ES2967616T3 - Tratamiento de AMD mediante el uso de AAV sFLT-1 - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para la prevención o tratamiento de la neovascularización ocular, tal como AMD, en un sujeto humano, mediante la administración por vía subretiniana de una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica tirosina quinasa soluble relacionada con Fms. - 1 proteína (sFlt-1) al sujeto humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento de AMD mediante el uso de AAV sFLT-1
Antecedentes de la descripción
La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una de las principales causas de daño irreversible de la visión en personas mayores de 50 años de edad. La AMD se divide clínicamente en dos tipos: “ seca” y “ húmeda” . La forma húmeda de AMD puede desarrollarse rápidamente y a menudo resulta en ceguera. Los cambios patológicos de la enfermedad pueden provocar una discapacidad visual grave. Las manifestaciones de AMD pueden incluir, pero no se limitan a, disfunción de las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) y neovascularización coroidea (CNV) en el área macular. En casos graves pueden producirse fugas de fluido, RPE o desprendimiento del epitelio neural y sangrado por ruptura de vasos sanguíneos. Se ha encontrado que muchos factores celulares juegan un papel importante en la regulación de la generación de CNV, entre los que se pueden incluir, pero no se limitan a, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor de VEGF (VEGFR), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor inducible por hipoxia (HIF), angiopoyetina (Ang) y otras citocinas, proteína quinasas activadas por mitógeno (MAPK) y otras.
Un tratamiento aprobado actualmente para la AMD húmeda es Lucentis®. Lucentis® es un agente antiangiogénesis y se dirige a todas las isoformas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Los estudios clínicos han demostrado una visión mejorada o estable en aproximadamente el 95 % de los pacientes a los que se les administró Lucentis®, en comparación con aproximadamente el 60 % de los pacientes que recibieron tratamiento simulado. Aunque Lucentis® es el primer agente aprobado para mejorar la visión, requiere administraciones intravítreas cada 4 semanas para obtener un beneficio visual óptimo. Eylea® es otro inhibidor de VEGF que ha sido aprobado para tratar la AMD húmeda. Eylea® también requiere inyecciones intravítreas frecuentes cada 4-8 semanas para un beneficio visual óptimo. Las vías de administración intravítreas pueden aumentar los riesgos de complicaciones graves como endoftalmitis infecciosa y desprendimiento de retina, cuyo riesgo acumulativo aumenta con administraciones repetidas. También se han informado aumento de la presión intraocular, cataratas traumáticas y desgarros retinianos. Finalmente, con un tratamiento que se administra por un oftalmólogo, la frecuencia del tratamiento determina la carga para el paciente, el médico y el sistema de salud en general y, en la medida de lo posible, debe reducirse. Las limitaciones de la terapia actualmente disponible para CNV secundaria a AMD han creado una necesidad en la técnica de enfoques alternativos que aborden la alta frecuencia de tratamientos requeridos y la invasividad del procedimiento de tratamiento. La neovascularización que implica la elevación de VEGF también puede conducir a otras patologías oculares, como retinopatía diabética, edema macular diabético (DME) y oclusiones de las venas retinianas (RVO). Estas enfermedades provocan neovascularización retiniana y pérdida de visión. Los inhibidores de VEGF como Lucentis® han demostrado eficacia en DME y RVO y, al igual que con AMD húmeda, requieren una administración intravítrea frecuente para mantener el beneficio.
Lukason y otros, “ Inhibition of Choroidal Neovascularization in a Nonhuman Primate Model by Intravitreal Administration of an AAV2 Vector expressing a Novel Anti-VEGF Molecule” , MOLECULAR THERAPY, vol. 19, no. 2, pp. 260-265, 2010 describe experimentos con la administración intravítrea de rAAV2-sFLT1 en monos y no describe ni sugiere una inyección intraocular previa de una proteína inhibidora de VEGF. La invención proporciona virus adenoasociados recombinantes (rAAV) para usar como se define en las reivindicaciones adjuntas. La descripción que se expone a continuación proporciona información de antecedentes técnicos y no pretende definir la invención como tal, sino más bien facilitar la comprensión y el funcionamiento de la invención al tiempo que la coloca en un contexto técnico.
Resumen de la descripción
La presente descripción proporciona composiciones y métodos para tratar la CNV, tal como la que se encuentra en la forma húmeda de AMD, en un sujeto humano.
En un aspecto, la presente descripción proporciona composiciones y métodos para tratar la AMD en un sujeto humano, que comprenden: administrar subretinalmente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un inhibidor de VEGF a un sujeto humano que necesita tratamiento para AMD. En un aspecto, la composición farmacéutica comprende un virus recombinante. En otro aspecto, el inhibidor de VEGF comprende un ácido nucleico que codifica la proteína tirosina quinasa-1 (sFLT-1) relacionada con Fms soluble.
En un aspecto, la presente descripción proporciona composiciones y métodos para la prevención de CNV en sujetos humanos con AMD, que comprenden: administrar subretinalmente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína tirosina quinasa-1 (sFLT-1) relacionada con Fms soluble a un sujeto humano que necesita un tratamiento para AMD.
En algunos aspectos, el virus se selecciona de virus adenoasociados (AAV), adenovirus dependientes de coadyuvante, retrovirus, virus del herpes simple, lentivirus, poxvirus, virus hemaglutinatina del complejo Japónliposoma (HVJ), virus de la leucemia murina de Moloney y virus en base a VIH. En algunos aspectos, la cápside de AAV o las repeticiones terminales invertidas (ITR) se selecciona del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV 12, rh 10, e híbridos de los mismos.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende un promotor seleccionado de promotor de citomegalovirus (CMV), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor de MMT, promotor de EF-1 alfa, promotor de UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor de CAG, promotor de RPE65 y promotor de opsina.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende un potenciador.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende un intrón o un intrón quimérico.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende una secuencia poli A de SV40.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende una proteína sFlt-1 humana o un fragmento funcional de la misma. En algunos aspectos, el virus recombinante se genera a partir de un plásmido que comprende un marcador de resistencia a ampicilina o un marcador de resistencia a no ampicilina.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende secuencias reguladoras bacterianas tales como un promotor de polimerasa de ARN de T7.
En algunos aspectos, el virus recombinante carece de secuencias reguladoras bacterianas tales como un promotor de polimerasa de ARN T7.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende un fragmento de ácido nucleico regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de la proteína sFlt-1 o un fragmento funcional de la misma en una célula del ojo.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x1015 genomas de vector viral recombinante, aproximadamente 1x107 a aproximadamente 1x1014 genomas de vector viral recombinante, aproximadamente 1x108 a aproximadamente 1x1013 genomas de vector viral recombinante, aproximadamente 1x109 a aproximadamente 3x1012 genomas de vector viral recombinante, o aproximadamente 1x1010 a aproximadamente 3x1012 genomas de vector viral recombinante.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra mediante inyección subretiniana.
En algunos aspectos, el método comprende además administrar al sujeto humano una cantidad farmacéuticamente efectiva de un inhibidor de VEGF. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF comprende un anticuerpo contra VEGF o un fragmento funcional del mismo. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF comprende ranibizumab. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra al menos 5, 6, 7 u 8 días después de la administración del inhibidor de VEGF. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra dentro de los 30, 60 o 90 días de la administración del inhibidor de VEGF.
En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra 1 vez antes de administrar la composición farmacéutica que comprende el virus recombinante y 1 a 2 veces después de la administración. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra al menos 2 veces antes de administrar la composición farmacéutica y 1 a 2 veces después de la administración. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante un período de 6 a 7 semanas. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF, como bevacizumab o ranibizumab. En otros aspectos, el inhibidor de VEGF es un receptor soluble, una proteína de fusión o un fragmento del mismo, tal como aflibercept o sFLT01.
En algunos aspectos, la AMD es AMD húmeda.
En algunos aspectos, la AMD es AMD seca.
En algunos aspectos, el sujeto humano está en riesgo de contraer AMD húmeda.
En algunos aspectos, el sujeto humano presenta síntomas de AMD húmeda en etapa temprana.
En algunos aspectos, se han administrado previamente al menos 3, 5, 10, 15 o 20 tratamientos de un inhibidor de VEGF diferente para el tratamiento de AMD a dicho sujeto humano.
En algunos aspectos, la agudeza visual mejor corregida (BCVA) no mejoró después de dicho tratamiento con ranibizumab. En algunos aspectos, la agudeza visual mejor corregida (BCVA), medida por las letras del ETDRS (Estudio de tratamiento temprano de la retinopatía diabética), mejora en más de 1 línea después de dicho tratamiento con ranibizumab.
En algunos aspectos, el sujeto humano presenta síntomas de AMD seca en etapa temprana.
En algunos aspectos, el tratamiento se administra con una frecuencia de al menos dos veces al año.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en dicho sujeto humano cuando el sujeto tiene 20,
40, 50, 55 o 65 años o más.
En algunos aspectos, la administración se realiza en un sitio fuera de la fóvea.
En algunos aspectos, la administración es a una o más células del espacio subretiniano de la retina central.
En algunos aspectos, la administración es a una o más células de la mácula externa.
En algunos aspectos, la administración es a una o más células mácula interna.
En algunos aspectos, la administración es a las células epiteliales pigmentarias de la retina.
En algunos aspectos, la administración no afecta negativamente a la función central de la retina ni a la estructura central de la retina.
En algunos aspectos, la administración no aumenta los niveles sistémicos del inhibidor de VEGF en el sujeto humano. En algunos aspectos, la administración no aumenta los niveles sistémicos de sFlt-1 en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la etapa de administración se realiza de forma simultánea o secuencial en ambos ojos.
En algunos aspectos, la etapa de administración se realiza en un ojo.
En algunos aspectos, la etapa de administración se realiza en un ojo cuando el ojo contrario presenta síntomas de AMD.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un sujeto humano resistente a la penicilina.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un sujeto humano sensible a la penicilina.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un sujeto humano alérgico a la penicilina.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un sujeto humano no alérgico a la penicilina.
En algunos aspectos, la etapa de administración no provoca inflamación del vítreo, se observa mediante biomicroscopía (BE) y oftalmoscopía indirecta (IOE) después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la etapa de administración no provoca una célula T citotóxica.
En algunos aspectos, la etapa de administración no provoca una respuesta de las células T citotóxicas, una medida en el aumento de las células T citotóxicas de menos de un 10 % mayor que el rango de la línea de base.
En algunos aspectos, las células T no muestran un fenotipo efector activado después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la agudeza visual mejor corregida (BCVA) mejora en 1, 2, 3, 4 o 5 líneas o más según lo medido por las letras del ETDRS (Estudio de tratamiento temprano de la retinopatía diabética), después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la reducción de la neovascularización se observa mediante el uso de la angiografía con fluoresceína (FA) después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la frecuencia de administración de ranibizumab se reduce a menos de 12 dosis por año. En algunos aspectos, la frecuencia de administración de aflibercept se reduce a menos de 6 dosis por año.
En algunos aspectos, ranibizumab o aflibercept u otro inhibidor de VEGF se administra con una frecuencia reducida o ya no se administra.
En algunos aspectos, el virus comprende un gen sFLT-1 o un fragmento funcional del mismo con una homología de secuencia > 90 % con la secuencia del gen sFLT-1 humano.
En algunos aspectos, el virus administrado comprende un gen de sFLT-1, una variante de gen o un fragmento de gen.
En algunos aspectos, no se detecta ningún vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano a los 7, 14, 21 o 30 días después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la presencia del vector viral se detecta mediante qPCR o ELISA.
En algunos aspectos, los niveles de proteína sFLT-1 en el vítreo del sujeto humano son aproximadamente 500 - 5000 pg/ml, aproximadamente 600 - 4000 pg/ml, aproximadamente 800 - 3000 pg/ml, aproximadamente 900 - 2000 pg/ml, o aproximadamente 1000 - 1800 pg/ml a los 7, 14, 21 o 30 días después de administrar la composición farmacéutica. En algunos aspectos, el nivel de proteína sFlt-1, que también puede denominarse concentración de proteína sFlt-1, en el vítreo del sujeto humano se eleva a 7, 14, 31, 30, 60, 90, 180, 270 y 365 días después de administrar la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, el sujeto humano no muestra toxicidad retiniana clínicamente significativa según la evaluación mediante exámenes oftálmicos en serie durante un período mínimo de dos meses.
En algunos aspectos, no se presentan signos inflamatorios superficiales, del segmento anterior o del vítreo en el sujeto humano durante un período de al menos dos meses.
En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate con un inhibidor de VEGF al menos 120 días después de la administración de los virus recombinantes. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate con un inhibidor de VEGF al menos 180 días o al menos 210 días después de la administración de los virus recombinantes. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate con un inhibidor de VEGF durante al menos 270 días después de administrar los virus recombinantes. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate con un inhibidor de VEGF durante al menos 365 días después de administrar los virus recombinantes.
En algunos aspectos, no hay evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de la IOP, desprendimiento de retina o cualquier respuesta inmune intraocular o sistémica en dicho sujeto humano al menos 180 días o al menos 210 días después de dicha administración de los virus recombinantes. En algunos aspectos, no hay evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de la IOP, desprendimiento de retina o cualquier respuesta inmune intraocular 0 sistémica en dicho sujeto humano al menos 365 días después de la administración de los virus recombinantes.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x1015 virus recombinantes, en donde cada uno de los virus recombinantes comprende un ácido nucleico que codifica la proteína tirosina quinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFlt-1).
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de la neovascularización ocular en un sujeto humano que comprende: administrar a uno o más sitios subretinianos una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica sFLT-1 a un sujeto humano que necesita tratamiento.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un sujeto humano que tiene o se sospecha que tiene una o más afecciones seleccionadas del grupo que consiste de: degeneración macular relacionada con la edad (AMD), AMD húmeda, AMD seca, neovascularización retiniana, neovascularización coroidea y retinopatía diabética. En algunos casos, el sujeto humano tiene o se sospecha que tiene una o más afecciones seleccionadas del grupo que consiste de: retinopatía diabética proliferativa, oclusión de la vena retiniana, oclusión de la vena retiniana central, oclusión de la vena retiniana ramificada, edema macular diabético, isquemia retiniana diabética, retinopatía isquémica y edema retiniano diabético.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un virus recombinante, el virus seleccionado del grupo que consiste de: virus adenoasociado (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de coadyuvante, retrovirus, virus del herpes simple, lentivirus, poxvirus, virus de la hemaglutinatina del complejo Japón-liposoma (HVJ), virus de la leucemia murina de Moloney y virus en base a VIH.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un ácido nucleico que codifica la sFLT-1 que está operativamente unido a un promotor seleccionado del grupo que consiste de: promotor de citomegalovirus (CMV), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor de MMT, promotor de EF-1 alfa, promotor UB6, promotor beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor opsina.
En algunos aspectos, la descripción proporciona ácido nucleico de sFLT-1, en donde sFLT-1 codifica al menos 1 dominio de dimerización. En algunos casos, el ácido nucleico de sFLT-1 no contiene una secuencia reguladora procariota. En algunos casos, el ácido nucleico de sFLT-1 contiene una secuencia reguladora procariota.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un virus o un plásmido.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de uno o más tratamientos de un inhibidor de VEGF al sujeto humano. En algunos casos, el inhibidor de VEGF se administra dentro de los 30, 90 o 180 días de la administración de la composición farmacéutica. En algunos casos, la composición farmacéutica de la descripción y el inhibidor de VEGF se administran con al menos 24 horas de diferencia.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que se administra a un sujeto humano de al menos 55 años.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de la composición farmacéutica fuera de la fóvea. En algunos aspectos, la descripción proporciona la mejor agudeza visual corregida (BCVA) del sujeto humano, para mejorar en al menos 1, 2, 3, 4 o 5 líneas según lo medido por las letras del ETDRS (Estudio de retinopatía diabética de tratamiento temprano) después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que la agudeza visual mejor corregida (BCVA) disminuya en menos de 15 letras según lo medido por ETDRS (Estudio de retinopatía diabética de tratamiento temprano) después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de la composición farmacéutica en condiciones seleccionadas del grupo que consiste de: administrar la composición farmacéutica en un ojo, administrar la composición farmacéutica secuencialmente en dos ojos y administrar la composición farmacéutica simultáneamente en dos ojos. En algunos aspectos, la descripción proporciona una reducción en la neovascularización como se observa mediante una angiografía con fluoresceína (FA) después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que no estén presentes signos inflamatorios superficiales, del segmento anterior o vítreo en el sujeto humano al menos 1 semana después de la inyección.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que no estén presentes signos inflamatorios superficiales, del segmento anterior o vítreo en el sujeto humano 1 semana o 3, 6, 9 o 12 meses después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que el sujeto humano no requiera tratamiento de rescate durante al menos 30, 60, 90, 120, 180, 270 o 365 días después de la administración de la composición farmacéutica. En algunos aspectos, la descripción proporciona que el sujeto humano no experimente pérdida de agudeza visual, elevación de la IOP, desprendimiento de retina, respuesta inmune intraocular o sistémica después de administrar la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que no se mida una respuesta aumentada de células T citotóxicas anti-AAV después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que no se detecte virus en las muestras de sangre, saliva u orina del sujeto humano, a los 3, 7, 14, 21 o 30 días después de la administración de la composición farmacéutica. En algunos aspectos, la descripción proporciona que los niveles de proteína sFLT-1 en el vítreo del sujeto humano sean de aproximadamente 500 - 5000 pg/ml, a los 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 o 365 días después de la administración de la composición farmacéutica al sujeto humano.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que el sujeto humano reciba uno o más tratamientos con inhibidores de VEGF antes de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que el sujeto humano sea resistente al tratamiento con inhibidores de VEGF.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un sujeto humano que no ha recibido previamente un inhibidor de VEGF antes de administrar la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de la composición farmacéutica con una frecuencia de menos de 3 veces al año en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de la composición farmacéutica para reducir la frecuencia de administración de tratamientos adicionales con inhibidores de VEGF en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que la concentración de proteína sFLT-1 en el vítreo del sujeto humano se eleve cuando se mide a los 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 o 365 días después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona a un sujeto humano al que se le retira el gel vítreo antes o dentro de un día o una semana de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que se administra mediante el uso de un sistema de vitrectomía que es menor que el calibre 20.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que se administra mediante el uso de un sistema de vitrectomía que no requiere suturas.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que se administra mediante el uso de una punta de cánula que es menor que el calibre 39.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica seguida de intercambio gas/fluido en la cámara vítrea.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que el grosor central de la retina del sujeto no aumente en más de 50 micrómetros, 100 micrómetros o 250 micrómetros dentro de los 12 meses siguientes al tratamiento con dicho agente farmacológico.
En algunos aspectos, la descripción proporciona que la atrofia geográfica no progrese en el ojo enfermo del sujeto humano en comparación con los ojos enfermos de sujetos humanos no tratados.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende virus o plásmidos recombinantes que comprenden un ácido nucleico que comprende al menos 1 secuencia promotora unida operativamente a una secuencia del transgén sFLT-1. En algunos casos, la composición farmacéutica de la descripción comprende una secuencia promotora y la secuencia del transgén sFLT-1 separadas por una secuencia de más de 300 pares de bases. En algunos casos, la composición farmacéutica de la descripción comprende una secuencia promotora y la secuencia del transgén sFLT-1 separadas por una secuencia UTR. En algunos casos, la secuencia UTR comprende al menos 10 pares de bases. En algunos casos, la composición farmacéutica comprende al menos 3 secuencias enlazadoras, cada una de las cuales comprende al menos 50 pares de bases.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica, en donde el ácido nucleico de sFLT-1 codifica al menos 1 dominio de dimerización.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende una secuencia promotora seleccionada del grupo que consiste en sec. con n° de ident.:17, sec. con n° de ident.:18, sec. con n° de ident.:19, sec. con n° de ident.:20, sec. con n° de ident.:21, sec. con n° de ident.:22, sec. con n° de ident.:23, sec. con n° de ident.:24, sec. con n° de ident.:25, sec. con n° de ident.:26, sec. con n° de ident.:27, sec. con n° de ident.:28, sec. con n° de ident.:29, sec. con n° de ident.:30, sec. con n° de ident.:31, sec. con n° de ident.:32, sec. con n° de ident.:33, sec. con n° de ident.:34, sec. con n° de ident.:35, sec. con n° de ident.:36, sec. con n° de ident.:37, sec. con n° de ident.:38, sec. con n° de ident.:39, sec. con n° de ident.:340, sec. con n° de ident.:41, sec. con n° de ident.:42, sec. con n° de ident.:46 y sec. con n° de ident.:47; sec. con n° de ident.:42, sec. con n° de ident.:46 y sec. con n° de ident.:47; sec. con n° de ident.:42, sec. con n° de ident.:46 y sec. con n° de ident.:47; una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF seleccionado del grupo que consiste en sec. con n° de ident.:102, sec. con n° de ident.:103, sec. con n° de ident.:104, sec. con n° de ident.:105, sec. con n° de ident.:106, sec. con n° de ident.:107 y sec. con n° de ident.:108; una secuencia de intrones que consiste en la sec. con n° de ident.:48, sec. con n° de ident.:115, sec. con n° de ident.:116, sec. con n° de ident.:117, sec. con n° de ident.:118 y sec. con n° de ident.:119; una secuencia UTR seleccionada del grupo que consiste en sec. con n° de ident.:91, sec. con n° de ident.:2, sec. con n° de ident.:92, sec. con n° de ident.:93, sec. con n° de ident.:94, sec. con n° de ident.:95, sec. con n° de ident.:96, sec. con n° de ident.:97, sec. con n° de ident.:98, sec. con n° de ident.:99, sec. con n° de ident.:100 y sec. con n° de ident.:101; y una secuencia de terminación seleccionada del grupo que consiste en sec. con n° de ident.:49, sec. con n° de ident.:50, sec. con n° de ident.:51, sec. con n° de ident.:52, sec. con n° de ident.:53, sec. con n° de ident.:54 y sec. con n° de ident.:55.
En algunos aspectos, la descripción proporciona para una dosis unitaria de una composición farmacéutica que comprende virus recombinantes de 1x106 a 1x1015 de genomas de vector, en donde los virus recombinantes comprenden un ácido nucleico que codifica sFlt-1 unida operativamente a un promotor. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica comprende 1x1010 a 3x1012 de genomas de vector.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para generar un virus recombinante en una célula, que comprende el método: introducir en una célula, un ácido nucleico que comprende al menos 1 secuencia promotora unida operativamente a una secuencia transgénica de sFLT-1, una secuencia ITR y secuencia UTR; y purificar el virus recombinante. En algunos casos, la secuencia UTR es una secuencia UTR humana. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico no contiene una secuencia de resistencia a antibióticos betalactámicos. En algunos casos el virus recombinante produce la proteína sFlt-1 en el intervalo de 100-10.000 pg/ml cuando se mide a las 72 horas después de la transducción de células HEK293 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1x10®. En algunos casos, el virus recombinante inhibe la proliferación de células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC).
En algunos aspectos, la descripción proporciona una célula para generar un vector viral recombinante, que comprende la célula al menos 1 secuencia de polinucleótidos promotora unida operativamente a una secuencia del transgén sFLT-1, una secuencia de polinucleótidos ITR y una secuencia de polinucleótidos UTR.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica sFLT-1 para usar en el tratamiento o profilaxis de neovascularización ocular en un humano; en donde dicho uso comprende administrar directamente a un sujeto humano que lo necesita, a uno o más sitios subretinianos en dicho sujeto humano, una cantidad eficaz de una composición farmacéutica; en donde dicha composición farmacéutica comprende dicho ácido nucleico.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, en donde dicho sFLT-1 es un inhibidor de VEGF y en donde dicho tratamiento o reducción de la probabilidad de neovascularización ocular se produce como resultado de la inhibición del VEGF.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, en donde la composición farmacéutica es capaz de elevar los niveles de proteína sFLT-1 en el vítreo del sujeto humano después de al menos 72 horas después de la administración de dicha composición farmacéutica a dicho sujeto humano, en comparación con los niveles de proteína sFLT-1 en el vítreo de dicho ser humano antes de dicha administración.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, en donde el ácido nucleico que comprende dicho sFLT-1 comprende un virus recombinante, el virus seleccionado del grupo que consiste de: virus adenoasociado (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de coadyuvante, retrovirus, virus del herpes simple, lentivirus, poxvirus, virus hemaglutinatina del complejo Japón-liposoma (HVJ), virus de la leucemia murina de Moloney y virus en base a VIH.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, en donde el ácido nucleico que codifica el sFLT-1 está operativamente unido a un promotor seleccionado del grupo que consiste de: promotor del citomegalovirus (CMV), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), Promotor MMT, promotor EF-1 alfa, promotor UB6, promotor beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor opsina.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, en donde el ácido nucleico está empaquetado por un virus o es un plásmido de ADN.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, dicho uso comprende además la administración de uno o más inhibidores de VEGF adicionales al sujeto humano que necesita tratamiento o reducción, en donde opcionalmente dicho inhibidor de VEGF adicional es ranibizumab o bevacizumab.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, dicho uso comprende administrar dicha composición farmacéutica a un sujeto humano de al menos 50, 55 o 65 años.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, que comprende dicho uso administrar dicha composición farmacéutica fuera de la fóvea.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, en donde la agudeza visual mejor corregida (BCVA) del sujeto humano que necesita tratamiento, mejora en al menos 1, 2, 3, 4 o 5 líneas según lo medido por las letras del ETDRS. (Estudio de tratamiento temprano de la retinopatía diabética) posteriores a la administración de una cantidad efectiva de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, en donde la administración de la composición farmacéutica se realiza con una frecuencia de al menos una vez cada 3, 6, 9, 12, 18 o 24 meses en un sujeto humano que necesita tratamiento.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para usar, en donde la administración de la composición farmacéutica se realiza con una frecuencia de menos de 3 veces al año en el sujeto humano o se realiza con una frecuencia que reduce la frecuencia de administración de los tratamientos con inhibidores de VEGF adicionales en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una dosis unitaria de la composición farmacéutica que comprende aproximadamente 1x106 a 1x1015 o 1x1010 a 3x1012 genomas de vector. En algunos aspectos, los virus recombinantes comprenden un ácido nucleico que codifica sFLT-1, o un fragmento funcional del mismo, unido operativamente a un promotor.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de la neovascularización ocular en un sujeto humano que comprende: administrar a uno o más sitios subretinianos una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica un inhibidor de VEGF a un sujeto humano que necesita tratamiento. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento funcional del mismo. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF es un receptor soluble, una proteína de fusión o un fragmento funcional del mismo.
Breve descripción de los dibujos
Las características novedosas de la descripción se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente descripción por referencia a la siguiente descripción detallada que establece aspectos ilustrativos, en donde se usan los principios de la descripción y sus figuras acompañantes: LaFigura 1representa la representación esquemática de un plásmido ilustrativo.
LaFigura 2representa la expresión, secreción y actividad biológica de sFLT-1 de células transducidas con rAAV.sflt-1.(a)Análisis de transferencia Western de medios acondicionados de células 293 transducidas con Ad.sFlt-1 (línea 1), células D407 transducidas con rAAV.sFlt-1 (línea 2), células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 (línea 3) y células D407 transducidas con AAV.gfp (línea 4).(b)Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF por medio condicionado de células transducidas con rAAV.sFlt-1. Las HUVEC se cultivaron en medio de inanición (columna 1), en medio que contenía VEGF recombinante (columna 2), en medio que contenía VEGF y 40 pl de medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 (columna 3), en medio que contenía VEGF y 80 pL de medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 (columna 4), y en medio que contiene VEGF y 80 pL de medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.gfp (columna 5). (* P <0,02, ** P <0,005 para diferencias entre rAAV.sFlt-1 más VEGF y VEGF solamente.
LaFigura 3Arepresenta un gráfico que muestra la expresión de sFlt-1 (hsFLT-1) humana en el vítreo de monos inyectados en el ojo izquierdo con rAAV.sFlt-1 (Monos 8514, 8530, 8523, 8524 y 999), rAAV.gfp (Monos 8297 y 8532), en ambos ojos con proteína sFLT-1 recombinante (Mono 8294) y mono control no inyectado (control). El control y los monos 8294 y 999 se sacrificaron a los 3 meses después de la inyección, el mono 8524 se sacrificó a los 9 meses después de la inyección y los monos 8297, 8532, 8514, 8530 y 8523 se sacrificaron a los 12 meses después de la inyección. * indica niveles de proteína sFLT-1 que son significativamente más altos en los ojos inyectados con rAAV.sFlt-1 (p <0,05). LaFigura 3Brepresenta gráficos que muestran los niveles de hsFLT-1 en rAAV.sFlt-1 inyectado (999, 8524, 8523, 8530 y 8514), rAAV.gfp inyectado (8297 y 8532), monos inyectado con proteína recombinante sFlt-1 (8294) y no inyectados (control) en diferentes momentos después de la inyección.
Figura 4:Población del subconjunto de células inmunitarias en ojos de ratón. Gráficos que muestran la población de subconjuntos de células inmunitarias en los diferentes momentos posteriores a la inyección.
Figura 5:Población del subconjunto de células inmunitarias en bazos de ratón. Gráficos que muestran la población de subconjuntos de células inmunitarias en los diferentes momentos posteriores a la inyección.
LaFigura 6muestra diagramas que comparan las respuestas de Ki67 en células T CD4+ en diferentes ratones en diferentes momentos después de la inyección.
LasFiguras 7Aa7Drepresentan varias secuencias de origen de replicación ilustrativas.
LasFiguras 8Aa8Frepresentan las secuencias de varios promotores ilustrativos.
LasFiguras 9Aa9Crepresentan la secuencia de varios intrones, secuencias poli A y regiones ITR ilustrativas. LasFiguras 9Da9Frepresentan la secuencia de varias secuencias enlazadoras ilustrativas.
LasFiguras 9Ga9Hrepresentan la secuencia de varias secuencias de UTR ilustrativas.
LasFiguras 10Aa10Crepresentan la secuencia que codifica varias proteínas anti-VEGF ilustrativas.
LaFigura 11Arepresenta la secuencia de aminoácidos de sFLT-1. LaFigura 11Brepresenta la secuencia de aminoácidos del dominio 2 de sFLT-1, un fragmento funcional de sFLT-1. LaFigura 11Crepresenta una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio 2 de sFLT-1.
LasFiguras 12Aa12Brepresentan las secuencias de varios genes s de resistencia a antibióticos ilustrativos. LaFigura 13representa la FC de una composición ilustrativa (rAAV.sFlt-1), en donde alcanza una expresión anti-VEGF óptima a las 6-8 semanas. RBZ es un tratamiento estándar de anti-VEGF, tal como ranibizumab. “ Rescate RBZ” significa tratamiento de rescate.
LaFigura 14describe la evaluación oftalmológica de los pacientes. La inflamación se evaluó mediante biomicroscopía (BE) y oftalmoscopía indirecta (IOE). NDest: nada destacable.
LasFiguras 15Ay15Brepresentan los resultados de la agudeza visual.
LaFigura 16representa la medición del grosor de la retina de un paciente que recibió 24 inyecciones de Lucentis anteriores. LaFigura 17representa la biodistribución: qPCR para la secuencia de sFLT-1 (número de copias detectado).
LaFigura 18representa la biodistribución: Cápside de AAV medida por ELISA, título de AAV en cápsides/ml.
LaFigura 19representa la biodistribución de sFLT-1 medida por ELISA. Se muestra la concentración de sFLT-1 humana (pg/ml).
LasFiguras 20Ay20Brepresentan evaluaciones de OCT de pacientes a los que se les administró una dosis baja de rAAV.sFlt-1 (R1, R2, R4) o una dosis alta de rAAV.sFlt-1 (R5, R6 y R8).
LasFiguras 21Ay21Brepresentan los resultados de agudeza visual de sujetos humanos tratados con rAAV.sFlt-1 frente a pacientes de control no tratados a los 180 días después del tratamiento.
LasFiguras 22Ay22Brepresentan los resultados de agudeza visual de sujetos humanos tratados con rAAV.sFlt-1 frente a pacientes de control no tratados 1 año después del tratamiento.
LaFigura 23representa una tabla de sujetos humanos que recibieron inyecciones de rescate de Lucentis (readministración de inhibidor de VEGF) por semana en un estudio clínico de rAAV.sFlt-1.
LaFigura 24representa imágenes de agudeza visual y SD-OCT por semana para un sujeto humano tratado con rAAV.sFlt-1 en un estudio clínico de rAAV.sFlt-1.
LasFiguras 25Ay25Brepresentan datos sobre la producción de proteína sFlt-1 humana en células 293 de riñón embrionario humano (HEK293) detectadas por ELISA. Se produjo rAAV.sFlt-1 mediante el uso de transfección de plásmido en células HEK293. Se produjo una segunda construcción, rAAV(bv).sFlt-1, mediante el uso de baculovirus recombinante en células de insecto Sf9. La concentración de proteína sFlt-1 se midió mediante ELISA después de 72 a varios MOI.
Descripción detallada de la descripción
La presente descripción proporciona composiciones y métodos para la prevención o el tratamiento de la neovascularización ocular, como la AMD, en un sujeto humano, mediante la administración subretiniana de una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína tirosina quinasa soluble relacionada con Fms. -1 (sFlt-1) al sujeto humano.
Varios aspectos de la descripción se describen más abajo con referencia a aplicaciones de ejemplo para ilustración. Debe entenderse que se establecen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de la descripción. Sin embargo, un experto en la técnica relevante reconocerá fácilmente que la descripción se puede poner en práctica sin uno o más de los detalles específicos o con otros métodos. La presente descripción no está limitada por el orden ilustrado de actos o eventos, ya que algunos actos pueden ocurrir en diferentes órdenes y/o simultáneamente con otros actos o eventos. Además, no todos los actos o eventos ilustrados son necesarios para implementar una metodología de acuerdo con la presente descripción.
La terminología de la presente descripción tiene el propósito de describir casos particulares solamente y no pretende ser una limitación de las composiciones, métodos y composiciones de esta descripción.
Las composiciones y métodos de esta descripción como se describen en la presente descripción pueden emplear, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales y descripciones de biología molecular (lo que incluye técnicas recombinantes), biología celular, bioquímica, inmunoquímica y técnicas oftálmicas, que están dentro de la habilidad de aquellos que practican la técnica. Dichas técnicas convencionales incluyen métodos para observar y analizar la retina, o la visión en un sujeto, clonación y propagación de virus recombinantes, formulación de una composición farmacéutica y purificación bioquímica e inmunoquímica. Pueden obtenerse ilustraciones específicas de técnicas adecuadas al hacer referencia a los ejemplos de la presente descripción. Sin embargo, también pueden usarse, por supuesto, procedimientos convencionales equivalentes. Dichas técnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar en manuales de laboratorio estándar tales como Green, y col., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, y col., Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DnA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); y Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, “ Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” IRL Press, London (1984); Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000); y Berg y col., Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2002). Antes de que se describan las presentes composiciones, herramientas de investigación y métodos, debe entenderse que esta descripción no se limita a los métodos, composiciones, objetivos y usos específicos descritos, ya que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir únicamente aspectos particulares y no pretende limitar el alcance de la presente descripción, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Como se usa en la presente descripción, las formas singulares “ un” , “ una” y “ el o la” pretenden incluir las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que los términos “ que incluye” , “ incluye” , “ que tiene” , “tiene” , “ con” o variantes de los mismos se usen en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, se pretende que dichos términos sean inclusive de una manera similar al término “ que comprende” .
Los intervalos se pueden expresar en la presente descripción desde “ aproximadamente” un valor particular y/o hasta “ aproximadamente” otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otro caso incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente “ aproximadamente” , se entenderá que el valor particular forma otro caso. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final como independientemente del otro punto final. El término “ aproximadamente” , como se usa en la presente descripción, se refiere a un intervalo que es el 15 % más o menos de un valor numérico establecido dentro del contexto del uso particular. Por ejemplo, aproximadamente 10 incluirían un intervalo de 8,5 a 11,5. El término “ aproximadamente” también explica el error típico o la imprecisión en la medición de valores.
I. AMD
La AMD es la principal causa de ceguera en pacientes mayores de 50 años y se caracteriza por una degeneración progresiva de los fotorreceptores, la retina externa y el epitelio pigmentario de la retina en la mácula. La forma “ húmeda” avanzada (neovascular o exudativa) de la AMD es menos común, pero con frecuencia puede provocar una pérdida rápida y a menudo sustancial de la visión central en los pacientes. En la forma húmeda de AMD, la neovascularización coroidea se forma y se desarrolla en una red de vasos que pueden crecer debajo y a través del epitelio pigmentario de la retina. Como esto se acompaña de pérdida de plasma y/o hemorragia en el espacio subretiniano, podría producirse una pérdida repentina grave de la visión central si esto ocurre en la mácula.
El término “ AMD” , si no se especifica lo contrario, puede ser AMD seca o AMD húmeda. La presente descripción contempla el tratamiento o la prevención de AMD, AMD húmeda y/o AMD seca.
Como se sabe previamente en la técnica, se ha demostrado que AMD no tiene una causa única. Esta enfermedad altamente compleja puede resultar de contribuciones variables que incluyen, pero no se limitan a, la edad, la predisposición genética y el entorno o una combinación de los mismos. En los seres humanos, por ejemplo, los factores de riesgo epidemiológico establecidos pueden incluir, pero no se limitan a, el tabaquismo, la dieta, el sexo femenino, la raza caucásica y los antecedentes familiares de AMD. Debido a que la a Md es poco común en personas menores de 50 años, el único factor de riesgo necesario es la edad, lo que implica la multitud de cambios celulares que acompañan al envejecimiento normal en la patogenia de la AMD.
La complejidad etiológica de la AMD se refleja en la relativa escasez de terapias eficaces, estrategias preventivas y buenos modelos animales con los que estudiarla. Debido a la complejidad y la caracterización incompleta de la enfermedad, la AMD está modelada de forma incompleta en animales. Esto se debe en parte a las diferencias anatómicas en las retinas de animales y primates, así como también al tiempo prolongado necesario para que se desarrolle la enfermedad. La evidencia de estudios en animales y genética molecular humana respalda la noción de que la homeostasis alterada de una multitud de mecanismos responsables de la fisiología normal de los fotorreceptores-RPE puede precipitar la enfermedad. Al menos a nivel molecular, la enfermedad se puede explorar en modelos animales y, en algunos casos, incluso en aquellos cuyos defectos genéticos no son las causas principales de la AMD en humanos.
Los estudios genéticos anteriores, así como el análisis patológico en profundidad, revelan que no hay un patrón de herencia simple para la AMD, ni una patología única es común a varios modelos animales de AMD. Si bien se sabe en la técnica que los modelos de primates no humanos se aproximan mejor a la CNV en humanos que los modelos de ratones o ratas, las diferencias fundamentales en la anatomía, histología e incluso la genética de la retina de los primates no humanos producen patologías especie específicas diferentes.
Además, y como se describe en la presente descripción, la fotocoagulación con láser puede usarse para inducir CNV, un síntoma similar a AMD en modelos animales. En algunos casos, el tratamiento con láser rompe la membrana de Bruch y provoca una respuesta proliferativa fibrovascular que se origina en la coroides. Esta respuesta es la base para modelar la neovascularización coroidea en la AMD tardía y se desarrolló en macacos rhesus y cynomolgus.
Mediante el uso de un láser de argón, las manchas se mantienen pequeñas y se inducen con suficiente potencia para romper la membrana de Bruch. Esto es visible en el fondo de ojo como una burbuja en el momento de la fotocoagulación. La fotocoagulación induce la trombosis de los vasos coroideos seguida de reendotelialización 48 horas después y el crecimiento de nuevos vasos en el espacio subretiniano durante una semana. Debido a que los vasos recién formados son más permeables, el desarrollo neovascular se puede monitorear con angiografía con fluoresceína para evaluar la fuga del vaso.
La involución neovascular espontánea (indicada por una disminución de la fuga de fluoresceína) comienza aproximadamente a las 3 a 7 semanas y luego progresa gradualmente (durante un período de aproximadamente 2 a 13 meses) hasta que la fuga ya no es evidente en el sitio.
La extensión del crecimiento de nuevos vasos en comparación con las cicatrices mal vascularizadas puede variar en todos los modelos y está influenciada por la especie, la ubicación de la lesión en la retina y la intensidad del rayo láser. La variabilidad inherente en las diferencias de tratamiento de una especie a otra respalda aún más la idea de que ningún modelo animal recapitula completamente la AMD en humanos.
Las terapias para AMD han cambiado durante los últimos años, con la disponibilidad de aptámeros, anticuerpos y señuelos de receptores solubles que se unen a la proteína VEGF. Se ha demostrado que la proteína VEGF o ligando VEGF estimula la formación de nuevos vasos sanguíneos (es decir, angiogénesis) mediante la unión a receptores celulares, que incluye el receptor VEGF. Como se conoce en la técnica, los agentes anti-VEGF pueden prevenir, hasta cierto punto, la neovascularización y la angiogénesis que se produce en la AMD húmeda. La inyección intraocular de Macugen® o Lucentis® o Eylea® (agentes anti-VEGF) es costosa, y en la mayoría de los casos el tratamiento debe repetirse cada cuatro a seis semanas o cada ocho semanas en el caso de Eylea®. Por ejemplo, Lucentis es un fragmento de anticuerpo VEGF que cuesta alrededor de $ 1950/iny. Mensual. Avastin (Anticuerpo VEGF) se usa fuera de la etiqueta, y Eylea (trampa VEGF) cuesta aproximadamente de $ 1850/iny. y se administra cada dos meses. Todos estos medicamentos comparten problemas comunes de disminución del perfil farmacocinético y, por lo tanto, requieren inyecciones oculares repetidas.
Existe una necesidad en la técnica de una estrategia de tratamiento práctica, económicamente viable y de mayor duración. La descripción proporciona un nuevo tratamiento terapéutico para abordar algunas de estas necesidades.
La presente descripción proporciona una molécula anti-VEGF, tal como sFLT-1, administrada por cualquier vector adecuado (por ejemplo, sistema viral recombinante) a la retina de un sujeto humano que tiene o se sospecha que tiene AMD o enfermedades retinianas neovasculares relacionadas. En algunos casos, sFLT-1 puede ser una potente proteína de unión directa de VEGF. En algunos casos, sFLT-1 también puede bloquear o inhibir la actividad de VEGF.
Por ejemplo, como se conoce en la técnica, se ha observado que sFLT-1 (como se describe más adelante en la presente descripción) se une al dímero de la proteína VEGF con una Kd = 10 pM.
La presente descripción también describe composiciones y métodos relacionados con la administración de genes mediada por rAAV en el ojo. Se ha observado expresión génica a largo plazo en ojos de perro (> 8 años) con el sistema basado en AAV. La expresión de ARNm de sFLT-1 en la retina se mantiene al menos durante 18 meses. Se han realizado tres ensayos en humanos para la amarousis congénita de Leber que demostraron la seguridad de un sistema de administración basado en AAV en el contexto de una enfermedad degenerativa de la retina tal como la LCA.
II. Proteína de tirosina quinasa-1 (sFLT-1) relacionada con VEGF y Fms
A. VEGF
El factor de crecimiento endotelial vascular (denominado en la presente descripción “ VEGF” o “ ligando de VEGF” ) es un potente mitógeno específico de células endoteliales que desempeña un papel clave en la formación fisiológica de vasos sanguíneos. En algunos casos, la actividad de VEGF resulta de la unión del ligando de VEGF a uno o más receptores de VEGF en una célula. La unión del ligando de VEGF al receptor de VEGF puede tener numerosos efectos celulares y bioquímicos aguas abajo, que incluyen, pero no se limitan a, angiogénesis en tejidos. El VEGF se ha implicado en prácticamente todos los tipos de trastornos angiogénicos o neovasculares, que incluyen los asociados con el cáncer, la isquemia y la inflamación. Además, el VEGF se ha implicado en enfermedades oculares, que incluyen, pero no se limitan a, retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), AMD húmeda, AMD seca, neovascularización retiniana, edema macular diabético, isquemia de la retina diabética, edema de retina diabética, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de la vena retiniana, oclusión de la vena retiniana central, oclusión de la vena retiniana ramificada. Además, los tratamientos anti-VEGF, que incluyen las composiciones y métodos de esta descripción, como se describe en la presente descripción, pueden usarse en el tratamiento de una o más de estas enfermedades descritas en la presente descripción.
Datos recientes sugieren que VEGF es el principal factor de crecimiento angiogénico en la patogénesis de la forma húmeda de AMD.
El VEGF, un glicopéptido homodimérico de 46 kDa, se expresa en varios tipos de células oculares diferentes que incluyen, pero no se limitan a, células epiteliales pigmentarias, pericitos, células endoteliales vasculares, neuroglia y células ganglionares. En algunos casos, VEGF se expresa en espacios específicos y patrones temporales durante el desarrollo de la retina. En algunos casos, las isoformas humanas de VEGF pueden incluir proteínas de 206, 189, 183, 165, 148, 145 y 121 aminoácidos por monómero; sin embargo, las isoformas de VEGF humanas predominantes incluyen, pero no se limitan a, VEGF121, VEGF165, VEGF189 y VEGF206. Estas proteínas se producen mediante corte y empalme alternativo del ARNm de VEGF y difieren en su capacidad para unirse a la heparina y a los receptores o correceptores específicos de VEGF (neuropilinas). El dominio codificado por los exones 1-5 del gen VEGF contiene la información necesaria para el reconocimiento de los receptores VEGF conocidos KDR/FLK-1 y FLT-1. Este dominio está presente en todas las isoformas de VEGF. El VEGF actúa a través de estos receptores, que son receptores de tirosina quinasas de alta afinidad, lo que conduce a la proliferación, migración y aumento de la vasopermeabilidad de las células endoteliales.
El VEGF es uno de los varios factores implicados en el complejo proceso de angiogénesis y tiene una especificidad muy alta por las células endoteliales vasculares. El VEGF es un regulador de la angiogénesis fisiológica durante procesos tales como la embriogénesis, el crecimiento esquelético y la función reproductiva, pero también se ha implicado en la angiogénesis patológica asociada con enfermedades tales como el cáncer, los trastornos placentarios y otras afecciones. Los efectos biológicos potenciales del VEGF pueden estar mediados por receptores específicos de membrana tipo fms, FLT-1 y FLK-1/KDR. En algunos casos, estas asociaciones de unión de VEGF de origen natural pueden afectar la unión de VEGF a los receptores de VEGF, modulando así la activación del receptor de VEGF y las vías aguas abajo posteriores.
En relación con el cáncer, varios inhibidores de VEGF, que incluye un anticuerpo monoclonal humanizado contra VEGF (rhuMab VEGF), un anticuerpo anti-VEGFR-2, moléculas pequeñas que inhiben la transducción de señales de VEGFR-2 y un receptor de VEGF soluble, han mostrado algunas propiedades terapéuticas.
En relación con las enfermedades neovasculares intraoculares, tales como la retinopatía diabética, las oclusiones de las venas retinianas o la degeneración macular relacionada con la edad, algunos antagonistas de VEGF han mostrado efectos terapéuticos, a pesar de la necesidad de una administración frecuente.
B. Anti-VEGF
El virus recombinante de la presente descripción comprende la secuencia que codifica una proteína anti-VEGF, que incluye, pero no se limita a, las proteínas de unión a VEGF o fragmentos funcionales de las mismas descritos en las patentes US-5.712.380, US-5.861.484 y US-7.071.159 y las proteínas de fusión de unión a VEGF descritas en la patente US-7.635.474. Una proteína anti-VEGF también puede incluir la proteína sFLT-1 como se describe en la presente descripción.
Los virus o plásmidos recombinantes de la presente descripción pueden comprender la secuencia que codifica una proteína anti-VEGF, que incluye la proteína sFlt-1 de origen natural, como se describe en la patente US-5,861,484 y esa secuencia descrita por la sec. con n° de ident.: 109. También incluye, pero no se limita a, fragmentos funcionales de los mismos, que incluye las secuencias del dominio 2 de sFlt-1 o las establecidas en la sec. con n° de ident.: 121, así como también a construcciones relacionadas, tales como las proteínas de fusión de unión a VEGF descritas en la patente US-7.635.474. Una proteína anti-VEGF también puede incluir la proteína sFLT-1 como se describe en la presente descripción. Estas secuencias se pueden expresar a partir de ADN que codifica dichas secuencias mediante el uso del código genético, una técnica estándar que entienden los expertos en la técnica. Como pueden apreciar los expertos en la técnica, debido a la degeneración del código genético, las secuencias de proteínas anti-VEGF pueden expresarse fácilmente a partir de varias secuencias de ADN diferentes.
“ Proteína sFlt-1” en la presente descripción se refiere a una secuencia polipeptídica, o fragmento funcional de la misma, con al menos 90 %, o más, de homología con la secuencia sFLT-1 humana de origen natural, de modo que la proteína o polipéptido sFlt-1 se une a VEGF y/o al receptor de VEGF. La homología se refiere al % de conservación de residuos de una alineación entre dos secuencias (por ejemplo, como la proteína sFLT-1 humana de origen natural puede incluir cualquier variante adecuada de sFLT-1, que incluye, pero no se limita a, fragmentos funcionales, secuencias que comprenden inserciones, deleciones, sustituciones, pseudofragmentos, pseudogenes, variantes de empalme o secuencias optimizadas artificialmente. En algunos casos, la “ proteína sFLT-1” puede ser al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 % homóloga a la secuencia de la proteína sFLT-1 humana de origen natural. En algunos casos, la “ proteína sFLT-1” puede ser como máximo aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 % homóloga a la secuencia de la proteína sFLT-1 humana de origen natural. En algunos casos, la “ proteína sFLT-1” puede ser al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 % espacialmente homóloga a la conformación de la proteína sFLT-1 humana de origen natural. En algunos casos, la “ proteína sFLT-1” puede ser como máximo aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, 99,99 % o 100 % espacialmente homóloga a la conformación de la proteína sFLT-1 humana de origen natural.
Además, la forma truncada soluble del receptor de VEGF FLT-1, sFLT-1, es el único inhibidor específico endógeno conocido de VEGF. En la naturaleza, se genera mediante empalme de ARNm alternativo y carece del dominio similar a inmunoglobulina proximal a la membrana, la región de extensión transmembrana y el dominio de tirosina quinasa intracelular. Estructuralmente, las proteínas FLT-1 y sFLT-1 pueden comprender múltiples dominios funcionales. En algunas variantes, las proteínas<f>L<t>y sFLT comúnmente comparten 6 dominio entrelazados; 3 dominios implicados en la dimerización de la proteína y 3 dominios implicados en la unión de un ligando, tal como VEGF.
sFLT-1 es una forma truncada soluble del FLT-1 y se expresa de forma endógena. Como se describe en la presente descripción, FLT-1 “ soluble” o sFLT-1 se refiere a FLT-1 que no está restringido a la membrana celular. La sFLT-1 libre puede difundirse libremente en el espacio o solución extracelular.
sFLT-1 es el único inhibidor específico endógeno conocido de VEGF. Esta interacción es específica y puede competir con VEGF sin marcar en exceso de 100 veces. En algunos casos, la actividad angiostática de sFLT-1 puede resultar de la inhibición de VEGF por dos mecanismos: i) secuestro de VEGF, al que se une con alta afinidad, y ii) formación de heterodímeros inactivos con isoformas que atraviesan la membrana de los receptores VEGF FLTt-1 y FLK-1/KDR. Como se conoce en la técnica, los ensayos de unión in vitro han indicado que sFLT-1 se une a VEGF con alta afinidad y también puede inhibir la proliferación impulsada por VEGF de células endoteliales de la vena umbilical humana. En modelos animales de cáncer, sFLT-1 inhibe el crecimiento tumoral. En algunos casos, sFLT-1 puede funcionar de una manera subestequiométrica o negativa dominante, ya que se puede evitar que el exceso de VEGF en el espacio extracelular se una y posteriormente active el receptor de VEG<f>. Estas propiedades de sFLT-1 se han descrito en Kendall y Thomas,
1993; Proc Natl Acad Sci. 90: 10705-10709. Como se conoce en la técnica, se pueden usar fragmentos funcionales de sFLT-1 en lugar de la proteína de longitud completa. Más específicamente, el dominio de unión a VEGF (dominio 2), o alternativamente el dominio 2 de sFLT-1 más el dominio 3 de sFLT1, KDR u otro miembro de la familia, puede usarse para unirse e inactivar a VEGF. Tales fragmentos funcionales se describen en Wiesmann y col., 1997; Cell, 91: 695-704.
Los términos “ sFLT-1” y “ un fragmento funcional de sFLT-1” son equivalentes y se usan aquí indistintamente.
III. Vectores y virus recombinantes
Las composiciones y métodos de la descripción proporcionan el suministro de un ácido nucleico que codifica un anti-VEGF (por ejemplo, proteínas sFLT-1) a células en un sujeto humano o paciente que lo necesite. En algunos casos, la administración del ácido nucleico puede denominarse terapia génica.
La composición y los métodos de la descripción proporcionan cualquier método adecuado para la administración del ácido nucleico anti-VEGF (por ejemplo, sFLT-1). En algunos casos, el suministro del ácido nucleico se puede realizar mediante el uso de cualquier “vector” adecuado (a veces también denominado como “ suministro de genes” o “vehículo de transferencia de genes” ). Vector, vehículo de administración, vehículo de administración de genes o vehículo de transferencia de genes, puede denominarse a cualquier macromolécula o complejo de moléculas adecuado que comprenda un polinucleótido para ser administrado a una célula diana. En algunos casos, una célula objetivo puede ser cualquier célula a la que se suministra el ácido nucleico o el gen. El polinucleótido a administrar puede comprender una secuencia codificante de interés en terapia génica, como el gen sFLT-1.
Por ejemplo, los vectores adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, vectores virales tales como adenovirus, virus adenoasociados (AAV) y retrovirus, liposomas, otros complejos que contienen lípidos y otros complejos macromoleculares capaces de mediar la liberación de un polinucleótido a una célula objetivo.
En algunos casos, un vector puede ser una molécula orgánica o inorgánica. En algunos casos, un vector puede ser una molécula pequeña (es decir, <5 kD), o una macromolécula (es decir, >5 kD). Por ejemplo, un vector puede incluir, pero no se limita a, moléculas inertes, no activas biológicamente, tales como partículas metálicas. En algunos casos, un vector puede ser partículas de oro.
En algunos casos, un vector puede comprender una molécula biológicamente activa. Por ejemplo, los vectores pueden comprender macromoléculas polimerizadas tales como dendrímeros.
En algunos casos, un vector puede comprender un vector viral recombinante que incorpora uno o más ácidos nucleicos. Como se describe en la presente descripción, los ácidos nucleicos pueden referirse a polinucleótidos. Ácido nucleico y polinucleótido pueden usarse indistintamente. En algunos casos, los ácidos nucleicos pueden comprender
ADN o ARN. En algunos casos, los ácidos nucleicos pueden incluir ADN o ARN para la expresión de sFLT-1. En algunos casos, los ácidos nucleicos de ARN pueden incluir, pero no se limitan a, una transcripción de un gen de interés
(por ejemplo, sFLT-1), intrones, regiones no traducidas, secuencias de terminación y similares. En otros casos, los ácidos nucleicos de ADN pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias tales como secuencias de genes promotores híbridos, secuencias promotoras constitutivas fuertes, el gen de interés (por ejemplo, sFLT-1), regiones no traducidas, secuencias de terminación y similares. En algunos casos, se puede usar una combinación de ADN y ARN.
Como se describe en la descripción de la presente descripción, el término “ construcción de expresión” pretende incluir cualquier tipo de construcción genética que contenga un ácido nucleico o polinucleótido que codifique productos génicos en los que parte o toda la secuencia que codifica el ácido nucleico es capaz de transcribirse. La transcripción puede traducirse en una proteína. En algunos casos, puede estar parcialmente traducido o no traducido. En ciertos aspectos, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción del ARNm en un producto génico.
En otros aspectos, la expresión solo incluye la transcripción de los genes que codifican el ácido nucleico de interés.
En un aspecto, la presente descripción proporciona un virus recombinante, tal como un virus adenoasociado (rAAV) como un vector para mediar en la expresión de sFLT-1.
En algunos casos, el vector viral de la descripción puede medirse como pfu (unidades formadoras de placa). En algunos casos, la pfu del virus recombinante o el vector viral de las composiciones y métodos de la descripción puede ser de aproximadamente 108 a aproximadamente 5x1010 pfu. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son al menos aproximadamente 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5*108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x10 4x109, 5*109, 6x1097*109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010 y 5x1010 pfu. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son como máximo aproximadamente 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5*108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5*109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x10 En algunos casos, el vector viral de la descripción puede medirse como genomas de vector. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son 1x1010 a 3x1012 genomas de vector. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son 1x109 a 3x1013 genomas de vector. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son 1x108 a 3x1014 genomas de vector. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción pueden ser al menos aproximadamente 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1X106, 1x107, 1X108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1 x i013, 1<x>1014, 1<x>1015, 1<x>1016, 1<x>1017 y 1<x>1018 genomas de vector. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son 1x108 a 3x1014 genomas de vector. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción pueden ser como máximo aproximadamente 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1<x>1012, 1<x>1013, 1<x>1014, 1<x>1015, 1<x>1016, 1 x l017y 1<x>1018 genomas de vector.
En algunos casos, el vector viral de la descripción puede medirse mediante el uso de la multiplicidad de infección (MOI). En algunos casos, la MOI puede referirse a la proporción o múltiplo de genomas vectoriales o virales a las células a las que se puede administrar el nucleico. En algunos casos, la MOI puede ser 1x106 En algunos casos, la MOI puede ser 1<x>105 -1<x>107. En algunos casos, la MOI puede ser 1<x>104 -1<x>108. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son al menos aproximadamente 1<x>101, 1<x>102, 1<x>103, 1<x>104, 1<x>105, 1<x>106, 1<x>107, 1 x i08, 1 x i09, 1 x i010, 1 x i011, 1 x i012, 1 x i013, 1 x i014, 1 x i015, 1 x i016, 1 x i017 y 1 x i018 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son 1x108 a 3x1014 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son de al menos aproximadamente 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 y 1x1018 MOI.
En algunos aspectos, el ácido nucleico puede administrarse sin el uso de un virus (es decir, con un vector no viral) y puede medirse como la cantidad de ácido nucleico. Generalmente, se puede usar cualquier cantidad adecuada de ácido nucleico con las composiciones y métodos de esta descripción. En algunos casos, el ácido nucleico puede ser al menos aproximadamente 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, o 5g. En algunos casos, el ácido nucleico puede ser como máximo aproximadamente 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g o 5 g.
En algunos aspectos, puede usarse un vector autocomplementario (sc). El uso de vectores de AAV autocomplementarios puede eludir el requisito de síntesis de ADN de segunda hebra viral y puede conducir a una mayor tasa de expresión de la proteína transgénica, según lo proporcionado por Wu, Hum Gene Ther. 2007, 18(2): 171-82.
En algunos aspectos, se pueden generar varios vectores AAV para permitir la selección del serotipo, promotor y transgén más óptimos.
En algunos casos, el vector puede ser un vector dirigido, especialmente un vector dirigido que se une selectivamente a una célula específica, tal como células cancerosas o células tumorales o células oculares. Los vectores virales para usar en la descripción pueden incluir aquellos que presentan baja toxicidad para una célula diana e inducen la producción de cantidades terapéuticamente útiles de la proteína anti-VEGF de una manera específica en la célula.
Las composiciones y métodos de la descripción proporcionan cualquier sistema de administración de ácido nucleico viral adecuado que incluye, pero no se limita al uso de al menos uno de un virus adenoasociado (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de coadyuvante, retrovirus, virus del herpes simple, lentivirus, poxvirus, virus hemaglutinatina del complejo Japón-liposoma (HVJ), virus de la leucemia murina de Moloney y virus basado en el VIH. Preferentemente, el vector viral comprende un promotor eucariota fuerte unido operativamente al polinucleótido, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV).
Generalmente, cualquier vector viral adecuado puede diseñarse para optimizarlo para usar con las composiciones y métodos de la descripción. Por ejemplo, pueden usarse vectores virales derivados de adenovirus (Ad) o virus adenoasociados (AAV). Se pueden usar vectores virales tanto humanos como no humanos y el vector viral recombinante se puede alterar de manera que pueda tener defectos de replicación en humanos. Cuando el vector es un adenovirus, el vector puede comprender un polinucleótido que tiene un promotor unido operativamente a un gen que codifica la proteína anti-VEGF y es de replicación defectuosa en humanos.
Para combinar propiedades ventajosas de dos sistemas de vectores virales, se pueden usar vectores virales híbridos para administrar un ácido nucleico que codifica una proteína sFLT-1 a una célula o tejido diana. Las técnicas estándar para la construcción de vectores híbridos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales técnicas se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook, y otros, In Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, Nueva York o cualquier número de manuales de laboratorio que analicen la tecnología del ADN recombinante. Los genomas de AAV bicatenarios en cápsides adenovirales que contienen una combinación de AAV e ITR adenovirales pueden usarse para transducir células. En otra variación, un vector AAV puede colocarse en un vector adenoviral “ sin agallas” , “ dependiente de adyuvante” o “ de alta capacidad” . Los vectores híbridos adenovirus/AAV se analizan en Lieber y col., J. Virol. 73:9314-9324, 1999. Los vectores híbridos retrovirus/adenovirus se analizan en Zheng y col., Nature Biotechnol. 18:176-186, 2000.
Los genomas retrovirales contenidos dentro de un adenovirus pueden integrarse dentro del genoma de la célula diana y efectuar una expresión génica estable.
Los vectores adenovirales recombinantes de replicación defectuosa se pueden producir de acuerdo con técnicas conocidas. Véase Quantin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, y col., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992); y Rosenfeld, y col., Cell, 68:143-155 (1992).
Los vectores adicionales preferidos pueden incluir, pero no se limitan a, vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de leucemia murina de Moloney y virus basados en VIH. En algunos casos, puede usarse un vector viral basado en VIH, en el que el vector viral basado en VIH comprende al menos dos vectores en donde los genes gag y pol son de un genoma de VIH y elgen enves de otro virus. Pueden usarse vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de la viruela tales como los vectores de la viruela ortopox o avipox, los vectores del virus del herpes tal como el vector del virus del herpes simple I (VHS) [Geller, AI y otros, J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., y col., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. y col., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A.I., y col., Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)], Adenovirus Vectors [LeGal LaSalle y col., Science, 259:988 (1993); Davidson, y col., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, y col., J. Virol. 69: 2004 (1995)] y Adeno-associated Virus Vectors [Kaplitt, M.G., y col., Nat. Genet. 8: 148 (1994)].
Otros vectores virales que pueden usarse de acuerdo con la presente descripción incluyen vectores basados en el virus del herpes simple (HSV). Los vectores de HSV eliminados de uno o más genes tempranos inmediatos (IE) son ventajosos porque generalmente no son citotóxicos, persisten en un estado similar a la latencia en la célula diana y proporcionan una transducción eficaz de la célula diana. Los vectores de HSV recombinantes pueden incorporar aproximadamente 30 kb de ácido nucleico heterólogo.
También se pueden usar en la descripción retrovirus, tales como retrovirus de tipo C y lentivirus. Por ejemplo, los vectores retrovirales pueden basarse en el virus de la leucemia murina (MLV), según lo proporcionado por Hu y Pathak, Pharmacol. Rev. 52:493511, 2000 y Fong y otros, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:1-60, 2000. Los vectores basados en MLV pueden contener hasta 8 kb de ADN heterólogo (terapéutico) en lugar de los genes virales. El ADN heterólogo puede incluir un promotor específico de tejido y un ácido nucleico proteico anti-VEGF. En los métodos de administración a células neoplásicas, también puede codificar un ligando para un receptor específico de tejido.
Se pueden utilizar vectores retrovirales adicionales, que incluye, pero no se limitan a, vectores basados en lentivirus defectuosos en la replicación, que incluye vectores basados en inmunodeficiencia humana (VIH), según lo proporcionado por Vigna y Naldini, J. Gene Med. 5:308-316, 2000 y Miyoshi y col., J. Virol. 72:8150-8157, 1998. Los vectores lentivirales pueden ser ventajosos porque son capaces de infectar tanto células que se dividen activamente como que no se dividen. También pueden ser muy eficientes en la transducción de células epiteliales humanas.
Los vectores lentivirales para usar en la descripción pueden derivarse de lentivirus humanos y no humanos (que incluye el VIS). Los ejemplos de vectores lentivirales incluyen secuencias de ácido nucleico necesarias para la propagación del vector, así como también un promotor específico de tejido unido operativamente a un gen de proteína anti-VEGF. Las secuencias de ácido nucleico pueden incluir las lTr virales, un sitio de unión del cebador, un tracto de polipurina, sitios att y un sitio de encapsidación.
Se puede empaquetar un vector lentiviral en cualquier cápside lentiviral adecuada. La sustitución de una proteína de partículas por otra de un virus diferente se denomina “ pseudotipificación” . La cápside del vector puede contener proteínas de la envoltura viral de otros virus, que incluye el virus de la leucemia murina (MLV) o el virus de la estomatitis vesicular (VSV). El uso de la proteína G del VSV produce un título de vector alto y da como resultado una mayor estabilidad de las partículas del virus del vector.
Los vectores basados en alfavirus, tales como los elaborados a partir del virus del bosque semliki (SFV) y el virus sindbis (SIN), también pueden usarse en la descripción. El uso de alfavirus se describe en Lundstrom, K., Intervirology 43: 247-257, 2000 y Perri y otros, Journal of Virology 74: 9802-9807, 2000.
Los vectores de alfavirus recombinantes con replicación defectuosa pueden ser ventajosos porque son capaces de expresión génica heteróloga (terapéutica) de alto nivel y pueden infectar una amplia gama de células diana. Los replicones de alfavirus pueden dirigirse a tipos de células específicos mostrando en la superficie de su virión un ligando o dominio de unión heterólogo funcional que permitiría la unión selectiva a las células diana que expresan una pareja de unión análoga. Los replicones de alfavirus pueden establecer latencia y, por lo tanto, expresión de ácido nucleico heterólogo a largo plazo en una célula diana. Los replicones también pueden presentar expresión transitoria de ácido nucleico heterólogo en la célula diana.
Los vectores virales de la viruela pueden introducir un gen en el citoplasma de la célula. Los vectores del virus avipox pueden dar como resultado sólo una expresión a corto plazo del gen o ácido nucleico. Los vectores de adenovirus, los vectores de virus adenoasociados y los vectores del virus del herpes simple (HSV) pueden usarse con las composiciones y métodos de la descripción. El vector de adenovirus puede dar como resultado una expresión a más corto plazo(p. ej.,menos de aproximadamente un mes) que el virus adenoasociado, en algunos aspectos, y puede presentar una expresión mucho más prolongada. El vector particular elegido puede depender de la célula objetivo y de la afección a tratar.
Los virus adenoasociados (AAV) son pequeños virus de ADN monocatenario sin envoltura. Son parvovirus humanos no patógenos y pueden depender de virus auxiliares, lo que incluye el adenovirus, el virus del herpes simple, el virus vaccinia y el CMV, para la replicación. La exposición a AAV de tipo salvaje (wt) no está asociada ni se sabe que cause ninguna patología humana y es común en la población general, por lo general ocurre en la primera década de vida en asociación con una infección adenoviral.
Como se describe en la presente descripción, “ AAV” se refiere a un virus adenoasociado, “ rAAV” se refiere a un virus adenoasociado recombinante.
En algunos casos, el AAV de tipo salvaje codifica los genes rep y cap. El gen rep es necesario para la replicación viral y el gen cap es necesario para la síntesis de proteínas de la cápside. A través de una combinación de sitios alternativos de inicio de traducción y de empalme, el genoma pequeño puede expresar cuatro productos génicos rep y tres cap. Los productos y secuencias del gen rep en las repeticiones terminales invertidas (ITR de 145 pb, que flanquean el genoma) pueden ser fundamentales en este proceso. Hasta la fecha, se han aislado 11 serotipos de AAV. El AAV2 puede usarse con la composición y los métodos de la descripción. Las composiciones y métodos de la descripción proporcionan el uso de cualquier serotipo de AAV adecuado. En algunos aspectos, el AAV se selecciona del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV2,5, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV 12, rh 10 e híbridos de los mismos.
En algunos aspectos, la presente descripción proporciona un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que comprende además una forma humana del receptor 1 de VEGF soluble truncado (sFLT-1) y se denomina rAAV.sFlt-1. El vector es un vector viral adenoasociado (rAAV) recombinante, con replicación deficiente, de serotipo 2. En otro aspecto, el vector es un vector viral adenoasociado (rAAV) recombinante, con replicación deficiente, de serotipo 2 denominado rAAV.sFlt-1.
AAV2 es el más caracterizado. Se ha demostrado que rAAV2 puede mediar la expresión transgénica a largo plazo en los ojos de muchas especies de animales. En ratas, el gen informador mediado por rAAV (proteína verde fluorescente) todavía estaba presente 18 meses después de la inyección. En los monos, el mismo gen informado estaba presente 17 meses después de la inyección. De manera similar, estaban presentes niveles altos de proteína sFLT-1 en el vítreo de ojos de mono inyectados con rAAV.sFlt-1 15 meses después de la inyección.
El rAAV.sFlt-1 se ha probado en modelos animales para detectar trastornos neovasculares intraoculares. rAAV.sFlt-1 pareció retardar la progresión de la neovascularización en modelos animales de neovascularización corneal y neovascularización retiniana. Curiosamente, el sFlt-1 mediado por rAAV indicó cierta inhibición de la neovascularización en un modelo de mono de neovascularización coroidea (modelo para la forma húmeda de degeneración macular relacionada con la edad o AMD). En este estudio, la presencia de la construcción rAAV.sFlt-1 mostró niveles bajos de expresión de sFLT-1 en los ojos de los monos y no afectó el bienestar o la función retiniana de los monos. No hay evidencia que sugiera problemas de seguridad asociados con la exposición sistémica a rAAV.sFlt-1. Los hallazgos positivos generales y la falta de toxicidad de los vectores rAAV en estos estudios, así como también los hallazgos con rAAV.sFlt-1 en modelos de mamíferos de neovascularización coroidea/AMD proporcionan datos de apoyo extensos de que el vector tiene un perfil de seguridad favorable cuando se administra al ojo.
A pesar de la capacidad de rAAV.sFlt-1 para mejorar ciertos síntomas de AMD en el modelo de mono, los niveles de proteínas sFLT-1 son inesperadamente bajos en la retina. Se ha demostrado en la técnica que los niveles de expresión de sFLT-1 impulsados por un promotor de mamífero constitutivamente activo proporcionan altos niveles de expresión de proteínas en numerosos tipos de células. Si bien no está vinculado a la teoría, pueden existir múltiples posibilidades para este nivel de expresión más bajo de lo esperado. Como proteína grande de múltiples dominios, la sFLT-1 puede ser susceptible a una degradación proteolítica prematura, una mala cinética de expresión o una clasificación no óptima. Con respecto a esta última, como proteína secretada, la sFLT-1, tal como se expresa de forma recombinante en la célula, entra en la vía secretora. En las células de la retina, que incluye las células del RPE, la sFLT-1 puede secretarse apical o basolateralmente, en dependencia tanto de la clasificación de la proteína por RE o el aparato de Golgi. En algunos casos, la clasificación no óptima puede secretar la molécula a la membrana basolateral no deseada, disminuyendo así la concentración de moléculas de sFLT-1 disponibles para inhibir la señalización de VEGF y la angiogénesis neovascular en la superficie apical de la capa de células del RPE.
Además, se desconocía en la técnica cómo este nivel inesperadamente más bajo de sFLT-1 puede afectar la eficacia del fármaco para el tratamiento de la enfermedad de AMD real en seres humanos. Si bien los niveles apenas elevados en el modelo de mono mostraron signos prometedores de mejora de los síntomas de AMD, el modelo animal de mono para AMD simplemente sirve como sustituto de la enfermedad de AMD. Como se describe en la presente descripción, los síntomas de AMD se inducen artificialmente (mediante láser) en la retina. Si bien este modelo es adecuado para varios análisis, la eficacia real del fármaco en el tratamiento de síntomas en el modelo de mono es difícil de extrapolar al tratamiento de enfermedades en humanos. Los niveles de proteína inesperadamente más bajos generados por rAAV.sFlt-1 aumentan aún más la dificultad en esta evaluación sin experimentos en humanos.
Además, se están llevando a cabo 3 ensayos clínicos sobre amaurosis congénita de Lebers (LCA) en el Reino Unido y Estados Unidos, mediante el uso de la cadena principal de rAAV2. La LCA es una enfermedad ocular hereditaria rara que aparece al nacer o en los primeros meses de vida y se caracteriza por nistagmo, respuesta pupilar lenta o nula y pérdida de visión grave o ceguera. Hasta la fecha, no se han informado problemas de seguridad después de la inyección del constructo rAAV2 en el espacio subretiniano de 6 participantes en estos dos ensayos. Ambos equipos involucrados en los ensayos clínicos concluyeron que sus hallazgos han respaldado más estudios de terapia génica en pacientes con LCA.
Dadas las aparentes dificultades técnicas para generar niveles elevados sustancialmente o sostenidos de sFLT-1 en monos, se pueden tomar varias estrategias de optimización para abordar uno o más de los problemas técnicos subyacentes a niveles de proteína más bajos de sFlt-1 en la retina después de la introducción de rAAV. sFlt-1. En algunos casos, las estrategias de optimización, que incluye las proporcionadas por la composición y los métodos de esta descripción, pueden incluir aumentar la optimización de la secuencia o dominios de la proteína sFlt-1, introducir elementos de control para dirigir la clasificación correcta después de la expresión en las células de la retina o elevar los niveles de proteína sFlt-1 para compensar cualquiera de estos posibles factores. En algunos casos, la composición y los métodos de la descripción proporcionan estrategias específicas dirigidas hacia este último, que implican la incorporación de secuencias de ácido nucleico específicas dirigidas a mejorar los niveles de proteína elevados en retinas humanos por encima de los niveles de sFlt-1 como se observó previamente en estudios con monos. Como se describe en la presente descripción, se pueden usar varias secuencias, enlazadores, UTR, intrones, variantes de sFLT-1 o combinaciones de los mismos para elevar los niveles de proteína de la proteína sFlt-1 en la retina después de la exposición a rAAV.sFlt-1.
Los vectores pueden comprender componentes o funcionalidades que modulan adicionalmente la entrega de genes y/o la expresión de genes, o que de otro modo proporcionan propiedades beneficiosas a las células diana. Tales otros componentes incluyen, por ejemplo, componentes que influyen en la unión o direccionamiento a células (que incluyen componentes que median la unión específica de tipo célula o tejido); componentes que influyen en la absorción del ácido nucleico del vector por la célula; componentes que influyen en la localización del polinucleótido dentro de la célula después de la captación (tales como agentes que median la localización nuclear); y componentes que influyen en la expresión del polinucleótido. Dichos componentes también podrían incluir marcadores, tales como marcadores de detección y/o de selección que pueden usarse para detectar o seleccionar células que han captado y están expresando el ácido nucleico liberado por el vector. Dichos componentes pueden proporcionarse como una característica natural del vector (tales como el uso de ciertos vectores virales que tienen componentes o funcionalidades que median la unión y la absorción), o los vectores pueden modificarse para proporcionar tales funcionalidades.
Los marcadores de selección pueden ser positivos, negativos o bifuncionales. Los marcadores de selección positivos permiten la selección de las células que llevan el marcador, mientras que los marcadores de selección negativos permiten que las células que llevan el marcador se eliminen de forma selectiva. Se ha descrito una variedad de estos genes marcadores, que incluye marcadores bifuncionales (es decir, positivos/negativos) (ver, por ejemplo, Lupton, S., WO 92/08796, publicado el 29 de mayo de 1992; y Lupton, S., W<o>94/28143, publicado el 8 de diciembre de 1994). Los ejemplos de marcadores de selección negativos pueden incluir la inclusión de genes de resistencia a antibióticos, tales como ampicilina o kanamicina. Dichos genes marcadores pueden proporcionar una medida adicional de control que puede ser ventajosa en contextos de terapia génica. Se conoce en la técnica una gran variedad de tales vectores y generalmente están disponibles.
En algunos casos, los ácidos nucleicos que codifican marcadores de resistencias de antibióticos pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias tales como SEQ ID No. 110, SEQ ID No. 111, SEQ ID No. 112, SEQ ID No. 113 o SEQ ID No. 114.
En muchos de los vectores virales compatibles con los métodos de la descripción, se pueden incluir uno o más promotores en el vector para permitir que el vector exprese más de un gen heterólogo. Además, el vector puede comprender una secuencia que codifica un péptido señal u otro resto que facilita la expresión de la proteína anti-VEGF de la célula diana.
El ácido nucleico que codifica un producto génico puede estar bajo control transcripcional por un promotor. Un “ promotor” , como se proporciona en la presente descripción, se refiere a una secuencia de ADN adecuada requerida para iniciar la transcripción de un gen. La frase “ bajo control transcripcional” significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con el ácido nucleico para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del gen. En algunos casos, el promotor puede incluir un promotor “ fuerte” o constitutivamente activo. Por ejemplo, el promotor de CMV puede usarse como se conoce en la técnica como un promotor constitutivamente activo. En algunos casos, el promotor de CMV puede comprender elementos reguladores adicionales para promover la expresión. En algunos casos, el promotor de CMV puede comprender el promotor de CMV inicial temprano.
En algunos casos, un promotor puede referirse a un promotor “ débil” , o secuencia que produce niveles más bajos de proteína sFLT-1 que un promotor fuerte. En algunos casos, se puede usar un promotor de manera que el promotor dirija la expresión selectiva de sFLT-1. En algunos casos, un promotor u otros elementos reguladores usados en combinación con otras secuencias como se describe en la presente descripción pueden usarse para impulsar la expresión selectiva de sFLT-1 en una célula ocular o tejido ocular.
Además, el “ promotor” , 104 también se puede usar en la presente descripción indistintamente para referirse a cualquier módulo adicional de control de la transcripción adecuado que pueda estar presente alrededor del sitio de inicio de las ARN polimerasas. Las composiciones y métodos de esta descripción pueden usar cualquier promotor y módulo de control transcripcional adecuado para la expresión de un transgén, 106. Los módulos de control de la transcripción adicionales pueden incluir, pero no se limitan a, elementos tales como la timidina quinasa (tk) de HSV y las unidades de transcripción temprana de SV40. Generalmente, los promotores pueden estar compuestos de módulos funcionales discretos, cada uno de los cuales consiste de aproximadamente 7-20 pb de ADN, o 20-5000 pb de ADN, y contienen uno o más sitios de reconocimiento para proteínas activadoras o represoras de la transcripción. La composición y los métodos de la descripción proporcionan cualquier secuencia reguladora adecuada o combinación de las mismas. En algunos casos, estas secuencias del módulo de control de la transcripción pueden denominarse o identificarse como secuencias potenciadoras o represoras.
Al menos un módulo en cada promotor funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. Un ejemplo es la caja TATA. Otro ejemplo puede incluir algunos promotores que carecen de una caja TATA, tal como el promotor del gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor de los genes tardíos de SV40, un elemento discreto que se superpone al sitio de inicio en sí y ayuda a fijar el lugar de inicio.
Los elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de inicio de la transcripción. Generalmente, estos están ubicados en una región 30-110 pb aguas arriba del sitio de inicio, aunque varios promotores pueden contener elementos funcionales también aguas abajo del sitio de inicio. El espaciamiento entre los elementos promotores con frecuencia puede ser flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven entre sí. En el promotor tk, por ejemplo, el espaciamiento entre los elementos del promotor se puede aumentar a 50 pb antes de que la actividad comience a disminuir. En dependencia del promotor, los elementos individuales pueden posicionarse para funcionar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción.
Las composiciones y métodos de la descripción proporcionan cualquier secuencia adecuada para el control de la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en la célula diana. Por tanto, cuando se selecciona como diana una célula humana, las secuencias pueden modificarse por ingeniería genética de la región codificante del ácido nucleico para que sea adyacente y esté bajo el control de un promotor que sea capaz de expresarse en una célula humana. Generalmente, dicho promotor podría incluir un promotor humano o viral.
En varios aspectos de la descripción, el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (es decir, CMV), el promotor temprano de SV40, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, la@-actina, el promotor de insulina de rata y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa pueden usarse para obtener un alto nivel de expresión de la secuencia codificante de interés (por ejemplo, sFLT-1). También se contempla el uso de otros promotores de fagos bacterianos o celulares virales o de mamíferos que son bien conocidos en la técnica para lograr la expresión de una secuencia codificante de interés, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un propósito dado. En algunos aspectos, pueden estar presentes secuencias reguladoras procarióticas en el vector, como la secuencia promotora de la ARN polimerasa de T7. En otros aspectos, el vector está libre de tales secuencias reguladoras. Empleando un promotor con propiedades conocidas, se puede optimizar el nivel y patrón de expresión de la proteína de interés después de la transfección o transformación.
La selección de un promotor que es regulado en respuesta a señales fisiológicas o sintéticas específicas puede permitir la expresión inducible del producto génico. Por ejemplo, en el caso de que la expresión de un transgén, o transgenes cuando se usa un vector multicistrónico, sea tóxica para las células en las que se produce el vector, puede ser deseable prohibir o reducir la expresión de uno o más de los transgenes. Ejemplos de transgenes que pueden ser tóxicos para la línea celular productora son genes proapoptóticos y de citocinas. Se encuentran disponibles varios sistemas de promotores inducibles para la producción de vectores virales en los que el producto transgénico puede ser tóxico. La composición y los métodos de la descripción proporcionan cualquier combinación adecuada de secuencia promotora, secuencias reguladoras y transgén. En algunos casos, una combinación de secuencias puede dar como resultado ninguna toxicidad para la célula. En algunos casos, una combinación de secuencias puede dar como resultado una alta toxicidad para la célula. En algunos casos, una combinación de secuencias puede dar como resultado niveles moderados de toxicidad en la célula.
El sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, California) es uno de esos sistemas para la expresión transgénica. Este sistema está diseñado para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamíferos. Consiste en un mecanismo de expresión estrictamente regulado que permite poca expresión de nivel basal del transgén, pero una inducibilidad superior a 200 veces. El sistema se basa en el receptor de ecdisona heterodimérico de Drosophila, y cuando la ecdisona o un análogo como la muristerona A se une al receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión del transgén corriente abajo, se alcanzan niveles elevados de transcritos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico se expresan constitutivamente a partir de un vector, mientras que el promotor sensible a ecdisona que dirige la expresión del gen de interés está en otro plásmido. La ingeniería de este tipo de sistema en el vector de transferencia génica de interés puede usarse en las composiciones y métodos de esta descripción. La cotransfección de plásmidos que contienen el gen de interés y los monómeros del receptor en la línea celular productora permitiría entonces la producción del vector de transferencia génica sin expresión de un transgén potencialmente tóxico. En el momento apropiado, la expresión del transgén podría activarse con ecdisona o muristerona A.
En algunas circunstancias, puede ser deseable regular la expresión de un transgén en un vector de terapia génica. Por ejemplo, se pueden usar diferentes promotores virales con diferentes fuerzas de actividad dependiendo del nivel de expresión deseado. En células de mamífero, el promotor temprano inmediato de CMV puede usarse para proporcionar una fuerte activación transcripcional. También se han usado versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean niveles reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión de un transgén en células hematopoyéticas, a menudo se usan promotores retrovirales tales como LTR (Repeticiones terminales largas) de MLV o Mm TV. Otros promotores virales que pueden usarse dependiendo del efecto deseado incluyen SV40, RSV LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores de adenovirus tales como de la región E1A, E2A o MLP, AAV LTR, virus del mosaico de la coliflor, HSV- TK y virus del sarcoma aviar.
En algunos aspectos, los promotores específicos de tejido se usan para efectuar la transcripción en tejidos o células específicos con el fin de reducir la toxicidad potencial o los efectos indeseables en los tejidos no objetivo. Por ejemplo, pueden usarse promotores tales como PSA, probasina, fosfatasa de ácido prostético o calicreína glandular específica de la próstata (hK2) para dirigir la expresión génica en la próstata.
En algunos casos, se pueden usar promotores o elementos de secuencia reguladora para dirigir la expresión selectiva en células o tejidos oculares. Por ejemplo, el promotor, los elementos de secuencia o las secuencias reguladoras que se encuentran en tipos de células oculares específicas, tales como células epiteliales de pigmento retiniano, pueden usarse en una construcción de expresión adecuada (por ejemplo, el promotor RPE65 o VMD2).
La selección de los promotores apropiados se puede realizar fácilmente. En algunos casos, se puede usar un promotor fuerte o de alta expresión. Un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor de citomegalovirus (CMV) de 763 pares de bases. El virus del sarcoma de Rous (RSV) (Davis y otros, Hum Gene Ther 4:151 (1993)) y también se pueden usar promotores MMT. Ciertas proteínas pueden expresarse mediante el uso de su promotor nativo. También se pueden incluir otros elementos que pueden potenciar la expresión, tales como un potenciador o un sistema que da como resultado niveles altos de expresión, como un gen tat y un elemento tar. Este casete puede insertarse luego en un vector,por ejemplo,un vector plasmídico tal como pUC19, pUC118, pBR322 u otros vectores plasmídicos conocidos, que incluye, por ejemplo, un origen de replicación deE. coli.Véase, Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989). Los promotores se analizan a continuación. El vector plasmídico también puede incluir un marcador seleccionable tal como el gen de la p-lactamasa para la resistencia a la ampicilina, siempre que el polipéptido marcador no afecte negativamente al metabolismo del organismo que se está tratando. El casete también se puede unir a un resto de unión de ácido nucleico en un sistema de administración sintético, como el sistema descrito en WO 95/22618. Generalmente, las secuencias promotoras y/o cualquier secuencia reguladora asociada pueden comprender aproximadamente al menos 150 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1000 pb, 2000 pb, 3000 pb, 4000 pb, 5000 pb o 10 000 pb. Las secuencias promotoras y cualquier secuencia reguladora asociada pueden comprender como máximo aproximadamente 150 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1000 pb, 2000 pb, 3000 pb, 4000 pb, 5000 pb o 10000 pb.
En algunos aspectos, el virus o plásmido recombinante comprende un promotor seleccionado de promotor de citomegalovirus (CMV), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y promotor de MMT, promotor de EF-1 alfa, promotor de UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor de CAG, promotor de RPE65 y promotor de opsina. Generalmente, las secuencias promotoras y las secuencias promotor/potenciador como las proporcionadas por la presente descripción, pueden incluir, pero no se limitan a cualquier secuencia seleccionada de SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39, SEQ ID No.
340, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46, y SEQ ID No. 47.
En algunos aspectos, se usa un marcador antibiótico en el proceso de producción del virus recombinante. Pueden usarse marcadores de resistencia a antibióticos para identificar células transgénicas positivas en la generación de virus recombinantes. En algunos aspectos, el marcador de antibiótico comprende una secuencia que codifica un gen de resistencia a antibiótico, tales como los proporcionados en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, las secuencias mostradas en la Figura 8A y la Figura 8B. Por ejemplo, los marcadores que confieren resistencia pueden incluir, pero no se limitan a, kanamicina, gentamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, doxiciclina o higromicina. En algunos aspectos, el gen de resistencia a los antibióticos es un gen de resistencia a los antibióticos no betalactámicos como la kanamicina.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o el plásmido usado para generar virus recombinante comprenden una secuencia que codifica una secuencia de origen de replicación, tales como las que se proporcionan en la presente descripción. El origen de las secuencias de replicación, generalmente proporcionan una secuencia útil para propagar un plásmido. Generalmente, el origen de las secuencias de replicación proporcionadas por la presente descripción puede incluir, pero no se limitan a, cualquier secuencia seleccionada de secuencias como las proporcionadas en la Figura 7A, Figura 7B, Figura 7C y Figura 7D.
En algunos aspectos, un origen u origen de secuencias de replicación puede incluir, pero no se limita a, secuencias tales como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16 o SEQ ID No. 17.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o el plásmido usado para generar virus recombinante comprenden un potenciador, tal como los proporcionados en la presente descripción.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o plásmido utilizado para generar virus recombinante, comprende un intrón quimérico o un intrón, 105, tales como los proporcionados en la presente memoria y descritos en la patente US-7.635.474. El intrón o intrón quimérico se puede usar indistintamente en la presente descripción. En algunos casos, un intrón puede referirse a cualquier secuencia que se pueda transcribir pero que no se traduzca. En algunos casos, un intrón puede referirse a cualquier secuencia que se transcribe y se elimina de un transcripto de ARN maduro en una célula. En algunos casos, un intrón puede comprender aproximadamente al menos 1 pb, 50 pb, 100 pb, 150 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1000 pb, 2000 pb, 3000 pb, 4000 pb o 5000 pb. En algunos casos, un intrón puede comprender puede comprender aproximadamente al menos 1 pb, 50 pb, 100 pb, 150 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1000 pb, 2000 pb, 3000 pb, 4000 pb o 5000 pb. En algunos casos, un intrón puede tener aproximadamente 300 pb. En algunos casos, un intrón puede tener aproximadamente 200-400 pb. En algunos casos, un intrón quimérico puede tener aproximadamente 100 - 500 pb. En algunos casos, un intrón puede tener aproximadamente 50 - 200 pb. En algunos casos, un intrón puede ser un intrón natural intacto o un intrón quimérico.
En algunos aspectos, un intrón puede incluir, pero no se limita a, secuencias tales como SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 115, SEQ ID No. 116, SEQ ID No. 117, SEQ ID No. 118, SEQ ID No. 119 o SEQ ID No. 120.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o el plásmido usado para generar el virus recombinante comprenden una secuencia de poli A (poliadenilación), 107, tales como las que se proporcionan en la presente descripción (por ejemplo, secuencia de poli A de SV40). Generalmente, se puede usar cualquier secuencia de poli A adecuada para la expresión deseada del transgén (es decir, sFLT-1). Por ejemplo, en algunos casos, la presente descripción proporciona una secuencia que comprende la secuencia poli A de SV40, o una parte de la secuencia poli A de SV40. En algunos casos, pueden usarse secuencias de poli A nativas que se encuentran aguas abajo (3'UTR) del gen sFLT-1 humano que se encuentran en la secuencia genómica humana. En otros casos, pueden usarse secuencias de poli A que se encuentran aguas abajo de genes distintos de sFLT-1. En otros casos, la presente descripción proporciona secuencias poli A que comprenden una combinación de una o más secuencias poli A o elementos de secuencia. En algunos casos, no se usa ninguna secuencia poli A. En algunos casos, una o más secuencias poli A pueden denominarse regiones no traducidas (UTR), 3' UTR o secuencias de terminación.
En ciertos aspectos de la descripción, el uso de elementos del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) o del virus de la fiebre aftosa (FMDV) puede usarse para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES pueden eludir el modelo de exploración de ribosomas de la traducción dependiente de Cap metilada en 5' y comenzar la traducción en los sitios internos. Se han descrito elementos IRES de dos miembros de la familia de los picornavirus (poliovirus y encefalomiocarditis), así como también un mensaje IRES de un mamífero. Los elementos IRES se pueden vincular a marcos de lectura abiertos heterólogos. Se pueden transcribir juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto puede ser accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Se pueden expresar de manera eficiente múltiples genes mediante el uso de un solo promotor/potenciador para transcribir un solo mensaje. Un sistema alternativo para la coexpresión de dos proteínas en vectores de administración de terapia génica es el sistema FMDV 2A. El sistema FMDV 2A emplea un vector de plásmido retroviral en el que dos genes pueden unirse a una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia 2A del virus de la fiebre aftosa por picornavirus. La transcripción y traducción dan lugar a un ARNm bicistrónico y dos productos proteicos independientes.
Cualquier marco de lectura abierto heterólogo se puede vincular a elementos IRES. Esto puede incluir genes para proteínas secretadas, proteínas de múltiples subunidades, codificadas por genes independientes, proteínas intracelulares o unidas a la membrana y marcadores de selección. De esta manera, la expresión de varias proteínas se puede modificar simultáneamente en una célula con una única construcción y un único marcador de selección.
Una secuencia poli A puede comprender una longitud de 1 - 10 pb, 10- 20 pb, 20 - 50 pb, 50 - 100 pb, 100 - 500 pb, 500 pb - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb - 9 Kb, y 9Kb -10 Kb de longitud. Una secuencia poli A puede comprender una longitud de al menos 1 pb, 2 pb, 3 pb, 4 pb, 5 pb, 6 pb, 7 pb, 8 pb, 9 pb, 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb y 10 Kb de longitud. Una secuencia poli A puede comprender una longitud de como máximo 1 pb, 2 pb, 3 pb, 4 pb, 5 pb, 6 pb, 7 pb, 8 pb, 9 pb, 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb y 10 Kb de longitud.
En algunos casos, una secuencia poli A o de terminación puede incluir, pero no se limita a, secuencias tales como SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54 y SEQ ID No. 55.
Generalmente, las secuencias de poli A, como se proporciona en la presente descripción, pueden incluir, pero no se limitan a, cualquier secuencia seleccionada de las Regiones 1-10 de Poli A como se proporciona en la Figura 9A y la Figura 9B.
En algunos casos, las secuencias de poli A pueden optimizarse para varios parámetros que afectan la expresión de proteínas, que incluyen, pero no se limitan a, la vida media del ARNm del transgén en la célula, la estabilidad del ARNm del transgén o la regulación transcripcional. Por ejemplo, las secuencias de poli A pueden alterarse para aumentar la transcripción de ARNm del transgén, lo que puede dar como resultado un aumento de la expresión de la proteína. En algunos casos, las secuencias de poli A pueden alterarse para disminuir la vida media del transcrito de ARNm del transgén, lo que puede dar como resultado una disminución de la expresión de proteínas.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o plásmido usado para generar virus recombinante, comprende un polinucleótido que codifica una proteína sFLT-1 humana o un fragmento funcional de la misma. En algunos casos, el virus recombinante y/o plásmido usado para generar virus recombinante, comprende un ácido nucleico que codifica otra proteína anti-VEGF o inhibidor de VEGF.
En algunos casos, un inhibidor de VEGF puede incluir, pero no se limita a, secuencias tales como SEQ ID No. 102, SEQ ID No. 103, SEQ ID No. 104, SEQ ID No. 105, SEQ ID No. 106, SEQ ID No. 107, SEQ ID No. 108, o SEQ ID No. 122
En algunos casos, los ácidos nucleicos de un inhibidor de VEGF pueden codificar secuencias polipeptídicas que pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias polipeptídicas tales como SEQ ID No. 109 o SEQ ID No. 121.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o el plásmido usado para generar el virus recombinante comprenden un fragmento de ácido nucleico regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de la proteína sFLT-1 en una célula del ojo. En algunos casos, las células oculares pueden comprender células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE).
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o plásmido usado para generar virus recombinante puede comprender una o más regiones o secuencias no traducidas (UTR). Generalmente, se puede usar cualquier secuencia UTR adecuada para la expresión óptima deseada del transgén (es decir, sFLT-1). Por ejemplo, en algunos casos, las regiones o secuencias UTR pueden comprender secuencias nativas. En algunos casos, las secuencias UTR pueden ser secuencias que se encuentran aguas arriba (5 'UTR) o aguas abajo (3' UTR) del gen sFLT-1 humano como se encuentra en la secuencia genómica humana o porciones de la misma. En otros casos, las secuencias UTR pueden comprender secuencias no nativas, como las que se encuentran aguas arriba o aguas abajo de genes distintos de sFLT-1 o comprender secuencias que comprenden además una combinación de uno o más elementos de secuencia UTR como se describe adicionalmente en la presente descripción. En algunos casos, solo se usa una secuencia 5' UTR. En algunos casos, solo se usa una secuencia 3' UTR. En algunos casos, no se usan secuencias UTR.
Una secuencia UTR puede comprender una longitud de 1 -10 pb, 10- 20 pb, 20 - 50 pb, 50 - 100 pb, 100 - 500 pb, 500 pb - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb - 9 Kb, y 9Kb -10 Kb en longitud. Una secuencia UTR puede comprender una longitud de al menos 1 pb, 2 pb, 3 pb, 4 pb, 5 pb, 6 pb, 7 pb, 8 pb, 9 pb, 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb y 10 Kb de longitud. Una secuencia UTR puede comprender una longitud de como máximo 1 pb, 2 pb, 3 pb, 4 pb, 5 pb, 6 pb, 7 pb, 8 pb, 9 pb, 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb y 10 Kb de longitud.
Generalmente, las secuencias UTR proporcionadas por la presente descripción pueden incluir, pero no se limitan a, cualquier secuencias que incluyen, pero no se limitan a, SEQ ID No. 91, SEQ ID No. 2, S<e>Q ID No. 92, SEQ ID No. 93, SEQ ID No.
94, SEQ ID No. 95, SEQ ID No. 96, SEQ ID No. 97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, SEQ ID No. 100 y SEQ ID No. 101.
En algunos casos, las variaciones de la 5' UTR y/o 3' UTR pueden optimizarse para un nivel deseado de expresión de proteínas. En algunos casos, las secuencias 3' UTR pueden optimizarse para varios parámetros que afectan la expresión de proteínas, que incluyen, pero no se limitan a, la vida media del ARNm del transgén en la célula, la estabilidad o la estructura secundaria del ARNm del transgén o la regulación condicional (por ejemplo, la unión de varios factores para modular la traducción). Por ejemplo, la secuencia 3' UTR puede alterarse para aumentar la vida media del transcrito de ARNm del transgén, lo que puede dar como resultado un aumento de la expresión de proteínas. En algunos casos, la secuencia 3' UTR puede alterarse para disminuir la vida media del transcrito de ARNm del transgén, lo que puede dar como resultado una disminución de la expresión de proteínas.
Generalmente, las secuencias de 3 'UTR pueden comprender varios elementos de secuencia. La presente descripción proporciona secuencias 3 'UTR que pueden incluir, pero no se limitan a, elementos de secuencia tales como una o más señales de poliadenilación, secuencias enlazadoras, secuencias espaciadoras, elementos SECIS, secuencias ARE o ricas en AU o secuencias de unión de miARN o ARNi, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de terminación 3' o variantes y/o combinaciones de las mismas.
En algunos casos, las secuencias 5' UTR pueden optimizarse para diversos parámetros que afectan la expresión de proteínas, que incluyen, pero no se limitan a, la vida media del ARNm del transgén en la célula, la estabilidad o la estructura secundaria del ARNm del transgén o la regulación transcripcional. Por ejemplo, las secuencias 5' UTR pueden alterarse para aumentar la eficiencia de traducción del transcrito de ARNm del transgén, lo que puede dar como resultado un aumento de la expresión de la proteína. En algunos casos, las secuencias 5' UTR pueden alterarse para disminuir la eficiencia de traducción del transcrito de ARNm del transgén, lo que puede dar como resultado una disminución de la expresión de la proteína.
Generalmente, las secuencias 5' UTR pueden comprender varios elementos de secuencia. La presente descripción proporciona secuencias 5' UTR que pueden incluir, pero no se limitan a, elementos de secuencia tales como uno o más sitios de unión a ribosomas (RBS), secuencias enlazadoras, secuencias espaciadoras, secuencias reguladoras, elementos de respuesta reguladora, riboconmutadores, secuencias que promueven o inhiben el inicio de la traducción, secuencias reguladoras para el transporte de ARNm o variantes y/o combinaciones de las mismas.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o el plásmido usado para generar virus recombinante pueden comprender una o más secuencias enlazadoras o espaciadoras. Como se describe en la presente descripción, la secuencia enlazadora o la secuencia espaciadora pueden usarse indistintamente. Generalmente, una secuencia enlazadora o secuencia espaciadora puede ser cualquier secuencia adecuada usada para crear una secuencia no contigua entre al menos dos elementos de secuencia. Por ejemplo, en un aspecto de la descripción, puede encontrarse una secuencia enlazadora insertada entre una secuencia ITR-1,108, o ITR-2,103,y una secuencia de gen de resistencia a antibióticos,106como se refleja en la Figura 1A. En otro ejemplo, las secuencias enlazadoras pueden insertarse adyacentes a cualquier elemento de secuencia del virus recombinante o del plásmido que codifica el virus recombinante, que incluye las secuencias de ITR, las secuencias promotoras o promotoras/potenciadoras, la secuencia del intrón, la secuencia transgénica y la secuencia de la región poli A. Generalmente, se puede usar cualquier secuencia espaciadora o enlazadora adecuada para crear secuencias no contiguas. Por ejemplo, en algunos casos, las secuencias enlazadoras pueden ser secuencias generadas aleatoriamente. En algunos casos, la secuencia enlazadora puede ser una secuencia no específica optimizada para prevenir la formación de estructuras secundarias o interacciones intramoleculares que pueden afectar negativamente la expresión de la proteína. En algunos casos, las secuencias enlazadoras pueden comprender cualquier elemento de secuencia funcional adicional, que incluye, entre otros, intrones, secuencias reguladoras, potenciadores o similares. Los elementos funcionales en las secuencias enlazadoras pueden usarse para la producción óptima deseada de virus y/o la expresión de la expresión transgénica. En algunos casos, las secuencias enlazadoras son sitios de clonación, restos de sitios de clonación anteriores u otras secuencias no significativas y la inserción de tales enlazadores entre dos elementos de secuencia cualesquiera es opcional.
Generalmente, la secuencia enlazadora, como se proporciona en la presente descripción, puede incluir, pero no se limita a, cualquier secuencia seleccionada de secuencias como se proporciona en la Figura 9D, Figura 9E y Figura 9F.
En algunos casos, la longitud de la secuencia enlazadora puede optimizarse para la producción óptima deseada de virus y/o expresión de la expresión transgénica. En algunos casos, la longitud de una o más secuencias enlazadoras ubicadas en uno o más sitios en el genoma del virus o plásmido puede variarse para producir la expresión de proteína óptima deseada. Por ejemplo, se puede encontrar una secuencia enlazadora entre el intrón, como se describe en la presente descripción, y el transgén (es decir, sFLT-1). La longitud de la secuencia enlazadora se puede variar para producir efectos variables sobre la transcripción y la posterior traducción del transgén en la célula.
Una secuencia enlazadora puede comprender una longitud de 1 -10 pb, 10- 20 pb, 20 - 50 pb, 50 - 100 pb, 100 - 500 pb, 500 pb - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb - 9 Kb, y 9Kb -10 Kb en longitud. Una secuencia enlazadora puede comprender una longitud de al menos 1 pb, 2 pb, 3 pb, 4 pb, 5 pb, 6 pb, 7 pb, 8 pb, 9 pb, 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb y 10 Kb de longitud. Una secuencia enlazadora puede comprender una longitud de como máximo 1 pb, 2 pb, 3 pb, 4 pb, 5 pb, 6 pb, 7 pb, 8 pb, 9 pb, 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb y 10 Kb de longitud.
En algunos casos, una secuencia enlazadora o espaciadora puede incluir, pero no se limita a, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No.70, SEQ ID No. 71, SEQ ID No. 72, SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 77, SEQ ID No. 78, SEQ ID No. 79, SEQ ID No. 80, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 82, SEQ ID No. 83, SEQ ID No. 84, SEQ ID No. 85, SEQ ID No. 86, SEQ ID No. 87, SEQ ID No. 88, SEQ ID No. 89, y SEQ ID No. 90.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende secuencias de repetición terminal invertida (ITR) usadas para empaquetar el casete de expresión del gen recombinante en el virión del vector viral. En algunos casos, el ITR proviene de un virus adenoasociado (AAV). En algunos casos, el ITR es del serotipo 2 de AAV. En algunos casos, una ITR puede incluir, pero no se limita a, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58 o SEQ ID No. 59.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o el plásmido usado para generar virus recombinante comprende elementos de ácido nucleico en el siguiente orden: a) una primera secuencia ITR; b) una secuencia promotora; c) una secuencia intrónica; d) una primera secuencia UTR; e) una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF; f) una segunda secuencia UTR; g) una secuencia de poli A; y h) una segunda secuencia ITR. En algunos aspectos del virus recombinante y/o plásmido usado para generar el virus recombinante, la secuencia promotora comprende una secuencia promotora/potenciadora. En algunos aspectos, la secuencia que codifica un inhibidor de VEGF comprende una secuencia que codifica la proteína sFLT-1 humana o un fragmento funcional de la misma. En otros aspectos, el plásmido usado para generar el virus recombinante comprende además un origen de secuencia de replicación, 102. En algunos aspectos, el plásmido comprende además una secuencia para un gen de resistencia a antibióticos como se proporciona en la presente descripción.
En algunos aspectos, el virus recombinante y/o el plásmido usado para generar virus recombinante comprende elementos de ácido nucleico en el siguiente orden: a) una primera secuencia ITR; b) una primera secuencia enlazadora; c) una secuencia promotora; d) una segunda secuencia enlazadora; e) una secuencia intrónica; f) una tercera secuencia enlazadora; g) una primera secuencia UTR; h) una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF; i) una segunda secuencia UTR; j) una cuarta secuencia enlazadora; k) una secuencia de poli A; l) una quinta secuencia enlazadora; y m) una segunda secuencia ITR. En algunos aspectos del virus recombinante y/o plásmido usado para generar virus recombinante, la secuencia promotora comprende una secuencia promotora/potenciadora. En algunos aspectos, la secuencia que codifica un inhibidor de VEGF comprende una secuencia que codifica la proteína sFLT-1 humana o un fragmento funcional de la misma. En otros aspectos, el plásmido usado para generar el virus recombinante comprende además un origen de secuencia de replicación. En algunos aspectos, el plásmido comprende además una secuencia para un gen de resistencia a antibióticos como se proporciona en la presente descripción.
IV. Composiciones farmacéuticas
Una composición farmacéutica es una formulación que contiene uno o más ingredientes activos, así como también, uno o más excipientes, portadores, estabilizadores o agentes de carga, que es adecuada para la administración a un paciente humano para lograr un resultado de diagnóstico o efecto terapéutico o profiláctico deseado. Para la estabilidad durante el almacenamiento y la conveniencia de manipulación, una composición farmacéutica puede formularse como un polvo liofilizado (es decir, liofilizado) o secado al vacío que puede reconstituirse con solución salina o agua antes de su administración a un paciente. Alternativamente, la composición farmacéutica se puede formular como una solución acuosa. Una composición farmacéutica puede contener un ingrediente activo proteico. Desafortunadamente, las proteínas pueden ser muy difíciles de estabilizar, lo que da como resultado la pérdida de proteína y/o la pérdida de actividad de la proteína durante la formulación, reconstitución (si es necesario) y durante el almacenamiento antes del uso de una composición farmacéutica que contiene proteína. Pueden producirse problemas de estabilidad debido a la desnaturalización, degradación, dimerización y/o polimerización de las proteínas. Se han usado diversos excipientes, como albúmina y gelatina, con diferentes grados de éxito para intentar estabilizar un ingrediente activo proteico presente en una composición farmacéutica. Además, se han usado crioprotectores tales como los alcoholes para reducir la desnaturalización de las proteínas en las condiciones de congelación de la liofilización.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso interno incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos como polisorbatos (Tween™), dodecil sulfato sódico (lauril sulfato sódico), óxido de lauril dimetilamina, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), alcoholes polietoxilados, polioxietileno sorbitán, octoxinol (Triton X100™), N, N - dimetildodecilamina-N-óxido, bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB), polioxil 10 lauril éter, Brij 721™, sales biliares (desoxicolato sódico, colato sódico), ácidos plurónicos (F-68, F-127), aceite de ricino polioxilado (Cremophor™), etoxilato de nonilfenol (Tergitol™), ciclodextrinas y cloruro de etilbencetonio (Hyamine™). La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol y ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. Puede conseguirse una absorción prolongada de las composiciones internas al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse soluciones estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.
En un aspecto, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente. Las suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente US-4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto humano a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la descripción está dictada y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un contenedor, paquete o dispensador junto con las instrucciones de administración.
Las composiciones farmacéuticas de la descripción abarcan todas las sales, ésteres o sales farmacéuticamente aceptables de dichos ésteres, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal que comprende un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológicamente activo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se refiere a profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la descripción, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes.
El término “ profármaco” indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa(es decir, unfármaco) dentro del cuerpo o células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones.
El término “ sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la descripción: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto original y no le imparten efectos toxicológicos no deseados.
Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, tales como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Los metales usados como cationes comprenden sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Las aminas comprenden N-N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína (ver, por ejemplo, Berge y otros, “ Pharmaceutical Salts” , J. Pharma Sci., 1977, 66, 119). Las sales de adición de base de dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de la manera convencional. La forma de ácido libre puede regenerarse poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislando el ácido libre de la manera convencional. Las formas de ácido libre difieren algo de sus respectivas formas de sal en ciertas propiedades físicas tales como solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a sus respectivos ácidos libres para los propósitos de la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, una “ sal de adición farmacéutica” comprende una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de los componentes de las composiciones de la descripción. Estos comprenden sales de ácidos orgánicos o inorgánicos de las aminas. Las sales ácidas preferidas son los hidrocloruros, acetatos, salicilatos, nitratos y fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica y comprenden sales básicas de una variedad de ácidos inorgánicos y orgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos carboxílicos orgánicos, sulfónicos, sulfo o fosfoácidos o ácidos sulfámico N-sustituidos, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o ácido isonicotino; y con aminoácidos, tales como los 20 aminoácidos alfa implicados en la síntesis de proteínas en lanaturaleza,por ejemplo ácido glutámico o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 4-metilbencenosulfónico, ácido naftalen-2-sulfónico, ácido naftalen-1,5-disulfónico, 2 o 3-fosfoglicerato, glucosa-6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos), o con otros compuestos orgánicos ácidos, tales como ácido ascórbico. También se pueden preparar sales de compuestos farmacéuticamente aceptables con un catión farmacéuticamente aceptable. Los cationes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica y comprenden cationes alcalinos, alcalinotérreos, de amonio y de amonio cuaternario. También son posibles carbonatos o hidrogenocarbonatos. Para los oligonucleótidos, los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables comprenden, pero no se limitan a: (I) sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliamidas tales como espermina y espermidina, y similares; (II) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (III) sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfónico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalacturónico y similares; y sales (IV) formadas a partir de aniones elementales tales como cloro, bromo y yodo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción comprenden, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que comprenden, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes.
Ciertas composiciones de la presente descripción también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se usa en la presente descripción, “ compuesto portador” o “ portador” puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte(es decir,no posee actividad biológica per se) pero es reconocido como un ácido nucleico por procesosin vivoque reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, generalmente con un exceso de esta última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otros reservorios circulatorios extra, presumiblemente debido a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente fosforotioato en el tejido hepático puede reducirse cuando se coadministra con ácido polinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilben-2,2'disulfónico (Miyao y otros, Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura y col., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
El vector o los virus recombinantes (viriones) se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas para su administración a pacientes mamíferos, particularmente seres humanos. El vector o los viriones se pueden formular en portadores acuosos no tóxicos, inertes y farmacéuticamente aceptables, preferentemente a un pH en el intervalo de 3 a 8, con mayor preferencia en el intervalo de 6 a 8. Tales composiciones estériles comprenderán el vector o virión que contiene el ácido nucleico que codifica la molécula terapéutica disuelta en un tampón acuoso que tiene un pH aceptable después de la reconstitución.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en la presente descripción comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector o virión en mezcla con un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, fosfato y aminoácidos, polímeros, polioles, azúcar, tampones, conservantes y otras proteínas. Ejemplos de aminoácidos, polímeros y azúcares y similares son compuestos de octilfenoxi polietoxi etanol, compuestos de monoestearato de polietilenglicol, ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, sacarosa, fructosa, dextrosa, maltosa, glucosa, manitol, dextrano, sorbitol, inositol, galactitol, xilitol, lactosa, trehalosa, albúmina de suero bovino o humano, citrato, acetato, soluciones de Ringer y Hank, cisteína, arginina, carnitina, alanina, glicina, lisina, valina, leucina, polivinilpirrolidona, polietileno y glicol. Preferentemente, esta formulación es estable durante al menos seis meses a 4 °C.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en la presente descripción comprende un tampón, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o fosfato de sodio/sulfato de sodio, tampón tris, tampón de glicina, agua estéril y otros tampones conocidos por el experto en la técnica, tales como los descritos por Good y col. (1966) Biochemistry 5:467. El pH del tampón en el que la composición farmacéutica que comprende el anti-VEGF contenido en el sistema de administración del vector adenovírico, puede estar en el intervalo de 6,5 a 7,75, 7 a 7,5 o 7,2 a 7,4. El pH de la formulación puede estar en el rango entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 12,0. El pH de la composición inmunogénica puede ser de al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 unidades de pH. El pH de la composición inmunogénica puede ser como máximo de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 unidades de pH.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en la presente descripción comprende sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano, en una cantidad de aproximadamente 1 a 10 por ciento, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 por ciento.
Ciertos aspectos de la descripción proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más virus recombinantes y uno o más de otros agentes quimioterapéuticos.
Los ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos comprenden, pero no se limitan a, fármacos contra el cáncer tales como daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, mostaza nitrogenada, clorambucilo, melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato (MIX), colchicina, vincristina, vinblastina, etopósido, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Ver, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15.° Ed., Berkow y otros, Eds., 1987, Rahway, NJ, pág. 1206-1228).
Los fármacos antiinflamatorios, que comprenden, pero no se limitan a, fármacos antiinflamatorios no esteroides y corticosteroides, y fármacos antivirales, que comprenden, pero no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en las composiciones de la descripción (The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow y otros, Eds., 1987, Rahway, NJ, pág. 2499-2506 y 46-49, respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos no antisentido también están dentro del alcance de esta descripción. Se pueden usar dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.
En otro aspecto relacionado, las composiciones de la descripción pueden contener uno o más virus recombinantes, particularmente sFLT-1 con diferentes secuencias. Pueden usarse dos o más virus combinados juntos o secuencialmente.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una dosis unitaria de una composición farmacéutica que comprende aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x1015 genomas virales, en donde los virus comprenden
un ácido nucleico que codifica a sFLT-1.
En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción se puede medir como pfu (unidades formadoras de placa). En algunos casos, las pfu de la dosis unitaria de la composición farmacéutica de
la descripción pueden ser aproximadamente 1x108 a aproximadamente 1*1010 pfu. En algunos casos, las ufp de la
dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción son al menos aproximadamente 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5*108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 72x109, 8x109, 9x109, 2x1010, 3x1010, 4x1010y 5x1010 pfu. En algunos casos, las ufp de la dosis unitaria de la composición farmacéutica
de la descripción son como máximo aproximadamente 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5*108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 72x 109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010y 5x1010 pfu.
En algunos casos, el vector viral de la descripción puede medirse como genomas de vector. En algunos casos, la dosis
unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es 1*1010 a 3*1012 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es 1 * l09a 3x1013 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es 1*1010 a 1x1011 genomas de vector. En algunos
casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es 1x108 a 3*1014 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es como al menos aproximadamente
1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x101°, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x10 1 x l017y 1x l018genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción
es 1x l08 a 3x1014 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es como máximo aproximadamente 1x l01, 1x i02, ix i03, ix i04, ix i05, ix i06, ix i07, ix i08, ix i09, l x i010,
1 x i011, i x i012, i x i013, i x i014, i x i015, i x i016, i x i017y 1x1018 genomas de vector.
En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción puede medirse mediante el uso
de multiplicidad de infección (MOI). En algunos casos, la MOI puede referirse a la proporción o múltiplo de genomas vectoriales o virales a las células a las que se puede administrar el nucleico. En algunos casos, la MOI puede ser
1 x l06. En algunos casos, la MOI puede ser 1 x l05 -1 x i07. En algunos casos, la MOI puede ser 1 x i04 -1x108. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son al menos aproximadamente 1 x l01, 1 x i02, ix i03, i x i04, 1x105, 1 x i06, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1 x i017y 1x1018 MOI. En
algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son 1x108 a 3x1014 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción pueden ser como máximo aproximadamente 1 x l01, 1 x i02, 1<x>103, 1<x>104, 1<x>105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017y 1x1018MOI.
En algunos aspectos, el ácido nucleico puede administrarse sin el uso de un virus (es decir, con un vector no viral) y puede medirse como la cantidad de ácido nucleico. Generalmente, se puede usar cualquier cantidad adecuada de
ácido nucleico con las composiciones y métodos de esta descripción. En algunos casos, cantidad de ácido nucleico
puede ser al menos aproximadamente 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600
pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng,
1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg,
300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, o 5g. En algunos casos, el ácido nucleico
puede ser como máximo aproximadamente 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg,
600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng,
1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg,
300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, o 5g.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x1015 virus recombinantes, aproximadamente 1x107 a aproximadamente 1x1014 virus recombinantes, aproximadamente
1x108 a aproximadamente 1x1013 virus recombinantes, aproximadamente 1x109 a aproximadamente 3x1012 virus recombinantes, o aproximadamente 1x1010 a aproximadamente 3x1012 virus recombinantes.
Kits
Las composiciones y reactivos útiles para la presente descripción se pueden empaquetar en kits para facilitar la aplicación
de la presente descripción. En algunos aspectos, el presente método proporciona un kit que comprende un ácido nucleico recombinante de la descripción. En algunos aspectos, el presente método proporciona un kit que comprende un virus recombinante de la descripción. Las instrucciones pueden estar en cualquier forma deseada, que incluye, pero no se limita
a, impresas en un inserto de kit, impresas en uno o más contenedores, así como también instrucciones almacenadas electrónicamente proporcionadas en un medio de almacenamiento electrónico, tal como un medio de almacenamiento
legible por computadora. También se incluye opcionalmente un paquete de programa informático en un medio de almacenamiento legible por computadora que permite al usuario integrar la información y calcular una dosis de control.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un kit que comprende las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción. En otro aspecto más, la descripción proporciona kits para el tratamiento de enfermedades tales como, por ejemplo: AMD,<d>M<e>, RVO, enfermedades relacionadas con la angiogénesis, cáncer, enfermedades autoinmunitarias, organismos de enfermedades infecciosas y similares.
En un aspecto, un kit comprende: (a) un virus recombinante proporcionado en la presente descripción, y (b) instrucciones para administrar a las células o a un individuo una cantidad terapéuticamente efectiva del virus recombinante. En algunos aspectos, el kit puede comprender sales o soluciones farmacéuticamente aceptables para administrar el virus recombinante. Opcionalmente, el kit puede comprender además instrucciones para parámetros operativos adecuados en forma de una etiqueta o un inserto separado. Por ejemplo, el kit puede tener instrucciones estándar que informen a un médico o técnico de laboratorio para preparar una dosis de virus recombinante.
Opcionalmente, el kit puede comprender además un estándar o información de control de modo que una muestra de paciente pueda compararse con el estándar de información de control para determinar si la cantidad de prueba de virus recombinante es una cantidad terapéutica consistente con, por ejemplo, el encogimiento de un tumor. Opcionalmente, el kit podría comprender además dispositivos para la administración, como una jeringa, una aguja con filtro, un tubo de extensión, una cánula y un inyector subretiniano.
Los virus recombinantes pueden generarse por cualquier medio adecuado. Los métodos y composiciones de la descripción proporcionan la generación de virus recombinantes a través de diversos medios, que incluye el uso de células transgénicas, que pueden incluir células de mamíferos, células de insectos, células animales o células fúngicas.
Por ejemplo, en algunos aspectos, se pueden generar virus recombinantes mediante la transfección de células de insecto mediante baculovirus recombinantes. En algunos casos, se puede generar un baculovirus recombinante como intermediario, por lo que el baculovirus puede contener secuencias necesarias para la generación de otros virus tales como los virus a Av o rAAV2. En algunos casos, se pueden usar uno o más baculovirus en la generación de virus recombinantes usados para la composición y métodos de tratamiento de esta descripción. En algunos casos, se pueden usar células de insectos como las líneas celulares Sf9, High-Five o Sf21. En algunos casos, las líneas celulares pueden generarse utilizando métodos transitorios (es decir, infección con transgenes no integrados de manera estable) En otros casos, las líneas celulares pueden generarse mediante la generación de líneas celulares estables (es decir, infección con transgenes integrados de forma estable en el genoma de la célula huésped). En otros aspectos, la composición farmacéutica aquí proporcionada se fabrica utilizando células adherentes de riñón embrionario humano 293 (HEK293). En un aspecto alternativo, la composición farmacéutica proporcionada en la presente descripción se fabrica mediante el uso de células HEK293 adaptadas a la suspensión. En otro aspecto, la composición farmacéutica proporcionada en la presente descripción se fabrica mediante el uso del sistema de expresión de baculovirus (BVES) en células de insectos. En algunos aspectos, el vector se produce mediante el uso del virus auxiliar del herpes. En algunos aspectos, el vector se produce mediante el uso de métodos de producción de clones. En algunos aspectos, el vector se produce mediante el uso de Ad-AAV.
Generalmente, se puede usar cualquier método adecuado en la purificación bioquímica de los virus recombinantes para usar en una composición farmacéutica como se describe en la presente descripción. Los virus recombinantes se pueden recolectar directamente de las células o del medio de cultivo que rodea a las células hospederas. El virus se puede purificar mediante el uso de diversos medios bioquímicos, tales como filtración en gel, filtración, cromatografía, purificación por afinidad, ultracentrifugación en gradiente o métodos de exclusión por tamaño. El virus recombinante puede probarse en cuanto a contenido (es decir, identidad), pureza o potencia (es decir, actividad) mediante el uso de cualquier medio adecuado, antes de la formulación en una composición farmacéutica. El método puede incluir, pero no se limita a, inmunoensayos, ELISA, SDS-PAGE, transferencia western, transferencia Northern, transferencia Southern o PCR, ensayos HUVEC y similares.
V. Método de tratamiento
En otro aspecto, la presente descripción proporcionó un método para tratar una enfermedad patológica relacionada con la angiogénesis, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción a un sujeto humano que necesita dicho tratamiento. En algunos aspectos, la enfermedad se selecciona del grupo de enfermedades neovasculares oculares que consisten de: degeneración macular relacionada con la edad (AMD), AMD húmeda, AMD seca, neovascularización retiniana, neovascularización coroidea, retinopatía diabética, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de la vena retiniana, oclusión de la vena central de la retina, oclusión de la vena retiniana ramificada, edema macular diabético, isquemia retiniana diabética, retinopatía isquémica y edema retiniano diabético.
En algunos casos, se puede tratar la AMD seca. En algunos casos, la AMD seca puede denominarse atrofia geográfica central, caracterizada por atrofia del epitelio pigmentario de la retina más adelante debajo de la retina y posterior pérdida de fotorreceptores en la parte central del ojo. La composición y los métodos de esta descripción proporcionan el tratamiento de todas y cada una de las formas de AMD.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para el tratamiento profiláctico de AMD o enfermedades neovasculares oculares como se describe en la presente descripción, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción a un sujeto humano que necesite dicho tratamiento. La presente descripción puede usarse para tratar pacientes con riesgo de desarrollar AMD o que presenten síntomas tempranos de la enfermedad. Esto puede incluir el tratamiento de los ojos de forma simultánea o secuencial. El tratamiento simultáneo puede significar que el tratamiento se administra en cada ojo al mismo tiempo o que ambos ojos se tratan durante la misma visita al médico tratante u otro proveedor de atención médica. Se ha documentado que los pacientes tienen un mayor riesgo de desarrollar AMD en el ojo sano contrario de un ojo que presenta síntomas de AMD, o en pacientes que tienen una predisposición genética a desarrollar AMD. La presente descripción se puede usar como tratamiento profiláctico en la prevención de AMD en el ojo contrario.
Si bien se desconoce el mecanismo que subyace al aumento del riesgo de progresión de la enfermedad neovascular ocular en el ojo contrario, existen múltiples estudios en la técnica que detallan este riesgo elevado. Por ejemplo, en uno de estos estudios a gran escala, se observó que, de 110 ojos contrarios, que progresaron a AMD avanzada, se desarrolló neovascularización coroidea (CNV) en 98 ojos y atrofia geográfica foveal G (A) en 15 ojos. Ophthalmologica.
2011;226(3):110-8. doi: 10,1159/000329473. Curr Opin Ophthalmol. Junio de 1998;9(3):38-46. Ninguna característica no ocular (edad, sexo, antecedentes de hipertensión o tabaquismo) o característica ocular del ojo del estudio al inicio del estudio (composición de la lesión, tamaño de la lesión o agudeza visual) fue predictiva de la progresión a AMD avanzada en esta cohorte. Sin embargo, el análisis estadístico indica que los síntomas de la AMD del primer ojo, que incluye el tamaño de las drusas, la hiperpigmentación focal y la atrofia geográfica no foveal, tenían relaciones independientes significativas en la evaluación del riesgo de desarrollar AMD en el ojo contrario. Estudios recientes han indicado que, de las características oculares, los factores genéticos y ciertos factores ambientales pueden desempeñar un papel en el aumento del riesgo de desarrollar AMD en el ojo contrario. JAMA Ophthalmol. 2013 Apr 1;131(4):448-55. doi: 10.1001/jamaophthalmol.2013.2578. Dado el elevado riesgo bien caracterizado de desarrollo de AMD en ojos contrarios no tratados, existe una necesidad en la técnica de métodos para prevenir la aparición y posterior pérdida de la visión debido a la enfermedad.
El término “ sujeto” o “ individuo” o “ paciente” como se usa en la presente descripción en referencia a individuos que tienen una enfermedad o trastorno o se sospecha que tienen una enfermedad o trastorno, y similares. El sujeto, el individuo o la paciente pueden usarse indistintamente en la descripción y abarcan mamíferos y no mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, cualquier miembro de la clase de los mamíferos: humanos, primates no humanos como los chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tal como vacas, caballos, ovejas, cabras, cerdos; animales domésticos como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio, incluidos roedores como ratas, ratones y cobayas, y similares. Los ejemplos de no mamíferos incluyen, pero no se limitan a, aves, peces y similares. En algunos aspectos de los métodos y composiciones proporcionados en la presente descripción, el mamífero es un ser humano.
El término “ sujeto” o “ individuo” también incluye seres humanos que padecen el trastorno o enfermedad, de 20 años o más. Inesperadamente, la presente descripción se puede usar en una variedad de edades de pacientes. Esto incluye a pacientes más jóvenes que generalmente no se asocian con la enfermedad de AMD, que se presenta con mayor frecuencia en pacientes mayores de 65 años. Los sujetos humanos o pacientes de la descripción pueden incluir edades de al menos aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100. Los sujetos humanos o los pacientes de la descripción pueden incluir edades como máximo de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100.
En algunos aspectos, el término “ sujeto” o “ individuo” incluye pacientes con respuestas variables a la penicilina, tales como resistencia o sensibilidad a sus efectos o pacientes que muestran o carecen de síntomas de respuesta alérgica al fármaco.
A. Método de entrega
En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra a sitios subretinianos mediante el uso de cualquier método de dirección. En algunos casos, el método de administración puede ser por inyección, tal como los descritos en patente publicada de Estados Unidos No. 2010008170. En algunos casos, la administración directa a sitios subretinianos incluye la inyección de una composición farmacéutica líquida a través de una jeringa. En otro ejemplo, la administración directa puede implicar la inyección a través de una cánula u otro instrumento adecuado para la administración de un vector o virus recombinante. En otros ejemplos, la administración directa puede comprender un implante que comprende además un vector adecuado para la administración de transgenes tales como sFLT-1. En algunos casos, el implante puede implantarse directamente en la retina o cerca de ella.
Las regiones centrales de la retina, la mácula y la fóvea de la retina son únicas entre los mamíferos y los primates. Además, existen claras diferencias en la anatomía y la posterior patogénesis de la AMD entre primates y humanos. La retina central es el área de la retina que rodea el polo posterior entre las arcadas vasculares del ojo de un primate, que incluye la fóvea, la mácula y el área circundante. La mácula está cerca del centro de la retina y tiene un diámetro de aproximadamente 1,5 mm. Esta área contiene la mayor concentración de fotorreceptores tanto de bastón como de cono. En el centro de la mácula se encuentra la fóvea, un pequeño hoyo que contiene la mayor concentración de fotorreceptores de cono. Las regiones de la mácula y la fóvea de la retina también contienen células del RPE subyacentes. Estas regiones de la retina son responsables de la percepción de detalles finos (agudeza) y color. Dado que esta región es responsable de la parte más importante de la visión humana (visión fina), se desea una orientación segura y efectiva del vector al espacio subretiniano de la mácula y la fóvea. En algunos casos, se administra una composición farmacéutica de la descripción en la retina central. En algunos casos, se administra en la retina central fuera de la fóvea.
En resumen, el método general para administrar un vector al espacio subretiniano de la mácula y la fóvea puede ilustrarse mediante el siguiente breve esquema. Este ejemplo está destinado simplemente a ilustrar ciertas características del método, y de ninguna manera pretende ser limitante.
Generalmente, el vector se puede administrar en forma de suspensión inyectada intraocularmente (subretinalmente) bajo observación directa mediante el uso de un microscopio quirúrgico. Este procedimiento puede implicar una vitrectomía seguida de la inyección de una suspensión de vector mediante el uso de una cánula fina a través de una o más retinotomías pequeñas en el espacio subretiniano.
En resumen, se puede suturar una cánula de infusión en su lugar para mantener un volumen normal del globo mediante infusión (de, por ejemplo, solución salina) durante toda la operación. Se realiza una vitrectomía mediante el uso de una cánula de diámetro apropiado (por ejemplo, calibre 20 a 27), en donde el volumen de gel vítreo que se extrae se reemplaza por infusión de solución salina u otra solución isotónica de la cánula de infusión. La vitrectomía se realiza ventajosamente porque (1) la eliminación de su corteza (la membrana hipotaloide posterior) facilita la penetración de la retina por la cánula; (2) su eliminación y reemplazo con fluido (por ejemplo, solución salina) crea espacio para acomodar la inyección intraocular del vector, y (3) su eliminación controlada reduce la posibilidad de desgarro retiniano y desprendimiento de la retina no planificado.
En algunos aspectos, el vector se inyecta directamente en el espacio subretiniano dentro de la retina central, mediante el uso de una cánula del tamaño de agujero apropiado (por ejemplo, calibre 27-45), creando así una ampolla en el espacio subretiniano. En otros aspectos, la inyección subretiniana de suspensión de vector está precedida por una inyección subretiniana de un pequeño volumen (por ejemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml) de un fluido apropiado (tal como solución salina o de Ringer) en el espacio subretiniano dentro de la retina central. Esta inyección inicial en el espacio subretiniano establece una ampolla de fluido inicial dentro del espacio subretiniano, lo que provoca un desprendimiento de retina localizado en la ubicación de la ampolla inicial. Esta ampolla de fluido inicial puede facilitar la administración dirigida de la suspensión del vector al espacio subretiniano (al definir el plano de inyección antes de la administración del vector) y minimizar la posible administración del vector en la coroides y la posibilidad de inyección del vector o reflujo en la cavidad vítrea. En algunos aspectos, esta ampolla de fluido inicial puede inyectarse adicionalmente con fluidos que comprenden una o más suspensiones de vector y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales mediante la administración de estos fluidos directamente a la ampolla de fluido inicial con cánulas tanto de calibre fino iguales o adicionales.
La administración intraocular de la suspensión de vector y/o el pequeño volumen inicial de fluido se puede realizar mediante el uso de una cánula de calibre fino (por ejemplo, calibre 27-45) unida a una jeringa. En algunos aspectos, el émbolo de esta jeringa puede ser accionado por un dispositivo mecanizado, tal como presionando un pedal. La cánula de calibre fino se avanza a través de la esclerotomía, a través de la cavidad vítrea y dentro de la retina en un sitio predeterminado en cada sujeto de acuerdo con el área de la retina que se va a apuntar (dentro de la retina central). En un aspecto, la administración se realiza en un sitio fuera de la fóvea. Bajo visualización directa, la suspensión del vector se inyecta mecánicamente debajo de la retina neurosensorial provocando un desprendimiento de retina localizado con una retinotomía autosellante no expansiva. Como se señaló anteriormente, el vector puede inyectarse directamente en el espacio subretiniano creando una ampolla dentro de la retina central o el vector puede inyectarse en una ampolla inicial dentro de la retina central, provocando que esta se expanda (y expandiendo el área de desprendimiento de retina). En algunos aspectos, la inyección de la suspensión de vector va seguida de la inyección de otro fluido en la ampolla.
Sin desear ceñirse a la teoría, la velocidad y la ubicación de las inyecciones subretinianas pueden dar como resultado fuerzas de cizallamiento localizadas que pueden dañar la mácula, la fóvea y/o las células del RPE subyacentes. Las inyecciones subretinianas se pueden realizar a una velocidad que minimice o evite las fuerzas de cizallamiento. En algunos aspectos, el vector se inyecta durante aproximadamente 15-17 minutos. En algunos aspectos, el vector se inyecta durante aproximadamente 17-20 minutos. En algunos aspectos, el vector se inyecta durante aproximadamente 20-22 minutos. En algunos aspectos, el vector se inyecta durante aproximadamente 1 minuto o durante aproximadamente 1-3 minutos o en menos de un minuto. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 35 a aproximadamente 65 pl/min o 65 pl/min a aproximadamente 150 pl/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 35 pl/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 40 pl/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 45 pl/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 50 pl/ml. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 55 pl/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 60 pl/ml. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 65 pl/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 100 pl/min. Un experto en la técnica reconocería que la velocidad y el tiempo de inyección de la ampolla pueden estar determinados, por ejemplo, por el volumen del vector o el tamaño de la ampolla necesarios para crear un desprendimiento de retina suficiente para acceder a las células de la retina central, el tamaño de la cánula utilizada para administrar el vector y la capacidad de mantener con seguridad la posición de la cánula de la descripción.
Se pueden crear una o varias ampollas (por ejemplo, 2, 3 o más). Generalmente, el volumen total de ampolla o ampollas creadas por los métodos y sistemas de la descripción no puede exceder el volumen de fluido del ojo, por ejemplo, aproximadamente 4 ml en un sujeto humano típico. El volumen total de cada ampolla individual es preferentemente de aproximadamente 0,1 - 0,2 ml. Un experto en la técnica apreciará que al crear la ampolla de acuerdo con los métodos y sistemas de la descripción, debe mantenerse la presión intraocular apropiada para evitar daños en las estructuras oculares. El tamaño de cada ampolla individual puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 50 pl a aproximadamente 100 pl, de aproximadamente 50 pl a aproximadamente 200 pl, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2 ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,3 ml o > 0,3 ml.
Para transducir de manera segura y eficiente áreas de la retina objetivo (por ejemplo, la retina central) fuera del borde de la ubicación original de la ampolla, en algunos casos puede ser deseable manipular la ampolla para reposicionar la ampolla en el área objetivo para la transducción. La manipulación de la ampolla puede ocurrir por la dependencia de la ampolla que es creada por el volumen de la ampolla, el reposicionamiento del ojo que contiene la ampolla, el reposicionamiento de la cabeza del ser humano con un ojo u ojos que contienen una o más ampollas, y/o mediante intercambio fluido-aire. Esto es particularmente relevante para la retina central ya que esta área generalmente resiste el desprendimiento por inyección subretiniana.
En algunos aspectos se utiliza el intercambio de fluido-aire después de la inyección subretinal; el fluido de la cánula de infusión se reemplaza temporalmente por aire, por ejemplo, de soplar aire sobre la superficie de la retina. A medida que el volumen de aire desplaza al fluido salino de la cavidad vitrea, la ampolla se mantiene en su lugar sin salida hacia la cavidad vitrea. Colocando el globo ocular de manera apropiada, la ampolla del vector subretiniano en algunos casos puede manipularse para involucrar áreas adyacentes (por ejemplo, la mácula y/o la fóvea). En algunos casos, la masa de la ampolla es suficiente para provocar que gravite, incluso sin el uso del intercambio fluido-aire. El movimiento de la ampolla se puede facilitar aún más alterando la posición de la cabeza del sujeto humano, para permitir que la ampolla gravite hacia la ubicación deseada en el ojo. Una vez que se logra la configuración deseada de la ampolla, el fluido se devuelve a la cavidad vitrea. El fluido es un fluido apropiado, por ejemplo, solución salina fresca. Generalmente, el vector subretiniano se puede dejar in situ sin retinopexia a la retinotomía y sin taponamiento intraocular, y la retina se volverá a unir espontáneamente en aproximadamente 48 horas.
Se ha demostrado la administración subretinal de AAV-2 para el tratamiento de una enfermedad ocular en el tratamiento de la enfermedad genética rara, Amaurosis congénita de Leber (“ LCA” ). La patología de la LCA y la población de pacientes con LCA son diferentes a las de la AMD húmeda y, por lo tanto, no se esperaba que el tratamiento de la AMD húmeda con terapia génica, y en particular, con AAV-2, fuera seguro y efectivo antes del estudio clínico con rAAV.sFLT. Específicamente, la LCA es una enfermedad genética degenerativa provocada por una expresión insuficiente de la proteína retiniana RPE-65. Provoca un deterioro lento de la visión en bebés y niños pequeños que conduce a la ceguera total en la edad adulta temprana, generalmente antes de los 25 a 30 años. Por el contrario, como se describió aquí anteriormente, la AMD húmeda es provocada por el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en la retina al final de la vida, generalmente a partir de los 65 a 75 años. La presencia de nuevos vasos plantea la preocupación de que las partículas de AAV, el transgén o el producto transgénico, se transportarían fuera del ojo en mayores cantidades de lo que se mostró en el estudio LCA. Además, el sistema inmunológico y la respuesta inmunitaria a sustancias extrañas cambian a medida que los pacientes envejecen creando incertidumbre antes de los resultados del estudio descritos en el Ejemplo 12 de que el tratamiento de la<a>M<d>húmeda con un vector viral tal como rAAV.sFLT-1 sería seguro y efectivo.
B. Efecto del Tratamiento
En algunos aspectos, una sola inyección de la composición farmacéutica de la presente descripción en el ojo afectado no solo tiene los beneficios del tratamiento con Lucentis®, sino que también puede requerir solo una sola inyección.
La composición farmacéutica de la presente descripción puede detener la fuga en los vasos sanguíneos existentes y puede inhibir además la formación de nuevos vasos en el espacio subretiniano de pacientes que padecen CNV secundaria a AMD durante al menos 18 meses y, en algunos aspectos, la actividad continúa durante 3-5años. La inhibición de las fugas y la formación de nuevos vasos previene el desarrollo de ceguera en los pacientes afectados.
En algunos aspectos, los niveles de proteína sFLT-1 en el vítreo de dicho sujeto humano es aproximadamente 500 -5000 pg/ml, aproximadamente 600 - 4000 pg/ml, aproximadamente 800 - 3000 pg/ml aproximadamente 900 - 2000 pg/ml, o aproximadamente 1000 - 1800 pg/ml, 500 - 700 pg/ml, 700 - 1000 pg/ml, 1000 - 1200 pg/ml, 1200 - 1500 pg/ml, 1800 - 2000 pg/ml. En algunos casos, los niveles de proteína en el vítreo del sujeto humano son de al menos aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700. 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 o 2400 pg/ml. En algunos casos, los niveles de proteína en el vítreo del sujeto humano son como máximo aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 o 2400 pg/ml.
En algunos casos, los “ niveles” de proteína pueden referirse a cualquier cantidad o cantidad relativa de proteína. En algunos casos, el nivel puede medirse como una concentración (por ejemplo, pM, nM, uM, etc.), una molalidad (por ejemplo, m), como una masa (por ejemplo, pg, ug, ng, etc.) o cualquier medida adecuada. En algunos casos, una medida sin unidades puede indicar un nivel.
En algunos casos, los niveles de proteína se pueden medir al menos aproximadamente de 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 o 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o 365 días después de administrar dicha composición farmacéutica. En algunos casos, los niveles de proteína se pueden medir como máximo aproximadamente de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,70,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 o 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o 365 días después de administrar dicha composición farmacéutica. En algunos casos, los niveles de proteína se miden al menos 72 horas después de administrar dicha composición farmacéutica.
La administración de la composición farmacéutica de la presente descripción en general no conduce a efectos secundarios o eventos adversos.
En algunos aspectos, no se detecta vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano a los 7, 14, 21 o 30 días después de la administración de dicha composición farmacéutica. En algunos aspectos, la presencia del vector viral se detecta mediante qPCR o ELISA como se conoce en la técnica.
En algunos casos, no se detecta ningún vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,70,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 o 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o 365 días después de administrar dicha composición farmacéutica. En algunos casos, no se detecta ningún vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano como máximo alrededor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,70,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 o 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o 365 días después de administrar dicha composición farmacéutica. En algunos casos, no se detecta vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano, se miden al menos 72 horas después de la administración de dicha composición farmacéutica.
En algunos aspectos, el sujeto humano no muestra toxicidad retiniana clínicamente significativa según lo evaluado por exámenes oftálmicos en serie durante al menos aproximadamente un período de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. En algunos aspectos, el sujeto humano no muestra toxicidad retiniana clínicamente significativa según la evaluación de exámenes oftálmicos en serie durante un período de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses.
En algunos aspectos, no se presentan signos inflamatorios superficiales, del segmento anterior o del vítreo en el sujeto humano durante un período de al menos dos meses. En algunos casos, no están presentes signos inflamatorios superficiales, del segmento anterior o del vítreo en el sujeto humano a 1 semana o a 3, 6, 9 o 12 meses después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, no se observan signos inflamatorios, que incluye una respuesta de células T citotóxicas dentro de aproximadamente un 10% del intervalo normal después de la etapa de administración. En algunos aspectos, no hay un aumento en la respuesta de las células T según lo medido por ELISpot. En algunos aspectos, las células T no expresan HLA-DR o Ki67 y no desarrollan un fenotipo efector activado, como se describe en Lai y col.2011; Gene Therapy. En algunos aspectos, no se observa inflamación del vítreo mediante biomicroscopía (BE) y oftalmoscopía indirecta (IOE) después de la etapa de administración. En algunos aspectos, las trazas de inflamación del vítreo que se resolvieron en 10 días se observan mediante biomicroscopía (BE) y oftalmoscopía indirecta (IOE) después de la etapa de administración. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate al menos 120 días después de la administración. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate durante al menos 30 días, al menos 60 días, al menos 90 días, al menos 120 días, al menos 180 días, al menos 270 días o al menos 365 días después de la administración.
Como se usa en la presente descripción, el tratamiento de rescate se refiere a la administración de una dosis de un inhibidor de VEGF después de la administración inicial de la composición farmacéutica descrita en la presente descripción. Se administra un tratamiento de rescate para aumentar la cantidad de inhibición de VEGF en el paciente ocular con el fin de detener o revertir los signos y síntomas de progresión de la enfermedad. La decisión de administrar un tratamiento de rescate puede basarse en criterios de diagnóstico predeterminados, como en el estudio clínico descrito en el Ejemplo 12, o en el juicio clínico de un médico de que los signos de enfermedad activa están presentes en un paciente.
En algunos aspectos, no hay evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de la IOP, desprendimiento de retina o cualquier respuesta inmune intraocular o sistémica en dicho sujeto humano al menos 120 días después de la administración. En algunos aspectos, no hay evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de la IOP, desprendimiento de retina o respuesta inmune intraocular o sistémica en dicho sujeto humano al menos 30 días, al menos 60 días, al menos 90 días, al menos 120 días, al menos 180 días, al menos 270 días o al menos 365 días después de la administración. En algunos aspectos, no hay evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de la IOP, desprendimiento de retina o cualquier respuesta inmune intraocular o sistémica en dicho sujeto humano como máximo 30 días, al menos 60 días, al menos 90 días, al menos 120 días, al menos 180 días, al menos 270 días o al menos 365 días después de la administración.
En algunos aspectos, la agudeza visual mejor corregida (BCVA) de un paciente mejora en 1, 23, 4, 5 o más líneas.
En algunos aspectos, una reducción de la neovascularización según la evaluación de la angiografía con fluoresceína (FA) seguida de la etapa de administración.
En algunos casos, se puede medir el grosor de la retina para examinar los efectos del tratamiento. En algunos casos, el grosor de la retina central del sujeto humano no aumenta en más de 50 micrómetros, 100 micrómetros o 250 micrómetros dentro de los 12 meses posteriores al tratamiento con la composición farmacéutica de la descripción. En algunos casos, el grosor de la retina central del sujeto humano disminuye en al menos 50 micrómetros, 100 micrómetros, 200 micrómetros, 250 micrómetros, 300 micrómetros, 400 micrómetros, 500 micrómetros, 600 micrómetros en 3 meses, 6 meses, 9 meses o 12 meses después del tratamiento con la composición farmacéutica de la descripción. La disminución del grosor de la retina central del sujeto humano puede medirse comparando el grosor de la retina central en un momento determinado con una medición de línea de base tomada en o dentro de 1, 3, 7 o 10 días de la administración de la composición farmacéutica de la descripción. C. Tratamiento combinado con inhibidores de VEGF
En algunos aspectos, el método comprende además administrar al sujeto humano una cantidad farmacéuticamente efectiva de un inhibidor de VEGF.
En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF comprende un anticuerpo contra VEGF o un fragmento funcional del mismo. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF comprende ranibizumab. En otros aspectos, el inhibidor de VEGF es un receptor soluble, una proteína de fusión o un fragmento del mismo, tal como aflibercept o sFLT01. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 días después de la administración de dicho inhibidor de VEGF. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 días después de la administración de dicho inhibidor de VEGF. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra dentro de los 90 días posteriores a la administración de dicho inhibidor de VEGF.
En algunos aspectos, el paciente es tratado según un protocolo tal como el que se describe en la Figura 13. Después que la proteína expresada por el virus recombinante se expresa en un nivel adecuado (o “ activado” ), se realiza un seguimiento de los pacientes con criterios en base a repetición de tratamiento:
a. Si la enfermedad recurre, se permite la repetición de tratamiento con ranibizumab
b. Se espera de 5-8 repeticiones de tratamientos por año con el grupo de control
c. En el grupo de tratamiento, se espera una visión equivalente con una disminución sustancial en el número de repeticiones de tratamientos.
El paciente se elige para una repetición de tratamiento si hay signos de CNV activa:
a. En base a criterios objetivos evaluados por el personal enmascarado (técnico y oftalmólogo)
Los criterios de repetición del tratamiento se basan en la experiencia sustancial con el tratamiento “ según sea necesario” (PRN) en ensayos previos con agentes anti-VEGF.
Se justifica una repetición de tratamiento en base a los signos de enfermedad activa; tales como:
a. >10 Pérdida de letras del Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) de la visita anterior de un sujeto humano (atribuible a causas retinianas), una disminución de OR de > 5 letras de ETDRS de la visita anterior junto con la percepción del paciente de la pérdida funcional;
b. Cualquier aumento, nuevo o persistente, subsensorial, subretiniano pigmento epitelial (RPE), o fluido intrarretiniano en OCT;
c. Signos de aumento de la fuga de CNV a través de FA.
En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante al menos 1 vez antes de administrar dicha composición farmacéutica y 1 o 2 veces más a intervalos de aproximadamente 30 días después de dicha administración para prevenir la progresión de la enfermedad mientras que la expresión de proteínas aumenta a niveles adecuados. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante al menos 2 veces antes de administrar dicha composición farmacéutica. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante un período de 6 a 7 semanas después de la administración de dicha composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la frecuencia de administración del inhibidor de VEGF se reduce en menos de un año o se detiene por completo.
En algunos aspectos, la presente descripción se usa después de 3 o más tratamientos de inhibidores de VEGF. En algunos aspectos, la presente descripción se usa después de la observación de que los pacientes con AMD no muestran una mejora en la BCVA después del uso de otros inhibidores de VEGF.
D. Otros tratamientos combinados
En otro aspecto preferido, el tratamiento de un paciente comprende la administración de una o más de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción, junto con otras terapias, por ejemplo, quimioterapia, radiación, cirugía, agentes antiinflamatorios, vitaminas seleccionadas y similares. Los otros agentes pueden administrarse antes, después o coadministrarse con las composiciones farmacéuticas.
Los aspectos de la descripción se pueden practicar sin los aspectos teóricos presentados. Además, los aspectos teóricos se presentan con el entendimiento de que los solicitantes no buscan estar sujetos a la teoría presentada.
Si bien los aspectos preferidos de la presente descripción se han mostrado y descrito en la presente descripción, será evidente para los expertos en la técnica que tales aspectos se proporcionan solamente a modo de ejemplo. Ahora se les ocurrirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones a los expertos en la técnica sin apartarse de la descripción. Debe entenderse que pueden emplearse varias alternativas a los aspectos de la descripción descritas en la presente descripción en la práctica de la descripción. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la descripción y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes estén cubiertos de ese modo.
La dosis efectiva del ácido nucleico estará en función de la proteína particular expresada, la enfermedad particular a la que se dirigirá, el paciente y su estado clínico, peso, edad, sexo, etc.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la descripción.
Debe explicarse, si no se especifica, que el porcentaje de los siguientes ejemplos son todos porcentajes en peso de contenido % en peso.
Ejemplo 1
rAAV. sFlt-1
Un ejemplo de virus recombinante es rAAV.sFlt-1. Este codifica un vector y una forma humana del receptor 1 de VEGF soluble truncado (sFLT-1). El vector es un vector viral adenoasociado (rAAV) recombinante, con replicación deficiente, de serotipo 2.
El rAAV.sFlt-1 se fabricó según las buenas prácticas de fabricación (cGMP). En el sitio de fabricación, el producto final se dividió en alícuotas en tubos de microcentrífuga estériles de baja unión a virus (viales de tapón plano esterilizados, de baja retención y envueltos individualmente) según los requisitos del protocolo (es decir, 200 □ 1 de 1x1010 o 1x1011 genomas virales) y se almacenan a -80 °C para esperar la liberación del producto final. Cada vial contenía suficiente vector para usar en un solo paciente (100 □ 1 para administrar).
El virus recombinante, rAAV.sFlt-1, es un vector de virus adenoasociado recombinante 2 (rAAV2) que lleva el receptor 1 de VEGFR soluble (VEGFR1) o sFLT-1 impulsado por el promotor del citomegalovirus humano (CMV). El vector rAAV.sFlt-1 y el genoma AAV2 intacto utilizados como columna vertebral se prepararon como se describe en Lai y col. Gene Therapy 2002 vol. 9 (12) 804-813). El vector rAAV2 está desprovisto de secuencias de codificación viral, es decir, rep y cap se han reemplazado con un casete de expresión para el gen terapéutico. El resto activo de rAAV.sFlt-1 es sFlt-1. sFLT-1 es la forma truncada soluble del receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR1 0 Flt-1) que se produce de forma natural. sFLT-1 es el único inhibidor específico endógeno conocido de VEGF. sFLT-1 se genera mediante corte y empalme alternativo y carece del dominio similar a inmunoglobulina proximal a la membrana, la región de extensión transmembrana y el dominio de tirosina quinasa intracelular. Por lo tanto, contiene solo los primeros seis bucles extracelulares similares a inmunoglobulinas seguidos de 31 residuos de aminoácidos únicos. La sFLT-1 se identificó por primera vez en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), pero desde entonces se ha descubierto que se produce de forma natural en la placenta y circula sistemáticamente en mujeres embarazadas. El sFLT-1 usado para generar rAAV.sFlt-1 contiene un marco de lectura abierto que codifica solo los primeros seis dominios extracelulares similares a inmunoglobulinas del FLT-1 de longitud completa que atraviesa la membrana, seguido de un extremo C-terminal único con una extensión de 31 aminoácidos de longitud, que representa los empalmes alternativos, isoforma de FLT-1 soluble secretada descrita anteriormente.
Si bien se ha demostrado que la ITR posee una actividad promotora leve, para niveles máximos de expresión transgénica, el casete generalmente incluye una combinación de promotor/potenciador, una pequeña secuencia de intrón, el ADNc del gen terapéutico y una señal de poliadenilación. En rAAV.sFlt-1, el potenciador/promotor del gen temprano inmediato principal del CMV humano y un intrón quimérico se colocaron aguas arriba del ADNc de sFLT-1. Se colocó una señal de poliadenilación del virus de simio 40 (poli A de SV40) aguas abajo del ADNc de sFLT-1.
Se ha demostrado ampliamente la unión de sFLT-1 a VEGFin vitro.La capacidad de sFLT-1 para inhibir la angiogénesis impulsada por VEGF ha atraído considerable atención por su potencial aplicación clínica, pero no se mostró evidencia de eficacia o idoneidad en humanos antes del estudio clínico de rAAV.sFlt-1 descrito en el Ejemplo 12. La actividad angiostática de sFLT-1 da como resultado la inhibición de VEGF por dos mecanismos: i) secuestro de VEGF, al que se une con alta afinidad, y ii) formación de heterodímeros inactivos con isoformas que atraviesan la membrana de los receptores de VEGF Flt-1 y KDR/Flk-1.
Secuencia de nucleótidos y diagrama del vector plasmídico usado para generar rAAV.sFlt-1
rAAV.sFlt-1 se generó mediante la triple transfección de células 293 de riñón embrionario humano con ADN del vector plasmídico pSSV.CI.hsFlt-1 y plásmidos auxiliares, como se conoce en la técnica (Xiao y otros, 1998. J Virololgy, 72(3): 2224-2232). El rAAV.sFlt-1 se purificó mediante un proceso secuencial de aislamiento de núcleos, centrifugación en gradiente de densidad y cromatografía en columna de afinidad con sulfato de heparina. En la Figura 1 se proporciona una representación esquemática del vector plasmídico sFLT-1.
Formulación
el rAAV.sFlt-1 se formuló en solución salina estéril regulada con fosfato (pH7) a 2 concentraciones: 1x1010 vector de vector/100 ul (dosis baja) y 1x1011 genoma de vector/100 ul (dosis alta) en tubos de microcentrífuga estériles de bajo virus. La formulación no contiene conservantes y es para una sola descongelación, un solo uso mediante inyección subretiniana.
rAAV (bv).sFlt-1
Un segundo ejemplo de virus recombinante es rAAV(bv).sFlt-1. rAAV(bv).sFlt-1 es un vector viral adenoasociado (rAAV) recombinante, deficiente en replicación, del serotipo 2 que se produce mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus (BEVS) en células de insecto Sf9, y codifica una forma humana del receptor 1 de VEGF soluble truncado (sFLT-1). El vector se produjo mediante el uso de infección en células Sf9 con dos baculovirus recombinantes, Bac-inRepinCap y Bac-sFlt-1. Bac-sFlt-1 se derivó de ADN bácmido que se generó a partir de la transformación de células electrocompetentes con un plásmido de 8,7 kb, AVA01-pFB-CMV-sFlt, que se clonó a partir de Frag001m-BHKan y la cadena principal del plásmido V109-pFB-AAV- CMV-SV40pA-Kan mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular, como se describe en Maniatis y otros, y como se describe adicionalmente más abajo. Frag001 m se formó a partir de los siguientes elementos secuenciales de ácidos nucleicos que fueron sintetizados químicamente por Blue Heron Biotech, LLC (Bothell, WA) y clonados en una cadena principal de BHKan: un ITR (serotipo 2 de AAV), promotor CMV-IE, intrón quimérico, 5 ' región no traducida (UTR), secuencia codificante de sFlt-1, región poli A de SV40, ITR (serotipo 2 de AAV). El plásmido V109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kan se obtuvo de Virovek, Inc. (Hayward, CA). El plásmido contenía un gen de resistencia a antibióticos de kanamicina, un origen ColE1 y un casete de AAV recombinante, que contenía un promotor de CMV-IE, un intrón, múltiples secuencias de clonación y una región poli A de SV40, flanqueada por repeticiones terminales invertidas (ITR) del serotipo 2 de AAV. Este casete de rAAV estaba flanqueado por un gen de resistencia a la gentamicina y sitios de unión de Tn7L. AVA01-pFB-CMV-sFlt no contenía un promotor de polimerasa de ARN T7 u otra secuencia reguladora procariota. Bac-inRep-inCap es un baculovirus recombinante que contiene casetes de expresión para los genes rep y cap del serotipo 2 de AAV.
Producción de rAAV(bv).sFlt-1 en Baculovirus
El rAAV (bv).sFlt-1 se produjo en baculovirus según los métodos descritos en la solicitud de patente US-12/297.958 y más específicamente como sigue: Las células Sf9 se cultivaron a 28 °C a aproximadamente 107 células/ml en medio SFM II SFM que contenía 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina, y se diluyeron a aproximadamente 5 x 106 células/ml antes de la infección. Se usaron Bac-inRep-inCap y Bac-sFlt-1, cada uno en MOI de uno, para infectar las células a 28 °C durante 3 días para producir vectores de AAV tipo 2. Después de 3 días de infección, se recogieron los sedimentos celulares mediante centrifugación a 2000 rpm durante 15 min en una centrífuga de mesa. Los sedimentos celulares se lisaron en tampón de lisis como se describe por Urabe y col., Hum Gene Ther. 1; 13(16):1935-43 (2002) y ácidos nucleicos celulares (ADN y ARN) se digirieron mediante benzonasa (Sigma, St. Louis, Mo.). Los lisados celulares se aclararon mediante centrifugación a 8000 rpm durante 30 min en una centrífuga Avanti J-25 (Beckman, Fullerton, CA) y luego se cargaron en un tubo de centrífuga SW28 que contenía 5 ml de 1,55 g/cc y 10 ml de 1,32. g/cc de soluciones de CsCl. Después de centrifugación a 28000 rpm durante aproximadamente 16 horas a 15 °C, se recogió la fracción que contenía rAAV perforando el tubo de centrífuga mediante el uso de una aguja de jeringa y se sometió a una segunda ronda de ultracentrifugación con CsCl. La fracción que contenía rAAV se recogió de nuevo perforando el tubo de centrífuga mediante el uso de una aguja de jeringa y se dializó en tampón PBS para eliminar las sales y los detergentes. Los títulos de los vectores se determinaron mediante un ensayo de PCR cuantitativo en tiempo real de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Ejemplo 2
Inhibición in vitro de la proliferación de células endoteliales inducida por VEGF
Se realizaron estudios para evaluar la inducción de VEGF de la proliferación de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEc ) y para determinar si la proliferación de HUVEC inducida por VEGF sería inhibida por sFLT-1 mediada por rAAV. La presencia de sFLT-1 en células transducidas se confirmó en primer lugar mediante análisis de transferencia Western de medios acondicionados (Figura 2, panel a). Se añadió medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 y transducidas con rAAV.gfp a HUVEC tratadas con VEGF en diluciones crecientes. También se incluyó solamente un medio de control de inanición (medio de crecimiento HUVEC normal sin factor de crecimiento endotelial bovino). Se añadió heparina a cada pocillo a 100 pg/ml. La proliferación relativa inducida por VEGF de HUVECS tratadas con VEGF y los diferentes medios acondicionados se analizó mediante la adición de 25 pL de bromuro de 3-(4,5-dimetiazol-2-il)-2,5-difeniltetrozolio (MTT, 5 mg ml, Sigma) a cada pocillo durante 4 horas a 37 °C. Se confirmó que el sFLT-1 secretado codificado por el vector rAAV en 40 pl de medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 inhibe la proliferación de HUVECS inducida por VEGF en un 32 %. Duplicar el volumen de medio acondicionado dio como resultado una inhibición completa con un crecimiento celular equivalente a niveles basales similares al cultivo en medio de inanición (Figura 2, panel b).
Evaluación in vitro de la potencia del vector rAAV.sFt-1
Se realizaron estudios para evaluar la potencia de los vectores AAV que codifican el gen sFlt-1 humano recombinante cuantificando la expresión de la proteína sFlt-1 humana de células 293 de riñón embrionario humano transducidas (HEK293) mediante ELISA. Las células 293 de riñón embrionario humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE. UU.) y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; GIBCO, Grand Island, NY, EE. UU.) con suero bovino fetal al 10% (FBS, GIBCO) y 1X penicilinaestreptomicina-glutamina. Todos los cultivos se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2 en una atmósfera humidificada.
Las células HEK293 se sembraron en células 8E4 o 1.5E5/24 pocillos y se transdujeron al 60-90 % de confluencia con los vectores AAV recombinantes en una multiplicidad de infección (MOl) que varía de 1x103 - 1x106 en medio DMEM suplementado con 2 % de FBS. Después de 72 horas, después de la transducción, se recogieron los medios acondicionados. Se prepararon alícuotas del medio acondicionado para ELISA mediante el uso de reactivos y de acuerdo con las instrucciones estándar del kit R&D Systems SVR100B Quantikine ELISA Human sVEGF R1/sFlt-1. (Sistemas de R&D, Minneapolis, MN). Las muestras, los estándares y los controles se prepararon de acuerdo con las instrucciones del kit ELISA con los reactivos ELISA de R&D Systems y luego se transfirieron a una placa ELISA prerrecubierta con un anticuerpo para sVEGF R1/sFlt-1 y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador de microplacas placa horizontal orbital. Después de la incubación, se aplicaron secuencialmente el conjugado anti-sVEGF R1 (dos horas), la solución de sustrato (30 minutos) y la solución de parada a cada pocillo con las etapas de aspiración y lavado entre cada uno de acuerdo con los procedimientos estándar del ensayo ELISA. La densidad óptica (DO) de las muestras, estándares y controles se midió dentro de los 30 minutos de detener la reacción del sustrato con un lector de placas de ELISA. La concentración de sFlt-1 en pg/ml se calculó mediante el uso del programa informático SoftmaxPro mediante el uso de las mediciones de DO del lector de placas de ELISA.
Los resultados de los estudios para rAAV.sFlt-1 y rAAV(bv).sFlt-1 se presentan en la Figura 25A y Figura 25B. La concentración de proteína sFlt-1 expresada por células HEK293 72 horas después de la transducción con rAAV.sFlt-1 y rAAV(bv).sFlt-1 osciló entre 100-1000 pg/ml a una MOI de 1x104, 100-10.000 pg/ml a una MOI de 1x105 y 1000 10.000 pg/ml a una MOI de 1x106.
Ejemplo 3
Estudios de rAAV.sFlt-1 en ratones
Se usaron ratones transgénicos (trVEGF029) con neovascularización retiniana lenta pero estable inducida por la expresión transgénica de VEGF humano a partir de células fotorreceptoras como modelo para la neovascularización retiniana. Se han realizado dos estudios separados con estos ratones.
En el primer estudio con ratones, se evaluaron 13 ratones transgénicos para detectar cambios neovasculares oculares antes y después de la administración del vector rAAV.sFlt-1 (1x1011 partículas de vector) en un ojo y del vector de control en el ojo contralateral. Se evaluaron los ojos para detectar cambios neovasculares mediante el uso de angiografía con fluoresceína uno, tres y ocho meses después de la inyección. El grado, la intensidad y el estadio de la neovascularización fueron graduados (0 -4) por tres observadores, enmascarados al tratamiento recibido en los ojos examinados. Hubo una reducción general estadísticamente significativa en la clasificación neovascular de un grado medio de '3' (antes de la inyección) a un grado medio de '1' un mes después de la inyección (P = 0,012). Esta reducción se mantuvo a los tres meses (mediana = 1; P = 0,001) y a los ocho meses (mediana = 1; P = 0,001) después de la inyección con rAAV.sFlt-1. La inyección del vector rAAV.sFlt-1 dio como resultado la regresión a largo plazo (al menos ocho meses) de los vasos neovasculares en el 85 % (11 de 13) de los ojos tratados en comparación con el 8 % (1 de 13) en los ojos tratados con el vector de control.
El examen histológico de los ojos en este estudio preclínico reveló que la alteración o pérdida de fotorreceptores fue significativamente (P <0,01) más pronunciada en los ojos inyectados con vector de control en comparación con los ojos inyectados con rAAV.sFlt-1. La expresión de sFLT-1 también se confirmó mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa de muestras de tejido; El ARNm para sFLT-1 se detectó en los cuatro ojos probados. No se observaron efectos adversos específicos del vector rAAV.sFlt-1 en el ojo inyectado con rAAV.sFlt-1 en comparación con el ojo inyectado con el vector de control (rAAV.gfp).
En el segundo estudio, realizado en ratones transgénicostrVEGF02, el objetivo del estudio era determinar si la inyección subretiniana de rAAV.sFlt-1 dio como resultado alguna respuesta inmunitaria mediada por células que pudiera tener un impacto negativo en la expresión a largo plazo de sFLT-1 o provocar daño a la retina asociado a la respuesta inmune. En este estudio, 50 ratones transgénicos trVEGF02 recibieron inyecciones subretinianas de rAAV.sFlt-1 (8x109 partículas virales) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un ojo. Las retinas de 30 ratones de los grupos de tratamiento rAAV.sFlt-1 o de control se evaluaron una semana y un mes después de la inyección para determinar la presencia de células inmunes (leucocitos, macrófagos y linfocitos B y T). El examen citométrico de flujo de la copa posterior del ojo mostró que una semana después de la inyección se había producido un aumento estadísticamente significativo de los leucocitos CD45+ (6,6 veces más que en el control; P < 0,05) y macrófagos CD11b+ (aumento de 5,7 veces en comparación con el control; P < 0,036). Sin embargo, no hubo diferencias en CD19+, CD8+ y CD4+ (linfocitos B y T) en este momento. Un mes después de la inyección, no hubo diferencias en el número de células entre los subconjuntos de leucocitos (es decir, células CD45+, CD19+, CD11b+, CD8+ o CD4+) en los ojos de los ratones tratados con rAAV.sFlt-1 o el control PBS, lo que sugiere que la infiltración de leucocitos y macrófagos fue transitoria. La evaluación citométrica de flujo de subconjuntos de linfocitos de los bazos de estos ratones en los puntos de tiempo de una semana y un mes no mostró diferencias significativas en el número de linfocitos. Este hallazgo sugiere que no se observó una respuesta inmune sistémica, aunque se mostró una respuesta inmune transitoria y localizada en la retina.
En este segundo estudio, el examen histológico de los ojos de cinco de los ratones inyectados con rAAV.sFlt-1 o PBS no reveló destrucción o secuelas observables asociadas a la respuesta inmune en las retinas de ninguno de los ratones examinados.
Para evaluar el impacto de rAAV.sFlt-1 en el nivel de neovascularización en este modelo de ratón transgénico (trVEGF02) de neovascularización retiniana, las retinas de los ratones inyectados con rAAV.sFlt-1 o PBS también fueron calificadas de forma independiente por dos evaluadores diferentes a los dos meses después del tratamiento. En general, hubo una reducción significativa en los grados de neovascularización media (antes de la inyección: 1,46 ± 0,58; después de la inyección: 0,81 ± 0,57; P < 0,00015) en los ojos inyectados con rAAV.sFlt-1, mientras que hubo un aumento significativo en las calidades de neovascularización media (antes de la inyección: 1,08 ± 0,56; después de la inyección: 1,63 ± 0,96; P < 0,018) en los ojos inyectados con control de PBS.
Los hallazgos de este segundo estudio en ratones indican claramente que el tratamiento con rAAV.sFlt-1 pareció revertir el aumento progresivo de la neovascularización observada en este modelo de ratón de neovascularización retiniana y AMD. Además, solo se observó una respuesta inflamatoria limitada, localizada, una semana después de la inyección subretiniana con rAAV.sFlt-1 y se resolvió al mes. Esta respuesta inmune no pareció comprometer la eficacia terapéutica a largo plazo de rAAV.sFlt-1 en la retina.
Los modelos de ratones transgénicos descritos en este Ejemplo 3 demuestran que las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden usarse para el tratamiento y/o profilaxis de otras enfermedades vasculares de la retina en las que está implicada la inhibición de VEGF. Estos incluyen edema macular diabético, isquemia de retina diabética, edema de retina diabético, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de la vena retiniana, oclusión de la vena retiniana central y oclusión de la vena retiniana ramificada. En estudios clínicos, se ha demostrado que algunos inhibidores de VEGf , como Lucentis, tratan efectivamente algunas de estas enfermedades, que incluye el edema macular diabético y la oclusión de las venas retinianas. La eficacia de rAAV.sFlt-1 demostrada en estos modelos de ratón indica que rAAV.sFlt-1 también es efectiva en el tratamiento de estas enfermedades mediadas por VEGF.
Ejemplo 4
Estudio rAAV.sFlt-1 en ratas
En el estudio de rata rAAV.sFlt-1, se usaron dos modelos de neovascularización ocular: neovascularización de la córnea inducida por cauterización y neovascularización coroidea inducida por fotocoagulación con láser (CNV). En el modelo de neovascularización de la córnea, se inyectaron 22 ratas con vector rAAV.sFlt-1 (8x108 partículas virales) en la cámara anterior de un ojo y con el vector de control (rAAV.gfp) en el ojo contralateral, seguido de la cauterización de la córnea. A continuación, se examinó la neovascularización de los ojos cuatro días después de la cauterización, mediante el uso de fotografías con lámpara de hendidura. Se encontró una velocidad significativamente menor de vascularización de la córnea en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 en comparación con los ojos tratados con el control (27 % y 63 %, respectivamente; P = 0,009). El examen histológico de los ojos mostró que no se observaron vasos sanguíneos en la córnea en la mayoría de los ojos cauterizados, tratados con rAAV.sFlt-1. El examen histológico también reveló que la infiltración celular de la capa del estroma de la córnea fue más pronunciada en los ojos inyectados con el vector de control en comparación con los ojos tratados con rAAV.sFlt-1. Además, hubo un edema obvio e inflamación del estroma de la córnea en los ojos tratados con el vector de control, mientras que no hubo evidencia de una inflamación tisular significativa en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1.
En el modelo de CNV inducida por fotocoagulación con láser, se inyectaron subretinalmente 10 ratas con vector rAAV.sFlt-1 (8x108 partículas virales) en un ojo, y un vector de control (rAAV.gfp) en el ojo contralateral. Se usó fotocoagulación con láser para inducir CNV un mes después de la inyección. Cinco semanas después de la fotocoagulación con láser, se examinaron los ojos en busca de CNV mediante el uso de angiografía con fluoresceína. Sólo el 41 % de las áreas tratadas con láser mostraron fugas en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 en comparación con el 60 % en los ojos tratados con el vector de control (P = 0,002). Dieciséis semanas después de la CNV inducida por láser, los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 todavía mostraban una neovascularización significativamente menor que los ojos de control. El examen histológico de los ojos en las áreas inmediatamente adyacentes a los sitios de inyección reveló un epitelio pigmentado retiniano normal y segmentos externos normales y una capa nuclear externa. Estos hallazgos sugirieron que no había una toxicidad obvia asociada con la expresión de sFLT-1. Los electrorretinogramas también indicaron el funcionamiento normal de los ojos tratados con rAAV.sFlt-1. La mayoría de las lesiones por láser tratadas con rAAV.sFlt-1 y con vector de control desarrollaron membranas celulares subretinianas. Sin embargo, las lesiones en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 generalmente tenían menos células endoteliales que proliferaban, lo que refleja los hallazgos de la angiografía con fluoresceína e indica que la velocidad de angiogénesis (es decir, neovascularización) se redujo en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1.
Estudio rAAV.sFlt-1 y rAAV(bv).sFlt-1 en un modelo de diabetes en ratas
Para evaluar aún más la seguridad y eficacia de rAAV.sFlt-1 y rAAV(bv).sFlt-1 para el tratamiento de la retinopatía diabética (DR) y el edema macular diabético (DME), se llevó a cabo un experimento en un modelo de diabetes en ratas.
La pérdida de la visión en los pacientes diabéticos está mediada por la inflamación, lo que conduce a la eventual ruptura de la barrera hematorretiniana y la consiguiente fuga vascular, lo que da como resultado un edema macular. El modelo de rata diabética con estreptozotocina (STZ) muestra un patrón bien caracterizado de fuga vascular, en el que el VEGF está fuertemente sobre regulado tan pronto como a las 2 semanas. (Miyamoto, K., y col. Proc Natl Acad Sci USA 96, 10836-10841 (1999). Los enfoques actuales para el tratamiento de modelos animales de DR demuestran solo una resolución parcial de la fuga vascular.
La diabetes se induce en ratas Brown Norway mediante inyección intraperitoneal de estreptozotocina (50 mg/kg). La diabetes se confirma y monitoreó mediante mediciones de glucosa en sangre. Las ratas con glucosa en sangre > 350 mg/dl se consideraron diabéticas. Ocho días después del inicio de la diabetes, las ratas se trataron mediante inyección subretiniana (n = 12 ojos por grupo) con 5 pl que contienen 1x1010 o 5x1010 genomas de vector de rAAV.sFlt-1 o rAAV(bv).sFlt-1 mediante el uso de técnicas establecidas como se describe en Chalberg, TW y col., Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 2140-2146 (2005). Se inyectaron AAV2.GFP (5x1010 vg) y el vehículo como controles. Los grupos sin tratamiento para diabéticos y no diabéticos también se usaron como controles.
El efecto del rAAV(bv).sFlt-1 que expresa sFLT-1 sobre la fuga vascular se mide a los 60 días. La fuga vascular retiniana se mide mediante el método de fuga de albúmina FITC después de la inyección usando la albúmina conjugada con FITC como trazador. El método de fuga de albúmina FlTC mide directamente la fuga de albúmina FITC que se filtra hacia la retina desde la circulación y es un método comúnmente usado para medir la permeabilidad vascular retiniana. La fuga vascular retiniana en los ojos inyectados se comparará con los controles no diabéticos, los ojos diabéticos no tratados y tratados con vehículo, y los serotipos 2 y 8 de AAV de tipo salvaje.
Resultados: rAAV(bv).sFlt-1 que expresa sFLT-1 reduce la fuga vascular en la rata diabética STZ mientras que la inyección de AAV2.GFP y otros controles no lo hace.
Ejemplo 5
Estudio rAAV.sFlt-1 en monos
La eficacia y seguridad de rAAV.sFlt-1 también se examinó en un modelo de primate no humano (macaco) de AMD mediante el uso de fotocoagulación con láser para inducir CNV. Un desafío en el desarrollo de tratamientos para AMD en humanos es que los primates no humanos no desarrollan AMD. La CNV inducida por fotocoagulación con láser simula algunos síntomas de la AMD, pero el proceso biológico subyacente es la curación de una lesión aguda en lugar de la progresión de una enfermedad crónica y, por lo tanto, puede no predecir el rendimiento de ningún tratamiento en particular para la CNV en humanos con AMD u otras enfermedades basadas en CNV. No obstante, debido a que los ojos humanos son anatómicamente más similares a los ojos de primates no humanos que a los ojos de no primates, los primates no humanos se estudian con frecuencia para evaluar la toxicidad y la respuesta histológica a un tratamiento potencial u otra intervención.
En el primer estudio sobre primates no humanos, se inyectaron subretinalmente a cinco monos macacos con rAAV.sFlt-1 (4x1012 partículas virales) en un ojo y un vector de control (rAAV.gfp) en el ojo contralateral. La salud ocular de los monos se evaluó periódicamente después de la inyección subretiniana. No hubo ninguna complicación aparente relacionada directamente con la inyección subretiniana tanto en el vector de control o en el vector rAAVsFlt-1. Se observó una irritación conjuntival transitoria y una neblina vítrea en la semana siguiente a la inyección, que desapareció en la segunda semana. La inyección subretiniana no tuvo éxito en el ojo derecho de uno de los monos; por lo tanto, este animal no se sometió a evaluación adicional.
La inyección subretiniana de 40-100 uL de suspensión de rAAV levantó la retina, creando una ampolla que albergaba el vector entre el epitelio pigmentario y la capa de fotorreceptores de manera localizada. Esta ampolla se corrigió automáticamente en 24 a 48 horas. Excepto por una alteración menor del epitelio pigmentario de la retina en el punto de penetración de la aguja, no se observaron otras anomalías retinianas durante el seguimiento (3 a 17 meses después de la inyección). No se observaron otras anormalidades o eventos adversos; en ningún momento, el desprendimiento de la retina estuvo asociado con la cirugía.
Para evaluar la eficacia terapéutica a largo plazo de rAAVsFlt-1, los cuatro monos inyectados se sometieron a una intensa fotocoagulación con láser 16 meses después del tratamiento con los vectores. Se indujeron ocho lesiones mediante el uso de láser en cada ojo, y los ojos luego se monitorearon para CNV a las dos y cuatro semanas después del tratamiento con láser. Después de la fotocoagulación con láser, solo tres de los cuatro monos fueron analizables, por lo tanto, se recopilaron datos de eficacia para tres animales. Ninguno de los ojos de los tres monos tratados con rAAVsFlt-1 desarrolló lesiones relacionadas con la CNV y solo se observó una tinción débil con fluoresceína, lo que indica una mínima filtración/neovascularización. Todos los ojos contralaterales tratados con el vector de control desarrollaron lesiones relacionadas con la CNV.
En un estudio de seguimiento destinado a evaluar la seguridad y toxicidad de rAAV.sFlt-1 inyectado en el espacio subretiniano, se usaron ocho monos: cinco se inyectaron en el ojo izquierdo con rAAV.sFlt-1, dos se inyectaron en el ojo izquierdo con rAAV.gfp, uno se inyectó en ambos ojos con proteína Flt-1 recombinante y el otro se mantuvo como control sin inyectar. Los monos se examinaron antes y después de la inyección mediante fotografía en color del fondo de ojo, angiografía con fluoresceína y electrorretinografía. Se recogió sangre de forma rutinaria para analizar los niveles de sFLT-1 y se aislaron linfocitos de sangre periférica para citometría de flujo para evaluar la respuesta del subconjunto de células inmunitarias. En el momento del sacrificio (3, 9 y 12 meses después de la inyección), se recogieron tejidos para i) estudios de biodistribución en el vector rAAV.sFlt-1 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real en ADN genómico extraído; ii) proteína hsFlt-1 y cuantificación del nivel de proteína de la cápside de AAV2 por ELISA; y iii) histología de los ojos.
La fotografía en color del fondo de ojo, la angiografía con fluoresceína y la electrorretinografía no detectaron ningún efecto adverso en el ojo después de la inyección. El nivel de sFLT-1 en plasma no mostró ningún aumento en el nivel relacionado con la inyección de rAAV.sFlt-1 en ninguno de los monos machos o hembras examinados. A excepción de una muestra de nervio óptico, la secuencia rAAV.sFlt-1 no se detectó en el ADN genómico de ninguno de los otros tejidos muestreados (ganglios linfáticos, bazo, hígado, cerebro, cerebro, corazón, bazo, córnea). Las secciones de los ojos embebidas en parafina y teñidas con hematoxilina y eosina parecían normales.
Si bien la anatomía de los primates no humanos es más similar a la anatomía humana que la anatomía de mamíferos más pequeños como los ratones, existen limitaciones que hacen que los estudios en primates no humanos sean intrigantes, pero no predictivos de los resultados clínicos en humanos. Como se señaló anteriormente, el estudio en este ejemplo usa un modelo de lesión por láser en el que el animal tiene tejido retiniano por lo demás sano. El tejido de la retina no se degradó con el tiempo como en el tejido de la retina enfermo ni están presentes los factores patógenos específicos de la enfermedad. Los primates no humanos con frecuencia difieren de los humanos con respecto a la biodistribución, la farmacocinética y las dependencias de la dosis, el título de anticuerpos, la respuesta inmune y la respuesta inflamatoria de formas que no son predecibles. Las diferencias adicionales incluyen la ILM (membrana limitante interna) y el volumen de la cámara vítrea, que es aproximadamente cuatro veces más grande en humanos que los primates no humanos usados en este estudio. La membrana limitante interna humana, una barrera que actúa para limitar el transporte entre la retina y el vítreo, es una barrera más profunda y efectiva que la ILM de un mono.
Ejemplo 6
Estudios de seguridad
En estos estudios, se midió la proteína sFLT-1 en el vítreo y el plasma de animales mediante el uso de un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para la detección de la proteína sFLT-1. El nivel de proteína sFLT-1 se incrementó en el vítreo y los ojos de los animales inyectados con rAAV.sFlt-1. La Figura 3A muestra el nivel de proteína vítrea sFLT-1 en ojos de monos inyectados con rAAV.sFlt-1 (ojo izquierdo) y ojo de control inyectado con rAAV.gfp y ojos no inyectados (ojo derecho). Los niveles de proteína sFLT-1 fueron significativamente más altos en cuatro de los cinco ojos inyectados con rAAV.sFlt-1. La Tabla 5.3.1 muestra el nivel de proteína sFLT-1 en los ojos de ratón que no fueron inyectados y que fueron inyectados con rAAV.sFlt-1 y enucleados un mes después de la inyección. La sobreexpresión de sFLT-1 en los ojos de los ratones y el vítreo de los monos no tuvo ningún efecto adverso sobre su bienestar general. En los monos, la sobreexpresión de sFLT-1 en el vítreo no tuvo ningún efecto sobre su función retiniana y no tuvo ningún efecto tóxico clínicamente o histológicamente evidente en los ojos. Los niveles de proteína sFLT-1 significativamente más altos en los ojos inyectados con rAAV.sFlt-1 sugieren una expresión de hsFLT-1 mediada por rAAV a largo plazo y respaldan los datos previos sobre la detección de la secuencia de ARNm viral y la presencia de la expresión de gfp mediada por rAAV en la retina de mono 17 meses después de la inyección.
Tabla 1 Resumen de los niveles de proteína hsFLT-1 en ojos de ratón inyectados con rAAV.sFlt-1 y ojos de ratón sin inyectar 1 mes después de la inyección.
Los niveles de hsFLT-1 en plasma en los monos no mostraron ninguna tendencia en los diferentes tiempos de muestreo (Figura 3B). Esto sugiere que la inyección de rAAV.sFlt-1 no tuvo un efecto obvio sobre el nivel de hsFLT-1 en plasma. Los niveles que fluctuaron no tuvieron ningún efecto sobre el bienestar de los monos.
Tabla 2 Estudios de inmunogenicidad
Tabla 2: Resumen de la cepa animal, vía de inyección, duración y dosis de rAAV.sFlt-1 utilizado en estudios de inmunogenicidad
Ejemplo 7
Estudios de inmunogenicidad en ratones
La respuesta inmune celular a la terapia con rAAV.sFlt-1 se evaluó en el ojo del ratón una, dos y cuatro semanas después de la inyección mediante el uso de citometría de flujo. Los leucocitos que se infiltraron se identificaron en base a la expresión de CD45 y se clasificaron como monocitos/granulocitos, células B, células T CD4+ y células T CD8+ en base a la expresión de CD11b, CD19, CD4 y CD8, respectivamente. La copa ocular posterior se recogió de cinco ratones en cada grupo (inyectado con rAAV.sFlt-1, inyectado con PBS, control no inyectado) y se combinó para el análisis. Como se muestra en la Figura 4A, no hubo diferencia en el número de células recuperadas de cada grupo de ratones durante el transcurso de este experimento. Sin embargo, hubo un aumento significativo en el número de células CD45+ una y dos semanas después de la inyección que desapareció a las cuatro semanas (Figura 4B). Casi todo el aumento observado en una semana podría atribuirse a un aumento en las células CD11b+ (Figura 4C), ya que no hubo diferencia en el número de células CD4+, CD8+ y CD19+ (Figuras 4D-F). A las dos semanas, sin embargo, ya no había una diferencia significativa en el número de CD11b+ presentes en los ojos de los ratones inyectados con AAV. sFlt-1; en cambio, se produjo un aumento significativo del número de linfocitos T CD4+ y CD8+ y una posible tendencia a un aumento de los linfocitos B. El número de células CD4+ y CD8+ disminuyó drásticamente a las cuatro semanas, pero permaneció significativamente aumentado en comparación con los ratones inyectados y no inyectados con PBS. Por el contrario, no hubo cambios en el número de células CD11b+, CD4+, CD8+ y CD19+ en el bazo durante el curso de este experimento (Figuras 5A-E).
La función de las células T que se infiltran en la retina se examinó más de cerca estimulándolas con PMA/ionomicina o anti-CD3 y midiendo la producción intracelular de IFN-gamma mediante citometría de flujo. La Figura 6 muestra que, en comparación con los controles no inyectados, una pequeña proporción tanto de células T CD4+ y CD8+ se prepararon para producir IFN-gamma después de la inyección de rAAV.sFlt-1. La frecuencia de las células que producen IFN-gamma no varió significativamente durante el transcurso del experimento a pesar de un aparente aumento entre las células T CD8+ el día 3 (Figura 6B). Se midieron niveles más bajos de IFN-gamma cuando las células T se reestimularon con un epítopo restringido por MHC de clase I de la proteína de la cápside rAAV y también se detectó algo de IFN-gamma en ausencia de estimulación (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos resultados indican que una pequeña proporción de las células T que se infiltran en los ojos de los ratones inyectados con rAAV.sFlt-1 se habían activado recientemente para producir IFN-gamma, pero esto no varió entre los subconjuntos de células T durante el transcurso de este experimento.
Los datos presentados para estos experimentos sobre la infiltración de células inmunes en los ojos de ratones inyectados con AAV-sFLT-1 muestran claramente dos ondas de infiltración celular. Hubo una onda temprana de células CD11b+ a la semana 1 seguida de una onda de células T CD4+ y CD8+ a las 2 semanas. Es importante destacar que ninguna onda de infiltración seguía presente a las 4 semanas, lo que sugiere que la infiltración se había resuelto por sí sola. Es importante destacar que la producción de proteína sFLT-1 no disminuyó en este punto y, de hecho, continuó expresándose a niveles muy altos.
Los datos sobre la producción de IFN-gamma indicaron que alrededor del 5 % de células T CD4+ y CD8+ fueron cebadas recientemente, y esta frecuencia no varió durante el transcurso del experimento. Hu. y otros describieron por primera vez la ruptura de la barrera hematorretiniana por las células T activadas, y los datos presentados aquí son consistentes con la infiltración de células CD4+ y CD8+ activadas. Sin embargo, no hubo evidencia de un aumento en el número de células T específicas de la cápside entre esta población, ya que la reestimulación con péptidos específicos solo reveló niveles bajos de producción de IFN-gamma que no cambiaron durante el transcurso del experimento. En conjunto, estas observaciones sugieren que la agresión inicial que se produjo con la inyección de rAAV.sFlt-1 produjo una onda de infiltración de células inmunitarias de corta duración que se resolvió por sí sola en cuatro semanas, pero no consiguió provocar una respuesta inmunitaria continua que pudiera dañar los tejidos del ojo o afectar la expresión de sFLT-1.
Ejemplo 8
Estudios de inmunogenicidad en monos
Se analizó la respuesta inmune después de la inyección subretiniana de rAAV.sFlt-1 o rAAV.gfp mediante el uso de un panel de anticuerpos que identificarían cambios en las poblaciones de subconjuntos de células inmunes. Los resultados se resumen en la Figura 4. En algunos monos, se observaron cambios muy pequeños en las poblaciones de subconjuntos de células inmunitarias, pero no fueron estadísticamente significativos. A pesar de esto, esto fue seguido por un estudio más profundo de las células circulantes. Específicamente, evaluamos la posibilidad de que el vector (rAAV) o el producto génico insertado (sFLT-1) puedan provocar activación inmune. Se investigó la activación de células B y células T (Figura 5 y Figura 6). También se analizaron otras poblaciones de linfocitos para determinar si la terapia provocó diferencias observables que pudieran ser indicativas de activación directa o una respuesta a la activación. El análisis se realizó mediante el uso de una combinación de marcadores clásicos (Pitcher, 2002 # 129), así como también un nuevo análisis fenotípico descrito en un informe publicado recientemente (Miller, 2008 # 126). Utilizando un pequeño subconjunto de marcadores fenotípicos (HLA-DR, Ki-67 y Bcl-2) investigamos si tras la administración de rAAV-sFLT-1 las células T CD4+ o CD8+ y/o las células B mostraban signos de activación. En los estudios publicados por Miller y colaboradores, las células T activadas muestran un fenotipo efector activado caracterizado por la expresión del marcador de diferenciación HLA-DR y el antígeno nuclear asociado al ciclo celular Ki-67, que se usa como marcador de proliferación. Las células T en reposo no expresan Ki-67, mientras que las células T en ciclo o divididas recientemente regulan positivamente la expresión de Ki-67. Normalmente, se detecta un nivel de expresión de Ki-67 como parte del ciclo celular homeostático.
Ejemplo 9
Biodistribución de rAAV.sFlt-1
El ADN genómico se extrajo de los tejidos recolectados (nervio óptico, ganglio linfático, cerebro, corazón, pulmones, bazo, hígado, córnea) inmediatamente después de la eutanasia de los monos. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real se realizó en el ADN genómico para determinar si la construcción del vector rAAV.sFlt-1 inyectada en el espacio subretiniano estaría presente en otra parte. En base a la comparación de los valores de Ct entre cantidades conocidas de ADN del plásmido de control pssv.C1.sflt-1, la construcción rAAV.sFlt-1 se encontró con un número bajo de copias del gen en el nervio óptico de un ojo inyectado y no en las otras muestras de tejidos. Esto sugiere que rAAV.sFlt-1 inyectado en el espacio subretiniano permanece principalmente dentro del ojo. La Tabla 4 es un resumen de los valores de Ct del ADN genómico extraído de monos que no fueron inyectados o inyectados con rAAV.sFlt-1- y rAAV.gfp.
Tabla 3: Valores de Ct y valores de desviación estándar de Ct para las diferentes muestras de ADN genómico y plásmido de control analizadas.
Ejemplo 10
Estudios de eficacia en un modelo de ratón de neovascularización retiniana
En el estudio se usaron ratones transgénicos generados a través de la sobre regulación de VEGF en las células fotorreceptoras. Se inyectó rAAV.sFlt-1 en un ojo y se inyectó rAAV.gfp en el ojo contralateral. El grado, la intensidad y el estadio de la neovascularización se calificaron por observadores enmascarados en base a una escala acordada. Los resultados mostraron que hubo una reducción general estadísticamente significativa en los grados de neovascularización de una mediana de 3 (grave) a una mediana de 1 (leve) un mes después de la inyección (P = 0,012). Este bajo nivel de fuga de fluoresceína se mantuvo en tres (mediana = 1; P = 0,001) y ocho meses (mediana 1; P = 0,001) después de la inyección de rAAV.sFlt-1, lo que sugiere el efecto terapéutico sostenido a largo plazo de rAAV.sFlt-1.
Tabla 4: Clasificación de ojos antes y después de la inyección de AAV.sFlt-1 y AAV.gfp y números/filas de fotorreceptores a los 8 meses después de la inyección
Puntos en el tiempo (meses) Números de Filas de Regresión después de la inyección fotorreceptores fotorreceptores
Identificación a0 1 3 8
del animal
243 I 1 0 0 0 68,8 ± 14,1b 4-8 Moderado 243 D 1 3 3 3 0 0 Ninguno
244 I 2 1 1 1 72,8 ± 18,8b 3-7 Moderado 244 D 1 3 2 1 5,8 ± 3,1 0-1 Ninguno
247 I 2 2 0 0 80,8 ± 31,0 b 3-8 Significativo 247 D 1 1 1 1 28,3 ± 33,3 0-4 Ninguno
249 I 3 1 1 1 0 0 Significativo 249 D 3 3 3 4 7,2 ± 13,1 0-1 Ninguno
250 I 3 1 1 1 65,1 ± 24,4 b 3-8 Significativo 250 D 3 3 3 3 0 0 Ninguno
251 I 3 2 1 1 0 0 Significativo 251 D 3 3 3 4 0 0 Ninguno
253 I 3 2 1 1 73,8 ± 20,39b 5-7 Significativo 253 D 3 2 3 2 20 ± 30,3 0-2 Moderado 254 I 3 1 0 0 61,8 ± 14,3 b 4-6 Significativo 254 D 2 2 2 2 8,8 ± 9,6 0-1 Ninguno
324 I 1 1 1 1 ND ND Ninguno
324 D 1 1 1 1 ND ND Ninguno
326 I 2 1 1 1 ND ND Moderado 326 D 2 2 2 2 ND ND Ninguno
327 I 2 2 0 0 ND ND Significativo 327 D 2 3 2 2 ND ND Ninguno
329 I 3 2 2 2 ND ND Moderado 329 D 2 2 2 2 ND ND Ninguno
330 I 3 3 2 3 ND ND Ninguno
330 D 3 3 3 3 ND ND Ninguno
I = ojo izquierdo inyectado con AAV.sFlt-1, D = ojo derecho inyectado con AAV.GFP, ND = no hecho
a 3 días antes de la inyección con vectores AAV.
b Diferencia estadísticamente significativa en el número de fotorreceptores (p<0,01)
Estudios de eficacia en un modelo de mono de neovascularización coroidea inducida por láser
Se inyectaron cinco monos en un ojo con rAAV.sFlt-1 y en el otro con rAAV.gfp. La inyección subretiniana no tuvo éxito en el ojo derecho de uno de los monos; por lo tanto, este animal no se sometió a evaluación adicional. La inyección subretiniana de 40-100 |jl de suspensión de rAAV levantó la retina, creando una ampolla que alojó el vector entre el epitelio pigmentario y la capa de fotorreceptores de manera localizada. Esta ampolla se corrigió automáticamente en 24 a 48 horas. Excepto por una alteración menor del epitelio pigmentario de la retina en el punto de penetración de la aguja, no se observaron otras anomalías retinianas durante el seguimiento (3 a 17 meses después de la inyección). No se observaron otras anormalidades o eventos adversos; en ningún momento, el desprendimiento de la retina estuvo asociado con la cirugía.
Para evaluar la eficacia terapéutica a largo plazo de rAAVsFlt-1, los cuatro monos inyectados se sometieron a una intensa fotocoagulación con láser 16 meses después del tratamiento con los vectores. Se indujeron ocho lesiones mediante el uso del láser en cada ojo, y luego se monitoreó la neovascularización coroidea en los ojos a las dos y cuatro semanas después del tratamiento con láser. Después de la fotocoagulación con láser, solo tres de los cuatro monos fueron analizables, por lo tanto, se recopilaron datos de eficacia para tres animales. Ninguno de los tres ojos de mono tratados con rAAVsFlt-1 desarrolló lesiones relacionadas con la neovascularización coroidea y solo se observó una tinción débil con fluoresceína, lo que indica una mínima filtración/neovascularización. Todos los ojos contralaterales tratados con el vector de control desarrollaron lesiones relacionadas con la neovascularización coroidea. Los datos de eficacia para los tres animales se presentan en la Tabla 5.
Tabla 5: Efecto de la administración subretiniana de rAAV.sFlt-1 o vector de control (rAAV.gfp) sobre la CNV inducida por láser en monos macacos
Lesiones de CNV después de una angiografía del fondo de ojo con fluoresceína f
Mono Tiempo de CNV inducida por Ojo derecho (rAAV.sFlt-1) Ojo izquierdo (rAAV.gfp) No. láser (meses) * 2 semanas 4 semanas 2 semanas 4 semanas
1 16 0/8 0/8 1/8 6/8
2 16 0/8 0/8 0/8 3/8
4 16 0/8 0/8 0/8 2/8
*La CNV se indujo a los 16 meses después de la inyección subretiniana o rAAV.
f Número de lesiones maculares con neovascularización (fuga de fluoresceína) tras la fotocoagulación con láser.
La función retiniana de los monos se evaluó mediante electrorretinografía. Se calcularon las amplitudes y los tiempos implícitos de las respuestas del ojo inyectado y del ojo contralateral no inyectado y se compararon antes de la inyección y en diferentes momentos después de la inyección. Los resultados mostraron que la inyección de rAAV.sFlt-1, la proteína sFLT-1 recombinante o rAAV.gfp no tuvo ningún efecto adverso sobre la función retiniana de los monos.
Ejemplo 12
El estándar de atención en el tratamiento de la AMD húmeda implica la inyección intraocular frecuente de proteínas anti-VEGF recombinantes cada 4-8 semanas. Se ha desarrollado una construcción rAAV para una potente (Kd ~10 pM), proteína anti-VEGF de origen natural, tirosina quinasa 1 soluble relacionada con Fms (sFlt-1), para el tratamiento de la AMD húmeda. rAAV.sFlt-1 se produjo según las pautas de la FDA y la ICH en el Laboratorio de aplicación humana núcleo de vector de la UNC. Se realizó un estudio controlado con ocho pacientes sobre la seguridad y eficacia de rAAV.sFlt-1. Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron los siguientes:
Criterio de elegibilidad
Edades elegibles para el estudio: 65 años y más
Géneros elegibles para el estudio: Ambos
Acepta voluntarios saludables: No
Criterios de inclusión:
• edad mayor o igual a 65 años;
• CNV subfoveal secundaria a AMD y con mejor agudeza visual corregida de 20/80 - 20/400 o mejor en el otro ojo;
• el angiograma con fluoresceína del ojo del estudio debe mostrar evidencia de una lesión neovascular coroidea subfoveal con fugas;
• debe ser candidato para inyecciones intravítreas anti-VEGF;
• la dimensión total de la lesión no debe exceder las 12 áreas del disco del estudio de fotocoagulación macular;
• sin tratamiento retiniano previo de terapia fotodinámica o láser;
• capaz de dar su consentimiento informado;
• el participante tiene un laboratorio y un ECG clínicamente aceptables en el momento de la inscripción; y • capaz de cumplir con los requisitos del protocolo, que incluye las visitas de seguimiento.
Criterio de exclusión:
• enzimas hepáticas > 2 veces el límite superior de lo normal;
• evidencia clínica de infección activa de cualquier tipo, que incluye adenovirus, hepatitis A, B o C, o virus del VIH;
• cualquier tratamiento previo para AMD en el ojo de estudio/control, que excluye las inyecciones anti-VEGF;
• un desgarro en el epitelio pigmentado de la retina;
• extenso tejido cicatricial submacular;
• enfermedad significativa de la retina distinta de la AMD por CNV subfoveal, como la retinopatía diabética o la oclusión vascular retiniana;
• enfermedad significativa no retiniana tal como atrofia ocular o cataratas;
• alergia conocida a la fluoresceína;
• uso actual de prednisolona, otros esteroides antiinflamatorios o fármacos inmunosupresores. Se permiten medicamentos no esteroides como la aspirina;
• cualquier otra enfermedad o trastorno significativo que, en opinión del investigador, pueda poner en riesgo a los participantes debido a su participación en el estudio, o que pueda influir en el resultado del estudio o en la capacidad del participante para participar en el estudio;
• participantes que hayan participado en otro estudio de investigación que involucre un producto en investigación en las últimas 12 semanas; y y
• sensibilidad a la penicilina.
Procedimiento de administración: La composición farmacéutica que contiene rAAV.sFlt-1 se administró a los sujetos del estudio en un entorno apropiado para la inyección subretiniana según el siguiente procedimiento:
1. La piel periocular del sujeto, los márgenes de los párpados y las pestañas se limpiaron con povidona yodada al 5 % antes de colocarlos;
2. Se colocó un paño estéril para todo el cuerpo seguido de un paño adicional para los ojos.
3. Se insertó un espéculo para párpados, asegurándose de que esté bien posicionado debajo de los párpados para dirigir las pestañas lejos del campo y que estén protegidas por un paño para los ojos.
4. Se insertaron 3 puertos de vitrectomía de 23 g o 25 g;
5. Se conectó infusión de solución salina al 1er puerto;
6. Se insertó fibra óptica en el 2do puerto;
7. Se conectó una cánula subretiniana 36G-41G a la jeringa del fármaco mediante un microconector en el 3er puerto; 8. Bajo control microscópico, se inyectan 100 microlitros debajo de la retina;
9. Después de la inyección, se retiraron los instrumentos y los puertos;
10. Se aplicó un ungüento de cloranfenicol;
11. Se instiló una gota de atropina al 1 % de un recipiente estéril de un solo uso; y
12. Se aplicó una almohadilla para los ojos y un protector para los ojos.
Los resultados del estudio rAAV.sFlt-1 se resumen en la presente descripción.
Los ocho sujetos incluidos (edad media 77 años) tenían neovascularización coroidea subfoveal activa, con agudeza visual de 20/40 a 20/400, y habían recibido previamente entre 1 y 25 inyecciones intravítreas de ranibizumab. Los pacientes se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos, un grupo de control y dos grupos experimentales. Todos los pacientes recibieron inyecciones intravítreas de ranibizumab el día 1 y el día 30 del estudio. El día 7, se administró 1x1010 genomas de vector de rAAV.sFlt-1 en un volumen de 100 ul mediante inyección subretiniana al primer grupo experimental y se administró 1x1011 genomas de vector de rAAV.sFlt-1 en un volumen de 100 ul mediante inyección subretiniana al segundo grupo experimental. En los seis casos de los pacientes de los grupos experimentales, la ampolla de fluido subretiniano se resolvió en 4 horas. Después de 24 horas, la mayor parte del aire en el vítreo se había absorbido y solo el lugar de la inyección retiniana permanecía visible. Un paciente desarrolló una hemorragia menor asociada con el procedimiento que no afectó la visión. Como se esperaba después de la vitrectomía, hubo un aumento transitorio en el recuento de neutrófilos que volvió a la normalidad 14 días después de la inyección. La secuencia del vector se encontró en las lágrimas de un sujeto un día después de la inyección que desapareció el día 30. Aparte de esta única ocurrencia, AAV2 no se detectó en ninguna de las muestras de sangre, saliva u orina de los sujetos ni por qPCR ni por ELISA hasta la fecha. Los niveles de fondo de la proteína sFLT-1 de origen natural mostraron una alta variación inicial en la orina, el suero y la saliva sin aumento después del tratamiento. Los niveles de sFLT-1 en el vítreo también variaron entre los sujetos (975-2085 pg/ml). La bioquímica sanguínea, el recuento sanguíneo completo y la respuesta de las células T se mantuvieron sin cambios significativos en comparación con los valores iniciales. La inyección subretiniana de rAAV.sFlt-1 no mostró toxicidad retiniana clínicamente significativa según lo evaluado por exámenes oftálmicos en serie durante un período de dos meses. Ninguno de los sujetos presentaba signos inflamatorios superficiales, del segmento anterior o del vítreo. No hubo evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de la IOP, desprendimiento de retina o respuesta inmune intraocular o sistémica en ninguno de los pacientes. Un resumen de los tratamientos anti-VEGF, tanto iniciales como de rescate, para cada paciente se resume en la Tabla 6.
Tabla 6: Resumen de las inyecciones de ranibizumab por paciente
Notablemente, ninguno de los pacientes de los grupos experimentales requirió tratamiento de rescate el día 60 y la mayoría de los pacientes del grupo experimental de dosis más baja requirieron 0 tratamientos de rescate el día 90, el día 120, el día 150, el día 180 o el día 210 o el día 270 o día el 365 (1 año). El paciente control requirió múltiples tratamientos de rescate. Estos resultados son inesperados y amplían la promesa de la terapia génica para la gran cohorte de pacientes ancianos que padecen AMD húmeda. Generalmente, los pacientes tratados con la terapia anti-VEGF actual, tal como inyecciones intravítreas de una proteína inhibidora de VEGF u otro agente anti-VEGF requerirán inyecciones adicionales en 30, 60 o 90 días.
Los niveles máximos de expresión de sFLT-1 en un sujeto de estudio o un paciente se alcanzan de seis a ocho semanas después de la administración subretiniana de rAAV.sFLT-1. Durante este período denominado de “ aceleración” , se inyectan al menos una, dos o tres inyecciones intravítreas de un agente anti-VEGF a intervalos de 15 a 45 días, y preferentemente a intervalos de aproximadamente 30 días, para prevenir la progresión de la enfermedad. Se prefiere administrar la primera inyección intravítrea de un agente anti-VEGF entre 1 y 30 días, y preferentemente entre 5 y 10 días, antes de la administración de rAAV.sFlt-1 para permitir la absorción del agente anti-VEGF inyectado por vía intravítrea. (Lucentis o Avastin o Eylea u otros agentes no sFLT). Si esta primera inyección intravítrea se administra menos de 24 horas antes de la administración subretiniana de rAAV.sFLT, puede lavarse del vítreo durante el procedimiento de inyección subretiniana dando lugar a una concentración de agente anti-VEGF subterapéutico y progresión de la enfermedad.
Después de la finalización del período de rampa, los pacientes que expresan suficiente sFLT-1 para tratar o prevenir la progresión de su AMD pueden no necesitar inyecciones de anti-VEGF intravítreas adicionales, aunque se espera que permanezcan bajo el cuidado de un médico. Los pacientes son monitoreados y tratados según sea necesario en base a criterios objetivos, como un aumento de la medición del grosor de la retina en el punto central con una tomografía de coherencia óptica.
En este estudio, los pacientes del grupo de control y de ambos grupos experimentales fueron evaluados para detectar signos de neovascularización coroidea activa aproximadamente una vez al mes y se volvieron a tratar con ranibizumab intravítreo si se cumplía alguno de los siguientes criterios:
- >10 pérdida de letras del Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) de la visita anterior del sujeto (atribuible a causas retinianas), o una disminución de > 5 letras de ETDRS de la visita anterior junto con la percepción del paciente de la pérdida funcional;
- cualquier aumento, nuevo o persistente, subsensorial, subretiniano pigmento epitelial (RPE), o fluido intrarretiniano en OCT;
- signos de aumento de la fuga de CNV a través de FA.
Ejemplo 13
Tomografía de coherencia óptica (OCT)
La tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) se realizó mediante el uso de un equipo aprobado (Heidelberg Spectralis® SD-OCT) y técnicas estándar para monitorear el grosor del punto central de la retina y la fuga de fluido en la retina de los pacientes.
La tomografía de coherencia óptica (OCT) es una tecnología de imágenes médicas sin contacto similar a la ecografía y la resonancia magnética. Con OCT, la luz reflejada se usa para producir imágenes detalladas de cortes transversales y 3D del ojo. El SPECTRALIS® SD-OCT mide simultáneamente múltiples longitudes de onda de luz reflejada en un espectro, de ahí el nombre de dominio espectral. El aumento de la velocidad y el número de exploraciones se traduce en una resolución más alta y una mayor probabilidad de observar enfermedades. En pacientes con AMD húmeda, la SD-OCT puede detectar la detección de nuevo fluido retiniano o un aumento clínicamente significativo en el grosor de la retina. (Adhi y col., Curr Opin Ophthalmol. Mayo de 2013; 24(3):213-21; Malamos y col.,_Invest Ophthalmol Vis Sci. Octubre de 2009; 50(10):4926-33). La detección de estos síntomas en un paciente con AMD indica una progresión de la enfermedad que justifica el tratamiento con una terapia anti-VEGF como Lucentis o Eylea.
La salud de la retina y los síntomas de la progresión de AMD de cada sujeto del estudio se controlaron mediante SD-OCT. Se tomaron al menos 6 exploraciones radiales a través de la mácula, cada una de aproximadamente 6 mm de longitud, y se recogieron imágenes/exploraciones OCT en cada visita especificada. Se evaluó la presencia de fluido intrarretiniano en las imágenes SD-OCT mediante un lector enmascarado y se midió el grosor central de la retina mediante el uso del programa informático Heidelberg Heyex SD-OCT. Los resultados del grosor central de la retina para cada visita para 8 pacientes se presentan a continuación en la Tabla 7.
Tabla 7: Cambio medio en el grosor central de la retina desde el inicio en el día 0 en micrómetros por grupo de dosificación
Como se muestra en la tabla 7, el grosor medio de la retina central de los sujetos en todas las cohortes de dosificación disminuyó después de la administración de las inyecciones intravítreas de la proteína anti-VEGF (Lucentis) al comienzo del estudio según lo requerido por el protocolo. Como era de esperar, el grosor central de la retina de los pacientes del grupo de control comienza a aumentar y se puede ver fluido en las imágenes de SD-OCT dentro de los 30 - 90 días posteriores a la administración de la proteína anti-VEGF. Inesperadamente, el grosor central de la retina de los sujetos en los grupos de dosis baja y alta generalmente está bien controlado por rAAV.sFlt-1 y no aumenta con el tiempo. No se produce nuevo fluido intrarretiniano en las retinas de los sujetos del grupo de dosis baja o de los sujetos del grupo de dosis alta. Esto lo muestra OCT, por ejemplo, en la Figura 24. A los 12 meses, el grosor central de la retina de los sujetos tratados con rAAV.sFlt-1 no aumentó en más de 50 micrómetros, ni en más de 100 micrómetros, ni en más de 250 micrómetros dentro de los 12 meses posteriores a la administración de una composición farmacéutica que comprende rAAV.sFlt-1. En comparación con el valor inicial, el grosor central de la retina de los sujetos humanos tratados con rAAV.sFlt-1 disminuyó en 50 micrómetros o, en algunos casos, en 100 micrómetros o, en algunos casos, en 200 micrómetros. Esta disminución se observó dentro de las 8 semanas posteriores a la administración de sFlt-1 y se mantuvo a los 3 meses, 6 meses, 9 meses y 12 meses. Este resultado es sorprendente y se desconoce en el tratamiento clínico de AMD y la neovascularización ocular en sujetos humanos. Más generalmente, sin administraciones adicionales de una proteína anti-VEGF u otro inhibidor de VEGF, se observará fluido intrarretiniano y un aumento en el grosor central de la retina con 30 días, 60 días, 90 días o 180 días de un tratamiento inicial anti-VEGF.
Angiografía con fluoresceína (FA)
La FA se realizó mediante el uso de una técnica estándar. Se toman imágenes de tránsito del ojo de estudio. Las imágenes de fase intermedia y tardía se toman del estudio y del ojo no estudiado; y FA se obtiene en cada visita especificada.
Estudios de biodistribución
La diseminación del vector se investigó mediante la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genomas del vector aislados de muestras de lágrimas, plasma, orina y saliva. La biodistribución del vector y sFLT-1 se investigó mediante ELISA para las cápsides sFLT-1 y AAV2 en plasma, lágrimas y saliva.
Extracción de ADN
Las muestras (100-300 ul) se pipetearon sobre tarjetas de recogida de muestras (Qiagen, Valencia, CA) o aplicadores de punta de espuma estéril. El ADN se extrajo de cada muestra según el protocolo del fabricante. El ADN purificado se disolvió en 50 ul de tampón de elución. La cantidad de ADN presente se determinó mediante espectrofotometría.
Detección de rAAV.sFlt-1 por PCR en tiempo real
Se cribaron muestras de ADN genómico (0,5-1 |jg) para detectar la presencia del vector AAV.sFlt-1 mediante el uso de los ensayos de expresión génica TaqMan® (Applied Biosystems, Estados Unidos). El ensayo consiste en un par de cebadores de PCR no marcados que amplifican un fragmento entre las secuencias AAV2 y sFLT-1, y una sonda TaqMan® con una etiqueta de colorante<f>A<m>™ o VIC® y un resto ligante de surco menor en el extremo 5', y un colorante extintor no fluorescente en el extremo 3'. Las condiciones del ciclo fueron 1 mantenimiento durante 2 minutos a 50 °C y otro mantenimiento a 95 °C durante 20 segundos, seguido de 45 ciclos de 95 °C durante 3 segundos y 60 °C durante 30 segundos.
Las muestras positivas para el fragmento rAAV.sFlt-1 se probaron adicionalmente y el número de copias del gen de rAAV.sFlt-1 presente se cuantificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Se amplificaron entre 0,5-1,0 ug de ADN extraído en mezclas de reacción de 20 ul que contenían Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) y 0,5 uM de cada cebador mediante el uso del sistema de PCR en tiempo real IQ5 Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, California, Estados Unidos). Un conjunto similar de muestras enriquecidas con ADN plasmídico que contiene la secuencia diana se preparó en paralelo como muestras enriquecidas. El par de cebadores utilizado (hacia adelante: CACTAGTCCAGTGTGGTGGA; al revés: AGCCAGGAGACAACCACTTC) se diseñó con ayuda de Primer3 Output (Whitehead Institute, MA, EE. UU.) para amplificar la región del ADNc del vector en el gen sFLT-1 utilizando el Rotorgene (Corbett). Las condiciones de ciclado que se utilizaron fueron: 2 min 50,0 °C, 2 min 95,0 °C y 60 ciclos de tres pasos de 95,0 °C 20 s, 60,0 °C durante 20 s y 72,0 °C durante 20 s. En cada ciclo se generó una curva estándar a partir de diluciones de 10 veces el ADN plasmídico (pSSV.sFlt-1) que tenía la misma secuencia del vector diana. Cada muestra se analizó por triplicado.
Cuantificación de la concentración de proteína sFlt-1 por ELISA
La concentración de sFLT-1 presente en el plasma, las lágrimas y la saliva se midió cuantitativamente mediante ELISA mediante el uso de un kit de ELISA Quantikine (R&D Systems, Minneapolis, MN) que se basó en la técnica de inmunoensayo sándwich. Las muestras (100 ul) se añadieron a la placa de 96 pocillos recubierta con un anticuerpo monoclonal específico para VEGF R1/sFLT-1 y se dejaron incubar durante 2 horas. Cualquier sFLT-1 no unido se eliminó lavando con un tampón. Después de la incubación con un anticuerpo policlonal ligado a enzima específico para VEGF R1/sFLT-1, se lavó el exceso de conjugado anticuerpo-enzima y las muestras se incubaron luego con una solución de sustrato. La formación de cromógeno catalizada por enzimas se cuantificó midiendo la absorbancia visible a 450 nm. Las concentraciones de sFLT-1 (en pg/ml) en las muestras se calcularon a partir del valor de absorbancia mediante el uso de una curva de calibración trazada con sFLT-1 humana recombinante.
Detección de AAV2 por ELISA
La presencia de la cápside de AAV2 en el plasma, las lágrimas, la orina y la saliva se analizó mediante el uso del kit ELISA de valoración de AAV2 (American Research Products, Inc., Belmont, Massachusetts, Estados Unidos). Este kit se basa en una técnica de ELISA sándwich y usa un anticuerpo monoclonal de ratón específico para un epítopo conformacional en partículas AAV ensambladas. Este anticuerpo monoclonal se recubre sobre tiras de microplacas y se usa para capturar partículas de AAV de la muestra. Las partículas de AAV capturadas se detectaron en dos pasos. Primero, se unió al complejo inmune un anticuerpo monoclonal conjugado con biotina a AAV. En la segunda etapa, el conjugado de estreptavidina peroxidasa reacciona con las moléculas de biotina. La adición de la solución de sustrato da como resultado una reacción de color que fue proporcional a las partículas de virus unidas específicamente. La absorbancia se midió fotométricamente a 450 nm. El kit de control proporcionado contiene una preparación de partículas de AAV de cápsides vacías y permitió la determinación cuantitativa de muestras con un título de partículas desconocido. Se añadieron muestras (100 ul) a las placas y el ensayo se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Detección de anticuerpo neutralizante AAV-2
Se analizó la capacidad del plasma para bloquear la transducción de células HEK293 con AAV2.gfp. El plasma del paciente se diluyó en serie en suero de ratón normal en placas de pocillos múltiples. Se añadió AAV2.gfp a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora antes de la adición a las células HEK293 por triplicado. El título de anticuerpo neutralizante se expresó como la dilución de plasma que dio como resultado una inhibición del 50 % de la transducción por AAV2-gfp. La actividad máxima de gfp se representó por el vector diluido en el suero normal del ratón; la inhibición máxima se representó por medio solo en suero normal de ratón. El plasma de referencia de cada sujeto se analizó junto con cada muestra posoperatoria. Las células verdes de la transducción de células 293T con AAV2.gfp se contaron en los pocillos de prueba después de 48 horas y se compararon con el número de células verdes en la muestra de suero de referencia.
Detección de anticuerpos anti-AAV2
Para detectar anticuerpos de plasma a la cápside AAV2, se recubrieron placas de ELISA de unión a proteínas mejoradas con 109 gv/ml de AAV2 (Facility Vector Core, Carolina del Norte) a 4 °C durante la noche. Las placas se bloquearon a 37 °C durante 2 horas y luego se incubaron a 4 °C durante la noche con anticuerpo monoclonal anti-AAV2 diluido en serie (Industries International, Concord, MA) o diluciones 1:50, 1:100, 1:200, o 1:400 de plasma del paciente. Las placas se incubaron con Ig antihumana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) a 37 °C durante 2 horas, luego con sustrato de tetrametilbencidina (TMP) y peróxido de hidrógeno (H2O2). La reacción se detuvo con ácido fosfórico (H3PO4) y se leyó a 450 nm en un lector de placas. El título de anticuerpos anti-AAV2 se calculó en base a la curva estándar del anticuerpo comercial determinada en paralelo. Cada valor se determinó por triplicado.
Atrofia geográfica
Los sujetos humanos del estudio fueron examinados en busca de signos de atrofia geográfica en sus ojos tratados y no tratados de acuerdo con técnicas estándar. No se observaron aumentos de atrofia geográfica en pacientes tratados con rAAV.sFlt-1 a los 3 meses, 6 meses, 9 meses o 12 meses. Se plantea la hipótesis de que el tratamiento puede detener la progresión de la atrofia geográfica en un ojo tratado hasta por 15 meses, 18 meses, 24 meses, 36 meses, 5 años y 10 años.
Ejemplo 14
Para probar aún más la seguridad y eficacia de rAAV.sFlt-1 para el tratamiento de AMD húmeda y la neovascularización coroidea, se inscribieron cuarenta (40) sujetos adicionales en un estudio clínico controlado. Como en el Ejemplo 12, rAAV.sFlt-1 se produjo de acuerdo con las directrices de la FDA y la ICH en el Laboratorio de Aplicaciones Humanas de UNC Vector Core. Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron los siguientes:
Elegibilidad:
Edades elegibles para el estudio: 55 años y mayores
Géneros elegibles para el estudio Ambos
Acepta voluntarios saludables: No
Criterios de inclusión:
• Edad mayor o igual a 55 años;
• CNV subfoveal secundaria a AMD y con mejor agudeza visual corregida en el ojo del estudio de 20/30 -20/400 y 20/200 o mejor en el otro ojo;
• el angiograma con fluoresceína del ojo del estudio debe mostrar evidencia de una lesión neovascular conoidea subfoveal con fugas; o neovascularización coroidea actualmente bajo gestión activa con terapia anti-VEGF;
• debe ser candidato para inyecciones intravítreas anti-VEGF;
• la dimensión total de la lesión no debe exceder las 12 áreas del disco del estudio de fotocoagulación macular;
• sin tratamiento retiniano previo de terapia fotodinámica o láser;
• capaz de dar su consentimiento informado;
• el participante tiene parámetros de laboratorio y ECG clínicamente aceptables en el momento de la inscripción; y • capaz de cumplir con los requisitos del protocolo, que incluye las visitas de seguimiento.
Criterio de exclusión:
• enzimas hepáticas > 2 veces el límite superior normal;
• evidencia clínica de infección activa de cualquier tipo, incluidos adenovirus, hepatitis A, B o C, o virus VIH; o antecedentes documentados de hepatitis B o hepatitis C;
• cualquier tratamiento previo para la AMD en el ojo de estudio/control, excluidas las inyecciones anti-VEGF;
• un desgarro en el epitelio pigmentado de la retina;
• cicatrización subfovial extensa, atrofia geográfica extensa o sangre subretiniana espesa en el ojo del estudio según determine el investigador;
• enfermedad retiniana significativa distinta de AMD por CNV subfoveal, como la retinopatía diabética o la oclusión vascular retiniana, que podría comprometer la visión en el ojo del estudio;
• enfermedad significativa no retiniana como atrofia ocular o catarata significativa en el ojo del estudio, que incluye la cicatrización de la córnea central que afecta la agudeza visual, glaucoma con defectos de campo o cualquier uveítis mensurable;
• alergia conocida a la fluoresceína;
• uso actual de prednisolona, otros esteroides antiinflamatorios o fármacos inmunosupresores. Se permiten los esteroides inhalados y los medicamentos no esteroides como la aspirina;
• cualquier otra enfermedad o trastorno significativo que, en opinión del investigador, pueda poner en riesgo a los participantes debido a su participación en el estudio, o que pueda influir en el resultado del estudio o en la capacidad del participante para participar en el estudio;
• participantes que hayan participado en otro estudio de investigación que involucre un producto en investigación en las últimas 12 semanas; y
• sensibilidad a la penicilina confirmada por los registros médicos de los participantes.
Los sujetos incluidos inicialmente tenían neovascularización coroidea subfoveal activa, con agudeza visual en el ojo del estudio de 20/30 a 20/400, y habían recibido previamente entre 0 y 25 inyecciones intravítreas de ranibizumab. Los pacientes se distribuyeron aleatoriamente en un grupo de control o un grupo experimental hasta que se inscribieron un total de 14 pacientes de control y 26 de experimentos. Todos los pacientes recibieron inyecciones intravítreas de ranibizumab el día 1 y el día 30 del estudio. El día 7, se administró 1x1011 genomas de vector de rAAV.sFlt-1 en un volumen de 100 ul mediante inyección subretiniana al grupo experimental.
Como en el estudio del Ejemplo 12, los niveles máximos de expresión de sFLT-1 en un sujeto de estudio o un paciente se alcanzaron de seis a ocho semanas después de la administración subretiniana de rAAV.sFLT-1. Durante este período denominado de “ aceleración” , se inyectaron al menos una, dos o tres inyecciones intravítreas de un agente anti-VEGF a intervalos de 15 a 45 días, y preferentemente a intervalos de aproximadamente 30 días, para prevenir la progresión de la enfermedad. Se prefiere administrar la primera inyección intravítrea de un agente anti-VEGF entre 1 y 30 días, y preferentemente entre 5 y 10 días, antes de la administración de rAAV.sFLT-1 para permitir la absorción del agente anti-VEGF inyectado por vía intravítrea. (Lucentis o Avastin o Eylea u otros agentes no sFLT). Si esta primera inyección intravítrea se administra menos de 24 horas antes de la administración subretiniana de rAAV.sFLT, puede lavarse del vitreo durante el procedimiento de inyección subretiniana dando lugar a una concentración de agente anti-VEGF subterapéutico y progresión de la enfermedad.
Después de completar el período de rampa, los pacientes que expresaron suficiente sFLT-1 para tratar o prevenir la progresión de su AMD u otros síntomas de neovascularización coroidea no necesitaron inyecciones intravítreas adicionales de anti-VEGF, aunque se espera que permanezcan bajo el cuidado de un médico.
En este estudio citado en este ejemplo, los pacientes de los grupos de control y experimental fueron evaluados en busca de signos de neovascularización coroidea activa aproximadamente una vez al mes y se volvieron a tratar con ranibizumab intravítreo si se cumplía alguno de los siguientes criterios:
- >10 pérdida de letras del Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) de la visita anterior del sujeto (atribuible a causas retinianas), o una disminución de > 5 letras de ETDRS de la visita anterior junto con la percepción del paciente de la pérdida funcional;
- cualquier aumento, nuevo o persistente, subsensorial, subretiniano pigmento epitelial (RPE), o fluido intrarretiniano en OCT;
- signos de aumento de la fuga de CNV a través de FA.
Ejemplo 15
Para probar la seguridad y eficacia de rAAV.sFlt-1 para la prevención o profilaxis de la enfermedad neovascular ocular de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), se lleva a cabo un estudio clínico controlado adicional con cuarenta (150) pacientes. rAAV(bv).sFlt-1 se produce según las pautas de la FDA y la ICH en Lonza Houston, Inc.(Houston, Texas). Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron los siguientes:
Elegibilidad:
• Edades elegibles para el estudio: 50 años y mayores
• Géneros elegibles para el estudio: Ambos
• Acepta voluntarios sanos: Sí
Criterios de inclusión:
• pacientes con AMD no exudativa (cualquiera de las categorías 2, 3 o 4 según los criterios de AREDS; en el grupo 4, se incluirán los ojos con AMD no avanzada); se incluyen pacientes con AMD clasificada como “ húmeda” o “ seca” ; • edad entre 50 y 90 años;
• capaz de comprender y cumplir con los requisitos del ensayo;
• agudeza visual > 0,4;
Criterio de exclusión:
• actualmente inscrito en un ensayo clínico oftalmológico;
• ojos con trastornos maculares o coroideos concomitantes distintos de la AMD y con signos indefinidos de la AMD;
• ojos con diagnóstico de la AMD exudativa con neovascularización subretiniana activa (SRNV) o lesiones de CNV que requieran fotocoagulación con láser en el ojo del estudio;
• sujetos con opacidades significativas del cristalino que causen disminución de la visión;
• sujetos con ambliopía;
• sujetos con enfermedad nerviosa óptica (neuropatía, atrofia, papilar), glaucoma inestable como se define por presiones intraoculares superiores a 25 mm Hg, 3 o más medicamentos para el glaucoma, C/D de 0,8 o mayores y campos visuales consistentes con glaucoma; antecedentes de cirugía vítrea-vítreo, miopía degenerativa, enfermedad inflamatoria intraocular posterior activa, uso crónico de medicamentos de esteroides oculares tópicos, retinopatías vasoproliferativas (distintas de AMD), desprendimiento de retinal regatógeno y distrofias macular hereditarias; • • sujetos con marcapasos a demanda o epilepsia;
• sujetos con hipertensión no controlada (definida como diastólica de 90 o más y sistólica de 150 o más); • sujetos con historia reciente (dentro del año anterior) de enfermedad vascular cerebral;
• se manifiestan con ataques isquémicos transitorios (TIA) o accidentes vasculares cerebrales (CVA);
• sujetos con antecedentes de SIDA;
• sujetos que se hayan sometido a cirugía intraocular en el ojo del ensayo en los 3 meses anteriores a la inscripción en el ensayo;
• pacientes que no están dispuestos a cumplir con los horarios de exámenes de las visitas;
Medidas de resultado primarias:
MPDO y electrorretinogramas multifocales [Marco de tiempo: 1 año ] [Designado como problema de seguridad: SÍ ] Medidas de resultado secundarias:
La seguridad y eficacia de rAAV(bv).sFlt-1 para reducir el riesgo de desarrollo de AMD avanzada. [ Marco de tiempo: 1 año] [Designado como problema de seguridad: SÍ ]
Tabla 9: Grupos de diseño experimental
Ejemplo 16
Para probar la seguridad y eficacia de rAAV.sFlt-1 para el tratamiento de la enfermedad neovascular ocular edema macular diabético (DME), se lleva a cabo un estudio clínico controlado adicional con cuarenta (40) pacientes. rAAV(bv).sFlt-1 se produce según las pautas de la FDA y la ICH en Lonza Houston, Inc. (Houston, Texas). Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron los siguientes:
Elegibilidad:
• Edades elegibles para el estudio: 18 años y mayores
• Géneros elegibles para el estudio: Ambos
• Acepta voluntarios saludables: No
Criterios generales de inclusión:
• Los sujetos son elegibles si cumplen los siguientes criterios:
• Voluntad de proporcionar consentimiento informado por escrito y, en los centros de EE. UU., autorización de la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico (HIPAA), y en otros países, según proceda de acuerdo con las leyes nacionales.
• Diabetes mellitus (tipo 1 o 2).
• Engrasamiento retiniano secundario a la diabetes mellitus (EMD) que afecta al centro de la fóvea con un grosor macular central > 275 pm en el subcampo central, según la evaluación de la tomografía de coherencia óptica (OCT). • Agudeza visual mejor corregida (AVMC) en el ojo del estudio de 20/40 a 20/320 equivalente de Snellen aproximado utilizando el protocolo del estudio de retinopatía diabética de tratamiento precoz (ETDRS) a una distancia de prueba inicial de 4 metros.
• Se determina que la disminución de la visión se debe principalmente al DME y no a otras causas.
• Capacidad (en opinión del investigador) y voluntad de volver para todas las visitas y evaluaciones programadas. Criterio de exclusión:
• Antecedentes de cirugía vitreorretiniana en el ojo del estudio.
• Fotocoagulación panretiniana (PRP) o fotocoagulación macular con láser en el ojo del estudio en los 3 meses anteriores al cribado.
• Retinopatía diabética proliferativa (PDR) en el ojo del estudio, a excepción de la PDR inactiva y en regresión.
• Neovascularización del iris, hemorragia vítrea, desprendimiento de retina por tracción o fibrosis prerretiniana que afecte a la mácula en el ojo del estudio.
• Tracción vitreomacular o membrana epirretiniana en el ojo del estudio.
• Inflamación ocular (incluyendo trazas o por encima) en el ojo de estudio.
• Antecedentes de uveítis idiopática o autoinmune en cualquiera de los dos ojos.
• Daño estructural en el centro de la mácula en el ojo del estudio que probablemente impida la mejora de la VA tras la resolución del edema macular, incluyendo atrofia del epitelio pigmentario de la retina (RPE), fibrosis subretiniana o placa de exudado duro organizada.
• Trastornos oculares en el ojo del estudio que puedan confundir la interpretación de los resultados del estudio, incluyendo oclusión vascular retiniana, desprendimiento de retina, agujero macular o neovascularización coroidea (CNV) de cualquier causa (por ejemplo, degeneración macular asociada a la edad (AMD), histoplasmosis ocular o miopía patológica). • • Cirugía de cataratas en el ojo del estudio en los últimos 3 meses, capsulotomía con láser de itrio-aluminiogranate (YAG) en los últimos 2 meses, o cualquier otra cirugía intraocular en los 90 días anteriores al Día 0.
• Glaucoma no controlado o cirugía de filtración previa en el ojo del estudio.
• Tensión arterial no controlada.
• Antecedentes de accidente vascular cerebral o infarto de miocardio en los 3 meses anteriores al Día 0. • Diabetes mellitus no controlada.
• Insuficiencia renal que requiera diálisis o trasplante renal.
• Antecedentes de otras enfermedades, disfunción metabólica, hallazgos en la exploración física o en el laboratorio clínico que hagan sospechar razonablemente de una enfermedad o afección que contraindique el uso de un fármaco en investigación, pueda afectar a la interpretación de los resultados del estudio o haga que el sujeto corra un alto riesgo de complicaciones derivadas del tratamiento.
Medidas de resultado primarias:
• Porcentaje de pacientes que obtienen > 15 letras en su puntuación de mejor agudeza visual corregida (BCVA) desde el inicio en el mes 12 [Marco de tiempo: Referencia al mes l2 ] [ Designado como problema de seguridad: No ]
Medidas de resultado secundarias:
• Cambio medio respecto al valor inicial en la puntuación de la mejor agudeza visual corregida (BCVA) en los meses 12, 24 y 36
• Porcentaje de pacientes con una agudeza visual (VA) equivalente a Snellen de 20/40 o mejor en los meses 12, 24 y 36.
• Cambio medio desde el inicio en el grosor foveal central medido por SD-OCT en los meses 12, 24 y 36.
• Reducción de la frecuencia del tratamiento concomitante con anti-VEGF (p. ej., Lucentis, Avastin, Macugen o Eyelea) [Designado como problema de seguridad: No]
Tabla 10: Grupos de diseño experimental para el estudio DME
Los sujetos inicialmente inscritos tienen DME, con agudeza visual en el ojo del estudio de 20/40 a 20/320, y habrán recibido previamente entre 0 y 25 inyecciones intravítreas de ranibizumab o aflibercept. Los pacientes se distribuyen aleatoriamente en un grupo de control o dos grupos experimentales hasta que se inscriban un total de 14 pacientes de control, 13 pacientes experimentales de dosis baja y 13 pacientes experimentales de dosis alta. Todos los pacientes recibieron inyecciones intravítreas de ranibizumab el día 1 y el día 30 del estudio. El día 7, se administran 1x1010 o 1x1011 genomas de vector de rAAV(bv).sFlt-1 en un volumen de 100 ul mediante inyección subretiniana a los grupos experimentales.
Como en el estudio del Ejemplo 12, los niveles máximos de expresión de sFLT-1 en un sujeto de estudio o un paciente se alcanzan entre seis y ocho semanas después de la administración subretiniana de rAAv(bv).sFLT-1. Durante este período denominado de “ aceleración” , se inyectan al menos una, dos o tres inyecciones intravítreas de un agente anti-VEGF a intervalos de 15 a 45 días, y preferentemente a intervalos de aproximadamente 30 días, para prevenir la progresión de la enfermedad. Se prefiere administrar la primera inyección intravítrea de un agente anti-VEGF entre 1 y 30 días, y preferentemente entre 5 y 10 días, antes de la administración de rAAV(bv).sFLT-1 para permitir la absorción del agente anti-VEGF inyectado por vía intravítrea (Lucentis o Avastin o Eylea u otros agentes no sFLT). Si esta primera inyección intravítrea se administra menos de 24 horas antes de la administración subretiniana de rAAV(bv).sFLT, puede eliminarse por lavado del vítreo durante el procedimiento de inyección subretiniana, lo que da lugar a una concentración subterapéutica del agente anti-VEGF y a la progresión de la enfermedad.
Después de la finalización del período de rampa, los pacientes que expresan suficiente sFLT-1 para tratar o prevenir la progresión de su DME pueden no necesitar inyecciones de anti-VEGF intravítreos adicionales, aunque se espera que permanezcan bajo el cuidado de un médico.
En este estudio citado en este ejemplo, los pacientes de los grupos de control y experimental se evalúan para detectar signos de DME nuevos o activos y neovascularización aproximadamente una vez al mes y se vuelven a tratar con ranibizumab intravítreo si se cumplía alguno de los siguientes criterios:
- >10 pérdida de letras del Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) de la visita anterior del sujeto (atribuible a causas retinianas), o una disminución de > 5 letras de ETDRS de la visita anterior junto con la percepción del paciente de la pérdida funcional;
- cualquier aumento, nuevo o persistente, subsensorial, subretiniano pigmento epitelial (RPE), o fluido intrarretiniano en OCT;
- signos de aumento de la fuga de CNV a través de FA.
Ejemplo 17
Para probar la seguridad y eficacia de rAAV.sFlt-1 para el tratamiento de la oclusión de la vena retiniana de la enfermedad neovascular ocular (RVO), se lleva a cabo un estudio clínico controlado adicional con cuarenta (40) pacientes. El estudio clínico se realiza con pacientes de 2 cohortes, 1 cohorte que incluye pacientes con oclusión de la vena retiniana central (CRVO) y 1 cohorte que incluye oclusión de vena retiniana ramificada (BRVO). Como en el Ejemplo 15, rAAV(bv).sFlt-1 se produce según las directrices de la FDA e ICH en Lonza Houston, Inc. (Houston, Texas). Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron los siguientes:
Criterios de inclusión:
• edema macular con compromiso central secundario a oclusión de la vena central de la retina (CRVO) o edema macular con compromiso de rama secundario a BRVO durante no más de 9 meses con un grosor medio del subcampo central > 250 pm en la tomografía de coherencia óptica (OCT);
• adultos >18 años;
• agudeza visual mejor corregida (AVMC) del estudio de retinopatía diabética con tratamiento precoz (ETDRS) de 20/40 a 20/320 (73 a 24 letras) en el ojo del estudio;
Criterio de exclusión:
• cualquier tratamiento previo con agentes anti-VEGF en el ojo del estudio (pPegaptanib sódico, acetato de anecortave, bevacizumab, ranibizumab, etc.) o administración previa de medicamentos antiangiogénicos sistémicos; • fotocoagulación láser panretiniana o macular previa en el ojo del estudio
• duración de la enfermedad CRVO > 9 meses desde la fecha del diagnóstico; duración de la enfermedad BRVO > 9 meses desde la fecha del diagnóstico;
• uso previo de corticosteroides intraoculares en el ojo del estudio o uso de corticosteroides perioculares en el ojo del estudio en los 3 meses anteriores al Día 1;
• neovascularización del iris, hemorragia vítrea, desprendimiento de retina por tracción o fibrosis prerretiniana que afecte a la mácula en el ojo del estudio o en el ojo contralateral;
Medidas de resultado primarias:
• Cambio medio desde el inicio en la puntuación de la agudeza visual mejor corregida (BCVA) a los 6 meses.
[Marco de tiempo: Valor de referencia y 6 meses] [Designado como problema de seguridad: NO].
• Rango de referencia de estudio definido de la puntuación en letras de la agudeza visual mejor corregida (BCVA) del estudio de retinopatía diabética de tratamiento temprano (ETDRS) de 73 a 24 (= agudeza de 20/40 a 20/320) en el ojo de estudio; una puntuación más alta representa un mejor funcionamiento. Nominador = (Número de participantes que mantuvieron la visión * 100); Denominador = Número de participantes analizados.
Medidas de resultado secundarias:
• Porcentaje de participantes que obtuvieron > 15 letras en la puntuación de BCVA en el mes 6 en comparación con el valor de referencia.
• Cambio medio desde el inicio en el grosor central de la retina (CRT) a los 6 meses [ Marco de tiempo: Valor de referencia y 6 meses] [Designado como problema de seguridad: No ]
• Reducción de la frecuencia del tratamiento concomitante con anti-VEGF ((p. ej., Lucentis, Avastin, Macugen o Eyelea) [Designado como problema de seguridad: No]
Tabla 11: Grupos de diseño experimental para el estudio BRVO/CRVO
Los sujetos inicialmente inscritos tienen CRVO o BRVO, con agudeza visual en el ojo del estudio de 20/40 a 20/320, y habrán recibido previamente entre 0 y 25 inyecciones intravítreas de ranibizumab o aflibercept. Los pacientes se distribuyen aleatoriamente en un grupo de control o dos grupos experimentales hasta que se inscriban un total de 14 pacientes de control, 13 pacientes experimentales de dosis baja y 13 pacientes experimentales de dosis alta. Todos los pacientes recibieron inyecciones intravítreas de ranibizumab el día 1 y el día 30 del estudio. El día 7, se administran 1x1010 o 1x1011 genomas de vector de rAAV(bv).sFlt-1 en un volumen de 100 ul mediante inyección subretiniana a los grupos experimentales.
Como en el estudio del Ejemplo 14, los niveles máximos de expresión de sFLT-1 en un sujeto de estudio o un paciente se alcanzan entre seis y ocho semanas después de la administración subretiniana de rAAV(bv).sFLT-1. Después de completar el período de rampa, como se describe en el Ejemplo 14, los pacientes que expresan suficiente sFLT-1 para tratar o prevenir la progresión de su BRVO o CRVO pueden no necesitar inyecciones intravítreas adicionales de anti-VEGF, aunque se espera que permanezcan bajo el cuidado de un médico.
En este estudio citado en este ejemplo, los pacientes en los grupos de control y experimentales son evaluados para detectar signos de oclusión de la vena retiniana activa o nueva y neovascularización aproximadamente una vez al mes y se vuelven a tratar con ranibizumab intravítreo si se cumple alguno de los siguientes criterios:
- >10 pérdida de letras del Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) de la visita anterior del sujeto (atribuible a causas retinianas), o una disminución de > 5 letras de ETDRS de la visita anterior junto con la percepción del paciente de la pérdida funcional;
- cualquier aumento, nuevo o persistente, subsensorial, subretiniano pigmento epitelial (RPE), o fluido intrarretiniano en OCT;
- signos de aumento de la fuga de CNV a través de FA.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) para usar en un método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular en un sujeto humano que tiene neovascularización ocular, el método comprende:
i) administrar por inyección intravítrea o subretiniana al menos una dosis de un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) antes de administrar el rAAV al sujeto humano;
ii) administrar en el ojo del sujeto humano una dosis unitaria que comprende al menos 1x106 y como máximo 1x1015 genomas de vector del rAAV y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el rAAV comprende una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína anti-VEGF, y en donde la proteína anti-VEGF comprenda la tirosina cinasa soluble tipo fms humana 1 (sFLT1) o un fragmento funcional de la misma; y
iii) administrar por inyección intravítrea o subretiniana una o dos dosis de un inhibidor de VEGF en un intervalo de 30 días después de la administración del rAAV.
2. El rAAV para usar en el método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular según la reivindicación 1, en donde la etapa de administración (ii) se realiza solo una vez en al menos 18 meses, en un sujeto humano que padece neovascularización coroidea (CNV) secundaria a la degeneración macular relacionada con la edad (AMD).
3. El rAAV para usar en el método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular según la reivindicación 1 o 2, en donde la dosis unitaria comprende al menos 1x108 y como máximo 1x1013 genomas de vector.
4. El rAAV para usar en el método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular según la reivindicación 1 o 2, en donde la dosis unitaria comprende al menos 1x109 y como máximo 3x1013 genomas de vector.
5. El rAAV para usar en el método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el uso comprende además medir la agudeza visual mediante letras del estudio de retinopatía diabética de tratamiento temprano (ETDRS) después de la administración de la composición farmacéutica, en donde se observa una reducción en la neovascularización por angiografía por fluoresceína (FA) después de la administración de la composición farmacéutica, o en donde la agudeza visual mejor corregida (BCVA) del sujeto humano disminuye en menos de 15 letras según lo medido por las letras del ETDRS después de la administración de la composición farmacéutica, o en donde la BCVA del sujeto humano mejora en al menos 1 línea medida por las letras del ETDRS después de la administración de la dosis unitaria.
6. El rAAV para usar en el método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la administración comprende inyección intravítrea o subretiniana.
7. El virus recombinante para usar en el método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la enfermedad neovascular ocular está asociada con una afección seleccionada del grupo que consiste en: degeneración macular relacionada con la edad (AMD), neovascularización retiniana, neovascularización coroidea, retinopatía diabética, oclusión de la vena retiniana, edema macular diabético, isquemia retiniana diabética, retinopatía isquémica y edema retiniano diabético, en donde la afección es opcionalmente AMD.
8. El rAAV para usar en el método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular según la reivindicación 6, que comprende además retirar el gel vítreo antes de administrar la dosis unitaria.
9. El rAAV para usar en el método para el tratamiento de una enfermedad neovascular ocular según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el inhibidor de VEGF se selecciona del grupo que consiste en bevacizumab, ranibizumab y aflibercept.
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