ES2327435T3 - Un marcador biologico para la imflamacion. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para determinar la eficacia de un tratamiento terapéutico antiinflamatorio de un sujeto al que se ha administrado agonista de A3AR, que comprende la determinación del nivel de expresión de A3AR en muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) del sujeto, en dos o más momentos sucesivos, al menos uno de los cuales se realiza durante un tratamiento antiinflamatorio, en el que una diferencia en el nivel de expresión es indicativo de la eficacia del tratamiento de fármaco.
Description
Un marcador biológico para la inflamación.
La presente invención se prefiere al campo de la
diagnosis y eficacia de la determinación de tratamiento de
inflamación y en particular al uso de marcadores biológicos
asociados a estados inflamatorios.
La siguiente es una lista de la técnica anterior
que se considera que es pertinente para la descripción del estado
de la técnica en el campo de la invención. El reconocimiento de
estas referencias en el presente documento se realizará a veces
mediante la indicación de su número entre paréntesis de la lista
dada a continuación.
1. Fishman P, Madi L,
Bar-Yehuda S, Barer F, Del
Valle L, Khalili K. Evidence for involvement of Wnt
signaling pathway in IB-MECA mediated suppression
of melanoma cells. Oncogene., 21: 4060-4064
(2002).
2. Fishman P,
Bar-Yehuda S,
Rath-Wolfson L, Ardon E, Barrer
F, Ochaion A, Madi L. Targeting the A3 adenosine
receptor for cancer therapy: inhibition of Prostate carcinoma cell
growth by A_{3}AR agonist. Anticancer Res., 23:
2077-2083 (2003).
3. Madi L,
Bar-Yehuda S, Barer F, Ardon E,
Ochaion A, Fishman P. A3 adenosine receptor activation
in melanoma cells: association between receptor fate and tumor
growth inhibition. J. Bio. Chem., 278:
42121-42130 (2003).
4. Ohana G,
Bar-Yehuda S, Arich A, Madi L,
Dreznick Z, Silberman D, Slosman G,
Volfsson-Rath L, Fishman P.
Inhibition of primary colon carcinoma growth and liver metastasis by
the A3 adenosine receptor agonist IB-MECA. British
J. Cancer., 89: 1552-1558 (2003).
5. Fishman P,
Bar-Yehuda S, Ohana G, Ochaion
A, Engelberg A, Barer F, Madi L. An agonist to
the A3 adenosine receptor inhibits colon carcinoma growth in mice
via modulation of GSK-3 and
NF-\kappaB. Oncogene, 23:
2465-2471 (2004).
6. Solicitud de patente de Estados Unidos Nº
20040167094A1.
7. Szabo, C., et al. Suppression
of macrophage inflammatory protein (MIP)- 1\alpha production and
collagen- induced arthritis by adenosine receptor agonists.
British J. Pharmacology, 125: 379-387
(1998).
8. Mabley, J., et al. The
adenosine A3 receptor agonist, N6-(3-iodobenzyl)-
adenosine-5'-N-methyluronamide,
is protective in two murine models of colitis. Europ. J.
Pharmacology, 466: 323-329 (2003).
9. Baharav, E., et al. The effect
of adenosine and the A3 adenosine receptor agonist
IB-MECA on joint inflamación and autoimmune
diseases models. Inter. J. Mol. Med. 10 (suplemento 1) página
S104, resumen 499 (2002).
10. Solicitud PCT, publicación Nº
WO2005/0063246, titulada "Method for Treatment of Multiple
Sclerosis".
11. Montesinos, M. Carmen, et al.
Adenosine A2A or A3 receptors are required for inhibition of
inflamación by methotrexate and its analog MX-68.
Arthritis & Rheumatism, 48: 240-247
(2003).
12. Madi L, Ochaion A,
Rath-Wolfson L,
Bar-Yehuda S, Erlanger A, Ohana
G, Harish A, Merimski O, Barer F,
Fishman P. The A3 Adenosine Receptor is Highly Expressed in
Tumor vs. Normal Cells: Potential Target for Tumor Growth
Inhibition. Clinical Cancer Research, 10:
4472-4479, 2004.
13. Solicitud de patente de Estados Unidos,
publicación Nº 20040137477 A1, titulada " A_{3}AR as a marker
for a diseased state".
14. Gessi, S. et al. Elevated
expression of A3 adenosine receptors in human colorectal cancer is
reflected in peripheral blood cells Clinical Cancer Research
10: 5895-5901, 2004.
\vskip1.000000\baselineskip
El receptor de adenosina A3, un receptor de la
superficie celular asociado a la proteína G_{i}, se propuso como
una diana para combatir cáncer e inflamación. El receptor se
expresa en gran medida en diversos tipos de células tumorales
mientras la expresión en tejidos normales adyacentes es
relativamente baja. La activación del receptor por un agonista
sintético específico induce la modulación de las rutas de la
transducción de señal cadena abajo que incluyen el Wnt y el NF-
kB, dando como resultado inhibición del crecimiento tumoral
(1-5).
Los estudios in vivo han mostrado que los
agonistas A_{3}AR inhiben el desarrollo de carcinomas de colon,
próstata y de páncreas así como melanoma y hepatoma. Los agonistas
de A_{3}AR también se ha mostrado que actúan como agentes
antiinflamatorios mediante la mejora del proceso inflamatorio en
diferentes modelos autoinmunes experimentales tales como artritis
reumatoide, enfermedad de Crohn y esclerosis múltiple
(6-10). Se propuso también que los receptores
A_{2A} y A_{3} receptores median los efectos antiinflamatorios
de metotrexato (11).
Los niveles de expresión del receptor de
adenosina A_{3} (A_{3}AR) están elevados en células de cáncer
cuando se compara con las células normales (12). De este modo, el
nivel de expresión de A_{3}AR se ha descrito como un medio para
la diagnosis de cáncer (13).
Además, los niveles de expresión de A_{3}AR
también se han descrito que están elevados en las células de sangre
periférica de pacientes con cáncer colorrectal (14).
Un objeto de la divulgación es proporcionar un
procedimiento para determinar un estado inflamatorio en un
sujeto.
Otro objeto de la divulgación es proporcionar un
procedimiento para determinar la gravedad de un estado inflamatorio
en un sujeto.
Un objeto de la invención es proporcionar un
procedimiento para determinar la eficacia de un tratamiento
terapéutico antiinflamatorio de un sujeto.
Es un objeto adicional de la invención
proporcionar un procedimiento para seleccionar sujetos para recibir
un tratamiento terapéutico antiinflamatorio.
La presente invención se basa en el hallazgo
sorprendente de que existe un incremento en el nivel de expresión
del receptor de adenosina A_{3} en los WBC de un sujeto que tiene
una afección inflamatoria cuando se compara con los WBC de un
sujeto sano. Además, se encontró que en los sujetos que responden a
un tratamiento de fármacos antiinflamatorio existe una reducción
en el nivel de expresión del receptor de adenosina A en sus WBC.
Este hallazgo allana el camino para el uso del nivel de expresión
del receptor de adenosina A_{3} como un medio para diagnosis de
un estado inflamatorio, así como otras aplicaciones descritas más
adelante.
En un primer aspecto se proporciona un
procedimiento de determinación de un estado inflamatorio en un
sujeto que comprende determinar el nivel de expresión del receptor
de adenosina A_{3} (A_{3}AR) en los glóbulos blancos (WBC),
por ejemplo, WBC circulantes, del sujeto. Un alto nivel de expresión
de A_{3}AR es indicativo de un estado inflamatorio en el
sujeto.
La muestra que comprende WBC puede ser una
fracción sanguínea que contiene WBC. A veces, se puede desear usar
una fracción que incluye una población específica de WBC tales como
células mononucleares (MNC), subpoblaciones de
MNC-monocitos o linfocitos, o una subppoblación de
linfocitos, por ejemplo, células T, células B o sus subpoblaciones.
Una muestra que comprende WBC también se puede a veces obtener a
partir del sistema linfático, por ejemplo, a partir de ganglios
linfáticos.
La determinación del nivel de expresión se puede
llevar a cabo mediante la determinación del nivel de ARNm de
A_{3}AR así como el nivel de la proteína de A_{3}AR. El término
"nivel de expresión" como se usa en el presente documento de
este modo incluye el ARNm de A_{3}AR así como el nivel de proteína
de A_{3}AR o fragmentos de proteína de A_{3}AR en las células
muestreadas.
Se encontró que la medicación puede influenciar
el nivel d expresión de A_{3}AR. De este modo, la historia de la
enfermedad pasada que incluye tratamiento anterior o actual, puede
influenciar el nivel de expresión de A_{3}AR y puede necesitar
tenerse en cuenta en el comportamiento de los procedimientos de la
invención.
En un segundo aspecto, se proporciona un
procedimiento para determinar la gravedad de un estado inflamatorio
en un sujeto que comprende la determinación del nivel de expresión
de A_{3}AR en WBC del sujeto; y comparando el nivel de expresión
de A_{3}AR en las células con el nivel de patrones determinados
anteriormente que correlacionan el nivel de expresión de A_{3}AR
con la gravedad de la infección. Los patrones determinados
anteriormente pueden comprender, por ejemplo, un conjunto de
valores, que pueden ser una lista de valores discretos o una curva
continua, que correlaciona los resultados con una medición de la
gravedad de la inflamación; o puede ser un conjunto de
descriptores, tal como una lista cuantitativa de posibles resultados
y sus significados con respecto a la gravedad de la inflamación,
por ejemplo, si el resultado se manifiesta como una reacción de
color, los descriptores pueden enumerar el intervalo de resultados
de color o intensidades de color y su significado con respecto a
la gravedad de inflamación; o puede incluir representaciones
gráficas o pictóricas de los resultados de ensayo esperados para
las diferentes gravedades de inflamación o diferentes estados
inflamatorios; o un conjunto de patrones de referencia, que se
pueden llevar a cabo en paralelo con la muestra para la calibración
y evaluación de los datos. Los patrones se pueden obtener de manera
típica mediante el ensayo de nivel de expresión de A_{3}AR en una
diversidad de muestras a partir de cada número de estados
patológicos inflamatorios para obtener una medida estadística sobre
la correlación entre el nivel de expresión y el estado patológico.
La clasificación de los estados patológicos puede ser por ejemplo
binaria: inflamación ligera e inflamación grave. La clasificación
también puede incluir una diversidad de estados diferentes, tal
como, por ejemplo, inflamación ligera, moderada o grave. La
clasificación también se puede realizar mediante el uso de un valor
numérico, de acuerdo con el nivel de expresión, por ejemplo, un
número entre 1 y 10, para la inflamación ligera a grave, etc. Como
se apreciará, puede haber muchos tipos de clasificaciones y la
invención no se limita a tipos específicos de clasificaciones.
En un aspecto de la invención, se proporciona un
procedimiento para determinar la eficacia de un tratamiento
terapéutico antiinflamatorio de un sujeto, al que se ha administrado
agonista de A_{3}AR. El tratamiento puede ser una monoterapia con
un A_{3}AR o una terapia de combinación de A_{3}AR con otro
fármaco, tal como una combinación de un A_{3}AR con metotrexato.
El procedimiento comprende la determinación del nivel de expresión
de A_{3}AR en los WBC del sujeto en dos o más momentos sucesivos,
al menos uno de los cuales es durante un tratamiento
antiinflamatorio, en el que una diferencia en el nivel es indicativo
de la eficacia del tratamiento de fármaco. Los momentos sucesivos
pueden, por ejemplo ser uno o más de antes de un tratamiento
antiinflamatorio y uno o más durante el tratamiento, uno o más
tomados durante el tratamiento y uno o más tomados durante el cese
del tratamiento.
El nivel de expresión de A_{3}AR en WBC de
acuerdo con algunas realizaciones de la invención se puede usar
para determinar el estado de la gravedad de la inflamación, por
ejemplo, para determinar la presencia o la ausencia de un estado
inflamatorio. El nivel de expresión de A_{3}AR se puede usar para
la determinación cuantitativa del grado de gravedad del estado
inflamatorio. De este modo, el término "determinar" o
"determinación" como se usa en el presente documento abarca
la determinación tanto cuantitativa como cualitativa.
Un "estado inflamatorio" incluye
cualquier estado de inflamación activa o subclínica. Mediante una
realización preferida la invención se usa para determinar un estado
inflamatorio en sujetos que padecen una enfermedad inflamatoria
autoinmune. La inflamación se puede deber a una enfermedad
inflamatoria, o puede ser un efecto secundario de algún otro tipo
de enfermedad o trastorno. Los ejemplos de enfermedades
inflamatorias incluyen pero no se limitan a enfermedades
inflamatorias del intestino, corpúsculo inflamatorio, hiperplasia
fibrosa inflamatoria, enfermedad inflamatoria de la vesícula
biliar, hiperplasia papilar inflamatoria y enfermedades
autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes pueden incluir cualquiera
de los siguientes: artritis reumatoide, Miastenia grave (MG),
miastenia grave congénita, eclerosis múltiple (MS), síndrome del
hombre rígido, paraparesia espástica topical, encefalitis de
Rasmussen, neuropatía axonal motora aguda, neuropatía axonal motora
sensorial aguda, neuritis de los ganglios de la raíz dorsal,
neuropatía pan autonómica aguda, neuritis braquial,
leucoencefalitis hemorrágica necrotizante aguda, mielopatía
necrotizante esporádica, degeneración cerebral paraneoplásica
síndrome de Guillain-Barre, encefalitis límbica,
ataxia Opsoclonus-mioclonus, neuronitas sensorial,
neuropatía autonómica, neuropatía desmielizante, complejo
SIDA-demencia, síndrome de Tourette, síndrome de
Miller-Fisher, enfermedad de Alzheimer, enfermedad
de Graves, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis después del parto,
tiroiditis Focal, tiroiditis juvenil, hipotiroidismo idiopático,
diabetes mellitus de tipo I Type I (insulina dependiente),
enfermedad de Addison, Hipofisitis, diabetes insípidus autoinmune,
Hipoparatiroidismo, Pénfigo vulgar, Pénfigo foliáceo, "Penfigoide
buloso" gestaciones pengifoides, pengifoide cicatrizal,
Dermatitis herpetiformis, acquisita epidérmica bullosa, Eritema
multiforme, Herpes gestatonis, Vitiligo, urticaria crónica, lupus
discoide, alopecia universal/areata, Psoriasis, hepatitis
autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis activa crónica,
síndrome de solapamiento de hepatitis activa crónica/cirrosis
biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, anemia
hemolítica autoinmune, púrpura tromocitopénica idiopática, síndrome
de Evans, tromocitopenia inducida por heparina, neutropenia
autoinmune primaria, neutropenia autoinmune (primaria) de infancia,
neutropenia autoinmune después de transplante de médula ósea,
hemofilia autoinmune adquirida, gastritis autoinmune y anemia
perniciosa, enfermedad celíaca, Enfermedad de Crohn, colitis
ulcerosa, Sialadenitis, fallo de ovario autoinmune prematuro,
Azoospermia, Hipogonadismo, infertilidad masculina asociada a
anticuerpos de esperma, orquitis autoinmune, fallos de ovario
prematuro, ooforitis autoinmune, Uveitis, Retinitis, oftalmia
simpática, retinocoroidiopatía de Birdshot, uveitis granulomatosa
de Vogt-Koyanagi-Harada,
degeneración de la retina, uveitis inducida por lentes, neuritis
óptica, pérdida auditiva sensorneural autoinmune, enfermedad de
Meniere, miocarditis autoinmune, bloqueo cardíaco congénito (lupus
neonatal), enfermedad de Chagas, cardiotoxicidad por adriamicina,
síndrome de miocarditis de Dressler, asma bronquial, enfermedad
pulmonar intersticial fibrosa, glomerulonefritis de progresión
rápida, nefritis autoinmune tubulointersticial, lupus sistémico
eritematoso (SLE), síndrome antifosfolipídico, artritis reumatoide,
artritis reumatoide juvenil, síndrome de Felty, Large granular
linfocitosis granular mayor (LGL), síndrome de Sjogren, esclerosis
sistémica (escleroderma), síndrome de Crest, enfermedad del tejido
conectivo mixto, Polimiositis/dermatomiositis, enfermedad de
Goodpasture, granulomatosis de Wegener, síndrome de
Churg-Strauss, púrpura de
Henoch-Schonlein, Microscopio poliangiatis
microscópica, Periarteritis nodosa, síndrome de Bechet,
aterosclerosis, artritis temporal de células (gigantes),
espondilitis anquilosante, poliendocrinopatía autoinmune, distrofia
por candidiasis ectodérmica, vasculitis crioglobulémica esencial,
angitis cutánea crioglobulénica, enfermedad de Lyme, fiebre cardíaca
y enfermedad reumática, fasciitis eosinófila, hemoglobinuria
paroxística por frío, polimialgia reumática, fibromialgia, síndrome
de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, cambios en
la piel y manchas M, Policondritis recurrente, síndrome autoinmune
linfoproliferativo, síndrome de TINU (nefritis tubulointersticial
aguda y uveitis), Inmunodeficiencia variable común, deficiencia en
TAP (transportador asociado a la presentación de antígeno), síndrome
de Omenn, síndrome de HyperIgM, agammaglobulinemia de BTK, virus de
inmunodeficiencia humana y después de trasplante de médula
ósea.
La muestra que comprende WBC usada en los
procedimientos puede incluir cualquiera de los tipos de células
conocidos que completan este grupo. En particular, la muestra debe
preferiblemente incluir células mononucleares (monocitos y/o
linfocitos). A veces, la muestra puede incluir además, o como
alternativa, granulocitos (neutrófilos, eosinófilos o
basófilos).
Se emplea un alto nivel de expresión de
A_{3}AR como un indicador de un estado inflamatorio en el sujeto.
El término "alto nivel" se ha de entender como un significado
de un nivel de expresión significativamente mayor en células
normales. Por ejemplo, el nivel de expresión de A_{3}AR en los WBC
se puede comparar con un nivel de control, siendo el nivel de
control coel nivel de expresión de A_{3}AR en los WBC normales de
un sujeto. A veces puede ser útil determinar el nivel de expresión
mediante el ensayo de una muestra de prueba de un individuo en
paralelo con uno o más patrones de referencia, por ejemplo, un
indicador patrón de referencia de un estado normal y otro indicador
de un estado inflamatorio; o un patrón de referencia indicador de
un estado normal y dos o más estados patológicos diferentes.
El nivel de expresión determinado se compara con
los patrones. Los patrones se pueden basar en los niveles
determinados previamente de los individuos sanos y de individuos
con un estado inflamatorio o con diferentes estados inflamatorios.
Los patrones se pueden proporcionar, por ejemplo, en la forma de
valores numéricos discretos o, en el caso del procedimiento de
ensayo es colorimétrico, en la forma de una carta con diferentes
colores o sombras para los estados sanos e inflamatorios; o se
pueden proporcionar en la forma de una curva comparativa preparada
en la base de tales patrones.
Tales patrones se pueden preparar determinando
el nivel de expresión de A_{3}AR (que puede ser el nivel de
proteína de A_{3}AR, fragmento de proteína, o nivel de ARNm etc.,
como se ha descrito anteriormente) presente en los WBC obtenidos a
partir de una diversidad de una diversidad de pacientes
diagnosticados positivamente (mediante otros medios, por ejemplo
mediante un médico, mediante técnicas histológicas etc.) por tener
inflamación a niveles variables de gravedad. La gravedad de la
enfermedad para la preparación de los patrones también se puede
determinar mediante diversos procedimientos convencionales tales
como técnicas patológicas. El ensayo se lleva a cabo en paralelo
con un número de patrones de sujetos sanos y sujetos de diferentes
estados inflamatorios y se compara después con tales patrones el
nivel determinado en la muestra ensayada.
Por ejemplo, un nivel de contenido de proteína
de entre X_{1} y X_{2} por 1.000.000 de células se puede
definir por ser indicativo del grado 1 de inflamación, un mayor
contenido de proteína de Y_{1} a Y_{2} por 1.000.000 de células
se puede definir por ser indicativo del grado 2 de inflamación, etc.
Después que se han preparado tales patrones, es posible comparar el
nivel de la expresión de A_{3}AR obtenido de un individuo
específico con el correspondiente valor específico de los patrones,
y de este modo obtener la valoración de la gravedad de la
enfermedad.
La eficacia de un tratamiento terapéutico
antiinflamatorio de un sujeto se puede determinar tomando muestras
de WBC at en diversos momentos antes, durante y después del
tratamiento. Por ejemplo, se puede tomar una primera muestra en un
momento antes del inicio del tratamiento y se puede tomar una
segunda muestra en un momento durante el tratamiento. Una
disminución en el nivel de de la expresión de A_{3}AR en la
segunda muestra cuando se compara con la primera muestra sería
indicativa que el tratamiento es eficaz. El grado de disminución
puede ser indicativo del grado de eficacia del tratamiento, es
decir, la correlación sería cuantitativa.
En otro ejemplo, se puede tomar una primera
muestra durante el tratamiento y se puede tomar una segunda muestra
en un momento durante el tratamiento posterior al momento de la
primera muestra. Una disminución en el nivel de la expresión de
A_{3}AR en la segunda muestra cuando se compara con la primera
muestra sería indicativa que el tratamiento es eficaz.
En un tercer ejemplo, se puede tomar una primera
muestra durante el tratamiento y se puede tomar una segunda muestra
en un momento después que se haya descontinuado el tratamiento. En
este caso, un incremento en el nivel de la expresión de A_{3}AR
en la segunda muestra cuando se compara con la primera muestra sería
indicativa que el tratamiento es eficaz.
De hecho, se pueden llevar a cabo diversas otras
combinaciones, así como la toma de muestras en más de dos
momentos.
La invención también proporciona un
procedimiento para seleccionar sujeto que padece una cierta
enfermedad inflamatoria, para recibir tratamiento terapéutico
antiinflamatorio que comprende la administración al sujeto de un
agonista del receptor de adenosina A_{3} (A_{3}AR),
comprendiendo el procedimiento la determinación del nivel de
expresión de A_{3}AR en una muestra de PBMNC tomada del sujeto y
seleccionar el sujeto para recibir dicho tratamiento terapéutico
antiinflamatorio si dicho nivel está por encima del nivel
predeterminado. Dicho nivel predeterminado puede ser un cierto
nivel umbral para todos los sujetos. Dicho nivel predeterminado
también puede ser un intervalo de niveles para diferentes grupos de
pacientes, por ejemplo: para grupos de edad diferente; para
diferentes estados patológicos; para diferentes historias
patológicas-historias de medicación pasada (por
ejemplo, se encontró que el metotrexato induce un incremento
A_{3}AR) número de años que tiene la enfermedad etc. Dicho nivel
predeterminado se puede determinar mediante estudios clínicos que
buscan la correlación entre la expresión del receptor y una
respuesta del fármaco de acuerdo con uno de los criterios de
respuesta aceptables, tal como ACR20, ACR50 y ACR70 establecido por
el Colegio Americano de Reumatología o cualquier otro criterio de
eficacia aceptable.
La selección de sujetos adecuados para el
tratamiento antiinflamatorio se puede ejecutar mediante la
determinación del nivel de expresión de A_{3}AR en una muestra de
WBC con la retirada de dicho sujeto antes de tratamiento. El sujeto
se selecciona si el nivel determinado de A_{3}AR está por encima
de un umbral determinado.
El umbral es cierto múltiplo de la expresión de
A_{3}AR en WBC de un sujeto sano. El umbral se determina en base
del nivel de expresión medio en pacientes que tienen dicha
enfermedad inflamatoria, y puede dicho promedio o cierto múltiplo o
fracción del mismo. El umbral se determina en base a los estudios
clínicos en pacientes humanos que se designan para determinar la
correlación entre el nivel de expresión y la respuesta de los
pacientes a dicho tratamiento terapéutico. Como se apreciará, el
umbral puede ser diferente para diferentes enfermedades
inflamatorias. Como también se puede apreciar, por su naturaleza tal
criterio de selección se basa en estadísticas y de esta manera
significa una cierta probabilidad de que un paciente seleccionado
pueda responder a un tratamiento. De este modo, en tal criterio de
selección, no se apreciará ninguna duda por una persona versada
en la técnica, tal criterio de selección puede no ser completamente
predictivo como respuesta y también pueden ser una cierta fracción
de los pacientes seleccionados de esta manera que no responderán al
tratamiento.
El procedimiento de selección también se puede
aplicar para seleccionar candidatos para participar en estudios
clínicos para ensayar la eficacia de tratamientos antiinflamatorios
que comprenden la administración de un agonista de A_{3}AR a
pacientes, o bien solo o en combinación con otros fármacos tal como
metotrexato. Como apreciarán los expertos en la técnica, un estudio
clínico (también conocido por los términos ensayo clínico o
"protocolo clínico"), es un estudio científico en voluntarios
humanos para determinar cómo una nueva medicina o tratamiento actúa
en sujetos humanos. Los ensayos intervencionales determinan si los
tratamientos experimentales o nuevas formas de usar las terapias
conocidas son seguras y eficaces en ambientes controlados. Mediante
los estudios clínicos los médicos encuentran nuevas y mejores
formas para evitar, diagnosticar, controlar, y tratar enfermedad.
Los estudios clínicos para los que se seleccionan los pacientes, de
acuerdo con la invención, basándose en el nivel de A_{3}AR puede
ser Fase I, Fase II, Fase III, Fase IV o cualquier otro tipo de
estudio clínico.
\vskip1.000000\baselineskip
Figs. 1A-1D muestras
transferencias de Western ejemplares y los gráficos de barras
correspondientes de intensidad de mancha media y error estándar que
muestra que A_{3}AR está regulado hacia arriba en tejidos
inflamatorios y hematopoyéticos tras la aparición de la
inflamación.
Fig. 2 muestra una transferencia de Western y el
gráfico de barras correspondiente de intensidad de mancha media y
error estándar que muestra que el nivel de expresión de A_{3}AR se
correlaciona con la Puntuación Clínica de la Enfermedad en el
modelo AIA. "0" indica animales ingenuos (animales sin
inflamación) y "6", "9" y "12" se refieren a
animales inflamados y los números indican la puntuación de
inflamatorio en estos animales.
Fig. 3 es un gráfico que muestra el cambio en la
gravedad de artritis en función del tiempo en animales control y en
animales AIA tratados con o bien metotrexato (MTX), CF101 (calidad
clínica IB-MECA), una combinación de MTX y CF101 o
vehículo solamente (control).
Figs. 4A-4B muestran
transferencias de Western ejemplares y los gráficos de barras
correspondientes con los errores estándar que muestran el nivel de
expresión de la proteína A_{3}AR en células de ganglios
linfáticos (Fig. 4A) y bazo (Fig. 4B) en animales ingenuos, en
animal AIA y en animales AIA después de tratamiento con CF101
(calidad clínica IB-MECA).
Figs. 5A-5C muestran
transferencias de Western ejemplares y los gráficos de barras
correspondientes con los errores estándar que muestran el nivel de
expresión de la proteína en pata (Fig. 5A), tejido sinovial (Fig.
5B) y células mononucleares sanguíneas periféricas (Fig. 5C) en AIA
o bien tratados con vehículo o tratados con CF101.
Fig. 6 muestra una transferencia de Western y el
gráfico de barras correspondiente que muestra el nivel de expresión
de la proteína A_{3}AR en ganglios linfáticos en animales
ingenuos, animales AIA y en animales AIA tratados con MTX.
Fig. 7 muestra una transferencia de Western y el
gráfico de barras correspondiente que muestra el nivel de expresión
de la proteína A_{3}AR en 7 sujetos sanos y en 7 pacientes
RA.
Fig. 8 es un gráfico de barras que muestra el
nivel de A_{3}AR en células mononucleares sanguíneas periféricas
de pacientes RA antes y después de 3 meses de tratamiento con CF101.
para cada paciente la respuesta en % de acuerdo con el criterio de
ACR (criterio para determinar la eficacia de fármacos para tratar
RA, establecido por el Colegio Americano de Reumatología).
Fig. 9 muestra transferencia de Western de la
expresión de A_{3}AR en PBMNC y gráficos de barras
correspondientes de la intensidad de expresión en 4 pacientes antes
(columnas de color oscuro) y después (columnas de color gris) y
durante el tratamiento con metotrexato, medida en unidades
arbitrarias.
\newpage
Se obtuvieron ratas hembra Lewis, de
8-12 semanas de edad de los laboratorios Harlan
(Jerusalem, Israel). Se mantuvieron las ratas con una dieta de
gránulos convencional y provistas de una toma de agua. Se realizaron
los experimentos de acuerdo con las directrices establecidas por el
Comité de Cuidado y uso de Animales en Can-Fite
BioPharma, Petah Tikva, Israel. A las ratas se les inyectó por vía
subcutánea (SC) en la base de la cola 100 \mul de suspensión
compuesta de adyuvante de Freund incompleto (IFA) con 10 mg/ml de
Mycobacterium tuberculosis inactivado por calor, (Mt) H37Ra,
(Difco, Detroit, Estados Unidos). Cada grupo contenía 10
animales.
Se inició el tratamiento con
IB-MECA (10 \mug/kg) el día 14 después de la
vacunación y se administró por vía oral mediante sonda
nasogástrica, dos veces al día. Se trató otro grupo con Metotrexato
(MTX) (1,5 mg/kg) por vía intraperitoneal cada 3 días, comenzando
el día 14 después de la vacunación. El grupo de control en cada
experimento recibió vehículo solamente (DMSO en una dilución
correspondiente a la de los fármacos).
Se determinó la Puntuación de Actividad de
Enfermedad Clínica como sigue: los animales se inspeccionaron cada
segundo día para la evaluación de artritis clínica. El sistema de
puntuación variaba entre 0-4 para cada miembro: 0-
sin artritis; 1- enrojecimiento o inflamación de una articulación
del dedo del pie/dedo; 2- enrojecimiento e inflamación de más de
una articulación del dedo del pie/dedo, 3- complicación de las
articulaciones del tobillo y del tarso y metatarso. 4-
enrojecimiento o inflamación de la para entera. Se calculó la
puntuación clínica mediante la adición de la puntuación de 4
piernas individuales. La intensidad inflamatoria también se
determinó de acuerdo con el incremento del diámetro de la pata
posterior de la rata, mediado por un calibre (Mitotoyo, Tokyo,
Japón).
Se diseccionaron las patas traseras por encima
de la articulación del tobillo. Se rompió el tejido óseo en piezas,
se congeló de manera rápida en nitrógeno líquido y se almacenó a
-80ºC hasta uso. Para preparar un extracto de proteína, se añadió
tampón RIPA (que contiene 150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% de NP40, 0,5%
de Deoxicolato y 0,1% de SDS) al tejido de la pata (4 ml/gr de
tejido). Se homogeneizó la mezcla sobre hielo con un politrón y se
centrifugó.
Se retiró el tejido sinovial y se separaron las
células sinoviales mediante la incubación del tejido en RPMI que
contiene 1 mg/ml de Colagenasa IV y 0,1 mg/ml de ADNasa con una
agitación vigorosa (200 rpm) a 37ºC durante 30 min. Se recogió el
sobrenadante que contiene las células sinoviales y se volvió a
extraer el tejido sin digerir. Se combinaron los sobrenadantes de
ambas extracciones y se lavaron las células con PBS. Se prepararon
los extractos de proteína.
Se retiraron los ganglios linfáticos y se
separaron las células mediante primero troceado del tejido y
disgregación mediante una aguja de 22 G. Se retiraron los bazos y
se sometieron a Lymphoprep (Nycomed AS, Oslo, Noruega) para la
separación de células mononucleares. Se prepararon extractos de
proteína.
Se extrajo sangre de sujetos sanos o pacientes
RA. Se separaron las células mononucleares (linfocitos y monocitos)
usando gradiente Ficoll- Hypaque. Se extrajo la proteína de las
células mononucleares.
Se extrajo sangre de pacientes RA que se
enrolaron en un estudio clínico patrocinado por
Can-Fite BioPharma, en el que se evaluó el efecto
de CF101, un IB-MECA de calidad clínica, en
pacientes artríticos. Los pacientes recibieron al azar 0,1, 1,0 ó
4,0 mg de CF101 dos veces al día. Se extrajo sangre en dos momentos:
(a) después de un período de lavado de 4-6 semanas
de un tratamiento previo y antes que se iniciara un tratamiento con
CF101 - esto se consideró como nivel de comienzo; (b) después de 3
meses de tratamiento con CF101. Se separaron las células
mononucleares de sangre periférica y se extrajo la proteína como se
ha descrito anteriormente. Además, se registraron los valores de la
proteína C reactiva (CRP), el número de articulaciones sensibles e
inflamadas, la evaluación global del médico, la evaluación del
propio paciente, la puntuación de dolor y la puntuación de
incapacidad y se calculó la puntuación de para cada paciente (ACR
es una puntuación que se calcula de acuerdo con los criterios
establecidos por el Colegio Americano de Farmacología, basándose en
las mediciones anteriormente mencionadas, para evaluar la eficacia
de fármacos para tratamiento de RA; ACR 20, ACR 50 y ACR 70
respectivamente representan un 20%, 50% y 70% de mejora en esta
puntuación).
Se llevaron a cabo análisis de transferencia de
Western (WB) de sinovial, pata, bazo y ganglios linfáticos de
acuerdo con el siguiente protocolo. Se enjuagaron a las muestras con
PBS enfriado con hielo y se transfirieron a tampón de lisis
enfriado con hielo (tampón TNN, tampón 50mM Tris pH = 7,5, 150 mM
NaCl, NP 40). Se eliminó el desecho de células mediante
centrifugación para 10 min, a 7500 x g. Se determinaron las
concentraciones de proteína usando el reactivo de tinte de ensayo
de proteína Bio-Rad. Se separaron cantidades iguales
de la muestra (50 \mug) mediante SDS-PAGE, usando
geles de poliacrilamida al 12%. Las proteínas resueltas se
electrotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher
& Schuell, Keene, NH, Estados Unidos). Las membranas se
bloquearon con 1% de BSA y se incubaron con el anticuerpo primario
contra A_{3}AR (dilución 1:1000) durante 24 h a 4ºC. Después se
lavaron las manchas y se incubaron con un anticuerpo secundario
durante 1 h a temperatura ambiente. Se registraron las bandas
usando el kit de desarrollo de color BCIP/NBT (Promega, Madison,
W1, Estados Unidos).
Se determinó el nivel de expresión de A_{3}AR
en modelo AIA mediante análisis WB. En este punto, se obtuvieron
extractos de proteína de tejido inflamado (pata) o del tejido
hematopoyético periférico (células mononucleares de sangre
periférica, ganglios linfáticos y bazo) y se analizaron como se ha
descrito en Materiales y Procedimientos. Las Figs
1A-1D presentan los resultados de los análisis de
WB, también se presentan en los correspondientes gráficos de
barras, que proporcionan los resultados medios y la desviación
estándar. Como se muestra, A_{3}AR está regulado hacia arriba en
el tejido inflamado (Fig. 1A) así como en tejidos hematopoyéticos
periféricos (Figs. 1B-1D).
El nivel de expresión de A_{3}AR en modelo AIA
se correlaciona también con la Puntuación Clínica de la Enfermedad
(Fig. 2) proporcionando una evidencia adicional para la correlación
entre inflamación y expresión de A_{3}AR.
Aproximadamente 21 después de la inmunización,
la mayoría de los animales tratados desarrollaron progresivamente
artritis. El tratamiento de CF101 (10 \mug/kg, proporcionado por
vía oral dos veces al día, comenzando el día 14 después de la
inmunización) y tratamiento con metotrexato (MTX) dio como resultado
una disminución significativa de la gravedad de la enfermedad, muy
similar para ambos fármacos, como se evalúa mediante la puntuación
clínica de artritis. La enfermedad era máxima los días
21-28 y se observó un efecto máximo de CF101 o MTX
en estos días (Fig. 3).
Se detectó un bajo nivel de expresión de
A_{3}AR en los tejidos de pata y sinoviales sanos. En los tejidos
inflamatorios derivados de ratas AIA, se observó un notable
incremento en el nivel de expresión de la proteína A_{3}AR
(Figs. 4A-4B). Tras el tratamiento de
IB-MECA el nivel de A_{3}AR se reguló hacia abajo
(Figs. 4A-4B). Se observó un patrón similar en los
tejidos hematopoyéticos periféricos, es decir un bajo nivel de
expresión de A_{3}AR en el bazo y ganglio linfático (LN) derivado
de animales ingenuos, alto en tejidos de AIA y una baja expresión
in en los tejidos de ratas tratadas con IB-MECA
(Figs. 5A-5C). En el LN derivado de ratas AIA
tratadas con MTX, se observó un perfil similar de expresión de
A_{3}AR (Fig. 6).
Se encontró un bajo nivel de expresión de
A_{3}AR en MNC de sujetos sanos mientras se detectó un alto nivel
de expresión en MNC derivadas de pacientes RA (Fig. 7).
Se extrajo sangre de pacientes 17 RA que
participaron en un estudio clínico para ensayar el efecto de CF101
sobre la manifestación de enfermedad en tales pacientes. Se extrajo
la sangre después de un período de lavado del tratamiento anterior
y después de 3 meses de tratamiento, se separaron células
mononucleares de sangre periférica (PBMNC) y se determinó el nivel
de A_{3}AR en estas células. Como se puede observar en la Fig. 8,
de estos 17 pacientes, 5 no eran respondedores, a saber estos
pacientes no habían incluso logrado una respuesta de ACR 20,
mientras que los otros 13 pacientes eran respondedores ya que tenían
al menos una respuesta de ACR 20 (como se puede observar en la
Figura 8, 3 de los respondedores tenían una respuesta de ACR 70, 5
lograron una respuesta de ACR 50 y otros 4 solamente una respuesta
de ACR 20).
Como además se puede observar en la Fig. 8,
todos los respondedores de ACR 50 y ACR 70 tenían un alto nivel
inicial de A_{3}AR, que se redujo después de 3 meses de
tratamiento, mientras no existía esencialmente ningún cambio en el
nivel de A_{3}AR en los no respondedores. El paciente marcado por
un "*" (nº de paciente 1517), aunque no tenía respuesta a ACR
(en vista del hecho que no había ningún cambio en el nivel de CRP,
uno de los parámetros usados para calcular la puntuación de ACR -
véase más adelante, estaba por debajo de 0%), tenía una mejora muy
significativa en otros parámetros, particularmente el número de
articulaciones inflamadas y sensibles.
Estos datos claramente demuestran la capacidad
de uso del nivel de A_{3}AR con el fin de predecir una respuesta
de un paciente a una terapia de fármaco antiinflamatorio,
particularmente tal terapia que hace uso de agonistas de A_{3}AR
como un fármaco que modifica la enfermedad.
Se tomaron muestras de sangre de 4 pacientes RA
antes y después del inicio del tratamiento con metotrexato. Se
separaron PBMNC y se ensayaron los niveles de A_{3}AR como se ha
descrito anteriormente. Los resultados que se muestran en la Fig.
9, demuestran que el tratamiento con metotrexato induce un
incremento en el nivel de A_{3}AR.
Estos datos muestran que la historia pasada de
la enfermedad, en particular la medicación pasada, puede influir en
el nivel de A_{3}AR en PBMNC y esta historia puede necesitar
tenerse en cuenta para la realización del procedimiento de acuerdo
con la invención.
Claims (12)
1. Un procedimiento para determinar la eficacia
de un tratamiento terapéutico antiinflamatorio de un sujeto al que
se ha administrado agonista de A_{3}AR, que comprende la
determinación del nivel de expresión de A_{3}AR en muestras de
células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) del sujeto, en
dos o más momentos sucesivos, al menos uno de los cuales se realiza
durante un tratamiento antiinflamatorio, en el que una diferencia
en el nivel de expresión es indicativo de la eficacia del
tratamiento de fármaco.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que una o más de las primeras muestras se toman en momentos
antes del inicio del tratamiento y una o más segundas muestras se
toman en un momento durante el tratamiento, en el que una
disminución del nivel de la expresión de A_{3}AR en una o más de
las segundas muestras comparado con una o más de las primeras
muestras es indicativo de que el tratamiento es eficaz.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que una o más de las primeras muestras se toman en un momento
durante el tratamiento posterior al momento de una o más de las
primeras muestras, en el que una disminución en el nivel de la
expresión de A_{3}AR en una o más segundas muestras cuando se
compara con una o más primeras muestras es indicativo de que el
tratamiento es eficaz.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que una o más de las primeras muestras se toman en un momento
después de que el tratamiento se haya descontinuado, en el que un
incremento en el nivel de expresión de A_{3}AR en una o más de
las segundas muestras comparado con una o más de las primeras
muestras es indicativo de que el tratamiento es eficaz.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho tratamiento terapéutico implica un fármaco
antiinflamatorio.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el estado inflamatorio es el resultado de una enfermedad
autoinmune.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide (RA).
8. A procedimiento para seleccionar un sujeto
que padece una cierta enfermedad inflamatoria para recibir
tratamiento terapéutico antiinflamatorio, que comprende la
administración al sujeto de un agonista de A_{3}AR, comprendiendo
el procedimiento la determinación del nivel de expresión de
A_{3}AR en una muestra de PBMNC tomada del sujeto y seleccionar
el sujeto para recibir dicho tratamiento antiinflamatorio
terapéutico si está por encima del nivel predeterminado.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que dicha muestra de PBMNC se toma de un sujeto antes de recibir
tratamiento antiinflamatorio.
10. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que el estado inflamatorio es el resultado de una enfermedad
autoinmune.
11. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide (RA).
12. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que dicho tratamiento antiinflamatorio terapéutico comprende
suministrar a dicho sujeto IB-MECA.
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