ES2325819T3

ES2325819T3 - Metodo para la purificacion del inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1pi).

Info

Publication number: ES2325819T3
Application number: ES06776720T
Authority: ES
Inventors: Peter Matthiessen; Gerald Brachtl; Peter Turecek; Hans-Peter Schwarz
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Priority date: 2005-08-11
Filing date: 2006-08-09
Publication date: 2009-09-18
Anticipated expiration: 2026-08-09
Also published as: AU2006278143A1; US7807435B2; EP1913024A1; EP1913024B1; WO2007017277A1; AU2006278143B2; HK1119185A1; ATE431365T1; JP5091862B2; CA2614838A1; JP2012140452A; JP2009504594A; DE602006006840D1; WO2007017277A8; US20070037270A1

Abstract

Método para la purificación del inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl) de una fracción proteica, que comprende los pasos de: a) proporcionar una fracción proteica congelada que comprende a1Pl, b) descongelarla a una temperatura ambiente de 2-25ºC hasta que la fracción proteica haya alcanzado la temperatura ambiente, c) incubarla durante 4 horas como mínimo a una temperatura ambiente de 2-25ºC, y d) someterla a un paso de lavado.

Description

Método para la purificación del inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl)

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la purificación del inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl) a partir de fracciones proteicas. De forma más específica, la invención se refiere a un método mejorado para la purificación de inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl) caracterizado porque se puede aumentar la producción de a1Pl mediante la descongelación de la materia de partida y su incubación durante varias horas antes de someterla a un paso de lavado.

Antecedentes de la invención

El inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl), también denominado alfa-I-antitripsina (AAT), es un inhibidor glicopeptídico de las proteasas, y se encuentra en suero humano y otros fluidos. La inhibición de la proteasa por una a1Pl es un componente esencial de la regulación de la proteolisis en los tejidos, y la carencia de a1Pl está implicada en la patología de diversas enfermedades. Los individuos que heredan una carencia de a1Pl, por ejemplo, tienen mayor riesgo de padecer enfisema grave precoz como resultado de la destrucción no regulada del tejido pulmonar por la elastasa de los leucocitos humanos. Se ha demostrado que la administración de a1Pl exógena humana inhibe la elastasa y se asocia a la supervivencia y a la reducción de la velocidad de disminuación de la función pulmonar en pacientes carentes de a1Pl (Crystal y col., Ain. J. Respir. Crit. Care Med. 158: 49-59 (1998); R. Mahadeva y D. Lomas, Thorax 53: 501-505 (1998) para información).

Debido a su utilidad terapéutica, la producción comercial de a1Pl ha sido objeto de importantes investigaciones. Se han realizado muchos progresos en la producción de AAT recombinante en E. coli (R. Bischoff y col., Biochemistry 30: 3464-3472 (1991)), levaduras (K. Kwon y col., J. Biotechnology 42: 191-195 (1995); Bollen y col., patente de Estados Unidos 4.629.567) y plantas (J. Huang y col., Biotechnol. Prog. 17: 126-33 (2001)), y por secreción láctea en mamíferos transgénicos (G. Wright y col., Biotechnology, 9: 830-834 (1991); A. L. Archibald, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5178-5182 (1990)).

Sin embargo, el aislamiento de la a1Pl a partir de plasma humano es actualmente el método práctico más eficaz para obtener a1Pl en grandes cantidades, siendo el plasma humano la única fuente aprobada por la FDA.

Se han descrito numerosos procesos para aislar y purificar la a1Pl a partir de fracciones de plasma humano, los cuales implican combinaciones de etapas de precipitación, adsorción, extracción y cromatografía.

En los procesos más conocidos de aislamiento de la a1Pl se empieza por una o más fracciones de plasma humano conocidas, tales como precipitados de la fracción IV de Cohn, por ejemplo fracción IV-1 o fracción IV1-4, que se obtienen del plasma en forma de una pasta después de una serie de precipitaciones con etanol y ajustes del pH (E. J. Cohn y col., J. Amer. Chem. Soc., 68: 459-475 (1946)).

M. H. Coan y col., Vox Sang., 48(6): 333-342 (1985) describen un método en el cual se purificó a1Pl a partir de una pasta congelada de la fracción IV-1 de Cohn mediante precipitación con polietilenglicol y cromatografía en DEAE-Sepharose. R. H. Hein y col., Eur. Respir. J. Suppl., 9: 16s-20s (1990) utilizaron también una pasta de Cohn IV-1 como materia de partida para la producción comercial de a1Pl en un proceso similar al que se describe en Coan y col.

La WO-95/35306 revela un método que se inicia a partir de un precipitado de la fracción IV_{1}+IV_{4} de Cohn obtenido tal como se describe aquí, el cual se somete a una precipitación con polietilenglicol/ZnCl_{2}. Dicha precipitación es seguida de otra precipitación con ZnCl_{2} antes de aplicar el precipitado resolubilizado a una columna de QAE.

La WO 98/00154 muestra un proceso en el cual se incluye un paso de lavado posterior al fraccionado de Cohn y anterior a someter el material que comprende la a1Pl a otros pasos de procesamiento. En este método, la pasta IV_{1}+IV_{4} se suspende en agua o en una solución salina. Las proteínas solubles que incluyen albúmina, globulinas tales como alfa-1-globulina y beta-globulina se separan entonces de las proteínas insolubles que comprenden la a1Pl mediante filtración, centrifugación o similares. El residuo se lava con agua o con una solución salina para eliminar la proteína soluble adicional físicamente atrapada en la pasta insoluble. De forma similar a la descrita en la WO 95/35306, el material se somete entonces a precipitaciones con PEG y ZnCl_{2} y se aplica en un paso de cromatografía de intercambio iónico.

Tal como se ha mencionado anteriormente, se han descrito en la técnica diversos otros procesos para la a1Pl a partir de fracciones de plasma humano.

Sin embargo, aunque la a1Pl resulta un tratamiento eficaz para el enfisema debido a la carencia de alfa-1-antitripsina, el tratamiento es muy costoso (actualmente de unos \textdollar25.000 al año), debido al suministro limitado y al complejo proceso de fabricación. Siguen siendo necesarios más métodos eficaces y rentables para aislar la a1Pl humana a partir de plasma. La presente invención de enfoca en esta necesidad.

Sumario de la invención

La invención se dirige a un método mejorado para la purificación del inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl) a partir de fracciones proteicas caracterizado porque se puede aumentar la producción de a1Pl mediante descongelación e incubación de la fracción proteica a una temperatura ambiente de 2-25ºC. El método para la purificación del inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl) a partir de fracciones proteicas comprende los pasos de proporcionar una fracción proteica congelada que incluye la a1Pl, descongelarla a una temperatura ambiente de 2-25ºC hasta que la fracción proteica haya alcanzado la temperatura ambiente e incubar la fracción proteica descongelada durante al menos 4 horas a una temperatura ambiente de 2-25ºC antes de someterla a un paso de lavado. De acuerdo con el método de la presente invención, la producción de a1Pl puede incrementarse notablemente debido a una reducción de la pérdida de a1Pl durante el paso posterior de lavado.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un método para la purificación del inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl) a partir de una fracción proteica que comprende los pasos de proporcionar una fracción proteica congelada que incluye a1Pl, descongelarla a una temperatura ambiente de 2-25ºC hasta que la fracción proteica haya alcanzado la temperatura ambiente, incubar dicha fracción proteica descongelada durante al menos 4 horas a la temperatura ambiente de 2-25ºC y someterla a un paso de lavado.

Las fracciones proteicas pueden proceder de diversas fuentes. Entre las fuentes útiles se incluyen plasma, a1Pl producida por métodos recombinantes o cualquier otra fuente que comprenda a1Pl.

Existen múltiples métodos conocidos en la técnica para precipitar proteínas a partir de una solución, por ejemplo mediante la adición de sales, alcoholes y polietilenglicol, a menudo en combinación con un enfriamiento y varios ajustes del pH. La separación del precipitado de la solución se puede llevar a cabo por centrifugación, filtración o similar. Cuando se utiliza la filtración como método de separación, se puede emplear la ayuda de un filtro. Medios filtrantes útiles son los CELPURE, que comprenden un 96 - 98% de SiO_{2}.

La presente invención será aplicable a la mayoría de los precipitados proteicos que incluyan la a1Pl con la actividad recuperable de la a1Pl. El término "fracción proteica" tal como se utiliza aquí se refiere al precipitado proteico que comprende la a1Pl preparado por medio de uno o varios de estos métodos conocidos.

Las fracciones proteicas útiles para la presente invención incluyen fracciones de plasma precipitadas con etanol tales como, por ejemplo, la fracción IV de Cohn, como la fracción IV_{1} y/o la fracción IV_{4}, la fracción IV_{1}+IV_{4} de Cohn y la fracción IV-1,4 de Cohn. La fracción proteica puede comprender además una composición de más de una fracción plasmática.

En una realización de la presente invención, la fracción proteica es de origen humano.

Las fracciones proteicas se pueden almacenar congeladas a temperaturas ambiente > -20ºC, por ejemplo a 4-8ºC, hasta su procesamiento posterior. De acuerdo con una realización de la presente invención, las fracciones proteicas congeladas incluyen partes de aproximadamente 0,05 kg de pasta de Cohn en forma de un bloque con un tamaño de aproximadamente 4 x 4 x 3 cm^{3}, partes de aproximadamente 0,6 kg de pasta de Cohn en forma de un bloque con un tamaño de aproximadamente 8 x 8 x 9 cm^{3}. La fracción proteica se puede almacenar también en recipientes de plástico de 10 litros con un tamaño de aproximado 32 x 21 x 15 cm^{3}.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la fracción proteica congelada se descongela a una temperatura ambiente de 2-25ºC hasta que la fracción proteica haya alcanzado la temperatura ambiente.

Tal como se utiliza aquí, el término fracción proteica "descongelada" se refiere a una fracción proteica que ha alcanzado la temperatura ambiente. En consecuencia, el término "descongelación" se refiere al proceso de incubar la fracción proteica congelada a una temperatura ambiente por encima de la temperatura de congelación hasta que toda la fracción proteica haya alcanzado dicha temperatura ambiente.

Ejemplos de temperaturas ambiente útiles para descongelar la fracción proteica incluyen aquellas temperaturas que no superen los 15ºC, que no excedan los 8ºC y no sobrepasen los 5ºC. Una temperatura ambiente útil es de aproximadamente 4ºC.

En una realización de la presente invención, la descongelación se puede acelerar triturando la fracción proteica congelada.

El período de tiempo necesario hasta que la fracción proteica haya alcanzado la temperatura ambiente depende de varios parámetros, tales como la masa de la fracción proteica, la forma de la fracción proteica congelada, la temperatura a la cual se ha almacenado la fracción proteica antes de la descongelación, así como la temperatura ambiente a la cual se descongela la fracción proteica.

\newpage

La descongelación se puede controlar colocando sensores de temperatura en la fracción proteica. Los sensores se pueden colocar tanto en la superficie como dentro de la fracción proteica. La información procedente de los sensores de temperatura se puede utilizar para determinar los períodos de tiempo de descongelación e incubación de la fracción proteica.

En una realización de la presente invención, la fracción proteica se incuba durante al menos 4 horas contando desde aquel momento en el que se descongela la fracción proteica, es decir que ha alcanzado la temperatura ambiente. En otra realización de la presente invención, la fracción proteica descongelada se incuba durante al menos 8 horas. En otra realización de la presente invención, la fracción proteica descongelada se incuba durante al menos 15 horas. En otra realización de la presente invención, la fracción proteica descongelada se incuba durante 16 a 19 horas. De acuerdo con otra realización de la invención, el período de incubación puede durar hasta 52 horas.

Posteriormente, la fracción proteica se somete a un paso de lavado.

El término "paso de lavado" tal como se emplea aquí se refiere a un proceso en el cual se eliminan otras proteínas, tales como albúmina, globulinas y/u otras impurezas. El paso de lavado de acuerdo con la presente invención incluye la suspensión de la fracción proteica en agua o en una solución salina. El agua utilizada para el paso de lavado puede ser agua purificada, tal como agua para inyección (WFI). La solución salina puede ser, por ejemplo, una solución de NaCl desde aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,15M. La cantidad de agua o de solución salina puede ser de 5 \pm 2 partes por cada parte de fracción proteica.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el paso de lavado se lleva a cabo a una temperatura inferior a aproximadamente 15ºC y durante un período de tiempo de aproximadamente 1 hora como mínimo.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el pH de la suspensión de lavado se ajusta posteriormente a aproximadamente 5,5 \pm 0,2. Según otra realización de la presente invención el pH de la suspensión de lavado se ajusta posteriormente a aproximadamente 6,0 \pm 0,2.

Se podría demostrar que las pérdidas de a1Pl durante el paso de lavado podrían reducirse ajustando el pH a un nivel inferior después de la suspensión en agua. Cuando se descongela e incuba la pasta congelada antes de someterla al paso de lavado, no es necesario bajar el pH del paso de lavado, ya que la pérdida de a1Pl se puede reducir.

De acuerdo con una realización de la presente invención, las proteínas solubles, incluyendo albúmina, alfa-2-globulina y beta-globulina, se separan entonces de las proteínas insolubles, incluyendo el inhibidor de la proteinasa alfa-1, mediante un filtro prensa, por centrifugación o similar.

En una realización de la presente invención, se puede añadir un medio filtrante. Un medio filtrante útil es un filtro de diatomita de alto rendimiento y gran pureza que comprende un 96 - 98% de SiO_{2} tal como CELPURE.

En otra realización de la presente invención, el paso de lavado descrito anteriormente se puede realizar varias veces para eliminar la proteína soluble adicional físicamente retenida en el residuo insoluble. De acuerdo con una realización de la presente invención, la fracción proteica se lava dos veces.

Cuando se añade un medio filtrante, éste se puede añadir al final del primer paso de lavado antes de empezar la filtración.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la fracción proteica lavada se somete a pasos posteriores de purificación hasta obtener una preparación farmacéutica final.

Los pasos posteriores de purificación a utilizar de acuerdo con una realización de la presente invención consisten en una precipitación con polietilenglicol (PEG), seguida de una precipitación con ZnCl_{2}, una inactivación viral mediante tratamiento con disolvente-detergente, una cromatografía de intercambio aniónico y un tratamiento posterior del eluato que comprende la a1Pl.

La precipitación con PEG se puede llevar a cabo resuspendiendo el residuo de proteínas insolubles en aproximadamente 5 \pm 2 volúmenes de agua a pH 8,5 \pm 0,5 por volumen de residuo, a una temperatura de aproximadamente 15ºC \pm 5ºC, preferentemente durante 6 horas aproximadamente, aunque se pueden utilizar tiempos más cortos o más largos. Se añade entonces Tris sólido hasta una concentración final de 10 \pm 5 mM y se añade NaCl sólido hasta una concentración final de 150 \pm 20 mM y se ajusta el pH a 8,0. Luego se añade polietilenglicol 3350 hasta una concentración final del 15 \pm 5% en peso/peso y se mezcla a aproximadamente 15 \pm 5ºC durante aproximadamente 1 hora para precipitar la alfa-2-globulina.

El precipitado de PEG que se forma se elimina con un filtro prensa. El filtro prensa se lava antes y después de la filtración con una disolución que contiene 150 \pm 25 mM de NaCl y un 15 \pm 5% en peso/peso de PEG a un pH de
8,0 \pm 0,5. Alternativamente, el precipitado se puede eliminar por centrifugación.

La precipitación con ZnCl_{2} se puede llevar a cabo mediante la adición de ZnCl_{2} (100 \pm 10 mM) al sobrenadante de PEG hasta una concentración final de 6 \pm 5 mM y se ajusta el pH de la solución a 7,5 \pm 0,5. La solución se enfría a aproximadamente 5 \pm 5ºC y se mezcla durante aproximadamente 1 hora como mínimo. El ZnCl_{2} precipita a1Pl bruta. La a1Pl bruta se concentra por filtración, por ejemplo mediante filtración Prostak^{TM}, tal como se describe en "Prostak Open-Channel Modules", de Millipore Corporation, que se incorpora aquí como referencia, o por centrifugación y se elimina el filtrado. La suspensión concentrada o precipitada se puede congelar para un procesamiento
posterior.

Para la inactivación viral, la alfa-1-Pl bruta se resolubiliza en NaEDTA aproximadamente 50 mM a través de Prostak por recirculación. Se añade un azúcar, por ejemplo sacarosa, en una cantidad de aproximadamente un 15 \pm 5% en peso/peso (o Na_{3}citrato aproximadamente 0,25 \pm 0,05M) como estabilizante durante la inactivación viral. Se mezcla la solución a 15 \pm 5ºC hasta que se disuelve la sacarosa.

La solución que incluye la a1Pl es inactivada frente a los virus mediante un tratamiento con disolvente-detergente (SD). Se añade una solución al 10 \pm 1% en peso/volumen de polisorbital 80 y un 3 \pm 0,3% en peso/peso de fosfato de tri-n-butilo a la solución de a1Pl hasta una concentración final del 1,0 \pm 0,5% en peso/volumen de polisorbato 80 y un 0,3 \pm 0,15% en peso/peso de fosfato de tri-n-butilo. La solución se incuba entonces a 27 \pm 3ºC, pH 8 \pm 0,5, durante no menos de 6 horas para inactivar todo virus que pueda estar presente en la a1Pl.

Se ha descubierto que la presencia de azúcar, por ejemplo sacarosa, como estabilizante, durante la inactivación viral por tratamiento con disolvente-detergente aumenta la producción de a1Pl en unidades en comparación con un control, esto es una solución de a1Pl inactivada contra los virus con el disolvente-detergente sin azúcar como estabilizante. El incremento de producción puede ser de al menos un 10%, al menos un 20% o al menos un 30%.

Después de dicha incubación, la solución tratada de a1Pl se enfría a 0 - 10ºC y se ajusta el pH a 8,0 \pm 0,1.

La cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo mediante la dilución de la solución tratada con SD con aproximadamente 1 volumen de agua por volumen de solución tratada con SD. La solución diluida se aplica entonces a un medio de cromatografía QAE pre-equilibrada o a otro medio similar de intercambio aniónico que una la a1Pl, permitiendo que otras proteínas se separen de la a1Pl. Se puede utilizar una cromatografía discontinua o en columna. Después de que la a1Pl haya sido absorbida en el medio, se lava con un tampón que comprende NaCl 20 \pm 10 mM y fosfato sódico (NaH_{2}PO_{4}) 20 \pm 10 mM a un pH 8 \pm 1 para eliminar el material no unido, incluyendo las beta-proteínas. Se eluye entonces la a1Pl del medio de cromatografía de intercambio aniónico con un lavado de elución que comprende NaCl 100 \pm 50 mM y fosfato sódico 20 \pm 10 mM, a un pH 8 \pm 1. El eluato que incluye la a1Pl se recoge para un procesamiento posterior.

Después de la retirada de la a1Pl, se limpia el medio de intercambio iónico mediante lavado secuencial con: una solución acuosa que comprende NaCl 2 \pm 0,2 M, fosfato sódico 20 \pm 10 mM, pH 8 \pm 1; entonces agua para inyección (WFI); después con una disolución acuosa que comprende NaOH 500 mM; y finalmente WFI. Entonces, se almacena el medio de cromatografía en NaCl 2 \pm 0,2 M, fosfato sódico 20 \pm 10 mM, pH 8 \pm 1.

El tratamiento posterior del eluato que comprende la a1Pl se lleva a cabo combinando los eluatos que comprenden la a1Pl y tratando con un 0,1 a 1,0% en peso/peso de bentonita, durante una hora aproximadamente o más, para reducir la cantidad de apolipoproteína, por ejemplo a hasta menos de aproximadamente 0,01 mg/ml de apolipoproteína A y menos de aproximadamente 0,01 mg/ml de apolipoproteína B. La bentonita se elimina por filtración, preferentemente por filtración Cuno®, por ejemplo tal como se describe en "Zeta Plus® C Series Filter Medium" por Cuno Inc., que se incorpora aquí como referencia. La solución resultante se concentra por ultrafiltración hasta que la actividad de la a1Pl sea de al menos 21,5 mg de a1Pl activa/ml. El producto concentrado se filtra entonces en un filtro de 0,45 micras para eliminar toda materia particulada. La a1Pl se filtra entonces con Planova 15N para eliminar los virus, se filtra de forma estéril con un filtro de 0,22 micras para ser distribuida en viales y liofilizada para su almacenamiento. La a1Pl se almacena a 2 - 8ºC.

La a1Pl liofilizada se puede redisolver en agua estéril para su administración a los pacientes.

La actividad a1Pl de la a1Pl reconstituida se puede determinar mediante un ensayo cromogénico. Este ensayo utiliza un sustrato cromogénico sensible a la tripsina que libera p-nitroanilina en presencia de tripsina (suministrada por Sigma Chemical Co. de St Louis, Mo.). La p-nitroanilina liberada se detecta a 405 nm. La a1Pl inhibe la liberación de la p-nitroanilina del sustrato. La actividad de a1Pl en el producto se determina con referencia a una curva estándar de actividad de la a1Pl. El ensayo cromogénico de la a1Pl liofilizada reconstituida según el proceso anterior muestra una actividad específica de al menos 1,0 unidad / OD280 aproximadamente. En una realización de la presente invención, la actividad de a1Pl se determina midiendo la inhibición de la elastasa pancreática porcina (Boehringer Mannheim) por succinil-(alanina)_{3}-para-nitroanilida (Bachem Fine Chemicals) como sustrato, tal como se describe en E.H. Mattes y col., Vox Sang., 81: 29-36 (2001).

El contenido proteico total se puede determinar con azul de Coomassie según Bradford.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la preparación farmacéutica final se puede infundir en un paciente a una velocidad de aproximadamente 0,08 ml/kg de peso corporal por minuto durante los primeros 10 minutos. Si el paciente no experimenta molestia alguna, se puede aumentar la velocidad según tolerancia. Si se tolera, las infusiones posteriores al mismo paciente pueden realizarse a una velocidad más alta. Si ocurriesen eventos adversos, la velocidad debe ser reducida o la infusión interrumpida hasta que los síntomas cedan. La infusión entonces puede seguir a una velocidad que sea tolerada por el paciente.

Si se tuvieran que administrar grandes dosis, se pueden reunir varios viales reconstituidos de a1Pl en un recipiente de infusión I.V. vacío, estéril utilizando técnicas asépticas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Partes alícuotas de 100 g de pasta IV-1 obtenida por fraccionamiento de Cohn mediante filtración como método de separación y utilizando CELPURE como medio filtrante se descongelaron durante 16, 8, 4 ó 0 horas a 4ºC y se lavaron después en paralelo con 249,1 ml de WFI a 5-7ºC, se agitaron durante 10 minutos, se ajustaron a un pH 6,0 con NaOH 1M y se agitaron durante 10 minutos más. Después de su centrifugación a 5.000 rpm a 4ºC durante 15 minutos, se retiraron las muestras del sobrenadante y la pasta residual, que incluía CELPURE, se extrajo con 5,5 veces el volumen de WFI a 17,5ºC, se agitaron durante 30 minutos, se ajustaron a un pH 8,8 y se agitaron durante 15,5 horas más a 17,5ºC, con ajustes de pH después de 1, 2, 3, 5, 7 y 8 horas (después del primer ajuste de pH a 8,8). Después de otra centrifugación a 5.000 rpm a 4ºC durante 15 minutos, se decantó el sobrenadante y se retiraron las muestras.

Se observa un aumento de la producción de a1Pl en el extracto cuando se incrementa la duración de la incubación. Sin la descongelación e incubación de la pasta congelada, se podía recuperar un 8% de la a1Pl plasmática del extracto, mientras que después de 4 horas de incubación a una temperatura ambiente de 4ºC, la producción aumentó hasta un 22% de a1Pl plasmática, después de 8 horas de incubación hasta un 24% y después de 16 horas hasta un 27%. El contenido en a1Pl del extracto aumentó de 107 mg/l de plasma sin incubación a 282 mg/l de plasma después de 4 horas de incubación, a 311 mg/l de plasma después de 8 horas y a 352 mg/l de plasma después de 16 horas de incubación a temperatura ambiente.

Se observa un aumento del contenido total de a1Pl en el extracto de 0,33 a 0,95 mg/ml al incrementar el tiempo de incubación. Correspondientemente, el contenido total de a1Pl en el sobrenadante del lavado disminuyó de 0,42 a
0,09 mg/ml. La actividad específica del extracto aumentó ligeramente, de 0,084 a 0,112 mg de a1Pl por mg de proteína total.

Ejemplo 2

Partes alícuotas de 50 g de pasta IV-1 obtenida por fraccionamiento de Cohn mediante centrifugación como método de separación se descongelaron durante 16, 8, 4 ó 0 horas a 4ºC y se lavaron después en paralelo con 350 ml de WFI a 5-7ºC, se agitaron durante 10 minutos, se ajustaron a un pH 5,5 o a un pH 6,0 con NaOH 1M y se agitaron durante 10 minutos más. Después de la adición de 21,2 g de CELPURE y agitación durante 10 minutos más, se inició la centrifugación a 5.000 rpm a 4ºC durante 15 minutos. Se retiraron las muestras de sobrenadante y la pasta residual, que incluía CELPURE, se extrajo con 5,5 veces el volumen de WFI a 17,5ºC, con ajustes del pH después de 1, 2, 3, 5, 7 y 8 horas (después del primer ajuste de pH a 8,8). Después de otra centrifugación a 5.000 rpm a 4ºC durante 15 minutos, se decantó el sobrenadante y se retiraron las muestras.

Se observa un aumento de la producción de a1Pl en el extracto al incrementar la duración de la incubación seguido de un paso de lavado a un pH de 5,5. Sin la descongelación e incubación de la pasta congelada, se podía recuperar un 35% de la a1Pl plasmática del extracto, mientras que, después de varias horas de incubación a una temperatura ambiente de 4ºC, la producción aumentó hasta un 42% de a1Pl plasmática después de 19 horas de incubación. El contenido en a1Pl del extracto aumentó de 459 mg/l de plasma sin incubación a 506 mg/l de plasma después de 4 horas de incubación, a 531 mg/l de plasma después de 8 horas y a 570 mg/l de plasma después de 19 horas de incubación a temperatura ambiente.

Se observa un aumento del contenido total de a1Pl en el extracto de 1,42 a 1,68 mg/ml al incrementar el tiempo de incubación. Correspondientemente, el contenido total en a1Pl del sobrenadante del lavado disminuyó de 0,27 a
0,07 mg/ml. La actividad específica del extracto no se vio afectada de manera significativa.

También se observa un incremento en la producción de a1Pl en el extracto al aumentar la duración de incubación, aun seguido de un paso de lavado a un pH de 6,0. La producción aumentó del 19% de a1Pl plasmática al 35% de a1Pl plasmática después de 19 horas de incubación. El contenido en a1Pl del extracto se incrementó de 248 mg/l de plasma sin incubación a 461 mg/l de plasma después de 19 horas de incubación a temperatura ambiente.

Se observa un aumento del contenido total en a1Pl del extracto de 0,79 a 1,30 mg/ml al incrementar el tiempo de incubación. Correspondientemente, el contenido total de a1Pl del sobrenadante del lavado disminuyó de 0,60 a
0,18 mg/ml. La actividad específica del extracto varió ligeramente de 0,10 a 0,18 mg de a1Pl por mg de proteína total.

Ejemplo 3

Se llevó a cabo el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 2 utilizando partes alícuotas de 600 g de pasta IV-1, excepto que se empleó una filtración en lugar de una centrifugación para la separación de la pasta prelavada.

Cuando se compara el incremento relativo de producción de a1Pl [en % de pasta total] después de 16 horas de incubación seguido de un paso de lavado a un pH de 5,5 con el aumento de producción de a1Pl después del mismo período de incubación seguido de un paso de lavado a un pH de 6,0, se debe observar que, mientras la producción sin incubación y posterior paso de lavado a un pH de 6,0 es notablemente inferior a la producción después de un paso de lavado a un pH de 5,5, la incubación de la pasta durante 16 horas aumentó la producción hasta valores similares debido a una reducción drástica de la pérdida de a1Pl en el sobrenadante de lavado.

Ejemplo 4

236 kg de pasta IV_{1} (Vienna, NG pathway) obtenida después de centrifugación y recogida en recipientes de plástico de 10 kg (32 x 21 x 15 cm^{3}) y almacenada a \leq -20ºC se descongelaron e incubaron durante 52 horas a 5ºC. Después de 24 horas, el núcleo interno del recipiente de 10 kg había alcanzado -2ºC. Se suspendió la pasta en 7 volúmenes de agua a 5-7ºC, se agitó intensamente durante 10 minutos, se ajustó a pH 6,0 y se agitó durante 10 minutos más a 5-7ºC. Después de la adición de CELPURE como medio filtrante, la pasta lavada con agua se separó en un filtro prensa que contenía capas filtrantes CUNO 10-CP. La pasta lavada con agua se obtuvo del filtro prensa lavado posteriormente, se disolvió en 5,5 volúmenes de agua, se ajustó el pH a 8,8 y se agitó durante 6 horas a 15-20ºC. Las proteínas asociadas precipitaron después de la adición de sales por PEG 15% a pH 8,0 y se retiraron mediante el filtro prensa provisto de capas filtrantes CUNO 10-CP. El filtrado que contenía la a1Pl extraída bruta precipitó mediante la adición de ZnCl_{2} 2,5 mM, se concentró 10 veces utilizando una unidad de ultrafiltración PROSTAK y finalmente se disolvió en una solución de EDTA 50 mM a un pH de 8,0 y 2-8ºC.

La producción de a1Pl en el concentrado de Zn/EDT podía aumentar en aproximadamente un 20% en comparación con la producción habitual con pasta congelada, trituradora de pasta y lavado a pH 5,5.

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Claims

1. Método para la purificación del inhibidor de la proteinasa alfa-1 (a1Pl) de una fracción proteica, que comprende los pasos de:

a): proporcionar una fracción proteica congelada que comprende a1Pl,

b): descongelarla a una temperatura ambiente de 2-25ºC hasta que la fracción proteica haya alcanzado la temperatura ambiente,

c): incubarla durante 4 horas como mínimo a una temperatura ambiente de 2-25ºC, y

d): someterla a un paso de lavado.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica congelada que comprende la a1Pl procede de plasma.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica congelada que comprende la a1Pl incluye al menos una fracción de Cohn seleccionada de entre el grupo consistente en la fracción IV_{1} de Cohn, la fracción IV_{4} de Cohn, la fracción IV_{1}+IV_{4} de Cohn y la fracción IV_{1,4} de Cohn.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque la fracción de Cohn se obtiene por medio de filtración como método de separación y caracterizado porque la fracción de Cohn comprende un medio filtrante.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el medio filtrante comprende un 96 - 98% de SiO_{2}.

6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica congelada que comprende la a1Pl procede de una a1Pl producida por métodos recombinantes.

7. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica congelada es de origen humano.

8. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica congelada se tritura.

9. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica congelada se descongela a una temperatura ambiente de aproximadamente 4ºC.

10. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica descongelada se incuba a una temperatura ambiente de aproximadamente 4ºC.

11. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica descongelada se incuba durante al menos 8 horas.

12. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica descongelada se incuba durante al menos 15 horas.

13. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica descongelada se incuba durante 16 a 19 horas.

14. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica descongelada se incuba durante un período de tiempo de hasta 52 horas.

15. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de lavado comprende la suspensión de la fracción proteica descongelada e incubada en agua o en una solución salina a una temperatura inferior a aproximadamente 15ºC durante al menos 1 hora, ajustando posteriormente el pH de la suspensión de lavado a aproximadamente 5,5 ó 6,0 y separando las proteínas solubles de las proteínas insolubles mediante filtración o centrifugación.

16. Método según la reivindicación 15, caracterizado porque las proteínas solubles se separan de las proteínas insolubles mediante filtración y se utiliza un medio filtrante para dicha separación.

17. Método según la reivindicación 16, caracterizado porque el medio filtrante comprende un 96 - 98% de SiO_{2}.

18. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de lavado se realiza al menos dos veces.

19. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción proteica lavada se somete a un tratamiento con SD para la inactivación viral.

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20. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque se añade un azúcar en una cantidad de aproximadamente un 15 \pm 5% en peso/peso a la fracción proteica lavada.

21. Utilización de un azúcar durante el tratamiento con SD de una fracción proteica que contiene a1Pl para aumentar la producción de a1Pl al ser tratada con SD.

22. Utilización según la reivindicación 21, caracterizada porque el incremento de la producción es de al menos el 10%.

23. Utilización según la reivindicación 21, caracterizada porque el incremento de la producción es de al menos el 20%.

24. Utilización según la reivindicación 21, caracterizada porque el incremento de la producción es de al menos el 30%.