ES2327657T3 - Metodo para intensificacion de la expresion de genes en las plantas. - Google Patents
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Abstract
Un constructo genético para la expresión de un polipéptido en una célula de planta, que comprende: (a) un promotor operativo dentro de dicha célula de planta, (b) el primer intrón del gen FAD2, en donde dicho gen FAD2 procede de Arabidopsis thaliana, y en donde dicho primer intrón se representa por SEQ ID NO 1, (c) una secuencia de nucleótidos enlazada operativamente a dicho promotor, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica dicho polipéptido, (d) un sitio de poliadenilación (PAA) enlazado operativamente a dicha secuencia de nucleótidos, en donde dicho promotor no es un promotor FAD2 natural y en donde dicho intrón está insertado entre dicho promotor y el comienzo de la traducción de dicha secuencia de nucleótidos.
Description
Método para intensificación de la expresión de
genes en las plantas.
Están disponibles sistemas de transformación
eficientes en las plantas, en particular en especies de
monocotiledóneas, especialmente aquéllas de importancia económica
tales como maíz, trigo, cebada y arroz. Actualmente es posible
contemplar la introducción de una serie de rasgos por dicha técnica.
Las técnicas utilizadas más ampliamente son el suministro de DNA
desnudo por bombardeo con microproyectiles o el uso de Agrobacterium
como vector. En ambos casos, el gen de interés y las secuencias
asociadas se introducen en un tejido vegetal diana adecuado y
llegan a integrarse de manera estable en el genoma de la planta. El
tejido diana tiene el potencial de regenerarse en una planta
completa plenamente fértil.
A fin de que se exprese el gen introducido, el
mismo debe estar dirigido por un promotor. Los promotores pueden
ser de tipos diferentes; constitutivos o tisulares y temporalmente
específicos. Promotores utilizados en gran escala incluyen los
derivados de virus y bacterias; con inclusión del Virus 35S del
Mosaico de la Coliflor y octopina y
nopalina-sintasa y RuBISCo, actina y ubiquitina
procedentes de especies de plantas.
Los promotores utilizados más ampliamente son
constitutivos debido a que los mismos se utilizan generalmente para
controlar el gen marcador seleccionable y pueden utilizarse también
para dirigir el gen de interés.
Aunque se conocen promotores adecuados para
especies de monocotiledóneas, no se dispone de números suficientes
para uso en aplicaciones de biotecnología. La transformación puede
requerir que un promotor dirija el marcador seleccionable y un
promotor separado dirija el gen de interés.
De hecho es indeseable utilizar el mismo
promotor para ambos genes por varias razones. Inicialmente, la
clonación y preparación de los constructos se hace problemática.
Las duplicaciones de secuencias pueden conducir a deleciones de
genes y otras corrupciones que podrían dar como resultado la
eliminación de la expresión génica. La duplicación de secuencias
subsiguientemente en las plantas puede dar como resultado la
silenciación de genes. En consideración a más largo plazo de los
programas de mejora genética, apilamiento de genes por
retransformación o cruzamiento de líneas transgénicas existentes,
la carencia de elección de promotores resultará cada vez más
limitante.
Se prefieren promotores fuertes, debido a que la
eficiencia de producción de plantas transgénicas útiles se
incrementa, por dos vías. En primer lugar, se seleccionan
inicialmente más plantas en cultivo de tejidos debido a la
expresión suficiente del marcador seleccionable para sobrevivir a
las condiciones de selección, y en segundo lugar más plantas
seleccionadas de este modo tendrán un fenotipo satisfactorio
resultante de la expresión del gen o genes de interés. Con objeto
de intensificar el número de promotores adecuados se descubrió que
la fuerza de un promotor puede incrementarse por el uso de un
intrón.
Los intrones interrumpen las regiones
codificantes de los genes eucariotas y se eliminan después de la
transcripción por el proceso de remodelación. Se sabe que la
expresión de genes en las células animales es dependiente de los
intrones desde los últimos años 1970, pero la primera demostración
del efecto de la inclusión de un intrón en una especie de planta no
llegó hasta 1987 (Callis et al., Genes and Development
1:1183-1200).
Los intrones utilizados más ampliamente son los
primeros intrones de Actina del arroz y Ubiquitina del maíz,
utilizados en combinación con los promotores naturales. Estos
promotores fueron los primeros promotores fuertes identificados
para especies de monocotiledóneas. La actina del arroz se identificó
inicialmente como un gen candidato adecuado para provisión de un
promotor constitutivo fuerte debido a que la actina es un componente
fundamental y esencial de la célula eucariota y del citoesqueleto.
Se identificó un gen de actina del arroz que codificaba un
transcrito que era abundante en todos los tejidos del arroz y todas
las etapas del desarrollo (McElroy et al., 1990, Plant Cell
2:163.) La caracterización ulterior reveló que la presencia del
primer intrón era esencial para la función eficiente del promotor
per se. Análogamente, se identificó el promotor ubiquitina
del maíz, que tenía una actividad constitutiva de alto nivel
dependiente de la presencia de su propio primer intrón (Morris
et al 1993, Plant Molecular Biology
21:895-906).
El efecto intensificador del primer intrón de
actina del arroz y el primer intrón de ubiquitina del maíz puede
combinarse también con secuencias promotoras heterólogas que por sí
solas tienen una actividad mínima en especies de monocotiledóneas.
(Vain et al, 1996, Plant Cell Reports
15:489-494).
Se han identificado un número limitado de
intrones de plantas que pueden combinarse con promotores heterólogos
subóptimos para crear nuevos promotores suficientemente fuertes
para utilización en aplicaciones biotecnológicas. Las primeras
comparaciones de una serie de intrones revelaron que no todos tienen
una actividad significativamente intensificadora en combinación con
un promotor subóptimo. (Vain et al, 1996).
Sin embargo, la duplicación de intrones es
deseable por las mismas razones que debería evitarse la duplicación
de promotores.
Existe por tanto una necesidad continua de
identificar nuevos intrones adecuados para intensificar la expresión
en plantas, y especialmente en sistemas de transformación de
monocotiledóneas. Estos intrones precisan ser capaces de
intensificar el nivel de expresión cuando se combinan con diversos
promotores.
En el momento actual existen muy pocos intrones
de este tipo identificados, y esto limita últimamente el número de
transformaciones genéticas que pueden realizarse en una especie de
monocotiledónea dada.
La invención proporciona ahora un nuevo intrón
que es utilizable para intensificar la expresión de un gen
heterólogo en una célula de planta, en particular una célula de
planta monocotiledónea, tal como trigo, maíz, cebada, o arroz.
Los inventores han observado de hecho
sorprendentemente que la presencia del primer intrón del gen FAD2 de
Arabidopsis, que se creía no tenía efecto alguno sobre la
expresión, puede intensificar eficazmente la eficiencia de un
promotor.
El gen FAD2 es el gen que codifica la desaturasa
microsómica del ácido graso \omega-6
(FAD2/delta-12-desaturasa), y su
secuencia es bien conocida por las personas expertas en la técnica,
una vez que se dispone de la secuencia del genoma del cromosoma 3
de Arabidopsis thaliana.
Han sido identificados otros genes FAD2 (por
ejemplo Brassica oleracea, representada por AF181726 en
GenBank, soja con el número de acceso a proteínas de GenBank
P48628, Brassica napus, número de acceso a proteínas de
GenBank P48627 ...). La identificación de los primeros intrones de
genes FAD2 de otras especies está totalmente dentro de la
experiencia de los especialistas en la técnica, por las diferencias
entre las secuencias de cDNA y genómicas.
Figura 1: Representación esquemática de
pJIT65del
Figura 2: Representación esquemática de
pWP443A
Figura 3: Representación esquemática de
pWP461
Figura 4: Representación esquemática de
pWP464
Figura 5: Representación esquemática de
pWP480
Figura 6: Representación esquemática de
pWP500
Figura 7: Representación esquemática de
pWP514
Figura 8: Comparación de la expresión
transitoria en trigo. Se bombardearon embriones con 3 promotores con
y sin intrón FAD2.
Figura 9: Comparación de la expresión
transitoria en la cebada: a) se bombardearon embriones con pWP480;
b) se bombardearon embriones con pWP500.
Figura 10: Hojas de trigo transformado de manera
estable con a) pBSV sin intrón FAD2, o b) pBSV con intrón FAD2.
La invención se refiere, así pues, a un
constructo genético para la expresión de un polipéptido en una
célula de planta, que comprende:
- (a)
- un promotor operativo dentro de dicha célula de planta,
- (b)
- el primer intrón de un gen FAD2 como se especifica más adelante,
- (c)
- una secuencia de nucleótidos enlazada operativamente a dicho promotor, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica dicho polipéptido,
- (d)
- un sitio de poliadenilación (PAA) enlazado operativamente a dicha secuencia de nucleótidos.
Dicho polinucleótido se denomina
"polinucleótido de interés" y está codificado por un "gen de
interés".
\newpage
Debe entenderse que un "promotor operativo en
una célula de planta" significa una secuencia que dirige la
iniciación de la transcripción en una célula de planta. La misma
puede proceder de una o múltiples fuentes, y ser natural o
sintética.
En la realización preferida, el constructo
genético de la invención es tal que dicho gen FAD2 procede de
Arabidopsis thaliana (GenBank AJ271841), en donde dicho
primer intrón se representa por SEQ ID NO 1, como se indica en SEQ
ID NO 3, 5, 7 y 8.
En el contexto de la presente invención, "la
totalidad o parte del primer intrón de un gen FAD2" debe
considerarse como la secuencia completa del primer intrón de un gen
FAD2, o un fragmento que comprende al menos 200, 500 ó 1000
nucleótidos de dicha secuencia.
El promotor podría ser cualquier promotor como
se ha descrito arriba. En una realización preferida, dicho promotor
es un promotor específico de tejido. En otra realización, dicho
promotor es un promotor constitutivo. Así pues, está claro que el
promotor considerado es un promotor heterólogo, es decir diferente
del promotor FAD2 natural.
Secuencias promotoras de genes que se expresan
naturalmente en plantas pueden ser de origen vegetal, bacteriano o
viral. Promotores constitutivos adecuados incluyen, pero sin
carácter limitante, los promotores de
octopina-sintasa, nopalina-sintasa,
manopina-sintasa derivada del T-DNA
de Agrobacterium tumefaciens; CaMV35S y CaMV19S de Virus del
Mosaico de la Coliflor; actina de arroz, ubiquitina de maíz e
histona de especies de plantas.
Promotores específicos de tejidos incluyen, pero
sin carácter limitante, rolC de Agrobacterium rhizogenes;
RTBV del Virus Baciliforme del Arroz Tungro; glutenina LMW y HMW del
trigo; alcohol-deshidrogenasa, zeína cérea de maíz,
y AoPR1 de Asparagus.
Todos estos promotores (y otros) se describen
detalladamente en la técnica.
Si bien los promotores utilizados más
ampliamente son constitutivos o específicos de tejido, es también
posible contemplar el uso de promotores inducibles tales como
Pin-II o AoPRT-L (WO 99/66057); más
específicamente inducibles por luz, con inclusión de la subunidad
pequeña de RUBISCO y la proteína de fijación de clorofila a/b de
una serie de especies, y promotores sintéticos, v.g. EMU (US
19900525866).
El constructo genético de acuerdo con la
invención se produce dentro de la célula de la planta en un vector.
En una realización, dicho vector se mantiene como un vector
episómico dentro de la célula de la planta. En la realización
preferida, dicho vector es capaz de integración dentro del genoma de
dicha célula de planta. La integración de un constructo genético
dentro de una célula de planta se realiza utilizando métodos
conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo
transformación por Agrobacterium, o bombardeo con cañón
electrónico.
Agrobacterium tumefaciens ha sido
utilizado amplia y eficientemente para transformar numerosas
especies de dicotiledóneas y con inclusión de monocotilédoneas
tales como maíz, arroz, cebada y trigo (WO 00/63398). Métodos
alternativos de transferencia y transformación de genes incluyen
transformación de protoplastos mediante calcio, polietilenglicol o
adsorción de DNA desnudo mediada por electroporación. Métodos
adicionales incluyen introducción de DNA en células intactas o
tejidos regenerables por microinyección, fibras de carburo de
silicio o, más ampliamente, bombardeo con microproyectiles. Todos
estos métodos son actualmente bien conocidos en la técnica.
La invención se refiere por tanto a un método
para intensificación de la expresión de un polipéptido en una
célula de planta, que comprende el paso de introducir el constructo
genético de la invención en dicha célula de planta, por ejemplo
utilizando los métodos que se han mencionado arriba. La expresión se
intensifica en comparación con la expresión obtenida cuando no está
presente en el constructo el intrón FAD2.
La expresión hace referencia a transcripción y
traducción de un gen de tal modo que se fabrica una proteína.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para intensificar la expresión de un gen, bajo el control de
un promotor en una célula de planta, comprendiendo dicho métodos los
pasos de:
- (a)
- insertar el primer intrón del gen FAD2 como se define arriba entre dicho promotor y el comienzo de la traducción de dicho gen, formando de este modo un gen modificado con intrón; y
- (b)
- introducir dicho gen modificado con intrón en una célula de planta de tal modo que dicho gen se expresa bajo el control de dicho intrón en dicha célula de planta, con lo cual se incrementa la tasa de expresión de dicho gen en comparación con un gen no modificado.
Dicho gen se denomina "gen de interés".
En particular, dicho gen puede ser un marcador
seleccionable. Estos marcadores seleccionables incluyen, pero sin
carácter limitante, genes de resistencia a antibióticos, genes de
resistencia a herbicidas o genes marcadores visibles. Otros
marcadores fenotípicos se conocen en la técnica y pueden utilizarse
en esta invención.
Se conocen en la técnica cierto número de
agentes selectivos y genes de resistencia. (Véase, por ejemplo,
Hauptmann et al., 1988; Dekeyser et al., 1988;
Eichholtz et al., 1997; y Meijer et al., 19991).
Señaladamente, el marcador seleccionable
utilizado puede ser el gen bar que confiere resistencia a bialafós
(White et al., 1990), el gen de resistencia al herbicida de
sulfonamida Asulam, suI (descrito en WO 98/49316) que codifica una
dihidropterato-sintasa (DHPS) tipo I, el gen NPTII
que confiere resistencia a un grupo de antibióticos que incluyen
kanamicina, G418, paromomicina y neomicina (Bevan et al.,
1983), el gen hph que confiere resistencia a higromicina (Gritz
et al., 1993), el gen EPSPS que confiere resistencia a
glifosato (US 5188642), el gen HPPD que confiere resistencia a
isoxazoles (WO 96/38567), el gen que codifica la enzima GUS, la
proteína verde fluorescente (GFP), cuya expresión confiere una
característica física reconocible a las células transformadas, el
gen de cloramfenicol-transferasa, cuya expresión
destoxifica el cloranfenicol.
En otra realización, dicho gen codifica una
proteína que imparte resistencia a insectos, más preferiblemente
genes que codifican las endotoxinas de Bacillus thuringiensis
(Bt) (inter alia, las patentes EE.UU. Núms. 5.460.963;
5.683.691; 5.545.565; 5.530.197; 5.317.096). Los ácidos nucleicos
que están abarcados preferiblemente por la presente invención son
los genes cryI, cryII, cryIII y cryIV. Más preferiblemente, los
genes incluyen: cryIA (a), cryIA (b); cryIA (c); y cryIIIA (a). Muy
preferiblemente, el gen es cryIA (a), cryIA (b) o cryIA (c).
Otros genes de interés son:
- -
- el gen bacteriano dapA para intensificar el nivel de lisina;
- -
- el gen para endotoxina Bt o para un inhibidor de proteasa o para proteínas extraídas de bacterias tales como Photorabus (WO 97/17432 & WO 98/08932), para resistencia a los insectos;
- -
- entre las proteína so péptidos de interés que confieren nuevas propiedades de resistencia a enfermedades, se hará mención en particular de quitinasas (WO 92/01792), glucanasas (WO 93/02197), oxalato-oxidasa (WO 94/13790) o péptidos antibacterianos y/o antifúngicos, en particular los péptidos que contienen menos de 100 aminoácidos ricos en cisteínas, tales como tioninas o defensinas de plantas, y más particularmente péptidos líticos de cualquier origen que comprenden uno o más enlaces disulfuro entre las cisteínas y regiones que comprenden aminoácidos básicos, en particular los péptidos líticos siguientes: androctonina (WO 97/30082 y WO 99/09189), drosomicina (WO 99/02717), tanatina (WO 99/24594) o heliomicina (WO 99/53053). De acuerdo con una realización particular de la invención, la proteína o péptido de interés se selecciona de péptidos indirectos fúngicos, en particular elicitinas (Kamoun et al., 1993); Panabiéres et al., 1995);
- -
- genes implicados en los procesos biosintéticos que conducen a un cambio en la calidad de los productos de la planta transgénica, tales como los genes que codifican enzimas para la biosíntesis o la degradación del almidón (a saber sintasas, enzimas ramificadoras del almidón, etc.); genes que codifican proteínas de almacenamiento de granos (es decir subunidades de gluteninas, gliadinas, hordeínas); genes relacionados con la solidez del grano en el trigo (es decir puroindolinas);
- -
- genes que modifican la constitución de las plantas modificadas, en particular el contenido y la calidad de ciertos ácidos grasos esenciales (EP 666918) o el contenido y la calidad de las proteínas, en particular en las hojas y/o los granos de dichas plantas. Se hará mención, en particular, de los genes que codifican proteínas enriquecidas en aminoácidos que contienen azufre (Korit, A.A. et al.; WO 98/20133; WO 97/41239; WO 95/31554; WO 94/20828; WO 92/14822). La función de estas proteínas enriquecidas en aminoácidos que contienen azufre será también atrapar y almacenar el exceso de cisteína y/o metionina; haciendo posible así evitar los posibles problemas de toxicidad ligados a una superproducción de estos aminoácidos que contienen azufre por captura de los mismos. Puede hacerse también mención de genes que codifican péptidos ricos en aminoácidos que contienen azufre, y más particularmente en cisteínas, teniendo también dichos péptidos actividad antibacteriana y/o antifúngica. Se hará mención más particularmente de las defensinas de las plantas, y también de péptidos líticos de cualquier origen, y más particularmente los péptidos líticos siguientes: androctonina (WO 97/30082 y WO 99/09189), drosomicina (WO 99/02717), tanatina (WO 99/24594) o heliomicina (WO 99/53053);
- -
- pueden utilizarse también genes para esterilidad artificial masculina (a saber, barnasa y PR-glucanasa bajo el control de un promotor adecuado), para la producción de semillas híbridas.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
del primer intrón del gen FAD2 como se define arriba para
intensificación de la expresión de un polipéptido en una célula de
planta.
En otro aspecto, el primer intrón FAD2 como se
define arriba puede utilizarse para convertir un promotor específico
de tejido en un promotor constitutivo. Por ejemplo, el promotor
fuerte de glutenina de HMW específico de semillas se convierte en
un promotor fuerte/útil activo en muchos tipos de tejidos, cuando se
utiliza con el primer intrón FAD2.
Todas las modificaciones y digestiones de DNA se
realizaron utilizando enzimas de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes y siguiendo protocolos descritos en Sambrook y
Russell, 2001; Molecular Cloning, A Laboratory Manual.
El primer intrón del gen FAD2 se obtuvo por la
reacción en cadena de polimerasa (PCR) a partir de DNA genómico de
Arabidopsis thaliana. Se utilizaron el par de iniciadores
siguiente:
Se llevó a cabo una reacción PCR estándar, con
amplificación en las condiciones siguientes: 30 ciclos de 97ºC
durante 30 segundos, 57ºC durante 30 segundos y 64ºC durante 1
minuto 40 segundos. Los productos de reacción se separaron por
electroforesis en gel de agarosa.
El producto deseado de 1146 pb se escindió del
gen y se ligó en el sitio de restricción SmaI de pTZ18 (vector de
clonación estándar; Pharmacia) para crear pWP430. La fidelidad del
clon se confirmó por secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificaron varios promotores, que son
conocidos en el campo de la biotecnología de plantas, para ser
testados con y sin el intrón FAD2. Éstos incluían, pero sin carácter
limitante, el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor
(Odell et al, Nature, 1985, Feb 28 - Mar 6; 313 (6005:
810-2), el promotor del Virus de las Estrías del
Plátano de ORF1 (WO 99/43836), Sc4, un miembro de la familia de
promotores de la Expresión de Plantas (PLEX) (EP 785999; US
6211431) y el promotor glutenina HMW (HMWG). Se prepararon
constructos a partir de elementos genéticos bien caracterizados y
se clonaron en vectores de plásmido ampliamente utilizados.
El promotor 35S se clonó en un vector pUC, que
dirigía el gen GUS (Jefferson et al., PNAS
83:8447-8451, 1986), para obtener el plásmido
pJIT65. Este plásmido se modificó por digestión con XbaI y
EcoRI para eliminar los sitios interpuestos BamHI y
SmaI. Esta versión modificada se designó como pJIT65del.
Se insertó el intrón FAD2 entre el promotor 35S
y el gen GUS, específicamente en la 5'UTR, por digestión de pWP430
con SmaI y ligación del intrón en pJIT65del digerido con
SmaI, para crear pWP443A.
El promotor BSV se clonó en el sitio
EcoRV de Bluescript KS para crear pWP453B. Se utilizaron los
iniciadores siguientes:
Se digirió pWP453B con SstI y SalI
para aislar el fragmento del promotor BSV que se ligó luego en
JTr65del digerido con SstI y SalI, reemplazando así el
promotor 35S para crear pWP461.
Para crear la combinación del promotor BSV con
el intrón FAD2, se reemplazó el promotor 35S de pWP443A por el
promotor BSV de pWP461. Ambos plásmidos se digirieron con
SstI y BamHI, y los fragmentos se ligaron para producir
pWP464.
Un constructo preparado previamente, pKH2, que
tenía el promotor Sc4 que dirigía el gen GUS, con la inclusión del
primer intrón de actina de arroz en la 5'UTR, se digirió con SstII y
NcoI para eliminar el intrón de actina y crear pWP480.
Análogamente a la creación de pWP464, para
combinar el promotor Sc4 con el intrón FAD2, el promotor 35S de
pWP443A se reemplazó por el promotor Sc4 de pWP480 utilizando
materiales digeridos adecuados.
Un clon pUC del promotor HMWG que dirigía el gen
GUS (Glu-1Dx5-GUS2) se obtuvo como
se describe en Halford et al. 1989 (Plant Science 62,
207-16). El intrón FAD2 se insertó entre el promotor
HMWG y el gen GUS, específicamente en la 5'UTR, para crear
pWP514.
\vskip1.000000\baselineskip
Se bombardearon una serie de tejidos y callos de
plantas con partículas recubiertas con uno de los cuatro
constructos promotores que incluían el intrón FAD2, de acuerdo con
métodos conocidos en la técnica. Se sumergieron los tejidos en una
solución del sustrato histoquímico, X-glucurónido, y
se realizó una evaluación subjetiva de la actividad del constructo.
En cada caso, se observaron un número significativo de manchas
azules en cada uno de los tejidos testados.
Es especialmente digno de mención que se
observaba una expresión significativa en los tejidos de hoja y
embrión después del bombardeo con el constructo HMWG (pWP514). El
promotor HMWG es un promotor natural fuerte específico del
endospermo. La inclusión del intrón FAD2 ha convertido el mismo en
un promotor constitutivo fuerte.
Una vez establecido que los promotores
modificados por la inclusión del intrón FAD2 eran funcionales, se
realizó una comparación cuantitativa entre los promotores con y sin
el intrón.
Se dispusieron embriones aislados en sistemas de
4 x 4. Se bombardearon 32 embriones con cada constructo.
Se realizó bombardeo simultáneo con un segundo
constructo que contenía la Proteína Verde Fluorescente (GFP) bajo
control del promotor actina del arroz. La expresión de GFP puede
testarse de modo no destructivo y con ello puede normalizarse la
eficiencia de cada bombardeo individual para permitir la comparación
entre los bombardeos individuales.
El nivel de expresión para cada constructo se
evaluó de nuevo visualmente por ensayo histoquímico para el gen GUS
(Figura 8) lo que permitió a la vez una evaluación cuantitativa (por
recuento de número de focos azules por sistema 4 x 4), y
cualitativa (consideración del tamaño de los focos azules).
El aumento en la expresión debida a la inclusión
del intrón FAD2 era de 5,6 veces para el promotor Sc4, ocho veces
para el promotor doble 35S y, lo que era más notable, 161 veces para
el promotor BSV. Por tanto, la expresión del promotor más débil
(BSV) se incrementa hasta un nivel comparable con el promotor
ubiquitina del maíz (pAAA) que se utiliza ampliamente debido a que,
como se sabe, se trata de un promotor muy fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un control negativo que contenía únicamente
partículas de oro no producía mancha alguna.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron otros experimentos de bombardeo
sobre embriones de cebada. Los resultados demostraron también que
la presencia del intrón FAD2 aumenta la expresión de la proteína GUS
en esta especie (Figura 9). Se bombardearon 2 placas de 16
embriones con el plásmido pWP480 o pWP500. Se registró el número de
focos azules por embrión y se promedió.
La expresión de GFP cobombardeada se utilizó de
nuevo para evaluar la eficiencia relativa de cada bombardeo
individual y se utilizó para normalizar y permitir la comparación
entre los bombardeos individuales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformaron establemente embriones de trigo
por bombardeo (WO 98/49316). Los embriones se bombardearon con
pWP461 o pWP464.
Se regeneraron plantas transgénicas y se
cultivaron, y se estudió la expresión de la proteína GUS por tinción
con X-Gluc para actividad de glucuronidasa. Después
del bombardeo con WP461, no se observó expresión alguna de GUS en
las plantas transgénicas regeneradas. Después del bombardeo con
pWP464, pudo observarse expresión constitutiva fuerte en una serie
de tejidos que incluían hoja (figura 10, raíz, partes florales
masculinas y femeninas, y semillas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un gen marcador seleccionable
constituido por el promotor Sc4, el intrón FAD2, la región
codificante nptII y el terminador nopalina-sintasa.
Se preparó un gen marcador seleccionable comparable constituido por
el promotor actina del arroz más ampliamente utilizado y el primer
intrón asociado, la región codificante nptII y el terminador
nopalina-sintasa. Ambas versiones del gen marcador
seleccionable se clonaron en un vector adecuado para transformación
de trigo. Se transformaron establemente embriones de trigo por el
Método de Inoculación de Semillas con Agrobacterium (SIM; WO
00/63398) utilizando cualquier versión del marcador seleccionable,
y se seleccionaron plántulas transgénicas transformadas establemente
en medios de cultivo de tejidos de plantas que contenían una
concentración adecuada de Geniticina G418. Se registró el número de
sucesos transgénicos independientes y se calculó la eficiencia de
transformación como el porcentaje de embriones tratados que
regeneraban sucesos transgénicos.
El promotor actina del arroz que incluye el
primer intrón es un promotor muy fuerte utilizado ampliamente para
dirigir el marcador seleccionable en especies de monocotiledóneas.
Se observaron frecuencias de transformación entre 0,5 y 9,2% con un
promedio de 4,1%. Cuando el marcador seleccionable estaba dirigido
por el promotor Sc4 en combinación con el intrón FAD2, se
observaron frecuencias de transformación de 0,4 a 8,3%, un promedio
de 3,9%.
Sorprendentemente, la combinación del promotor
muy débil Sc4 con el intrón FAD2 es tan eficiente como el promotor
actina del arroz ampliamente utilizado, cuando se emplea para
dirigir el marcador seleccionable necesario para transformación
estable del trigo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las dos versiones del gen marcador seleccionable
descrito en el Ejemplo 6 se clonaron en un vector adecuado para
transformación de maíz. Se transformaron de manera estable embriones
de maíz esencialmente por el método de Ishida et al (1996)
utilizando cualquier versión del marcador seleccionable, y las
plántulas transgénicas transformadas de manera estable, se
seleccionaron en medios de cultivo de tejidos de plantas que
contenían una concentración adecuada de kanamicina. Se registró el
número de sucesos transgénicos independientes y se calculó la
eficiencia de transformación como el porcentaje de embriones
tratados que regeneraban sucesos transgénicos.
Sorprendentemente, la combinación del promotor
muy débil Sc4 con intrón FAD2 es más eficiente que el promotor
actina del arroz ampliamente utilizado cuando se utiliza para
dirigir el marcador seleccionable necesario para la transformación
estable del maíz (promedio 1,3%, comparado con 0,77%).
<110> BIOGEMMA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para intensificación de la
expresión de genes en las plantas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BGM 29 - WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 04103188.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-07-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proVir35Sx2 - EcGUS - terVirCaMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(733)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 35 S x 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (782)..(2587)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Peoteína GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2645)..(2646)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2657)..(3391)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4534
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proVir35Sx2 - intAtFAD2 - EcGUS -
terVirCaMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(733)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 35 S x 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (722)..(1902)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> intrón FAD2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1925)..(3730)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3788)..(3789)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3800)..(4534)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminador CAMV
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proVirSc4 - EcGUSintStLS1 -
terVirCaMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(532)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor Sc4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (551)..(2545)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2578)..(3361)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminador CAMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4561
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proVirSc4 - intAtFAD2 -
EcGUSintStLS1 - terVirCaMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(532)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor Sc4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (580)..(1714)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Intrón FAD2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1751)..(3745)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3778)..(4561)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminador CAMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3307
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proVirBSV - EcGUSintStLS1 -
terVirCaMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(494)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor BSV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (497)..(2491)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2571)..(3307)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminador CAMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> provirBSV - intAtFAD2 - EcGUS -
terVirCaMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(475)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor BSV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (497)..(1627)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Intrón FAD2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1650)..(3455)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3513)..(3514)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3525)..(4259)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4448
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proTaHMWG- intAtFAD2 - EcGUSintStLS1
- terVorCaMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(418)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor TaHMWG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4457)..(1601)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Intrón FAD2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia codificante
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1638)..(3632)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3711)..(4498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminador CAMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggccaggtc cgtcgcttct cttcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtttctgc agaaaaccaa aagc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgctctag atctgctgg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccatggct tgctctgara ccagacggg
\hfill29
Claims (10)
1. Un constructo genético para la expresión de
un polipéptido en una célula de planta, que comprende:
- (a)
- un promotor operativo dentro de dicha célula de planta,
- (b)
- el primer intrón del gen FAD2, en donde dicho gen FAD2 procede de Arabidopsis thaliana, y en donde dicho primer intrón se representa por SEQ ID NO 1,
- (c)
- una secuencia de nucleótidos enlazada operativamente a dicho promotor, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica dicho polipéptido,
- (d)
- un sitio de poliadenilación (PAA) enlazado operativamente a dicha secuencia de nucleótidos,
en donde dicho promotor no es un
promotor FAD2 natural y en donde dicho intrón está insertado entre
dicho promotor y el comienzo de la traducción de dicha secuencia de
nucleótidos.
2. El constructo genético de la reivindicación
1, en donde dicho promotor es un promotor específico de tejido.
3. El constructo genético de la reivindicación
1, en donde dicho promotor es un promotor constitutivo.
4. El constructo genético de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, capaz de integración en el genoma de dicha
célula de planta.
5. Un método para intensificar la expresión de
un polipéptido en una célula de planta, que comprende el paso de
introducir el constructo genético de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en dicha célula de planta.
6. Método para intensificar, en una célula de
planta, la tasa de expresión de un gen bajo el control de un
promotor, comprendiendo dicho método los pasos de:
- (a)
- insertar el primer intrón del gen FAD2, en donde dicho gen FAD2 procede de Arabidopsis thaliana, y en donde dicho primer intrón se representa por SEQ ID Nº 1, entre dicho promotor y el comienzo de la traducción de dicho gen, formando así un gen modificado con intrón; y
- (b)
- introducir dicho gen modificado con intrón en una célula de planta de tal modo que dicho gen se expresa bajo el control de dicho intrón en dicha célula de planta, con lo cual se incrementa la tasa de expresión de dicho gen en comparación con un gen no modificado.
en donde dicho promotor no es un
promotor FAD2
natural.
7. El uso del primer intrón del gen FAD2 en
combinación con un promotor diferente del promotor FAD2 natural
para intensificar la expresión de un polipéptido en una célula de
planta, en donde dicho gen FAD2 procede de Arabidopsis
thaliana, y en donde dicho primer intrón se representa por SEQ
ID Nº 1.
8. Una planta que comprende un constructo
genético de acuerdo con la reivindicación 1 integrado en su
genoma.
9. La planta de la reivindicación 8, que es una
monocotiledónea.
10. La planta de la reivindicación 9, que se
selecciona del grupo constituido por trigo, cebada, maíz y
arroz.
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