ES2326563T3 - Coniosetina, procedimiento para su preparacion y uso como medicamento. - Google Patents

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Abstract

Compuesto de Fórmula (VI) **(Ver fórmula)** para el tratamiento y profilaxis de la enfermedad de Alzheimer.

Description

Coniosetina, procedimiento para su preparación y uso como medicamento.
De acuerdo con el nivel de conocimientos actuales, la enfermedad de Alzheimer (demencia de tipo Alzheimer, AD) es una atrofia hereditaria, que progresa de forma inexorable en la corteza cerebral, que está asociada con un trastorno creciente del proceso mental. La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurosiquiátrica que se presenta principalmente en personas de edad avanzada. La enfermedad se manifiesta por un complejo de síntomas que incluyen, trastornos de la memoria, poder de atención disminuido, trastornos de la orientación, trastornos del habla, trastornos en la capacidad de pensar lógicamente, etc. En los pacientes con Alzheimer se encuentran cambios neurohistológicos característicos, tales como por ejemplo, el depósito de las denominadas placas amiloides y una degeneración de las neurofibrillas en las células nerviosas (denominados "ovillos fibrilares"). Aunque estos cambios son característicos, sin embargo no son de ninguna manera específicos de la enfermedad, puesto que también aparecen en menor grado, en el proceso normal de envejecimiento.
En la actualidad, la AD sólo se puede tratar sintomáticamente y no de forma causal. Hasta la fecha, hay medicamentos que sólo pueden retrasar el curso de la enfermedad, pero que no pueden curarla. El tratamiento terapéutico más importante, lo brinda el grupo de inhibidores de la acetilcolinesterasa cerebral (tacrina®, donepezilo®, rivastigmina®, galantamina®), ya que la transmisión de la señal colinérgica es muy importante para las estructuras relevantes de la memoria que, en el caso de AD están dañadas en gran medida. Sin embargo, los medicamentos sólo se pueden emplear en un estado leve o medio de la enfermedad. Incrementan la concentración de acetilcolina en las sinapsis del cerebro para la transmisión de la información. En caso de un deterioro grave de las neuronas, es decir, en un estado avanzado de la enfermedad, ya no son eficaces. Otras sustancias cuyo uso se está considerando son los estrógenos, los analgésicos no esteroides, los antioxidantes y los factores de crecimiento nervioso (NGF). Sin embargo, ninguno de estos medios es adecuado por su efecto para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Se estima que en la actualidad, aproximadamente un millón de personas en la República Federal de Alemania padece la enfermedad de Alzheimer. Este número aumentará más todavía en los próximos años, debido a que la esperanza de vida aumentará todavía más (F. Kohl, Prax. Naturwiss. Biol. (1999), 48(6), 26-31). Por ello existe una necesidad imperiosa de nuevas sustancias para tratar esta enfermedad.
Los cambios histológicos en el cerebro, característicos de la AD son las llamadas placas amiloides. Son depósitos proteicos patológicos del péptido \beta-amiloide o de la proteína \betaA4 que, por un defecto metabólico, se elimina por separación de un constituyente fisiológico de la membrana celular, la proteína precursora de amiloide (APP). A continuación, se acumula dentro del cerebro, en donde el cuerpo ya no puede degradarla más y aparece en forma de placa (F. Kohl, Prax. Naturwiss. Biol. (1999), 48(6), 26-31; D. J. Selkoe; Trends Cell Biol. (1998), 8, 447-453). El elemento esencial de la placa amiloide es un péptido que comprende 39 a 43 aminoácidos, el denominado \beta-amiloide o A\beta. Este péptido se forma durante el procesamiento de la APP. En los pacientes que padecen la forma hereditaria de AD, se han encontrado mutaciones en los genes que codifican este procesamiento. En los mismos casos se observó un aumento de la producción de A\beta, por lo que se consideró que el procesamiento de la APP podría ser un lugar adecuado para acometer el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La secuencia parcial del tetrapéptido Asn-Pro-Thr-Tyr tiene una función en el procesamiento de la APP. Esta secuencia parcial es reconocida por las proteínas COFE65 y, en particular, FE65, y se supone que estas proteínas están implicadas en la interacción proteína-proteína que es responsable del procesamiento de la APP (documento de patente WO 98/21327). Los agentes que inhiben la interacción de APP - FE65, deberían ser por tanto un valioso recurso para el tratamiento de la AD.
El documento FR2740454 describe fragmentos de péptidos de la FE65 y su clonación. Además, esta publicación describe la capacidad de los péptidos mencionados para la modulación y, en última instancia, la inhibición de la interacción de FE65 con APP.
Algunos compuestos con la estructura básica del tiopéptido de farnesilo ya se conocen.
Eng Wui Tan y col. (J. Am. Chem. Soc. (1991), 113, 6299-6300) y Bryant A. Gilbert (J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 3966-3973) describen los compuestos farnesilcisteína y óxido de farnesilcisteína,
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que son buenos sustratos de la metiltransferasa de proteína isoprenilada.
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La importancia de la prenilación de proteínas para su anclaje en las membranas biológicas, ya se conocía previamente (J. A. Glomset y col., Trends in Biochem. Sciences (1990), 15, 139-142).
Miyakawa y col. (J. Bacteriol. (1982), 151, 1184-1194) describen los compuestos rhodoturocina A (p=0) y rhodoturocina-A-S-óxido (p=1),
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como hormonas sexuales de la célula tipo A de Rhodosporidium toruloides.
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Se encontró sorprendentemente que la cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856, es capaz de formar nuevos compuestos que no sólo inhiben eficazmente la interacción de APP-FE65, sino que también se toleran bien.
El hongo Coniochaeta ellipsoidea Udagawa fue depositado en la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (DSM), Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, Alemania, según las normas del Tratado de Budapest, el 17-11-2000, con el siguiente número de orden: DSM 13856. El hongo posee un micelio de sustrato blanco y muy poco micelio aéreo y en cultivo no forma ninguna fructificación esporígena característica de Coniochaeta.
En lugar de la cepa DSM 13856 también se pueden utilizar sus mutantes y/o variantes, siempre y cuando que sinteticen los compuestos de acuerdo con la invención.
Los mutantes son organismos que pertenecen a la misma especie pero que se diferencian en sus genes y por ello muestran diferentes genotipos ("Genotipo: La constitución genética de un organismo, generalmente en relación con un gen o con unos pocos genes importantes en un contexto particular", McGraw-Hill, Diccionario de términos científicos y técnicos, McGraw-Hill Book Company, N.Y. 1978, página 672).
La preparación de mutantes se describe entre otros en Brock y col. "Biología de microorganismos", Prentice Hall, págs. 238-247 (1994), en donde por ejemplo, medios físicos, p. ej., la irradiación con rayos ultravioletas o rayos X o a través de mutágenos químicos, como p. ej., metanosulfonato de etilo (EMS); 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona (MOB) o N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) pueden inducir mutaciones.
Las variantes en el sentido de la descripción se diferencian en el fenotipo de tipo silvestre ("Fenotipo: Los caracteres observables de un organismo", McGraw-Hill, Diccionario de términos científicos y técnicos, McGraw-Hill Book Company N. Y. 1978, página 1199). Los microorganismos tienen la capacidad de desarrollar distintos fenotipos dependiendo de su entorno: "Los microorganismos tienen la capacidad de adaptarse a los cambios del entorno. Esta capacidad adaptativa es la causa de la flexibilidad fisiológica observada. En la adaptación fenotípica, están implicadas todas las células de una población. Este tipo de cambio no está condicionado genéticamente. Es una modificación reversible bajo condiciones alteradas" (H. Stolp, "Ecología microbiana: organismos, hábitats, actividades", Cambridge University Press, Cambridge, GB, 1988, página 180).
El rastreo en busca de mutantes y variantes que producen los citados compuestos, puede tener lugar mediante la determinación de la actividad biológica del compuesto activo acumulado en el caldo de cultivo o mediante cromatografía de líquida de alto rendimiento (determinación con HPLC).
Como fuentes de carbono para la fermentación son adecuados, por ejemplo, los carbohidratos y los alcoholes de azúcar asimilables, tales como, glucosa, lactosa, sacarosa o D-manitol, así como productos naturales que contienen carbohidratos, como p. ej., extracto de malta o extracto de levadura. Como nutritivas que contienen nitrógeno se consideran, por ejemplo, los aminoácidos, los péptidos y las proteínas, así como sus productos de degradación, como caseína, peptona o triptona, además extractos de carne, extractos de levadura, semillas molidas, por ejemplo, de maíz, de trigo, frijoles, soja o de la planta del algodón, residuos de la destilación de la preparación de alcohol, harinas de carne o extractos de levadura, y también sales de amonio y nitrato, especialmente también péptidos obtenidos de forma sintética o biosintética. La solución nutritiva puede contener como sales inorgánicas, por ejemplo, cloruro, carbonato, sulfato o fosfato de metales alcalinos o alcalinotérreos y como oligoelementos, hierro, zinc, cobalto, molibdeno, boro, vanadio y manganeso.
El medio de cultivo contiene preferentemente extracto de malta, extracto de levadura, glucosa, almidón, copos de avena y/o glicerol, se prefiere especialmente en porcentajes de 0,05 a 5%, preferentemente 1 a 2% de extracto de malta, 0,05 a 3%, preferentemente 0,05 a 1% de extracto de levadura, 0,2 a 5%, especialmente 0,5 a 2% de glucosa y 0,5 a 3%, preferentemente 1,5% a 3% de copos de avena, en cada caso referidos al peso de la solución nutritiva total.
El cultivo del microorganismo se realiza preferentemente de forma aerobia, es decir por ejemplo, se sumerge mientras que se agita en frascos de agitación o fermentadores, o bien en medio sólido, eventualmente introduciendo aire u oxígeno. El cultivo se puede realizar en un intervalo de temperatura desde aproximadamente 15 a 35ºC, preferentemente desde aproximadamente 20 a 35ºC, en especial aproximadamente de 25 a 30ºC. El intervalo del pH del cultivo puede estar entre 3 y 10, preferentemente entre 6,5 y 7,5. Los microorganismos se cultivan bajo estas condiciones en general durante un período de 48 a 960 horas, preferentemente 72 a 720 horas. De forma ventajosa, el cultivo se realiza en una variedad de etapas, es decir, primero se preparan uno o varios precultivos en un medio de cultivo líquido que, a continuación, se inoculan en el medio de producción real, el cultivo principal, por ejemplo, en una proporción en volumen de 1:10-1:100. El precultivo se obtiene, por ejemplo, inoculando un micelio en una solución nutritiva y permitiéndole crecer durante aproximadamente 20 a 120 horas, preferentemente 48 a 72 horas. El micelio se puede obtener por ejemplo, dejando crecer la cepa durante aproximadamente 1 a 40 días, preferentemente 21 a 35 días, sobre un medio nutritivo sólido o líquido, por ejemplo, levadura-agar de malta, agar de copos de avena o agar de dextrosa de patata.
El curso de la fermentación y la formación de los citados compuestos se puede supervisar de acuerdo con métodos conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo sometiendo a ensayo la actividad biológica con bioensayos o mediante métodos cromatográficos, tales como cromatografía en capa fina (DC) o cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).
La cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856, produce, además de ello, un derivado de ácido tetrámico, denominado coniosentina, de la fórmula (VI)
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que asimismo inhibe la interacción de APP-FE65.
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Si no se indica otra cosa, centros de quiralidad en el compuesto de la fórmula (VI) puede presentarse en la configuración R o en la configuración S, en forma de compuestos ópticamente puros o en forma de mezclas de estereoisómeros, tales como mezclas de enantiómeros y mezclas de diastereoisómeros.
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De preferencia, el compuesto de la fórmula (VI) posee la estereoquímica mencionada en la fórmula (VIA):
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Para la obtención de coniosentina de la fórmula (VI) se fermenta Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856, coincidiendo la temperatura de fermentación, el valor del pH y los componentes del medio de cultivo con los datos mencionados para la obtención de coniosulfuro y derivados de coniosulfuro, a continuación se extrae y se aísla. A continuación, coniosentina de la fórmula (VI) se puede transformar, opcionalmente, en un equivalente químico evidente y/o una sal farmacológicamente aceptable.
Equivalentes químicos evidentes de los compuestos de las fórmulas (VI) y (VIA) son compuestos que presentan una ligera diferencia química, es decir, tienen la misma actividad o se convierten, bajo condiciones suaves, en los compuestos de acuerdo con la invención. A los equivalentes antes mencionados pertenecen, por ejemplo, ésteres, azometinas, (bases de Schiff), productos de la hidrogenación, productos de reducción, complejos o aductos del o con los compuestos de acuerdo con la invención que se preparan según métodos conocidos por la bibliografía (J. March, Advanced Organic Síntesis, 4ª edición, John Wiley & Sons, 1992).
Dobles enlaces en la cadena de alquilo en compuestos de las fórmulas (VI) y (VIA) se pueden reducir, por ejemplo, por hidrogenolisis o según otros métodos, en sí conocidos, por ejemplo descritos por P.N. Rylander en "Hydrogenation Methods", Academic Press, Nueva York (1985), Capítulo 2, o por H.O. House en "Modern Synthetic Reactions", W.A. Benjymin, Inc. Nueva York (1972), páginas 446-452. Los dobles enlaces pueden oxidarse, además, en epóxidos, por ejemplo mediante ácido meta-cloroperbenzoico (MCPBA; J. March, Advanced Organic Síntesis, 4ª edición, John Wiley & Sons, 1992).
Los compuestos de las fórmulas (VI) y (VIA), así como los equivalentes químicos evidentes de los mismos se pueden transformar, según métodos conocidos por el experto en la materia, en las correspondientes sales fisiológicamente aceptables.
Por sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de acuerdo con la invención se entienden tanto sales inorgánicas como sales orgánicas, tales como se describen en Remingtons Pharmaceutical Sciences (17ª edición, página 1418 [1985]). Como sales entran en consideración, en particular, sales de metales alcalinos, de amonio, de metales alcalinotérreos, sales con aminas fisiológicamente aceptables y sales con ácidos inorgánicos u orgánicos, tales como, por ejemplo, HCl, HBr, H_{2}SO_{4}, ácido maleico, ácido fumárico.
Coniosetina y derivados de coniosetina, un procedimiento para su preparación por fermentación de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856, y el uso de coniosetina y derivados de coniosetina como medicamentos se describen en la solicitud de patente alemana número DE 10060810.8.
Se ha encontrado que los compuestos de las fórmulas (VI) y (VIA) presentan una fuerte inhibición de la interacción proteína precursora amiloide - FE65, por lo tanto se adecuan para el tratamiento y profilaxis de neuropatías degenerativas y de la enfermedad de Alzheimer. La inhibición de la interacción proteína precursora amiloide - FE65 por parte de coniosetina asciende a CI_{50} = 28 \muM.
Un objeto de la invención es, por tanto, el uso de un compuesto de fórmula (VI), preferentemente de fórmula (VIA), para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de la enfermedad de Alzheimer.
Dicho medicamento se prepara mezclando al menos un compuesto de fórmula (VI) con al menos un vehículo y/o un agente auxiliar fisiológicamente adecuados y dándole una forma de administración adecuada.
Los citados medicamentos se pueden emplear de forma entérica (oral), parenteral (intramuscular o intravenosa), rectal o local (tópica). Se pueden administrar en forma de soluciones, polvos, tabletas, cápsulas que incluyen microcápsulas, ungüentos, cremas, geles o supositorios. Como vehículos o sustancias auxiliares fisiológicamente adecuadas para esas formulaciones, se consideran las cargas líquidas o sólidas y los diluyentes farmacéuticamente adecuados, disolventes, emulsionantes, lubricantes, correctores del sabor, colorantes y/o sustancias tampón.
Como dosis adecuadas se administran 0,1 - 1000, preferentemente 0,2 - 100 mg/kg de peso corporal. Se administran convenientemente en unidades de dosificación que, por ejemplo, contienen la cantidad diaria eficaz de los citados compuestos, p. ej., 30 - 3000, preferentemente 50 - 1000 mg.
Los siguientes ejemplos pretenden explicar la invención con mayor detalle.
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Ejemplo 1
Preparación de un cultivo de glicerol de Coniochaeta ellipsoidea, DSM 13856
30 mL de solución nutritiva (extracto de malta al 2,0%, extracto de levadura al 0,2%, glucosa al 1,0% (NH_{4})_{2}HPO_{4} 0,05%, pH 6,0) en un matraz Erlenmeyer estéril de 100 mL se inoculan con la cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856, y se incuban durante 6 días, a 25ºC y 140 rpm en un agitador giratorio. A continuación, se diluyen 1,5 ml de este cultivo con 2,5 ml de glicerol al 80% y se almacenan a -135ºC.
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Ejemplo 2
Preparación de un precultivo en matraces Erlenmeyer de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856
100 mL de solución nutritiva (extracto de malta al 2,0%, extracto de levadura al 0,2%, glucosa al 1,0%
(NH_{4})_{2}HPO_{4} al 0,05%, pH 6,0) en un matraz Erlenmeyer estéril de 300 ml se inoculan con la cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856, y se incuban durante 4 días, a 25ºC y 140 rpm en un agitador giratorio. 2 ml de este precultivo se emplean a continuación para la preparación de los cultivos principales.
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Ejemplo 3
Preparación de un cultivo principal de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856, sobre placas con medio sólido
En 30 placas estériles de 22 x 22 cm, se vierte en cada una 200 ml de una solución nutritiva que contiene 20 g/l de extracto de malta, 20 g/l de copos de avena, 2% de agar y pH 7,0. Estas placas se inoculan con 2 ml de un precultivo de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa, DSM 13856, obtenido según el Ejemplo 2, y se incuban a 25ºC. La producción máxima de uno o de varios compuestos de la coniosetina de acuerdo con la invención, se alcanza después de aproximadamente 676 horas.
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Ejemplo 4
Aislamiento de coniosetina
Se liofilizan 30 placas de agar, en cada caso con un tamaño de 25 x 25 cm, obtenidas según el ejemplo 3, y se extraen con 2,5 litros de metanol. La fase líquida transparente se concentra en vacío hasta 100 mL, se diluye con agua y se incorpora en una columna de 580 mL de capacidad, cargada con la resina de adsorción MCI Gel® CHP20P. Dimensiones de la columna; anchura x altura: 5 cm x 30 cm. Se eluye con un gradiente de disolvente de acetonitrilo al 5% en agua hasta acetonitrilo al 90% y el líquido que sale de la columna (40 mL/minuto) se recoge en fracciones de en cada caso 120 mL. Las fracciones que contienen coniosetina, que se examinan mediante análisis con HPLC, se reúnen y se concentran a vacío, así como se liofilizan (0,3 g).
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Ejemplo 5
Cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) de la coniosetina
Columna:
Superspher 100 RP-18e®, 250-4, con precolumna,
Fase móvil:
75% de acetonitrilo en ácido fosfórico al 0,1%,
Caudal:
1 mL por minuto,
Detección mediante absorción de UV a 210 nm.
El tiempo de retención de coniosetina asciende a 13,6 minutos.
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Ejemplo 6
Purificación final de la coniosetina
El antibiótico coniosetina enriquecido (0,3 g), obtenido según el Ejemplo 4, se fracciona sobre una columna de HPLC LiChrospher® 100 RP-18e (5 \mum, ancho x alto = 2,5 cm x 25 cm) en un procedimiento de gradiente con 75% a 100% de acetonitrilo en ácido acético al 0,05%. Caudal: 30 mL/min. Tamaño de la fracción: 60 mL. Las fracciones analizadas por HPLC analítica (véase, el Ejemplo 5), se combinan según su contenido en coniosetina, se concentran a vacío y se liofilizan. Se obtienen 170 mg de coniosetina con un 98% de pureza.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7
Caracterización de la coniosetina Determinación del pico molar
A la molécula buscada se le asocia la masa 413 en virtud de los hallazgos siguientes: El espectro ESI^{+}, así como los espectros FAB^{+} muestran picos a 414 uma (M+H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Resolución elevada del ión casi molécula
Bajo condiciones FAB con una matriz de alcohol nitrobencílico se observa, entre otros, un pico a 414-2645 uma. La exactitud de masa presente en la medición es de aprox. 5 ppm. El valor medido se corresponde bien con la composición elemental calculada para C_{25}H_{36}NO_{4} = 414.2644 uma. En el caso de esta composición elemental están presentes 9 equivalentes de dobles enlaces.
Las propiedades físico-químicas y las propiedades espectroscópicas del antibiótico de acuerdo con la invención se pueden resumir del modo siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Apariencia
Sustancia de incolora a amarilla pálida, soluble en disolvente medio polar y orgánico polar, y poco soluble en agua. Estable en medio neutro y ligeramente ácido, pero inestable en solución fuertemente ácida y fuertemente alcalina.
Fórmula empírica: C_{25}H_{35}NO_{4}
Peso molecular: 413,56
^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN: véanse las Tablas 6 y 7
Máximo de UV: 233 nm, 288 nm
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 6 Desplazamientos químicos de ^{1}H y ^{13}C de coniosetina en DMSO-d_{6} y metanol-d_{4} a 300 K
6
TABLA 7 Desplazamientos químicos de ^{1}H y ^{13}C de coniosetina en CDCl_{3} a 300 K
7 
\newpage
Ejemplo 11
Ensayo de inhibición de la interacción de APP - FE65 Reactivos y fuentes de suministro
HEPES,
Sigma, H-9136,
NaCl,
Riedel de Haen, 31434,
EDTA,
Sigma, E-1644,
CHAPS,
Sigma, C-5849,
KF,
Sigma, P-1179,
BSA,
Sigma, A-9647
anticuerpo monoclonal anti GST
marcado con XL665,
CIS bio Intern., D11/459/12/47270;
estreptavidina marcada con Eu-criptato,
CIS bio Intern., D11/450/12/47269;
cAPP de 32 meros,
Sigma, E2533;
Biotina-cAPP,
Aventis SA, Vitry.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón A
HEPES 10 mM, pH 7,2 + NaCl 150 mM + EDTA 3,4 mM + 0,184 g/L de CHAPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón B
HEPES 100 mM, pH 7,0 + KF 400 mM + EDTA 133 mM + 1 g/L de BSA.
\vskip1.000000\baselineskip
Realización
1 \mul de la solución que se va a ensayar se pipetea junto con cAPP de 32meros 30 \muM en tampón A en una placa de microtitulación. A continuación se añadió 1 \mul de biotina-cAPP (10 nM, disuelto en tampón A). Después de incubar durante 15 minutos, se añadió 1 \muL de GST-PTB2 (20 nM en tampón A) y se incubó de nuevo durante 15 minutos. A continuación se añadieron 4 \mul de mezcla de anticuerpo (estreptavidina marcada con Eu-criptato, 2 ng por pocillo; anticuerpo monoclonal anti GST marcado con XL665, 25 ng en tampón B).
Después de 30 minutos a temperatura ambiente, se midió la señal de emisión de la transferencia de energía y la señal de europio en un ultrafotómetro Tecan, a 665 nm y 615 nm, después de haber activado la solución del ensayo con luz de una longitud de onda de 340 nm. Para la inhibición de la interacción de la proteína precursora de amiloide - FE65, se encontró: CI_{50} = 28 \muM.

Claims (2)

1. Compuesto de Fórmula (VI)
8
para el tratamiento y profilaxis de la enfermedad de Alzheimer.
2. Compuesto de la fórmula (VI) según la reivindicación 1, caracterizado por el compuesto de fórmula (VIA)
9
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