ES2220913T3 - Procedimiento para la transformacion de monocotiledonas utilizando el escutelo de un embrio inmaduro. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para transformar monocotiledones que comprende transformar el escutelo de un embrión inmaduro de un monocotiledón con una bacteria perteneciente al género Agrobacterium que contiene un gen deseado, dicho embrión no habiendo sido sometido a un tratamiento de desdiferenciación, para obtener un transformante.

Description

Procedimiento para la trasformación de monocotiledones utilizando el escutelo de un embrión inmaduro.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de transformación de monocotiledones.

Antecedentes de la invención

Los procedimientos convencionales de transformación de monocotiledones incluyen el procedimiento de electroporación, el procedimiento del polietilenglicol (procedimiento PEG), procedimiento de pistola de partículas y otros.

El procedimiento de electroporación es un procedimiento en el que los protoplastos y el DNA deseado se mezclan y se forman agujeros en las membranas celulares mediante un pulso eléctrico con el fin de introducir el DNA dentro de las células, transformándose, de esta manera, las células. Se han introducido diversos genes en los monocotiledones, especialmente en plantas de arroz, siguiendo este procedimiento (Toriyama, K. et al., 1998; Biotech. 6: 1072-1074, Shimamoto K. et al., 1989; Nature 338: 274-276, Rhodes C. A. et al., 1988; Science 240:204-207). Sin embargo, este procedimiento tiene problemas en que 1) se puede aplicar sólo a especies de plantas para las que se ha establecido el sistema de regeneración de plantas a partir de protoplastos, 2) puesto que lleva varios meses regenerar las plantas a partir de los protoplastos, se requiere de un largo periodo de tiempo para obtener los transformantes y 3) puesto que el periodo de cultivo es largo, la frecuencia de aparición de mutantes durante el cultivo es alta de acuerdo con esto, de manera que la frecuencia de obtención de transformantes normales disminuye.

El procedimiento PEG es un procedimiento en el que se mezclan el gen deseado y los protoplastos y la mezcla se trata con PEG, introduciéndose, de esta manera, el gen dentro de los protoplastos. Este procedimiento es diferente del procedimiento de electroporación en que se utiliza PEG en lugar del pulso eléctrico. La eficacia en la introducción del gen mediante este procedimiento se piensa que es algo inferior al del procedimiento de electroporación. Aunque existen algunas publicaciones que mencionan que los transformantes se obtenían mediante este procedimiento, este procedimiento no se utiliza ampliamente. Cuando se utilizan protoplastos, este procedimiento tiene los mismos problemas que el procedimiento de electroporación (Zhang W et al., 1988; Theor. Appl. Genet. 76: 835-840, Datta S. K. et al., 1990; Biotech. 8:736-740).

Recientemente, se ha publicado un documento de un procedimiento de introducción de un gen en embriones inmaduros tratados débilmente con un enzima de degradación de la pared celular y callos de maíz mediante un pulso eléctrico (D'Halluin K. et al., 1992; Plant Cell 4: 1495-1505). La existencia del gen introducido se ha confirmado también en plantas regeneradas. Sin embargo, solo se ha realizado un artículo en el que se describa el éxito en la transformación.

El procedimiento de pistola de partículas es un procedimiento en el que el gen deseado se une a partículas metálicas finas y las partículas metálicas son disparadas a las células o tejidos a una velocidad elevada, llevándose a cabo, así, la transformación. De esta manera, de acuerdo con este principio, la transformación se puede realizar en cualquiera de los tejidos. Por lo tanto, se dice que este procedimiento es efectivo en la transformación de las especies de plantas para las que no se hayan establecidos los sistemas de regeneración de plantas a partir de protoplastos.

Se han realizado diversos artículos de obtención de transformantes de maíz con la fertilidad normal mediante transformación de callos de maíz de tipo II (Armstrong C. L. y Green C. E., 1985; Planta 164:207-214) mediante el procedimiento de pistola de partículas (Gordon-Kamm W. J. et al., 1990; Plant Cell 2: 603-618, Fromm M. E. et al., 1990; Biotech 8:833-839, Walters D. A. et al., 1992; Plant Mol. Biol. 18:189-200, Vain P. et al., 1993; Plant Cell Rep. 12: 84-88). Sin embargo casi todos los artículos utilizaban variedades fácilmente cultivables como materiales de partida y las técnicas descritas en esos documentos no se podían aplicar a variedades no limitadas.

Vasil et al., obtuvo callos resistentes a Basta y plantas regeneradas introduciendo un gen bar (Thompson C. J. et al., 1987; EMBO J. 6: 2519-2523) capaces de acetilar la fosfinotricina, que es el componente principal en herbicidas tales como el Basta, bialafos, etc, y el gen GUS en los callos embriogénicos de trigo, utilizando una pistola de partículas. Estos identificaron la actividad del enzima que es un producto de los genes introducidos en estos callos y plantas regeneradas y también se identificó el gen bar en estos mediante análisis de transferencia Southern (Vasil V. et al., 1992; Biotech. 10: 667-674).

Li et al., obtuvieron plantas regeneradas resistentes a higromicina, introduciendo un gen de resistencia a higromicina en embriones inmaduros y callos embriogénicos de arroz utilizando una pistola de partículas seguido de la selección de los transformantes. Estos identificaron el gen de resistencia a higromicina en las plantas mediante análisis de transferencia Southern. Revelaron que la relación de segregación de las plantas resistentes a higromicina y sensibles a higromicina en la progenie R1 de las plantas era de 3:1 (Li et al., 1993; Plant Cell. Resp. 12:250-255).

Christou et al., obtuvieron plantas que son resistentes a higromicina o bialafos y que tienen una actividad GUS introduciendo el gen bar, un gen de resistencia a higromicina y un gen GUS en embriones inmaduros de arroz mediante la utilización de una pistola de partículas, e identificaron los genes introducidos en las plantas mediante análisis de transferencia Southern (Christou P. et al., 1991; Biotech 9:957-962).

Koziel et al., obtuvieron plantas resistentes a fosfinotricina introduciendo el gen bar y un gen productor de la toxina Bt en embriones inmaduros de maíz mediante la utilización de una pistola de partículas. Identificaron la producción de una proteína de la toxina Bt en estas plantas y también los genes introducidos ahí mediante análisis de transferencia Southern (Koziel M. G. et al., 1993; Biotech. 11: 194-200).

Otros procedimientos incluyen 1) cultivar semillas o embriones con DNA (Topfer R et al., 1989; Plant Cell 1:133-139; Ledoux L. et al., 1974; Nature 249:17-21), 2) tratar los tubos de polen (Luo y Wu, 1988; Plant Mol. Biol. Rep. 6: 165-174), y 3) procedimiento de liposomas (Caboche M., 1990; Physiol. Plant. 79:173-176, Neuhaus G. et al., 1987; Theor. Appl. Genet. 75:30-36). Sin embargo, estos procedimientos tienen problemas de eficacia en la transformación, reproducibilidad o aplicabilidad, por lo que estos procedimientos no son populares.

Por otro lado, se utiliza ampliamente un procedimiento para introducir un gen utilizando el plásmido Ti de una bacteria que pertenece al género Agrobacterium como vector para transformar dicotiledones como los de tabaco, petunia, rape y similares. Sin embargo, se dice que los hospedadores de las bacterias que pertenecen al género Agrobacterium se restringen a solo dicotiledones y que los monocotiledones no son infectados por Agrobacterium (De Cleene M., 1976; Bot. Rev. 42:389-466).

Como para la transformación de monocotiledones por Agrobacterium, a pesar de que se haya publicado la transformación de asparagus (Bytebier B. et al., 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345-5349) y de Dioscore bulbifera (Schafer et al., 1987; Nature 327:529-532), se dice que este procedimiento no se puede aplicar a otros monocotiledones, especialmente a plantas que pertenecen a la familia Gramineae (Potrykus I., 1990; Biotechnology 8:535-543).

Grimsley et al., publicaron que el T-DNA de Agrobacterium en el que el DNA del virus estriado de maíz se había insertado, se inoculó en los meristemos apicales de plantas de maíz y se confirmó la infección de las plantas mediante virus estriado del maíz. Puesto que los síntomas infectados no se observan cuando el DNA del virus estriado del maíz se inocula meramente en este, ellos interpretaron el resultado anteriormente mencionado como una parte de la evidencia que muestra que Agrobacterium puede introducir el DNA en el maíz (Grimsley et al., 1987; Nature 325:177-179). Sin embargo, puesto que es posible que los virus se repliquen incluso si no se incorporan dentro del genoma del núcleo, el resultado no muestra que el T-DNA se incorporara dentro del núcleo. Publicaron, subsiguientemente, que la eficacia de la infección es la más alta cuando se inocula el Agrobacterium en los meristemos apicales en los ápices de las raíces de maíz (Grimsley et al., 1988; Biotech. 6:185-189) y que el gen virC en el plásmido Agrobacterium es indispensable para la infección (Grimsley et al., 1989; Mol. Gen. Genet. 217:309-316).

Gould et al. inocularon los meristemos apicales del maíz con Agrobacterium EHA1 supervirulento que tenía un gen de resistencia a canamicina y un gen GUS después de haberlas lesionado con una aguja, y seleccionado los meristemos apicales tratados de esta manera en base a su resistencia a la canamicina. Como resultado, se obtuvieron las plantas que tienen resistencia a canamicina. Estos confirmaron por análisis de transferencia Southern que algunas de las semillas de las generaciones posteriores de las plantas seleccionadas de esta manera tenían introducidos los genes (Gould J. et al., 1991; Plant Physiol. 95: 426-434). Esto significa que las plantas crecen a partir de los meristemos apicales tratados con Agrobacterium y se seleccionan en base a su resistencia a canamicina que tienen tanto células transformadas como células no transformadas (fenómeno quimera).

Mooney et al., intentaron introducir un gen de resistencia a canamicina en embriones de trigo utilizando Agrobacterium. Los embriones se trataron con un enzima para lesionar sus paredes celulares y, a continuación, se inocularon las células de Agrobacterium. Entre los callos tratados, se asumió que una pequeña cantidad de callos tuvieran un aumento de resistencia a canamicina, pero las plantas no se pudieron regenerar a partir de estos callos. La existencia del gen de resistencia a canamicina en estos se comprobó mediante análisis de transferencia Southern. Como resultado, en todos los callos con resistencia, se observó el cambio en la estructura del gen introducido (Mooney P. A. et al., 1991; Plant Cell, Tissue, Organ Culture, 25:209-218).

Raineri et al., inocularon 8 variedades de arroz con Agrobacterium A281 supervirulento (pTiBo542) después de haber lesionado el escutelo de las plantas de arroz. Como resultado, se observó el crecimiento de tejidos similar a tumores en dos variedades, Nipponbare y Fujisaka 5. Además, las células de Agrobacterium que contenían un plásmido que tenían un T-DNA del cual se había extraído el gen sintetizador de la hormona y, en su lugar, se habían insertado un gen de resistencia a canamicina y un gen GUS dentro de éstas se inocularon en los embriones de arroz. Como resultado, se observó el crecimiento de callos resistentes a canamicina. Aunque se observó la expresión del gen GUS en estos callos resistentes, no se pudieron obtener las plantas transformadas a partir de los callos. Ellos interpretaron a partir de estos resultados que el T-DNA de Agrobacterium se introducía en las células de arroz (Raineri et al., 1990; Biotech. 8:33-38).

De esta manera, se han publicado los resultados experimentales que sugieren que la introducción de genes dentro de las plantas que pertenecen a la familia Gramineae como el arroz, maíz y trigo se puede conseguir utilizando Agrobacterium. Sin embargo, todos estos tienen un problema en la reproducibilidad y dieron resultados no convincentes puesto que no se identificaron completamente los genes introducidos. (Potrykus I. 1990; Biotech. 8:535-543).

Chan et al., lesionaron embriones inmaduros de arroz que habían sido cultivados durante 2 días en presencia de 2,4-D y, a continuación, se inocularon en las células de Agrobacterium que tenían el gen nptII y el gen GUS en un medio que contenía células de patata cultivadas en suspensión. Cultivaron los embriones inmaduros inoculados de esta manera en un medio al que se había añadido G418 para obtener plantas regeneradas a partir de los callos inducidos. Investigaron la existencia del gen GUS en las plantas regeneradas y estas progenies mediante análisis de transferencia Southern y se encontró la existencia del gen introducido tanto en R_{0} como en R_{1} (Chan M. T. et al., 1993; Plant Mol. Biol., 22: 491-506). Estos resultados soportan la transformación del arroz con Agrobacterium pero la frecuencia de transformación fue tan baja como 1,6%. Además, solo se obtuvo una planta regenerada que tenía el crecimiento normal de los 250 embriones inmaduros ensayados. La separación de embriones inmaduros de las plantas de arroz necesita más trabajo. Por lo tanto, dicha baja eficacia en la transformación no es a nivel práctico.

Descripción de la invención

Como se ha mencionado más arriba, la introducción de genes en plantas pertenecientes a la familia Gramineae se lleva a cabo ahora, principalmente, mediante el procedimiento de electroporación y el procedimiento de pistola de partículas. En el procedimiento de electroporación, sin embargo, puesto que se utilizan protoplastos, se requiere de un periodo de tiempo largo y mucho trabajo para obtener plantas regeneradas. Además, existe el peligro de que puedan surgir mutantes con una frecuencia elevada debido al largo periodo de cultivo. Además, todavía este procedimiento no se puede aplicar a plantas tales como el maíz para los que no se ha establecido que el sistema de regeneración de plantas a partir de los protoplastos. Se ha publicado un procedimiento en el que los genes se introducen en embriones inmaduros que han sido tratados con un enzima en tal grado que las células no se convierten en protoplastos, mediante pulso eléctrico (D'Halluin K. et al., 1992). Sin embargo, solo se conoce, por ahora, un éxito en el procedimiento. Por lo tanto, es difícil decir que el procedimiento sea popular. Dadas las situaciones, el procedimiento de pistola de partículas mencionado más arriba se ha aplicado al maíz, utilizando callos de tipo II o embriones inmaduros. El procedimiento de pistola de partículas da una elevada posibilidad de obtener los transformantes deseados pero necesita un aparato especial, una pistola de partículas. Sin el aparato, no se puede llevar a cabo el procedimiento de pistola de partículas. Además, el procedimiento de pistola de partículas tiene otro problema en que las partículas metálicas finas se dispersan a menudo para dejar a los investigadores en peligro.

Para el maíz, se ha intentado un procedimiento para infectar sus meristemos apicales con células de Agrobacterium (Gould J. et al., 1991). Sin embargo, se necesita mucho esfuerzo para aislar los puntos de crecimiento del maíz y no es fácil siempre preparar una gran cantidad de estos. Los inventores presentes intentaron producir en vano transformantes de maíz mediante este procedimiento (véase Tabla 1 de más abajo).

De acuerdo con esto, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de transformación de monocotiledones, con el que el tiempo requerido para la obtención de plantas regeneradas desde el momento de la transformación es más corto que en los procedimientos convencionales, el cual se puede aplicar de manera general incluso a las plantas para las que todavía no se han establecido los sistemas para regenerar plantas a partir de protoplastos sin requerir ningún aparato especial, y con el que la preparación de los materiales a ser utilizados es fácil.

Los inventores presentes estudiaron intensamente las influencias de los tejidos de plantas monocotiledóneas a ser tratadas con Agrobacterium, las condiciones de tratamiento con Agrobacterium, las constituciones de vectores binarios, etc, en la eficacia de introducción de genes en los monocotiledones y, como resultado, han descubierto que los embriones inmaduros de monocotiledones a los que no se les ha aplicado un tratamiento de desdiferenciación, se pueden transformar con bacterias que pertenecen al género Agrobacterium con una eficacia drásticamente alta, que el procedimiento de transformación es reproducible y que el objeto mencionado más arriba se puede obtener mediante este procedimiento, completándose de esta manera la presente invención.

Específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento de transformación de monocotiledones que comprende transformar el escutelo de un embrión inmaduro de un monocotiledón con una bacteria perteneciente al género Agrobacterium que contiene un gen deseado, no estando sometido dicho embrión inmaduro a un tratamiento de desdiferenciación, para obtener un transformante.

El procedimiento de la presente invención es el primero que ha hecho posible la introducción reproducible de un gen extraño deseado dentro de los monocotiledones, por ejemplo plantas de la familia Gramineae, tales como el arroz, maíz, trigo, cebada, etc. Hasta este momento son bien conocidos procedimientos para la transformación de monocotiledones con células de Agrobacterium. Como se ha mencionado más arriba, sin embargo, es difícil decir que los procedimientos conocidos sean unos establecidos. De acuerdo con la presente invención, contrario a estos, los embriones inmaduros de monocotiledones, que no han sido sometidos a un tratamiento de desdiferenciación, que no han sido utilizados en la técnica anterior, se inoculan con células de Agrobacterium mediante el procedimiento mejorado de acuerdo con la presente invención, introduciéndose de esta manera, un gen deseado en el mismo con facilidad. Puesto que el procedimiento de la presente invención utiliza embriones inmaduros que se pueden preparar fácilmente, los materiales para el procedimiento se pueden obtener más fácilmente que los del estado de la técnica que utilizan los meristemos apicales de plantas. Además, puesto que la transformación se realiza en el escutelo de los embriones inmaduros de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, el tiempo necesario para regenerar las plantas a partir de los transformantes resultantes se puede acortar cuando se compara con la transformación de protoplastos y, adicionalmente, la frecuencia de mutación está disminuida. Cuando se utiliza un vector superbinario para llevar a cabo la presente invención, es posible introducir un gen deseado en variedades que son difíciles de cultivar, tales como el maíz o algunas variedades de arroz, con una eficacia elevada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la estructura de pTOK162 que es un ejemplo del plásmido contenido en la bacteria del género Agrobacterium utilizable en la presente invención y la construcción del plásmido pTOK232 utilizado en el ejemplo de la presente invención.

La Figura 2 muestra la estructura de pSB1 y la construcción del plásmido pSB131, como en la Figura 1.

Mejor manera de llevar a cabo la invención

Los monocotiledones a ser transformados mediante el procedimiento de la presente invención no están restringidos. La presente invención se puede aplicar a cualquier monocotiledón, como por ejemplo, arroz, maíz, trigo, cebada, espárrago, etc. Son preferidas las plantas que pertenecen a la familia Gramineae que incluyen el arroz, maíz, trigo, cebada, etc. El maíz es el más preferido.

El término "embrión inmaduro" significa aquí el embrión de una semilla inmadura que está en el estadio de maduración después de la polinización. El estadio de maduración de los embriones inmaduros a ser tratados mediante el procedimiento de la presente invención no están restringidos y los embriones recogidos pueden estar en cualquier estadio después de la polinización. Los embriones preferidos son los recogidos en no menos de dos días después de su fertilización. También son preferidos los escutelos de embriones inmaduros capaces de inducir una desdiferenciación de los callos que tienen capacidad para regenerar las plantas normales después de haber sido transformadas mediante el procedimiento mencionado más abajo. Los embriones inmaduros pueden ser preferiblemente endogámicos, F_{1} entre endogámicos, F_{1} entre un endogámico y una variedad polinizada de manera natural y variedades F_{1} comerciales.

"Tratamiento de desdiferenciación" significa un procedimiento de obtención de agregaciones celulares, tales como callos, que muestran un crecimiento desorganizado mediante cultivo de células diferenciadas de tejidos de plantas en un medio de desdiferenciación.

Como la Agrobacterium a ser utilizada para la transformación, se pueden utilizar los Agrobacterium que tienen un plásmido Ti o un plásmido Ri y que han sido hasta ahora utilizados para la transformación de dicotiledones. Muchos de estos Agrobacterium contienen un vector que tiene una región de DNA originada a partir de Agrobacterium tumefaciens. El gen codificante del carácter que se desea dar a la planta, se inserta en este vector, o existe en un plásmido separado y se inserta en el plásmido Ti in vivo mediante recombinación homóloga o similares. Komari et al., desarrolló un vector que contenía una región de DNA originada a partir de la región virulenta (región vir) del plásmido Ti pTiBo542 contenido en un Agrobacterium tumefaciens A281 altamente virulento que tiene una eficacia de transformación extremamente elevada (Hood E. E. et al., 1984; Bioetch. 2:702-709, Hood, E. E. et al., 1986; J. Bacteriol. 168:1283-1290, Komari, T et al., 1986; J. Bacteriol. 166: 88-94, Jin, S. et al., 1987; J. Bacteriol. 169:4417-4425, Komari, T., 1989; Plant Science, 60:223-229, ATCC 37349) (Solicitud de patente japonesa en trámite (Kokai) Nº 4-222527). En esta memoria, este vector puede ser referido como "vector superbinario". Dicho vector súperbinario se puede utilizar preferiblemente en la presente invención.

Un ejemplo de dicho vector súperbinario es pTOK162 (Solicitud de patente en trámite (Kokai) Nº 4-222527). Su estructura se muestra en la Figura 1. Este plásmido comprende un plásmido llamado pTOK154 que puede replicarse tanto en Escherichia coli como en Agrobacterium tumefaciens (pTOK154 es un plásmido que contiene una región T, que se construyó mediante el procedimiento descrito más abajo a partir de un plásmido conocido pGA472 que tiene un amplio espectro de hospedadores llamado pVCK101), dentro del cual se ha insertado un fragmento kpnI (que contiene los genes virB, virG y virC) con un tamaño de 15,2 Kb originado a partir de la región de virulencia de pTiBo542, habiendo sido clonado el fragmento kpnI. En pTOK154, entre las dos secuencias frontera de la región T, se inserta un gen de resistencia a canamicina como gen a ser introducido en los monocotiledones. Esta es una realización en donde el gen deseado a ser introducido en los monocotiledones se dispone en un plásmido que tiene el fragmento de DNA clonado originado a partir de la región virulenta de pTiBo542.

El gen que se desea incorporar dentro de los monocotiledones se puede insertar en un punto de restricción en la región del T-DNA del plásmido descrito más arriba, y el plásmido recombinante deseado se puede seleccionar dependiendo del marcador selectivo adecuado como resistencia a una droga y similares que tiene el plásmido. Sin embargo, si el vector, tal como pTOK162 mostrado en la Figura 1, es grande y tiene una serie de puntos de restricción, no siempre es fácil insertar el DNA deseado en la región T del vector mediante procedimientos de subclonación convencionales. En dicho caso, el DNA deseado se puede insertar en pTOK162 utilizando la recombinación homóloga en vivo (Herrera-Esterella L. et al., 1983; EMBO J. 2:987-995; Horsch R. H. Et al., 1984; Science 223:496-498) en las células de Agrobacterium tumefaciens. Esto es, por ejemplo, pTOK162 se introduce primero en Agrobacterium tumefaciens y el plásmido pBR322 (o un plásmido similar) que contenga el DNA deseado se introduce otra vez en el mismo. Puesto que el DNA de pTOK162 tiene una región de homología con pBR322, el derivado de pBR322 que contiene el gen deseado es para que se inserte en pTOK162 mediante recombinación genética por regiones homólogas. A diferencia de pTOK162, pBR322 no puede replicarse por sí mismo en Agrobacterium tumefaciens. Por tanto, pBR322 puede estar sólo vivo en Agrobacterium tumefaciens en la forma insertada en pTOK162 (pTOK162 recombinado y pBR322 es referido de aquí en adelante como "derivado pTOK162::pBR322"). Seleccionando los transformantes en base al marcador selectivo (como resistencia a fármaco) específico para cada uno de pTOK162 y derivado de pBR322, se pueden obtener transformantes de Agrobacterium tumefaciens que contengan el derivado pTOK162::pBR322. Los presentes inventores realizaron un estudio introduciendo diversos plásmidos que contenían pTOK162 en Agrobacterium tumefaciens para descubrir que, como marcador de selección del derivado pBR322, es excelente el gen de resistencia a espectinomicina (SP) originado a partir del trasposón Tn7 (De Greve, H. H. et al., 1981; Plasmid 6:235-248). De esta manera, en los casos en donde ha sido clonado ya el gen deseado en pBR322, insertando el gen SP dentro del plásmido, se puede insertar el gen deseado en la región T de pTOK162 mediante recombinación homóloga in vivo en Agrobacterium tumefaciens. De manera alternativa, se proporciona primero un plásmido que contenga un DNA originado a partir de pBR322 y el gen SP y se puede insertar el gen deseado dentro de este plásmido. En este caso, utilizando las secuencias frontera de la región T, es posible obtener, finalmente, el gen de resistencia a canamicina y el gen deseado en regiones T separadas en pTOK162. Cuando se transforman las plantas utilizando la resistencia a canamicina como marcador, existe una probabilidad sustancial de que se introduzcan ambas regiones T y la introducción del gen deseado se pueda conseguir de manera suficiente. Además, en este caso, puesto que ambas regiones T se pueden insertar en diferentes cromosomas, puede ser posible segregar, subsiguientemente, el gen deseado del gen de resistencia a canamicina.

Como bacterias hospedadoras pertenecientes al género Agrobacterium, se pueden utilizar, preferiblemente, aunque no de manera restrictiva, Agrobacterium tumefaciens.

La introducción de un plásmido dentro de la bacteria perteneciente al género Agrobacterium tal como Agrobacterium tumefaciens se puede llevar a cabo mediante un procedimiento convencional tal como el procedimiento de triple cruce de bacterias (Ditta G. et al., 1980; Proc. Natl. Sci. USA, 77:7347-7351).

Puesto que la Agrobacterium preparada según se ha mencionado más arriba tiene genes de virulencia altamente eficiente originados a partir de pTOK162, se puede lograr la transformación de los monocotiledones con una eficacia elevada.

Se debería indicar que en el procedimiento de la presente invención, el gen que se desea introducir en el monocotiledón se coloca entre las secuencias frontera de la región T como en el estado de la técnica, y el gen deseado se puede colocar en el plásmido Ti o en otro plásmido en el Agrobacterium.

La transformación de los embriones inmaduros de monocotiledones mediante Agrobacterium se puede llevar a cabo poniendo meramente en contacto los embriones inmaduros con el Agrobacterium. Por ejemplo, se prepara una suspensión celular del Agrobacterium que tenga una densidad de población de aproximadamente 10^{6} a 10^{11} células/ml y los embriones inmaduros se sumergen en esta suspensión durante aproximadamente 3 a 10 minutos. Los embriones inmaduros resultantes se cultivan, a continuación, en un medio sólido durante varios días con Agrobacterium los embriones a ser transformados se someten directamente a transformación sin que sean sometidos a un tratamiento de desdiferenciación tal como cultivarlos en presencia de 2,4-D la transformación convencional de plantas con Agrobacterium es tal que los embriones inmaduros a ser transformados ahí se desdiferencian cultivándolos en presencia de 2,4-D, antes de que se lleguen a poner en contacto con el Agrobacterium. Los inventores presentes han encontrado que la desdiferenciación es innecesaria de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invención es superior al procedimiento convencional en el que el antiguo es más sencillo que el más reciente. Algunas plantas, especialmente maíz tienen una eficacia de transformación reducida si se someten al tratamiento de desdiferenciación antes de la transformación. Por lo tanto, la eficacia de transformación de dichas plantas se puede incrementar de acuerdo con el procedimiento de la presente invención en el que no se lleva a cabo el pretratamiento. Además, la transformación convencional de las plantas con Agrobacterium utiliza una etapa de lesión de las plantas o una etapa de tratamiento de estas con un enzima para digerir las paredes celulares, incrementándose de esta manera, la eficacia de la infección, antes de su transformación con Agrobacterium. El procedimiento de la presente invención puede tener dicho pretratamiento, pero los inventores presentes han encontrado que se puede lograr la transformación eficiente mediante el procedimiento de la presente invención incluso en ausencia de dicho pretratamiento. Por esta razón, dicho pretratamiento es desfavorable para el maíz.

Es preferido que los embriones inmaduros así transformados se desdiferencien después, mediante un procedimiento conocido (Green, C. E. y Phillips, R. L., 1975; Crop Science 15:417-421, Duncan, D. R. et al., 1985; Planta 165:322-332) y las células transformadas desdiferenciadas de esta manera se seleccionan y se hacen crecer. La selección se puede efectuar en base a la expresión del gen deseado citado anteriormente. Se desea que las células desdiferenciadas estén en forma de callos que tengan la capacidad de producir plantas normales. La regeneración de las plantas a partir de células transformadas se puede efectuar mediante procedimientos conocidos (Luppotto, E. y Lusardi, H. C., 1988; Maydica XXXIII:163-177). De esta manera, las plantas adquirieron el carácter deseado mediante la transformación, preferiblemente se pueden regenerar las plantas transformadas adquirieron el carácter deseado y teniendo una fertilidad normal. Estas etapas se ilustran, concretamente, en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

La presente invención será explicada más concretamente con referencia a los siguientes ejemplos. Se debería indicar, sin embargo, que la presente invención no está restringida a los ejemplos.

(1) Preparación de muestras de tejidos (i) Variedades de maíz

Se escogieron como muestras las variedades de maíz de P3732, A188, H84, B37Ht, Mo17Ht, W117Ht, Oh43, H99, W64A Ht rhm, F1 (A188 X Black Mexican Sweet), F1 (A188 X B73Ht), F1 (B73Ht x A188), F1 (H84 x A188), F1 (Mo17Ht x A188) y F1 (C103 x A188). La variedad P3732 se obtuvo de IWATA RAKUNOU KYODOKUMIAI. Todos los endogámicos y la variedad de Black Mexican Sweet se obtuvieron del National Institue of Agrobiological Resources, Ministry of Agriculture, Forestry & Fisheries.

(ii) Variedad de arroz

Se seleccionó como muestra la variedad de arroz de Tsukinohikari.

(iii) Preparación del tejido del ápice de la raíz del maíz

Las semillas de maíz se sumergieron en etanol al 70% durante un minuto y, a continuación, en hipoclorito sódico al 1% durante 5 minutos, y se lavaron tres veces con agua esterilizada. Después del lavado, estas se colocaron en medio sólido LS (sales mayores LS y sales menores LS (Linsmaier E. y Skoog F. 1965; Physiol. Plant. 18:100-127), 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 1 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/l de mioinositol, 100 mg/l de ácido casamino, 700 mg/l de prolina, 20 g/l de sacarosa y 2,3 g/l de Gelrite) y se cultivaron a 25ºC bajo iluminación. Después de aproximadamente 4 días, los tejidos con una longitud de aproximadamente 0,1 mm x 0,3 mm que contenían los tejidos que contenían los ápices que dividían los tejidos se cortaron de las plantas semilleras crecidas jóvenes y se utilizaron como muestras.

(iv) Preparación de embriones inmaduros de maíz

Aproximadamente 14 días después de la polinización, se aislaron de manera aséptica los embriones inmaduros con una longitud de 1 a 2 mm de las puntas hembras.

(v) Preparación de embriones inmaduros de arroz

Las semillas inmaduras se recogieron en los días 7 a 12 después de la floración y se esterilizaron sumergiéndolas en etanol al 70% durante 30 segundos y, a continuación, en hipoclorito sódico al 1% durante 10 minutos después de extraer las glumas. Los embriones inmaduros se aislaron a partir de estos y, a continuación, se utilizaron como muestras.

(2) Plásmido Ti

El gen de resistencia a higromicina (HPT), el gen de resistencia a fosfinotricina (PPT) (bar) y el gen GUS se insertaron dentro de la región T del plásmido Ti para obtener los siguientes plásmidos:

(i) pIG121Hm

Un plásmido en el que el gen GUS que contenía el primer intrón del gen de la catalasa de caster beans y un gen de resistencia a higromicina se ligaron (Nakamura et al., 1991; Plant Biotechnology II (Nakamura et al., Extra Issue of GENDAI KAGAKU, pág. 123-132), presentado por el Dr. Nakamura en Nagoya University).

(ii) pTOK232 (a) Inserción del intrón del gen GUS y del gen de resistencia a higromicina dentro del vector intermedio pTOK229

El fragmento ClaI (2,5 kb) que contenía el gen de resistencia a espectinomicina originado a partir de Tn7 se trató con el fragmento klenow para despuntar sus extremos. El fragmento resultante se insertó en el sitio SamI de pUC19 para obtener un plásmido pTOK107 (5,2 kb) que tenía los genes resistencia a ampicilina y resistencia a espectinomicina.

El pTOK107 así obtenido se trató con EcoRI e HindIII y el fragmento resultante de 2,5 kb que contenía el gen de resistencia a espectinomicina se ligó al fragmento EcoRI-HindIII (2,7 kb) de pGA482 para obtener pTOK170 (5,2 kb) que contenía el gen de resistencia a espectinomicina y que tiene los sitios HindIII y HpaI.

Un vector pIG221 en el que se había ligado el primer intrón de la catalasa del caster beans y el gen GUS al promotor 35S (Ohta et al., 1990, presentado por Dr. Nakamura en la Universidad de Nagoya) se digirió con EcoRI y lo resultante se trató con fragmento klenow para despuntar sus extremos. En el resultante, se insertó un engarce de HindIII (pCAAGCTTG; código 4660P comercialmente disponible de TAKARA SHUZO). Se extrajo un fragmento que contenía el promotor 35S y el intrón del gen GUS, digiriendo el vector resultante con HindIII, y el fragmento se insertó en el sitio HindIII de un plásmido pGL2 (J. Paszkowski, obtenido de Friedrich Miescher Institute) que contenía el gen de resistencia a higromicina ligado al promotor 35S, para obtener pGL2-IG (7,6 kb). El plásmido pGL2 anteriormente mencionado se obtuvo insertando un gen de resistencia a higromicina (Gritz L. y Davis J, 1983; Gene 25:179-188) en pDH51 (Pietrazak et al., 1986; Nucleic Acids Research 14:5857-5868). El fragmento obtenido tratando pTOK170 con HpaI se ligó a un fragmento PvuII (5,2 kb) de pGL2-IG para obtener pTOK229 (10,1 kb).

(b) Inserción en el vector súperbinario pTOK162

La inserción de los genes deseados (gen de resistencia a higromicina y intrón del gen GUS) dentro del vector superbinario pTOK162 obtenido insertando los genes virB, virC y virG procedentes de Agrobacterium A281 supervirulento, se llevó a cabo mediante recombinación homóloga. Esto es, puesto que ambos vectores contienen una región procedente de un plásmido de E. coli pBR322, en las células bacterianas seleccionadas por resistencias a espectinomicina y canamicina, sólo está contenido el plásmido generado por recombinación de ambos plásmidos. El plásmido que comprende el vector súperbinario en el que se insertan el gen de resistencia a higromicina y el intrón GUS es referido como pTOK232 (véase Figura 1).

En la Figura 1 y en la Figura 2 mencionadas más abajo, "SP" significa gen de resistencia a espectinomicina, "HPT" significa gen de resistencia a higromicina, "NPT" significa gen de resistencia a canamicina, "TC" significa gen de resistencia a tetraciclina, "BAR" significa gen de resistencia a fosfinotricina, "IG" significa intrón del gen GUS, "BR" significa secuencia frontera derecha del T-DNA, "BL" significa secuencia frontera izquierda del T-DNA, "virB", "virB" y "virG" significan regiones vir originadas a partir de Agrobacterium supervirulento A281, "COS" significa región COS del fago lambda, "K" significa enzima de restricción del sitio KpnI y "H" significa enzima de restricción del sitio HindIII.

(iii) pSB131 (a) Construcción del pSB131

Se digirió pTOK170 con BamHI y BgIII y, a continuación, se circularizó para dar pYS138. Este pYS138 se digirió con EcoRI y Asp7181 y, a continuación, se trató con DNA polimerasa T4. Dentro de éste se insertó el delineador de SalI (5'-GGTCGACC-3') y lo resultante se circularizó para dar pYS151. Este PYS se digirió con SalI, y se insertó un fragmento SalI (4,7 kb) que tenía T-DNA de pGA643 (An et al., Plant Molecular Biology Manual A3:1-19, Kluwer Academic, Dordrecht, 1988) en el punto de escisión para dar pTOK235. Este pTOK235 se cortó en su sitio SacII, sus extremos se despuntaron con DNA polimerasa T4, se insertó en el mismo un engarce de HindIII (5'-CAAGCTTG-3') y lo resultante se circularizó. El plásmido así obtenido se refirió como pTOK246. Este pTOK246 se digirió con HindIII y EcoRI para eliminar la mayoría del T-DNA y se insertó en el mismo un fragmento HindIII-EcoRI (2,2 Kb) que tenía un gen que se había preparado ligando un gen acetiltransferasa fosfinotricina (patente japonesa Kohyo Koho Hei-1-503434) al promotor 35S (gen bar que tiene la capacidad de conferir resistencia a fosfinotricina a las plantas) para obtener pSB25. Además, este pSB25 se digirió con HindIII, y se insertó en el mismo un fragmento HindIII (3,1 kb) aislado de pIG221 y que tenía el promotor 35S y un intrón GUS, para construir pSB31. De esta manera, este pSB31 es un vector intermedio que tiene el intrón del gen GUS y el gen de resistencia a fosfinotricina (bar), ambos expresándose en plantas.

(b) Construcción del pNB1

pVCK101 (Knauf et al., Plasmid 8:45-54; 1982) se digirió con EcoRI, se trató con la DNA polimerasa T4 y se circularizó por lo que se suprimió su sitio EcoRI. Este fue digerido, además, con BglII y, a continuación, se circularizó por lo que se suprimió el sitio BglII. El plásmido resultante se llamó pVCK101Q. Este pVCK101Q se digirió con HindIII y XhoI y se ligó a un pUC18 que se había digerido con HindIII y SalI, para dar pTOK150. Este pTOK150 se digirió con HindIII y se trató con DNA polimerasa T4. Se insertó en el punto de corte un engarce EcoRI (5'-CCGAATTCGG-3') y lo resultante se circularizó para dar pTOK239 que tenía un sitio EcoRI en lugar de un sitio HindIII. PGA482 se digirió con HpaI, se insertó en este un engarce XhoI (5'-CCTCGAGG-3') y lo resultante se circularizó para dar pTOK236. Este pTOK236 se digirió con XbaI y EcoRI para aislar un fragmento de 2,6 kb. Se digirió pTOK239 con EcoRI y XbaI para eliminar un fragmento de 2,7 kb. El fragmento XbaI-EcoRI de 2,7 kb de pTOK236 se insertó en este y el resultante se circularizó para dar pNB1. Este pNB1 es un tipo de vector aceptor y no contiene ni T-DNA ni los DNA de las regiones que dan lugar a virulencia.

(c) Construcción de pSB1

Se digirió el pNB1 con KpnI y se insertó ahí un fragmento KpnI de 15,2 kb que tenía los genes virB y virG en la región de virulencia de pTiBo542 (American Type Culture Collection Nº de acceso 37349). Lo resultante se circularizó para dar pSB1. Este pSB1 es un vector aceptor. Cuando se inserta un vector intermedio que tiene T-DNA en este para dar un vector híbrido, el vector híbrido resultante se puede combinar con un plásmido auxiliar para construir un vector súperbinario.

(d) Inserción de pSB31 en pSB1

Como en el caso de pTOK232, se insertó pSB31 en pSB1 mediante recombinación homóloga para construir pSB131 (véase Fig. 2).

(3)Agrobacterium hospedador

Las cepas LBA4404 y EHA101 de las que se suprimió la región de T-DNA se utilizaron como bacterias hospedadoras. La cepa LBA4404 tiene un plásmido auxiliar PAL4404 (que tiene una región vir completa) y está disponible en la American Type Culture Collection (ATCC 37349). La cepa EHA101 tiene un plásmido auxiliar que tiene la región vir procedente del Agrobacterium súpervirulento A281 y está disponible por Hood E.E. et al., 1986 (mencionado más arriba).

Los diversos vectores binarios descritos en (2) se introdujeron en estas dos cepas de Agrobacterium, y las cepas descritas más abajo se utilizaron para introducir los genes. Los plásmidos se introdujeron en las cepas de Agrobacterium mediante cruzamiento triple (Ditta G et al., 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7347-7351).

LBA4404(pTOK232)

LBA4404(pSB131)

EHA101 (pIG121Hm)

(4) Preparación de una suspensión de células de Agrobacterium

Las colonias obtenidas cultivando las cepas de Agrobacterium en medio AB (Drlica K. A. y Kado C. I., 1974; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:3677-3681) se recogieron durante 3 a 10 días con un bucle de platino y se suspendieron en medio LS para la suspensión celular (que comprende sales mayores LS, sales menores LS, 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de hidrocloruro de piridoxina, 1 mg/ml de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/ml de mioinositol, 1,5 mg/l de 2,4-D, 1 g/l de ácido casamino, 100 uM de acetosiringona, 0,2 M de sacarosa y 0,2 M de glucosa) para la inoculación en plantas de maíz pero en un medio AA modificado (que comprenda sales inorgánicas mayores AA, aminoácidos AA y vitaminas AA (Toriyama K. y Hinata K., 1985; Plant Sci., 41: 179-183), sales menores MS (Murashige T. y Skoog F., 1962; Physiol. Plant., 15:473-497), 1,0 g/l de ácido casamino, 100 \muM de acetosiringona, 0,2 M de sacarosa y 0,2 M de glucosa) para la inoculación en plantas de arroz. La población de células de cada medio se ajustó para que fuera de 3 x 10^{9} a 5 x 10^{9} células/ml. Las suspensiones se utilizaron para la inoculación en las plantas.

(5) Condiciones para la inoculación y el cultivo

Los tejidos muestra se lavaron con agua esterilizada y se sumergieron en las suspensiones anteriormente descritas de cepas de Agrobacterium durante 3 a 10 minutos, después de que las muestras de los ápices de la raíz se hubieran partido con una aguja de vidrio (casera) mientras que los embriones inmaduros estaban como estaban. Después de la inmersión, las muestras de ápices de la raíz se transplantaron en el medio LS modificado (que comprende sales de LS mayor, sales menores de LS, 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 1 mg/ml de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/l de mioinositol, 0,1 mg/l de quinetina, 1,0 mg/l de ácido casamino y 2,3 g/l de Gelrite) que contenía 100 \muM de acetosiringona, 20 g/l de sacarosa y 10 g/l de glucosa y se cultivaron en este a 25ºC bajo iluminación durante 2 a 3 días. Después de esto, estas se lavaron con agua esterilizada que contenía 250 mg/l de cefotaxima y, a continuación, se mantuvieron en cultivo en el medio LS que tenía la misma concentración de cefotaxima. Después de la inmersión, los embriones inmaduros se transplantaron a un medio LSD1.5 (que comprendía sales mayores LS, sales menores LS, 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de hidrocloruro de piridoxina, 1mg/ml de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/ml de mioinositol, 1,5 mg/l de 2,4-D, 700 mg/l de prolina, 500 mg/l de MES y 8 g/l de agar) que contenía 100 \muM de acetosiringona, 20 g/l de sacarosa y 10 g/l de glucosa, y se cultivaron a 25ºC en la oscuridad durante 1 a 5 días. A continuación, sin que fueran lavadas (esto es debido a que si se lavan, la velocidad de regeneración de las plantas transformadas se vuelve baja), los embriones inmaduros de esta manera infectados se continuaron cultivando en un medio de crecimiento LDS1.5 de callos (que tenía la misma composición que el medio LDS1.5 anteriormente mencionado excepto en que no contenía glucosa y acetosiringona) que contenía 250 mg/ml de cefotaxima. Por otro lado, los embriones inmaduros de arroz sumergidos se transplantaron en un medio sólido 2N6 (que comprendía sales inorgánicas N6 y vitaminas (Chu C. C., 1978; Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pág. 43-50), 1 g/l de ácido casamino, 2 mg/l de 2, 4-D y 2 g/l de Gelrite) que tuvo las mismas concentraciones de acetosiringona, sacarosa y glucosa como se ha mencionado más arriba, y cultivadas a 25ºC en la oscuridad durante 2 a 5 días. Después de esto, los embriones inmaduros, infectados de esta manera, se lavaron con agua esterilizada que contenía 250 mg/l de cefotaxima y cultivados en medio sólido 2N6 que tenía la misma concentración de cefotaxima durante 3 días a una semana.

(6) Procedimiento para examinar la actividad GUS

Inmediatamente después de que el cultivo anteriormente mencionado en presencia de cepas de Agrobacterium, los tejidos se sumergieron en un tampón fosfato 0,1 M (pH 6,8) que contenía Tritón X-100 al 0,1% a 37ºC durante una hora. Después de lavar las cepas de Agrobacterium con el tampón fosfato, se añadió un tampón fosfato que contenía 1 mM de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico (X-gluc) y metanol al 20%. Después de incubar a 37ºC durante 24 horas, se contaron el número de tejidos coloreados de azul bajo microscopio y se describen los porcentajes de estos respecto al número de las muestras ensayadas. En la valoración de las actividades GUS de los callos resistentes a higromicina y callos resistentes a fosfinotricina que se piensan que se transforman en células después de la selección, así como en la valoración de las actividades GUS de las plantas transformadas, se cortaron partes de los callos o plantas resistentes y se sometieron a la misma tinción GUS.

(7) Selección de las células transformadas y regeneración de las plantas

Los embriones inmaduros de maíz infectados con Agrobacterium se cultivaron en medio de crecimiento de callos LSD1.5 que contenía 250 mg/l de cefotaxima y de 0 a 100 mg/l de higromicina o de 0 a 20 mg/l de PPT, durante aproximadamente 8 semanas para seleccionar los callos resistentes. Estos callos resistentes se colocaron en un medio LSZ (que tenía la misma composición que el medio de crecimiento de callos LSD1.5, excepto en que este no contiene 2,4-D pero contiene 50 mg/l de zeatina) y se cultivaron a 25ºC bajo iluminación, regenerándose de esta manera los callos.

Los embriones inmaduros de arroz se cultivaron en medio sólido 2N6 que contenía 250 mg/l de cefotaxima y 50 mg/l de higromicina durante 3 a 4 semanas, y se seleccionaron los callos resistentes. Además, los callos resistentes se cultivaron en medio N6-7 (que comprendía sales inorgánicas N6, vitaminas N6, 2 g/l de ácido casamino, 1 mg/l de 2,4-D, 0,5 mg/l de 6BA, 30 g/l de sorbitol, 20 g/l de sacarosa y 2 g/l de Gelrite) que contenía 100 mg/l de higromicina durante 2 a 3 semanas y, a continuación, se transplantaron en medio N6S3 para la regeneración de las plantas (que comprende la mitad de concentraciones de sales inorgánicas mayores N6, sales inorgánicas menores N6, vitaminas N6, 1 g/l de ácido casamino, 0,2 mg/l de NAA, 1 mg/l de quinetina y 3 g/l de Gelrite) que contenía 50 mg/l de higromicina. Todos los medios utilizados contenían 250 mg/l de cefotaxima.

(8) Expresión de los genes introducidos en transformantes de maíz de segunda generación

Las plantas transformadas de primera generación obtenidas mediante inoculación de LBA4404 (pSB131) y selección mediante PPT se autofertilizaron para obtener semillas de segunda generación. Las semillas se sembraron y se recogieron los trozos de hojas procedentes de las plantas semilleras jóvenes aproximadamente dos semanas después de la siembra. Se examinó la expresión del gen GUS. Además de una parte de las hojas de estas plantas semilleras jóvenes, se aplicó Basta diluido 500 veces (un herbicida que contiene PPT como ingrediente principal, disponible comercialmente de HOECHST) y se comprobó la resistencia a PPT dos semanas después de la aplicación de Basta. Además, se cruzó la primera generación de plantas transformadas con no transformadas (variedad A188) y los embriones inmaduros se recogieron aproximadamente dos semanas después del cruce, y los embriones inmaduros recogidos se colocaron en medio LSD1.5 para la inducción de los callos que contenía 10 mg/l de PPT. Los embriones inmaduros se cultivaron a 25ºC durante 3 semanas en la oscuridad y se evaluó la resistencia a PPT en base a si se formaban o no los callos en el cultivo. Las plantas transformadas obtenidas mediante inoculación con LBA4404 (pTOK233) y la selección con higromicina también se cruzaron con no transformadas (variedad: A188) y se examinó la expresión del gen GUS en plantas semilleras jóvenes de las plantas de segunda generación.

(9) Análisis de los genes introducidos mediante el procedimiento de transferencia Southern

De las plantas semilleras jóvenes de la primera generación de transformantes de maíz que se habían obtenido mediante selección con PPT después de infectar con la cepa LBA4404 (pSB131) y de la segunda generación de plantas, se extrajeron los DNA mediante el procedimiento de Komari et al. (Komari et al., 1989; Theor. Appl. Genet. 77: 547-552). Los DNA extraídos de esta manera se digirieron con un enzima de restricción BamHI. Los fragmentos resultantes se sometieron a la detección de los genes introducidos mediante análisis de transferencia Southern utilizando el gen GUS y el gen bar como sondas. La longitud de la región de DNA del sitio BamHI en la región de T-DNA hasta el terminal de la secuencia frontera L era de aproximadamente 2,3 Kb para el gen GUS y aproximadamente 2,7 kb para el gen bar (véase Fig. 2). El análisis de transferencia Southern se llevó a cabo de acuerdo con la descripción en Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

(10) Introducción del gen en los tejidos de ápices de raíces de maíz

Con el fin de confirmar que se podía conseguir la transformación utilizando tejidos de crecimiento puntual (tejidos de los ápices de raíces) publicados por Gould et al. (Gould J. et al., 1991; Plant Physiol. 95: 426-434), se trataron los tejidos aislados de ápices de raíces de maíz aislados con la cepa de Agrobacterium EHA101 (pIG121Hm) anteriormente descrita, y se determinó la actividad GUS de las plantas crecidas. Mientras no se observó expresión del gen GUS en los tejidos no tratados con la cepa de Agrobacterium, se observó la expresión del gen GUS en las manchas cortadas con la aguja en los tejidos tratados con la cepa de Agrobacterium. Las plantas obtenidas cultivando los tejidos se ensayaron por su actividad GUS. Sin embargo, ninguna planta exhibió la actividad GUS. La vecindad del punto de crecimiento es un tejido muy fino, de tal manera que no es fácil que la aguja perfore el tejido muy fino para infectar el tejido con Agrtobacterium. Los resultados de esta experimento muestran que la transformación infectando la vecindad del punto de crecimiento con Agrobacterium requiere una experiencia elevada en cortar y perforar el punto de crecimiento, etc.

TABLA 1 Introducción del gen en tejidos de ápices de raíz de maíz

1

La variedad de la muestra fue P3732 en todos los experimentos.

(11) Inoculación en los embriones inmaduros de maíz.

Los embriones inmaduros de las diferentes variedades de maíz se trataron con la cepa de Agrobacterium. El gen GUS se expresó en una proporción elevada en todas las variedades de maíz ensayadas. El tamaño del punto del gen GUS expresado en cada muestra ensayada era tal que se observaba visualmente de manera clara. De esta manera, el gen GUS se expresaba en un rango amplio de células. No se observó ninguna diferencia en la velocidad de expresión del gen entre las cepas LBA4404 (pTOK232) y LBA4404 (pSB131). A partir de los resultados, se estableció que los embriones inmaduros de maíz son adecuados como materiales a ser infectados y transformados con Agrobacterium con eficacia elevada.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Eficacia en la introducción del gen GUS dentro de embriones inmaduros de maíz

2

Cepa 1: EHA101(pIG121Hm), 2: LBA4404(pTOK232), 3: LBA4404(pSB131).

(12) Inoculación en los embriones inmaduros pre-cultivados de maíz (Ejemplo comparativo).

Chan et al., utilizaron embriones inmaduros de plantas de arroz que habían sido precultivadas (tratamiento de desdiferenciación) en medio N_{6}RD (comprendiendo N_{6} sales inorgánicas, vitaminas N_{6}, 30 g/l de sacarosa, 2 mg/l de 2, 4-D, 8 g/l de agarosa) durante 2 días, como materiales a ser transformados con Agrobacterium (Chan M. T. et al., 1993; Plant Mol. Biol. 22: 491-506). Con el fin de volver a confirmar si el procedimiento de Chan et al., es o no efectivo también en el caso de utilizar embriones inmaduros de plantas de maíz, los embriones inmaduros de maíz (variedad: A188) que se habían precultivado en medio LSD1.5 para la inducción de los callos durante 2 días se intentaron transformar con Agrobacterium. La inoculación y el cultivo en presencia de Agrobacterium se llevaron a cabo de la misma manera que la mencionada más arriba. La cepa de Agrobacterium utilizada fue LAB4404(pSB131). Como control, los embriones inmaduros de la misma variedad de maíz se sometieron al mismo ensayo inmediatamente después de recogerlos. Tres días después del co-cultivo con Agrobacterium, los embriones inmaduros de ambos grupos de ensayo se sometieron a tinción de GUS. Como resultado, casi todos los embriones inmaduros ensayados inmediatamente después de recogerlos se tiñeron mientras que ninguno de los embriones inmaduros ensayados después del pre-cultivo se tiñó (véase Tabla 3). Estos resultados indican claramente que la transformación del maíz no se consigue si se utilizan los embriones inmaduros pre-cultivados de maíz.

TABLA 3 Introducción de la eficacia del gen GUS dentro de embriones inmaduros pre-cultivados de maíz

3

(13) Identificación de las células transformadas de maíz

Los callos que se habían seleccionado en un medio que contenía 30 mg/l o 50 mg/l de higromicina y se había verificado que tenían resistencia a higromicina en un medio que contenía 75 mg/l de higromicina, se sometieron a tinción GUS con el resultado de que todos los callos expresaban el gen GUS. El DNA que se había extraído de estos callos de acuerdo con el procedimiento de Komari et al., (Komari et al., 1989; Theor. Appl. Genet. 77:547-552) se utilizó como plantilla para llevar a cabo la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) utilizando cebadores capaces de amplificar el gen GUS (5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3', 5'-ATGGTGCGCCAGGAGAGTTG-3'). La reacción se llevó a cabo utilizando 1 \mul de la disolución de DNA, una mezcla de los dos cebadores de 5 pM de cada uno, 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, un tampón de PCR (comercialmente disponible de TAKARA SHUZO) y 2,5 U de DNA polimerasa Amplitag (comercialmente disponible de TAKARA SHUZO), siendo el volumen total de 100 \muL. Se repitieron 30 ciclos de la reacción, de acuerdo con el siguiente perfil de temperaturas para un ciclo: es decir, el perfil de temperaturas para un ciclo de la reacción comprendía 94ºC durante un minuto, 55ºC durante 2 minutos y, a continuación, 72ºC durante 3 minutos, todo en un THERMOCYCLER DNA (comercialmente disponible de PARKIN ELMER CETUS CORP.). El producto de la PCR se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7%. Cuando se utilizó el DNA extraído procedente de callos no infectados con Agrobacterium como plantilla, no se detectó ningún fragmento amplificado; mientras que cuando se utilizaba el DNA extraído de LBA4404 (pTOK232) o el DNA extraído de los callos que tenían la resistencia a higromicina, como plantilla, se detectó, mediante electroforesis, un fragmento amplificado de 1,8 kb teñido con bromuro de etidio. Además, la PCR se llevó a cabo utilizando cebadores capaces de amplificar la región de 795 pb que tiene el codón de iniciación VirG de Agrobacterium (5'-GACGTTTATGAAGTAGGCGAGA-3', 5'-TAAAAACGCGAGGAGAAGATTG-3'). Cuando se utilizó como plantilla el LBA4404 (pTOK232), se detectó un fragmento amplificado de 0,8 kpb; mientras que cuando se utilizaron el DNA extraído de callos resistentes y el DNA extraído de callos no infectados con Agrobacterium, como plantillas, no se detectó ningún fragmento amplificado. A partir de estos resultados, se consideró que la expresión del gen GUS en todos los callos que tenían la resistencia a higromicina no resultó del Agrobacterium adherido a los callos sino resultó del gen GUS introducido y que los callos compactos y nodales que habían crecido en los medios que tenían concentraciones incrementadas en lo que respecta a las etapas de higromicina eran transformantes.

(14) Selección de las plantas de maíz transformadas

Después del cocultivo con Agrobacterium, se seleccionaron los callos resistentes a higromicina o resistentes a PPT en medios que contenían de 30 a 100 mg/l de higromicina o de 5 a 20 mg/l de PPT. En la selección de higromicina, en primer lugar, se obtuvieron callos resistentes a higromicina del 11 al 27% de los embriones inmaduros; mientras que en la selección posterior con PPT, se obtuvieron los callos resistentes a PPT del 35 al 64% de los embriones inmaduros (véanse tablas 4 y 6). Estos callos se colocaron en un medio de regeneración que contenía higromicina o PPT, con lo que las plantas se regeneraron con una elevada frecuencia. Las hojas de las plantas regeneradas se tiñeron mediante tinción GUS, resultando en la expresión del gen GUS en muchas de las plantas (véanse tablas 5 y 6). Estos datos mostraron que estas plantas eran plantas transformadas. La frecuencia de dar las plantas transformadas era especialmente elevada en la selección con PPT y existía una pequeña diferencia entre los experimentos, siempre dando plantas transformadas independientes a partir del 10% o más de embriones inmaduros ensayados (véase Tabla 6). Los resultados sugieren que el procedimiento utilizado en estos experimentos es un procedimiento de transformación estable capaz de producir transformantes con una frecuencia elevada. A continuación, los callos resistentes a PPT que se habían cultivado y seleccionado bajo las mismas condiciones de todas las maneras, desde la inoculación hasta la propagación de los callos, se colocaron en un medio de regeneración que contenía una concentración elevada (20 mg/l) de PPT y un medio de regeneración que no contenía PPT con el fin de comprobar la expresión de GUS. En las plantas regeneradas en el medio que contenía PPT, el número de plantas quiméricas y escapes (GUS-) era pequeño. Esto certifica el efecto de la selección obtenida mediante la adición de PPT durante la regeneración (véase Tabla 7).

TABLA 4 Eficacia de la transformación de embriones inmaduros de maíz mediante selección con higromicina

4

Para la selección con higromicina, los callos se co-cultivaron con Agrobacterium y, a continuación, se cultivó más en presencia de higromicina que tenía las concentraciones indicadas, cada una durante 2 a 3 semanas.

TABLA 5 Eficacia de selección de transformantes en la selección con higromicina

5

6

TABLA 7 Influencia del PPT añadido al medio de regeneración en la frecuencia de regeneración y transformación

7

(15) Análisis de transferencia Southern de los genes introducidos en la primera generación de transformantes de maíz

El DNA total extraído del transformante se digirió con BamHI para obtener los fragmentos de DNA. Estos fragmentos de DNA se sometieron a análisis de transferencia Southern, utilizando el gen bar o el gen GUS como sonda, con el fin de detectar el gen introducido en los transformantes de primera generación. Como resultado, se observó la existencia del gen introducido en todos los transformantes ensayados cuando se utilizó como sonda cualquiera de uno de los genes. El número de copias de los genes introducidos fueron uno o varios. El fragmento BamHI que tenía el gen bar en el plásmido pSB131 tenía 2,7 kb y el fragmento BamHI que tenía el gen GUS en el plásmido pSB131 tenía 2,3 kb, mientras que todos los transformantes ensayados mostraron una banda que tenía aproximadamente 3 kb o más. Estos resultados soportan la introducción del gen bar y del gen GUS dentro de los cromosomas de la planta. Además, las longitudes de los fragmentos de DNA detectados variaban dependiendo de sus orígenes. Esto indica que los genes se insertaron en diferentes regiones en los cromosomas del maíz. Por lo tanto, se confirmó que los fragmentos de DNA detectados no se originaron a partir de las bacterias restantes en las plantas.

TABLA 8 Número de copias de genes introducidos en la primera generación de transformantes determinados por análisis de transferencia Southern

8

(16) Expresión del gen introducido en la segunda generación de transformantes de maíz en los que se ha introducido pTOK233

Las hojas obtenidas de las plantas de segunda generación mediante cruce de los transformantes obtenidos por selección a higromicina con no transformantes se tiñeron con GUS. La relación de plantas GUS positivas respecto a las plantas GUS negativas fue de aproximadamente 1:1 según lo esperado (Tabla 9).

TABLA 9 Expresión de los genes introducidos en transformantes de maíz de segunda generación obtenidos mediante selección con higromicina

9

(17) Expresión de los genes introducidos en plantas de maíz de segunda generación en los que se ha introducido pSB131

Las hojas de las plantas no transformadas se tiñeron por GUS y todas eran negativas, mientras que todas las hojas de los transformantes de segunda generación obtenidos mediante autofertilización, los transformantes eran GUS positivos excepto un transformante. Además, se aplicó Basta a las hojas. Como resultado, todas las hojas de las plantas no transformadas murieron en aproximadamente 2 semanas mientras que las hojas de los transformantes eran saludables excepto la planta GUS negativa (Tabla 10). Tanto la expresión del gen GUS como la resistencia a PPT exhibió segregación genética de acuerdo con dos factores de segregación. Además, los embriones inmaduros recogidos de las plantas no transformadas se cultivaron en un medio que contenía PPT. Como resultado, se inhibió el crecimiento de los embriones y no se indujeron a los callos. Por otro lado, con los embriones inmaduros de ambas líneas recogidas de las plantas R0 obtenidas mediante cruzamiento de los transformantes y no transformantes, se indujeron los callos en aproximadamente un 50% de los embriones inmaduros colocados y los callos crecieron bien en el mismo medio (Tabla 11). Los callos crecidos se tiñeron por GUS. Como resultado, en todos los callos, la totalidad de los callos se tiñeron de azul.

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(Tabla pasa a página siguiente)

10

TABLA 11 Expresión de los genes introducidos en transformantes de maíz de segunda generación obtenidos mediante selección con PPT (probado en embriones inmaduros)

11

(18) Análisis de transferencia Southern de los genes introducidos en la segunda generación de pSB131 introducido en el maíz

Los DNA se extrajeron de las plantas de segunda generación obtenidas mediante autofertilización del transformante nº 21 mostrado en la Tabla 10, y se intentaron detectar los genes introducidos mediante análisis de transferencia Southern de la misma manera que la mencionada más arriba. En todas las plantas excepto para la planta que era GUS negativa y sensible al PPT, se detectaron los genes introducidos cuando cualquiera de los genes se utilizaba como sonda (Tabla 12). Los números de las copias del gen bar y del gen GUS en las plantas en las que se confirmó la existencia de los genes introducidos, eran idénticos y la longitud de cada banda era idéntica a la detectada en la planta de primera generación. A partir de estos resultados, se confirmó que los genes introducidos en el maíz utilizando Agrobacterium de acuerdo con el procedimiento de la presente invención se introducen en los núcleos de las plantas y quedan adheridas de manera estable a la siguiente generación de acuerdo con las leyes de Mendel.

TABLA 12 Número de copias de los genes introducidos en los transformantes de segunda generación determinado por análisis de transferencia Southern

12

(19) Inoculación de los embriones inmaduros de arroz con Agrobacterium

Se observó una elevada tasa de expresión del gen GUS se observó también en los embriones inmaduros de arroz en los que se había introducido el gen GUS se había introducido, como en los embriones inmaduros de maíz que tienen el gen GUS. Especialmente, se observó la expresión del gen GUS con una eficacia elevada cuando se utilizó la cepa LBA4404(pSB131) que tenía el vector súperbinario (véase Tabla 13).

TABLA 13 Eficacia de la introducción del gen GUS en embriones inmaduros de arroz

13

Los vectores binarios utilizados en este experimento no causaron la expresión del gen GUS en las células de Agrobacterium. Basado en el gen GUS en los embriones inmaduros de arroz que se habían cocultivado con Agrobacterium como el índice, se ha verificado que las células de Agrobacterium son útiles para insertar el gen dentro de las células de maíz y arroz.

(20) Selección de las plantas de arroz transformadas

Los embriones inmaduros de arroz infectados con Agrobacterium se sometieron a selección de callos resistentes a higromicina en un medio que contenía 50 mg/l de higromicina. Como resultado, se obtuvieron los callos resistentes con una tasa elevada cuando se utilizaba la cepa que tenía un vector súperbinario (véase Tabla 14). Los callos producidos, seleccionados de esta manera, regeneraron las plantas con facilidad después de transferirlos a un medio de regeneración de plantas que contenía el marcador de selección (véase Tabla 14). Las hojas de las plantas regeneradas se examinaron con respecto a la expresión del gen GUS en el mismo, con el resultado de que el gen GUS se expresaba en todas las plantas regeneradas. Estos datos mostraron que las plantas regeneradas eran plantas transformadas. La cepa de Agrobacterium EHA101 (pIG121Hm) tiene una región de virulencia del pTiBo542 súpervirulento pero no tiene un vector súperbinario. Las cepas utilizadas por Chan et al., eran del mismo tipo. Por lo tanto, como los resultados de este ejemplo, ellos obtuvieron una eficacia de transformación extremadamente baja (Chan M. T. et al., 1993; Plant Mol. Biol., 22:491-506). El presente ejemplo ha clarificado que la utilización de las cepas que tienen un vector súperbinario resulta en la producción de las plantas transformadas procedentes de embriones inmaduros de arroz con una eficacia drásticamente elevada.

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(Tabla pasa a página siguiente)

14

(21) Identificación del gen introducido en las plantas de arroz transformadas

Para investigar la presencia del gen introducido, se sometieron tres plantas transformadas aleatorias e independientes obtenidas tratando los embriones inmaduros de arroz con la cepa LBA4404 (pTOK232) a la reacción de la polimerasa en cadena. Ambos extremos de sus regiones estructurales se utilizaron como cebadores del gen GUS y del gen HPT. El DNA del no transformante y de un plásmido que tenía uno de los genes GUS y HPT se utilizaron como control. Como resultado, los tres transformantes obtenidos mediante tratamiento con LBA4404 (pTOK232) dieron un fragmento amplificado de 1,1 kb del gen HPT, como los del plásmido control. Todos los transformantes que tenían el gen GUS también dieron un fragmento amplificado de 1,8 kb, similar a los del plásmido control. Sin embargo, los no transformantes no dieron estos fragmentos. Estos resultados verificaron que todas las plantas muestras ensayadas en este experimento son plantas transformadas que tienen el gen introducido por Agrobacterium.

Aplicación industrial

Como se ha mencionado más arriba, el procedimiento de la presente invención es un procedimiento de transformación de monocotiledones, con el que el periodo de tiempo requerido desde la transformación a la regeneración de plantas es corto, que se puede aplicar de manera general a las plantas que no tienen ningún procedimiento de regeneración de las plantas a partir de los protoplastos, que no necesita un equipo especial y en el que es fácil la preparación del material a ser utilizado. Por lo tanto, la presente invención se puede aplicar a la reproducción de plantas monocotiledóneas que tienen las características deseadas.

Claims (15)

1. Procedimiento para transformar monocotiledones que comprende transformar el escutelo de un embrión inmaduro de un monocotiledón con una bacteria perteneciente al género Agrobacterium que contiene un gen deseado, dicho embrión no habiendo sido sometido a un tratamiento de desdiferenciación, para obtener un transformante.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho monocotiledón es una planta perteneciente a la familia Gramineae.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha planta perteneciente a la familia Gramineae es maíz.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha planta perteneciente a la familia Gramineae es arroz.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho embrión inmaduro se somete a transformación sin pretratamiento en el que dicho embrión inmaduro se trata con un enzima o se lesiona.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho monocotiledón es maíz y dicho embrión inmaduro se somete a transformación sin pretratamiento en el que dicho embrión inmaduro se trata con un enzima o se lesiona.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el escutelo de dicho embrión inmaduro es, después de haber sido transformado, desdiferenciado y las células transformadas se seleccionan y crecen mientras están en estado desdiferenciado.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en donde los transformantes con fertilidad normal se regeneran a partir de las células transformadas que se han seleccionado y hecho crecer mientras están en un estado desdiferenciado.

9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha bacteria es una perteneciente al género Agrobacterium que contiene un plásmido Ti o el plásmido Ri y que tiene un plásmido que contiene un fragmento de DNA originado a partir de la región de virulencia de un plásmido Ti pTiBo542 de Agrobacterium tumifaciens.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha bacteria perteneciente al género Agrobacterium es Agrobacterium tumifaciens.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha bacteria perteneciente al género Agrobacterium utilizado para la transformación, tiene una población celular de 10^{6} a 10^{11} células/ml.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho embrión inmaduro es uno en el estadio de no menos de dos días después de la polinización.

13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el escutelo de dicho embrión inmaduro es uno capaz de inducir un callo que tiene la capacidad de regenerar una planta normal.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde el tejido cultivado que se ha desdiferenciado a partir del embrión inmaduro para la selección, crecimiento y desdiferenciación es un callo que se origina en el escutelo de un embrión inmaduro.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho embrión inmaduro es uno de un endogámico, F1 entre endogámicos, F1 entre un endogámico y una variedad polinizada de manera natural o variedades F1 comerciales.