ES2327562T3 - Combinacion de egf/ghrp-6 para la neurorregeneracion del sistema nervioso central. - Google Patents
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Abstract
La presente invención es dirigida a estimular la neuroregeneracin del sistema nervioso central debido al daño autoinmune. En paricular la combinación farmacéutica que comprende concentracionesterapéuticamente efectivas del Factor de Crecimiento Epidérmico del Hexapéptido Secretagogo de la Hormona de Crecimiento Humanaes administrada a un sujeto que sufre de los síntomas de Esclerois Múltiple y Neuromielitis Óptica y corrige la desmielinizacióncausada por células autoreactivas en el Sistema Nervioso Central
Description
Combinación de EGF/GHRP-6 para
la neurorregeneración del sistema nervioso central.
La presente invención se refiere a medicina, y
más específicamente a neurología, y se dirige a estimular la
neurorregeneración del sistema nervioso central después de un daño
autoinmunitario, particularmente para el tratamiento y la
prevención de recaídas en pacientes con esclerosis múltiple y
neuromielitis óptica, mediante la administración de composiciones
que contienen factor de crecimiento epidérmico y péptido liberador
de hormona del crecimiento 6.
La esclerosis múltiple (EM) y la neuromielitis
óptica (NO) son enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias que
afectan a gente joven, fundamentalmente mujeres, que dan como
resultado incapacitación e invalidez que progresa con el tiempo. La
incidencia de EM está fuertemente correlacionada con parámetros
avanzados de industrialización y desarrollo en países del primer
mundo.
El sistema nervioso central (SNC) es un sitio
inmunológico en el que las reacciones autoinmunitarias se encuentran
de modo infrecuente. Esto sucede cuando, por causas no
determinadas, falla el mecanismo regulador humoral y celular, lo
que determina que las células autorreactivas contra antígenos de
mielina que se generan periféricamente (lo que a menudo es el
caso), crucen a través de la barrera hematoencefálica (BBB) en forma
de linfocitos activados y encuentren una diana en el parénquima del
sistema nervioso central. A partir de entonces tiene lugar una
serie de eventos en forma de cascada que dan como resultado
desmielinización, astrocitosis reactiva y muerte celular de
neuronas y oligodendrocitos.
La reacción autoinmunitaria dentro del sistema
nervioso central se dirige contra antígenos de mielina de modo que,
en primera instancia, el daño se limita a láminas de mielina que
cubren los axones de las neuronas principales, al oligodendrocito
que es responsable de la producción de mielina y a otro grupo de
neuronas que sufren una lesión de un modo no específico debido a la
expansión de la reacción autoinmunitaria.
La desmielinización y la muerte neuronal
resultantes por necrosis y/o apoptosis dan como resultado pérdida
de sentido y/o función motora que afectan aleatoriamente a regiones
específicas del cuerpo humano.
El proceso de remielinización en EM y NO es, en
general, limitado y transitorio. Este proceso de remielinización,
aunque posible, depende del equilibrio entre astrocitos
autorreactivos y los oligodendrocitos (John G.R., Shankar S.L.,
Shafit-Zagardo B., Massimi A., Lee S.C., Raine C.S.
y col. (2002) Multiple sclerosis: re-expression of
a developmental pathway that restricts oligodendrocyte maturation
Nature Medicine 8(10):1115-1121).
Entre las estrategias de regeneración neural, el
tratamiento con factores de crecimiento tales como el factor de
crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento de
fibroblastos bovino (bFGF) han sido propuestas muy prometedoras,
demostrando que linajes celulares multipotentes no diferenciados
aislados a partir de la corteza cerebral son responsables de estos
factores de crecimiento, diferenciando hacia linajes celulares
diferentes tales como astrocitos de tipo I y II, oligodendrocitos
mielinizantes y tipos neuronales diferentes (Mehler M.F., Gokhan S.
(1999) Postnatal cerebral cortical multipotent progenitors:
regulatory mechanisms and potential role in the development of
novel neural regenerative strategies. Brain Pathol;
9(3):515-526).
El péptido liberador de hormona del crecimiento
6 (GHRP-6) aumenta la expresión del factor de
crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1) en el
sistema nervioso central (Frago L.M., Paneda C., Dickson S.L.,
Hewson A.K., Argente J., Chowen J.A. (2002) La hormona del
crecimiento (HC) y el péptido liberador de HC 6 aumentan la
expresión del factor de crecimiento similar a insulina I en el
cerebro y activan las rutas de señalización intracelular implicadas
en la neuroprotección. Endocrinology
143(10):4113-4122).
El IGF-1 está implicado en
procesos como la maduración de oligodendrocitos (Wilson H.C.,
Onischke C., Raine C.S. (2003) Human oligodendrocyte precursor
cells in vitro: phenotypic analysis and differential response
to growth factors. Glia 44 (2):153-165), bloqueando
las rutas de apoptosis dependiente del factor de necrosis tumoral
(TNF-\alpha), protegiendo así la EM y la NO del
daño inducido por TNF-\alpha (Ye P, D'Ercole A.J.
(1999) Insulin-like growth factor 1 protects
oligodendrocytes from tumor necrosis
factor-alpha-induced injury.
Endocrinology 140(7):3063-3072) y reduce
además la expresión de moléculas del complejo de histocompatibilidad
principal de clase I (MHC-I) (Ito T, Ito N,
Bettermann A, Tokura Y, Takigawa M, Paus R. (2004) Collapse and
restoration of MHC class-I-dependent
immune privilege: exploiting the human hair follicle as a model. Am.
J. Pathol 164(2):623-634). En modelos
experimentales de encefalitis autoinmunitaria (encefatilis
autoinmunitaria experimental o EAE), el IGF-1
disminuye la lesión del endotelio vascular de la BBB, el número y el
tamaño de placas de esclerosis, lesiones patognomónicas de
esclerosis múltiple. (Li W, Quigley L, Yao D.L, Hudson L.D, Brenner
M, Zhang B.J y col. (1998) Chronic relapsing experimental autoimmune
encephalonyelitis: effects of insulin-like growth
factor-1 treatment on clinical deficits, lesion
severity, glial responses, and blood brain barrier defects. J
Neuropathol Exp Neurol 57(5):426-438).
\newpage
Cuando se administra sistémicamente, el
GHRP-6 aumenta los valores de hormona
adrecorticotrofina endógena (ACTH) (Martins M.R, Pinto A.C, Brunner
E, Silva M.R, Lengyel A.M. (2003) GH-releasing
peptide (GHRP-6)-induced ACTH
release in patients with addison's disease: effect of glucocorticoid
withdrawal. J Endocrinol Invest.
26(2):143-147). La ACTH, como factor
liberador de esteroides endógenos, tiene un efecto beneficioso
contrarrestando los trastornos autorreactivos y ha sido, durante
largo tiempo, la terapia tradicional para EM (Oishi C, Sakuta M.
(2003) Steroid therapy for multiple sclerosis. Nippon Rinsho
61(8):1361-1366).
El EGF se sintetiza localmente en el sistema
nervioso central (SNC) por microglias, macrófagos derivados de
sangre y también por algunas neuronas. Al pasar a través de la BBB y
las membranas que se apoyan en el ventrículo, el EGF es capaz de
fluir al SNC. Se ha atribuido al EGF un número determinado de
funciones fisiológicas, como desarrollo del SNC, mantenimiento y
diferenciación de células parenquimales del SNC, actuaciones que
están mucho más relacionadas con procesos de regeneración neural y
con mecanismos de supervivencia activados por agresiones
(Plata-Salaman C.R. (1991) Epidermal growth factor
and the nervous system. Peptides
12(3):653-663).
El EGF estimula la proliferación y la
supervivencia celular dentro del SNC (Thorne R.G, Hrabetova S,
Nicholson C. (2004) Diffusion of Epidermal Growth Factor in Rat
Brain Extracellular Space Measured by Integrative Optical Imaging.
J Neurophysiol 92(6):3471-3481).
Los oligodendrocitos estimulados por EGF
obtienen un potencial de remielinización mejorado. El EGF contribuye
al proceso de proliferación de oligodendrocitos facilitando así el
comienzo de la división celular y, además, la diferenciación en
células especializadas como células de Schwann, astrocitos y
oligodendrocitos maduros. El EGF promueve eventos tales como
neurogénesis dada por la generación de neuronas nuevas (Crang A.J.,
Gilson J.M., Li W.W., Blakemore W.F. (2004) The remyelinating
potential and in vitro differentiation of
MOG-expressing oligodendrocyte precursors isolated
from the adult rat CNS. Eur J Neurosci
20(6):1445-1460; Raineteau O., Rietschin L.,
Gradwohl G., Guillemot F., Gahwiler B.H. (2004) Neurogenesis in
hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosci
26(2):241-250). Estos eventos se observan
probablemente con más frecuencia después de que los
oligodendrocitos hayan experimentado el daño, sugiriendo que los
efectos mediados por EGF sobre los procesos regenerativos son
consecuencia de interacciones entre el EGF y un sistema de
transducción de señal que se activa específicamente en
oligodendrocitos dañados. Esto sugiere también que la modulación de
este sistema de transducción de señal puede amplificar mecanismos
hacia la remielinización (Wang K., Wang J. J, Wang Y., He Q.H.,
Wang X., Wang X.M. (2004) Infusion of epidermal growth factor and
basic fibroblast growth factor into the striatum of parkinsonian
rats leads to in vitro proliferation and differentiation of
adult neural progenitor cells. Neurosci Lett
364(3):154-158; Knapp P.E., Adams M.H. (2004)
Epidermal growth factor promotes oligodendrocyte process formation
and regrowth after injury. Exp Cell Res
296(2):135-144).
Durante estos últimos años se han propuesto
intervenciones terapéuticas complejas como terapias de combinación
y/o terapias sistemáticas que están lejos de ser redundantes y que
fortalecen el enfoque terapéutico, permitiendo así el acceso a
problemas patofisiológicos complejos en los puntos centrales o
claves de la enfermedad de referencia. Hasta ahora se carece de una
terapia combinada con varios factores de crecimiento o la
combinación de uno de ellos con moléculas alternativas que tienen
trofismo positivo por el SNC.
En todos los casos, una terapia ideal reduciría
los síntomas asociados con los brotes iniciales y reduciría a un
mínimo la frecuencia de recaídas. Existe, por lo tanto, la necesidad
de desarrollar un procedimiento más eficaz para usar en el
tratamiento y la prevención de recurrencia de diferentes formas
clínicas de esclerosis múltiple y neuromielitis óptica.
Se ha sugerido previamente la administración de
la combinación que comprende concentraciones terapéuticamente
eficaces de EGF y el secretagogo GHRP-6 para la
profilaxis y el tratamiento de tejidos dañados debido a déficit de
suministro de sangre arterial (documento WO 02/053167).
La presente invención se basa en un
procedimiento en el que se representa la coadministración de EGF y
GHRP-6 y un tratamiento mejorado para trastornos
autoinmunitarios del SCN. Esta combinación protege de, y revierte,
los daños asociados a autoinmunidad en procesos crónicos del SNC,
particularmente en esclerosis múltiple y neuromeilitis óptica.
En comparación con cada ingrediente por
separado, la combinación produce una eficacia de más duración y una
reducción sustancial de recaídas; en otras palabras, activa eventos
regenerativos de un modo más eficaz. Tal como se usa en el presente
documento, "eficacia de más duración" significa que los
ingredientes activos conducen a una mejora de los síntomas
asociados a la EM o la NO durante un periodo de tiempo más largo,
confiriendo incluso protección para evitar episodios de recaída.
Esto asegurará la restauración de las funciones neurológicas
afectadas como consecuencia de desmielización y perdidas neuronales
por apoptosis/necrosis provocadas por el daño autoinmunitario. Por
otra parte, los ingredientes activos de la combinación farmacéutica
son proteínas y péptidos autólogos dotados de capacidades
estimulantes de células reguladoras naturales, de modo que se
estimularían para proliferarse después de la administración del
péptido exógeno. De este modo, la respuesta autoinmunitaria puede
contrarrestarse, ya que el papel regulatorio de los linfocitos T es
para mediar constitutivamente la tolerancia inmunológica (Jörn G.,
Benedikt B., Bruno K. (2004) Medullary Epithelial Cells of the Human
Thymus Express a Highly Diverse Selection of
Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal
Clusters. J Exp Med 199(2):155-166.); (Dayne
M., Christophe B. (2004) Back to Central Tolerance. Immunity
20:509-516); (Mark S.A., Emily S.V., Ludger K.,
Zhibin C., Stuart P.B., Shannon J.T. y col. (2002) Projection of an
Immunological Self Shadow Within the Thymus by the Aire Protein.
Science 298:1395-1400) (Shimon S. (2004) Naturally
arising CD4+ regulatory T cells for immunologic
self-tolerance and negative control of immune
responses. Annual Review of Immunology
22:531-562).
Debido al efecto sinérgico entre el EGF y el
GHRP-6 en relación con eventos
neurotróficos/neurorregenerativos, esta combinación es útil en la
aceleración de procesos neurogenerativos, ayudando en las funciones
de recuperación de nervios motores y sensores perdidas por la
lesión o el daño generado de modo autoinmunatario. La combinación
del EGF y el GHRP-6 podría estar asociada con alguna
terapia antioxidante.
La administración terapéutica de la combinación
para la neurorregeneración y neuroprotección requiere unos esquemas
de administración repetidos. Como se describe en la presente
invención, el ingrediente activo denominado como EGF puede
originarse en algunas especies animales, incluyendo la ovina,
bovina, porcina y seres humanos, en su secuencia nativa o sus
variantes y a partir de alguna fuente tal como sintética, natural o
recombinante. La forma preferente en este caso es el EGF humano en
su secuencia nativa, y la más preferente de todas es el EGF
recombinante humano. El ingrediente activo denominado como péptido
liberador de hormona del crecimiento (GHRP) es el hexapéptido que
tiene la siguiente secuencia:
His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},
obtenido por síntesis química.
En un marco particular, las dosis terapéuticas
que se administran durante las crisis de EM y la NO están en el
intervalo de entre 5 y 200 \mug/kg/día para EGF y entre 0,5 y 350
\mug/kg/día para el GHRP-6 durante 20 a 30
días.
En otro marco de la presente invención, las
dosis que se administran en las fases intercrisis para prevenir
recaídas en esclerosis múltiple están en el intervalo entre 0,5 y 50
\mug/kg/día para cada uno de los ingredientes durante un periodo
de hasta 130 días. La combinación debe administrarse como bolo. Las
vías de administración serán parenterales, en venas periféricas,
intramusculares o intraperitoneales. Los vehículos implicados en la
administración incluyen solución salina normal, solución Ringer
Lactato, plasma humano, solución de albúmina humana, dextrosa al
5%, solución de gelatina o las mezclas de los mismos.
Con la expectación de lograr la máxima eficacia
terapéutica para esclerosis múltiple, en formas clínicas de
remisión-recaída o progresiva secundaria, la primera
administración debe realizarse coincidiendo con la etapa prodrómica
de la enfermedad (de forma personalizada). En las fases de remisión,
los esquemas terapéuticos sostenidos se proponen con las dosis
citadas anteriormente como preventivas de las recaídas.
En otras formas clínicas de esclerosis múltiple
se proponen esquemas de tratamiento sostenido que implican dosis
terapéuticas.
En línea con otro marco de la presente
invención, la combinación de EGF/GHRP-6 induce la
proliferación de linfocitos T reguladores naturales y adaptativos
que previenen la aparición de formas clínicas graves de EAE en
experimentos de transferencia adoptiva.
La combinación de EGF/GHRP 6 puede usarse en una
composición farmacéutica única o mezclando los ingredientes
independientes justo antes de su uso. La combinación de ingredientes
activos puede usarse mediante dispositivos de liberación lenta. Si
la formulación se descongela, debe diluirse justo antes de su
uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la eficacia terapéutica de la
combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 se estableció
un modelo animal de EAE que representa la contrapartida de la
enfermedad de la esclerosis múltiple en seres humanos.
Se inmunizaron ratas de Lewis hembra (130g)
subcutáneamente con homogeneizado de médula espinal de cobaya (5mg)
en PBS (50%) y coadyuvante de Freund completo (50%), durante los
días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización, se inició
el esquema terapéutico usando la combinación de
EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día - 740 \mug/kg/día),
los ingredientes activos independientes EGF (200 \mug/kg/día),
GHRP 6 (740 \mug/kg/día) y placebo (PBS). Este esquema
terapéutico se siguió durante 10 días, usando administración
intraperitoneal. Los registros clínicos se basaron en la siguiente
escala: 0; sin síntomas, 1; parálisis del rabo, 2; parálisis de
alguna de las extremidades posteriores, 3; parálisis completa de las
extremidades posteriores, 4; parálisis completa de las extremidades
posteriores y anteriores, 5; agonía o muerte. La pérdida de peso y
la incontinencia en los esfínteres vesical y rectal, que son signos
clínicos de la enfermedad, se registran añadiendo 0,5 al índice
clínico descrito anteriormente. Cuarenta días después de la primera
inmunización se anestesió y se eutanizó a los animales; el encéfalo
y la médula espinal se procesaron para estudios histopatológicos
(formalina al 10%, tinción con H y E y azul luxol). Para el
análisis histopatológico se consideraron los siguientes parámetros:
número y tamaño de infiltrados inflamatorios perivasculares, número
de lesiones de desmielinación, número de neuronas apoptóticas y
reactividad de células glial y astrocitos. El estudio microscópico
se realizó de forma ciega.
Como se muestra en la tabla 1, la combinación de
EGF/GHRP-6 protege a los animales inducidos
experimentalmente a desarrollar EAE; sólo el 50% de estos animales
desarrolló la forma más suave de la enfermedad, mientras que el
resto permaneció inalterado. Por el contrario, en el resto de grupos
la enfermedad tuvo un 100% de incidencia (grupos tratados con los
ingredientes activos independientes y el placebo). El índice clínico
medio en los animales tratados con la combinación de
EGF/GHRP-6 fue de 0,37 \pm 0,47. Para los grupos
tratados con ingredientes independientes el índice clínico medio
fue 1,37 \pm 1,7 para el EGF y 1,5 \pm 1,6 para el
GHRP-6, y el grupo tratado con placebo mostró un
índice clínico medio de 1,7 \pm 1,4. Por cada grupo se asignaron
ocho ratas. La comparación estadística entre los grupos fue
p<0,001. Se usó el ensayo de comparación múltiple de Newman
Keuls.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la tabla 2, los
resultados del análisis de estudio patológico del encéfalo y la
médula espinal de los animales incluidos en los diferentes grupos
muestran que incluso existiendo la misma situación referente a
astrocitos reactivos, el número (prueba t independiente, p=0,028) y
tamaño del manguito vascular en animales tratados con
EGF/GHRP-6 es inferior que en el grupo tratado con
placebo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos demostraron que la combinación
farmacéutica de EGF/GHRP protege a los animales de desarrollar
formas clínicas graves de la enfermedad. Los mecanismos que subyacen
a este efecto protector son la producción aumentada de mielina por
oligodendrocitos y la subsiguiente remielinización de las
estructuras nerviosas afectadas. Otro mecanismo está relacionado
con la integridad de la BBB, para evitar el paso de células
autorreactivas al parénquima cerebral.
Para determinar el efecto profiláctico de la
combinación de EGF/GHRP-6 en un modelo animal de
EAE, que representa la enfermedad humana de esclerosis múltiple, se
inmunizaron subcutáneamente ratas de Lewis hembra (130g) con
homogeneizado de médula espinal de cobaya (5mg) en PBS (50%) y un
coadyuvante de Freund completo (50%), los días 0 y 6. Diez días
después de la primera inmunización se inició el esquema profiláctico
usando la combinación de EGF/GHRP-6 (200
\mug/kg/día - 740 \mug/kg/día), los ingredientes activos
independientes EGF (200 \mug/kg/día), GHRP-6 (740
\mug/kg/día) y placebo (PBS). Este esquema profiláctico se siguió
durante 10 días (-10 a -1 día antes de la primera inmunización),
usando la vía de administración intraperitoneal. Los registros
clínicos se basaron en la siguiente escala: 0; sin síntomas, 1;
parálisis del rabo, 2; parálisis de alguna de las extremidades
posteriores, 3; parálisis completa de las extremidades posteriores,
4; parálisis completa de las extremidades posteriores y anteriores
5; agonía o muerte. La pérdida de peso y la incontinencia en los
esfínteres vesical y rectal, que son signos clínicos de la
enfermedad, se registran añadiendo 0,5 al índice clínico descrito
anteriormente. Cuarenta días después de la primera inmunización se
anestesió y se eutanizó a los animales; el encéfalo y la médula
espinal se procesaron para estudios histopatológicos (formalina al
10%, tinción con H y E y azul luxol). Para el análisis
histopatológico se consideraron los siguientes parámetros: número y
tamaño de infiltrados inflamatorios perivasculares, número de
lesiones de desmielinación, número de neuronas apoptóticas y
reactividad de células glial y astrocitos. El estudio microscópico
se realizó de forma
ciega.
ciega.
Tal como se muestra en la tabla 3, la
combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 que se usa en
el esquema profiláctico protegió a los animales inducidos a
desarrollar EAE. El cien por cien de los animales tratados con
EGF/GHRP-6 desarrollaron una forma suave de la
enfermedad (0,5-1 de registro clínico). Por contra,
para los grupos tratados con los ingredientes únicos, el 75%
desarrollo una forma clínica grave de EAE (3-4 de
registro clínico). El índice clínico medio que se encontró para los
animales tratados con la combinación farmacéutica de
EGF/GHRP-6 fue
0,68 \pm 0,25. Para los grupos tratados con ingredientes únicos, los índices clínicos medios fueron 2,8 \pm 0,99 para el EGF y 2,7 \pm 1,03 para el GHRP-6 (P=0,0003 en comparación con los animales tratados con EGF/GHRP-6) y el grupo tratado con placebo mostró un índice clínico medio de 3 \pm 1,4 (p=0,0011 en comparación con los animales tratados con EGF/GHRP-6) Por cada grupo se usaron ocho ratas. Para la comparación estadística se usó la prueba T de Mann Whitney; comparando el grupo tratado con la combinación y el grupo de placebo se obtuvo un valor de p=0,0011 y para los grupos tratados con ingredientes activos independientes se obtuvieron valores de p=0,0003, en comparación con el grupo tratado con la combinación farmacéutica.
0,68 \pm 0,25. Para los grupos tratados con ingredientes únicos, los índices clínicos medios fueron 2,8 \pm 0,99 para el EGF y 2,7 \pm 1,03 para el GHRP-6 (P=0,0003 en comparación con los animales tratados con EGF/GHRP-6) y el grupo tratado con placebo mostró un índice clínico medio de 3 \pm 1,4 (p=0,0011 en comparación con los animales tratados con EGF/GHRP-6) Por cada grupo se usaron ocho ratas. Para la comparación estadística se usó la prueba T de Mann Whitney; comparando el grupo tratado con la combinación y el grupo de placebo se obtuvo un valor de p=0,0011 y para los grupos tratados con ingredientes activos independientes se obtuvieron valores de p=0,0003, en comparación con el grupo tratado con la combinación farmacéutica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se observa en la tabla 4, el análisis
patológico del encéfalo y la médula espinal en los grupos
experimentales muestra que incluso en el mismo caso de astrocitos
reactivos, el número (prueba T independiente, p=0,025) y tamaño del
manguito perivascular en animales tratados profilácticamente con
EGF/GHRP-6 era menor e inferior que el grupo
tratado con placebo.
Este experimento demostró que la combinación
farmacéutica de EGF/GHRP-6 que se usa protege
profilácticamente los animales de desarrollar EAE en su forma
clínica más grave. Además, demostró una fuerte correlación entre la
evolución clínica y los hallazgos histológicos. Los mecanismos que
explican este efecto protector están relacionados con la inducción
de diferenciación de células precursoras neuronales hacia
oligodendrocitos que serán precondicionados y activos en la
producción de mielina. La conservación de la integridad de la BBB
prevendrá el paso de células autorreactivas hacia el parénquima
cerebral; esto es otro evento que explica el papel protector de la
combinación farmacéutica de EGF/GHRP-6 que se usa de
modo preventivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Buscando un intervalo de dosificación para la
combinación farmacéutica que fuera eficaz para los efectos
terapéuticos, ésta se usó en las ratas Lewis hembra (130g) del
modelo de EAE mencionado anteriormente, que se inmunizaron
subcutáneamente con homogeneizado de médula espinal de cobaya (5mg)
en PBS (50%) y coadyuvante de Freund completo (50%), durante los
días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización, se inició
el esquema terapéutico usando la combinación de
EGF/GHRP-6 en diferentes concentraciones
EGF/GHRP-6 (400
\mug/kg/día-1480 \mug/kg/día).
EGF/GHRP-6 (200
\mug/kg/día-740 \mug/kg/día).
EGF/GHRP-6 (100
\mug/kg/día-340 \mug/kg/día).
EGF/GHRP-6 (50
\mug/kg/día-170 \mug/kg/día).
EGF/GHRP-6 (25
\mug/kg/día-85 \mug/kg/día).
EGF/GHRP-6 (12
\mug/kg/día-40 \mug/kg/día).
Este esquema terapéutico se siguió durante 10
días, usando administración intraperitoneal. Los registros clínicos
se basaron en la siguiente escala: 0; sin síntomas, 1; parálisis del
rabo, 2; parálisis de alguna de las extremidades posteriores, 3;
parálisis completa de las extremidades posteriores, 4; parálisis
completa de las extremidades posteriores y anteriores 5; agonía o
muerte. La pérdida de peso y la incontinencia en los esfínteres
vesical y rectal, que son signos clínicos de la enfermedad, se
registran añadiendo 0,5 al índice clínico descrito anteriormente.
Cuarenta días después de la primera inmunización se anestesió y se
eutanizó a los animales; el encéfalo y la médula espinal se
procesaron para estudios histopatológicos (formalina al 10%, tinción
con H y E y azul luxol). Para el análisis histopatológico se
consideraron los siguientes parámetros: número y tamaño de
infiltrados inflamatorios perivasculares, número de lesiones de
desmielinación, número de neuronas apoptóticas y reactividad de
células glial y astrocitos. El estudio microscópico se realizó de
forma ciega.
En el grupo tratado con
EGF/GHRP-6 (400 \mug/kg/día-1480
\mug/kg/día), el 25% de los animales permaneció inalterado y el
75% de los animales mostró una forma suave de la enfermedad
(0,5-1). El índice clínico medio fue
0,62 \pm 0,44. En el grupo tratado con EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día-740 \mug/kg/día), el 25% de los animales permaneció inalterado y el 75% de los animales mostró una forma suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico medio fue
0,5 \pm 0,37.
0,62 \pm 0,44. En el grupo tratado con EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día-740 \mug/kg/día), el 25% de los animales permaneció inalterado y el 75% de los animales mostró una forma suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico medio fue
0,5 \pm 0,37.
En el grupo tratado con
EGF/GHRP-6 (100 \mug/kg/día-340
\mug/kg/día), el 12,5% de los animales permaneció inalterado y el
87,5% de los animales mostró una forma suave de la enfermedad
(0,5-1). El índice clínico medio fue
0,62 \pm 0,35.
0,62 \pm 0,35.
En el grupo tratado con
EGF/GHRP-6 (50 \mug/kg/día-170
\mug/kg/día), el 100% de los animales desarrollaron EAE, el 12,5%
con una forma clínica intermedia (2) y el resto mostró una forma
suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico
medio fue 0,93 \pm 0,49.
En el grupo tratado con
EGF/GHRP-6 (25 \mug/kg/día-85
\mug/kg/día), el 100% de los animales desarrollaron EAE, el 37,5%
con una forma clínica intermedia (2) y el resto mostró una forma
suave de la enfermedad (0,5-1). El índice clínico
medio fue 1,25 \pm 0,65.
En el grupo tratado con
EGF/GHRP-6 (12 \mug/kg/día-40
\mug/kg/día), el 100% de los animales desarrollaron EAE, el 12,5%
con la forma más grave (3), el 37,5% con una forma clínica
intermedia (2) y el resto mostró una forma suave de la enfermedad
(0,5-1). El índice clínico medio fue 1,37 \pm
0,87.
Las tablas 5 y 6 muestran los resultados
clínicos y los histopatológicos. El análisis histopatológico mostró
que no había diferencias estadísticas en el número de los
infiltrados perivasculares linfocíticos en los grupos inducidos EAE
tratados con EGF/GHRP-6 (400
\mug/kg-1480 \mug/kg, 200
\mug/kg-740 \mug/kg, 100
\mug/kg-340 \mug/kg, 50
\mug/kg-170 \mug/kg y 25
\mug/kg-85 \mug/kg). En el caso del grupo
tratado con la combinación farmacéutica de
EGF/GHRP-6 (12 \mug/kg-40
\mug/kg), el número de infiltrados perivasculares mostró una
tendencia a ser superior (p=0,040), pero esta diferencia no fue
estadísticamente significativa. Estos resultados demostraron que
hay un intervalo de 50-400 \mug/kg/día para el EGF
y de 170 \mug/kg/día- 1,4 mg/kg/día para el
GHRP-6, que permite a la formulación de la
combinación mantener su utilidad para la protección contra la
inducción de EAE (Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron subcutáneamente veinte ratas
Lewis hembra (130g) con homogeneizado de médula espinal de cobaya
(5mg) en PBS (50%) y el coadyuvante de Freund completo (50%), los
días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización, el
esquema terapéutico se inició usando la combinación de
EGF/GHRP-6 (200 \mug/kg/día-740
\mug/kg/día) y se siguió durante otros 10 días mediante su
administración intraperitoneal en diez de las ratas inmunizadas
(Grupo A). Las otras 10 ratas se trataron con placebo PBS (Grupo B).
Una semana después de la última administración, los animales de
ambos grupos se anestesiaron para el sangrado y de este modo se
obtuvieron linfocitos mononucleares de sangre periférica. Los
linfocitos procedentes de los grupos A y B se trataron para el
segregado de linfocitos CD4+.
El análisis mediante FACS de los linfocitos
CD4+CD25+ fue 14,67% en el grupo A y 3,8% en el grupo tratado con
PBS (grupo B).
Otras ratas de Lewis hembra (130g) se
inmunizaron subcutáneamente con homogeneizado de médula espinal de
cobaya (5mg) en PBS (50%) y el coadyuvante de Lewis completo (50%),
los días 0 y 6. Diez días después de la primera inmunización se
transfirió de modo intravenoso adoptivamente un subgrupo (n=8) con
500.000 linfocitos CD4+ procedentes del grupo A. Otro subgrupo
(n=8) se transfirió de modo intravenoso adoptivamente con 500.000
linfocitos CD4+ procedentes del grupo B.
Los registros clínicos se basaron en la
siguiente escala: 0; sin síntomas, 1; parálisis del rabo, 2;
parálisis de alguna de las extremidades posteriores, 3; parálisis
completa de las extremidades posteriores, 4; parálisis completa de
las extremidades posteriores y anteriores 5; agonía o muerte. La
pérdida de peso y la incontinencia en los esfínteres vesical y
rectal, que son signos clínicos de la enfermedad, se registran
añadiendo 0,5 al índice clínico descrito anteriormente. Cuarenta
días después de la primera inmunización se anestesió y se eutanizó
a los animales; el encéfalo y la médula espinal se procesaron para
estudios histopatológicos (formalina al 10%, tinción con H y E y
azul luxol). Para el análisis histopatológico se consideraron los
siguientes parámetros: número y tamaño de infiltrados inflamatorios
perivasculares, número de lesiones de desmielinación, número de
neuronas apoptóticas y reactividad de células glial y astrocitos. El
estudio microscópico se realizó de forma ciega.
Tal como se muestra en la tabla 7, la
transferencia de linfocitos CD4+ en animales inducidos a EAE y
tratados con la combinación farmacéutica, protege al hospedador de
desarrollar EAE. Solo el 50% de los animales transferidos con
linfocitos CD4+ procedentes del grupo A desarrollaron una forma
suave de EAE (0,5-1 de registro clínico), el
restante 50% permaneció inalterado. Por el contrario, el 100% de los
animales transferidos adoptivamente con linfocitos CD4+ procedentes
del grupo B desarrollaron EAE, el 62,5% con la forma clínica grave
(2-4 de registro clínico) y el 37,5% con una forma
clínica suave (0,5-1 de registro clínico). El índice
clínico medio fue 0,31 \pm 0,34 en el subgrupo transferido
adoptivamente con CD4+ procedente del grupo A. El índice clínico
medio fue 2,1 \pm 0,99 en el subgrupo transferido adoptivamente
con CD4+ procedente del grupo B (P =0,0003). Se usó la prueba de
Mann Whitney para el análisis estadístico.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 8, los análisis
histológicos del encéfalo y la médula espinal en los grupos
experimentales mostraron que incluso existiendo la misma situación
en relación con astrocitos reactivos, el número (p=0,0001) y tamaño
de los manguitos vasculares en las ratas hospedadoras para los CD4+
procedentes del grupo A son inferiores que en las ratas a las que
se transfirió adoptivamente linfocitos CD4+ procedentes del grupo
B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demostraron que el tratamiento
con la combinación farmacéutica es capaz de inducir la proliferación
de linfocitos T reguladores naturales que protegen del desarrollo
de formas clínicas graves de EAE en experimentos de transferencia
adoptivos.
Claims (8)
1. Uso del factor de crecimiento epidérmico
(EGF) y del péptido liberador de hormona del crecimiento 6
(GHRP-6) para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento y mejora de trastornos del sistema nervioso central
en un paciente que padece de un síntoma o complicación relacionada
con desmielinización, degeneración neuronal y muerte celular
neuronal por apoptosis o necrosis, en el que las enfermedades antes
mencionadas tienen una etiología autoinmunitaria.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que el EGF es EGF humano.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el
que el EGF humano se obtiene a partir de una fuente natural,
mediante tecnología recombinante o síntesis química.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 3, en el que el trastorno del sistema nervioso
central es:
a. Esclerosis múltiple;
b. Neuromielitis óptica.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la combinación de
EGF-2GHRP-6 se administra
intravenosa, intramuscular o intraperitonealmente o mediante el uso
de un dispositivo de liberación controlada.
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el medicamento se administra
parenteralmente en un esquema terapéutico durante un periodo de 20 a
30 días, en un intervalo de dosificación de entre 5 y 10 \mug de
cada ingrediente independiente, por kilogramo de peso del cuerpo del
paciente por día.
7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el medicamento se administra
parenteralmente durante las remisiones, durante un periodo de hasta
130 días, en un intervalo de dosificación de entre 1 y 5 \mug de
cada ingrediente independiente, por kilogramo de peso del cuerpo del
paciente por día.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que el medicamento induce la proliferación de linfocitos T
reguladores naturales y adaptativos.
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