ES2327659T3 - Uso de k-252a e inhibidores de quinasas para la prevencion o el tratamiento de patologias asociadas a hmgb1. - Google Patents

Abstract

Uso de K-252a y/o una sal o un derivado del mismo para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una patología asociada con HMGB1, que es desencadenada y/o sostenida por HMGB1 y/o proteínas homólogas de HMGB1 seleccionada de restenosis, ateroesclerosis o lesión isquemia-reperfusión, en donde dicho derivado es un compuesto sintético y/o modificado químicamente, que es un compuesto que tiene sustituyentes en el sistema de anillos seleccionados de grupos alquilo C 1-C 4, un compuesto en el cual el grupo éster metílico ha sido reemplazado por otro grupo éster, un grupo amida o por H o un catión, y/o un compuesto en el cual el átomo N en el grupo amida cíclico está sustituido con un grupo alquilo C1-C4 y en el cual las proteínas homólogas de HMGB1 son HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG.

Description

Uso de K-252a e inhibidores de quinasas para la prevención o el tratamiento de patologías asociadas a HMGB1.

La presente invención se refiere al uso de K-252a, una sustancia fisiológicamente activa producida por microorganismos, y/o un inhibidor de quinasas y de sus sales o derivados modificados por síntesis y/o químicamente para la prevención o el tratamiento de patologías asociadas con HMGB1. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de K-252a y/o un inhibidor de quinasas para la prevención o el tratamiento de la restenosis.

Investigaciones recientes en el campo de la sepsis e inflamación han conducido a una mejor comprensión de los mecanismos y sucesos patógenos que subyacen en su aparición y desarrollo clínicos. En las primeras etapas de la sepsis, por ejemplo, endotoxinas bacterianas estimulan las células del sistema inmunitario innato que liberan citoquinas pro-inflamatorias (TNF, IL-1\alpha e IL-6). Estas citoquinas iniciales a su vez, inducen la liberación de un mediador de acción posterior aguas abajo - identificado como la proteína conocida HMGB1 - que desencadena las secuelas patológicas mediadas por la liberación subsiguiente de citoquinas como TNF, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-1Ra, IL-6, IL-8, etc., que conducen a una patogénesis multisistémica o a una inflamación sistémica letal.

La proteína HMGB1 pertenece a la familia de las proteínas del grupo de alta movilidad (HMG). Las proteínas HMG, así denominadas debido a su alta movilidad electroforética en geles de poliacrilamida, son las proteínas más ubicuas distintas de las histonas asociadas con la cromatina aislada en las células eucariotas. Estas proteínas juegan un papel "arquitectónico" generalizado en la flexión, la formación de bucles, el plegamiento y el envolvimiento del DNA, dado que distorsionan, flexionan o modifican el complejo de las estructuras de DNA con factores de transcripción o histonas. La proteína del grupo 1 de alta movilidad (HMGB1) es usualmente un factor nuclear, en particular una molécula reguladora de la transcripción que causa la flexión del DNA y facilita la flexión de varios complejos de transcripción.

La HMGB1 liberada extracelularmente actúa como una citoquina potente y como un factor estimulador de los macrófagos extremadamente potente. HMGB1 actúa directamente por fijación a la membrana celular induciendo señalización y quimiotaxis, teniendo funciones semejantes a una quimioquina, y actuando además indirectamente por regulación creciente de la expresión y secreción de citoquinas pro-inflamatorias. Esto hace de la proteína HMGB1 extracelular una potente proteína quimiotáctica e inmunorreguladora que promueve una respuesta inmunitaria inflamatoria efectiva.

Adicionalmente, otras proteínas pertenecientes a la familia de proteínas HMG y capaces de flexionar el DNA se liberan junto con HMGB1 en el medio extracelular. Estas proteínas son, entre otras, HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, MHG-4L y SP100-HMG. Las mismas comparten con HMGB1 secuencias de aminoácidos altamente homólogas. Al igual que HMGB1, dichas proteínas desencadenan/sostienen patologías inflamatorias que interaccionan con los mismos receptores y conducen a los mismos caminos de interacción aguas abajo.

Se ha demostrado que la liberación de HMGB1 por células lesionadas y necróticas moviliza activamente las células musculares lisas de la rata (RSMC) in vitro (1) y desencadena inflamación in vivo (2).

En las células sanas, HMGB1 migra al citoplasma por transporte tanto pasivo como activo. Sin embargo, todas las células cultivadas y los monocitos en reposo contienen la gran mayoría de HMGB1 en el núcleo, lo que indica que en las condiciones basales la importación es mucho más eficiente que la exportación. Las células podrían transportar HMGB1 desde el núcleo por acetilación de residuos lisina que son abundantes en HMGB1, neutralizando con ello su carga básica y haciéndolos incapaces de funcionar como señales de localización nuclear. La hiperacetilación nuclear de HMGB1 determina la relocalización de esta proteína desde el núcleo al citoplasma (en los fibroblastos, por ejemplo) o su acumulación en endolisosomas secretores (en monocitos y macrófagos activados, por ejemplo) y la redirección subsiguiente hacia la liberación a través de un camino secretor no clásico mediado por vesículas. La secreción de HMGB1 por monocitos ya activados es desencadenada luego por lisofosfatidilcolina (LPC) bioactiva, que es generada más tarde en el sitio de inflamación a partir de fosfatidilcolina por la acción de la fosfolipasa secretora sPLA2, producida por los monocitos varias horas después de su activación. Por consiguiente, la secreción de HMGB1 parece estar inducida por dos señales (Bonaldi et al., 2003) y parece tener lugar por tres pasos: 1) en primer lugar, una señal inflamatoria promueve la acetilación de HMGB1 y su relocalización del núcleo al citoplasma (paso 1) y almacenamiento en vesículas secretoras citoplásmicas (paso 2); a continuación, una señal de secreción (ATP extracelular o lisofosfatidilcolina) promueve la exocitosis (tercer paso) (Andersson et al., 2002; Scaffidi et al., 2002; Bonaldi et al., 2003; Friedman et al., 2003; Gardella et al., 2002).

La HMGB1 liberada ha sido identificada como uno de los ligandos que se fijan al receptor RAGE. Este receptor se expresa en la mayoría de los tipos de células, y a un nivel elevado principalmente en células endoteliales, en células de la musculatura lisa vascular, en monocitos y macrófagos y en fagocitos mononucleares. El reconocimiento implica el terminal C de HMGB1. La interacción de HMGB1 y RAGE desencadena un periodo sostenido de activación celular mediado por la regulación creciente de RAGE y señalización dependiente de receptores. En particular, la interacción de HMGB1 y RAGE activa varios caminos de transducción de señales intracelulares, que incluyen proteína-quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), Cdc-42, p21ras, Rac y el factor de translocación nuclear \kappaB (NF-\kappaB), el factor de transcripción enlazado clásicamente a procesos inflamatorios (Schmidt et al., 2001).

De acuerdo con varias pruebas experimentales, la HMGB1 liberada puede interaccionar también con los receptores pertenecientes a la familia de los receptores tipo Toll (TLR), v.g. con las subclases TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9.

Adicionalmente, HMGB1 puede interaccionar también con el dominio a lectina funcional N-terminal semejante a lectina (D1) de la trombomodulina. Debido a la capacidad del dominio funcional D1 de la trombomodulina para interceptar y fijar HMGB1 circulante, se evita la interacción de la HMGB1 con los receptores RAGE y los receptores tipo Toll.

Estructuralmente, la proteína HMGB1 es una proteína de aprox. 25 kDa con una secuencia altamente conservada entre los mamíferos, en donde 2 de 214 aminoácidos tienen sustituciones conservadoras en todas las especies de mamíferos. HMGB1 está presente ubicuamente en todos los núcleos de los vertebrados y, en particular, puede encontrarse en fibroblastos, neuronas, hepatocitos, glia y en células derivadas de las células madre hematopoyéticas, con inclusión de monocitos/macrófagos, neutrófilos y plaquetas. La molécula HMGB1 tiene una estructura tripartita compuesta de tres dominios distintos: dos dominios de fijación de DNA denominados secuencia A y secuencia B de HMG, y un término ácido carboxilo, que hace que la misma esté cargada bipolarmente. Los dos dominios básicos de fijación de DNA, denominados secuencia A y secuencia B, son capaces de reconocer y fijar DNA con afinidad alta e interaccionar con varios factores de transcripción y receptores esteroidales nucleares. Los mismos juegan un papel crucial no sólo en procesos de transcripción, sino también en la inducción de apoptosis (muerte celular programada) (3-5).

Recientemente, se ha demostrado que, al contrario que las células lesionadas o necróticas que liberan HMGB1 por simple difusión y desencadenan por ello inflamación, las células apoptóticas retienen ávidamente HMGB1 fijada a residuos de cromatina incluso después de su lisis eventual. Se ha argumentado también que la HMGB1 extracelular es fundamentalmente una señal de deterioro tisular y los monocitos y macrófagos han "aprendido" a mimetizar una señal antigua de alarma. Además, se ha demostrado muy recientemente que HMGB1 induce migración y proliferación de mesoangioblastos y células de la musculatura lisa adultos y embrionarios (2 y WO 02/074337).

K-252a (peso molecular 467,5) es un indol-carbazol glicosilado aislado por vez primera en 1986 (6) de Nocardiopsis sp. (US 4.555.402 y WO 97/38120-EP 0834574 B1). Dado que se trata de una molécula lipófila, el mismo es capaz de atravesar las membranas de las células vivas. K-252a es un inhibidor inespecífico de la numerosa familia de serina/treonina-proteína-quinasas tales como pkA, pkC, pkG, la quinasa de la cadena ligera de miosina (7), la quinasa CaM II, y se caracteriza por una afinidad nM para los receptores NGF (TrkA). La estructura química de K-252a se representa en la fórmula (I):

1

K-252a tiene efectos anti-liberación de histamina, anti-alérgicos (US 4.555.402) y un efecto anti-proliferativo en las líneas de células del carcinoma prostático humano (8) y en los queratinocitos de la psoriasis humana (WO 2005/014003). La última actividad es debida al bloqueo de la fosforilación de TrkA y la inhibición consiguiente de la actividad de NGF. Adicionalmente, se ha demostrado que las células musculares lisas tanto humanas como de rata expresan NGF y su receptor TrkA (9).

En JP 02 009819 se ha demostrado adicionalmente que K-252a tiene una actividad supresora o relajante sobre la contracción de los vasos sanguíneos y por consiguiente se espera que mejore diversos síntomas que están asociados con insuficiencia de flujo sanguíneo al cerebro, infarto cerebral, vasoespasmo cerebral, estenocardia y espasmo coronario.

Derivados de K-252a se han descrito también como útiles en el tratamiento de una diversidad de enfermedades. En JP 62 155284 se presenta un derivado de éster O-metílico de K-252 como potencialmente útil en la prevención y el tratamiento de alergias, tumores o enfermedades del sistema cardiovascular. JP 63 295589 describe un derivado de K-252a como agente antialérgico, agente antitrombótico, agente anti-inflamatorio o agente antitumoral. En WO 97/49406 se demuestra que un derivado de K-252a podría ser útil también en el tratamiento de neuropatías periféricas, degeneración neuronal central y superproducción de citoquinas, particularmente en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y afecciones autoinmunes y alérgicas. EP 1121932 se refiere a preparaciones terapéuticas de derivados de K-252a para trastornos oftálmicos. En WO 97/46565 se describe el uso de un derivado de K-252a con actividad inhibidora de PKC para tratamiento de trastornos neurológicos. En WO 96/11933 se describe un derivado de K-252a para efectuar la función y/o supervivencia de una célula sensible a factores tróficos, particularmente para el tratamiento de inflamación, alergias, cáncer, sepsis, MS, artritis reumatoide o psoriasis. WO 96/13506 se refiere al uso de un derivado de K-252a para el tratamiento de trastornos neurológicos.

Los procedimientos quirúrgicos durante la angioplastia inducen frecuentemente lesión de la íntima, causando el deterioro y la necrosis de una diversidad de tipos de células, con inclusión de células endoteliales. Esto puede dar como resultado restenosis, una afección caracterizada por reobstrucción de arterias - causada por re-proliferación y re-migración de células de los vasos sanguíneos. Hoy en día, la restenosis ocurre en más del 20% de los pacientes después de angioplastia quirúrgica y esta afección requiere una segunda cirugía. Así pues, existe necesidad de nuevos medicamentos que sean adecuados para la prevención o el tratamiento de la restenosis.

En la presente invención se ha demostrado que K-252a (i) tiene un efecto biológico potente sobre la migración y proliferación de las células musculares lisas inducida por HMGB1 en respuesta a la lesión mecánica inducida por la aplicación de dilatadores quirúrgicos y (ii) actúa como antagonista/inhibidor del amplio espectro de actividades patológicas desencadenadas y sostenidas/amplificadas por HMGB1 propiamente dicha en su papel de quimioquina pro-inflamatoria quimiotáctica y/o por la cascada de citoquinas inflamatorias inducidas por su liberación.

Adicionalmente, se encontró sorprendentemente que HMGB1 es secretada por las células de la musculatura lisa en las placas ateroescleróticas humanas (M. Bianchi, resultados no publicados).

Así pues, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de K-252a y/o una sal o un derivado del mismo para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una patología asociada con HMGB1, que es desencadenada y/o sostenida por HMGB1 y/o proteínas homólogas a HMGB1 seleccionada de restenosis, ateroesclerosis o lesión isquemia-reperfusión, en donde dicho derivado es un compuesto sintético y/o modificado químicamente, que es un compuesto que tiene sustituyentes en el sistema de anillos seleccionados de grupos alquilo C_{1}-C_{4}, un compuesto en el que el grupo éster metílico ha sido reemplazado por otro grupo éster, un grupo amida o por H o un catión, y/o un compuesto en el cual el átomo N en el grupo amida cíclico está sustituido con un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, y en donde las proteínas homólogas a HMGB1 son HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG. En este aspecto, K-252a y/o una sal o un derivado del mismo, como se ha definido arriba, se administra en una dosis terapéuticamente eficaz a un individuo que se encuentra en necesidad de ello a fin de prevenir o tratar dichas patologías asociadas con HMGB1.

En el contexto de la presente invención, dichas patologías asociadas con HMGB1 son preferiblemente patologías asociadas con la forma no acetilada y/o acetilada de HMGB1 y/o asociada con la forma no acetilada y/o acetilada de proteínas homólogas de HMGB1. Por esta razón, en el uso de la presente invención, dichas patologías asociadas a HMGB1 son preferiblemente patologías asociadas con la forma no acetilada y/o acetilada de HMGB1 o de proteínas homólogas de HMGB1 como se han definido. En el método de la presente invención para la prevención o el tratamiento de las patologías asociadas con HMGB1, las patologías asociadas con HMGB1 son preferiblemente patologías asociadas con la forma no acetilada y/o acetilada de HMGB1 o de proteínas homólogas de HMGB1 como se definen en esta memoria.

En el contexto de la presente invención, "HMGB1" incluye la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGB1. Análogamente, "proteínas homólogas de HMGB1" incluyen la forma no acetilada y/o la forma acetilada de proteínas homólogas de HMGB1 seleccionadas de HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG.

La K-252a utilizada en el contexto de la presente invención puede obtenerse por (i) extracción y purificación de células de microorganismos que contienen K-252a y que se obtienen por cultivo de microorganismos capaces de producir K-252a y/o por (ii) síntesis química (Wood et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 10413-10414, 1995). Microorganismos que producen K-252a y a partir de los cuales puede alquilarse K-252a pertenecen preferiblemente al género Nocardiopsis sp. y Saccharomyces sp.

Sin pretender quedar ligados por la teoría, los datos de dicroísmo circular de la presente invención y datos de fluorescencia indican que la acción inhibidora de K-252a sobre la actividad de HMGB1 no depende necesariamente de una interacción directa entre K-252a y HMGB1. Aunque el mecanismo por el cual K-252a inhibe las actividades de HMGB1 no está totalmente esclarecido, es muy probable que K-252a inhiba la actividad de HMGB1 por inhibición de al menos una quinasa, tal como una tirosina-quinasa, una fosfoquinasa y/o una quinasa adicional. La HMGB1 extracelular interacciona con sus receptores de membrana, en particular los receptores RAGE y TLR, desencadenando la iniciación de una cascada de quinasas en el interior de la célula. Esta cascada transporta la información de la fijación de HMGB1 extracelular a través de citoplasma y en el núcleo, haciendo que la célula responda al estímulo externo. Se supone que K-252a puede bloquear la cascada desencadenada por la fijación de HMGB1 en diferentes etapas, y dar así como resultado una inhibición global de la acción de HMGB1 sobre la célula.

Los autores de la presente invención han testado la actividad de inhibición de K-252a sobre 67 quinasas humanas y han encontrado que K-252a es capaz de inhibir varias de estas moléculas. De hecho, 17 de las 67 quinasas testadas exhibían una inhibición mayor que 90% (véase Ejemplo 5). Así pues, K-252a ha sido identificado como un agente para el tratamiento de trastornos asociados con una o varias quinasas como se muestra en las Tablas 1 y 2, para las cuales se ha encontrado una inhibición de al menos 80%, preferiblemente de al menos 90% y más preferiblemente de al menos 95%.

Un trastorno asociado con una quinasa es preferiblemente un trastorno asociado con actividad incrementada de quinasa en una célula u organismo enfermo comparada con una célula u organismo no enfermo. La actividad de quinasa puede determinarse a nivel de transcritos (v.g. por medida de mRNA) o al nivel de proteínas (v.g. por medida de la cantidad y/o actividad de la proteína).

Se describe adicionalmente en esta memoria, como se ha indicado arriba, que K-252a puede utilizarse con al menos un inhibidor de quinasas adicional, un inhibidor seleccionado de inhibidores de tirosina-quinasas y/o inhibidores de fosfoquinasas. Un inhibidor de tirosina-quinasa es un inhibidor de TrkA, TrkB, TrkC y/o un inhibidor de la subfamilia de receptores de tirosina-quinasa que incluyen el receptor Ron, c-Met (receptor del factor HGF/dispersión) y los receptores Sea. Un inhibidor de fosfoquinasa es un inhibidor de PKA, PKC, y/o PKG. Otro inhibidor de quinasas es un inhibidor de otras quinasas tales como la quinasa Raf, la quinasa Ras, la quinasa CaM, la quinasa MLC, la quinasa MAP, las quinasas MEK, ERK, JUN y/o PI3K\gamma.

Existen inhibidores de quinasas conocidos en la técnica anterior. Inhibidores adecuados conocidos de la quinasa CaM son el dominio de fijación de calmodulina, el inhibidor de la quinasa II Ca^{2+}/calmodulina 281-309, hipericina. Inhibidores adecuados conocidos de TrkA, TrkB, y/o TrkC son CP701, genisteína, herbimicina, lavendustina, quercetina y radicicol. Inhibidores adecuados conocidos de la quinasa MAP son himenialdisina, CP-1347, olomoucina, CC-401. Inhibidores adecuados conocidos de la quinasa MLC son piceatannol, staurosporina, y el inhibidor de la cadena ligera de miosina péptido 18. Inhibidores adecuados conocidos de fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K\gamma) son quercetina, y wortmannina. Inhibidores adecuados conocidos de PKA son staurosporina, y KT-5720. Inhibidores adecuados conocidos de PKC son staurosporina, bisindolmaleimida I, calfostina C, y cheleritrina. Inhibidores adecuados conocidos de PKG son staurosporina, H-7, H-9, y KT-5823.

En la presente invención, K-252a puede emplearse en la forma de una sal y/o derivado como se ha definido.

Sales preferidas de K-252a y/o sales de inhibidores de quinasas son sales con cationes farmacéuticamente aceptables, v.g. cationes alcalinos o alcalinotérreos o aniones, v.g. aniones inorgánicos o aniones orgánicos.

Una patología asociada a HMGB1 es una condición en un paciente en la cual una concentración incrementada de la proteína HMGB1 y/o de proteínas homólogas de HMGB1 en la forma acetilada o no acetilada está presente en los fluidos y tejidos biológicos, comparada con la concentración en individuos normales en los que estas proteínas HMGB1 son prácticamente indetectables. Las patologías asociadas a HMGB1 y/o las patologías asociadas con proteínas homólogas de HMGB1 son patologías con una base inflamatoria fuerte o patologías que son resultado de la estimulación de citoquinas tales como TNF-alfa, IL-1, IL-6, etc., o patologías que resultan de sucesos tóxicos, tales como intoxicación, infección, quemadura, etc. En particular, se han encontrado y determinado concentraciones elevadas de la proteína HMGB1 y proteínas homólogas en plasma de pacientes con sepsis, en plasma y fluido sinovial de pacientes de artritis reumatoide, en los cerebros de pacientes de la enfermedad de Alzheimer, en plasma y tejidos de pacientes de melanoma, en plasma de pacientes de lupus eritematoso sistémico, en placas ateroescleróticas de pacientes con ateroesclerosis, etc. La determinación y evidencia de la proteína HMGB1 y/o proteínas homólogas en fluidos y tejidos biológicos puede detectarse por herramientas comunes de diagnóstico conocidas por las personas expertas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, detección por ensayos ELISA, etc.

Las patologías asociadas a HMGB1 de acuerdo con la presente invención son preferiblemente afecciones patológicas mediadas por activación de la cascada de citoquinas inflamatorias inducida por la quimioquina HMGB1 y por la cascada inducida por HMGB1 de citoquinas inflamatorias seleccionada de restenosis, ateroesclerosis o lesión isquemia-reperfusión, causada por, asociada con y/o acompañada de liberación de la proteína HMGB1.

En una realización especialmente preferida, se utiliza K-252a para la prevención o el tratamiento de ateroesclerosis y/o restenosis que ocurren durante o después de angioplastia. Más preferiblemente, el medicamento se utiliza para bloqueo, retardo y/o deterioro de la regeneración del tejido conectivo en la restenosis durante o después de angioplastia.

Por inhibición de la actividad de HMGB1, puede prevenirse y/o inhibirse la migración y proliferación de células musculares lisas (SMC) que ocurren durante la restenosis. Las SMCs están localizadas en la túnica media donde las mismas están embebidas en una matriz extracelular. En los vasos intactos, las células SMC se encuentran en estado contráctil y exhiben un fenotipo caracterizado por ausencia de división celular y migración, que es responsable de la rigidez de la pared del vaso, el mantenimiento de la elasticidad y el control de la presión sanguínea periférica.

Cuando el endotelio de los vasos se deteriora, sea después de lesiones mecánicas (rascado por inserción de dilatadores) o lesiones inflamatorias locales, las SMCs cambian a un fenotipo sintético y sufren división celular y migración. La migración de las SMCs de la túnica media a la túnica íntima, que da como resultado engrosamiento de la íntima, juega un papel importante en la patofisiología de muchos trastornos vasculares, tales como ateroesclerosis y restenosis después de angioplastia coronaria. En el estado sintético, las SMCs producen también cantidades mayores de proteinasas extracelulares, factores de crecimiento, citoquinas y secretan una matriz fibrosa extracelular. Después de la lesión traumática de la pared del vaso, la liberación de varios factores de crecimiento y/o quimioatrayentes e inductores de la proliferación celular (HMGB1 y proteínas homólogas de HMGB1 son uno de los más relevantes), sea por monocitos, macrófagos y plaquetas circulantes activados, o por células endoteliales deterioradas, puede inducir el cambio de las células SMC del fenotipo contráctil al sintético y dirigir su migración hacia la íntima del vaso. En el contexto de la presente invención se encontró, sorprendentemente, que HMGB1 y las proteínas homólogas de HMGB1 son secretadas por las células musculares lisas en las placas ateroescleróticas humanas. Así, K-252a y/o derivados del mismo como se han definido, son agentes terapéuticos adecuados en la prevención y/o el tratamiento de la restenosis, v.g. por administración sistémica y/o por medio de dilatadores de elución de fármaco.

K-252a y/o derivados del mismo como se han definido pueden utilizarse sea solos o en combinación con uno o varios agentes adicionales. En particular, K-252a y/o derivados del mismo como se han definido pueden utilizarse en combinación con al menos un agente adicional capaz de inhibir un mediador inicial de la cascada de citoquinas inflamatorias. Por ejemplo, derivados de K-252a como se han definido pueden administrarse junto con un agente capaz de inhibir los mediadores iniciales de la cascada de citoquinas inflamatorias, v.g. un antagonista o inhibidor de una citoquina seleccionada del grupo constituido por TNF, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-R_{a}, IL-8, MIP-1\alpha, MIF1\beta, MIP-2.MIF e
IL-6.

El agente adicional utilizado en combinación con K-252a y/o derivados del mismo como se han definido puede ser también un inhibidor de RAGE, v.g. un anticuerpo dirigido a RAGE, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de RAGE, v.g. una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de RNA, o una molécula sintética pequeña antagonista de la interacción de HMGB-1 con RAGE, preferiblemente de la interacción de la forma no acetilada y/o acetilada de HMGB1 con RAGE, o RAGE soluble (sRAGE). El anticuerpo dirigido a RAGE es preferiblemente un anticuerpo para RAGE es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, más preferiblemente un anticuerpo quimérico o humanizado o un anticuerpo recombinante, tal como un anticuerpo monocatenario o un fragmento de fijación de antígeno de un anticuerpo de este tipo. El análogo de RAGE soluble puede estar presente opcionalmente como una proteína de fusión, v.g. con el dominio Fc de un anticuerpo humano. El antagonista molecular sintético pequeño de la interacción de HMGB1 con RAGE tiene preferiblemente un peso molecular inferior a 1000 Dalton. El antagonista molecular sintético pequeño inhibe preferiblemente la interacción de RAGE con la forma no acetilada y/o con la forma acetilada de HMGB1 y con la forma no acetilada y/o con la forma acetilada de proteínas homólogas de HMGB1 seleccionadas de HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG.

Además, el agente adicional puede ser un antagonista/inhibidor de HMGB1, v.g. un anticuerpo contra HMGB1, particularmente contra la secuencia B de HMGB1 o un fragmento de HMGB1 que tiene actividad antagonista, v.g. un fragmento de la secuencia A. Antagonistas e inhibidores adecuados de HMGB1 se describen en US 6.468.533, WO 02/074337 y US 2003/144.201. El agonista/inhibidor de HMGB1 es preferiblemente un antagonista/inhibidor de la forma no acetilada y/o acetilada de HMGB1.

El agente adicional utilizado en combinación con K-252a y/o derivados del mismo como se ha definido puede ser también un inhibidor de la interacción de un receptor tipo Toll (TLR), v.g. de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9, con HMGB1, inhibidor que es preferiblemente un anticuerpo monoclonal o policlonal, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de TLR, v.g. una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de RNA, o una molécula sintética que tiene preferiblemente un tamaño menor que 1000 Dalton. El inhibidor puede ser un inhibidor conocido de un receptor tipo Toll, en particular de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9. El inhibidor inhibe preferiblemente la interacción del receptor tipo Toll con la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGB1 y con la forma no acetilada y/o con la forma acetilada de proteínas homólogas de HMGB1 seleccionadas de HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG.

En otra realización más, el agente adicional utilizado en combinación con K-252a y/o derivados del mismo como se han definido es el dominio funcional N-terminal semejante a lectina (D1) de la trombomodulina. El dominio D1 de la trombomodulina es capaz de interceptar la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGB1 liberada y de proteínas homólogas de HMGB1 liberadas seleccionadas de HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG, evitando con ello su interacción con RAGE y receptores tipo Toll. El dominio D1 de la trombomodulina puede ser nativo o estar mutado a fin de hacerlo resistente a las proteasas.

El agente adicional puede ser también una molécula sintética de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico bicatenario con una estructura de forma plegada, particularmente un DNA bicatenario plegado, un PNA o una quimera o híbrido DNA/PNA o una estructura de DNA bicatenaria(o) cruciforme, PNA o quimera o híbrido DNA/PNA capaz de fijarse a la proteína MHGB1. Ácidos nucleicos y moléculas análogas de ácido nucleico preferidos(as) se describen en la solicitud de patente internacional de los mismos propietarios y pendiente también de tramitación No. PCT/EP 2005/007198 presentada el 4 de julio de 2005 (que reivindica la prioridad de la solicitud provisional EE.UU. No. 60/584.678 presentada el 2 de junio de 2004). El ácido nucleico sintético bicatenario o molécula análoga de ácido nucleico con una estructura de forma flexionada es preferiblemente capaz de fijarse a la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGB1 y la forma no acetilada y/o la forma acetilada de proteínas homólogas de HMGB1 seleccionadas de HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG.

El K-252a y/o un derivado del mismo como se ha definido se administra(n) usualmente como una composición farmacéutica, que comprende adicionalmente vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

La administración puede realizarse por métodos conocidos, v.g. por inyección, en particular por inyección intravenosa, intramuscular, transmucosal, subcutánea o intraperitoneal y/o por aplicación oral, tópica, nasal, inhalación, aerosol y/o rectal, etc. La administración puede ser local o sistémica.

Por tanto, la presente invención describe adicionalmente una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de K-252a y/o una sal o un derivado del mismo como se ha definido como un ingrediente activo para el tratamiento de dichas patologías asociadas a HMGB1 y vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables para el tratamiento de patologías asociadas con la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGB1 y/o de proteínas homólogas de HMGB1 como se han descrito.

La formulación, la ruta de administración y la dosificación exactas pueden ser seleccionadas por el médico individual teniendo en cuenta las condiciones del paciente. La administración puede realizarse en una sola dosis o en dosis repetidas a intervalos. La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente a fin de proporcionar el efecto terapéutico que da como resultado una mejora de los síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La cantidad real de una composición administrada dependerá, por supuesto, del individuo que se esté tratando, del peso del individuo, de la gravedad de la aflicción, del modo de administración y del criterio del médico que prescribe el tratamiento. Una dosis diaria adecuada estará comprendida entre 0,001 y 10 mg/kg, particularmente entre 0,1 y 5 mg/kg.

Una composición farmacéutica de este tipo puede utilizarse para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Para aplicaciones de diagnóstico, el compuesto puede estar presente en una forma marcada, v.g. una forma que comprenda un isótopo, v.g. un isótopo radiactivo o un isótopo que puede ser detectado por resonancia magnética nuclear. Una aplicación terapéutica preferida es el bloqueo, el retardo o la reducción de la regeneración del tejido conec-
tivo.

K-252a y/o una sal o un derivado del mismo como se ha definido puede administrarse como un compuesto libre y/o inmovilizado reversiblemente en la superficie de un dispositivo médico. Para este propósito, un dispositivo médico puede estar cargado de modo reversible con el ingrediente activo y, opcionalmente, agentes adicionales, en particular por fijación, imbibición y/o absorción de las moléculas del medicamento en la superficie del dispositivo médico o en una capa de recubrimiento de la superficie del dispositivo médico. Después de la puesta en contacto del dispositivo médico con el fluido corporal o tejido corporal, se liberan los compuestos inmovilizados de modo reversible. Por consiguiente, los dispositivos médicos recubiertos actúan como dispositivos de suministro de fármaco que eluyen el medicamento, por lo cual la cinética de suministro del fármaco puede controlarse, proporcionando una liberación inmediata o un suministro controlado, retardado o prolongado del fármaco, por ejemplo. Para una liberación controlada, retardada o prolongada, el agente activo puede estar embebido en nano- o microcápsulas o un recubrimiento de matriz; en particular, puede aplicarse un recubrimiento de matriz de polímero sobre un dispositivo médico, tal como un dilatador. Tecnologías de recubrimiento de dispositivos médicos son bien conocidas por las personas expertas en la técnica.

Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un dispositivo médico recubierto o embebido reversiblemente con K-252a y/o una sal o un derivado del mismo como se ha descrito. Preferiblemente, el dispositivo médico se selecciona de instrumentos quirúrgicos, implantes, catéteres o dilatadores, v.g. dilatadores para angioplastia. Muy preferiblemente, el dispositivo médico de acuerdo con la invención es un dilatador de elución de fármaco (DES).

Adicionalmente, la presente invención se explica con mayor detalle en las Figuras y Ejemplos que siguen.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - Actividad de K-252a en un ensayo de quimiotaxis.

Actividad inhibidora de K-252a sobre las células musculares lisas de la aorta de bovino (BASMC) en un ensayo típico de migración (quimiotaxis) realizado utilizando cámaras de Boyden modificadas y dos quimioatrayentes diferentes: HMGB1 y fMLP (péptido formil-metionina-leucina-fenilalanina - o fMetLeuPhe - un quimioatrayente específico de los leucocitos). K-252a antagoniza de forma activa y dependiente de la concentración (en un intervalo nanomolar) la migración de las células BASMC inducida por HMGB1, mientras que no interfiere con la migración celular inducida por fMLP, cualquiera que sea la concentración testada.

Figura 2 - Actividad de K-252a en un ensayo de proliferación.

Actividad inhibidora de K-252a sobre la proliferación de las células musculares lisas de la aorta de bovino (BASMC) inducida por HMGB1. K-252a antagoniza la proliferación de las células BASMC a todas las concentraciones testadas de una manera dependiente del tiempo y en un intervalo de nM.

Figura 3 - Dicroísmo circular de HMGB1 en presencia de K-252a.

Figura 4 - Inhibición por K-252a de la mortalidad por endotoxemia inducida por LPS. El tratamiento con K-252a exhibe una clara inversión de la letalidad inducida por LPS en los ratones.

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Ejemplos 1. Ensayo de quimiotaxis

Se realizaron ensayos de quimiotaxis utilizando un protocolo bien conocido y validado (1). Se utilizaron cámaras de Boyden modificadas con filtros que tenían un tamaño de poro de 5-8 \mum y tratados con colágeno I (100 \mug/ml en ácido acético 0,5M) y fibronectina (10 \mug/ml, Roche). Se cultivaron BASMC (células musculares lisas de aorta de bovino) en DMEM exento de suero y se añadió una muestra de 20.000-40.000 células al pocillo superior de una cámara de Boyden.

Se disolvió y diluyó K-252a en el mismo medio exento de suero y se añadió al pocillo inferior de la cámara. La concentración de HMGB-1 (procedente de timo de ternero) era 25 ng/ml, la de fMLP era 0,1 \muM, mientras que K-252a era 3, 10, 30, y 100 nM. Se dejó transcurrir la migración de las células durante una noche a 37 \pm 0,5ºC, después de lo cual se separaron las células por rascado y los filtros se fijaron en metanol y se tiñeron en una solución de violeta cristal al 10% en metanol de 20%. Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces por triplicado. Los resultados son el valor medio \pm SD del número de células contado en 10 campos de alta potencia por filtros y se expresaron como múltiplos del control. Se asignó a la migración celular aleatoria, es decir, la migración en ausencia de quimioatrayente, el valor arbitrario de 100%. Se realizó un análisis estadístico utilizando el test t de Student para comparaciones del tratamiento por pares, o un modelo ANOVA para la evaluación de los tratamientos con concentraciones crecientes de un reactivo. Los resultados se muestran en la Figura 1.

Un ensayo de quimiotaxis como se ha descrito arriba puede realizarse análogamente utilizando células BAEC. Se obtienen resultados correspondientes.

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2. Ensayo de proliferación

Se realizaron ensayos de proliferación utilizando un método ya descrito y validado (1). Células BASMC (células musculares lisas de aorta de bovino) se sembraron en placas de 6 pocillos (10^{5} células/pocillo) y se dejaron crecer en medio RPMI complementado con FCS al 20%. Después de 24 horas, se reemplazó el medio con RPMI exento de suero y las células se mantuvieron luego privadas de alimento durante 16 horas para sincronizar la población celular. Se añadieron vehículo (control negativo o proliferación basal) o 25 ng/ml (1 nM) de HMGB1 (producida bacterialmente) en presencia o en ausencia de K-252a 3, 10, 30, 100 ó 300 nM (disuelto y diluido en medio exento de suero). Cada punto experimental representa el valor medio \pm SD de determinaciones triplicadas. El experimento se repitió tres veces. Se determinó la proliferación de las células BASMC por desprendimiento de las células de la placa en los intervalos indicados (los días 1, 2, 3 y 4 de cultivo) y recuento de las células que excluían el azul tripán bajo el microscopio. Los resultados se muestran en Fig. 2.

Un ensayo de proliferación como se ha descrito arriba puede realizarse análogamente utilizando células BAEC. Se obtienen resultados correspondientes.

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3. Experimentos de Fijación de Proteínas por Dicroísmo Circular (CD)

Para comprobar la fijación de proteínas de K-252a, se realizó un estudio CD. Todos los espectros CD se recogieron en un espectropolarímetro Jasco J710 equipado con una unidad de controlador térmico NesLab ERT111, utilizando una cubeta cilíndrica de cuarzo con una longitud de recorrido de 1 cm (Jasco). Se utilizó en todos los casos una velocidad de escaneo de 20 nm/min, una anchura de banda de 1 nm, y una resolución de 1 nm.

La adición de K-252a en concentraciones de 3,42 \muM, 6,84 \muM y 10,26 \muM a HMGB1 induce un gran impacto en el CD de HMGB1 en el intervalo de 200 a aproximadamente 235 nm (véase Figura 3), pero no en el intervalo de aproximadamente 235 a 260 nm. El efecto en el intervalo de 200 a aproximadamente 235 nm podría, sin embargo, atribuirse a la acción desnaturalizadora del disolvente de K-252a (dimetilformamida, DMF) o a la interacción entre K-252a y contaminantes bacterianos de HMGB1. Los espectros están fuertemente alterados debido, muy probablemente, a DMF.

Suponiendo que tiene lugar una fijación de estequiometría 1:1 entre HMGB1 y K-252a, el valor K_{d} aparente del complejo debería ser aproximadamente 2 \muM, un valor que caracteriza una interacción extremadamente débil. Por tanto, la interacción directa no puede considerarse como el mecanismo por el cual K-252a inhibe la proliferación y migración de las células inducida por HMGB1. Ensayos de fluorescencia parecen confirmar la ausencia de una interacción directa entre K-252a y HMGB1.

K-252a es un inhibidor de las tirosina-quinasas (TrkA, TrkB, TrkC), de fosfoquinasas (PKA, PKC, PKG), y de otras quinasas (quinasa Raf, quinasa Ras, quinasa CaM, quinasa MLC, quinasa MAP, las quinasas MEK, ERK, JUN, y PI3K\gamma). Muy probablemente, K-252a no inhibe HMGB1 al nivel del receptor (RAGE), pero puede interferir con TrkA y/o con una de las quinasas aguas abajo de la interacción de HMGB1 con RAGE o con los receptores tipo Toll.

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4. Inversión por K-252a de la endotoxemia inducida por LPS en los ratones

Se adquirieron 32 ratones BALB/c macho de 6 a 7 semanas de Charles River (Calco, Italia) y se dejaron aclimatar durante una semana antes de utilizarlos. El día del experimento, todos los ratones recibieron una DL_{70-90} (10,5 mg/kg i.p. en la región inguinal derecha) de lipopolisacárido (LPS de Escherichia coli, cepa 0111:B4 SIGMA, lote 034154105), disuelto en solución salina estéril al 0,9%. Quince minutos antes de la inyección de LPS y 2, 12 y 24 h después de la administración de LPS, 16 ratones recibieron K-252a (6,7 mg/kg i.p., 10 ml/kg, en la región inguinal izquierda) disueltos en DMSO:solución salina estéril (8:92 v/v). Los 16 ratones restantes recibieron el mismo volumen del vehículo solo (controles). Se observaron los ratones durante 7 días consecutivos al menos dos veces al día y se registraron las muertes.

Los resultados se muestran en la Figura 4. Al final del periodo de observación (7 días), 10 de 16 ratones (62,5%) tratados con K-252a estaban vivos todavía, mientras el último ratón de control se encontró muerto ya en el curso del quinto día. El análisis estadístico (Análisis de Supervivencia Kaplan-Meier) da un valor "P" de 0,0001.

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5. Estudio del perfil de inhibición de las quinasas

Se ha realizado un análisis con la finalidad de medir las actividades inhibidoras de K-252a contra 67 proteína-quinasas a una concentración de 200 nM. En particular, las quinasas diana eran tirosina-quinasas y serina/treonina-quinasas.

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5.2 Resultados

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TABLA 1 Tirosina-quinasas

2

3

TABLA 2 Serina/Treonina-quinasas

4

6. Conclusiones

Los efectos inhibidores muy potentes exhibidos por K-252a en modelos in vitro de migración y proliferación celular hacen que K-252a sea un fármaco candidato prometedor para utilización en la terapia sistémica o local de enfermedades relacionadas con HMGB1.

Basándose en estos resultados, está claro que HMGB1, tanto liberada por células endoteliales lesionadas/muertas como secretada por macrófagos y monocitos circulantes activados, es una de las dianas más relevantes de la restenosis después de angioplastia quirúrgica y de varias patologías graves en el campo de la inflamación y la inmunidad. La inhibición de su papel y actividades de una quimioquina quimiotáctica típica principalmente in situ, exactamente donde está localizada la lesión traumática mecánica y donde se inicia y desarrolla el proceso que conduce a la formación de la restenosis, parece indicar actividades preventivas/terapéuticas de un antagonista específico de HMGB1.

Por la misma razón, la administración sistémica de inhibidores de las actividades patológicas inducidas por HMGB1 parece ser un enfoque terapéutico prometedor para curar un amplio panel de enfermedades sistémicas y locales. Se demuestra aquí que K-252a es un potente inhibidor in vitro de las dos actividades de HMGB1 implicadas principalmente en la inducción la restenosis y formación de la restenosis así como en el desencadenamiento, mantenimiento y amplificación de respuestas inflamatorias e inmunitarias locales y sistémicas.

De hecho, a concentraciones que están dentro del intervalo nanomolar, K-252a inhibía la migración celular inducida por HMGB1 (Fig. 1) y la proliferación (Fig. 2). Esto, traducido in vivo, significa que K-252ª, como agente terapéutico solo o liberado por un dilatador embebido/recubierto con K-252 propiamente dicho en el sitio lesionado antagonizaría activamente HMGB1 por bloqueo/inhibición del cambio de las células musculares lisas del fenotipo caracterizado por ausencia de división y migración celular al fenotipo sintético que conduce a las mismas a pasar a y proliferar en la pared endotelial del vaso sanguíneo lesionado, produciendo restenosis. Análogamente, en el caso de terapia de patologías inflamatorias e inmunológicas desencadenadas y sostenidas por HMGB1, la administración sistémica de K-252a inhibiría/bloquearía la cascada patológica inducida por esta quimioquina quimiotáctica, con efectos beneficiosos sobre la aparición y el curso de la naturalidad.

Además, los datos in vivo obtenidos para el tratamiento con K-252a de ratones afectados por endotoxemia grave inducida por LPS con K-252a, respaldan adicionalmente los resultados alcanzados con los datos in vitro arriba descritos de migración y proliferación celular. De hecho, la administración de 6,7 mg/kg i.p. de K-252a 4 veces a ratones que padecían una endotoxemia grave inducida por LPS, aumenta significativamente (más de un 60%) la supervivencia de los ratones testados comparada con la supervivencia de los ratones de control. De hecho, los ratones de control no sobreviven más del quinto día. Los resultados in vivo demuestran por tanto una disminución notable en la mortalidad de los ratones tratados con K-252a, confirmando que K-252a es una fármaco candidato prometedor para utilización en el tratamiento sistémico o local de las patologías relacionadas con HMGB1.

El mecanismo por el cual K-252a inhibe la actividad de HMGB1 parece ser la inhibición de quinasas. Por tanto, otros inhibidores de quinasas, en particular inhibidores de quinasas conocidos, v.g. de tirosina-quinasa tales como TrkA, TrkB, TrkC, de fosfoquinasa, tales como PKA, PKC, PKG y/o de una quinasa adicional, tal como la quinasa Raf, la quinasa Ras, la quinasa CaM, la quinasa MLC, la quinasa MAP, las quinasas MEK, ERK y JUN, PI3K\gamma, pueden ser también compuestos adecuados para inhibir la actividad de HMGB1 in vitro e in vivo. Por esta razón, tales inhibidores de quinasas pueden proporcionar un enfoque terapéutico prometedor en las enfermedades que implican actividad de HMGB1 liberada.

Referencias

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Claims (20)

1. Uso de K-252a y/o una sal o un derivado del mismo para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una patología asociada con HMGB1, que es desencadenada y/o sostenida por HMGB1 y/o proteínas homólogas de HMGB1 seleccionada de restenosis, ateroesclerosis o lesión isquemia-reperfusión, en donde dicho derivado es un compuesto sintético y/o modificado químicamente, que es un compuesto que tiene sustituyentes en el sistema de anillos seleccionados de grupos alquilo C_{1}-C_{4}, un compuesto en el cual el grupo éster metílico ha sido reemplazado por otro grupo éster, un grupo amida o por H o un catión, y/o un compuesto en el cual el átomo N en el grupo amida cíclico está sustituido con un grupo alquilo C_{1}-C_{4} y en el cual las proteínas homólogas de HMGB1 son HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG.

2. Uso de la reivindicación 1, en donde dicha patología asociada con HMGB1 está asociada con la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGB1 y asociada con la forma no acetilada y/o la forma acetilada de proteínas homólogas de HMGB1, en donde las proteínas homólogas de HMGB1 son HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en donde la patología asociada con HMGB1 es una condición patológica mediada por activación de la cascada de citoquinas inflamatorias inducida por HMGB1 y/o proteínas homólogas de HMGB1, en donde las proteínas homólogas de HMGB1 son HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG.

4. El uso de las reivindicaciones 1-3 para bloqueo, retardo o deterioro de la regeneración del tejido conectivo en la restenosis durante o después de angioplastia.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en combinación con un agente adicional.

6. El uso de la reivindicación 5, en donde el agente adicional es capaz de inhibir mediadores iniciales de la cascada de citoquinas inflamatorias.

7. El uso de la reivindicación 6, en donde el agente adicional es un antagonista o inhibidor de una citoquina seleccionada del grupo constituido por TNF, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-R_{a}, IL-8, MIP-1\alpha, MIF1\beta, MIP-2.MIF e IL-6.

8. El uso de la reivindicación 5, en donde el agente adicional es un anticuerpo para RAGE, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de RAGE, v.g. una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de RNA, o una molécula sintética pequeña antagonista de la interacción de HMGB1 con RAGE o RAGE soluble (sRAGE), en donde dicho análogo de ácido nucleico es PNA o una quimera o híbrido DNA/PNA.

9. El uso de la reivindicación 5, en donde el agente adicional es un antagonista o inhibidor de HMGB1.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde el antagonista o inhibidor es un antagonista o inhibidor de la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGB1.

11. El uso de la reivindicación 5, en donde el agente adicional es un inhibidor de la interacción de un receptor tipo Toll (TLR), en particular de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9, con HMGB1 y/o proteínas homólogas de HMGB1, preferiblemente un anticuerpo monoclonal o policlonal, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de TLR, v.g. una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de RNA, o una molécula sintética que tiene un tamaño menor que 1000 Dalton, en donde dicho análogo de ácido nucleico es PNA o una quimera o híbrido DNA/PNA.

12. El uso de la reivindicación 11, en donde el agente adicional es un inhibidor conocido de un receptor tipo Toll, en particular de TLR2, TLR4, TLR7, TKR8 y/o TLR9, en particular un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de TLR, v.g. una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de RNA, en donde dicho análogo de ácido nucleico es PNA o una quimera o híbrido DNA/PNA.

13. El uso de la reivindicación 5, en donde el agente adicional es el dominio N-terminal semejante a lectina (D1) de la trombomodulina.

14. El uso de la reivindicación 5, en donde el agente adicional es una molécula de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico sintético bicatenario o una estructura de forma plegada, en donde dicha molécula de análogo de ácido nucleico es PNA o una quimera o híbrido DNA/PNA.

15. El uso de la reivindicación 14, en donde la molécula de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico sintético bicatenario es una quimera o híbrido bicatenario plegado o cruciforme de DNA, PNA, o DNA/PNA.

16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde K-252a y/o una sal o un derivado del mismo está inmovilizado reversiblemente en la superficie de un dispositivo médico.

17. El uso de la reivindicación 16, en donde K-252a y/o una sal o un derivado del mismo está aplicado como recubrimiento sobre o embebido en la superficie del dispositivo médico.

18. El uso de las reivindicaciones 16 ó 17, en donde el dispositivo médico se selecciona de instrumentos quirúrgicos, implantes, catéteres o dilatadores.

19. Un dispositivo médico recubierto y/o embebido reversiblemente con K-252a y/o una sal o un derivado del mismo, en donde dicho derivado es un compuesto sintético y/o modificado químicamente, que es un compuesto que tiene sustituyentes en el sistema de anillos seleccionados de grupos alquilo C_{1}-C_{4}, un compuesto en donde el grupo éster metílico ha sido reemplazado por otro grupo éster, un grupo amida o por H o un catión, y/o un compuesto en el que el átomo N en el grupo amida cíclico está sustituido con un grupo alquilo C_{1}-C_{4}.

20. El dispositivo médico de la reivindicación 19, en donde el dispositivo médico se selecciona de instrumentos quirúrgicos, implantes, catéteres o dilatadores.