ES2325866T3 - Procedimiento de deteccion de cancer en base a una reaccion inmune a boris. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de detección de un cáncer caracterizado por la expresión del polipéptido BORIS (Brother of the Regulator of Imprinted Sites) anormal en un mamífero que comprende la detección de anticuerpos contra BORIS en una muestra obtenida a partir del mamífero, en el que la presencia de anticuerpos contra BORIS en la muestra indica la presencia del cáncer del mamífero.
Description
Procedimiento de detección de cáncer en base a
una reacción inmune a BORIS.
La presente invención se refiere a nuevos
polipéptidos BORIS y al uso de dichos polipéptidos para la detección
de anticuerpos específicos para BORIS en una muestra obtenida a
partir de un mamífero. La detección de anticuerpos en un mamífero
específico para BORIS es útil, inter alia, para la detección
de enfermedades proliferativas, tal como cáncer.
La identificación de antígenos asociados a
tumores reconocidos por un sistema inmune mamífero es útil para la
diagnosis y tratamiento de cáncer. Se han identificado una
diversidad de antígenos asociados a tumores, incluyendo antígenos
de cáncer de testículos que están expresados en células de cáncer,
pero no en tejidos normales distintos de los testículos. Sin
embargo, solamente una mino-ría de antígenos
asociados a tumores son inmunógenos para el mamífero que los
produce.
BORIS (Brother of the Regulator of Imprinted
Sites) es un antígeno asociado a un tumor, que es activado en un
amplia diversidad de cánceres humanos. De hecho, la síntesis
aberrante del producto de gen BORIS se ha encontrado en más de 300
tumores primarios y líneas de células de cáncer que representan
todos los tipos principales de cánceres humanos con ganancias
cromosómicas 20q13 recurrentes. Igualmente, se ha encontrado
activación de BORIS en todas las líneas de células de cáncer
NCI-60 convencionales, que están conservadas por el
National Cancer Institute (NCI), y las cuales se piensa que son un
conjunto representativo razonablemente completo de cánceres
humanos. Un mecanismo de acción mediante el cual se estima que BORIS
causa cáncer a través de la interferencia con el mantenimiento de
un patrón de metilación apropiado en el genoma mediado por el factor
de unión CCCTC (CTCF) (véase Klenova y otros, Seminars in Cancer
Biology, vol. 12, págs.. 39-414, (2002)).
BORIS es también un parálogo de CTCF, el cual
contiene todas las once huellas de cinc de CTCF, y que se ha
mostrado que promueve el crecimiento que conduce a la transformación
(véase Loukinov y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol.
99, págs. 6806-6811, (2002), y la Publicación de
Solicitud de Patente Internacional WO 03/072799 (PCT/US03/05186)).
Se estima que el gen BORIS mapea la región de amplificación asociada
a cáncer del cromosoma 20q13.
La detección de la expresión aberrante de
marcadores de cáncer, tal como el antígeno específico de la próstata
(PSA) y el antígeno carcinoembriónico (CEA), son conocidos en la
técnica. Sin embargo, estos ensayos detectan únicamente un número
limitados de cánceres, y tienen valor predictivo positivo limitado
para la detección de cáncer nuevo o recurrente, o para el
pronóstico de cáncer. De acuerdo con ello, existe una necesidad en
la técnica de identificar antígenos adicionales cuya expresión pueda
ligarse a enfermedades proliferativas, tal como cáncer, así como
procedimientos de detección de la presencia de dichos antígenos para
ayudar en la detección, diagnosis, pronosticación, o investigación
de dichos estados de enfermedad.
La invención proporciona procedimientos y
composiciones útiles para la detección, diagnosis, pronosticación,
o investigación de enfermedades asociadas con la expresión de BORIS
anormal, tal como cáncer. Estas y otras ventajas de la invención,
así como características adicionales de la invención, resultarán
evidentes a partir de la descripción de invención aquí
proporcionada.
La invención proporciona un procedimiento de
detección de una enfermedad asociada con la expresión de BORIS
anormal, incluyendo pero sin limitarlo al cáncer, cuyo procedimiento
comprende la detección de anticuerpos (por ejemplo,
autoanticuerpos) contra BORIS en una muestra obtenida a partir de un
mamífero. La invención proporciona igualmente un procedimiento de
detección de anticuerpos contra BORIS en una muestra obtenida a
partir de un mamífero, cuyo procedimiento comprende la puesta en
contacto de la muestra con un polipéptido BORIS y la detección de
la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido BORIS.
La invención proporciona además polipéptidos
BORIS (por ejemplo, polipéptidos que comprenden epítopos de BORIS),
composiciones, y kits que comprenden los polipéptidos BORIS. Además,
la invención proporciona un procedimiento de inducción de una
respuesta inmune en un mamífero que comprende la administración de
un polipéptido BORIS al mamífero.
La Figura 1 es una gráfica que representa los
resultados de ensayos ELISA indirectos para anticuerpos antiBORIS en
sueros humanos.
La invención proporciona un procedimiento de
detección de una enfermedad caracterizado por la expresión de gen
anormal, tal como una enfermedad hiperproliferativa que implica la
expresión de BORIS anormal (por ejemplo, cáncer), en un mamífero,
cuyo procedimiento comprende el proporcionar una muestra a partir de
un mamífero y la detección de anticuerpos contra BORIS en la
muestra obtenida a partir del mamífero. La presencia de anticuerpos
anti-BORIS en la muestra indica la presencia de la
enfermedad en el mamífero. Lo términos "enfermedad
proliferativa" y "enfermedad hiperproliferativa" se usan
aquí de manera sinónima. Sin desear quedar ligado a teoría alguna,
se estima que las enfermedades caracterizadas por expresión de gen
anormal, al como cáncer, están asociadas con la expresión anormal
de BORIS en tejidos en los que BORIS no se encuentra normalmente
(por ejemplo, tejidos distintos de los testículos). Como un
resultado de ello, el sistema inmune del mamífero produce
anticuerpos contra BORIS que pueden ser detectados en una muestra
(por ejemplo, los tejidos, sueros, o corriente sanguínea) obtenida
partir del mamífero enfermo. En la ausencia de una enfermedad de
este tipo, BORIS está confinado a los tejidos y órganos en os
cuales normalmente se encuentra (por ejemplos, los testículos), y el
sistema inmune del mamífero no produce anticuerpos contra BORIS.
Por ello, una muestra extraída a partir de un mamífero no enfermo
(por ejemplo, un mamífero sin una enfermedad caracterizada por la
expresión de gen anormal) no contendrá anticuerpos
anti-BORIS. De acuerdo con ello, mediante la
detección de la presencia o la ausencia de anticuerpos
anti-BORIS en la muestra de un mamífero, el
procedimiento de la invención hace posible una determinación de si
el mamífero tiene una enfermedad caracterizada por la expresión de
gen anormal, especialmente la expresión BORIS anormal, tal como
cáncer.
Los términos "BORIS" y "BORIS nativo"
se usan aquí de manera sinónima para referirse al polipétido BORIS
tal como se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, tal como se
produce o aísla a partir de un mamífero no manipulado
genéticamente). De acuerdo con ello, estos términos abarcan
cualquier isoforma u homólogo naturales de BORIS. Los términos
"anticuerpo anti-BORIS" y "anticuerpos contra
BORIS" se usan aquí de manera sinónima para referirse a cualquier
anticuerpo que se una a BORIS, incluyendo autoanticuerpos contra
BORIS.
El procedimiento de la invención puede usarse
para detectar cualquier enfermedad caracterizada por o asociada con
la producción anormal de BORIS, y la consecuente producción de
anticuerpos anti-BORIS, incluyendo, pero sin
limitarse a ellos, para la detección de cáncer. Tal como se ha
mencionado anteriormente, se ha detectado ARNm de BORIS en varios
cientos de líneas de células de cáncer y tumor que representan la
mayoría de las formas principales de cáncer. De acuerdo con ello,
el procedimiento de la invención puede usarse para detectar
cualquier tipo de cáncer. Dichos cánceres incluyen, pero sin
limitarse a ellos, cáncer de la cavidad oral y de faringe, el
sistema digestivo (por ejemplo, el esófago, estómago, intestino
pequeño, colon, recto, ano, hígado, vesícula biliar, y páncreas),
el sistema respiratorio (por ejemplo, la laringe, pulmón, y
bronquios, incluyendo carcinoma de pulmón de célula no pequeña,
huesos y articulaciones (por ejemplo, metástasis ósea), tejido
blando, la piel (por ejemplo, melanoma), pecho, sistema genital
(por ejemplo, cérvix uterino, corpus uterino, vulva ovaríca,
vagina, próstata, testículos, y pene), el sistema urinario (por
ejemplo, vesícula urinaria, riñón, pelvis renal, y uréter), el ojo
y órbita, el cerebro y sistema nervioso (por ejemplo glioma), o el
sistema endocrino (por ejemplo, tiroides). El cáncer puede ser
igualmente un linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y linfoma
no de Hodgkin), mieloma múltiple, o leucemia (por ejemplo, leucemia
linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide
aguda, leucemia linfoide crónica, y similares).
Puede usarse cualquier muestra adecuada en la
invención. Los tipos de muestras que pueden contener anticuerpos
(por ejemplo, autoanticuerpos) son conocidos en la técnica. La
muestra puede ser una muestra sólida, tal como una muestra de
tejido, o la muestra puede ser fluida tal como una muestra de fluido
corporal. Por ejemplo, puede usarse una sección de tejido entero
para análisis basado en inmunohistoquímica o puede homogeneizarse
para licuar los componentes que se encuentran en el tejido.
Preferiblemente, la muestra es un fluido. Las muestras fluidas
adecuadas incluyen, pero sin limitarse a ellas, sangre, suero,
plasma, linfa, y fluido intersticial.
Puede usarse cualquier procedimiento adecuado de
detección de anticuerpos anti-BORIS en una muestra.
En la técnica se encuentran disponible procedimientos para la
detección de la presencia de anticuerpos contra un antígeno
conocido en una muestra.
En un aspecto relacionado, la invención
proporciona un procedimiento de detección de anticuerpos específico
para BORIS en una muestra obtenida a partir de un mamífero, cuyo
procedimiento comprende la puesta en contacto de la muestra con un
polipéptido BORIS (por ejemplo, un polipéptido que comprende una
poción adecuada de BORIS que comprende uno o más epitopos de BORIS)
y la detección de si la muestra contiene anticuerpos
anti-BORIS. Por supuesto, la unión del polipéptido
BORIS a un anticuerpo en la muestra indica la presencia de
anticuerpos anti-BORIS en la muestra. El
procedimiento de detección de anticuerpos anti-BORIS
puede usarse para cualquier fin adecuado, y es especialmente útil
para la detección, pronosticación, control, o investigación de
enfermedades caracterizadas por la expresión de gen anormal,
especialmente de BORIS anormal, incluyendo sin limitación
enfermedades hiperproliferativas tal como cáncer. De acuerdo con
ello, el procedimiento de detección de anticuerpos
anti-BORIS proporcionado por la invención puede
usarse conjuntamente con el procedimiento de detección de una
enfermedad proporcionado por la invención.
A este respecto, el término "polipéptido
BORIS" tal como se usa aquí, se define como un polipéptido al
cual se une un anticuerpo anti-BORIS. Por ello, el
término "polipéptido BORIS" tal como se define para los fines
de esta invención, abarca, pero sin limitarse a él, a BORIS nativo.
Tal como se expone con mayor detalle más adelante, un polipéptido
BORIS puede, por ejemplo, comprender, estar constituido
esencialmente de, o estar constituido de BORIS, una porción o
fragmento de BORIS reconocido por un anticuerpo
anti-BORIS, o una variante de BORIS o porción o
fragmento del mismo recocido por un anticuerpo
anti-BORIS.
El polipéptido BORIS puede comprender, estar
constituido esencialmente de, o estar constituido de la proteína
BORIS nativa o una porción de la misma. Las proteínas BORIS de
longitud total son conocidas en la técnica y divulgadas, por
ejemplo, por Loukinov y otros, véase cita anterior, Klenova y otros,
véase cita anterior, y en el GenBank No. de Registro AF36042. Otras
isoformas, homólogos, y parólogos pueden aislarse usando las
informaciones aquí suministradas y técnicas de rutina.
Cualquier porción adecuada de BORIS puede usarse
para detectar anticuerpos específicos para BORIS. Tal como se usa
aquí, el término "porción" es sinónimo con el término
"fragmento", usándose ambos de los mismos para referirse a la
parte contigua de un polipéptido, que comprende preferiblemente 5 o
más aminoácidos. La porción de BORIS puede ser proporcionada por la
proteína BORIS de longitud total (por ejemplo, el polipéptido BORIS
nativo de longitud total); sin embargo, en ambas realizaciones es
conveniente usar una porción más corta de BORIS. De acuerdo con
ello, la porción de BORIS puede ser cualquier porción de la proteína
BORIS nativa de longitud total que pueda reconocer y unirse a un
anticuerpo anti-BORIS in vitro o in
vivo. Se puede determinar si cualquier porción dada de BORIS se
une a un anticuerpo anti-BORIS usando técnicas de
rutina a la vista de las divulgaciones aquí proporcionadas. Por
ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos anti-BORIS a
partir de un mamífero usando BORIS nativo. A continuación, la
porción de "ensayo" dada de BORIS puede ser puesta en contacto
con los anticuerpos anti-BORIS para determinar si
los anticuerpos anti-BORIS se unen a la porción de
"ensayo" dada de BORIS. Otros procedimientos de determinación
de si una porción dada de BORIS puede unirse a un anticuerpo
anti-BORIS resultarán evidentes para los expertos
normales en la técnica.
Las porciones adecuadas de BORIS incluyen la
porción amino-terminal de BORIS (el "dominio
N-terminal"), definido como la región que se
extiende desde el amino-terminal hasta el dominio de
la huella de cinc (el "dominio N-terminal"), o
al menos alguna porción de la misma que comprenda aproximadamente 10
o más aminoácidos (por ejemplo, 200 o más, 250 o más, 300 o más,
400 o más, o 500 o más aminoácidos) del dominio
N-terminal de BORIS. Una porción preferida de BORIS
es el dominio N-terminal de BORIS codificado por una
secuencia de ácido nucleico que comprende, está constituida por, o
está constituida esencialmente por la SEC ID NO:1.
Otras porciones adecuadas de BORIS incluyen la
porción carboxilo-terminal de BORIS, definida como
la región de iniciación después del dominio de la huella de cinc y
de terminación en el carboxilo-terminal de BORIS
(el "dominio C-terminal"), o al menos alguna
porción de la misma que comprenda aproximadamente 75 o más
aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 100 o más, 200 o más, 300
o más, o 400 o más aminoácidos) del dominio
C-terminal de BORIS. Una porción preferida de BORIS
incluye el dominio C-terminal de BORIS codificado
por una secuencia de ácido nucleico que comprende, está constituida
esencialmente por, o está constituida por la SEC ID NO:2.
En una realización particularmente preferida de
la invención, el polipéptido BORIS comprende al menos una porción
de cada uno del dominio N-terminal y el dominio
C-terminal, tal como se describe aquí. Más
preferiblemente, el polipéptido BORIS comprende el dominio
N-terminal y el dominio C-terminal
enteros. Se prefiere además que el polipéptido BORIS excluya el
dominio de la huella de cinc. Un polipéptido BORIS preferido está
codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende, está
constituida por, o está constituida esencialmente por la SEC ID
NO:3.
Pueden usarse incluso porciones más pequeñas de
BORIS, siempre y cuando que esté presente un epítopo de BORIS en la
porción o fragmento. Por "epítopo" se entiende una secuencia de
un antígeno que es reconocida por un anti cuerpo o un receptor de
antígeno. Igualmente, a los epítopos se hace referencia en la
técnica como "determinantes antigénicos". Por ejemplo, la
porción de BORIS, o el polipéptido BORIS que comprende, está
constituida esencialmente por, o está constituida por la porción de
BORIS, puede ser menor de aproximadamente 660, 200, 150, 100, 60,
50, 30, 20, 15, ó 12 restos de aminoácidos en longitud, siempre y
cuando que esta pueda estar específicamente unida por un anticuerpo
que se una a BORIS, y preferiblemente un anticuerpo que se una
únicamente a BORIS (es decir, un anticuerpo "específico de
BORIS"). Preferiblemente, el polipéptido BORIS comprende al menos
aproximadamente 10, 11, ó 12 aminoácidos. Por supuesto, el número
preferido de aminoácidos puede igualmente expresarse en términos de
intervalos dentro de cualquiera de los límites preferidos
anteriormente descritos (por ejemplo, 10-200
aminoácidos, 10-100 aminoácidos,
10-50 aminoácidos, 10-20
aminoácidos, etc.). No obstante, los polipéptidos BORIS que
comprenden menos de 11 aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 4,
6, 8, ó 10 o más aminoácidos) entran igualmente dentro del ámbito
de la invención.
Cualquier epítopo de BORIS que sea reactivo con
un anticuerpo anti-BORIS puede usarse solo, en el
contexto de un polipéptido BORIS más grande, insertado dentro de
otra proteína (es decir "no-BORIS"), o unida a
otra proteína (es decir, "no-BORIS"). Como
alternativa, puede usarse más de un epítopo de BORIS. Sin desear
quedar ligado a teoría particular alguna, es estima que los
diferentes individuos tendrán respuestas inmunógenas a BORIS en
base a las moléculas MHC expresadas sobre sus células que presentan
antígenos (por ejemplo, macrófagos). De acuerdo con ello, los
epítopos reactivos de BORIS pueden variar de individuo a individuo.
Más aún, en algunos pacientes con cáncer ha sido detectada una
respuesta de anticuerpo autoreactivo dirigida tanto contra los
dominios N-terminal como C-terminal
de BORIS. De acuerdo con ello, el procedimiento implica
preferiblemente el uso de más de un epítopo de BORIS. Cuando se usa
más de un epítopo de BORIS, los diferentes epítopos de BORIS pueden
ser proporcionados, por ejemplo, por diversas porciones no contiguas
de BORIS usadas simultáneamente (por ejemplo, dos o más
polipéptidos comprendiendo cada uno de ellos una porción diferente
de BORIS) o ligadas conjuntamente y usadas como un único reactivo
(por ejemplo, un único polipéptido BORIS comprendiendo dos o más
porciones diferentes de BORIS).
El polipéptido BORIS puede unirse a otras
biomoléculas, tales como, por ejemplo, proteínas, polipéptidos,
lípidos, carbohidratos, prenilo, y partes acilo, y ácidos nucleicos.
Cuando otra proteína o polipéptido está ligado con una porción de
BORIS, preferiblemente no está relacionada con BORIS (por ejemplo,
el otro polipéptido tendrá menos de 40% de identidad de secuencia
de aminoácidos con BORIS). En una realización preferida de la
invención, el polipéptido BORIS comprende una secuencia de
aminoácido de ligador flexible. Los ligadores flexibles se usan en
la técnica para unir dos polipéptidos diferentes, tal como, por
ejemplo, en la construcción de proteínas de fusión o quiméricas. En
realizaciones en las que el polipéptido BORIS comprende dos o más
porciones de BORIS, por ejemplo, una porción de dominio
N-terminal y una porción de dominio
C-terminal de BORIS, puede usarse un ligador
flexible para unir el dominio N-terminal y el
dominio C-terminal para formar una única molécula
polipéptida. El ligador flexible puede ser cualquier secuencia de
aminoácido adecuada que pueda usarse para unir dominios
polipéptidos separados. A este respecto, el ligador flexible
preferiblemente comprende aproximadamente 5 o más aminoácidos (por
ejemplo, aproximadamente 6 o más, 7 o más, o 9 o más aminoácidos),
más preferiblemente aproximadamente 10 o más aminoácidos (por
ejemplo, aproximadamente 11 o más, 12 o más, o 14 o más
aminoácidos), y lo más preferiblemente aproximadamente 15 o más
aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 17 o más, 20 o más, o 25
o más aminoácidos). El ligador flexible para uso en la presente
invención comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID NO:5; sin embargo, son conocidas en la técnica otras
secuencias ligadoras así como procedimientos para la unión de
dominios polipéptidos usando ligadores flexibles (véase, por
ejemplo, Imanishi y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
vol. 333, (nº. 1), págs. 167-73, (2005); Lin y
otros, Eur. Cytoquine Netw., vol. 15, (nº. 3), págs.
240-6, (2004)).
El polipéptido BORIS puede estar unido a un
resto de señalización (también conocido como un marcador
detectable). La identidad y uso de los restos de señalización es
bien conocido en la técnica. Un resto de señalización es una
molécula capaz de indicar la presencia de un analito o reactivo en
una muestra, usualmente después de la manipulación de la muestra.
Frecuentemente, dichas manipulaciones incluyen la incubación de una
muestra y los reactivos de detección apropiados bajo condiciones
que permiten unirse los dos restos conjuntamente, si están
presentes, y, a continuación, la separación de cualquiera de los
restos marcados de la muestra mediante lavado, filtración, u otras
técnicas adecuadas. Otros procedimientos de trabajo con restos de
señalización son bien conocidos en la técnica. Los restos de
señalización adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos,
moléculas fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde),
interruptores fluorescentes, epítopos y haptenos para anticuerpos
que no reconocen a BORIS (por ejemplo, el bien conocido epítopo
FLAG), enzimas (por ejemplo, cromógenas o luminiscentes (tal como
peroxidasa de rábano picante o
\beta-galactosidasa)), un ácido nucleico que
pueda ser amplificado o específicamente hibridado a una sonda,
botina, avidina, o estreptavidina, lecitinas y coloides. Los
procedimientos para el ligamiento de proteínas con marcadores
detectables y soportes sólidos son bien conocidos en la
técnica.
Puesto que la función primaria del polipéptido
BORIS es unirse con anticuerpos anti-BORIS en la
muestra, el polipéptido BORIS no necesita comprender una porción de
BORIS per se. Al contrario, el polipéptido BORIS puede ser
un polipéptido que se une con un anticuerpo que se une a BORIS. A
este respecto, el polipéptido puede comprender, estar constituido
esencialmente por, o estar constituido por una variante de BORIS.
Tal como se usa aquí, el término "variante de BORIS" significa
una variante de proteína BORIS nativa de longitud total o una
variante de una porción de BORIS, tal como se describe aquí. El
técnico experto puede generar y caracterizar variantes de BORIS por
su capacidad para unirse con un anticuerpo
anti-BORIS o un fragmento funcional del mismo (por
ejemplo, Fab o F(ab)_{2}) usando la información aquí
suministrada y procedimientos de rutina conocidos en la técnica.
Por ejemplo, las variantes de BORIS pueden generarse usando
cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica,
incluyendo, pero sin limitarse a ellas, mutagénesis dirigida al
sitio o aleatoria de una secuencia de ácido nucleico que codifica a
BORIS. Las características de unión de una variante de BORIS así
producida pueden determinarse, por ejemplo, usando anticuerpos
contra BORIS obtenidos a partir del suero de un mamífero con
cáncer. Dichos anticuerpos pueden obtenerse, por ejemplo, usando una
proteína BORIS nativa.
Una variante de BORIS comparte, de manera
deseable, una o más regiones de identidad de secuencia de
aminoácidos con una proteína BORIS nativa. A este respecto,
preferiblemente, la variante comprende una secuencia de aminoácidos
que es al menos aproximadamente 50% idéntica (por ejemplo, al menos
aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos
aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% idéntica) a un
polipéptido BORIS nativo. Más preferiblemente, el polipéptido
comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 75% idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente
85%, o al menos aproximadamente 95% idéntica) a una secuencia de
aminoácido de BORIS nativo. Lo más preferiblemente, el polipéptido
comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 90% idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente
95%, al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 99%
idéntica) a una secuencia de aminoácidos de BORIS nativo. Tal como
se usa aquí, la identidad de la secuencia es la que se determina
usando los algoritmos BLAST bien conocidos (por ejemplo, BLASTp,
BLAST2.1, BL2SEQ, y posteriores versiones de los mismos). Las
variantes de BORIS capaces de unirse a anticuerpos
anti-BORIS tienen, preferiblemente, al menos 5, 6, ó
7 restos de aminoácidos que son idénticos a BORIS sobre una ventana
de ocho restos de aminoácidos.
Las variantes de BORIS en las cuales una
alteración destruye la capacidad de la variante para unirse con, o
unirse específicamente con, un anticuerpo anti-BORIS
pueden usarse como un control negativo.
El anticuerpo detectado en la invención se une,
preferiblemente, a BORIS mejor que al factor de unión CCCTC (CTCF),
o no se une en absoluto a CTCF. De acuerdo con ello, el
procedimiento de la invención comprende, preferiblemente, la
detección de un anticuerpo anti-BORIS con una
afinidad de unión por BORIS que sea mayor que su afinidad de unión
por CTCF. Esto es particularmente cierto cuando la porción de BORIS
usada comprende el dominio de huella de cinc de BORIS. Más
preferiblemente, la constante de disociación (K_{d}) de unión bajo
condiciones convencionales entre el anticuerpo detectado por el
procedimiento de la invención y BORIS es al menos 10 veces menor,
más preferiblemente al menos 100 veces menor, o incluso 1000 veces
menor que la K_{d} de unión entre el mismo anticuerpo y CTCF. En
algunas realizaciones, la unión de anticuerpos en un suero de
paciente a CTCF puede usarse como un control negativo.
El mamífero usado conjuntamente con los
procedimientos aquí descritos puede ser cualquier mamífero adecuado,
tal como perros, gatos, vacas, cabras, cerdos, ratones, ratas,
cobayos, conejos, ratas asiáticas, monos, y hamsters.
Preferiblemente, el mamífero es un ratón, y más preferiblemente un
humano.
La muestra puede ponerse en contacto con un
polipéptido BORIS usando cualquier procedimiento conocido en la
técnica. Preferiblemente, la muestra se pone en contacto con un
polipéptido BORIS in vitro. Los procedimientos in
vitro para la detección de anticuerpos en una muestra son bien
conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayo
inmunoenzimático (ELISA), cromatografía de afinidad, y
radioinmunoensayo (RIA).
En una realización preferida, el procedimiento
de detección de cáncer o procedimiento de detección de anticuerpos
anti-BORIS incluye la determinación de la clase y/o
subclase de los anticuerpos presentes en el cuerpo del paciente, o
muestra obtenida a partir del mismo, que son reactivos con BORIS. Un
experto normal en la técnica comprenderá que las cinco clases
principales de inmunoglobulina humana (o "isotipos") son la
inmunoglobulina M (es decir, IgM), IgD, IgG, IgA, e IgE, las cuales
están típicamente definidas por la estructura de las regiones
constantes de la cadena pesada del anticuerpo. La cadena ligera de
una molécula de anticuerpo humana está típicamente clasificada en
la técnica como o bien una cadena lambda (\lambda) o una cadena
kappa (\kappa). Los anticuerpos IgG pueden subdividirse además en
cuatro subtipos (es decir, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), en tanto que
los anticuerpos IgA están típicamente subdivididos en dos subtipos
(es decir, IgA1 e IgA2). Es bien conocida en la técnica la forma de
determinar la clase y subclase de anticuerpos aislados o
purificados. Por ejemplo, los anticuerpos reactivos con BORIS
pueden aislarse a partir de un suero de humano mediante
inmunocromatografía. Los pocillos de las placas de microvaloración
pueden recubrirse con 10 \mug/ml de inmunoglobulina
anti-humana durante una noche a 4ºC. Después del
bloqueo con BSA al 5%, las placas se hacen reaccionar con 10
\mug/ml de un anticuerpo monoclonal o con controles de isotipos
purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. A
continuación, los pocillos pueden hacerse reaccionar con sondas
conjugadas con fosfatasa alcalina específica de IgG1, específica de
IgG2, específica de IgG3 o específica de IgG4 humano o específica de
IgM humano. Después de lavadas, las placas pueden revelarse con un
substrato luminógeno o cromógeno y analizarse para determinar su
revelado a la luz o de color.
Los procedimientos de detección de una
enfermedad y de detección de anticuerpos anti-BORIS
pueden usarse de diferentes formas. Por ejemplo, el procedimiento
puede usarse simplemente para establecer la existencia de un estado
de enfermedad para los fines de diagnosis o de rastreo. Además, el
procedimiento puede usarse, por ejemplo, para controlar el status
(por ejemplo, progresión o regresión) de un estado de enfermedad,
tal como mediante la comparación del nivel de anticuerpo
anti-BORIS (o niveles de expresión de BORIS) a
partir de muestras diferentes a lo largo del tiempo. Un uso de este
tipo sería de ayuda en el control de la respuesta de los pacientes a
un régimen terapéutico particular.
La invención proporciona igualmente una porción
inmunoreactiva aislada de BORIS. Por "porción inmunoreactiva"
se entiende una porción de la proteína BORIS que puede generar una
respuesta inmune en un mamífero in vitro, unirse a un
anticuerpo anti-BORIS in vivo o in
vitro, o comprender uno o más epítopos de BORIS. Una porción de
BORIS está aislada si está sintetizada, o si está separada de su
entorno natural. La porción inmunoreactiva aislada de BORIS puede
comprender, estar constituida esencialmente por, o estar constituida
por cualquier porción de BORIS o cualquier polipéptido BORIS
descrito aquí como útil conjuntamente con el procedimiento de
detección de una enfermedad o procedimiento de detección de un
anticuerpo anti-BORIS, incluyendo sin limitación las
secuencias de aminoácidos codificadas por cualquiera de las SEC ID
Nos: 1-3.
El polipéptido BORIS o porción de BORIS, tal
como se describe aquí, puede generarse mediante el uso de cualquier
procedimiento adecuado. A este respecto, las secuencias de ácido
nucleico que codifican fragmentos de BORIS pueden producirse de
manera sintética y expresarse en una célula huésped apropiada, dando
como resultado, de esta forma, la producción de una porción de un
polipéptido BORIS. Además, pueden sintetizarse fragmentos de
péptido BORIS usando procedimientos de síntesis de proteínas
conocidos en la técnica. Como alternativa, pueden generarse
fragmentos de polipéptido BORIS usando proteasas que se escinden
dentro del polipéptido BORIS de longitud total. Tal como se ha
expuesto anteriormente, la porción de BORIS puede marcarse con un
resto de señalización o marcador detectable, o ligarse a un soporte
sólido.
La invención proporciona además una composición
que comprende un polipéptido BORIS, tal como se ha descrito aquí,
en la que el polipéptido BORIS puede opcionalmente marcarse con un
marcador detectable. De manera ideal, la composición comprende un
polipéptido BORIS y un vehículo, diluyente, o excipiente aceptable
farmacéuticamente (por ejemplo, aceptable fisiológicamente). La
frase "vehículo aceptable farmacéuticamente", tal como se usa
aquí, se refiere a un medio vehículo que no interfiere con la
eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos y
que no es tóxico para el huésped o paciente. Las composiciones
farmacéuticas de la presente invención pueden presentarse en una
diversidad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de
dosificaciones sólidas, semi-sólidas y líquidas,
tales como comprimidos, píldoras, polvos, soluciones o suspensiones
líquidas, liposomas, soluciones inyectables e infusibles. Las
preparaciones inhalables, tales como aerosoles, se encuentran
igualmente incluidas. Las formulaciones preferidas son las
dirigidas a aplicaciones oral, intranasal y parenteral, pero se
comprenderá que la forma preferida dependerá del diagnóstico o
aplicación terapéutica particular. Los procedimientos para la
formulación y preparación de composiciones farmacéuticas son bien
conocidos en la técnica y se encuentran descritos, por ejemplo, en
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Philadelphia, Pa., 17th. Ed., (1985), The Merck Index, 11th
ed., (Merck & Co., 1989), y por Langer, en Science, vol.
249, págs. 1527-1533, (1990).
El polipéptido BORIS tal como se describe aquí,
incluyendo una proteína BORIS nativa de longitud total o porciones,
fragmentos, quimeras, fusiones, y derivados aislados de la misma,
puede usarse para cualquier fin. Además de ser útil en el
procedimiento de detección de una enfermedad y un procedimiento de
detección de anticuerpos anti-BORIS, el polipéptido
BORIS puede usarse para otros fines, tal como para la inducción de
una respuesta inmune en un mamífero. Dichas respuestas inmunes
tienen múltiples usos. Por ejemplo, los anticuerpos y otras
moléculas relacionadas con la inmunidad específicas para BORIS
pueden aislarse y usarse para investigación, reactivos de control
útiles en un procedimiento para la detección de la expresión de
BORIS en un mamífero, y como un procedimiento para la destrucción
de células de cáncer que están presentes o pudieran surgir en un
mamífero. A este respecto, la invención proporciona, como un aspecto
relacionado, un procedimiento de inducción de una respuesta inmune
en un mamífero que comprende la administración a un mamífero de un
polipéptido BORIS tal como se ha definido aquí. Los procedimientos
adecuados de administración son conocidos en la técnica. Todos los
otros aspectos del procedimiento de inducción de una respuesta
inmune son tal como previamente se han descrito aquí.
Un polipéptido BORIS tal como se describe aquí,
incluyendo una proteína BORIS nativa de longitud total o porciones,
fragmentos, quimeras, fusiones, y derivados aislados de la misma,
puede también suministrarse en un kit. De acuerdo con ello, en un
aspecto relacionado, la invención proporciona un kit que comprende
un polipéptido BORIS tal como se ha descrito aquí y un reactivo que
genera una señal cuando un anticuerpo se une a una porción de un
polipéptido BORIS. Dichos reactivos son conocidos en la técnica.
Preferiblemente, el kit comprende además instrucciones para la
determinación de si una muestra obtenida a partir de un mamífero
comprende anticuerpos específicos para BORIS, cuyas instrucciones
opcionalmente incluyen criterios para la determinación de si una
célula de cáncer está probablemente presente en el mamífero a partir
del cual se ha obtenido la muestra. Este kit puede usarse para
cualquier fin, tal como en la investigación de la expresión de BORIS
y enfermedades asociadas con el mismo, y para la detección de
anticuerpos de BORIS y la detección de cáncer en un mamífero.
Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente
la invención, pero, por supuesto, no deberían considerarse como
limitativos de ninguna manera de su ámbito.
Este ejemplo demuestra que la detección mediante
ELISA indirecto de anticuerpos de suero contra BORIS puede usarse
para la diagnosis de cáncer en pacientes humanos.
Con el fin de detectar anticuerpos contra BORIS
presentes en sueros humanos, se usó un ELISA indirecto que usa
regiones de BORIS que no tienen homología con CTCF como cebo. A este
respecto, se generaron tres constructos de plásmidos diferentes que
codifican porciones de los dominios N-terminal y/o
C-terminal de BORIS, usando el plásmido
pGEX-5x1 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La
secuencia de la proteína BORIS de longitud total es la suministrada
por Loukinov y otros, véase cita anterior, Klenova y otros, véase
cita anterior, y en el GenBank No. de Registro AF336042. El primer
plásmido contenía el dominio N-terminal de BORIS
correspondiente a los nucleótidos 90-867 de la
secuencia de ácido nucleico de BORIS publicada (GenBank No. de
Registro AF336042) y un ligador flexible (SEC ID NO:5). El segundo
plásmido contenía el dominio C-terminal de BORIS
correspondiente a los nucleótidos 1761-2098 de la
secuencia de ácido nucleico de BORIS publicada. El tercer plásmido
contenía tanto el dominio N-terminal como el
dominio C-terminal de BORIS del segundo plásmido
conjuntamente unido mediante el ligador flexible. Cada secuencia de
BORIS se expresó como parte de una proteína de fusión con
glutationa-S-transferasa (GST) para
facilitar la purificación.
Se absorbieron concentraciones adecuadas (por
ejemplo, aproximadamente 1 \mug/ml) de cada una de las proteínas
de fusión de BORIS en un tampón de recubrimiento adecuado (por
ejemplo, Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 30 mM, pH 9,6 con
NaN_{3} al 0,02%) sobre placas de microvaloración de 96 pocillos
durante un tiempo adecuado y a una temperatura adecuada (por
ejemplo, durante una noche a 4ºC). A continuación, las placas se
lavaron con una solución adecuada (por ejemplo,
Tween-20 al 0,05%/PBS) y se bloquearon (por ejemplo,
con 100 \mul por pocillo de una solución de BSA o caseína durante
aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente (TA)). Después del
lavado, se agregaron diluciones seriadas de suero humano en un
reactivo de bloqueo adecuado, tal como BSA o caseína, y se
incubaron bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, durante
aproximadamente 2 horas a 37ºC en un incubador saturado con agua).
El suero se obtuvo de pacientes humanos que sufrían de glioma,
cáncer de pulmón, cáncer de pecho, y cáncer de próstata.
Las placas se lavaron y se agregó anticuerpo
secundario diluido (incluyendo, por ejemplo, conjugados de fosfatasa
alcalina específico de IgG1, específico de IG2, específico de IgG3,
específico de IgG4 anti-humano o específico de IgM
humano) en un agente de bloqueo y se incubaron durante un período
adecuado de tiempo bajo condiciones adecuadas (por ejemplo,
aproximadamente 1 hora a 37ºC). A continuación, las placas se
lavaron, se incubaron con reactivos de visualización bajo
condiciones adecuadas durante tiempos adecuados, la reacción se
interrumpió, y se determinaron los resultados.
Usando la proteína de fusión de BORIS que
comprende el dominio N-terminal ligado al dominio
C-terminal d BORIS, los sueros procedentes de
cuarenta y siete pacientes de cáncer fueron positivos para
anticuerpos anti-BORIS (véase Figura 1). La Figura
1 muestra que el ELISA de los sueros procedentes de seis sujetos
normales tenían una lectura de placa de microvaloración media de
aproximadamente 0,1. Los sueros procedentes diecisiete pacientes
con gliomas tenían una lectura de placa de microvaloración media
mayor de 0,15, los procedentes nueve pacientes con cáncer de pulmón
una media de aproximadamente 0,3, los procedentes quince pacientes
con cáncer de pecho una media por encima de 0,4, y los procedentes
seis pacientes con cáncer de próstata una media por encima de 0,2.
Las diferencias entre cada de media de los grupos de cáncer y las de
los sueros humanos normales fueron estadísticamente
significativas.
Los anticuerpos contra el fragmento
N-terminal de la proteína de fusión de BORIS
codificada por el primer plásmido (por ejemplo, sin el dominio
C-terminal) se detectaron en sueros humanos, pero a
niveles más bajos que los anticuerpos específicos contra el
polipéptido BORIS codificado por el tercer plásmido. Los anticuerpos
contra el fragmento C-terminal de la proteína de
fusión de BORIS codificada mediante el segundo plásmido (por
ejemplo, sin el domino N-terminal) no fueron
detectables.
Este ejemplo demuestra que el uso de un
polipéptido BORIS para la detección de anticuerpos
anti-BORIS en suero es un procedimiento altamente
específico para la diagnosis de una amplia diversidad de
cánceres.
Todas las referencias, incluyendo publicaciones,
solicitudes de patentes, y patentes, citadas aquí son por la
presente incorporadas por referencias en la misma extensión que si
cada referencia fuera individual y específicamente indicadas para
ser incorporada por referencia y estuvieran expuestas aquí en su
totalidad.
El uso de los términos "un" y "uno" y
"el" y referentes similares en el contexto de la descripción de
la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones
siguientes) han de considerarse que abarcan tanto el singular como
el plural, salvo que se indique lo contrario aquí o claramente entre
en contradicción con el contexto. Los términos
"comprendiendo", "teniendo", "incluyendo", y
"conteniendo" han de considerarse como términos abiertos (es
decir, significando "incluyendo, pero no limitado a,") salvo
que se indique lo contrario. La mención de intervalos de valores
aquí están puramente destinados a servir como un procedimiento
taquigráfico de referirse individualmente a cada valor separado que
cae dentro del intervalo, salvo que se indique lo contrario aquí, y
cada valor separado se incorpora dentro de de la memoria descriptiva
como si estos fueran mencionados individualmente aquí. Todos los
procedimientos aquí descritos pueden llevarse a cabo en cualquier
orden adecuado salvo que se indique lo contrario aquí o entre
claramente en contradicción con el contexto. El uso de todos y cada
uno de los ejemplos, o de lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo,
"tal como") aquí proporcionado, se entiende que está destinado
puramente a iluminar mejor la invención y no plantean ninguna
limitación sobre el ámbito de la invención salvo que se reivindique
lo contrario. Ninguna forma de lenguaje en la memoria descriptiva
debería considerarse como indicativa de cualquier elemento no
reivindicado como esencial para la práctica de la invención.
Las realizaciones preferidas de esta invención
se describen aquí, incluyendo el mejor modo conocido por los
inventores para llevar a cabo la invención. Pueden llegar a ser
evidentes variaciones de las realizaciones preferidas para los
expertos normales en la técnica tras la lectura de la descripción
precedente. Los inventores esperan que los técnicos expertos usen
dichas variaciones de manera apropiada, y los inventores dan por
supuesto que la invención sea llevada a la práctica de manera
diferente a la descrita específicamente aquí. De acuerdo con ello,
esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la
materia sujeto citadas en las reivindicaciones adjuntas a la misma
tal como se permite por la ley aplicable. Más aún, cualquier
combinación de los elementos anteriormente descritos en todas las
variaciones posibles de los mismos está abarcada por la invención,
salvo que se indique lo contrario aquí o de otra forma claramente
entre en contradicción con el contexto.
<110> Gobierno de los Estados Unidos de
América, representado por el Secretario del Departamento de
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipSalud y Servicios Humanos
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de detección de cáncer
basado en una reacción inmune contra BORIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EP50655FZ163pau
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 05 799 643.
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2005-09-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/611.798
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-09-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US2005/033796
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-09-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 778
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1160
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (24)
1. Un procedimiento de detección de un cáncer
caracterizado por la expresión del polipéptido BORIS (Brother
of the Regulator of Imprinted Sites) anormal en un mamífero que
comprende la detección de anticuerpos contra BORIS en una muestra
obtenida a partir del mamífero, en el que la presencia de
anticuerpos contra BORIS en la muestra indica la presencia del
cáncer del mamífero.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que los anticuerpos contra BORIS se detectan mediante:
(a) la puesta en contacto de la muestra con un
polipéptido BORIS, y
(b) la detección de la unión del polipéptido
BORIS con un anticuerpo.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2,
en el que el cáncer está seleccionado entre el grupo constituido por
cáncer de pecho, glioma, cáncer de pulmón, y cáncer de próstata.
4. Un procedimiento de detección anticuerpos
anti-BORIS en una muestra obtenida a partir de un
mamífero que comprende:
(a) la puesta en contacto de la muestra con un
polipéptido BORIS, y
(b) la detección de la unión del polipéptido
BORIS con un anticuerpo,
en el que la unión del polipéptido BORIS con el
anticuerpo indica la presencia de anticuerpos
anti-BORIS.
5. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que el mamífero es un
ser humano.
6. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que la muestra es
fluida.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que el fluido está seleccionado entre el grupo constituido por
sangre, suero, plasma, linfa, y fluido intersticial.
8. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, en el que el polipéptido BORIS
comprende un polipéptido BORIS nativo de longitud total.
9. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que el polipéptido BORIS
comprende al menos una porción del dominio
N-terminal de BORIS.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el polipéptido BORIS comprende al menos 200 aminoácidos
procedentes del dominio N-terminal de BORIS.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que el polipéptido BORIS comprende la secuencia de aminoácidos
codificada por la SEC ID NO:1.
12. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, en el que el polipéptido
BORIS comprende al menos una porción del dominio
C-terminal de BORIS.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que el polipéptido BORIS comprende al menos 100 aminoácidos
procedentes del dominio C-terminal de BORIS.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que el polipéptido BORIS comprende la secuencia de aminoácidos
codificada por la SEC ID NO: 2.
15. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, en el que el polipéptido
BORIS comprende al menos una porción de los dominios
N-terminal y C-terminal de
BORIS.
16. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, en el que el polipéptido
BORIS comprende además un ligador flexible.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que el ligador flexible comprende una secuencia de aminoácidos de
la SEC ID NO: 5.
18. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-17, en el que el polipéptido
BORIS no comprende la región de huella de cinc de BORIS.
19. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-18, en el que el polipéptido
BORIS comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la SEC
ID NO: 3.
20. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, 9, 12, y 15, en el que el
polipéptido BORIS comprende menos de 60 aminoácidos.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en
el que el polipéptido BORIS comprende 10-20
aminoácidos.
22. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-21, en el que el polipéptido
tiene al menos ocho restos de aminoácidos y específicamente unidos
con un anticuerpo BORIS.
23. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-22, que comprende además la
determinación de la clase del anticuerpo que se une con el
polipéptido BORIS.
24. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-23, en el que el anticuerpo
detectado tiene una afinidad por BORIS que es mayor que su afinidad
de unión por el factor de unión CCCTC (CTCF).
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