ES2327103T3 - Vacuna viva de influenzavirus y procedimiento de fabricacion. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de fabricación de una vacuna de virus entero, preferiblemente una vacuna viva atenuada, que comprende las etapas de: a) infección de células de riñón de mono verde africano (Vero) con un virus deseado, en el que las células Vero se han hecho crecer en y separadas de un medio exento de suero que también está exento de proteínas no séricas; b) combinar las células infectadas con un medio de cultivo celular exento de suero adecuado, que también está exento de proteínas no séricas; c) incubar las células en dicho medio; d) recoger virus infecciosos recogiendo el líquido sobrenadante que contiene virus obtenido de centrifugación y/o filtración del cultivo celular; y e) preparar una vacuna de los mismos, que comprende someter el líquido sobrenadante que contiene virus a al menos una etapa de procesamiento seleccionada del grupo que consiste en concentrar, congelar, liofilizar y estabilizar la adición de un agente estabilizante, caracterizado porque el medio exento de suero y proteínas al que se hace referencia en la etapa (b) se complementa con una proteasa y una nucleasa, y la incubación en la etapa (c) se lleva a cabo en presencia tanto de dicha proteasa como de dicha nucleasa, para permitir la producción de virus infeccioso, y simultáneamente, para la digestión del material de ácido nucleico liberado al medio de cultivo celular; y porque dicha al menos una etapa de procesamiento para preparar una vacuna a partir del líquido sobrenadante que contiene virus no implica una etapa de separación de proteínas o purificación de proteínas, dando así como resultado dicha vacuna de virus entero en su forma lista para usar.
Description
Vacuna viva de influenzavirus y procedimiento de
fabricación.
La presente invención está en el campo de la
virología y el desarrollo de vacunas y se refiere a un procedimiento
mejorado para la fabricación de una vacuna vírica, en particular
una vacuna de virus entero, preferiblemente de una vacuna viva
atenuada y a vacunas que se pueden obtener por dicho
procedimiento.
El antígeno de la hemaglutinina (HA) de
influenzavirus es la diana principal para las respuestas
inmunitarias protectoras de un huésped frente al virus.
La práctica habitual de recuperar aislados
víricos nuevos implica la recuperación de un hisopo nasal o de
garganta o de una fuente similar, seguido del cultivo de los
aislados en huevos de pollo embrionados. El virus se adapta a su
huevo huésped y se puede llevar a cabo la producción a gran escala
del virus en huevos. Sin embargo, dicha metodología convencional
que implica huevos de pollo embrionados para producir la vacuna de
influenza, es extremadamente engorrosa, e implica la manipulación de
muchos miles de huevos por semana así como la purificación
extensiva de la suspensión de virus derivada del fluido alantoico
para asegurar la libertad respecto a la proteína del huevo.
Otra desventaja del uso de embriones de pollo
para la producción de virus está en el hecho de que este sustrato
favorece mucho la selección de variantes de virus que difieren en su
especificidad de antígeno del virus salvaje, y no es raro que de
como resultado virus que pueden no ser adecuados para la producción
de vacunas debido a sus fenotipos alterados, incluyendo, por
ejemplo, una reducción considerable de inmunogenicidad.
Por lo tanto, en la técnica se han hecho muchos
intentos de usar la tecnología del cultivo tisular estándar con
líneas celulares de mamíferos establecidas, tales como células MDCK
(riñón canino Madin-Darby) o Vero (riñón de mono
verde africano), para producir virus, en particular para producir
influenzavirus.
Una de las dificultades de hacer crecer cepas de
influenzavirus en cultivos de células tisulares surge de la
necesidad de la escisión proteolítica de la hemaglutinina de
influenzavirus en la célula huésped. Aunque la escisión del
precursor de HA vírico en los subfragmentos HA1 y HA2 no es
necesaria para el montaje de los elementos víricos para formar un
virión completo, sin embargo, si es necesaria para hacer al virión
infeccioso, es decir, para permitir que infecte una célula
nueva.
Se ha descrito (p. ej., Lazarowitz y col.,
"Enhancement of the Infectivity of Influenza and B Viruses by
Proteolytic Cleavage of the Hemagglutinin Polypeptide",
Virology, 68:440-454, 1975) que la
replicación limitada de varias cepas de influenzavirus A en
cultivos de células estándar podría superarse mediante la adición de
proteasas como la tripsina, al medio de cultivo tisular. Aunque
todavía quedan dificultades en algunos casos, por ejemplo cuando se
usan células Vero.
Kaverian y Webster (J. Virol.
69/4:2700-2703, 1995) describen que en los cultivos
de células Vero, y de forma menos pronunciada en cultivos de
células MDCK, de riñón de cerdo, o de riñón de mono rhesus, la
actividad de la tripsina en el medio disminuía rápidamente desde el
inicio de la incubación, dando como resultado el fracaso en la
acumulación de virus en el medio debido a la falta de producción de
un número suficiente de viriones infecciosos. Concluyeron que las
células Vero liberaban un factor de inhibición de la tripsina.
Además, mostraron que mediante la adición repetida de tripsina,
podía reanudarse y mantenerse la reproducción de virus durante una
serie de ciclos de reproducción, dando como resultado un rendimiento
de virus mucho mejor.
Se describía otro modo de producción eficaz de
vacunas en el documento US 5.753.489 en el que se usaba medio
exento de suero para la propagación de virus en una serie de células
de mamífero diferentes, que incluían células MDCK y Vero. El
procedimiento descrito en el mismo comprende hacer crecer células de
vertebrados en medio exento de suero, infectar el cultivo celular
con un virus, incubar el cultivo celular infectado con el virus,
separar una parte del medio que contiene virus y poner en contacto
esta parte con una proteasa, añadiendo después a esta porción un
inhibidor de proteasa y devolviendo esta porción al cultivo celular.
En dicho documento, se prefiere proporcionar las etapas de
crecimiento, infección e incubación en un primer recipiente, y las
etapas de poner en contacto con la tripsina y añadir inhibidor, se
llevan a cabo en un segundo recipiente conectado con el primer
recipiente en un bucle, de modo que las etapas se pueden realizar en
un ciclo cerrado. Este sistema permite usar la tripsina u otras
enzimas proteolíticas en concentraciones mucho mayores que las que
toleran normalmente las células en cultivo.
Kistner y col. (Vaccine
16(9/10):960-968, 1998) describen un sistema
de cultivo celular exento de suero, adaptado a células Vero para la
producción a gran escala de la vacuna de influenzavirus.
Desarrollaron un esquema de purificación complejo y de múltiples
etapas que daba como resultado una vacuna de virus entero de alta
pureza. El procedimiento descrito en dicho documento comprende
inocular en cultivos de células Vero diferentes influenzavirus,
incubar los cultivos celulares infectados en presencia de tripsina,
recoger el líquido sobrenadante que contiene virus del cultivo
celular y posteriormente purificar el líquido sobrenadante que
contiene virus mediante varias etapas de purificación que comprenden
clarificar el líquido sobrenadante del cultivo celular mediante el
uso de un separador, tratamiento con Benzoasa, inactivación con
formalina, concentración por ultracentrifugación, clarificación por
precipitación, purificación en un gradiente de sacarosa continuo al
0-50%, someter a ultracentrifugación y
filtración
estéril.
estéril.
El documento EP 0870508 describe un
procedimiento para producir una vacuna de antígeno vírico que
comprende infectar una línea de células animales, opcionalmente una
línea de células Vero, con virus, propagar el virus en el cultivo
celular, añadir una enzima nucleasa al cultivo celular justo antes
del final de la propagación del virus para digerir el material de
ácido nucleico liberado de las células huésped que sufren lisis,
recoger el virus y obtener antígenos víricos de los mismos mediante
extracción con el fin de hacer la vacuna de antígeno vírico. La
patente no dice nada con respecto al tipo de medio nutriente usado
para la propagación de virus ni tampoco con respecto a la adición
de una proteasa, que normalmente es necesaria para el procesamiento
final de la hemaglutinina del influenzavirus para lograr el virus
infeccioso. El procedimiento requiere además varias etapas de
purificación para proporcionar una preparación de vacuna lista para
usar.
Sin embargo, se sabe que la naturaleza del
sustrato huésped así como la composición del medio nutriente usado
para la propagación de virus puede afectar significativamente a la
inmunogenicidad y antigenicidad de la progenie vírica obtenida con
los mismos. En particular, el medio que contiene suero puede, no
solo disminuir la antigenicidad de la progenie vírica, si no además
puede disminuir la actividad de proteasa en el medio, y por lo tanto
inhibir la maduración de virus, y posteriormente requiere etapas
caras para la purificación.
La presente invención supera los inconvenientes
de la técnica anterior. Se refiere a un procedimiento sencillo y
eficaz para aislar virus de diferentes fuentes y para producir
progenie vírica para usar como vacunas, en particular vacunas de
influenzavirus vivos atenuadas, en condiciones en las que las
alteraciones en los antígenos de superficie del virus debido a la
selección adaptativa, se minimizan o se evitan completamente.
Un objetivo de la presente descripción también
es proporcionar un procedimiento para la producción de virus, en
particular de influenzavirus, que de una progenie vírica que
aglutine selectivamente eritrocitos humanos pero no eritrocitos de
pollo y que preferiblemente tenga propiedades antigénicas idénticas
a las de la cepa de virus inoculada inicialmente, p. ej., un
aislado salvaje clínico primario.
La secuencia de ácido nucleico del gen de HA y
opcionalmente del gen de NA del virus propagado es idéntica a la de
la cepa inicialmente inoculada (p. ej., una cepa epidérmica, aislado
clínico primario de un paciente infectado).
Otro objetivo de la invención es proporcionar un
procedimiento para la producción eficaz de una vacuna de virus
entero, particularmente una vacuna viva atenuada, en un
procedimiento de una etapa, que no necesita ninguna etapa
cromatográfica u otras etapas de purificación de la suspensión de
virus recogida del líquido sobrenadante del cultivo celular por
centrifugación, en particular etapas de separación o purificación de
proteínas.
Otro objetivo más de la invención es
proporcionar cepas A y B de influenzavirus sensibles a la
temperatura y adaptadas al frío, y atenuadas, y vacunas hechas con
las mismas.
la fig. 1 es una ilustración gráfica del curso
del tiempo de la inactivación de la tripsina en el líquido
sobrenadante en un cultivo de células Vero;
la fig. 2 es una ilustración gráfica del curso
del tiempo de la inactivación de la tripsina en el líquido
sobrenadante de un cultivo de células MDCK.
Los experimentos comparativos usando huevos
embrionados, células MDCK y Vero demostraron claramente que el
virus inicialmente inoculado es probable que experimente alteración
antígena durante el crecimiento en uno cualquiera de esos
sustratos.
Los experimentos de los autores de la invención
confirmaron que las alteraciones son mínimas o incluso están
ausentes para las cepas de influenzavirus hechas crecer en células
Vero en medio exento de suero. Además, resultó que los
influenzavirus A, al menos las cepas del subtipo H3N2, cuando se
multiplicaban en células Vero en medio exento de suero y exento de
proteínas, presentaban una selectividad para la aglutinación de
eritrocitos humanos, pero no para lo eritrocitos de pollo. Además,
tampoco crecían en huevos. Esto era una primera indicación de que
estos virus hechos crecer en Vero pueden ser más similares a los
virus salvajes del correspondiente aislado clínico que los que se
han hecho crecer en células MDCK o huevos.
Realmente, la comparación de las secuencias de
genes de HA y NA de aislados salvajes obtenidos de hisopos nasales,
con las de los mismos virus después de crecer en células Vero y
MDCK, respectivamente, puso de manifiesto alteraciones de HA o NA
de los virus hechos crecer en MDCK con respecto a HA o NA de los
aislados de hisopos o de los virus hechos crecer en Vero o de los
virus tanto de aislados de hisopos como hechos crecer en Vero.
Además, los datos experimentales obtenidos de
inmunizaciones de hurones con virus salvajes hechos crecer en Vero
y MDCK indican una virulencia mucho mayor de los virus hechos crecer
en Vero comparado con los virus hechos crecer en MDCK. También se
demostró que la inmunogenicidad de los virus hechos crecer en Vero
ensayados en un ensayo de animales en macacos, era
significativamente superior a la de los virus hechos crecer en
células MDCK o en huevos.
Estos descubrimientos juntos proporcionan una
prueba importante de la hipótesis de que el procedimiento de
multiplicación y propagación de virus de acuerdo con la presente
invención, como se describe en lo sucesivo con más detalle, da
virus que no están alterados comparado con los virus inicialmente
inoculados (p. ej., salvaje) o están modificados solo en una
extensión menor.
No solo el evitar las alteraciones antígenas
hacen que el presente procedimiento de multiplicación de virus sea
tan único, si no también la sorprendente simplicidad, que lo hace
extremadamente adecuado para la producción de vacunas a gran escala
industrial.
Experimentos adicionales han demostrado que la
fuente de tripsina (o tripsinógeno) puede ser un factor adicional
que influye en el rendimiento global de los viriones infecciosos. De
hecho, aunque los procedimientos conocidos en la técnica (p. ej.,
Kaverin y Webster, J. Virol. 69/4:2700-2703,
1995; o el documento US 5.753.489) usan la adición repetida de
tripsina (Kaverin y Webster) o altas concentraciones de tripsina
(documento US 5.753.489), el procedimiento de acuerdo con la
presente invención aplica solo la mitad o menos de las
concentraciones de tripsina descritas en la técnica anterior.
Además, una sola adición de tan poco como 0,5-10
\mug, preferiblemente 2-5 \mug de tripsina por
ml de medio de cultivo celular antes o al principio de la incubación
de las células huésped infectadas, es suficiente para alcanzar los
títulos de virus infecciosos óptimos. Los experimentos de
inactivación pusieron de manifiesto que las tripsinas recombinantes
porcinas o humanas son mucho menos susceptibles a la inactivación
por las células Vero o MDCK que la tripsina bovina. Puesto que la
tripsina bovina es la más habitualmente usada en la técnica, es
bastante probable que la bibliografía de la técnica anterior, salvo
que mencione explícitamente otra fuente de tripsina, se refiera
implícitamente solo a tripsina bovina. Esto también ayudaría a
explicar los modos y las concentraciones de aplicación de tripsina
citadas, por ejemplo en Kaverin y col, y en el documento US
5.753.489.
Por lo tanto, el uso de tripsinógeno o tripsina
rec. humana o porcina para complementar inicialmente el medio
exento de suero para los cultivos de células Vero de acuerdo con la
presente invención, permite usar concentraciones de tripsinógeno o
tripsina extremadamente bajas y por lo tanto evita la necesidad de
etapas trabajosas y costosas después de recoger el líquido
sobrenadante que contiene virus.
Otra etapa que contribuye a hacer el presente
procedimiento sencillo y por lo tanto atractivo para los fabricantes
de vacunas, es la adición de una sola dosis de endonucleasa
altamente activa al medio de cultivo celular antes o al principio
de la incubación de las células Vero infectadas, para la
propagación. Esta endonucleasa, preferiblemente Benzonase^{TM},
se añade una vez al medio con una concentración inicial muy baja de
2-30 preferiblemente 5-15 unidades
por ml de medio, y limpia eficazmente el medio de cultivo celular de
ADN y ARN libre que se origina principalmente a partir de las
células huésped que están sufriendo lisis o lisadas. La
concentración de enzima Benzonase residual en las preparaciones de
vacuna listas para usar obtenidas de los líquidos sobrenadantes
centrifugados permanece en 5 ng o menos por dosis.
La Benzonase^{TM} es una marca registrada de
Nycomed Pharma A/S Dinamarca, y se refiere a una endonucleasa
extracelular no específica obtenida de Serratia marcescens.
La Benzonase es una endonucleasa genéticamente diseñada que degrada
las cadenas tanto de ADN como de ARN en muchas formas a
oligonucleótidos pequeños. Promueve la reducción rápida de la
viscosidad de los lisatos celulares, lo cual facilita la
ultracentrifugación. Reduce la proteolisis y aumenta el rendimiento
de la proteína diana y ofrece la eliminación completa de ácidos
nucleicos de, por ejemplo, las proteínas recombinantes. Tiene una
actividad excepcionalmente alta de 400.000 U/mg.
Una tercera e importante ventaja del presente
procedimiento es el factor tiempo y por lo tanto los costes del
procedimiento. Debido al uso de medio exento de suero que no
contiene proteínas de origen animal y preferiblemente no contiene
antibióticos, los procedimientos de purificación caros y que
requieren mucho tiempo se pueden reducir a un mínimo o incluso se
pueden evitar totalmente. Además, debido a que la adición de enzimas
exógenas tales como la proteasa (p. ej., tripsina o tripsinógeno) y
nucleasa (p. ej., Benzonase) se produce una vez al principio de la
fase de propagación de virus, ahorra mucho tiempo, que los
procedimientos de la técnica actual requieren para el tratamiento
después de incubación en el líquido sobrenadante del cultivo que
contiene virus (p. ej., activación de HA, digestión de ARN/ADN,
purificación de proteína, etc.).
Sorprendentemente, resulta que la adición
temprana de una o ambas proteasas (p. ej., tripsina o tripsinógeno)
y nucleasa (p. ej., Benzonase) al cultivo de células Vero infectadas
por virus no tiene implicaciones negativas en el rendimiento del
virus, lo cual se debe probablemente a las concentraciones de enzima
muy bajas que se pueden aplicar en el procedimiento de la presente
invención.
\newpage
El presente procedimiento de propagación de
virus es útil para la manipulación de diferentes tipos de virus, en
particular influenzavirus A del subtipo H3N2, pero también es
adecuado para el aislamiento y la reproducción de cualquier cepa de
influenzavirus epidémica o de laboratorio, independientemente del
tipo de inóculo de virus (p. ej., muestra de suero de sangre,
lavado nasal, hisopo nasal, raspado faríngeo, saliva, etc.). Usando
los principios de este procedimiento, se ha producido una serie de
vacunas de influenzavirus A y B, que son parte de la presente
invención y que se caracterizan con más detalle en los siguientes
Ejemplos.
También se han confirmado la eficacia protectora
así como la seguridad de la vacuna para las vacunas hechas de
acuerdo con la presente invención, como se demostrará en los
Ejemplos.
La expresión "exento de proteínas" o
"exento de proteínas no séricas" tal como se usa en el presente
documento en relación con el procedimiento de multiplicación o
propagación de virus de acuerdo con la presente invención,
significará exento de cualquier proteína funcionalmente activa. Sin
embargo, no deben excluirse péptidos no funcionales que pueden
originarse de hidrolisatos de proteínas, tales como extracto de
levadura o extracto de soja. Salvo que se indique lo contrario, la
expresión "exento de proteínas" no excluirá tampoco la
presencia de una proteasa y una enzima nucleasa a las
concentraciones descritas y reivindicadas en el presente
documento.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un procedimiento sencillo, fiable y muy
económico para la fabricación de una vacuna de virus entero,
preferiblemente de una vacuna viva atenuada, como se reivindica en
la reivindicación 1.
Se prefiere que el virus usado para la
propagación no haya tenido nunca ningún contacto con un sustrato
huésped distinto de una línea de células Vero. Esto asegurará
mejores resultados con respecto a la identidad inmunógena y
antígena del virus inicial (p. ej., aislado de hisopo nasal) y de la
progenie vírica obtenida después de propagación.
También se prefiere que el virus usado para la
propagación, en particular para la fabricación de una vacuna de
virus entero, preferiblemente una vacuna viva atenuada de
influenzavirus, sea un influenzavirus seleccionado del grupo que
consiste en las cepas A/Sing/1/57ca, A/Sing/1/57ca/\DeltaNS 87,
A/Sing/1/57ca/\DeltaNSPR8, A/Sing/1/57ca/NS124PR8,
B/Vienna/T/99ca; B/Vienna799/ca37 y cualquier variante y
reagrupación atenuada derivados de una cualquiera de estas cepas.
Las características genéticas de las cepas de virus preferidas, p.
ej. cepas madre, se describen con gran detalle en los siguientes
Ejemplos.
En otra realización, la presente invención se
refiere a la propia vacuna de virus entero, preferiblemente a una
vacuna viva atenuada, que en su forma lista para usar comprende
líquido sobrenadante que contiene virus, opcionalmente filtrado y/o
concentrado, esencialmente no modificado, de un cultivo de células
Vero exento de suero y exento de proteínas, usado para la
producción de dicho virus. Se prefiere en particular que la vacuna
se produzca de acuerdo con el procedimiento de la presente invención
como se describe y reivindica en el presente documento.
Esta vacuna de "una etapa" que no requiere
procesamiento adicional, p. ej., etapas de purificación distintas
de la centrifugación y/o filtración convencional (es decir, no
filtración en gel), satisface los requisitos para la aprobación de
la FDA.
La expresión "esencialmente no modificado"
como se usa en el presente documento con respecto al líquido
sobrenadante que contiene virus en preparaciones de vacunas de
acuerdo con la presente invención se referirá a la composición del
líquido sobrenadante como está en el momento de la recolección del
virus propagado, es decir, a la composición de los componentes e
ingredientes solubles presentes en la fase líquida del líquido
sobrenadante. Las alteraciones menores de la composición de los
ingredientes, que pueden ocurrir debido a las etapas, por ejemplo,
de filtración, filtración estéril, centrifugación, concentración,
secado o liofilizado, del líquido sobrenadante que contiene virus,
debe considerarse que están dentro del campo de "esencialmente no
modificado". Además, la expresión no excluirá la presencia de
agentes conservantes y/o estabilizantes aplicados habitualmente en
la técnica, en la preparación de vacunas.
Las vacunas de virus enteros de la presente
invención se pueden usar para el tratamiento profiláctico o
terapéutico de infecciones víricas, en particular de infecciones
por influenzavirus. Se pueden administrar como se conoce en la
técnica, p. ej., por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, o
lo más preferiblemente intranasal. Sin embargo, las cepas de virus
descritas en el presente documento y las vacunas hechas con las
mismas, también se pueden usar como vectores o lanzaderas de
antígenos heterólogos presentes, al sistema inmunitario, p. ej.,
antígenos de proteínas de la envuelta vírica tales como antígenos de
VIH-1 o de virus de la hepatitis.
Las realizaciones preferidas adicionales se
definen en las reivindicaciones dependientes.
Con el fin de que la invención descrita en el
presente documento se pueda entender mejor, se presentan los
siguientes ejemplos.
\newpage
Ejemplo
1
Medio SF: DMEM (Biochrom F0435), Ham F12
(Biochrom F0815), L-Gln 5 mM, 0,1% de complemento SF
(a) o (b); antibióticos (solo para el primer pase del aislamiento
de virus).
Complemento SF: hidrolisato de proteína de
origen no animal, sin proteínas funcionales tales como insulina,
transferrina o factores de crecimiento:
a) 62,5 g de hy-soy/UF, Quest
5X59100, hasta 500 g de agua HQ, filtrado con filtro PES de 0,2
\mum;
b) 12,5 g de hy-pep 1510, Quest,
hasta 100 g de agua HQ, filtrado con filtro PES de 0,2 \mum.
Se descongeló el contenido de una ampolla
congelado a baja temperatura (nitrógeno líquido) y desinfectado
(etanol al 70%), de células Vero WCB, y se añadió a 9 ml de medio
exento de suero (SF) en un tubo de 10 ml y se centrifugó durante 10
min a 1000 rpm (170 g). El sedimento se volvió a suspender en medio
SF hasta un total de 30 ml, se transfirió a una botella Roux de 80
cm^{2} y se incubó a 37ºC y CO_{2} al 7%, durante al menos 15
min. Después, se separó el medio y las células se lavaron con PBS
def. aproximadamente 0,1 ml/cm^{2} (= PBS sin Ca^{2+} ni
Mg^{2+}). Se añadió tripsina/disolución de EDTA
(8-10 \mul/cm^{2}; tripsina al 0,1%/disolución
de EDTA al 0,02%) y se incubó a temperatura ambiente durante
aproximadamente 3 min. Se desprendieron empujando suavemente la
botella Roux contra la palma de la mano, se añadió medio SF e
inhibidor de tripsina (Sigma, T6522) en una cantidad de
aproximadamente 1/5 del volumen de la trispina/disolución de EDTA.
La suspensión celular se repartió en botellas Roux o botellas
giratorias, y se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 9%.
Se hicieron crecer células MDCK en DMEM/Ham F12
+ FCS al 2% (inactivado por calor); los huevos de gallina
embrionados tenían 11-12 días y eran de origen SPF
(sin patógenos específicos).
\vskip1.000000\baselineskip
Se separó el medio antiguo de las botellas
giratorias que contenían células Vero y las células se infectaron
con virus por adición de 5 ml de suspensión de virus en medio SF a
cada botella giratoria, dando como resultado una MDI (multiplicidad
de infección) de aproximadamente 0,01. Después de incubación durante
45 minutos a 33ºC, se separó el inóculo de virus con una pipeta. Se
añadieron 90 ml de medio SF complementado con tripsina porcina
0,5-10, preferiblemente 2-5 y lo más
preferiblemente 2 \mug/ml (proveedor: AvP) o tripsinógeno o
tripsina recombinante humana (producción de los autores de la
invención) y bicarbonato de sodio 0,5 g/l, a cada botella giratoria
y las botellas se incubaron a 33ºC y CO_{2} al 5%. Para la
producción de muestras de vacunas vivas atenuadas para usar en
ensayos con animales y en ensayos clínicos humanos, el medio SF se
complementó con tripsina, y además con Benzonase^{TM} en una
concentración de 2-30, preferiblemente
5-15, y lo más preferiblemente 10 Unidades de
Benzonase^{TM} por ml de medio. El virus se recogió 64 horas
después de la infección por centrifugación del líquido sobrenadante
del cultivo durante 5 min a 4000 rpm (3000 g) a 10ºC en tubos de 50
ml. Se reunió el líquido sobrenadante de cada cepa de virus y se
almacenó a +4ºC. Se usaron partes alícuotas del mismo para los
ensayos de
vacunas.
vacunas.
Con el propósito del almacenamiento, las
preparaciones de virus se pueden liofilizar y se puede añadir un
estabilizante tal como, por ejemplo, trehalosa e hidrolisato
enzimático de lactalbúmina en tampón de HEPES. La reconstitución se
puede hacer con agua estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó en los líquidos sobrenadantes
obtenidos de cultivos de células Vero (hechas crecer en medio SF
como se describe en el Ejemplo 1) y cultivos de células MDCK
(hechas crecer en medio complementado con FCS como se describe en
el Ejemplo 1), la capacidad de inactivar la tripsina de diferente
origen que se ha añadido al líquido sobrenadante en el tiempo = 0
h, con concentraciones iguales de cada uno. La tripsina porcina se
ha aplicado con 2 calidades diferentes (obtenidas de diferentes
fabricantes), es decir con actividad alta y baja. Los resultados se
presentan en la Tabla 1 y en las Figuras 1 y 2.
Los datos muestran sin ambigüedad que la
tripsina bovina es inactivada rápidamente en el líquido sobrenadante
del cultivo de células Vero, y menos rápidamente en el líquido
sobrenadante del cultivo de células MDCK. La tripsina porcina y
rec. humana (fabricada en los laboratorios de los autores de la
invención) permanece completamente activa en los líquidos
sobrenadantes de MDCK mientras que es inactivada gradualmente en los
líquidos sobrenadantes de Vero aproximadamente a la mitad o menos
de la velocidad de la inactivación de la tripsina bovina. La
diferencia de las trispinas porcinas ensayadas está solo en el
nivel de DO inicial a 247 nm, mientras que las características de
inactivación son esencialmente idénticas para ambos lotes de
tripsina porcina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La propagación de virus se llevó a cabo como se
ha descrito en el Ejemplo 1 para los diferentes sustratos de
células huésped. Cada uno de los 7 aislados recuperados en células
Vero era reactivo con eritrocitos humanos pero no con eritrocitos
de pollo y ninguno de ellos se acumulaba en huevos embrionados. Por
otra parte, todos los aislados recuperados en células MDCK eran
reactivos tanto con eritrocitos de pollo como humanos y eran
capaces de crecer en huevos. Aunque estas diferencias no se veían en
aislados de influenzavirus A del subtipo H1N1 ni en influenzavirus
B (véase las siguientes Tablas 3 y 4), se puede asumir, sin embargo,
que el cultivo de influenzavirus en células Vero mantendrá
propiedades antígenas de forma más adecuada que el cultivo en otros
sustratos.
A partir de los datos de la Tabla 3, parece que
los influenzavirus H1N1 pueden ser menos susceptibles a la
selección de adaptación, puesto que los aislados hechos crecer en
Vero y MDCK no presentan diferencias significativas en sus
características de hemaglutinación ni en sus secuencias de HA. Se
puede sacar una conclusión similar para los aislados B listados en
la Tabla 4.
El material de partida clínico (p. ej., muestras
de suero, hisopos) para el aislamiento y replicación de virus se
obtuvo principalmente de:
1. Institute of Virology, Vienna, Austria (Prof.
F. Heinz) 1995/96, 1996/97
2. Unité de Genetique Moleculaire des Virus
Respiratoires, Institute Pasteur, Paris, Francia (Prof. S. van der
Werf) 1996/97
3. Public Health Laboratory Service, London,
Reino Unido (Dr. M. Zambon) 1996/97
4. Laboratoire Central de Virologie,
Hôpitaux Universitaires de Geneve, Geneva, Suiza (Dr. W.
Wunderli) 1996/97, 1997/98
5. Virus Unit, Queen Mary Hospital, Hong Kong
(Dr. W.L. Lim) 1997/98
Los resultados muestran que con algunos aislados
no había alteración de la secuencia de HA de virus propagados en
Vero o MDCK frente a la secuencia de HA obtenida directamente del
material de hisopo por amplificación de PCR. En algunos otros
aislados hechos crecer en células MDCK, las secuencias de HA y/o NA
se desviaban de las correspondientes secuencias obtenidas en
células Vero. Sin embargo, los virus derivados de Vero no mostraron
ninguna desviación en la secuencia de HA frente a la secuencia de HA
de los aislados de hisopo, cuando se determinó.
Los macacos se inmunizaron por vía i.n. en
ausencia de anestesia con 1 ml de suspensión de virus
V - virus aislados de Vero
M - virus aislados de MDCK
E - virus aislados de huevo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales se inmunizaron por vía i.n. con
narcosis de éter con 1 ml de suspensión de virus.
N - temperatura normal de 38,1ºC a 39,9ºC;
F - fiebre, más de 40,0ºC
\newpage
El resultado más sorprendente y también
importante en la Tabla 6 es la inmunogenicidad muy baja del virus
A/Vienna/47/96 derivado de MDCK comparado con el correspondiente
virus derivado de Vero. No es particularmente sorprendente que los
virus derivados de huevo muestran solo inmunogenicidad pobre.
Igualmente, los resultados listados en la Tabla
7 indican que los virus derivados de Vero están menos, si lo están,
alterados por la selección de adaptación en su sustrato huésped en
comparación con los virus derivados de MDCK. Esto significa que con
respecto a los virus derivados de MDCK, los virus derivados de Vero
mantienen más, o incluso todas, las propiedades inmunológicamente
relevantes, en particular las antígenas, del virus original.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El procedimiento descrito en el Ejemplo 1
también se usó para producir muestras de vacuna para ensayos con
animales y estudios clínicos humanos. Se entiende que el
procedimiento de propagación de virus descrito en el mismo, también
abarca las variaciones que podría sugerir o aplicar un experto en la
materia sin contribución inventiva y siempre que las variaciones no
cambien el sentido de la presente invención como se describe en el
presente documento y las reivindicaciones.
Las muestras de vacuna que contienen una o más
de las cepas salvajes de influenzavirus A o B, cepas madre y cepas
de reagrupación (que se describen con más detalle a continuación) se
produjeron exclusivamente usando la línea de células Vero continua
como sistema de células huésped (salvo para el propósito de
comparación con muestras obtenidas de otros sustratos huésped) en
medio exento de suero complementado adicionalmente con los
ingredientes nutricionales y enzimas descritos en el Ejemplo 1.
Se conocen en la técnica algunos procedimientos
adecuados para modificar virus salvajes que incluyen los
procedimientos de atenuación (p. ej., sensibilidad a la
temperatura), adaptación al frío y reagrupación, y se ha revisado
ampliamente, por ejemplo, en el documento WO 99/64068.
Se dan características adicionales de las 2
cepas madre de influenzavirus A y B más preferidas útiles para la
producción de vacunas vivas atenuadas, por ejemplo por reagrupación
6/2 con los genes de HA y NA de los influenzavirus epidémicos
actuales recomendado por la OMS, en las siguientes Tablas
8-13.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cmca - adaptada al frío
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, debe observarse que los segmentos
genómicos nº 4 y 6, es decir los genes de HA y NA, no son necesarios
para caracterizar los candidatos de cepa madre de influenzavirus A,
porque estos genes se cambiarán por los correspondientes genes de
los influenzavirus epidémicos reales (como se ha mencionado en lo
que antecede). Las características importantes para la seguridad de
una vacuna, p. ej., la sensibilidad a la temperatura o las
características que permiten la administración intranasal de una
vacuna, en particular la adaptación al frío (porque la temperatura
media en una nariz es inferior a la temperatura corporal habitual),
son producidas principalmente por mutaciones en los 6 segmentos
genómicos restantes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La siguiente Tabla 10 lista las mutaciones en
los segmentos genómicos de A/Singapore/1/57/ca comparado con la
correspondiente cepa salvaje A/Singapore/1/57/wt.
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cmNúmero total de mutaciones – 13 (8 codificantes)
\hskip0.5cm* mutaciones codificantes
\newpage
Las variantes preferidas de A/Sing/1/57/ca
comprenden las listadas en la siguiente Tabla 11, en la que
"\Delta" significa "del" o "delta" y se refiere a
una mutación que contiene al menos una "deleción" en su
segmento del gen NS.
* segmento de genoma que se origina
en
A/Singapore/1/57/ca
** segmento genómico que se origina
en influenzavirus
A/PR8/34
ca - adapatado al frío; ts -
sensible a la
temperatura;
aa -
aminoácido(s)
IFN-induc. - la
cepa causa liberación de interferón en sustratos huésped que son
capaces de producir IFN, así como en sistemas inmunitarios animales
o humanos tras
administración.
IFN-sens. - cepa
que es sensible frente al interferón; se reduce o para la
replicación en sistemas que producen
IFN.
Sing ca/\DeltaNS 87 - cepa
A/Singapore/1/57/ca que contiene deleción de 87 aminoácidos en el
gen de NS1 en las posiciones de aa
36-123
Sing ca/\DeltaNSPR8 - cepa
A/Singapore/1/57/ca que contiene el segmento del gen NS de A/PR8/34
(denominado también de forma abreviada "PR8") que contiene una
deleción del gen NS1
entero
Sing ca/NS124PR8 - cepa
A/Singapore/1/57/ca que contiene el segmento del gen de NS de
A/PR8/34 que contiene un codón de parada en la posición del aa 128
del gen
NS1.
+/- significa que el fenotipo
necesita más clarificación y todavía no se puede definir sin
ambigüedad.
Las siguientes Tablas 12, 13 y 13A se refieren a
candidatos de cepas madre de influenzavirus B preferidas y a
variaciones y reagrupaciones, respectivamente, de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cmca - adaptada al frío
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa original B/Vienna/1/99 se aisló en
cultivo de células Vero hecho crecer con medio exento de suero en
febrero de 1999, en Viena, Austria, a partir de una hembra de 12
años de edad con influenza aguda. El Centro de Control de
Enfermedades (CDC) de Atlanta, EE.UU., lo clasificó como de tipo
B/Beijing/184/93. Después de un pase adicional a 33ºC, la cepa
salvaje, denominada B/Vienna/1/99 wt, se atenuó mediante 22 pases
seriados a 25ºC usando el mismo sistema de cultivo celular. La
purificación por placa se hizo a 25ºC para el primero y a 33ºC para
los siguientes 4 ciclos. El clon purificado de la placa derivada y
almacenado a -70ºC, se denominó B/Vienna/1/99 ca o de forma
abreviada BV22. La identidad como un virus de tipo B/Beijing/184/93
se confirmó mediante ensayo HI con antisuero estándar NIBSC.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, el pase adicional de la cepa
B/Vienna/1/99 ca durante 15 pases adicionales (es decir, un total de
37 pases en cultivo de células Vero exento de suero) dio como
resultado un mutante de B/Vienna/1/99 ca37 (abreviado BV37) con
propiedades incluso superiores a las de BV22. Este mutante contiene
un mayor número de mutaciones frente a BV22 y parece que
actualmente es un candidato más prometedor para la producción de una
vacuna de virus entero, en particular para una vacuna viva de
influenza atenuada, basada en un mutante de influenzavirus no
recombinante. Las mutaciones adicionales se listan en la siguiente
Tabla 13A:
Comparación con la base de datos de secuencias
de influenzavirus 13.2.2001 (www.flu-lani.gov):
a) mutaciones únicas subrayadas en negrilla;
b) mutaciones comunes con:
- ^{\text{*}}
- B/Lee/40, B/Osaka/70, B/Kadoma/1076/99 (aminoácido resultante: I)
- ^{+}
- B/Lee/40, B/Osaka/70
- ^{\alm{1}}
- frecuentes: B/Lee/40, B/Ann Arbor/1/66 ca y wt, B/Singapore/222/79, B/North Dakota/83, B/Norway/1/84, B/Ibaraki/2/85, B/Ann Arbor/1/86, B/Victorta/2/87, B/Aichi/5/88
- \bullet
- B/Kanagawa/73
Se entenderá que las cepas madre A y B de
influenzavirus de acuerdo con la presente invención no estarán
limitadas a las propiedades y características genéticas listadas
explícitamente en las tablas del presente documento, si no que
también comprenderán variaciones minoritarias de las mismas, con la
condición de que dichas variaciones estén dentro del sentido de la
presente invención y no alteren sustancialmente ninguna de las
propiedades funcionales de los virus.
Dichas variaciones pueden ocurrir, por ejemplo,
debido a etapas adicionales de la multiplicación o propagación de
virus (p. ej, para el propósito de obtener material para el análisis
de secuencia).
Además, las secuencias de genes listadas en el
presente documento incluyen las secuencias de cebadores (situadas
al principio y al final de cada segmento genómico) que se usaron
junto con la presente invención, cuyas secuencias de cebadores
pueden diferir de las secuencias verdaderas correspondientes de los
segmentos genómicos víricos de una o ambas cepas de virus salvaje y
atenuada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Los siguientes datos confirman la sensibilidad a
la temperatura y la seguridad de la vacuna para las vacunas de
influenza fabricadas de acuerdo con la presente invención, p. ej.,
como se describe en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
1 - número de animales con título de HI positivo
>1:4
2 - número de animales sin virus detectable en
los pulmones
3 - Título medio geométrico de anticuerpos en el
suero
Pr8wt - cepa de influenzavirus A/PR/8/34 salvaje
(H1N1), patógena para ratones
PR8/Sing ca-2/6 - es la
reagrupación entre cepa de influenzavirus atenuada A/Sing/1/57 ca y
PR8 wt, que contiene 2 genes (HA y NA) del virus PR8wt y todos los
demás genes de A/Sing/1/57 ca.
PR8/Sing\DeltaNS contiene los genes de HA y NA
de PR8wt, 5 genes de A/Sing/1/57 ca y el gen de NS de origen de PR8
que carece de la secuencia que codifica NS1 (deleción o que no
expresa NS1)
^{1}- número de animales con título de HI
positivo >1:4
^{2}- va- adaptada a Vero
^{3}- ca- adaptada a frío
^{4}- número de animales sin virus detectable
en los pulmones
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
^{a}Los ratones se infectaron por vía i.n. con
50 \mul de fluido de virus con un título de 1,0 x 10^{6}
UFP/ml.
^{b}UFP/ml de suspensión tisular al 10%,
valorada en células MDCK.
Se registró la temperatura rectal de los
animales 2 veces al día y se caracterizó como sigue:
N - temperatura normal de 38,1ºC a 39,9ºC
F - fiebre, más de 40,0ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Cada grupo consistía en 3 animales, que se
inmunizaron por vía i.n. con narcosis de éter, con 1 ml de fluido
de virus con un título de 2x10^{6} UFP/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
^{a}Los ratones se infectaron por vía i.n. con
narcosis de éter con 50 \mul de fluido de virus.
^{b}UFP/ml de suspensión tisular al 10%,
valorado en células Vero/SF, los datos se dan como valor medio para
6 ratones (los pulmones de cada animal se trataron por
separado).
\vskip1.000000\baselineskip
La reagrupación contiene los genes de HA y NA de
A/Hong Kong/1035/98 wt salvaje y de otros 6 genes de
A/Singapore/1/57/ca.
Los animales se inmunizaron por vía i.n. con
narcosis de éter con 1 ml de virus, 2x10^{6} UFP/ml
N - temperatura normal de 38,1ºC a 39,9ºC
F - fiebre, más de 40,0ºC
^{b}+++ - rinitis grave
\pm ausencia de rinitis
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados presentados en las Tablas 16 a 19
demuestran claramente la seguridad de las vacunas que contienen la
cepa madre sensible a la temperatura y atenuada, o en casos de
reagrupación, de las vacunas basadas en los virus reagrupados
compuestos del "esqueleto" de la cepa madre sensible a la
temperatura y atenuada (6 genes) y los genes de HA y NA de, por
ejemplo, la cepa salvaje patógena A/Hong Kong/1035/98 wt.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa BV22 se pasó 5 veces con MDI alto en
células Vero. Después se controló otra vez el fenotipo ts. La cepa
permaneció sensible a la temperatura como puede verse en la Tabla
21.
* Se inmunizaron 9 ratones OF1 por cepa por vía
intranasal con narcosis con éter con 10^{5} UFP. En los días
después de la infección indicados, se sacrificaron 3 ratones por
grupo. Se homogeneizaron los pulmones y turbinatos nasales en una
suspensión en PBS def. al 10% (p/v). Se realizó un ensayo en placa
de las suspensiones.
Los datos muestran que la reproducción moderada
del candidato de la cepa madre ca de BV22 era posible en la mucosa
nasal, mientras que la propiedad de ts del virus prevenía la
reproducción en los pulmones.
Se estableció una cepa de reagrupación 6/2 de HA
y NA de la cepa de influenzavirus salvaje B/USSR/69 wt y de los
otros 6 segmentos de genoma de B/Vienna/1/99 ca (BV22). Se ensayó el
origen de la hemaglutinina por ensayo HI, todos los demás segmentos
de genoma por RT-PCR y análisis de restricción
usando métodos conocidos en la materia.
* Se inmunizaron 9 ratones OF1 por cepa por vía
intranasal con narcosis con éter con 10^{5} UFP. En los días
después de la infección indicados, se sacrificaron 3 ratones por
grupo. Se homogeneizaron los pulmones y turbinatos nasales en una
suspensión en PBS def. al 10% (p/v). Se realizó un ensayo en placa
de las suspensiones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se produjeron las siguientes vacunas (en forma
de pulverizadores nasales) de acuerdo con la presente invención (p.
ej., como se describe en el Ejemplo 1) para el suministro
intranasal. Composición por ml (después de reconstitución del
material liofilizado):
(1) Placebo: 2x medio SF, tampón de HEPES 40 mM,
hidrolisato enzimático de lactalbúmina al 8%, trealosa al 4%;
(2) Vero-Vac H1: preparación de
tipo A/Beijing/262/95 (HIN1) que comprende 4,3x10^{7} DICT_{50}
de reagrupación 6/2 de A/Singapore/1/57/ca con A/Hong Kong/1035/98;
2x líquido sobrenadante del cultivo, tampón de HEPES 40 mM, 8
hidrolisato enzimático de lactalbúmina al 8%, trealosa al 4%;
(3) Vero Vac H3: preparación de tipo
A/Sidney/5/97 (H3N2) que comprende 2,1x10^{7} DICT_{50} de
reagrupación 6/2 de A/Singapore/1/57/ca con A/SW/7729/98; 2x
líquido sobrenadante de cultivo, tampón de HEPES 40 mM, hidrolisato
enzimático de lactalbúmina al 8%, trealosa al 4%;
(4) vacuna trivalente rusa (vacuna de
influenzavirus viva para adultos):
A/17/Beijing/95/25 DIE_{50} 1,1x10^{8}
A/17/Sidney/97/76 (H3N2) 2,3x10^{7} DIE_{
50}
B/60/Petersburg/95/20 1,1x10^{7} DIE_{
50}
(5) Vacuna Vero monovalente BV22: preparación
tipo B/Bejjing/184/93 que comprende 2x10^{6} DICT_{5O} del
candidato de células madre B/Vienna/1/99/ca (= BV22); 2x líquido
sobrenadante del cultivo, tampón de HEPES 40 mM, hidrolisato
enzimático de lactalbúmina al 8%, trealosa al 4%;
Las vacunas se administraron a 13 voluntarios
por cada grupo de vacunación. Se dieron 550 \mul de vacuna
reconstituida (o placebo, respectivamente) por vía intranasal a cada
paciente el día 0 y una segunda vez el día 22\pm1. Los resultados
se resumen en la siguiente Tabla 25.
El número total de sucesos adversos (SA) durante
5 días después de la primera y la segunda vacunación, fue 14 que
incluían 9 SA leves y 4 moderados. Solo un voluntario presentó un SA
grave, que comprendía un aumento de la temperatura corporal hasta
38,3ºC en las 3 horas después de la primera vacunación sin ningún
síntoma local o sistémico. Durante las siguientes 4 horas su
temperatura volvió a la normalidad. Después de la primera
vacunación, se observaron 7 SA. Uno de ellos era local y 6 eran
sistémicos. Después de la segunda vacunación, se observaron 2 SA
locales y 5 sistémicos.
No se pusieron de manifiesto diferencias
significativas en términos de seguridad entre los grupos de estudio
incluyendo el del placebo. No se observaron SA relacionados con la
vacunación excepto el mencionado antes. Dos de los SA moderados
ocurrieron en el grupo de H3N2 (aumento de la temperatura hasta
37,6ºC y faringitis aguda el día 3 en un voluntario; obstrucción
nasal, incomodidad en la garganta el día 22-24 y
aumento de la temperatura hasta 37,5ºC en otro voluntario), y uno
en el grupo H1N1 (dolor en la garganta, rinitis el día
22-26, aumento de la temperatura hasta
37-37,8ºC entre los días 22-24).
(8) pacientes que desarrollaron infección
espontánea durante el curso del estudio.
Los resultados obtenidos del estudio clínico
confirman, por lo tanto, una seguridad muy buena de las vacunas
producidas de acuerdo con la presente invención y usando los
candidatos de cepas madre de influenzavirus A y B preferidas de la
presente invención.
<110> Polymun Scientific Immunbiologische
Forschung GmbH
\hskip1cmKatinger, Hermann
\hskip1cmKatinger, Dietmar
\hskip1cmRomanova, Julia
\hskip1cmEgorov, Andrej
\hskip1cmFerko, Boris
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VACUNA DE INFLUENZA Y PROCEDIMIENTO
DE FABRICACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
BEP-4847-PC (Vacuna de
Influenza)
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/1/57/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1773
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/1/57/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1565
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1027
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 890
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 771
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 757
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 716
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 562
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 506
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus
A/Singapore/l/57/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1557
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1097
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 770
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 752
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 726
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 584
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 560
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
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<211> 100
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<212> PRT
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<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 32
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 34
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<211> 248
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<212> PRT
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<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
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<400> 34
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
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<211> 109
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<212> PRT
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<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 35
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<210> 36
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<211> 281
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
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<211> 122
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<212> PRT
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<213> Influenzavirus B/Vienna/l/99/ca
\newpage
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<400> 37
Claims (16)
1. Un procedimiento de fabricación de una vacuna
de virus entero, preferiblemente una vacuna viva atenuada, que
comprende las etapas de:
a) infección de células de riñón de mono verde
africano (Vero) con un virus deseado, en el que las células Vero se
han hecho crecer en y separadas de un medio exento de suero que
también está exento de proteínas no séricas;
b) combinar las células infectadas con un medio
de cultivo celular exento de suero adecuado, que también está
exento de proteínas no séricas;
c) incubar las células en dicho medio;
d) recoger virus infecciosos recogiendo el
líquido sobrenadante que contiene virus obtenido de centrifugación
y/o filtración del cultivo celular; y
e) preparar una vacuna de los mismos, que
comprende someter el líquido sobrenadante que contiene virus a al
menos una etapa de procesamiento seleccionada del grupo que consiste
en concentrar, congelar, liofilizar y estabilizar la adición de un
agente estabilizante,
caracterizado porque el medio exento de
suero y proteínas al que se hace referencia en la etapa (b) se
complementa con una proteasa y una nucleasa, y la incubación en la
etapa (c) se lleva a cabo en presencia tanto de dicha proteasa como
de dicha nucleasa, para permitir la producción de virus infeccioso,
y simultáneamente, para la digestión del material de ácido nucleico
liberado al medio de cultivo celular; y porque dicha al menos una
etapa de procesamiento para preparar una vacuna a partir del líquido
sobrenadante que contiene virus no implica una etapa de separación
de proteínas o purificación de proteínas, dando así como resultado
dicha vacuna de virus entero en su forma lista para usar.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que no tiene ninguna etapa de separación o
purificación cromatográfica, en particular cromatográfica en gel, y
preferiblemente no contiene ninguna etapa de purificación distinta
de la centrifugación y/o filtración convencional.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, que comprende al menos una etapa de filtración
estéril del líquido sobrenadante que contiene virus.
4. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la nucleasa
tiene actividad de ADNasa y/o ARNasa.
5. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteasa y la
nucleasa se añaden al medio de cultivo celular una vez, antes o al
comienzo de la incubación de las células infectadas.
6. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteasa
comprende tripsina y/o tripsinógeno de origen recombinante humano o
porcino, que está presente en el medio de cultivo celular en una
concentración inicial de 0,5 - 10, preferiblemente 2 - 5 \mug por
ml de medio.
7. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medio de
cultivo celular comprende nucleasa en una concentración inicial de
2 a 30, preferiblemente de 5 a 15 U por ml de medio.
8. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la incubación en
la etapa (a) se lleva a cabo durante 10 a 120 minutos,
preferiblemente durante 30 a 60 minutos.
9. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el virus se
selecciona del grupo que consiste en virus salvaje, un aislado
primario obtenido directamente de un individuo infectado, un virus
recombinante, un virus atenuado, un virus adaptado a Vero, un virus
adaptado al frío, un virus sensible a la temperatura y un virus de
reagrupación.
10. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el virus es un
influenzavirus A, preferiblemente el subtipo H3N2 o H1N1, o
influenzavirus B.
11. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el virus tiene
un fenotipo que induce interferón y/o sensible a interferón.
12. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el virus es un
influenzavirus seleccionado del grupo que consiste en las cepas
A/Sing/1/57ca, A/Sing/57ca/\DeltaNS 87,
A/Sing/1/57ca/\DeltaNSPR8, A/Sing/1/57ca/NS124PR8,
B/Vienna/1/99ca, B/Vienna/99/ca37, una cepa de reagrupación de
A/Sing/1/57ca y una cepa de reagrupación de la cepa B/Vienna/1/99ca,
estando compuesta la reagrupación de un esqueleto de 5 ó 6 genes
que codifican proteínas distintas de HA y NA.
13. Una vacuna de virus entero adaptado a
células Vero, en forma de una vacuna viva de influenza atenuada,
que comprende un líquido sobrenadante de cultivo celular que
contiene virus adaptado a células Vero, que se obtiene tras la
inoculación en células Vero de una cepa de virus, preferiblemente
una cepa epidémica o un aislado salvaje clínico primario,
incubación de dichas células Vero inoculadas en un medio de cultivo
celular exento de suero y exento de proteínas, que contiene
cantidades eficaces de una proteasa y una nucleasa, y recoger el
líquido sobrenadante que contiene virus del cultivo celular por
centrifugación y/o filtración,
caracterizado porque comprende al menos
un virus influenza que se selecciona del grupo que consiste en las
cepas A/Sing/1/57ca, A/Sing/57ca/\DeltaNS 87,
A/Sing/1/57ca/\DeltaNSPR8, A/Sing/1/57ca/NS124PR8,
B/Vienna/1/99ca, B/Vienna/99/ca37, una cepa de reagrupación de
A/Sing/1/57ca y una cepa de reagrupación de la cepa B/Vienna/1/99ca,
estando compuesta la reagrupación de un esqueleto de 5 ó 6 genes
que codifican proteínas distintas de HA y NA, en el que el virus
adaptado a células Vero contenido en el líquido sobrenadante es
idéntico al virus usado para la inoculación o difiere del mismo
solo en una extensión minoritaria con respecto a sus propiedades
antígenas y/o su secuencia de ácido nucleico de HA, y opcionalmente
del gen de M y/o NA, y en el que dicha vacuna de virus entero en su
forma lista para usar, se refiere a la composición del líquido
sobrenadante como está en el momento de la recolección,
opcionalmente procesado por concentración y/o liofilización y/o
complementado con al menos un aditivo seleccionado del grupo que
consiste en un conservante, un estabilizante para la liofilización
y agua estéril.
14. La vacuna de acuerdo con la reivindicación
13, caracterizada porque está en forma de una preparación
líquida adaptada para el suministro intranasal.
15. La vacuna de acuerdo con la reivindicación
13, que se puede obtener por un procedimiento de fabricación como
se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
16. Uso de al menos un influenzavirus
seleccionado del grupo que consiste en cepas A/Sing/1/57ca,
A/Sing/57ca/
\DeltaNS 87, A/Sing/1/57ca/\DeltaNSPR8, A/Sing/1/57ca/NS124PR8, B/Vienna/1/99ca, B/Vienna/99/ca37, una cepa de reagrupación de A/Sing/1/57ca y una cepa de reagrupación de la cepa B/Vienna/1/99ca, estando compuesta la reagrupación de un esqueleto de 5 ó 6 genes que codifican proteínas distintas de HA y NA, para la fabricación de una vacuna como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.
\DeltaNS 87, A/Sing/1/57ca/\DeltaNSPR8, A/Sing/1/57ca/NS124PR8, B/Vienna/1/99ca, B/Vienna/99/ca37, una cepa de reagrupación de A/Sing/1/57ca y una cepa de reagrupación de la cepa B/Vienna/1/99ca, estando compuesta la reagrupación de un esqueleto de 5 ó 6 genes que codifican proteínas distintas de HA y NA, para la fabricación de una vacuna como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.
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