ES2327772T3 - Procedimiento para la determinacion de sustancias eliminadas por celulas detectables. - Google Patents

Procedimiento para la determinacion de sustancias eliminadas por celulas detectables. Download PDF

Info

Publication number
ES2327772T3
ES2327772T3 ES06020937T ES06020937T ES2327772T3 ES 2327772 T3 ES2327772 T3 ES 2327772T3 ES 06020937 T ES06020937 T ES 06020937T ES 06020937 T ES06020937 T ES 06020937T ES 2327772 T3 ES2327772 T3 ES 2327772T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
molecules
test surface
substances
intensity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES06020937T
Other languages
English (en)
Inventor
Volkmar Schollhorn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AUTOIMMUN DIAGNOSTIKA GmbH
Original Assignee
AUTOIMMUN DIAGNOSTIKA GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AUTOIMMUN DIAGNOSTIKA GmbH filed Critical AUTOIMMUN DIAGNOSTIKA GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2327772T3 publication Critical patent/ES2327772T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7793—Sensor comprising plural indicators

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Procedimiento para determinar la cantidad de sustancias secretadas por células detectables, especialmente para el diagnóstico y/o el seguimiento de la terapia de enfermedades, en el que las sustancias secretadas por las células se hacen visibles sobre al menos una superficie de ensayo de un soporte mediante moléculas de captura con ayuda de superficies coloreadas, de manera que las superficies son descompuestas en puntos individuales y estos últimos son elaborados, caracterizado por el hecho de que se mide cuantitativamente la intensidad de la coloración total sobre la superficie de ensayo, donde la superficie de ensayo es descompuesta en una multitud de puntos individuales, la intensidad de color de cada punto individual es medida por separado y los valores de intensidad medidos son adicionados y la coloración producida por las sustancias secretadas se disminuye en su intensidad por puntos individuales y/o se aumenta su extensión superficial.

Description

Procedimiento para la determinación de sustancias eliminadas por células detectables.
La invención se refiere a un procedimiento para determinar la cantidad de sustancias secretadas por células detectables, especialmente para el diagnóstico y/o el seguimiento de la terapia de enfermedades.
La prueba de inmunosorción enzimática ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay) es un procedimiento de comprobación inmunológica para las más diversas biomoléculas, particularmente para proteínas y hormonas. El procedimiento ELISA clásico se realiza como un llamado procedimiento sandwich con dos anticuerpos que son ambos altamente específicos para el antígeno a comprobar, en el cual un anticuerpo (anticuerpo de recubrimiento) es inmovilizado sobre un soporte fijo y se añade un segundo anticuerpo (anticuerpo de detección), particularmente en forma de un conjugado de enzimas que permite una comprobación colorimétrica, después de una cierta fase de incubación. Con ayuda del procedimiento ELISA pueden ser probadas por consiguiente las sustancias secretadas por células, por lo cual en muchos casos podría ser difícil un análisis cuantitativo y también cualitativo de la actividad-intensidad celular de la reacción celular ante una influencia exógena determinada, por ejemplo a un antígeno.
Un desarrollo ulterior en vista de un dictamen mejorado de la actividad celular representa el llamado procedimiento ELISA-Spot (procedimiento ELIspot), en el cual las moléculas de captura que pueden ligar sustancias secretadas por células son inmovilizadas sobre un soporte. Debido a la presencia simultánea de las sustancias ajenas estimulantes de las células, particularmente los antígenos, se provoca la segregación o separación de sustancias específicas de las células a examinar, particularmente sustancias de defensa y/o sustancias mensajeras, que son ligadas por las moléculas de captura inmovilizadas y que pueden ser llevadas a una reacción coloreada que refleje la actividad de una célula individual. Estos procedimientos para la determinación de la actividad celular se basa en la medición del número de células, a pesar del hecho de que células individuales puedan reaccionar de manera muy diferente a la misma sustancia ajena, lo que se manifiesta particularmente en la cantidad de sustancias secretadas por las células. Así pueden darse absolutamente unas diferenciaciones de calidades respecto a la actividad de las células individuales, que no son captadas con el procedimiento ELIspot convencional.
Por lo tanto en años anteriores se realizaron grandes esfuerzos para desarrollar procedimientos inmunológicos que permitieran obtener también un valor informativo de las actividades celulares. De la patente DE 198 21 289 se puede deducir particularmente un procedimiento perfeccionado, en el que se toma en consideración la calidad de la actividad de las células individuales por la determinación del tamaño de las superficies de color producidas (Spots) sobre una superficie de ensayo. El procedimiento se basa en el conocimiento de que las células más activas producen spots más grande que las células menos activas y que el tamaño de los spots es proporcional a la actividad de las células individuales.
En la patente DE 103 52 678 A1 se describe otro procedimiento eficaz, en el que la medición de la calidad de la actividad de las células individuales se determina con ayuda del tamaño y de la intensidad de los spots producidos sobre una superficie examinada. Por consiguiente se tiene en cuenta la circunstancia de que por ejemplo un spot pequeño que presenta una coloración intensa refleja una reacción celular más fuerte que un spot grande que tenga un color menos intenso. Sin embargo en tales casos pueden darse ciertas dificultades en la evaluación de la actividad celular siendo necesario un dictamen de calidad y eventualmente una diferenciación de la calidad de los spots que presentan intensidades de color que están por encima del valor máximo de la intensidad de color técnicamente mensurable. En estos casos, la actividad medida de las células no corresponde a su actividad real, por lo cual pueden obtenerse resultados de medición imprecisos. Pueden aparecer otros problemas particularmente en caso de existir formaciones celulares (grupos), que puedan dar lugar a coloraciones solapadas, de manera que en tales casos se complica aún más una medición de la calidad de la actividad de células individuales.
La invención tiene por consiguiente el objetivo de proveer un procedimiento para determinar la actividad total de células, que permita también un dictamen exacto y fiable de la actividad celular total cuando se manifiesten superficies de intenso coloreado y particularmente superficies de colores solapados sobre una superficie de ensayo, particularmente en cuanto a la calidad de la actividad total de las células sobre la superficie de ensayo.
Objeto de la invención es un procedimiento para determinar la cantidad de sustancias secretadas por células detectables, especialmente para el diagnóstico y/o el seguimiento de la terapia de enfermedades, en el cual sobre al menos una superficie de ensayo de un soporte son visualizadas sustancias secretadas por células mediante moléculas de captura con ayuda de superficies coloreadas, descomponiendo las superficies en puntos individuales y elaborando estos últimos, midiendo cuantitativamente la intensidad de la coloración total sobre la superficie de ensayo.
Bajo el concepto "actividad total" en el sentido de la presente invención debe entenderse la intensidad total de la reacción de todas las células sobre la superficie de ensayo total a una influencia exógena definida, por ejemplo un antígeno.
Bajo el concepto "terapia" en el sentido de la presente invención deben entenderse tanto el tratamiento de enfermedades, el tratamiento de alteraciones del estado de ánimo que acompañan a las enfermedades así como las correspondientes medidas preventivas.
Según la invención, la superficie de ensayo del soporte se descompone en una multitud de puntos individuales, se mide por separado la intensidad de color de cada punto individual y se añaden los valores de intensidad medidos. Está previsto especialmente que 1 a 2 millones, en particular aprox. 1,5 millones de puntos de imagen (pixels) por superficie de ensayo son captados por ejemplo por una cámara. Para medir la intensidad de color de un punto individual sobre la superficie de ensayo hay disponibles entre 200 y 300, particularmente entre 220 y 260 y preferiblemente aprox. 256 graduaciones (escala de colores grisáceos). La elaboración y evaluación de los pixels puede ser realizada particularmente con un aparato de lectura. Se mide preferiblemente el número total de pixels así como su intensidad con ayuda de un analizador de imágenes. Por consiguiente es posible una medición de la coloración total referida a la superficie de ensayo o una parte determinada de la misma. Como valor de referencia puede servir un punto incoloro sobre la superficie de ensayo, eventualmente también de otra superficie de ensayo. La medida de la actividad total se obtiene entonces del número de pixels (coloreados) estimulados, multiplicado por la escala de color (por ejemplo la escala de colores grisáceos entre 0 y 256) de cada pixel estimulado. El producto es dividido convenientemente por 1000, para obtener valores numéricos fácilmente manejables. La captación y evaluación de los pixels se realiza preferiblemente desde arriba (sobre la superficie de ensayo). La elaboración a una imagen bidimensional se realiza preferiblemente con ayuda de técnicas informáticas.
En el procedimiento ELISA-Spot conocido se pretende obtener las reacciones de color más intensas posibles y concentradas en un spot, para que se pueda averiguar lo mejor posible el número de células activas.
Por otro lado en el procedimiento adoptado se reducen preferiblemente los componentes que participan en la reacción de color en su cantidad y/o posición con respecto a las condiciones habituales, particularmente en sus concentraciones, para mantener también el máximo color de una reacción celular en una zona cuantificable para la medición de la intensidad.
Según la invención se toman medidas, por las que la coloración producida por las sustancias secretadas disminuye en su intensidad por puntos individuales en comparación con el estado de la técnica y/o aumenta en su extensión superficial, es decir el número de los puntos individuales por célula. Debido al aumento de la extensión superficial se debilita particularmente la coloración por unidad de superficie y por consiguiente se ven más claras las diferencias de coloración entre las superficies individuales y/o dentro de una superficie mayor. El solapamiento de las superficies de color de las sustancias secretadas por las células no perturba. De esta manera se llevan las intensidades de color de los puntos individuales en el sector técnicamente mensurable. Por consiguiente, las superficies intensamente coloreadas, cuyas intensidades han sobrepasado el valor máximo técnicamente comprobable, pueden pasarse a una medición de diferenciación, considerando particularmente la cantidad y la calidad de la reacción celular con ayuda de la cantidad de sustancias secretadas, mediante el procedimiento según la invención, debido a la mayor extensión superficial. Una medición de la intensidad de color efectuada a continuación sobre la superficie coloreada produce por consiguiente resultados precisos y por lo tanto reproducibles en cuanto a la actividad total de las células. Mediante el procedimiento es por lo tanto también posible medir particularmente la actividad total de estructuras celulares que pueden dar lugar a superficies de color solapadas sobre la superficie de ensayo. En este caso ya no importa un contaje de las células activas.
Según la invención es especialmente preferible que se use un material de soporte que presente poca afinidad con las moléculas de captura, para un enlace de las moléculas de captura sobre el soporte. La afinidad es preferiblemente una afinidad de enlace que puede establecerse particularmente por enlaces covalentes, interacciones electroestáticas, enlaces de puentes de hidrógeno y/o interacciones hidrófobas, particularmente las fuerzas de Van-der-Waals. La poca afinidad del material de soporte a las moléculas de captura provoca un número pequeño de moléculas de captura inmovilizadas sobre la superficie de ensayo, por lo cual las sustancias secretadas por las células pueden recorrer un trayecto de difusión más largo sobre la superficie de ensayo, antes de que reaccionen con las moléculas de captura y se hagan visibles por una reacción coloreada adecuada. Las vías de difusión prolongadas de las sustancias secretadas provocan la coloración más débil por unidad de superficie ya descrita arriba y por ello dan lugar a resultados de medición más exactos y más fiables.
Como material de soporte apropiado puede usarse particularmente el poliestireno, difluoruro de polivinilideno (PVDF), nitrocelulosa o nylon, siendo especialmente preferido el poliestireno debido a su poca afinidad de enlace a las moléculas de captura. En el caso del poliestireno se puede tratar particularmente de un poliestireno inyectado o fundido. Son adecuados especialmente las placas de 96 pocillos de poliestireno.
En otra forma de realización del procedimiento según la invención, como otra medida de reducción de la intensidad por punto individual y de aumento de la extensión superficial, se puede trabajar con una concentración reducida en moléculas de captura. Así, en el procedimiento ELIspot se trabaja particularmente con una concentración de moléculas de captura de aprox. 5 \mug/ml. Utilizando concentraciones más escasas se inmoviliza una cantidad más pequeña de moléculas de captura sobre la superficie de ensayo, por lo cual surgen spots más grandes con diferencias de coloración claras sobre la superficie de ensayo. Ventajosamente el tiempo de incubación tiene lugar de 4 a 18 horas después de la ocupación del soporte con las moléculas de captura. Una vez efectuada la incubación se lavan las moléculas de captura sobrantes no inmovilizadas por el soporte.
Según la invención es particularmente preferido que durante la ocupación del soporte se trabaje con una concentración en moléculas de captura de 2 a 3 \mug/ml, particularmente de aprox. 2,5 \mug/ml, por 20 mm^{2}. Preferiblemente se inmovilizan aprox. 1 \mug de moléculas de captura sobre la superficie de ensayo del soporte.
En otra forma de realización especialmente preferida del procedimiento según la invención, la reducción de la intensidad de los puntos individuales de la coloración debida a las sustancias secretadas así como al aumento de la extensión superficial puede producirse tanto por una reducción de la concentración de las moléculas de captura como también por la utilización de un material de soporte con poca afinidad a las moléculas de captura, particularmente el poliestireno.
En algunos casos puede ser deseable medir, en su caso adicionalmente a la medición de la intensidad de color total, el número de células activas, por lo cual puede darse la dificultad de que las células presentes en una estructura celular no sean captables individualmente, debido a su enlace funcional y/o estructural y por el solapamiento de coloración recíproco. En este caso puede preverse que el número de células, particularmente en una estructura celular, con secreción de sustancias detectables en caso de coloraciones solapadas recíprocamente, sea determinado de manera que en cada caso se determinen los máximos de color (valores máximos de intensidad de color) a atribuir a las células individuales y estos sean contados.
Preferiblemente en el procedimiento se utilizan células eucarióticas, especialmente células humanas y/o animales, obteniendo las células preferiblemente del organismo vivo. Las células son particularmente células sanguíneas, por ejemplo células inmunocompetentes, preferiblemente linfocitos, células T, particularmente células ayudantes T (células T_{H}), y/o células dendríticas, particularmente células que presentan antígenos, por ejemplo macrófagos. Preferiblemente en el procedimiento se usan células ayudantes T, particularmente células T_{H1} y T_{H2}.
Está previsto además que las células sean enriquecidas antes de la medición, particularmente antes de la fijación, sobre la superficie de ensayo del soporte. El enriquecimiento de las células puede tener lugar por ejemplo con ayuda de la centrifugación, particularmente en un gradiente de azúcar. De esta manera es particularmente posible separar los eritrocitos pesados de las células inmunocompetentes más ligeras.
Está previsto particularmente que las células sean lavadas antes de la aplicación sobre la superficie de ensayo del soporte, particularmente en una solución tamponada. Las células en particular se recuentan. Las células son depositadas preferiblemente en forma de una capa simple (monocapa) sobre la superficie de ensayo del soporte.
Como moléculas de captura se usan ventajosamente las moléculas orientadas contra las sustancias secretadas por las células. Preferiblemente en lo que concierne las moléculas de captura, éstas son proteínas, preferiblemente anticuerpos. Las moléculas de captura pueden presentar particularmente marcaciones que permitan una verificación colorimétrica. Preferiblemente las moléculas de captura, particularmente los anticuerpos, son los llamados conjugados que presentan una proteína apropiada para la verificación colorimétrica, en particular una enzima, preferiblemente fosfatasa alcalina o peroxidasa, por ejemplo una peroxidasa de rábano picante.
En una forma de realización avanzada del procedimiento pueden usarse como moléculas de captura unos conjugados con oro o plata, preferiblemente plata. Las marcaciones de oro o plata de las moléculas de captura pueden ser usadas en el marco de los procedimientos de comprobación usuales del experto, por ejemplo procedimientos inmuno-oro, para generar superficies coloreadas sobre la superficie de ensayo del soporte. Preferiblemente se usan conjugados de anticuerpos con oro o plata, preferiblemente plata. Como coloración se entienden radiaciones que se distinguen de aquellas del fondo. A ellas pertenecen también coloraciones negras, blancas o grises así como radiaciones no visibles.
En una forma de realización preferida, para la visualización de las sustancias secretadas por las células, se usan moléculas de detección junto a las moléculas de captura. Las moléculas de detección son preferiblemente anticuerpos. Las moléculas de detección son conjugadas convenientemente con compuestos que permitan una verificación colorimétrica. Los compuestos son particularmente proteínas, preferiblemente enzimas. Entonces las moléculas de detección pueden ser conjugadas por ejemplo con fosfatasa o peroxidasa, en particular con peroxidasa de rábano picante. Las moléculas de detección pueden ser conjugadas además con oro o plata. Con respecto a otros detalles y características se hace referencia a la descripción precedente.
En otra forma de realización se coloca un reactivo de color del procedimiento sobre las células fijadas sobre la superficie de ensayo del soporte. Preferiblemente el reactivo de color es un substrato de una enzima conjugado con la molécula de captura, particularmente un paranitrofenilfosfato, carbazol o bromocloro-indolil-fosfato. Dichas formas de realización para producir una reacción coloreada son conocidas por el experto, de modo que no se hace una descripción detallada en este punto.
En una configuración avanzada del procedimiento, las sustancias secretadas son particularmente sustancias mensajeras, preferiblemente citoquinas. Según la invención es especialmente preferido que las sustancias secretadas sean al menos un representante del grupo consistente en interleuquina 2, interleuquina 4, interleuquina 5, interleuquina 10, interferón gamma y/o TNF\beta (Factor de necrosis tumoral \beta), siendo especialmente preferido el interferón gamma según la presente invención.
La secreción de las sustancias es motivada especialmente por las sustancias ajenas inmunológicas, los llamados antígenos, sobre la superficie de ensayo. Los antígenos pueden ser particularmente patógenos completos, por ejemplo virus y/o bacterias. En una forma de realización especial del procedimiento, los antígenos son los llamados epítopes (fragmentos), particularmente de péptidos, por ejemplo con una longitud de aminoácidos de 9 a 11 aminoácidos. Adicionalmente, debido a la presencia de células dendríticas, particularmente los macrófagos, pueden producirse epítopes sobre la superficie de ensayo debido a la fagocitosis de patógenos completos, que se presentan preferiblemente sobre la superficie de células que presentan los llamados antígenos.
La superficie de ensayo del soporte es preferiblemente plana. Esto es especialmente preferido, puesto que de esta manera pueden evitarse modificaciones de concentración locales sobre la placa de análisis. Además, la superficie de ensayo puede ser particularmente una superficie redonda, por ejemplo el fondo perforado de una placa perforada. Las placas perforadas son placas de microtitulación comercialmente disponibles, que pueden presentar un número diferente de agujeros (cavidades o pocillos). Preferiblemente se usa dentro del marco del procedimiento según la invención una placa perforada con 96 agujeros (placa de 96 pocillos).
Las placas de 96 pocillos tienen preferiblemente un diámetro de pocillo de aprox. 5 mm en el fondo, lo que corresponde a una superficie de base de aproximadamente 20 mm^{2}. En algunos casos puede ser necesario trabajar con superficies de ensayo más pequeñas. Según la invención puede preverse emplear superficies de base que sean menores de 15 mm^{2}, particularmente menores de 10 mm^{2}. La superficie preferida de 20 mm^{2} sirve particularmente para permitir el acceso de los equipos desarrollados para las placas perforadas habituales, particularmente placas de 96 pocillos, especialmente para el llenado, el lavado, la extracción y la medición automáticos.
Las enfermedades que pueden ser diagnosticadas con ayuda del procedimiento y/o cuyo transcurso puede ser observado, son particularmente enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes y/o alergias. Preferiblemente, las enfermedades infecciosas son la tuberculosis, el virus citomegálico (CMV), la borreliosis, el virus de Eppstein-Barr (EBV), herpes, gripe y/o hepatitis C. Las enfermedades autoinmunes son preferiblemente la artritis reumatoide.
El procedimiento según la invención permite, al influir particularmente en la disminución de las intensidades de las superficies coloreadas así como al aumentar la extensión superficial de las superficies coloreadas sobre la superficie de ensayo, un dictamen exacto y fiable particularmente de la actividad total cuantitativa de células. Debido al valor significativo cuantitativo mejorado de los resultados de medición puede realizarse una estimación mejorada del llamado estado inmunológico de un paciente. Así se puede determinar particularmente, con ayuda del procedimiento, si los afectados presentan una infección aguda o una infección ya reminiscente o incluso padecen una enfermedad crónica. Con ayuda del procedimiento es posible además determinar la actividad total de enlaces celulares. Otra ventaja resulta del hecho de que el procedimiento según la invención pueda realizarse con concentraciones reducidas de moléculas de captura, particularmente anticuerpos caros.
Ejemplo
Sobre el fondo perforado (diámetro: 20 mm^{2} se añade aprox. 2,5 \mug de un anticuerpo que es conjugado con fosfatasa alcalina. La incubación tiene lugar a 37ºC durante 4 a 12 horas, preferiblemente por la noche. A continuación, los anticuerpos no ligados son lavados del fondo de la placa perforada de una placa de 96 pocillos, encontrándose luego aprox. 1 \mug de anticuerpos en cada fondo perforado. A continuación se pone aprox. 50 \mul de una fracción celular purificada (con ayuda de la centrifugación) sobre el fondo perforado. Esto produce una capa monocapa de aprox. 200.000 células por pocillo. La incubación con una suspensión de antígenos de 50 \mul tiene lugar igualmente a 37ºC durante 18 horas, preferiblemente por la noche. Después de la adición de p-Nitrofenilfosfato se determina la actividad de todas las células sobre la superficie de ensayo con ayuda de la coloración total producida.
Diagnóstico de una tuberculosis latente o aguda
Para detectar el estado inmunológico con presencia de una tuberculosis se hacen en total 8 estimaciones, donde la 1ª solución de estimación corresponde al valor del blanco (ninguna actividad: aprox. 0 a 200 unidades). La 2ª solución de estimación contiene el antígeno de fitolaca, que estimula aprox. el 0,5 a 2% de todas las células T presentes sobre la superficie de ensayo. Una actividad medida de aprox. 100.000 corresponde a la actividad a observar en un paciente que tenga un sistema inmunitario que normalmente funciona bien. Si se mide una actividad inferior a 60.000, el paciente padece una inmunodebilidad. Este pronóstico es especialmente significativo, puesto que muchos pacientes de tuberculosis padecen una supresión inmunológica a consecuencia de la terapia. La 3ª solución de estimación contiene el antígeno de micobacterias. Una actividad medida de hasta 500 indica que el paciente presenta tuberculosis negativa. Por lo demás no es demostrable ninguna protección por una vacunación anterior. Una actividad medida de más de 1.000 indica una tuberculosis en el afectado. La 4ª solución de estimación contiene los antígenos de tuberculosis ESAT6 y CFP10. Una actividad negativa puede significar la no presencia de tuberculosis aguda o latente, donde se deduce una tuberculosis latente de una actividad de hasta aprox. 800 (actividad escasa). Alternativamente puede dictaminarse el resultado también como una tuberculosis ya desaparecida. Por consiguiente es posible diagnosticar formas de tuberculosis latente. Una actividad por encima de 1.000 demuestra por lo contrario una tuberculosis obvia, supuestamente una infección aguda. Las soluciones estimadas 5, 6 y 7 son respectivamente la misma solución que en la solución 4 (las llamadas soluciones de repetición). La solución 8 sirve de valor del blanco u otros controles.
Estado inmunológico para el control de resultados en caso de vacunaciones
Para detectar el estado inmune para un control exitoso en una vacunación se realizan igualmente 8 estimaciones. La solución 1ª corresponde al valor del blanco (ninguna actividad: aprox. 0 a 200 unidades, corresponde a un valor del blanco bueno). La solución 2 contiene antígenos de fitolaca. La solución 3 presenta una mezcla de virus citomegálico, virus de Eppstein-Barr y antígenos de Flue influenza (CEF), que suscita en muchos pacientes una respuesta inmune específica inducida por T_{H-1}, puesto que la mayoría de las personas estaban infectadas ya una vez con al menos uno de los agentes patógenos arriba citados. Una actividad medida de hasta 500 indica que el paciente es negativo con respecto a los patógenos conteniendo CEF y tampoco ha padecido una infección anterior. Una actividad medida superior a 1.000 indica que el sistema inmunitario del afectado ha reaccionado específicamente a al menos uno de los agentes patógenos contenidos en CEV. La 4ª solución de estimación contiene los componentes de la vacuna, donde una actividad negativa justifica un éxito de vacunación fallido. Una actividad medida hasta 800 (actividad escasa) indica un éxito de vacunación solamente escaso, que supuestamente no proporciona ninguna protección eficaz por vacunación. Una actividad medida por encima de 1.000 indica una protección por vacunación. En lo que concierne las soluciones de estimación 5, 6 y 7 se trata de las llamadas soluciones de repetición. La solución de estimación 8 puede servir de valor del blanco u otro control.
Estado inmunológico para la estimación de la funcionalidad de un sistema inmunitario normal
Para detectar el estado inmunológico durante la medición de la funcionalidad normal del sistema inmunitario se efectúan en total 8 estimaciones. La 1ª solución sirve de valor del blanco. La solución 2 contiene el antígeno de fitolaca. La solución 3 puede contener una agrupación de péptidos virulenta, por ejemplo del virus de Eppstein-Barr (EBV) y del virus citomegálico (CMV), donde una actividad medida de más de 1.000 demuestra una activabilidad buena y una actividad medida de menos de 1.000 justifica una respuesta inmunológica débil contra los virus arriba citados. La solución 4 contiene los antígenos completos EBV y CMV (virus enteros), donde una actividad medida de aprox. 800 justifica una respuesta positiva escasa a los virus citados. Una actividad medida de más de 1.000 indica una reacción clara a EBV y CMV. Si se mide en la solución 3 una actividad alta y en la solución 4 sin embargo una actividad solamente débil o incluso una actividad negativa, entonces se puede deducir un defecto inmunológico que afecta la facultad de procesamiento (fagocitosis de antígenos completos, digestión del antígeno completo con respecto a epítopes así como su presentación en la superficie de las llamadas células que presentan antígenos). Esto significa que particularmente la función de las células dendríticas está alterada. La solución 5 contiene antígenos bacterianos, por ejemplo el derivado proteico purificado PPD, tuberculina (Purified Protein Derivative, Tuberkulin) o el toxoide tétano. La solución puede servir de control para la reactividad contra bacterias, donde se debe adoptar un dictamen análogo como en la solución 4. La solución 6 contiene antígenos de hongos, por ejemplo de cándida o aspergillus, y sirve de control del sistema inmunitario sobre la reactividad contra hongos o levaduras. La solución 7 contiene por ejemplo un alérgeno. La solución 8 sirve para medir la actividad celular de las células asesinas naturales NK (Natural Killer), en la que son utilizados los llamados esfingolípidos para la estimulación (solamente estimulan las células NK) o se utilizan anticuerpos activadores de las células NK. Con ayuda de la solución 8 pueden evaluarse las respuestas inmunológicas a células degeneradas.
Estado inmunológico para el pronóstico o control de enfermedades crónicas en el ejemplo de artritis reumatoide
Se efectúan en total 8 soluciones, para determinar el estado inmunológico para la medición de la funcionalidad. La solución 1 corresponde al valor del blanco. La solución 2 contiene el antígeno de fitolaca. La solución 3 presenta una agrupación de péptidos provenientes del virus de Eppstein-Barr y sirve para la verificación de una respuesta inmunológica a los viruses y autoantígenos, donde una actividad medida superior a 1.000 justifica una activabilidad buena y posiblemente una enfermedad autoinmunológica. La solución 4 contiene péptidos EBV que representan autoantígenos, donde una actividad medida por encima de 1.000 justifica una respuesta autoinmunológica unívoca, mientras que una actividad por debajo de 800 indica una respuesta autoinmunológica positiva solamente escasa. Las soluciones 5 y 6 corresponden a las soluciones 3 y 4, pero pueden ser incubadas eventualmente también con otros antígenos. En el caso de la solución 7 se utiliza un antígeno especial, que es individual para el afectado, por ejemplo una proteína de choque térmico. La solución 8 sirve para la medición del antígeno especial CCP (péptido citrulinado cíclico).
Estado inmunológico para la estimación de una enfermedad crónica hacia la eliminación completa del agente patógeno
Se efectúan en total 8 soluciones para detectar el estado inmunológico, donde la solución 1 sirve de valor del blanco. La solución 2 presenta el antígeno de fitolaca. La solución 3 presenta antígenos especiales, por ejemplo antígenos de hepatitis C. Una actividad medida por encima de 1.000 justifica una respuesta unívoca a los antígenos, mientras que una actividad medida por debajo de 800 demuestra solamente una respuesta positiva escasa. La solución 4 corresponde a la solución 3, donde la interleuquina 4 y la interleuquina 5 son medidas como sustancias secretadas y se verifica una respuesta positiva a partir de una actividad medida de aprox. 300. La solución 5 corresponde a la solución 3, donde solamente la interleuquina 10 es medida como sustancia secretada y se puede hablar de una respuesta positiva a partir de una actividad medida de 2.000. Las soluciones 6, 7 y 8 corresponden a las soluciones 3, 4 y 5. En lo que concierne las interleuquinas 4, 5 y 10 se trata de las llamadas citoquinas suprimidas. Si hay más citoquinas en comparación con el interferón gamma, entonces el sistema inmunitario está totalmente suprimido y aumenta el riesgo de una infección crónica.
\vskip1.000000\baselineskip
Documentos citados en la descripción
Esta lista de los documentos citados por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.
Documentos de patente citados en la descripción
\bullet DE 19821289 A1 [0004]
\bullet DE 10352678 A1 [0005]

Claims (7)

1. Procedimiento para determinar la cantidad de sustancias secretadas por células detectables, especialmente para el diagnóstico y/o el seguimiento de la terapia de enfermedades, en el que las sustancias secretadas por las células se hacen visibles sobre al menos una superficie de ensayo de un soporte mediante moléculas de captura con ayuda de superficies coloreadas, de manera que las superficies son descompuestas en puntos individuales y estos últimos son elaborados, caracterizado por el hecho de que se mide cuantitativamente la intensidad de la coloración total sobre la superficie de ensayo, donde la superficie de ensayo es descompuesta en una multitud de puntos individuales, la intensidad de color de cada punto individual es medida por separado y los valores de intensidad medidos son adicionados y la coloración producida por las sustancias secretadas se disminuye en su intensidad por puntos individuales y/o se aumenta su extensión superficial.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que para un enlace de las moléculas de captura al soporte se usa un material de soporte que presenta poca afinidad para las moléculas de captura, donde se usa como material de soporte el poliestireno, difluoruro de polivinilio (PVDF), nitrocelulosa o nylon, preferiblemente el poliestireno.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que en la ocupación del soporte se trabaja con una concentración de moléculas de captura de 2 a 3 \mug/ml, particularmente de aprox. 2,5 \mug/ml.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que se ligan aprox. 1 \mug de moléculas de captura sobre la superficie de ensayo, particularmente sobre el fondo perforado de una placa de 96 pocillos.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que para la visualizar las sustancias secretadas por las células se usan las moléculas de detección además de las moléculas de captura.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que en lo que concierne las sustancias secretadas por las células, éstas son al menos un representante del grupo consistente en interleuquina 2, interleuquina 4, interleuquina 5, interleuquina 10, interferón \gamma y/o TNF\beta (Factor de necrosis tumoral beta), preferiblemente el interferón \gamma.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que en lo que concierne las enfermedades, éstas son tuberculosis, CMV (virus citomegálico), borreliosis, EBV (Virus de Eppstein-Barr), herpes, gripe y/o hepatitis C.
ES06020937T 2005-10-05 2006-10-05 Procedimiento para la determinacion de sustancias eliminadas por celulas detectables. Active ES2327772T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005048577 2005-10-05
DE102005048577A DE102005048577A1 (de) 2005-10-05 2005-10-05 Verfahren zur Bestimmung der Menge von zellulär ausgeschiedenen detektierbaren Stoffen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2327772T3 true ES2327772T3 (es) 2009-11-03

Family

ID=37605701

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06020937T Active ES2327772T3 (es) 2005-10-05 2006-10-05 Procedimiento para la determinacion de sustancias eliminadas por celulas detectables.

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1772734B1 (es)
AT (1) ATE433114T1 (es)
DE (2) DE102005048577A1 (es)
ES (1) ES2327772T3 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102007052517A1 (de) 2007-10-29 2009-04-30 Autoimmun Diagnostika Gmbh ELISPOT-Verfahren mit zwei Filtersystemen
DE102007052518A1 (de) * 2007-10-29 2009-04-30 Autoimmun Diagnostika Gmbh Verfahren zur in vitro-Diagnose und/oder in vitro- Therapieverfolgung von Infektionen

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19821289A1 (de) * 1998-05-13 1999-11-18 Volkmar Schoellhorn Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von menschlichen und tierischen Zellen, insbesondere Blutzellen, und Mikrotiterplatten
WO2003025580A1 (en) * 2001-09-19 2003-03-27 Ingenium Pharmaceuticals Ag Parallel miniaturized quantitative immunoassays
DE10352678A1 (de) * 2003-11-03 2005-06-02 A.I.D. Autoimmun Diagnostika Gmbh Diagnostizierung von Erkrankungen und Prognostizierung von deren Verläufen

Also Published As

Publication number Publication date
EP1772734B1 (de) 2009-06-03
DE102005048577A1 (de) 2007-04-12
EP1772734A1 (de) 2007-04-11
DE502006003870D1 (de) 2009-07-16
ATE433114T1 (de) 2009-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6620130B2 (ja) ハイスループット多重検出用システム、装置及び方法
ES2604978T3 (es) Separación virtual de marcador unido y libre en un ensayo de ligando para realizar inmunoensayos de fluidos biológicos, incluyendo sangre completa
EP1195606A1 (en) Allergen-microarray assay
ES2293444T3 (es) Sistema de test diagnostico para la deteccion de anticuerpos contra infecciones respiratorias agudas y neumonias atipicas.
US11513119B2 (en) Flow cytometry system and methods for the diagnosis of infectious disease
ES2237864T3 (es) Cuantificacion de la actividad de celulas sanguineas utilizando un metodo elispot.
JP4272431B2 (ja) 診断試験法
Espinosa et al. A new optical interferometric-based in vitro detection system for the specific IgE detection in serum of the main peach allergen
WO2018013579A1 (en) Sweat as a biofluid for analysis and disease identification
ES2637200T3 (es) Procedimiento para el diagnóstico in vitro y/o monitorización de terapia in vitro de infecciones
ES2327772T3 (es) Procedimiento para la determinacion de sustancias eliminadas por celulas detectables.
ES2711177T3 (es) Un ensayo serológico rápido y sensible para determinar si los pacientes están infectados por el virus del herpes simple de tipo 1 (VHS-1) y/o de tipo 2 (VHS-2)
AU2004269076B2 (en) Evaluation of adjuvanted vaccines
WO2019101370A1 (en) Method and device for discriminating between viral and bacterial infections
ES2214108B1 (es) Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca.
RU2289138C2 (ru) Способ аллергодиагностики по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов
US20180335432A1 (en) System and Method of Detecting Bacterial Infections
US20240168021A1 (en) Lateral flow test methods
US7867715B2 (en) Method of evaluating the immunological activity of a vaccine
ES2657422T3 (es) Método de diagnóstico para trastornos relacionados con el daño cerebral basado en la detección de NDKA
US20130236915A1 (en) Method of inspecting periodontal disease causing bacteria using outer membrane vesicle and measuring appliance of the same
Sikder et al. Immunoblotting Techniques for Protein Identification and Quantification and Its Application
Shen et al. Using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) for IFN-g detection: A preliminary study
JP2561170B2 (ja) リンパ球の抗原特異的インターロイキンー２反応性の測定法
US20180120330A1 (en) Pre-symptomatic diagnosis of a viral illness