ES2325603T3 - Variantes de la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa con una inhibicion reducida por l-serina, y genes que las codifican. - Google Patents
Variantes de la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa con una inhibicion reducida por l-serina, y genes que las codifican. Download PDFInfo
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Abstract
3-fosfoglicerato deshidrogenasa (PGD) que tiene, en comparación con una PGD de tipo salvaje de Escherichia coli, una sensibilidad disminuida frente a una inhibición por serina, con una secuencia de aminoácidos, que corresponde a la de la PGD de tipo salvaje de Escherichia coli (SEQ ID NO: 2) salvo en la posición 349, caracterizada porque en la posición 349 se encuentra el aminoácido D.
Description
Variantes de la 3-fosfoglicerato
deshidrogenasa con una inhibición reducida por
L-serina, y genes que las codifican.
El invento se refiere a variantes de la
3-fosfoglicerato deshidrogenasa con una inhibición
reducida por L-serina, y a genes que las
codifican.
La preparación de los veinte aminoácidos
proteinógenos naturales se realiza hoy en día predominantemente por
fermentación de microorganismos. En este contexto, se aprovecha el
hecho de que los microorganismos disponen de unas correspondientes
rutas de biosíntesis para la síntesis de los aminoácidos
naturales.
Tales rutas de biosíntesis están sujetas, sin
embargo, en las cepas de tipos salvajes a un estricto control, que
garantiza que los aminoácidos se preparen solamente para el consumo
propio de la célula. Un importante mecanismo de control en muchas
biosíntesis es, por ejemplo, el fenómeno de la inhibición por
retroalimentación (en inglés feedback) (o inhibición por el
producto final). En este caso, en la mayoría de los casos la enzima
de una ruta de biosíntesis, que cataliza la reacción enzimática
iniciadora de esta ruta de biosíntesis, es inhibida por el producto
final de la ruta de biosíntesis. La inhibición tiene lugar en la
mayoría de los casos mediante una fijación alostérica del producto
final a la enzima y da lugar a una modificación de la conformación
en un estado inactivo. De esta manera, se asegura que, en el caso de
una acumulación del producto final en la célula, se reprima la
síntesis ulterior mediante una inhibición de la etapa
iniciadora.
Una producción industrial eficiente de productos
metabólicos (tales como p.ej. aminoácidos) es posible, por lo
tanto, solamente cuando se pueden suprimir las restricciones
mediante una inhibición por retroalimentación de una ruta
metabólica, y de esta manera se hacen disponibles unos
microorganismos que, al contrario que los organismos del tipo
salvaje, tienen un rendimiento de producción drásticamente aumentado
para la producción del deseado producto metabólico.
La familia de aminoácidos de los fosfogliceratos
es definida por el hecho de que se trata de unos aminoácidos, que
en su biosíntesis se derivan del ácido
3-fosfoglicérico. La ruta natural del metabolismo
conduce en tal caso primeramente, pasando por los compuestos
intermedios 3-fosfohidroxipiruvato y
3-fosfo-L-serina, a
la L-serina. La L-serina se puede
convertir ulteriormente en glicina o bien, pasando por la
O-acetil-serina, en la
L-cisteína. También se ha de contar el
L-triptófano como perteneciente a este grupo, puesto
que en la biosíntesis él se deriva asimismo de la
L-serina. Asimismo, los aminoácidos no naturales,
que son preparados según el procedimiento descrito en el documento
de solicitud de patente de los EE.UU. US 2002/0039767 A1, deben de
ser asignados a la familia de los fosfogliceratos.
Ciertos compuestos, que se derivan del
metabolismo de C1, muestran asimismo una dependencia con respecto de
la biosíntesis de los aminoácidos de la familia de los
fosfogliceratos. Esto se debe al hecho de que en el caso de la
conversión de L-serina en glicina, el
tetrahidrofolato actúa como aceptor de grupos C1 y el
tetrahidrofolato cargado participa, como donante central de grupos
metilo en el metabolismo de C1, en muchas biosíntesis (p.ej. de
L-metionina, nucleótidos, ácido pantoténico, etc.).
Conforme al invento, los compuestos que se derivan del metabolismo
de C1 son, de manera preferida, unos compuestos que dependen en su
biosíntesis de una transferencia de grupos C1 a través del ácido
tetrahidrofólico.
La etapa iniciadora de la biosíntesis de los
aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos es la oxidación
del ácido D-3-fosfoglicérico para
dar un 3-fosfohidroxipiruvato y es catalizada por la
enzima 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (PGD) [EC
1.1.1.95]. Como aceptor para los equivalentes de reducción, que
resultan en la reacción, sirve el NAD^{+}, que se hace reaccionar
para dar el NADH/H^{+}.
Se conocen enzimas PGD a partir de los
organismos más diversos (p.ej. Rattus norvegicus, Arabidopsis
thaliana, Escherichia coli, Bacillus subtilis). En este caso,
los representantes microbianos mejor caracterizados están sujetos a
una inhibición por retroalimentación por la
L-serina.
En el plano de la secuencia de aminoácidos, las
enzimas PGD microbianas son muy similares unas a otras en la parte
del terminal de N (aminoácidos 1-340 de la secuencia
de E. coli), al contrario de lo cual la parte del terminal
de C sólo tiene unas similaridades pequeñas. Precisamente en esta
parte del terminal de C está localizado el dominio regulador, que
es responsable de la inhibición por serina
(Peters-Wendisch y colaboradores, 2002, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 60: 437-441).
La PGD mejor caracterizada es la procedente de
Escherichia coli. La enzima se investigó detalladamente por
medios bioquímicos (Dubrow & Pizer, 1977, J. Biol. Chem. 252,
1.527-1.538) y está sujeta a una inhibición por
retroalimentación alostérica por la L-serina con una
constante del inhibidor K_{i} de 5 \muM.
Esta inhibición por retroalimentación se opone a
una producción eficiente de aminoácidos de la familia de los
fosfogliceratos y, por lo tanto, ya fue un objetivo de enfoques de
biología molecular.
Así, en el documento de solicitud de patente
europea EP0620853A se describieron unas variantes de la PGD de
Escherichia coli con una sensibilidad disminuida frente a la
inhibición por serina, que tienen una modificación en el 25%
terminal de C de la PGD de tipo salvaje (es decir los aminoácidos
307-410), de manera preferida una modificación en
la región de los últimos 50 radicales (es decir los aminoácidos
361-410). Los mutantes descritos se obtuvieron
mediante una mutagénesis con un engarzador, es decir, mediante un
aprovechamiento sencillo de los sitios de corte por restricción,
que están presentes en el gen serA de E. coli, y mediante
una subsiguiente inserción de engarzadores de oligonucleótidos, con
una longitud de 8-14 pares de bases.
Tales mutagénesis con engarzadores son, no
obstante, problemáticas en la mayoría de los casos, puesto que,
mediante la incorporación o respectivamente la supresión de varios
radicales, la estructura de la proteína es modificada muy
grandemente y de esta manera se influye negativamente sobre la
actividad total o la estabilidad de la proteína. Realmente, la
mayoría de los mutantes descritos en el documento EP0620853A
muestran una actividad apenas detectable.
También en microorganismos corineformes se
llevaron a cabo unas mutagénesis en el gen serA, que tenían el
objetivo de una disminución de la sensibilidad de la PGD frente a
una inhibición por serina:
- -
- Peters-Wendisch y colaboradores (2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:437-441) describen supresiones en el terminal de C de la PGD de Corynebacterium glutamicum. También en este caso, las supresiones conducen a unas mermas parcialmente fuertes de actividad enzimática.
- -
- El documento de solicitud de patente europea EP0943687A2 describe un intercambio del radical de ácido glutámico en la posición 325 de la PGD de Brevibacterium flavum. Este radical se encuentra, en relación con la PGD de Escherichia coli, en una concordancia (en inglés alignment) con el algoritmo GAP del programa GCG (de GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisconsin, EE.UU.) ya en la parte variable del terminal de C de la proteína y se correlaciona con el radical de asparagina 364 de la proteína de Escherichia coli. Puesto que esta modificación se encuentra en la parte variable del terminal de C de la PGD, no es posible sacar ninguna conclusión en cuanto a la proteína de Escherichia coli.
A partir de la cita bibliográfica de Grant
Gregory A. y colaboradores, Journal of Biological Chemistry, tomo
273, nº 35, del 28 de agosto de 1998, páginas 22389 - 22394 es
conocido que la variante G349W de la PGD de E. coli tiene
una sensibilidad esencialmente disminuida frente a una inhibición
por serina.
Al-Rabiee Regina y
colaboradores, Journal of Biological Chemistry, tomo 271, nº 22,
1996, páginas 13013 - 13017 divulgan una mutante doble A359C,
G349C, que tiene la misma actividad enzimática que la PGD de tipo
salvaje de E. coli, pero tiene una sensibilidad disminuida
por el factor de 100 frente a una inhibición por serina.
Fue misión del presente invento poner a
disposición una variante de la PGD de Escherichia coli, que
tenga una sensibilidad disminuida en comparación con la PGD de tipo
salvaje de Escherichia coli frente a una inhibición por
serina.
El problema planteado por esta misión es
resuelto mediante una 3-fosfoglicerato
deshidrogenasa (PGD), que tiene una sensibilidad disminuida en
comparación con la PGD de tipo salvaje de Escherichia coli,
frente a una inhibición por serina, con una secuencia de
aminoácidos, que corresponde a la de la PGD de tipo salvaje de
Escherichia coli (SEQ ID NO: 2) salvo en la posición 349,
caracterizada porque en la posición 349 se encuentra el aminoácido
D.
El invento se refiere además a una secuencia de
ADN que codifica una PGD conforme al invento. Este alelo serA se
diferencia del gen de la PGD de Escherichia coli (gen serA,
SEQ ID NO: 1) por el hecho de que el codón 349 codifica el
aminoácido natural D.
Las variantes de PGD, que poseen un intercambio
de aminoácidos en la posición 349, se pueden producir mediante
técnicas clásicas de la biología molecular. Para ello, en los
correspondientes codones se introducen unas mutaciones en el gen
serA, que codifica una PGD. Se conocen unos correspondientes métodos
para la introducción de mutaciones en posiciones específicas dentro
de un fragmento de ADN.
Como material de partida para la mutagénesis
sirve de manera preferida el ADN del gen serA de E. coli. El
gen serA, que se ha de mutar, puede ser codificado en el cromosoma o
fuera del cromosoma. De manera preferida, el gen serA es
amplificado, no obstante, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y es clonado en un vector. Mediante aplicación de
los métodos antes mencionados de mutagénesis, se modifican uno o
varios nucleótidos de la secuencia de ADN, de tal manera que la PGD
codificada tenga el aminoácido D en la posición 349, constituyendo
la metionina de partida la posición 1 de la SEQ ID NO: 1.
Estas mutaciones dan lugar a que la PGD
codificada posea una sensibilidad disminuida frente a una inhibición
por L-serina (= resistencia por retroalimentación).
En este caso, es especialmente ventajoso el hecho de que las
variantes conformes al invento de la PGD, en ausencia de
L-serina, tienen, en comparación con la PGD de tipo
salvaje, una actividad de más de un 10%, de manera preferida una
actividad inalterada.
Para la determinación del grado de la
resistencia por retroalimentación de una variante conforme al
invento de la PGD se puede aprovechar cualquier método que permita
determinar la actividad de la enzima en presencia de
L-serina. Por ejemplo, la determinación de la
actividad de la PGD se puede efectuar apoyándose en el método
descrito por McKitrick y Pizer (1980, J. Bacteriol.
141:235-245). La actividad enzimática se mide
basándose en la retrorreacción en una tanda, que contiene
fosfohidroxipiruvato y un NADH/H^{+}. La reacción se inicia
mediante adición de la enzima y se vigila en un fotómetro espectral
a través de la disminución de la extinción a 340 nm, que es
provocada por oxidación del NADH/H^{+}. La inhibición de la
actividad de la PGD se ensaya en presencia de diferentes
concentraciones de L-serina en la tanda de reacción.
La actividad catalítica de las diferentes variantes de PGD se
determina en presencia y en ausencia de L-serina, y
a partir de ella se determina la constante del inhibidor K_{i}.
La K_{i} describe la concentración del inhibidor en la que la
actividad sólo es de un 50% de la actividad, que se había
determinado en ausencia del inhibidor.
A causa de su resistencia frente a la
retroalimentación, la enzima PGD conforme al invento se puede
utilizar para la preparación de aminoácidos de la familia de los
fosfogliceratos o de compuestos, que se derivan del metabolismo de
C1. Para ello, el alelo serA conforme al invento se expresa en una
cepa anfitriona.
La expresión del alelo serA conforme al invento
se puede efectuar bajo el control del promotor propio, que está
localizado delante del gen serA, o mediando utilización de otros
sistemas promotores adecuados, que son conocidos para un experto en
la especialidad. En este caso, el correspondiente alelo se puede
encontrar, por ejemplo, bajo el control de un promotor de este
tipo, o bien en una copia o en varias copias, en el cromosoma del
organismo anfitrión. Las estrategias para la integración de genes en
el cromosoma son estado de la técnica. De manera preferida, el alelo
serA que se ha de expresar, es clonado, no obstante, en un vector,
de manera preferida en un plásmido.
El invento se refiere, por lo tanto, también a
un vector, que está caracterizado porque contiene un alelo serA
conforme al invento, que está bajo el control funcional de un
promotor.
Para la clonación del alelo serA conforme al
invento se pueden utilizar unos vectores, que ya contienen elementos
genéticos (p.ej. promotores constitutivos o regulables, y
terminadores), que o bien hacen posible una expresión persistente o
una expresión inducible, controlada, del gen que codifica la PGD.
Además, en un vector de expresión se encuentran de manera preferida
otros elementos reguladores tales como sitios de fijación a
ribosomas y secuencias de terminación, así como unas secuencias,
que codifican marcadores selectivos y/o genes reporteros. La
expresión de tales marcadores de selección facilita la
identificación de los transformantes. Como marcador de selección se
adecuan unos genes, que codifican una resistencia frente a p.ej.
ampicilina, tetraciclina, cloramfenicol, kanamicina u otros
antibióticos. Cuando el alelo serA conforme al invento se deba de
replicar fuera del cromosoma, el vector plasmídico deberá contener
de manera preferida un punto de origen de la replicación. Se
prefieren especialmente unos vectores plasmídicos tales como, por
ejemplo, los vectores de E. coli pACYC184, pUC18,
pQE-70, pBR322, pSC101 y sus derivados. Como
promotores inducibles se adecuan, por ejemplo, el promotor lac,
tac, trc, lambda PL, ara ó tet, o unas secuencias derivadas de
ellos.
Por lo demás, se prefieren especialmente unos
vectores plasmídicos, que ya contienen un gen/alelo, cuyo empleo
conduce asimismo a una sobreproducción de aminoácidos de la familia
de los fosfogliceratos o respectivamente de compuestos, que se
derivan del metabolismo de C1, tal como, por ejemplo, para la
producción de:
- -
- L-serina (p.ej. los genes serB, serC, el gen de vehículo de la exportación, tal como se describe en el documento de solicitud de patente alemana DE10044831A1)
- -
- N-acetil-serina, O-acetil-serina, cistina, cisteína o derivados de cisteína (p.ej. alelos cysE tales como los que se describen en el documento de solicitud de patente internacional WO97/15673, genes de eflujo, tales como los que se describen en el documento EP0885962A1, el gen cysB tal como se describe en el documento de patente alemana DE19949579C1, y el gen yfiK, tal como se describe en el documento DE10232930A)
- -
- L-triptófano (p.ej. alelos trpE, tal como se describen en el documento EP0662143A)
- -
- ácido pantoténico (p.ej. tal como se describe en el documento WO02061108).
Tales vectores hacen posible la producción
directa de cepas de microorganismos conformes al invento con un
alto rendimiento de producción a partir de una cepa arbitraria de
microorganismo, puesto que un plásmido de este tipo también da
lugar a la supresión de otras restricciones de la ruta metabólica en
un microorganismo.
Mediante un método habitual de transformación
(p.ej. una electroporación) los plásmidos conformes al invento, que
contienen un alelo serA, se introducen en microorganismos y se
seleccionan, por ejemplo, mediante la resistencia frente a
antibióticos, en clones que llevan plásmidos.
El invento se refiere, por consiguiente, también
a un procedimiento para la producción de una cepa de microorganismo
conforme al invento, que está caracterizado porque en una cepa de
microorganismo se introduce un vector conforme al invento.
También es posible introducir vectores con un
alelo serA conforme al invento en microorganismos, que por ejemplo
ya expresan en el cromosoma los genes/alelos individuales, antes
mencionados, o varios de ellos, y que ya tienen una sobreproducción
de un producto metabólico. En tales casos, mediante la introducción
de un alelo serA conforme al invento se puede aumentar de nuevo el
rendimiento de producción.
Por lo general, como microorganismo anfitrión
para vectores conformes al invento se adecuan todos los organismos,
que tienen la ruta de biosíntesis para aminoácidos de la familia de
los fosfogliceratos, que son accesibles a procedimientos
recombinantes y que se pueden cultivar por fermentación. Tales
microorganismos pueden ser hongos, levaduras o bacterias. De manera
preferida, pasan a emplearse bacterias del grupo filogenético de
las Eubacterias. Se prefieren especialmente los microorganismos de
la familia de las Enterobacteriaceae y en particular de la especie
Escherichia coli.
El invento se refiere por consiguiente además a
una cepa de microorganismo, que se adecua para la preparación por
fermentación de aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos o
de sus derivados, o respectivamente de compuestos, que se derivan
del metabolismo de C1, la cual está caracterizada porque ella posee
una PGD conforme al invento.
Un objeto adicional del invento es la
preparación de aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos o
respectivamente de compuestos, que se derivan del metabolismo de
C1, mediante cultivación de una cepa de microorganismo conforme al
invento.
Para ello, se cultiva la cepa de microorganismo
conforme al invento, por ejemplo, en un fermentador, en un medio
nutricio, que contiene una fuente adecuada de carbono y una fuente
adecuada de energía, así como otros aditivos.
Las sustancias que se han formado durante la
fermentación, tales como, por ejemplo,
L-fosfoserina, L-serina,
O-acetil-L-serina,
L-cisteína, glicina, L-triptófano,
1,2,4-triazol-2-il-L-alanina,
L-metionina o ácido pantoténico, se pueden purificar
a continuación.
Los siguientes Ejemplos sirven para la
explicación adicional del invento. Todos los procedimientos de
biología molecular que se emplean, tales como la reacción en cadena
de la polimerasa, el aislamiento y la purificación de ADN, la
modificación de un ADN mediante enzimas de restricción, mediante el
fragmento de Klenow y la ligasa, una transformación, etc., se
llevaron a cabo de la manera conocida para un experto en la
especialidad, que se describe en la bibliografía o que es
recomendada por los respectivos fabricantes.
El gen serA de la cepa W3110 de Escherichia
coli (American Type Culture Collection, ATCC27325) se amplificó
con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa. Como cebadores
específicos sirvieron los oligonucleótidos
El fragmento de ADN resultante se digirió con
las enzimas de restricción NdeI y HindIII y las partes
sobresalientes en 5' se rellenaron con una enzima de Klenow. A
continuación, el fragmento de ADN se purificó con ayuda de una
electroforesis en gel de agarosa y se aisló con el método GeneClean
(estuche GeneClean BIO101 P.O.Box (Caja postal) 2285 La Jolla,
California, EE.UU., 92.038-2.284). La clonación del
fragmento serA obtenido de esta manera se efectuó en el vector de
expresión pQE-70 (de Qiagen, Hilden, Alemania). Para
ello, el vector se cortó primeramente con SpHI y BamHI y la parte
sobresaliente en 3' se digirió con la enzima de Klenow, o
respectivamente la parte sobresaliente en 5' se rellenó con una
enzima de Klenow. A continuación, el fragmento de vector se
purificó y se ligó con el fragmento de serA. El vector resultante
lleva la denominación pFL209. Después de la verificación de la
construcción artificial por secuenciación, la cepa JM109 de
Escherichia coli (de Stratagene, Amsterdam, Holanda) se
transformó, y se seleccionaron con ampicilina unos correspondientes
transformantes. La cepa bacteriana Escherichia coli
JM109/pFL209 se depositó en la DSMZ (Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH = Colección alemana de
Microorganismos y Cultivos celulares GmbH) D-38142
Braunschweig, Alemania) bajo el número DSM 15628 en concordancia con
el Acuerdo de Budapest.
La mutagénesis específica para un sitio en el
codón 349 del gen serA se llevó a cabo mediante una reacción en
cadena de la polimerasa inversa. Como matriz sirvió el vector pFL209
que se ha descrito en el Ejemplo 1. Para la mutagénesis del codón
349 se utilizaron los cebadores
El producto obtenido de la PCR se circularizó
mediante ligación y se transformó en el seno de la cepa JM109 de
E. coli. Mediante secuenciación se determinó finalmente la
mutación en el codón 349 y se comprobó el carácter correcto de la
secuencia restante.
Para la determinación de las actividades
enzimáticas de PGD y de la influencia de L-serina
sobre la actividad, 100 ml de un medio LB (10 g/l de triptona, 5
g/l de un extracto de levadura, 10 g/l de NaCl), que contenía
adicionalmente 100 mg/l de ampicilina, se inocularon con 2 ml de un
cultivo durante la noche de las cepas con los alelos serA
codificados en plásmidos y se incubaron a 30ºC y 150 rpm en un
dispositivo sacudidor. Con una densidad óptica de 1,0 se indujo la
expresión de serA mediante adición de
isopropil-\beta-tiogalactósido
0,4 mM, y se incubó el cultivo durante otras 3 horas. A
continuación, las células se cosecharon mediante centrifugación, se
lavaron y se resuspendieron en 2 ml de un tampón (fosfato de K 100
mM, de pH 7,0; MgCl_{2} 10 mM; ditiotreitol 1 mM). La
disgregación de las células se efectuó con ayuda de una prensa
French Press (de Spectronic Instruments, Inc., Rochester, Nueva
York, EE.UU) a una presión de 18.000 psi (1.260 kg/cm^{2}). Los
extractos en bruto se clarificaron mediante centrifugación a 30.000
g y se determinó la actividad de PGD con el ensayo de McKitrick y
Pizer (1980, J. Bacteriol. 141: 235-245).
Las siguientes Tablas muestran la actividad de
PGD de diferentes mutantes, así como las correspondientes constantes
del inhibidor K_{i}.
<110> Consortium fuer elektrochemische
Industrie GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Variantes de la
3-fosfoglicerato deshidrogenasa con una inhibición
reducida por L-serina y genes que las codifican
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> mutantes de serA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(1.230)
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 410
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador para la PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\hskip1cm
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para la PCR
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<400> 4
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\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para la PCR
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<400> 5
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\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para la PCR
Claims (7)
1. 3-fosfoglicerato
deshidrogenasa (PGD) que tiene, en comparación con una PGD de tipo
salvaje de Escherichia coli, una sensibilidad disminuida
frente a una inhibición por serina, con una secuencia de
aminoácidos, que corresponde a la de la PGD de tipo salvaje de
Escherichia coli (SEQ ID NO: 2) salvo en la posición 349,
caracterizada porque en la posición 349 se encuentra el
aminoácido D.
2. Alelo serA que codifica una PGD de acuerdo
con la reivindicación 1, caracterizado porque él se
diferencia con respecto del gen de la PGD de Escherichia
coli (gen serA, SEQ ID NO: 1) en el hecho de que el codón 349
codifica el aminoácido natural D.
3. Vector, caracterizado porque él
contiene un alelo serA de acuerdo con la reivindicación 2 bajo el
control funcional de un promotor.
4. Procedimiento para la preparación de una cepa
de microorganismo, caracterizado porque en una cepa de
microorganismo se introduce un vector de acuerdo con la
reivindicación 3.
5. Cepa de microorganismo, que se adecua para la
preparación por fermentación de aminoácidos de la familia de los
fosfogliceratos o de sus derivados, o respectivamente de compuestos,
que se derivan del metabolismo de C1, caracterizada porque
ella posee una PGD de acuerdo con la reivindicación 1.
6. Procedimiento para la preparación de
aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos o respectivamente
de compuestos, que se derivan del metabolismo de C1, mediante
cultivación de una cepa de microorganismo de acuerdo con la
reivindicación 5.
7. Utilización de una PGD de acuerdo con la
reivindicación 1 para la preparación de aminoácidos de la familia
de los fosfogliceratos o de compuestos, que se derivan del
metabolismo de C1.
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