ES2326101T3

ES2326101T3 - Vector de virus arn cadena (-) para celulas nerviosas.

Info

Publication number: ES2326101T3
Application number: ES99926878T
Authority: ES
Inventors: Masayuki Fukumura; Makoto Asakawa; Mamoru Hasegawa
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-01
Publication date: 2009-09-30
Anticipated expiration: 2019-07-01
Also published as: AU4395599A; US20050158279A1; JP3883213B2; EP1094115A1; ATE430806T1; CN1314949A; KR20010074631A; EP1094115A4; DE69940848D1; CN1249248C; HK1039792B; EP1094115B1; HK1039792A1; WO2000001837A1; CA2336472C; CA2336472A1

Abstract

Un método para transferir ácido nucleico a células nerviosas in vitro, que consiste en un paso de poner en contacto las células nerviosas con un vector viral de ARN de sentido negativo que está formado por un gen externo en su genoma o poner en contacto las células nerviosas que están formadas por dicho vector, donde dicho virus de ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.

Description

Vector de virus ARN cadena (-) para células nerviosas.

Campo técnico

La presente invención hace referencia a un método in vitro para transferir un gen para terapia de genes de células nerviosas usando un vector virus, más específicamente, un vector virus ARN de sentido negativo y materias relacionadas.

Técnica de contexto

Es un objeto extremadamente importante en la terapia de genes para humanos y animales desarrollar un sistema a través del cual se transfiera un gen a órganos objetivos y células objetivas con una elevada eficiencia. Los métodos para transferir un gen incluyen el método de fosfato de calcio, el método DEAE-dextrano, el método con liposoma catiónico, el método de electroporación, etc., y especialmente métodos para transferir un gen in vivo incluyen un método que usa un virus o liposoma, o un método de transferencia directa. Entre ellos, la trasferencia de gen llevada a cabo usando "un vector virus" obtenido por recombinación de gen viral es extremadamente útil para la transferencia de un gen a células, por ejemplo, para terapia de genes debido al procedimiento fácil de transferencia y a su elevada eficacia de transferencia.

Los vectores de virus comúnmente empleados en el presente en terapia de genes incluyen vectores de retrovirus, vector del virus herpes simplex (VHS), vector de adenovirus, y vector de virus asociado a adeno (AAV), etc. En particular, junto con los progresos recientes en análisis de funciones cerebrales usando MRI y PET, existe una gran demanda de vectores capaces de infectar de manera eficiente células nerviosas no divisoras y mediar una expresión de transgen con elevado nivel en las células infectadas. Por lo tanto, el vector adenoviral, el vector del virus herpes simples, AAV, VIH, etc., han recibido considerable atención.

A pesar de que se ha comprobado que VHS es capaz de transferir un gen a los ganglios en el sistema nervioso periférico, aún queda el problema de la cantidad de su expresión (Gene Therapy, 1995, 2:209-217). La infección de VIH de células nerviosas también ha sido confirmada (Nature Biotechnology, 1997, 15:871-875). Debido a que la posición cromosomal en la cual el genoma de VIH se inserta es prácticamente impredecible, hay posibilidades de dañar un gen normal, activar un gen cancerígeno, e inducir expresión excesiva o nula de un gen deseado.

AAV se ha empleado para el tratamiento del cerebro en enfermedad de Parkinson (Exp. Neurol., 1997, 144: 147-156) y mucopolisacaridosis del tipo Vil (Reunión ASGT, 1998, Artículo Nº 692). Sin embargo, se ha demostrado una transferencia incompleta del gen introducido en la sustancia negra en la enfermedad de Parkinson y su expresión insuficiente en el cerebro en mucopolisacaridosis del tipo VII.

El adenovirus ha sido el más empleado en el presente, y ha demostrado ser capaz de transferir un gen a la capa celular piramidal del hipocampo (Nature Medicine, 1997, 3: 997-1004). Sin embargo, el adenovirus presenta inconvenientes, como citotoxicidad y elevada inmunogenicidad.

Por otra parte, debido a que los virus de ARN de sentido negativo, como virus Sendai, no se integran en cromosomas, no activan genes cancerígenos. Además, ya que el virus Sendai es un virus de ARN, tiene ventajas, como su expresión proteica en un breve periodo de tiempo tras la infección y una expresión con nivel extremadamente alto del producto transgen en comparación con el Adenovirus.

En Biosis Abstract PREV 199799322964 los oligonucleótidos hechos un complejo con virus de hemaglutina de Japón (HUJ) se enviaron a células de CNS.

Descripción de la invención

Es un objetivo de esta invención proporcionar un método in vitro para transferir ácido nucleico usando un vector viral de ARN de sentido negativo, útil para terapia de genes de células nerviosas.

La presente invención primero preparó virus recombinantes que transportan varios genes externos, usando virus Sendai, un virus típico de ARN de sentido negativo y útil como vector para terapia de genes debido a su seguridad y conveniencia. Posteriormente, virus recombinantes se emplearon para transferir los genes externos a las células nerviosas, tejidos del cerebro, etc. Como resultado, los inventores descubrieron que el uso de estos recombinantes permitió una eficiente transferencia de genes externos a células nerviosas y tejidos del cerebro. Además, descubrieron que el uso de vectores virales de esta invención provocó una expresión de elevado nivel de genes externos
introducidos.

Además, los vectores virales de esta invención transferidos al cerebro mostraron la proliferación limitada. En otras palabras, la expresión de los vectores se redujo tras un cierto periodo de tiempo de la expresión de gen externo. Además, la terapia de genes que usó un vector viral de esta invención se aplicó al cerebro de un ratón deficiente de \beta-glucoronidasa, que mejoró los síntomas de dicho ratón. Por lo tanto, los presentes inventores descubrieron que los vectores virales preparados podrían funcionar de modo eficiente en la terapia de genes de neuropatía donde la terapia requiere regulación de expresión del transgén.

La administración intraventricular de un vector viral de esta invención que transporta un gen FGF a jerbos o ratones resultó en la infección del vector de células ependimales y el descenso de la toma de comida y peso corporal en los animales. Las células ependimales forman una capa celular que separa el cerebro de los ventrículos, y en el tercer ventrículo el fluido cerebroespinal y los núcleos hipotalámicos interactúan de manera íntima. Debido a que los vectores de esta invención pueden infectar eficientemente las células ependimales, pueden emplearse para expresar una proteína segregadora en el ventrículo para que la proteína pueda actuar sobre los núcleos hipotalámicos (centro de alimentación, centro de saciedad, etc.). Además, en un modelo isquémico usando jerbos, se ha revelado que la lesión celular se reduce de manera significativa introduciendo un vector viral para una expresión de factor de crecimiento en las células parenquimales del hipocampo, indicando una utilidad del vector de esta invención para prevenir la muerte celular debido a la exfoliación celular en isquemia cerebral. Estos hechos han indicado que los vectores de esta invención son útiles como vectores para transferir un gen al cerebro en varios tratamientos médicos.

La presente invención hace referencia a:

1.: Un método para transferir ácido nucleico a células nerviosas in vitro, que consiste en un paso de poner en contacto las células nerviosas con un vector viral de ARN de sentido negativo que está formado por un gen externo en su genoma o poner en contacto las células nerviosas que están formadas por dicho vector, donde dicho virus de ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae;

2.: Uso de un vector viral de ARN de sentido negativo para la fabricación de un medicamento para controlar el comportamiento alimenticio de animales, donde dicho vector está formado por un gen externo que codifica el factor de crecimiento para fibroblasto (FGF)-1 o FGF-5 en su genoma, y dicho virus ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae;

3.: Uso de un vector viral de ARN de sentido negativo para la fabricación de un medicamento para terapia de genes enfocada a células nerviosas, donde dicho vector está formado por un gen externo en su genoma, y dicho virus ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae;

4.: Uso de 3, donde dichas células nerviosas son las células del sistema nervioso central;

5.: Uso de 4, donde dichas células del sistema nervioso central son células ependimales ventriculares;

6.: Uso de 4, donde dichas células del sistema nervioso central son células del hipocampo;

7.: Uso de cualquiera 2 a 6, que además permite expresar de manera pasajera dicho gen externo;

8.: Uso de cualquiera 2 a 7, donde dicho gen externo codifica una proteína segregadora;

9.: Uso de 8, donde dicha proteína actúa sobre los núcleos hipotalámicos;

10.: Uso de 8, donde dicha proteína es capaz de proteger el cerebro frente a isquemia;

11.: Uso de cualquiera 2 a 10, donde dicho virus que pertenece a la familia Paramixoviridae es el virus Sendai; y

12.: Un vector viral de ARN de sentido negativo para terapia de genes in vivo de células nerviosas, estando formado dicho vector por un gen externo que codifica una proteína segregadora en su genoma, donde dicho virus de ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.

\vskip1.000000\baselineskip

En esta invención, "vectores virales de ARN de sentido negativo" incluyen un complejo que se deriva de un virus de ARN de sentido negativo y que tiene Infectividad. Aquí, "infectividad" significa la "capacidad de un complejo para transferir su ácido nucleico u otras sustancias en el interior del mismo a una célula a través de su habilidad para adherirse o fusionarse con la membrana celular".

En esta invención, el vector viral de ARN de sentido negativo puede prepararse usando, por ejemplo, un virus de ARN de sentido negativo como un material de inicio. Los virus empleados como materiales de inicio son virus que pertenecen a la familia Paramixoviridae como virus Sendai, virus de enfermedad de Newcastle, virus de las paperas, virus del sarampión, virus RS (virus sincitial respiratorio), virus de la peste bovina y virus del moquillo.

Cuando se emplea el virus Senai, un grupo de proteínas codificada por los tres genes, NP, P/C y L, que se cree que son esenciales para su réplica autónoma, no son estrictamente necesarias para codificarse por el vector viral de esta invención. Por ejemplo, el vector de esta invención puede producirse en las células huésped que transportan los genes codificadores de este grupo de proteínas para que las células huésped puedan proporcionar estas proteínas. Además, las secuencias de aminoácidos de estas proteínas no son necesariamente idénticas a las nativas del virus. Puede introducirse cualquier mutación o pueden emplearse sustituciones de genes homólogos de otros virus siempre y cuando las actividades transferidas por su ácido nucleico sean iguales o superiores a las de las proteínas que ocurren de manera natural.

Además, cuando se emplea el virus Sendai, un grupo de proteínas codificadas por los genes M, F y HN, que se cree que son esenciales para la capacidad de diseminación del virus, no son estrictamente necesarias para codificarse por el vector viral de esta invención. Por ejemplo, el vector de esta invención puede producirse en las células huésped que transportan los genes codificadores de este grupo de proteínas para que las células huésped puedan proporcionar estas proteínas. Además, las secuencias de aminoácidos de estas proteínas no son necesariamente idénticas a las nativas del virus. Puede introducirse cualquier mutación o pueden emplearse sustituciones de genes homólogos de otros virus siempre y cuando las actividades transferidas por su ácido nucleico sean iguales o superiores a las de las proteínas que ocurren de manera natural.

Para transferir un gen externo a células nerviosas, puede prepararse y usarse un complejo formado por un genoma recombinante viral en el que se inserta un gen externo. El complejo constituido por un genoma recombinante viral puede obtenerse por medio de transcripción in vitro o in vivo de un cADN modificado derivado de cualquiera de los virus anteriormente mencionados o un virus recombinante de los mismos seguido por reconstrucción del virus. Un método para reconstituir un virus ya se ha desarrollado (ver WO 97/16539).

Además, en lugar del genoma del virus completo Sendai, también pueden emplearse virus incompletos como partículas interferentes defectuosas (partículas DI) (J. Virol. 68, 8413-8417, 1994), oligonucleótidos sintéticos, etc., como componentes para constituir el complejo.

Cuando se emplea el virus Sendai como material, un complejo puede contener los tres genes, M, F, y HF, que se encuentran implicados en la capacidad de diseminación del virus. Sin embargo, en general, a pesar de que un complejo que incluye todos los genes M, F y HN se transfiere al cerebro, el complejo presumiblemente falla en la demostración de su capacidad de diseminación tras la formación de partículas virales, debido a la ausencia de proteasa para partir la proteína F, una proteína esencial para la capacidad de diseminación del virus Sendai. Aquí, "capacidad de diseminación" significa "la habilidad del ácido nucleico, que se transfiere a la célula por infección o empleando una técnica artificial, para replicar y dirigir la formación de partículas infecciosas o sus complejos equivalentes que pueden diseminar el ácido nucleico a otras células". En cambio, para incrementar la seguridad, los genes involucrados en la capacidad de diseminación de los virus se eliminan preferentemente o se inactivan funcionalmente en el genoma viral en el complejo. En el caso de virus Sendai, los genes involucrados en la capacidad de diseminación del virus son los genes M, F y/o HN. Se ha desarrollado un sistema de reconstitución de dichos complejos (WO 97/165538). Por ejemplo, para el virus Sendai, un vector viral que está formado por un genoma desde el que los genes F y/o HN se borran puede prepararse a partir del genoma contenido en el complejo reconstituido. Dichos vectores también se incluyen en los vectores de esta invención para transferir ácido nucleico a células nerviosas.

El complejo puede contener en su superficie de envoltura un factor que es capaz de adherirse a una célula específica, como un factor de adhesión, ligando, receptor, etc. Por ejemplo, partes de los genes del virus recombinante de ADN de sentido negativo pueden modificarse para inactivar los genes relacionados con la inmunogenicidad o para aumentar la eficiencia de transcripción y réplica de ARN.

El ARN contenido en el complejo puede incorporarse a un gen externo en su lugar apropiado. Para expresar una proteína deseada, un gen externo codificador de la proteína se incorpora al ARN. Para el ARN del virus Sendai, una secuencia de nucleótido consistente en nucleótidos en múltiples de seis se inserta de manera preferente entre las secuencias R1 y R2 (Journal of Virology, 1993, Vol. 67, No. 8, pp. 4822-4830). La expresión del gen externo insertada en el ARN puede regularse por medio del punto de inserción del gen o de la secuencia de ARN en la vecindad del gen insertado. Por ejemplo, en el caso de ARN viral de Sendai, se sabe que cuanto más cerca al gen NP se encuentre la posición de inserción de ARN, más alto será el nivel de expresión del gen insertado.

Un gen externo codificado por el ARN contenido en el complejo puede expresarse por células infecciosas con el complejo. Tal y como se muestra en los ejemplos a continuación, se ha demostrado que el complejo preparado como una realización de esta invención usando el sistema de reconstitución de virus Sendai permite una transferencia eficiente de un gen externo a varias cepas de células nerviosas. Tal y como se muestra en el Ejemplo 5, también se ha revelado que otra realización del complejo de esta invención en la que se emplea gen \beta-glucoronidasa como gen externo muestra una expresión significativamente más elevada que los vectores retrovirales. Debido a estas características, el complejo de esta invención puede emplearse para transferir genes a células nerviosas. Por ello, una realización del complejo de esta invención mostrado en el Ejemplo 6 disminuye su expresión aproximadamente una semana tras la administración intraventricular, y es útil en una terapia tal como la de genes que requiere la expresión de gen solamente durante un periodo limitado de tiempo.

El ácido nucleico de otros compuestos contenidos en el complejo preparado puede introducirse a las células nerviosas poniendo en contacto el complejo con las células nerviosas o directamente poniendo en contacto las células productoras de vector viral con las células nerviosas. Cuando se administra el complejo al cerebro, la administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, abriendo un agujero en el hueso craneal tras craniotomía bajo anestesia, seguido de inyección del complejo usando una aguja de cristal o un material similar. El complejo puede contener genes externos. Los genes externos pueden incluir cualquier tipo de gen, como gen específico de células nerviosas, gen supresor de apoptosis, u otros genes para tratar varios tipos de enfermedades, etc. Dichos genes pueden tomar las formas de ADN antisentido y ribozima de modo que inhiben la función de un gen específico.

Por ejemplo, se ha revelado que la muerte de células del cerebro en tejidos isquémico no ocurre justo después de la isquemia, sino varios días después (Neurosci. Left. 1998, 240: 69-72). Para evitar la muerte de células del cerebro en tal caso, puede usarse un complejo de esta invención que está formado por un gen responsable de la supresión de la muerte celular, como bcl-2, etc. De hecho, durante la investigación sobre si la administración del vector de esta invención pudiese prevenir o no la exfoliación retrasada de células nerviosas frágiles debido a la reducción de nutrientes causada por isquemia, se reveló que la administración de un vector de expresión FGF-1 podía prevenir de manera significativa la exfoliación celular (Ejemplo 10). Además, tal y como se demuestra en los Ejemplos 6 y 8, el complejo de esta invención puede transferir un gen externo a células ependimales y células presentes a lo largo del ventrículo a través de administración intraventricular. El uso de un gen que expresa una proteína segregadora como gen externo puede esparcir la proteína a través del fluido espinal al cerebro incluyendo el área del hipocampo. Tal y como se muestra en el Ejemplo 7, una realización del complejo de esta invención se expresó en células nerviosas incluso 13 días después de la administración del complejo al cerebro. La transferencia del complejo no causó ninguna muerte celular. Estos resultados indican la utilidad del complejo de esta invención para la terapia de genes de nervios centrales. Por ejemplo, en el Ejemplo 9, se demostró que la administración intraventricular de un vector de expresión FGF podía controlar de manera exitosa la cantidad de ingesta de comida y reducir el peso corporal. La pérdida de peso corporal atribuida a FGF-2 (Denton, D. A., et al. (1995) Physiol. Beba. 57 (4): 747-752) y la reducción del nivel de azúcar en sangre acompañada de la pérdida de peso corporal (Stephens, T. W. et al. (1995) Nature 377 (6549): 430-532) ya fueron demostradas, lo que coincide con los resultados obtenidos en la presente invención donde el nivel de azúcar en sangre se redujo en asociación con la pérdida de peso corporal.

Por lo tanto, los vectores de esta invención proporcionan un modo nuevo de administración de vectores enfocados a células ependimales. Además de las células ependimales, las células objetivo incluyen, aunque no se limitan a células presentes a lo largo de los ventrículos, células en la región del hipocampo, especialmente células piramidales del hipocampo, células de la raíz neural, células de la cresta neural derivadas de embriones de mamíferos, etc. Los genes que pueden introducirse incluyen, pero no se limitan a, aquellos para factores de crecimiento de fibroblasto, factores de crecimiento de nervios, inhibidores de apoptosis, proteínas de impacto de calor, peroxidasa, etc. Los ejemplos específicos de dichos genes incluyen aquellos para FGF-1 (J. Biol. Chem. 271 (47): 30263-30271, 1996), FGF-5 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (20): 8022-8026, 1990), NGF (Nature, 302 (2): 538-540, 1983), CNTF (Nature, 357 (6): 502-504, 1992), BDNF (EMBO J., 9 (8): 2459-2464, 1990; Genomics, 10 (3): 558-568, 1991), GDNF (J. Neurosci. Res. 41 (2): 279-290, 1995), p35 (J. Virol. 61 (7): 2264-2272, 1987), CrmA (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 7698-7702, 1986), ILP (EMBO J., 15 (11): 2685-2694, 1996), bcl-2 (Oncogene., 4 (11): 1331-6, 1989), ORP 150 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 230 (1): 94-99, 1997), etc. Los vectores de esta invención son útiles no solamente para buscar genes usando chips de ADN y selecciones de ADN, sino también para preparar de manera conveniente ratones modelo así como para desarrollar medicinas.

Los animales en los que el complejo de esta invención puede introducirse incluyen todos los tipos de mamíferos como humanos, jerbos, ratones, ganado, monos, etc.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra de modo esquemático un método para construir el virus Sendai competente de réplica (SeV) que está formado por un gen externo, como GFP o \beta-glucoronidasa. Usando el imprimador 1, que tiene un lugar NotI, y un imprimador 2, que está constituido por una señal de terminación para transcripción (R2), una secuencia interventora (Ig), una secuencia de iniciación para transcripción (R1) y un punto NotI, el ORF de un gen externo se amplifica por PCR y se inserta en el lugar NotI de pUC18/T7HVRJzADN (+18).

La Figura 2 es una vista en sección frontal del cerebro del ratón que muestra la expresión de GFG en un ratón infectado por el virus Sendai que está formado por el gen GFP (GFP-SeV).

La Figura 3 es una vista en sección del ventrículo lateral que muestra la expresión de \beta-glucoronidasa en un ratón deficiente de \beta-glucoronidasa 3 días después de la infección con virus Sendai que transporta el gen \beta-glucoronidasa.

La Figura 4A muestra una vista en sección transversal del ventrículo lateral que muestra la expresión \beta-glucoronidasa (áreas enmarcadas) en el ventrículo de un ratón deficiente de \beta-glucoronidasa 12 días después de la infección con virus Sendai que transporta el gen \beta-glucoronidasa. La Figura 4B muestra la sección adyacente a la de la Figura 4A teñida por el método Lorbacher.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los cambios en el peso corporal de jerbos tras la administración intraventricular de virus Sendai que expresa FGF-1, FGF-5 y GFP.

La Figura 6 es un gráfico que muestra los cambios en el peso corporal de ratones tras la administración intraventricular de virus Sendai que expresa FGF-1, FGF-5 y GFP.

La Figura 7 es un gráfico que muestra los cambios en la cantidad de ingesta de comida de ratones tras la administración intraventricular de virus Sendai que expresan FGF-1, FGF-5 y GFP.

La Figura 8 son micrográficos que muestran la exfoliación retrasada de células piramidales en el área CA1 del hipocampo de un jerbo 5 días después de isquemia.

La Figura 9 son micrográficos que muestran la prevención de exfoliación retrasada de células piramidales en la región CA1 del hipocampo tras la administración de un vector viral Sendai que expresa FGF-1.

\vskip1.000000\baselineskip

Mejor modo de realización de la invención

La presente invención se explicará con mayor detalle con referencia a los ejemplos a continuación, pero no debe entenderse como limitada a ellos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Preparación de virus Sendai competente para réplica (SeV)

Un fragmento NotI que está formado por un gen externo que va a ser transferido, señales de iniciación de transcripción (R1) y terminación (R2), y secuencia interventora (IG) (Fig. 1) se amplificó por PCR y se insertó en el lugar de división NotI de unidad de transcripción SeV pUC18/T7HVRJzADN (+18).(Genes Cells, 1996, 1: 569-579) (Fig. 1). De acuerdo con un método establecido (Genes Cells, 1996, 1: 569-579) usando células LLCMK2 y huevos de pollos embrionados, el virus que contiene los genes anteriormente descritos fue reconstituido, dando como resultado la recuperación del virus que contiene el gen deseado.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Confirmación de Infectividad de "GFP-SeV" para líneas celulares nerviosas establecidas

Como líneas celulares establecidas se emplearon células de fenocromocitoma de rata (PC12), neuroblastoma humano (IMR-32) y células de glioblastoma humano) (A172). Las células PC12 se cultivaron en un medio DMEM complementado con suero de caballo y suero de ternero hasta una concentración final de 5% de cada suero. Para provocar el brote de neurita, se añadió un factor de crecimiento de nervio (NGF7S) al medio hasta una concentración final de 50 ng/ml. Un medio MEM que contenía 10% suero de ternero complementado con una solución MEM de piruvato de sodio y solución MEM de aminoácido no esencial hasta una concentración final de 1 mM y 0.1 mM, respectivamente, se empleó para el cultivo de células de neuroblastoma humano (IMR-32). Las células de glioblastoma humano (A172) se cultivaron en un medio MEM (medio con alta glucosa) que contenía 10% suero de ternero.

Se emplataron 10^{5} células en un plato de 6 cm que contenía NGF en el medio, se incubaron durante 3 días para producir el brote de neurita y a continuación se emplearon para experimento de infección de célula PC12. Tras retirar el medio, las células se lavaron una vez con PBS. Se diluyó SeV en el cual se introduce el gen GFP (a partir de ahora referido como GFP-SeV) con 500 \mul de PBS complementado con 1% albúmina de suero bovino en placas 10^{6} que forman unidad (p.f.u.), y se añadió a las células para infectar GFP-SeV durante 20 minutos bajo las condiciones donde las células se protegieron de secado. Tras la infección el medio (5 ml) se añadió a las placas, y las células se cultivaron durante 2 días. Tras el cultivo, las células se examinaron para fluorescencia GFP bajo un microscopio estereoscópico fluorescente en el interior de las células. La emisión de fluorescencia no se pudo observar con las células de control infectadas con SeV transportando ningún gen GFP y con células no infectadas.

Las células IMR-32 (3 x 10^{5} células) se emplataron en una placa de 10 cm que contenía un medio predeterminado, y se cultivaron durante la noche. En base a que se estimó que el número de células era 6 x 10^{5} tras el cultivo, se diluyó GFP-SeV a m.o.i (multiplicidad de infección) de 10 con 1000 \mul de PBS que contenía 1% albúmina de suero bovino. Después de que las células fueron infectadas con el virus durante 20 min, se cultivaron en un medio predeterminado durante 12 o 36 horas, y a continuación se examinaron para fluorescencia GFP bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. Tras el cultivo de 12 horas, se observó fluorescencia en el cuerpo celular de células infectadas con GFP-SeV. Después del cultivo de 36 horas se observó fluorescencia GFP en la porción neurita además de en el cuerpo celular. No se observó fluorescencia en las células de control infectadas con SeV transportando ningún gen GFP y con células no infectadas.

Las células A172 también se infectaron con el virus de manera similar a la empleada con las células IMR-32. Se observó fluorescencia en el cuerpo celular de células infectadas por GFP-SeV, pero no en las células de control infectadas con SeV transportando ningún gen GFP y en células no infectadas.

GFP-SeV infectó todas las cepas establecidas de células nerviosas en el presente estudio, y tuvo éxito en la expresión de GFP a partir del gen GFP en el interior de células. Estos resultados indicaron una posibilidad de la infección SeV del cultivo primario de células del cerebro por administración in vivo del virus.

Ejemplo 3 Cultivo de células primarias del cerebro de rata

Una rata SD de 18 días de embarazo fue profundamente anestesiada con éter de dietilo, y fue sometida a eutanasia por la exanguinación de la arteria axilar. Después de desinfectar la región abdominal con etanol 95%, se sometió a laparotomía para retirar los fetos junto con el óvulo. Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo bajo condición libre de gérmenes en hielo, o en solución fría con hielo a menos que se establezca lo contrario. Los fetos se retiraron del útero empleando tijeras y fórceps de cabeza redondeada, y se transfirieron a una placa que contenía 20 ml de una solución para operación (50% DMEM y 50% PBS). Después de colocar los fetos en una almohadilla con gasa esterilizada, se realizó una incisión en el cuero cabelludo y en el esqueleto a lo largo de la línea central usando dos pares de fórceps INOX#4. A continuación, se insertó un par de fórceps INOX#7 a lo largo de la superficie inferior del tejido del cerebro para sacar el tejido cerebral como un todo cortando la médula oblongata, y el tejido se cortó y colocó en la solución para operación. Bajo un microscopio estereoscópico, el cerebro en la solución para operación se fileteó en tres partes usando dos escalpelos para separar la raíz cerebral, y dos piezas de los hemisferios cerebrales que contenían el hipocampo y el cuerpo estriado se transfirieron a otra solución de operación con fórceps con cabeza redondeada. Bajo un microscopio estereoscópico, se retiró completamente la meninge de la superficie del tejido cerebral usando dos pares de fórceps INOX#7 y se transfirió a otra solución de operación usando fórceps con extremos redondeados para lavado. Se colocaron seis piezas de hemisferios cerebrales en una solución de preservación (90% DMEM (que contenía 5% suero de caballo y 5% de suero de ternero), y 10% DMSO) con fórceps de extremos redondeados, y a continuación se cortaron en pequeños trozos de rodajas menores de 1 mm usando un escalpelo. Por lo tanto, las piezas del tejido cortados se colocaron en aproximadamente 1.5 ml de la solución de preservación en un tubo pre-enfriado, que se almacenó en un contenedor enfriador, se congelaron de manera lenta durante un periodo de 3 horas, y a continuación se almacenaron en nitrógeno líquido. Las piezas del tejido de 6 hemisferios cerebrales se sacaron del nitrógeno líquido, se descongelaron a 32ºC, se lavaron dos veces en 8 ml de la solución de operación, y se dejaron reposar durante 30 segundos para después retirar el sobrenadante. A las piezas del tejido se añadieron 5 ml de una solución de enzima de papaya enfriada con hielo (papaína 1.5 U, cisteína 0.2 mg, albúmina de suero bovino 0.2 mg, glucosa 5 mg, y Dnasa 0.2 mg/mkl) que había sido filtrado y esterilizado. La mezcla se calentó a 32ºC durante 15 min. Y se mezcló invirtiendo el tubo cada 5 minutos. Se separó el sobrenadante y se añadieron 5 ml de la solución que contenía 20% del suero de ternero. Se añadió una solución de papaína (5 ml) precalentada a 32ºC a la fracción del precipitado, y la mezcla resultante se calentó además durante 15 minutos. La mezcla se mezcló invirtiendo el tubo cada 5 minutos. Tras una buena turbiedad del sobrenadante así como la confirmación de la traslucidez de las piezas del tejido, las piezas del tejido se partieron por pipeteo. La primera fracción de sobrenadante precalentada a 32ºC se añadió a esta solución muestra, y la mezcla resultante se centrífugo en un centrifugado precalentado a 32ºC (a 1200 rpm durante 5 minutos). Tras la retirada del sobrenadante, se añadieron 5 ml de DMEM (que contenía 5% de suero de caballo y 5% de suero de ternero) y se mezcló con el residuo para dividir las células, y a continuación tuvo lugar una centrifugación bajo las condiciones anteriormente descritas. Tras la retirada del sobrenadante, se añadieron 2 ml de DMEM (que contenía 5% de suero de caballo y 5% de suero de ternero) al residuo y la mezcla resultante se agitó. Como resultado del conteo celular, el número de células resultó ser 5 x 10^{6} células/ml. Por lo tanto, el principal cultivo de células del cerebro obtenido se plantó en una placa cubierta con imina de polietileno y se cultivó.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Confirmación de infección de SeV en el cultivo primario de células del cerebro usando GFP-SeV

El cultivo primario de células del cerebro obtenidas en el Ejemplo 3 se cultivó en una placa de 10 cm durante 3 días. Tras la retirada del sobrenadante, se añadió una solución de muestra preparada diluyendo GFP-SeV en 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino al cultivo para infectar el virus durante 20 minutos. Tras la infección, se añadieron 10 ml de DMEM (que contenía 5% de suero de caballo y 5% de suero de ternero), y las células se cultivaron durante 2 días. A continuación, las células se examinaron para fluorescencia de GFP bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. Casi todas las células mostraron fluorescencia. Es decir, se confirmó que SeV infecta incluso el cultivo primario de células del cerebro.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Infección de virus Sendia que transporta el gen \beta-glucuronidasa (de aquí en adelante abreviado como \beta-glu-SeV) a células de fibroblasto humano deficientes del gen \beta-glucuronidasa y expresión de dicha enzima en las células

Para la mejora de esta invención, se emplearon las células de fibroblasto humano deficientes del gen \beta-glucuronidasa (de aquí en adelante abreviado como \beta-glu-célula deficiente) y células de fibroblasto normal.

La mucopolisacaridosis del tipo VII, un tipo de mucopolisacaridosis, es provocada por la deficiencia de \beta-glucuronidasa, y muestra una variedad de síntomas que van desde un caso leve a un caso severo de hidropesía fetal. Hay muchos casos que muestran varios síntomas desarrollados durante el periodo infantil, que incluyen la característica facial, esplenohepatomegalia, retardo psicomotriz, deformación ósea, etc.

Se ha indicado que, para el transporte intracelular de \beta-glucuronidasa a lisosoma, la adición de cadena de azúcar a la molécula de enzima y la fosforilización de la posición 6 de la molécula de manosa a la enzima son necesarias. A la llegada al lisosoma, la terminal C de la enzima sufre proteólisis.

Antes de la mejora de esta invención, se examinó \beta-glu-SeV para 1) su infección en células de fibroblasto humano, 2) su cantidad de expresión, y 3) la presencia de sus especies moleculares para ser transportadas a lisosoma.

1): Se prepararon células de fibroblasto deficientes de \beta-glu de modo que se colocaron 10^{5} células/pozo en una placa con 6 pozos. \beta-glu-SeV se diluyó en 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino par que la multiplicidad del cultivo (m.o.i) fuera 5, y las células deficientes de \beta-glu cultivadas durante la noche se infectaron durante una hora. Las células se cultivaron en un medio MEM libre de suero durante 24 horas. Por consiguiente, las células se fijaron a una mezcla de formalina y acetona (1:7, v/v). Con naftol AS-B1 glucuronida como un sustrato, la reacción se llevó a cabo en búfer de acetato, pH 5.0 a 37ºC, y la descomposición del sustrato se controló por la coloración roja. Como resultado, el citoplasma de células deficientes de \beta-glu incubadas con "\beta-glu-SeV" se tiñó de rojo, indicando que las células deficientes de \beta-glu se infectaron con \beta-glu-SeV' para expresar el gen transferido.

2): Se prepararon células de fibroblasto deficientes de \beta-glu de modo que se colocaron 10^{5} células/pozo en una placa con 6 pozos. \beta-glu-SeV se diluyó en 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino para que la multiplicidad del cultivo (m.o.i) fuera 0.1 y 1.0 y se incubaron durante la noche durante 24 o 48 horas. Tras la incubación durante el periodo predeterminado, las células se recuperaron y se sometieron a ultrasonido para preparar las facciones intracelulares. Con 4-metilumbeliferil- \beta-D-glucuronida como un sustrato, la cantidad de 4-metilumbeliferona (MU), el producto de reacción enzimática, se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia con un fluoro-espectrofotómetro. Los resultados se muestran en la Tabla 1. En esta tabla, la cantidad de expresión está representada por la cantidad de 4-metilumbeliferona (MU) producida por 1 mg de proteína en la fracción intracelular en una hora.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

200

Tal y como se muestra en la Tabla 1, la cantidad de expresión oscila entre 15,900 y 32,300 (nmol MU/proteína total/h) y 276 para células de fibroblasto normal y 911 para la células que expresa \beta-glucuronidasa con un retrovirus \beta-glu-retro), indicando que SeV fuertemente expresa un transgen en las células infectadas con SeV.

3) Las fracciones obtenidas en 2) se emplearon como la fracción intracelular de células de fibroblasto deficientes de \beta-glucuronidasa infectadas por "\beta-glu-SeV". Al igual que la fracción sobrenadante del cultivo, las proteínas contenidas en el sobrenadante del cultivo se recuperaron por precipitación con acetona fría. Por lo tanto, las muestras del test obtenidas se sometieron al análisis Western Blot usando un anticuerpo \beta-glucuronidasa anti-humano. Como resultado, en la fracción intracelular de células de fibroblasto deficientes de \beta-glucuronidasa infectadas por "\beta-glu-SeV", se identificaron dos tipos de proteínas: una tiene un elevado peso molecular y otra tiene un bajo peso molecular, y ambas son reactivas con el anticuerpo \beta-glucuronidasa anti-humano. La banda de la proteína de bajo peso molecular corresponde con la proteína reactiva con el anticuerpo \beta-glucuronidasa anti-humano en células de fibroblasto normal, lo que indica que es una especie molecular de \beta-glucuronidasa cuya terminal C ha sufrido proteólisis tras ser transportada al lisosoma. La proteína de elevado peso molecular no se observó en la célula de fibroblasto normal, pero estuvo presente en las fracciones intracelular y sobrenadantes de células de fibroblasto deficientes de \beta-glucuronidasa infectadas por "\beta-glu-SeV". La fracción sobrenadante solamente contuvo la proteína de elevado peso molecular. Esto puede deberse a la una expresión demasiado elevada de \beta-glucuronidasa provocada por la infección de \beta-glu-SeV, en la cual el transporte de especies de proteína de elevado peso molecular a lisosoma falló en alcanzar dicha elevada expresión de enzima, dando como resultado la segregación de la proteína en microsoma o espacio extracelular. De manera alternativa, juzgando su peso molecular, la proteína de elevado peso molecular puede ser una especie molecular con una cadena de azúcar unida pero sin la posición 6 de molécula de manosa siendo fosforilizada de modo que no puede transportarse a un lisosoma.

Por lo tanto, la \beta-glucuronidasa humana, que se asume que se transporta a lisosoma, fue capaz de expresarse en la fracción intracelular de células de fibroblasto deficientes de \beta-glucuronidasa infectadas por "\beta-glu-SeV".

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Expresión de GFP en células ependimales por administración intraventricular de GFP-SeV

Ratones de 8-10 semanas fueron anestesiados con 200 \mul de Nembutal diluido 10 veces. Tras craniotomía, se perforó un agujero de 1 mm de diámetro en el esqueleto en la posición 1.0 mm desde el bregma y 1.5 mm a la derecha de la línea central con una taladradora dental. Tras la retirada de la dura, se administró GFP-SeV en la posición 1.3 mm de profundidad usando una aguja de jeringuilla 27 G. La dosis de GFP-SeV fue de 20 a 30 \mul, y el número de virus contenidos en la solución de muestra se estimó que fue 1 x 10^{7} p.f.0 a 1.5 x 10^{7} p.f.u.. A los ratones de control se les administró PVS o SeV que no transportaba ningún gen GFP. La autopsia se realizó 3, 5, 7 y 10 días después de la administración. Se retiró todo el cerebro, se realizó una sección transversal frontal. Bajo un microscópico estereoscópico fluorescente, se observó fluorescencia GFP. En el cerebro diseccionado sometido a autopsia 3 días después de la administración de GFP-SeV, se observó una evidente fluorescencia GFP. En el punto a lo largo del ventrículo de la sección transversal frontal, se observó fluorescencia distinta de GFP (Fig. 2). Tal y como se describe en el Ejemplo 8 a continuación, se pensó que las células infectadas por SeV que emitieron GFP eran células ependimales. Las células a lo largo del ventrículo lateral también se volvieron fluorescentes 5 y 7 días después de la infección. Sin embargo, la intensidad de la fluorescencia disminuyó de manera significativa en las células 7 días después de la infección y no se observaron células fluorescentes en el cerebro 10 días después. No se pudo observar fluorescencia en los cerebros de los ratones de control a los cuales se les había administrado PBS o SeV sin gen GFP como control.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Administración de GFP-SeV a parénquima de cerebro bajo estereotaxia

Para examinar la infección SeV de células nerviosas, especialmente células piramidales y del hipocampo, que es el principal objeto de esta invención, precisamente se requiere la administración dirigida de SeV a la vecindad del hipocampo. Por lo tanto, se llevó a cabo un estereotaxia para introducir SeV en el cerebro parenquimal y las células parénquimas del cerebro se examinaron en busca de infección. Se emplearon 1) ratones y 2) ratas como animales experimentales.

1) Se perforaron 2 agujeros de 1 mm de diámetro a través del esqueleto en la posición 2 mm a la izquierda y a la derecha de la línea media y 3 mm anterior al bregma usando una perforadora dental. Se administró GFP-SeV (1.5 \mul cada uno) a las porciones parenquimales, 3.5 mm de profundidad sobre el costado derecho y 2.5 mm de profundidad sobre el costado izquierdo, usando un tubo capilar de cristal. Se cerró el esqueleto, y mediante cirugía se abrió 3 días después para examinar la expresión GFP, que se observó en la porción parenquimal. Tras la fijación con etanol, se prepararon los trozos de tejido. A pesar de que la fluorescencia de GFP se redujo de manera significativa en los trozos congelados tras la fijación con etanol debido a la fuga de cromóforos, aún se observaron puntos fluorescentes. En la materia blanca junto a la cápsula interna, se observó fluorescencia GFP sobre el axón desde el cual la proteína mielina se eluyó con etanol. Además, la fluorescencia GFP también se observó en el axón en el área que presuntamente era el cuerpo estriado.

Estos resultados demostraron que GFP-SeV fue capaz de infectar células nerviosas del cerebro de un ratón.

2) Debido a que ya se había realizado un espectrógrafo preciso para rata, puede administrarse de manera precisa GFP-SeV a la vecindad de células piramidales en el área del hipocampo CA1. Una rata que pesaba aproximadamente 170 gramos fue anestesiada, y tras craniotomía, se perforaron dos agujeros de 1 mm de diámetro a través del esqueleto en la posición 2 mm a la izquierda y derecha de la línea media y 4.5 mm anterior al sigma interno con una perforadora dental. Se administró GFP-SeV (1.5 \mul cada uno) a las porciones parenquimales, 3.5 mm de profundidad sobre el costado derecho y 2.5 mm de profundidad sobre el costado izquierdo, usando un tubo capilar de cristal. Se cerró el esqueleto, y mediante cirugía se abrió 3 días después para examinar la expresión GFP. Como resultado, la expresión GFP se observó en el área celular piramidal del hipocampo CA1, donde se administró GFP-SeV en 2.5 mm de profundidad. Una visión aumentada de la región adyacente al hipocampo a través de un microscopio fluorescente reveló la fluorescencia marcada en los cuerpos celulares de las células piramidales del hipocampo CA1 y dendríticas. La expresión GFP se observó incluso en las células piramidales 13 días después de la administración. Incluso 13 días después de la administración de GFP-SeV, la expresión GFP se observó en los cuerpos celulares y dendríticos de las células piramidales. Estos resultados demuestran que la infección de SeV no provoca la muerte celular incluso 13 días después de la infección, lo que sugiere de manera clara la utilidad de SeV como un vector para la terapia de genes dirigida a la prevención de muerte de células exfoliadas tras isquemia cerebral.

Ejemplo 8 Ensayo de Terapia de Genes en ratones deficientes de \beta-glucuronidasa usando \beta-glu-SeV

Los resultados del Ejemplo 6 indican que las células ependimales están infectadas por SeV por administración intraventricular. Por lo tanto, los inventores llevaron a cabo un experimento en el que se administró \beta-glu-SeV a ratones deficientes de \beta-glucuronidasa usando \beta-glu-SeV (J. Clin. Invest., 1989, 83: 1258-1266) para inducir secreción de \beta-glucuronidasa a partir de las células infectadas en el fluido cerebroespinal y a continuación absorberse por las células objetivo para que los síntomas mejoren.

Los ratones homocigotos se seleccionaron de ratones obtenidos por reproducción de ratones heterocigotos en base a la actividad \beta-glucuronidasa en sangre de la vena de la cola de los ratones y en base a la presencia del punto de división Nlal IV en los fragmentos de amplificación PCR del lugar deficiente de gen \beta-glucuronidasa en los cromosomas de ratones, y se emplearon en el presente experimento.

La administración de \beta-glu-SeV se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 6. Se extirpó el cerebro de 3 a 12 días después de la administración para preparar láminas congeladas de tejido. La actividad de \beta-glucuronidasa en el tejido fue examinada usando una modificación del método descrito en el Ejemplo 5, 1). Tal y como se muestra en la Figura 3, los puntos en los que se expresó \beta-glucuronidasa se tintaron fuertemente de rojo a lo largo de los ventrículos. Cuando se agrandaron en el microscopio, las células ependimales del ventrículo lateral verificaron que expresaban claramente \beta-glucuronidasa, que a continuación se segregó de las células. En la lámina de tejido preparada 12 días después de la administración (Figura 4), la \beta-glucuronidasa que había sido expresada y a continuación segregada de las células ependimales del ventrículo lateral demostró estar difusa en el ventrículo con la migración del fluido espinal hasta alcanzar la vecindad del hipocampo. Las capacidades físicas de los ratones homocigotos mejoraron aparentemente, aunque ligeramente, por medio de esta administración.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Experimentos en depresión alimenticia provocada por la administración del vector viral Sendai que transporta FGF-1 o 5- (experimentos de depresión alimenticia en jerbos y ratones)

Jerbos (de peso entre 60 y 80 g) fueron anestesiados con Nembutal, fijados a un instrumento estereotáctico, depilados, y a continuación se les realizó una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media. Se perforó un agujero en el esqueleto en la posición 1.0 mm desde el bregma y 1.5 mm a la derecha de la línea media usando una perforadora dental con cuidado de no evitar dañar los vasos sanguíneos bajo el hueso craneal. Tras perforar el agujero, se retiraron la dura y otros con pinzas. FGF-1-SeV de ratones (5 x 10^{6} pfu), FGF-5-SeV de humanos (5 x 10^{7} pfu) y GPF-SeV (5 x 10^{6} pfu) se inyectaron 1.0 mm de profundidad en el ventrículo lateral derecho (n = 2) con una aguja con jeringuilla 30G. Los virus recombinantes se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Los cambios en el peso corporal se controlaron midiendo el peso, y se observó un descenso del peso corporal a partir del siguiente día de la administración (Figura 5). En el grupo al que se le administró FGF-1, el peso corporal comenzó a descender a partir del siguiente día de la administración, y continuó descendiendo aproximadamente un 5% todos los días hasta 5 días más tarde, dando como resultado un 29.5% de descenso 6 días más tarde, y el máximo descenso de 29.8% se observó 7 días más tarde. A continuación, el peso corporal comenzó a aumentar, y se recuperó hasta un 3.5% del descenso 20 días después de la administración. En el grupo al que se le administró FGF-5, el peso corporal comenzó a descender a partir del siguiente día, alcanzó el máximo de 21.7% de descenso días después de la administración, y después volvió a aumentar, recuperándose hasta un 8.0% del descenso 20 días más tarde. En el grupo al que se le administró FGF-9, se observó un descenso similar en el peso corporal a partir del siguiente día, y mostró un máximo de 22.9% 5 días después de la administración, y a continuación volvió a aumentar, alcanzando la recuperación hasta un 6.40% del descenso 20 días después. En el grupo de control al que se le administró GFP-SeV, se observó un máximo de un descenso del 5.8% en el peso corporal, lo que fue provocado presumiblemente por la propia administración. Sin embargo, el índice de pérdida de peso corporal fue relativamente pequeño en comparación con los grupos a los que se les administró FGF, lo que claramente indica que FGF afecta a la pérdida de peso corporal.

Dado que el descenso de peso corporal debido a la administración de FGF-1-SeV y FGF-5-SeV se observó en jerbos, se llevó a cabo un estudio más detallado usando ratones B-6 (de peso oscilante entre 20 y 22 gramos). Se seleccionó el ventrículo derecho lateral como punto de administración, y se perforó un orificio de 1.0 mm de diámetro en el esqueleto en la posición 1.0 mm desde el bregma y 1.5 mm a la derecha de la línea media con una perforadora dental. Tras la retirada de la dura, se administró una muestra al animal en el orificio a una profundidad de 1.3 mm con una aguja de jeringuilla 27G. Las soluciones de muestra se prepararon añadiendo 9 \mul, 8 \mul y 9 \mu de PBS a soluciones de 1 \mul de FGF-1-SeV (1 x 10^{6} pfu), 2 \mul de FGF-5-SeV (2 x 10^{6} pfu), y 1 \mul de control GPF-SeV (1 x 10^{6} pfu), respectivamente. El peso corporal y la ingesta de comida se controlaron durante 2 semanas tras la administración viral.

A los ratones de control a los que se les administró GFP-SeV no mostraron ningún descenso en el peso corporal, pero mostraron un incremento del 7.5% en comparación con el peso medido antes de la administración (Figura 6). La cantidad de ingesta de comida no cambió de manera significativa (Figura 7). En el grupo al que se le administró FGF-SeV, se observó una media de un descenso de 30.5% en peso corporal 6 días después de la administración (Figura 6). Después, el peso corporal volvió a aumentar, dando como resultado un incremento corporal del 13.5% 2 semanas más tarde. El cambio en la ingesta de comida debido a la administración de FGF-1 fue tan drástico que prácticamente no se observó ingesta de comida desde el día 2 hasta el día 6, especialmente desde el día 3 hasta el día 6 tras la administración (Figura 7). En el grupo al que se le administró FGF-5-SeV, a pesar de que se observó un descenso del peso corporal, el índice de descenso fue menor en comparación con el grupo al que se le administró FGF-1-SeV, y el máximo fue un 17.9% (Figura 6). El efecto en el descenso del peso corporal fue de alguna manera similar al obtenido en el sistema experimental con jerbos. A pesar de que el efecto de la administración de FGF-5-SeV sobre el descenso del peso corporal fue menor que el de la administración de FGF-1-SeV, se observó claramente un descenso en la ingesta de comida (Figura 7).

Tal y como se muestra en los resultados del ejemplo, le efecto de la expresión intraventricular de FGF inducido por SeV en el descenso del peso corporal fue un descenso del 30% en el punto máximo. Teniendo en consideración que el efecto de la inyección intraventricular de FGF en la forma de proteína purificada sobre el descenso del peso corporal fue de 7 a 8% como máximo, la cifra de 30% conseguida en la presente invención demostró ser extremadamente elevada. Las diferencias en estos efectos pueden deberse a la diferencia en la acumulación intraventricular de FGP dependiendo de los métodos de administración, pero existe otra posibilidad de que la diferencia se deba a una acción directa de FGF sobre las células nerviosas a través de la infección de SeV a las células ependimales. Al igual que el control alimenticio en el cerebro, solo se observó el control del hipotálamo por los núcleos nerviosos. A la vista de esto, se infiere que SeV infecta de manera eficiente las células ependimales para segregar una proteína funcional al fluido cerebroespinal en el ventrículo, y que dicha proteína segregadora actúa de modo eficiente sobre los núcleos del nervio hipotalámico para ejercer el control alimenticio. Esta conclusión estaría apoyada por los hechos de que una parte del tejido del nervio hipotalámico tiene una construcción nerviosa con las uniones ajustadas de la barrera sangre-cerebro perdidas y contiene neuronas para recibir factores líquidos en la circulación periférica y fluido cerebroespinal.

Entre los núcleos hipotalámicos, las neuronas quimiosensibles se encuentran presentes en el hipotálamo ventromedio (VMH) y en el área lateral hipotalámica (LHA), que se cree que son los centros de alimentación y saciedad, y la actividad neuronal se altera en respuesta a los productos metabólicos y las hormonas contenidas en sangre y fluido cerebroespinal. Estas neuronas VMH y LHA que responden a la glucosa, y ciertas citoquinas y factores del crecimiento también son conocidos por actuar como reguladores del apetito. Además, se ha demostrado que, a partir del experimento de disrupción, el núcleo paraventricular (PVN) es también responsable de la supresión de ingesta de comida. Este núcleo tiene neuronas que producen una hormona que libera corticotropina (CRH) y muestra la depresión en la comida y la actividad receptiva del nervio. Además, el núcleo arqueado (ARC) es el punto para producir NPY, un estimulador de ingesta de comida, que se sugiere que va dirigido a PVN. Los resultados del experimento sobre el control de comportamiento alimenticio aquí descritos sugieren que FGF actuó sobre los núcleos nerviosos. Debería prestarse atención a la relación con leptina, que se expresa en adipocitos maduros que tienen gotas de lípido que se ha estudiado de modo extenso en relación con los comportamientos alimenticios así como NPY, etc.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Experimento en la supresión de exfoliación de células isquémicas usando jerbos

El área expuesta a isquemia cerebral sufre lesión celular, y además se deja que tenga lugar una muerte celular a medida que la isquemia progresa. La extensión de la muerte celular depende del grado y duración de isquemia. En el caso de isquemia severa, no solamente las células nerviosas sino también las células constitutivas en el área isquémica mantienen lesiones irreversibles en un breve periodo de tiempo, dando como resultado la formación de focos de infracción cerebrales provocados por necrosis. Sin embargo, en el caso de fuerza isquémica severa de corta duración, o en el caso de isquemia leve de larga duración, las células en la región isquémica se vuelven frágiles dependiendo de la severidad de la isquemia. Las células más frágiles son las células nerviosas, y a continuación le siguen los oligodendrocitos. Las células de astroglia, microglia, y endoteliales vasculares han demostrado ser más resistentes a la tensión isquémica. A partir del examen empleando un modelo difuso de isquemia en cerebro, se ha sabido que hay diferencias en la resistencia a la tensión isquémica entre células nerviosas. Las células más frágiles conocidas incluyen células nerviosas del hipocampo CA1, aquellas del hilo de giro dentado, y aquellas de los núcleos vestibulares en la región occipital de la cabeza, que muestran una muerte celular retardada. La muerte retardada de las células nerviosas es un buen modelo de muerte celular nerviosa selectiva con elevada reproducibilidad independiente de la insuficiencia energética, lo que contribuye en gran medida a la elucidación de mecanismos moleculares de muerte celular isquémica. Ha habido muchos informes sobre experimentos que han empleado estos sistemas de modelos para examinar, por ejemplo, qué cascada deben atravesar las células nerviosas hasta llegar a su muerte, qué paso de la cascada es crítico para proteger la célula, en qué tipo de muerte celular se clasifica la muerte retardada de célula nerviosa, etc.

Al igual que en el modelo experimental, animales tales como ratas, jerbos y ratones se emplean con frecuencia. Estos animales se usan para estudiar y tratar los cambios patológicos en las porciones vulnerables a la isquemia, como hipocampo, cuerpo estriado etc., inducidos por isquemia pasajera en todo el cerebro de los modelos de isquemia durante varios minutos. Un modelo de rata con oclusión de cuatro vaso, un modelo de rata con oclusión de arteria carótida común bilateral hipotensa, un modelo de jerbos con oclusión de arteria carótida común bilateral, etc., se emplean con frecuencia como modelo de isquemia. Los presentes inventores llevaron a cabo un experimento de isquemia usando un modelo de jerbo con oclusión de arteria carótida común bilateral. Se ha conocido que en jerbos la muerte celular ocurre principalmente en la mayor parte de las células piramidales en el área del hipocampo CA1 cuando los animales se someten a una isquemia durante un breve periodo de tiempo (5 min.). Por lo tanto, los presentes inventores realizaron un experimento con el objetivo de prevenir la exfoliación celular tras isquemia introduciendo en SeV un gen capaz de prevenir la muerte celular y administrando el complejo resultante al hipocampo de jerbos.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de un modelo de jerbo para muerte celular isquémica

Los experimentos se llevaron a cabo con un modelo de jerbo (especio de jerbo) con oclusión de arteria carótida común bilateral (5 min). Cerrando (5 min) la arteria carótida común bilateral de un jerbo, las células piramidales del hipocampo se exfolian de manera selectiva 3-5 días después de la oclusión. Sin embargo, debido a que este fenómeno no se observa comúnmente entre los jerbos, es necesario proyectar jerbos excelentes como modelos animales de los obtenidos a partir de una fuente comercial. Los jerbos seleccionados por la proyección (obtenidos del instructor Doctor Maeda, Departamento 1 de Anatomía, Universidad Municipal de Osaka) se usaron para este experimento.

Tras anestesiarlos con quetamina, los animales fueron sometidos a toracotomía para encontrar las arterias carótidas en el lado izquierdo y derecho de la tráquea, y se eliminó la grasa adherida a la arteria carótida. Tras la retirada de la grasa, las arterias carótidas se ocluyeron durante 5 minutos con clips. Durante este procedimiento, debido a que la velocidad de muerte celular se reduce de manera significativa cuando las temperaturas del cerebro y el cuerpo son bajas, los animales se mantuvieron calientes para mantener la temperatura corporal a 37.5ºC estando controlados con un termómetro insertado en el ano. Los clips se retiraron 5 minutos más tarde, y la sangre se inyectó de nuevo. Cinco días más tarde, los jerbos fueron sacrificados, y, tras la craniotomía, el cerebro se extirpó para preparar láminas de tejido en parafina. Las condiciones de las células nerviosas se confirmaron por tinte con toluidina. Tal y como se esperaba, la exfoliación de las células piramidales se observó en el área del hipocampo CA1 (Figura 8). Por consiguiente, se ha preparado el modelo de jerbo con muerte celular isquémica.

\vskip1.000000\baselineskip

Experimento sobre prevención de muerte celular nerviosa mediante la introducción de SeV recombinante

El vector SeV preparado anteriormente se emplea para examinar si el vector SeV es efectivo para la prevención de célula nerviosa del siguiente modo: El día antes de la isquemia, se introduce el virus solamente en el cerebro derecho de los jerbos. Se aplica isquemia el siguiente día, y los animales se sacrifican 5-6 días más tarde para observar las células piramidales del hipocampo.

\vskip1.000000\baselineskip

Transferencia de FGF-1-SeV al hipocampo

Se seleccionaron jerbos de peso entre 60 y 80 gramos y se emplearon en este experimento. Tras ser anestesiados con Nembutal, los animales se fijaron a un instrumento estereotáctico. A continuación, el cerebro se depiló y el cuero cabelludo se cortó y abrió a lo largo de la línea media del cerebro. Se perforó un orificio a través del esqueleto en la posición 5 mm desde el bregma y 2 mm a la derecha de la línea media usando una perforadora dental con cuidado de no dañar los vasos sanguíneos bajo el hueso craneal. Tras perforar el orificio, la dura y otros se retiraron con pinzas. Se insertó una aguja de cristal para administración en la posición a una profundidad de 1.4 mm, y se dejó que los animales reposaran durante 2 minutos. A través de la aguja de cristal, se inyectó 0.5 a 1.0 \mul de una solución de virus FGF-Sendai (virus de 1.0 x 10^{6} pfu a 2.0 x 10^{6} pfu) a la posición durante un periodo de 12 min, y se dejó que el animal reposara 10 minutos adicionales. Se retiró la aguja, y la incisión se cosió. En este procedimiento, el virus se administró solamente al cerebro derecho, y la exfoliación de las células nerviosas tras isquemia se determinó comparando los cerebros derecho e izquierdo.

\vskip1.000000\baselineskip

Operación Isquémica

Tras ser anestesiados con quetamina, los animales fueron sometidos a toracotomía para encontrar las arterias carótidas en el lado izquierdo y derecho de la tráquea, y se eliminó la grasa adherida a las arterias carótidas. Tras la retirada de la grasa, las arterias carótidas se ocluyeron durante 5 minutos con clips. Durante este procedimiento, debido a que la velocidad de muerte celular se reduce de manera significativa cuando las temperaturas del cerebro y el cuerpo son bajas, los animales se mantuvieron calientes para mantener la temperatura corporal a 37.5ºC estando controlados con un termómetro insertado en el ano. Los clips se retiraron 5 minutos más tarde, y la sangre se inyectó de nuevo. De cinco a seis días más tarde, los animales fueron sacrificados.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de secciones de parafina

Tras sacrificar el animal, las secciones transversales frontales del romboencéfalo se realizaron en láminas gruesas de 300-500 \mum, se dejaron en remojo en 4% de formaldehído durante la noche, y se unieron a parafina con un aparato automático para fijación y unión. Las secciones (5 \mum de grosor) se prepararon, se les eliminó la parafina, y se sometieron a tinte inmunohistoquímico y a otros tintes.

\vskip1.000000\baselineskip

Tinte inmunohistoquímico

Las secciones del cerebro a las que se les administró FGF-1 se prepararon para examinar la reactividad a un anticuerpo contra el virus, a un anticuerpo anti-tubulina (para determinar el efecto de operación isquémica), a un anticuerpo anti-GFAP (para examinar el movimiento de astrosito), y a un anticuerpo apoptag (para examinar la presencia de apoptosis). Los resultados se resumen brevemente a continuación (Tabla 2).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

100

En las células piramidales de la región del hipocampo CA-1, el tinte HE no reveló ningún cambio en las células nerviosas en la muestra de control, que no sufrió isquemia. Muchas células en un lado del cerebro que sufrieron isquemia pero a las que no se les administró el virus fueron células nerviosas atróficas que mostraron condensación nuclear en el núcleo y cambio eosinofílico en el citoplasma, los llamados cambios isquémicos. Sin embargo, en el otro lado del cerebro, que sufrió isquemia y al que se le administró el virus, se observó que un pequeño número de células nerviosas deformadas estaban dispersas, pero una mayor parte de las células nerviosas mantuvieron la morfología original. En el lado en el que el virus fue administrado, se observó una región que fue positiva para el anticuerpo contra el virus. En las células nerviosas que sufrieron isquemia pero donde el virus no fue administrado, la mayor parte de las células que mostraron deformación fueron positivas para el tinte apoptag. En cambio, en las células que sufrieron isquemia y donde se administró el virus, solamente una pocas células que se tintaron con HE y mostraron cambio morfológico fueron positivas para tinte apotag, lo que indica que apoptosis fue suprimida en la mayoría de las células en este lado (Figura 9).

Aplicabilidad Industrial

La presente invención ha proporcionado un método in vitro para transferir un gen a células nerviosas en los tejidos que incluyen el tejido nervioso central, en los que la transferencia de un gen había sido difícil hasta ahora. También se proporciona la materia relacionada con el método. La invención permite una transferencia eficiente de un gen deseado a las células en terapia de genes.

Claims

1. Un método para transferir ácido nucleico a células nerviosas in vitro, que consiste en un paso de poner en contacto las células nerviosas con un vector viral de ARN de sentido negativo que está formado por un gen externo en su genoma o poner en contacto las células nerviosas que están formadas por dicho vector, donde dicho virus de ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.

2. Uso de un vector viral de ARN de sentido negativo para la fabricación de un medicamento para controlar el comportamiento alimenticio de animales, donde dicho vector está formado por un gen externo que codifica el factor de crecimiento para fibroblasto (FGF)-1 o FGF-5 en su genoma, y dicho virus ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.

3. Uso de un vector viral de ARN de sentido negativo para la fabricación de un medicamento para terapia de genes enfocada a células nerviosas, donde dicho vector está formado por un gen externo en su genoma, y dicho virus ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.

4. Uso de la reivindicación 3, donde dichas células nerviosas son las células del sistema nervioso central.

5. Uso de la reivindicación 4, donde dichas células del sistema nervioso central son células ependimales ventriculares.

6. Uso de la reivindicación 4, donde dichas células del sistema nervioso central son células del hipocampo.

7. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, que además permite expresar de manera pasajera dicho gen externo.

8. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde dicho gen externo codifica una proteína segregadora.

9. Uso de la reivindicación 8, donde dicha proteína actúa sobre los núcleos hipotalámicos.

10. Uso de la reivindicación 8, donde dicha proteína es capaz de proteger el cerebro frente a isquemia.

11. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, donde dicho virus que pertenece a la familia Paramixoviridae es el virus Sendai.

12. Un vector viral de ARN de sentido negativo para terapia de genes in vivo de células nerviosas, estando formado dicho vector por un gen externo que codifica una proteína segregadora en su genoma, donde dicho virus de ARN de sentido negativo pertenece a la familia Paramixoviridae.