiciones de las citosinas individuales mediante una reacción de prolongación de cebadores (Gonzalgo M.L., Jones P.A., "Rapid Quantitation of Methylation Differences at Specific Sites Using Methylation-Sensitive Single Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE)". Nucleic Acids Res., 15 de junio de 1997; 25(12):2529-31, WO 95/00669) o mediante digestión enzimática (Xiong Z., Laird P. W., "COBRA: A Sensitive and Quantitative DNA Methylation Assay", Nucleic Acids Res., 15 de junio de 1997; 25(12):2532-4). Además, también se ha descrito la detección por hibridación (Olek et al., WO 99/28498).

Otras publicaciones que tratan el uso de la técnica del bisulfito para la detección de la metilación en genes individuales son: Grigg G., Clark S. "Sequencing 5-Methylcytosine Residues in Genomic DNA", Bioessays. Junio de 1994; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M., Schmitz B., Dittrich B., Buiting K., Horsthemke B., Doerfler W., "Imprinted Segments in the Human Genome: Different DNA Methylation Patterns in the Prader-Willi/Angelman Syndrome Region as Determined by the Genomic Sequencing Method", Hum. Mol. Genet., marzo de 1997; 6(3):387-95; Feil R., Charlton J., Bird A.P., Walter J., Reik W., "Methylation Analysis on Individual Chromosomes: Improved Protocol for Bisulphite Genomic Sequencing", Nucleic Acids Res., 25 de febrero de 1994; 22(4): 695-6; Martin V., Ribieras S., Song-Wang X., Rio M. C., Dante R., "Genomic Sequencing Indicates a Correlation Between DNA Hypomethylation in the 5' Region of the pS2 Gene and its Expression in Human Breast Cancer Cell Lines", Gene., 19 de mayo de 1995; 157(1-2):261-4; WO 97/46705 y WO 95/15373.

Es posible reunir una perspectiva general de la técnica anterior sobre la fabricación de matrices oligoméricas de una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volumen 21, enero de 1999), publicado en enero de 1999 y de la bibliografía citada en tal suplemento.

Habitualmente, se usan sondas marcadas fluorescentemente para escanear las matrices de ADN inmovilizadas. La unión simple de los colorantes Cy3 y Cy5 al OH de 5' de la sonda específica es particularmente adecuada para los marcadores de la fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, se encuentran comercialmente disponibles.

La espectrometría de masas por ionización de desorción por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas M., Hillenkamp F., "Laser Desorption Ionisation of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10,000 Daltons", Anal Chem., 15 de octubre de 1988; 60(20):2299-301). Se embebe un analito en una matriz de absorción de luz. Se evapora la matriz mediante un pulso corto de láser, transportando así la molécula de analito a la fase de vapor de una manera no fragmentada. El analito es ionizado por las colisiones con las moléculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones en el tubo de vuelo libre de campo. Debido a sus diferentes masas, los iones son acelerados a diferentes velocidades. Los iones más pequeños alcanzan el detector antes que los más grandes.

La espectrometría MALDI-TOF está adaptada de manera excelente al análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut I. G., Beck S., "DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Mass Spectrometry". Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). La sensibilidad a los ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces peor que a los péptidos, y disminuye desproporcionadamente al aumentar el tamaño del fragmento. Para los ácidos nucleicos que tienen una estructura cargada negativamente múltiplemente, el procedimiento de ionización por medio de la matriz es considerablemente menos eficaz. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz desempeña un papel eminentemente importante. Para la desorción de los péptidos, se han descubierto varias matrices muy eficaces que producen una cristalización muy fina. Ahora hay varias matrices sensibles para el ADN, sin embargo, la diferencia en la sensibilidad no se ha reducido. Es posible reducir la diferencia en la sensibilidad modificando químicamente el ADN de tal manera que se vuelva más similar a un péptido. Los ácidos nucleicos de fosforotioato en los que se han sustituido los fosfatos habituales de la estructura por tiofosfatos se pueden convertir en un ADN de carga neutra usando una química de alquilación simple (Gut I.G., Beck S., "A Procedure for Selective DNA Alkylation and Detection by Mass Spectrometry". Nucleic Acids Res., 25 de abril de 1995; 23(8):1367-73). El acoplamiento de una etiqueta de carga con este ADN modificado da como resultado un aumento de la sensibilidad hasta el mismo nivel que el encontrado para los péptidos. Otra ventaja del etiquetado de cargas es el aumento de la estabilidad del análisis frente a las impurezas, que hacen la detección de los sustratos no modificados considerablemente más difícil.

Usando procedimientos estándar, se obtiene ADN genómico del ADN de muestras celulares, tisulares y de otras muestras analíticas. Esta metodología estándar se encuentra en referencias, tales como Sambrook, Fritsch y Maniatis eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989.

Young et al., (en Young J. et al., "HPP1: a Transmembrane Protein-Encoding Gene Commonly Methylated in Colorectal Polyps and Cancers"; J. Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., enero de 2001, 2:98(1):265-70) describen el uso de la metilación de HPP1 (TPEF) en diversos trastornos proliferativos de células de colon, en el que la metilación se determina como una característica de la evolución neoplástica.

Goessl et al. (en Goessl et al., "DNA-Based Detection of Prostate Cancer in Blood, Urine an Ejaculates". Annals of the New York Academy of Sciences, vol 945, N.º 1, septiembre de 2001, pp 51-58) describen el uso de la GSTP1 como un marcador de la metilación para detectar el cáncer de próstata en sangre, orina y eyaculados.

Descripción

La invención proporciona un procedimiento para detectar y diferenciar entre los trastornos proliferativos de las células de colon que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una muestra de fluido corporal que contiene ADN genómico; b) extraer dicho ADN genómico; c) convertir las bases de citosina de dicha muestra de ADN genómico que están desmetiladas en la posición 5, mediante tratamiento, en uracilo u otra base que sea diferente a la citosina en términos del comportamiento en el apareamiento de bases; y d) identificar el estado de metilación de una o más posiciones de las citosinas del gen TPEF y/o sus regiones reguladoras.

La presente invención pone a disposición un procedimiento para determinar parámetros genéticos y/o epigenéticos del ADN genómico. El procedimiento es para su uso en la mejora del diagnóstico, del tratamiento y del control de los trastornos proliferativos de células de colon, más específicamente, permitiendo la mejor identificación de y la diferenciación entre las subclases de dicho trastorno y la predisposición genética de dichos trastornos. La invención presenta mejoras frente al estado de la técnica en tanto en cuanto permite una clasificación muy específica de los carcinomas de colon, permitiendo de ese modo un mejor tratamiento y con fundamento de los pacientes.

En una realización particularmente preferida, la presente invención pone a disposición procedimientos que permiten la diferenciación entre el carcinoma de colon, el adenoma de colon y el tejido de colon normal.

Además, el procedimiento permite el análisis de las metilaciones de las citosinas y los polimorfismos de un solo nucleótido.

El gen que forma la base de la presente invención se puede usar para formar un "panel de genes", i.e., una colección que comprende las secuencias genéticas particulares de la presente invención y/o sus respectivos sitios de metilación informativos. La formación de los paneles de genes permite la realización de un análisis rápido y específico de los trastornos con los que están relacionados. Los paneles de genes descritos en esta invención se pueden usar con una eficacia sorprendentemente alta para el diagnóstico, el tratamiento y el control, así como el análisis de los trastornos proliferativos de células de colon según lo descrito en la presente memoria. El uso de múltiples sitios CpG de una matriz diversa de genes permite un grado relativamente elevado de sensibilidad y especificidad en comparación con las herramientas de diagnóstico y detección de un solo gen. Además, el panel según lo descrito en la presente memoria se puede adaptar para su uso en el análisis de muchos aspectos de los trastornos proliferativos de células de
colon.

En una realización preferida, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

En la primera etapa del procedimiento, se debe aislar la muestra de ADN genómico de fluidos corporales. La extracción puede realizarse mediante procedimientos que son estándar para cualquier experto en la técnica, incluyendo éstos el uso de lisados de detergente, tratamiento ultrasónico y movimientos vorticiales con perlas de vidrio. Una vez extraídos los ácidos nucleicos, se usa el ADN bicatenario genómico en el análisis.

En una realización preferida, se puede escindir el ADN antes de la siguiente etapa del procedimiento, pudiendo hacerse mediante cualquier procedimiento estándar en el estado de la técnica, en concreto, pero no limitándose a, un procedimiento con endonucleasas de restricción.

En la segunda etapa del procedimiento, la muestra de ADN genómico se trata de una manera tal que las bases de citosina que están desmetiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina u otra base que es diferente a la citosina en términos del comportamiento en la hibridación. Esto se entenderá como "pretratamiento" de aquí en adelante.

El tratamiento descrito anteriormente del ADN genómico se lleva a cabo preferiblemente con bisulfito (sulfito, disulfito) y la posterior hidrólisis alcalina que da como resultado una conversión de las nucleobases de citosina no metiladas en uracilo o en otra base que es diferente a la citosina en términos del comportamiento en el apareamiento de bases. Si se usa solución de bisulfito para la reacción, entonces tiene lugar una adición en las bases de citosina no metiladas. Además, debe estar presente un reactivo de desnaturalización o un disolvente, así como un interceptor de radicales. Entonces se produce una hidrólisis alcalina con posterioridad a la conversión de las nucleobases de citosina no metiladas en uracilo. Luego se usa el ADN convertido químicamente para la detección de citosinas
metiladas.

Se amplifican los fragmentos del ADN pretratado usando conjuntos de oligonucleótidos cebadores según SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368, y una polimerasa preferiblemente estable al calor. Debido a consideraciones estadísticas y prácticas, se amplifican preferiblemente más de diez fragmentos diferentes que tienen una longitud de 100-2.000 pares de bases. La amplificación de varios segmentos de ADN se puede llevar a cabo simultáneamente en una y la misma cuba de reacción. Habitualmente, la amplificación se lleva a cabo por medio de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El procedimiento también puede ser posibilitado por el uso de cebadores alternativos, siendo el diseño de tales cebadores obvio para cualquier experto en la técnica. Éstos deberían incluir al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son inversamente complementarias o idénticas a un segmento de una longitud de al menos 18 pares de bases de las secuencias de bases especificadas en el apéndice (SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368). Dichos oligonucleótidos cebadores se caracterizan preferiblemente por no contener ningún dinucleótido CpG. En una realización particularmente preferida del procedimiento, la secuencia de dichos oligonucleótidos cebadores está diseñada para que se aparee selectivamente con y amplifique sólo el ADN específico del tejido de colon de interés, minimizando así la amplificación del ADN de fondo o del ADN no relevante. En el contexto de la presente invención, el ADN de fondo pretende significar el ADN genómico que no tiene un patrón de metilación específico del tejido relevante, siendo, en este caso, el de colon el tejido relevante, tanto sano como enfermo.

Según la presente invención, es preferible que haya al menos un oligonucleótido cebador unido a una fase sólida durante la amplificación. Se pueden disponer las diferentes secuencias de oligonucleótido y/o oligómero de ANP sobre una fase sólida plana en forma de una retícula rectangular o hexagonal, estando la superficie de la fase sólida compuesta preferiblemente por silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro, siendo posible también el uso de otros materiales, tales como nitrocelulosa o plásticos.

Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden portar un marcador directa o indirectamente detectable. Se prefieren los marcadores en forma de marcadores de fluorescencia, radionucleidos o fragmentos de moléculas separables que tienen una masa típica que puede ser detectada en un espectrómetro de masas, prefiriéndose que los fragmentos que sean producidos tengan una sola carga neta positiva o negativa para detectarlos mejor en el espectrómetro de masas. La detección se puede llevar a cabo y visualizarse por medio de espectrometría de masas de desorción/ionización en matriz inducida por láser (MALDI) o usando una espectrometría de masas por electrospray (IES).

Los fragmentos amplificados obtenidos en la segunda etapa del procedimiento son posteriormente hibridados con una matriz o un conjunto de oligonucleótidos y/o sondas de ANP. En este contexto, la hibridación tiene lugar preferiblemente de la manera que se describe a continuación. El conjunto de sondas usado durante la hibridación está preferiblemente compuesto por al menos 10 oligonucleótidos u oligómeros de ANP. Sin embargo, se entiende y también se reivindica que el procedimiento se puede realizar usando sólo un oligonucleótido o una sonda de ANP. En el procedimiento, los fragmentos amplificados se hibridan con los oligonucleótidos previamente unidos a la fase sólida. Los oligonucleótidos se pueden tomar del grupo que comprende SEC ID N.º 65 a SEC ID N.º 132 y SEC ID N.º 519 a SEC ID N.º 1.030. Los oligonucleótidos también se pueden tomar del grupo que comprende SEC ID N.º 895 a SEC ID N.º 1.030. Los fragmentos no hibridados son posteriormente retirados. Dichos oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de 10 nucleótidos que es inversamente complementaria o idéntica a un segmento de las secuencias de bases especificadas en el apéndice, segmento que contiene al menos un dinucleótido CpG o TpG. En otra realización preferida, la citosina del dinucleótido CpG, o en el caso de TpG, la tiamina, es el 5º o 9º nucleótido desde el extremo 5' del 10 mero. Existe un oligonucleótido por cada dinucleótido CpG o
TpG.

En la quinta etapa del procedimiento, se retiran los fragmentos amplificados no hibridados.

En la etapa final del procedimiento, se detectan los fragmentos amplificados hibridados. En este contexto, es preferible que los marcadores unidos a los fragmentos amplificados sean identificables en cada posición de la fase sólida en la que hay localizada una secuencia de oligonucleótido.

Según la presente invención, es preferible que los marcadores de los fragmentos amplificados sean marcadores de fluorescencia, radionucleidos o fragmentos de moléculas separables que tengan una masa típica que pueda ser detectada en un espectrómetro de masas. Para la detección de los fragmentos amplificados, trozos de los fragmentos amplificados o de las sondas que son complementarias a los fragmentos amplificados, se prefiere el espectrómetro de masas, siendo posible llevar a cabo y visualizar la detección por medio de espectrometría de masas de desorción/ionización en matriz inducida por láser (MALDI) o usando una espectrometría de masas por electrospray (IES). Los fragmentos producidos pueden tener una sola carga neta positiva o negativa para detectarlos mejor en el espectrómetro de
masas.

El procedimiento anteriormente mencionado se usa preferiblemente para determinar parámetros genéticos y/o epigenéticos del ADN genómico.

Para posibilitar este procedimiento, la invención describe además el ADN modificado de los genes MDR1, APOC2, CACNA1G, EGR4, AR, RB1, GPIb beta, MYOD1, WT1, HLA-F, ELK1, APC, BCL2, CALCA, CDH1, CDKN1A, CDKN1B (p27 Kip1), CDKN2a, CDKN2B, CD44, CSPG2, DARK1, EGFR, EYA4, GSTP1, GTBP/MSH6, HIC-1, HRAS, IGF2, LKB1, MGMT, MLH1, MNCA9, MSH3, MYC, N33, PAX6, PGR, PTEN, RARB, SFN, S100A2, TGFBR22, TIMP3, TP53, TP73, VHL, CDKN1C, CAV1, CDH13, DRG1, PTGS2, THBS1, TPEF (= TMEFF2; = HPP1), DNMT1, CEA, MB, PCNA, CDC2 , ESR1, CASP8, RASSF1, MSH4, MSH5, así como los oligonucleótidos y/o oligómeros de ANP para detectar las metilaciones de las citosinas de dichos genes. La presente invención se basa en el descubrimiento de que los parámetros genéticos y epigenéticos y, en concreto, los patrones de metilación de las citosinas de ADN genómico son particularmente adecuados para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control de los trastornos proliferativos de células de colon. Además, la invención permite la diferenciación entre las diferentes subclases de trastornos proliferativos de células de colon o la detección de una predisposición a padecer trastornos proliferativos de células de colon.

Los ácidos nucleicos según lo descrito se pueden usar para el análisis de parámetros genéticos y/o epigenéticos del ADN genómico.

Este objetivo se consigue según la presente invención usando un ácido nucleico que contiene una secuencia de al menos 18 bases de longitud del ADN genómico pretratado según una entre SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368, y las secuencias complementarias a las mismas.

El ácido nucleico modificado podía, hasta este momento, no estar relacionado con la determinación de los parámetros genéticos y epigenéticos relevantes para estas enfermedades.

La presente invención describe además un oligonucleótido o un oligómero para el análisis del ADN pretratado, para detectar el estado de la metilación de las citosinas genómicas, conteniendo dicho oligonucleótido al menos una secuencia de bases que tenga una longitud de al menos 10 nucleótidos que se hibride con un ADN genómico pretratado según la SEC ID N.º 133 a la SEC ID N.º 388. Las sondas de oligómero constituyen herramientas importantes y eficaces que, por primera vez, hacen posible la determinación de parámetros genéticos y epigenéticos específicos durante el análisis de muestras biológicas para las características asociadas con el desarrollo de trastornos proliferativos de células de colon. Dichos oligonucleótidos permiten la mejora del diagnóstico, del tratamiento y del control de los trastornos proliferativos de células de colon, y la detección de la predisposición a dichos trastornos. Además, permiten la diferenciación de las diferentes subclases de trastornos proliferativos de células de colon. La secuencia de bases de los oligómeros contiene preferiblemente al menos un dinucleótido CpG o TpG. Las sondas también pueden existir en forma de un ANP (ácido nucleico peptídico) que tenga propiedades de apareamiento particularmente preferidas. Los particularmente preferidos son los oligonucleótidos según la presente invención en los que la citosina del dinucleótido CpG es el 5º-9º nucleótido desde el extremo 5' del 13 mero; en el caso de los oligómeros de ANP, es preferible que la citosina del dinucleótido CpG sea el 4º-6º nucleótido desde el extremo 5' del 9 mero.

Los oligómeros según la presente invención se usan normalmente en los denominados "conjuntos" que contienen al menos un oligómero por cada uno de los dinucleótidos CpG en la SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368. Se prefiere un conjunto que contenga al menos un oligómero por cada uno de los dinucleótidos CpG seleccionado entre SEC ID N.º 65 a SEC ID N.º 132 y SEC ID N.º 519 a SEC ID N.º 1.030. Se prefiere más una selección de entre el conjunto que comprende la SEC ID N.º 895 a SEC ID N.º 1.030.

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En el caso de los conjuntos de oligonucleótidos según la presente invención, es preferible que al menos un oligonucleótido esté unido a una fase sólida. Es más preferible que todos los oligonucleótidos de un conjunto estén unidos a una fase sólida.

La presente invención se refiere además a un conjunto de preferiblemente al menos 10 n (oligonucleótidos y/o oligómeros de ANP) usado para detectar el estado de metilación de las citosinas del ADN genómico usando versiones tratadas de dicho ADN genómico (según la SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368, y secuencias complementarias a las mismas). Sin embargo, se entiende y también se reivindica que el procedimiento se puede realizar usando sólo un oligonucleótido o un oligómero de ANP. Estas sondas permiten mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control de los trastornos proliferativos de células de colon. Particularmente, permiten la diferenciación entre las diferentes subclases de trastornos proliferativos de células de colon y la detección de una predisposición a padecer dichos trastornos. En una realización particularmente preferida, el conjunto comprende SEC ID N.º 65 a SEC ID N.º 132 y SEC ID N.º 519 a SEC ID N.º 1.030.

También se puede usar el conjunto de oligómeros para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (PSN) usando ADN genómico pretratado según una entre SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368.

En la presente memoria, se describe una disposición de diferentes oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP (la denominada "matriz") presente de tal manera que asimismo está unida a una fase sólida. Esta matriz de las diferentes secuencias de oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP se puede caracterizar por estar dispuesta sobre una fase sólida en forma de una retícula rectangular o hexagonal. La superficie de la fase sólida está compuesta preferiblemente por silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro. Sin embargo, la nitrocelulosa, así como los plásticos tales como el nylon, que existen en forma de nódulos o también como matrices de resina son alternativas adecuadas.

En la presente memoria, se describe un procedimiento para la fabricación de una matriz fijada a un material vehículo para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control de los trastornos proliferativos de células de colon, para la diferenciación entre las diferentes subclases de trastornos proliferativos de células de colon y/o la detección de una predisposición a padecer trastornos proliferativos de células de colon. En dicho procedimiento, se acopla al menos un oligómero como los descritos a una fase sólida. Los procedimientos para la fabricación de tales matrices son conocidos, por ejemplo, a partir de la patente estadounidense n.º 5.744.305, por medio de química en fase sólida y grupos protectores fotolábiles.

En la presente memoria, se describe un chip de ADN para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control de los trastornos proliferativos de células de colon. Además el chip de ADN permite la detección de una predisposición a padecer trastornos proliferativos de células de colon y la diferenciación entre las diferentes subclases de trastornos proliferativos de células de colon. El chip de ADN contiene al menos un ácido nucleico según lo descrito. Los chips de ADN se conocen, por ejemplo, por la patente estadounidense n.º 5.837.832.

Además, en la presente memoria se describe un equipo que puede estar compuesto, por ejemplo, por un reactivo que contiene bisulfito, un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contiene al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias corresponden en cada caso o son complementarias a un segmento de 18 bases de longitud de las secuencias de bases especificadas en el apéndice (SEC ID N.º 133 a SEC ID N.º 388), oligonucleótidos y/u oligómeros de ANP, así como las instrucciones para llevar a cabo y evaluar el procedimiento descrito. Sin embargo, un equipo como el descrito también puede contener sólo parte de los componentes anteriormente men-
cionados.

Los oligómeros o las matrices de los mismos, así como un equipo como el descrito están destinados a ser usados para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control de los trastornos proliferativos de células de colon. Además, el uso de dichas invenciones se extiende a la diferenciación entre las diferentes subclases de trastornos proliferativos de células de colon y a la detección de una predisposición a padecer trastornos proliferativos de células de colon. Según la presente invención, el procedimiento se usa preferiblemente para el análisis de los parámetros genéticos y/o epigenéticos importantes del ADN genómico, en particular, para su uso en la mejora del diagnóstico, del tratamiento y del control de los trastornos proliferativos de células de colon, la detección de la predisposición a padecer dichos trastornos y la diferenciación entre las subclases de dichos trastornos.

Los procedimientos según la presente invención se usan, por ejemplo, para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el control de la progresión de los trastornos proliferativos de células de colon, para la detección de la predisposición a padecer dichos trastornos y para la diferenciación entre las subclases de dichos trastornos.

Otra realización de la invención es un procedimiento para el análisis del estado de metilación del ADN genómico del gen TPEF sin la necesidad de un pretratamiento. En la primera etapa del procedimiento, se debe aislar la muestra de ADN genómico de fluidos corporales. La extracción puede realizarse mediante procedimientos que son estándar para cualquier experto en la técnica, incluyendo éstos el uso de lisados de detergente, tratamiento ultrasónico y movimientos vorticiales con perlas de vidrio. Una vez extraídos los ácidos nucleicos, se usa el ADN bicatenario genómico en el análisis.

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En una realización preferida, se puede escindir el ADN antes del tratamiento, pudiendo hacerse esto mediante cualquier procedimiento estándar en el estado de la técnica, en particular, con endonucleasas de restricción. En una segunda etapa, se digiere entonces el ADN con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación. La digestión se lleva a cabo tal que la hidrólisis del ADN en el sitio de restricción aporta información sobre el estado de metilación de un dinucleótido CpG específico.

En la tercera etapa, se amplifican los fragmentos de restricción. En una realización preferida, esto se lleva a cabo usando una reacción en cadena de la polimerasa.

En la etapa final, se detectan los fragmentos amplificados. La detección se puede realizar mediante cualquier procedimiento estándar en la técnica, por ejemplo, pero no limitándose a, análisis de electroforesis sobre gel, análisis de hibridación, incorporación de etiquetas detectables en los productos de PCR, análisis de matrices de ADN, análisis MALDI o IES.

La presente invención se refiere además al diagnóstico y/o al pronóstico de eventos que son perjudiciales o relevantes para los pacientes o individuos en los que es posible comparar parámetros genéticos y/o epigenéticos importantes del ADN genómico, siendo dichos parámetros obtenidos por medio de la presente invención, con otro conjunto de parámetros genéticos y/o epigenéticos, sirviendo las diferencias como base para el diagnóstico y/o el pronóstico de eventos que son perjudiciales o relevantes para los pacientes o los individuos.

En el contexto de la presente invención, el término "hibridación" debe ser entendido como un enlace de un oligonucleótido con una secuencia completamente complementaria a lo largo de las líneas de apareamientos de bases de Watson-Crick en el ADN de muestra, formando una estructura de dúplex.

En el contexto de la presente invención, los "parámetros genéticos" son mutaciones y polimorfismos del ADN genómico y de las secuencias que se requieren además para su regulación. Se designan como mutaciones, en concreto, las inserciones, las eliminaciones, las mutaciones puntuales, las inversiones y los polimorfismos, prefiriéndose particularmente los PSN (polimorfismos de un solo nucleótido).

En el contexto de la presente invención "análisis del estado de la metilación" pretende significar el análisis de las citosinas de un ácido nucleico destinado a determinar si están metiladas o no. En el contexto de la presente invención, los "parámetros epigenéticos" son, en particular, metilaciones de citosinas y otras modificaciones de bases de ADN de ANP genómico y de las secuencias que se requieren además para su regulación. Otros parámetros epigenéticos incluyen, por ejemplo, la acetilación de histonas, que no se puede analizar directamente mediante el uso del procedimiento descrito, pero que, a su vez, se correlaciona con la metilación del ADN.

A continuación, la presente invención será explicada más detalladamente en base a las secuencias y a los ejemplos, sin que por ello esté limitada a los mismos.

La SEC ID N.º 1 a la SEC ID N.º 64 representan las regiones 5' y/o reguladoras del ADN genómico de los genes MDR1, APOC2, CACNA1G, EGR4, AR, RB1, GPIb beta, MYOD1, WT1, HLA-F, ELK1, APC, BCL2, CALCA, CDH1, CDKN1A, CDKN1B (p27 Kip1), CDKN2a, CDKN2B, CD44, CSPG2, DARK1, EGFR, EYA4, GSTP1, GTBP/MSH6, HIC-1, HRAS, IGF2, LKB1, MGMT, MLH1, MNCA9, MSH3, MYC, N33, PAX6, PGR, PTEN, RARB, SFN, S100A2, TGFBR2, TIMP3, TP53, TP73, VHL, CDKN1C, CAV1, CDH13, DRG1, PTGS2, THBS1, TPEF (= TMEFF2; = HPP1), DNMT1, CEA, MB, PCNA, CDC2, ESR1, CASP8, RASSF1, MSH4, MSH5. Estas secuencias derivan de la base de datos ensembl (fecha 01.10.2001) (http://www.ensembl.org) y se considerará que incluyen todas las variaciones menores del material secuencial que actualmente no están previstas, por ejemplo, pero no limitándose a, las eliminaciones menores y los PSN.

La SEC ID N.º133 a 388 muestran las secuencias pretratadas del ADN derivado de los genes MDR1, APOC2, CACNA1G, EGR4, AR, RB1, GPIb beta, MYOD1, WT1, HLA-F, ELK1, APC, BCL2, CALCA, CDH1, CDKN1A, CDKN1B (p27 Kip1), CDKN2a, CDKN2B, CD44, CSPG2, DAPK1, EGFR, EYA4, GSTP1, GTBP/MSH6, HIC-1, HRAS, IGF2, LKB1, MGMT, MLH1, MNCA9, MSH3, MYC, N33, PAX6, PGR, PTEN, RARB, SFN, S100A2, TGFBR2, TIMP3, TP53, TP73, VHL, CDKN1C, CAV1, CDH13, DRG1, PTGS2, THBS1, TPEF (= TMEFF2; = HPP1), DNMT1, CEA, MB, PCNA, CDC2, ESR1, CASP8, RASSF1, MSH4, MSH5. Se considerará que estas secuencias incluyen todas las variaciones menores del material secuencial que actualmente no están previstas, por ejemplo, pero no limitándose a, las eliminaciones menores y los PSN.

La SEC ID N.º 389 a SEC ID N.º 518 presentan las secuencias de los oligonucleótidos cebadores para la amplificación del ADN pretratado según la SEC ID N.º 133 a la SEC ID N.º 388.

La SEC ID N.º 65 a la SEC ID N.º 132 presentan las secuencias de los oligómeros que son útiles para el análisis de las posiciones de CpG en el ADN genómico según SEC ID N.º 1 a SEC ID N.º 64.

La SEC ID N.º 519 a la SEC ID N.º 1.030 presentan las secuencias de los oligómeros que son útiles para el análisis del estado de metilación de las posiciones de CpG en el ADN genómico según SEC ID N.º 1 a SEC ID N.º 64 tras el tratamiento de dicho ADN genómico con bisulfito.

La SEC ID N.º 895 a la SEC ID N.º 1.030 presentan las secuencias de los oligómeros que son particularmente útiles para el análisis de las posiciones de CpG en el ADN genómico según SEC ID N.º 1 a SEC ID N.º 64, tras el tratamiento de dicho ADN genómico con bisulfito, y son objeto de una realización preferida de esta invención.

Descripción de las figuras

Figura 1: Diferenciación entre tejido sano de colon y tejido de adenoma o carcinoma de colon según el ejemplo 2. Las etiquetas del lado izquierdo de la gráfica son identificadores de genes y CpG, pudiendo ser referenciados de forma cruzada usando la tabla 3 y la tabla 7. Las etiquetas del lado derecho de la figura proporcionan la relevancia (valor p y test T) de la diferencia entre las medias de los dos grupos. Cada fila corresponde a un solo CpG y cada columna a los niveles de metilación de una muestra. Los CpG están ordenados según su contribución a la diferenciación entre los dos tipos de tejidos (A = sano, B = no sano), aumentado la contribución de arriba a abajo. El color negro indica la metilación total en una determinada posición de CpG, el blanco representa la falta de metilación en una determinada posición, estando los grados de metilación representados en color gris, de gris claro (baja proporción de metilación) a gris oscuro (alta proporción de metilación).

Figura 2: Diferenciación entre tejido sano de colon y tejido de carcinoma de colon según el ejemplo 2. Las etiquetas del lado izquierdo de la gráfica son identificadores de genes y CpG, pudiendo ser referenciados de forma cruzada usando la tabla 4 y la tabla 7. Las etiquetas del lado derecho de la figura proporcionan la relevancia (valor p y test T) de la diferencia entre las medias de los dos grupos. Cada fila corresponde a un solo CpG y cada columna a los niveles de metilación de una muestra. Los CpG están ordenados según su contribución a la diferenciación entre los dos tipos de tejidos (A = sano, B = carcinoma) aumentado la contribución de arriba a abajo. El color negro indica la metilación total en una determinada posición de CpG, el blanco representa la falta de metilación en una determinada posición, estando los grados de metilación representados en color gris, de gris claro (baja proporción de metilación) a gris oscuro (alta proporción de metilación).

Figura 3: Diferenciación entre tejido sano de colon y tejido de adenoma de colon según el ejemplo 2. Las etiquetas del lado izquierdo de la gráfica son identificadores de genes y CpG, pudiendo ser referenciados de forma cruzada usando la tabla 5 y la tabla 7. Las etiquetas del lado derecho proporcionan la relevancia (valor p y test T) de la diferencia entre las medias de los dos grupos. Cada fila corresponde a un solo CpG y cada columna a los niveles de metilación de una muestra. Los CpG están ordenados según su contribución a la distinción con respecto al diagnóstico diferencial entre los dos tipos de tejidos (A = sano, B = adenoma) aumentado la contribución de arriba a abajo. El color negro indica la metilación total en una determinada posición de CpG, el blanco representa la falta de metilación en una determinada posición, estando los grados de metilación representados en color gris, de gris claro (baja proporción de metilación) a gris oscuro (alta proporción de metilación). Debido al formato de la página, en esta figura sólo se muestran 40 CpG.

Figura 4: Diferenciación entre tejido de carcinoma de colon y el tejido de adenoma de colon según el ejemplo 2. Las etiquetas del lado izquierdo de la gráfica son identificadores de genes y CpG, pudiendo ser referenciados de forma cruzada usando la tabla 6 y la tabla 7. Las etiquetas del lado derecho proporcionan la relevancia (valor p y test T) de la diferencia entre las medias de los dos grupos. Cada fila corresponde a un solo CpG y cada columna a los niveles de metilación de una muestra. Los CpG están ordenados según su contribución a la distinción con respecto al diagnóstico diferencial entre los dos tipos de tejidos (A = carcinoma, B = adenoma) aumentado la contribución de arriba a abajo. El color negro indica la metilación total en una determinada posición de CpG, el blanco representa la falta de metilación en una determinada posición, estando los grados de metilación representados en color gris, de gris claro (baja proporción de metilación) a gris oscuro (alta proporción de metilación).

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Ejemplos 1 y 2

Fenotipo digital

En los siguientes ejemplos, se llevó a cabo una PCR multiplex sobre muestras de tejido originarias de adenomas de colon o de carcinoma de colon. La PCR multiplex también se llevó a cabo sobre tejido sano de colon. Se trató cada una de las muestras de la manera descrita más adelante en el ejemplo 1 para deducir el estado de metilación de las posiciones de CpG, siendo recopilada la información sobre la metilación de CpG de cada muestra y luego usada en un análisis, como se describe detalladamente en el ejemplo 2. En el ejemplo 3, se describe un procedimiento alternativo para el análisis del estado de metilación de CpG según lo descrito en el ejemplo 3.

Ejemplo 1

En la primera etapa, se aisló el ADN genómico de las muestras celulares usando el equipo Wizzard de (Promega).

Se trata el ADN genómico aislado de las muestras usando una solución de bisulfito (hidrógeno sulfito, bisulfito). El tratamiento es tal que todas las citosinas no metiladas de la muestra son convertidas en tiamidina y, por el contrario, las citosinas 5-metiladas de la muestra permanecen invariables.

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Entonces se amplificaron los ácidos nucleicos tratados usando varias PCR multiplex, amplificando 8 fragmentos por reacción con cebadores marcados fluorescentemente con Cy5. En la tabla 1, se describen los cebadores de PCR. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes:

Solución de reacción:

: 10 ng ADN tratado con bisulfito

: MgCl_{2} 3,5 mM

: varios dNTP 400 \muM

: 2 pmoles de cada cebador

: 1 U de Taq Hot Star (Qiagen)

Se llevaron a cabo cuarenta ciclos como se explica a continuación. Desnaturalización a 95ºC durante 15 min, seguida por un apareamiento a 55ºC durante 45 s, alargamiento de cebadores a 65ºC durante 2 min. Se llevó a cabo un alargamiento final a 65ºC durante 10 min.

Entonces se hibridaron todos los productos de PCR de cada muestra individual con portaobjetos de vidrio que portaban un par de oligonucleótidos inmovilizados para cada posición de CpG sometida a análisis. Cada uno de estos oligonucleótidos de detección fue diseñado para que se hibridara con la secuencia convertida con bisulfito alrededor de un sitio de CpG que originariamente estaba bien desmetilado (TG) o metilado (CG). Para más información, véase la tabla 2 de todos los oligonucleótidos de hibridación usados (tanto los informativos como los que no informativos). Las condiciones de hibridación se seleccionaron para que permitieran la detección de las diferencias de un solo nucleótido entre las variantes TG y CG.

Se diluyó un volumen de 5 \mul de cada producto de PCR multiplex en 10 x tampón de Ssarc (10 x Ssarc: 230 ml; 20 x SSC; 180 ml de solución de lauril-sarcosinato de sodio al 20%, diluido hasta 1.000 ml con H_{2}Od). Entonces se hibridó la mezcla de reacción con los oligonucleótidos de detección según lo siguiente. Desnaturalización a 95ºC, enfriamiento hasta 10ºC, hibridación a 42ºC durante una noche seguida por el lavado con 10 x Ssarc y H_{2}Od a
42ºC.

Se detectaron señales fluorescentes procedentes de cada oligonucleótido hibridado usando un escáner y un programa informático genepix. Se calcularon las proporciones para las dos señales (la procedente del oligonucleótido CG y la procedente del oligonucleótido TG usados para analizar cada posición de CpG) en base a la comparación de la intensidad de las señales fluorescentes.

Ejemplo 2

Entonces se clasifican los datos obtenidos según el ejemplo 1 en una matriz ordenada (según lo mostrado en las figuras 1 a 4) según las diferencias en la metilación de los CpG entre las dos clases de tejidos, usando un algoritmo. Las posiciones de CpG de mayor relevancia están en la parte inferior de la matriz, disminuyendo la relevancia hacia la parte superior. El color negro indica la metilación total en una determinada posición de CpG, el blanco representa la falta de metilación en una determinada posición, estando los grados de metilación representados en color gris, de gris claro (baja proporción de metilación) a gris oscuro (alta proporción de metilación). Cada fila representa una posición de CpG específica de un gen y cada columna muestra el perfil de metilación para los diferentes CpG de una muestra. En el lado izquierdo, se muestra un identificador de CpG y de gen que puede ser referenciado de forma cruzada con las tablas anexas (tabla 1 y 7) para determinar el gen en cuestión y el oligómero de detección usado. En el lado derecho, se muestran los valores p para las posiciones de CpG individuales. Los valores p son las probabilidades de que la distribución observada tenga lugar por casualidad en el conjunto de datos.

Para las distinciones seleccionadas, se formó un algoritmo de aprendizaje (máquina de soporte vectorial, SVM). La SVM (según lo tratado por F. Model, P. Adorjan, A. Olek, C. Piepenbrock, "Feature selection for DNA methylation based cancer classification". Bioinformatics. Junio de 2001; 17 Supl. 1: S157-64) construye un discriminante óptimo entre dos clases de muestras de formación ofrecidas. En este caso, cada muestra se describe mediante los patrones de metilación (proporciones entre CG/TG) en los sitios de CpG investigados. La SVM fue preparada sobre un subconjunto de muestras de cada clase, que fueron presentadas junto con el diagnóstico. Entonces se presentaron muestras analíticas independientes que no habían sido mostradas a la SVM antes para evaluar si es posible predecir correctamente el diagnóstico en base al predictor creado en la serie de preparación. Se repitió este procedimiento varias veces usando diferentes divisiones de las muestras, un procedimiento denominado validación cruzada. Cabe destacar que todas las series se realizan sin usar ninguno de los conocimientos obtenidos en las series anteriores. Se calculó la media del número de clasificaciones correctas frente a todas las series, lo que proporcionó una buena estimación de la exactitud analítica (porcentaje de muestras clasificadas correctas frente a todas las series).

Tejido sano de colon comparado con tejido no sano de colon (adenoma de colon y carcinoma de colon) (Figura 1)

La figura 1 muestra la diferenciación entre el tejido sano y el tejido no sano, en la que las muestras no sanas se obtienen de tejido bien de adenoma de colon o de carcinoma de colon. La evaluación se lleva a cabo usando posiciones de CpG informativos procedentes de 27 genes. Las posiciones de CpG informativos se describen más detalladamente en la tabla 3.

Tejido sano de colon comparado con tejido de carcinoma de colon (Figura 2)

La figura 2 muestra la diferenciación entre el tejido sano y el tejido de carcinoma usando posiciones de CpG informativos procedentes de 15 genes. Las posiciones de CpG informativos se describen más detalladamente en la tabla 4.

Tejido sano de colon comparado con tejido de adenoma de colon (Figura 3)

La figura 3 muestra la diferenciación entre el tejido sano y el tejido de adenoma usando posiciones de CpG informativos procedentes de 40 genes. Las posiciones de CpG informativos se describen más detalladamente en la tabla 5.

Tejido de carcinoma de colon comparado con tejido de adenoma de colon (Figura 4)

La figura 4 muestra la diferenciación entre el tejido de carcinoma y el tejido de adenoma usando posiciones de CpG informativos procedentes de 2 genes. Las posiciones de CpG informativos se describen más detalladamente en la tabla 6.

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Ejemplo 3 Identificación del estado de metilación de un sitio de CpG del gen CD44

Se amplificó por PCR un fragmento del ADN tratado con bisulfito del gen CD44 (SEC ID N.º 20) usando los cebadores GAAAGGAGAGGTTAAAGGTTG (SEC ID N.º 429) y AACTCACTTAACTCCAATCCC (SEC ID N.º 430). El fragmento resultante (696 pb de longitud) contenía un CpG informativo en la posición 235. Se digirió el ADN amplificado con la endonucleasa de restricción Apa I, sitio de reconocimiento GGGCC. La hidrólisis realizada por dicha endonucleasa es bloqueada por la metilación del CpG en la posición 235 del fragmento amplificado. El fragmento digerido se usó como control.

Se aisló el ADN genómico de la muestra usando el equipo de aislamiento de ADN DNA Wizzard (Promega). Cada muestra fue digerida usando Apa I según las recomendaciones del fabricante (New England Biolabs).

Entonces se amplificaron 10 ng de cada fragmento digerido genómico usando los cebadores de PCR GAAAG
GAGAGGTTAAAGGTTG y AACTCACTTAACTCCAATCCC. Las reacciones PCR se realizaron usando un termociclador (Eppendorf GmbH), usando 10 ng de ADN, 6 pmoles de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP, MgCl_{2} 1,5 mM y 1 U de HotstartTaq (Qiagen AG). El resto de las condiciones fueron según lo recomendado por el fabricante de la polimerasa de Taq. Usando los cebadores anteriormente mencionados, se amplificaron los fragmentos génicos por PCR realizando una primera etapa de desnaturalización durante 14 min a 96ºC, seguida por 30-45 ciclos (etapa 2: 60 s a 96ºC; etapa 3: 45 s a 52ºC; etapa 4: 75 s a 72ºC) y un posterior alargamiento final de 10 min a 72ºC. Se analizó la presencia de los productos de PCR mediante electroforesis sobre gel de agarosa.

Los productos de PCR fueron detectables con ADN hidrolizado por Apa I aislado en el que la posición de CpG en cuestión fue metilada secuencia arriba al repetirse la etapa 2 a la etapa 4 del programa de ciclos 34, 37, 39, 42 y 45 veces. Por el contrario, los productos de PCR sólo fueron detectable con ADN hidrolizado por Apa I aislado de ADN metilado secuencia abajo (y ADN control) al repetirse la etapa 2 a la etapa 4 del programa de ciclos 42 y 45 veces. Estos resultados se incorporaron en un análisis de matrices de metilación de CpG según lo descrito en el ejemplo 2.

Tablas TABLA 1 Cebadores y productos de la PCR

1

TABLA 1 (continuación)

2

TABLA 1 (continuación)

3

TABLA 1 (continuación)

4

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5

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6

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7

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8

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9

TABLA 2 Oligonucleótidos de hibridación

10

TABLA 2 (continuación)

11

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12

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15

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TABLA 3 Oligonucleótidos usados en la diferenciación entre tejido de adenomas o de carcinoma de colon y tejido de colon sano

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TABLA 3 (continuación)

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TABLA 4 Oligonucleótidos usados en la diferenciación entre tejido de carcinoma de colon y tejido de colon sano

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TABLA 4 (continuación)

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TABLA 4 (continuación)

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TABLA 5 Oligonucleótidos usados en la diferenciación entre tejido de adenoma de colon y tejido de colon sano

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TABLA 6 Oligonucleótidos usados en la diferenciación entre tejido de carcinoma de colon y tejido de adenoma de colon

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TABLA 7 Tabla de referenciación cruzada para relacionar los números usados en el marcaje de las figuras con los números ID usados a lo largo del documento

63

TABLA 7 (continuación)

64

TABLA 7 (continuación)

65

TABLA 7 (continuación)

66

TABLA 7 (continuación)

67

TABLA 7 (continuación)

68

Claims

1. Un procedimiento para detectar y diferenciar entre los trastornos proliferativos de las células de colon que comprende las siguientes etapas:

a): proporcionar una muestra de fluido corporal que contiene ADN genómico,

b): extraer dicho ADN genómico,

c): convertir las bases de citosina de dicha muestra de ADN genómico que están desmetiladas en la posición 5, mediante tratamiento, en uracilo o en otra base que sea diferente de la citosina en términos del comportamiento en el apareamiento de bases y

d): identificar el estado de metilación de una o más posiciones de citosina del gen TPEF y/o sus regiones reguladoras.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo es una solución de bisulfito, hidrógeno sulfito o disulfito.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los fragmentos de dicho ADN genómico pretratado son amplificados por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes de la etapa d).

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se amplifican más de diez fragmentos diferentes que tienen una longitud de 100-2.000 pares de bases.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa de amplificación se lleva a cabo usando al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son cada una inversamente complementarias o idénticas a un segmento de una longitud de al menos 18 pares de bases de una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa de amplificación amplifica de forma preferente ADN que es de particular interés en tejidos de colon sanos y/o enfermos, en base al estado de metilación genómica específica del tejido de colon, a diferencia del ADN de fondo.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la identificación del estado de metilación de una o más posiciones de citosina en base a dicha matriz implica una hibridación de cada fragmento amplificado con un oligonucleótido o un oligómero de ácido nucleico peptídico (ANP).

8. El procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque los fragmentos amplificados están marcados.

9. El procedimiento según la reivindicación 8 que comprende además detectar los fragmentos amplificados o fragmentos de los fragmentos amplificados mediante espectrometría de masas.

10. Un procedimiento para detectar y diferenciar entre los trastornos proliferativos de las células de colon que comprende las siguientes etapas:

a): proporcionar una muestra de fluido corporal que contiene ADN genómico,

b): extraer dicho ADN genómico,

c): digerir el ADN genómico del gen TPEF usando una enzima de restricción sensible a la metilación y

d): detectar los fragmentos de ADN generados en el fragmento digerido de la etapa d).

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el fragmento digerido de ADN es amplificado antes de la etapa d).

12. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la amplificación se lleva a cabo por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

13. El procedimiento según la reivindicación 11 ó 12, en el que la amplificación de más de un fragmento de ADN se lleva a cabo en una cuba de reacción.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho procedimiento diferencia entre tejido de colon normal y tejido de trastorno proliferativo celular de colon, diferencia entre tejido de adenoma de colon y tejido de colon normal, diferencia entre tejido de carcinoma de colon y tejido de colon normal o diferencia entre tejido de adenoma de colon y tejido de carcinoma de colon.

15. Uso de un panel de genes que comprende al menos un ácido nucleico diana seleccionado entre el gen TPEF (= TMEFF2; = HPP1) y/o sus regiones reguladoras para la detección de trastornos proliferativos de células de colon en fluidos corporales en un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

16. Uso de un panel de genes según la reivindicación 15, en el que dichos ácidos nucleicos diana se seleccionan del grupo que comprende SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368, y secuencias complementarias de las mismas.

17. Uso de un panel de genes según la reivindicación 15 ó 16, en el que dicho panel está presente en forma de una matriz de ácidos nucleicos o de ácidos nucleicos peptídicos para el análisis de trastornos proliferativos de células de colon asociados con el estado de metilación de dichos ácidos nucleicos diana.

18. Uso según la reivindicación 17, caracterizado porque la superficie de la fase sólida de dicha matriz está compuesta por silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro.

19. Uso de un oligonucleótido que contiene al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos que se hibrida con un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368 en un procedimiento según la reivindicación 1.

20. Uso de un oligonucleótido de una longitud de al menos 18 bases que se hibrida con un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por SEC ID N.º 239, 240, 367 y 368 en un procedimiento según la reivindicación 1.

21. Uso de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, en el que la secuencia de bases del mismo comprende al menos un dinucleótido CG o TG.