ES2328025T3 - Mejoramiento de las respuestas inmunitarias por anticuerpos agonistas 4-1 bb. - Google Patents

Abstract

(a) Un antígeno para el cual un receptor de célula T es específico; y (b) un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB para uso como un medicamento o una combinación de medicamentos para generar una respuesta inmunitaria mejorada en un individuo.

Description

Mejoramiento de las respuestas inmunitarias por anticuerpos agonistas 4-1BB.

La investigación descrita en esta solicitud estaba apoyada en parte por la subvención R01 CA79915 del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno puede tener ciertos derechos en la invención.

Campo técnico

La invención se relaciona con inmunoregulación, y más particularmente con la regulación de la respuesta de las células T.

Antecedentes

Los linfocitos T de mamífero reconocen péptidos antigénicos enlazados a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) sobre la superficie de células que presentan antígeno (APC). Los péptidos antigénicos se generan por degradación proteolítica de antígenos de proteína dentro de las APC. La interacción de las células T con las APC y la respuesta posterior de las células T están cualitativa y cuantitativamente reguladas por interacciones entre receptores de la superficie de la célula sobre las células T tanto con mediadores solubles como con ligandos sobre la superficie de las APC.

TAKAHASHI, C. y colaboradores, Journal of Immunology, 1999, Vol. 162, No. 9, páginas 5037-5040 describen el uso de un anticuerpo agonista 4-1BB en combinación con enterotoxina estafilococal A (SEA). Por estimulación con SEA se expandirán clonalmente las células T periféricas. Después de la expansión, se presenta una disminución dramática en la frecuencia y en el número absoluto de células T específicas de la SEA. Cuando se inyecta SEA con un mAb agonista específico para 4-1BB en ratones, se incrementa significativamente la expansión clonal de las células T CD4 V\beta3. Además, se inhibió la supresión de células T CD8 expandidas.

Resumen

Los inventores han descubierto que el tratamiento de ratones que sufren de un tumor débilmente inmunogénico con un anticuerpo agonístico específico para 4-1BB de múrido (también conocido como CD137) y un fragmento de péptido de un polipéptido expresado por el tumor resultó en la regresión del tumor. Además, el tratamiento de ratones que padecen un segundo tumor débilmente inmunogénico con el mismo anticuerpo 4-1BB y células dendríticas autólogas "cebadas" in vitro con células del tumor resultaron en la regresión del tumor. Además, los inventores han encontrado que la señalización a través de la superficie de moléculas 4-1BB de la superficie de la célula y suministrando un estímulo inmunogénico (a) se previene la inducción de anergia en células T CD8+ y (b) se revierte la anergia ya establecida en las células T CD8+. De este modo, la invención presenta (a) un antígeno para el cual es específico un receptor de células T tal como un epítopo de péptido asociado con un tumor y (b) un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB para uso como un medicamento o una combinación de medicamentos para generar una respuesta inmune mejorada en un individuo. La invención también presenta un método in vitro para mejorar la respuesta de una célula T en el cual una población de células que contienen una célula T se incuba con (a) un antígeno para el cual es específico un receptor de células T tal como un epítopo de péptido de un microorganismo infeccioso y (b) un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB.

La invención también abarca un método in vitro para activar una célula T, por ejemplo, una célula T CD8+ o una célula T CD4+. Este método implica: (a) proporcionar una muestra de células que contienen una célula T; y (b) cultivar la muestra de células con un antígeno para el cual es específico un receptor de células T y un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB.

Otro aspecto de la invención es un método para prevenir la inducción de anergia o de revertir la anergia en una célula T; el método incluye poner en contacto la célula T con: (a) un antígeno para el cual es específico un recetor de células T; y (b) un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB. El contacto puede ser in vitro. La invención también presenta (a) un antígeno para el cual es específico un receptor de células T y un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB; (b) un ácido nucleico que codifica al antígeno y al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB; (c) al antígeno y a un ácido nucleico que codifica al anticuerpo agonístico para el enlazamiento de 4-1BB; o (d) un ácido nucleico que codifica al antígeno y un ácido nucleico que codifica al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB para uso como un medicamento o una combinación de medicamentos para prevenir la inducción de anergia o reversar la anergia en una célula T en un individuo. El ácido nucleico que codifica al antígeno-y un ácido nucleico que codifica al anticuerpo para enlazamiento de 4-1BB, el ácido nucleico que codifica al antígeno y el ácido nucleico que codifica al anticuerpo para enlazamiento de 4-1BB estando en la misma molécula de ácido nucleico. Además, el ácido nucleico que codifica al antígeno o el agente para enlazamiento de 4-1BB pueden ser transfectados o transducidos entro de una célula, siendo la célula una célula, o una progenie de una célula, que fue obtenida de un mamífero antes de la transfección o de la transducción.

En los métodos de la invención, el anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB puede ser un fragmento funcional del mismo. El antígeno puede ser (a) un antígeno asociado con un tumor (TAA) o (b) un fragmento funcional de un TAA y puede ser un polipéptido. El TAA puede ser una molécula producida por una leucemia, un linfoma, un cáncer neurológico, un melanoma, un cáncer de seno, un cáncer de pulmón, un cáncer de cabeza y de cuello, un cáncer gastrointestinal, un cáncer de hígado, un cáncer pancreático, un cáncer genitourinario, un cáncer de próstata, un cáncer de células renales, un cáncer óseo, o una célula de cáncer vascular. El antígeno puede ser una célula dendrítica que tiene una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con epítopo de péptido enlazado al mismo, siendo el epítopo de péptido un fragmento de un TAA o un fragmento de un polipéptido producido por un microorganismo infeccioso. La molécula del MHC puede ser una molécula clase I del MHC o una molécula clase II del MHC. El antígeno puede ser también una célula híbrida, por ejemplo, un producto de fusión de una célula tumoral y una célula dendrítica. Además, el antígeno puede ser una célula tumoral, un lisado de célula tumoral, un TAA, un epítopo de péptido de un TAA, o una proteína de choque térmico enlazada a un epítopo de péptido de proteína expresada por una célula tumoral. El antígeno puede ser también una célula dendrítica que ha sido incubada con células tumorales, un lisado de células tumorales, un TAA, un epítopo de péptido de un TAA, o una proteína de choque térmico enlazada a epítopo de péptido de proteína expresada por una célula tumoral. Donde el antígeno es o contiene una célula tumoral, una APC, o una célula híbrida, la célula puede ser transfectada o transformada con un ácido nucleico que codifica una citoquina o un factor de crecimiento, por ejemplo, un factor que estimula colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).

Alternativamente, el antígeno puede ser una molécula producida por un microorganismo infeccioso, por ejemplo, un virus tal como un retrovirus, una bacteria, un hongo, o un parásito protozoario.

Como se lo utiliza aquí, se obtiene una "respuesta inmunitaria mejorada" por medio de la administración a un individuo de antígeno para el cual es específico un receptor de células T y un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB. En ausencia de administración de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB, un antígeno apropiado o bien estimula una respuesta no inmunitaria en el individuo o estimula una respuesta inmunitaria en el individuo que puede detectarse como inferior a una respuesta estimulada por medio de la administración del antígeno y de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB.

Como se lo utiliza aquí, una "célula T anérgica" o una "célula T anergizada" es una célula T cuya habilidad para responder a un estímulo inmunogénico, con respecto al menos a una actividad de la célula T, ha sido parcial o completamente inhibida. De este modo, por ejemplo, una célula T anérgica o anergizada puede carecer o tener una menor habilidad para proliferar y producir interleuquina 2 en respuesta a un estímulo inmunogénico, pero su habilidad para producir interferón \gamma en respuesta al estímulo inmunogénico puede estar sustancialmente intacta. Alternativamente, una célula T anérgica o anergizada puede mostrar una carencia o una disminución en todas las actividades funcionales provocada por un estímulo inmunogénico en tal célula T.

Como se lo utiliza aquí, "reversar" la anergia en una célula T significa restablecer total o parcialmente la habilidad de la célula T para llevar a cabo una o más funciones en respuesta a un estímulo inmunogénico.

Como se lo utiliza aquí, "prevenir la inducción de" anergia en una célula T significa inhibir total o parcialmente la inducción de anergia en la célula T.

Como se lo utiliza aquí, un "agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB" es una sustancia que por enlazamiento a una molécula de 4-1BB sobre una célula objetivo (por ejemplo, una célula T) mejora la respuesta de la célula objetivo a un estímulo inmunogénico.

Como se lo utiliza aquí, un "fragmento funcional de un antígeno asociado con un tumor (TAA)" es un fragmento de un TAA más corto que el TAA de longitud completa pero con más del 10% (por ejemplo, más del 10%, más del 20%, más del 30%, más del 40%, más del 50%, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90%, más del 95%, más del 98%, más del 99%, más del 99,5%, o el 100% o más) de la habilidad del TAA de longitud completa para activar una respuesta inmunitaria en presencia o en ausencia de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB. En TAA que son polipéptidos, un TAA de "longitud completa" es el TAA maduro, es decir, que el polipéptido carece de su secuencia nativa de señal.

Como se lo utiliza aquí, un "epítopo de péptido" de un polipéptido es un fragmento de un polipéptido que se enlaza a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y es reconocido en la forma de un complejo con la molécula del MHC por medio de un receptor específico del antígeno sobre una célula T (TCR). Las moléculas del MHC pueden ser moléculas del MHC de clase I o de clase II.

"Polipéptido" y "proteína" son utilizados en forma intercambiable y significan cualquier cadena de aminoácidos que forman péptidos, independientemente de la longitud o de una modificación posterior a la traducción.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que comúnmente entiende alguien normalmente capacitado en el arte a la cual pertenece esta invención. En caso de conflicto, se controlará el presente documento, incluidas las definiciones. Más adelante se describen los métodos preferidos y los materiales, aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí, en la práctica o en la comprobación de la presente invención.

Los materiales, métodos, y ejemplos divulgados aquí son únicamente ilustrativos y no pretenden constituirse en limitantes.

Otras características y ventajas de la invención, por ejemplo, respuestas inmunitarias mejoradas en individuos mamíferos, serán evidentes a partir de la siguiente descripción, a partir de los dibujos y de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1A es un histograma de una citometría de flujo (FFC) que muestra el enlazamiento del mAb 2A (contorno no relleno con línea continua (marcado como "2A") y contorno no relleno con línea punteada (marcada como "2A + 4-1BB")) o un anticuerpo isotipo de control (contorno relleno) con células T de múrido purificadas a través de nylon-lana, estimuladas durante 24 horas con anticuerpos inmovilizados específicos para CD3 y CD28. Las reacciones de coloración fueron llevadas a cabo en ausencia (contorno no relleno con línea continua y contorno relleno) o en presencia (contorno no relleno con línea punteada) de la proteína de fusión 4-1BBlg de múrido.

La Fig. 1B es un histograma de FFC que muestra el enlazamiento del mAb 2A (contorno no relleno (marcado como "2A")), un mAb comercialmente disponible específico para 4-1BB de múrido (contorno no relleno marcado como "1AH2"), o un anticuerpo isotipo de control (contorno relleno) con células de linfoma T de múrido S49.1.

La Fig. 1C es una gráfica lineal que muestra la proliferación ("Incorporación de ^{3}H-TdR") en recuentos por minuto ("cpm x 10^{5}") de células T de múrido purificadas a través de nylon-lana, estimuladas con anticuerpo específico para CD3 de ratón (colocadas sobre el fondo de los pozos de placas para cultivo de tejidos de 96 pozos con una concentración de 0,1 \mug/ml) y ya sea mAb 2A (círculos no rellenos) o IgG de rata (círculos rellenos), cada uno recubriendo el fondo de los pozos de las placas de cultivo para tejido de 96 pozos en las concentraciones indicadas.

La Fig. 2 es una serie de gráficas lineales que muestran el crecimiento de tumores ("Diámetro Promedio del Tumor") de tumores en ratones inyectados en forma subcutánea (s. c.) con células tumorales C3 (paneles de la parte inferior) o células tumorales EL4E7 (paneles de la parte superior) el día 0. Siete días después de la inyección de las células tumorales se inyectaron los ratones ya sea con mAb 2A (paneles de la derecha) o con IgG de rata (paneles e la izquierda). Cada línea representa un solo ratón.

Las Figs. 3A y 3B son gráficas que muestran la actividad citolítica (% de "Lisis") contra las células objetivo indicadas de células efectoras con diferentes proporciones de células efectoras objetivo ("Proporción E:T"). Se inyectaron los ratones en forma s. c. ya sea con 1 x 10^{6} células tumorales C3 (Fig. 3A) o con 4 x 10^{6} células tumorales EL4E7 (Fig. 3B) el día 0. Los ratones fueron inyectados con 100 \mug ya sea de mAb 2A (círculos no rellenos) o con IgG de rata (círculos rellenos) los días 1 y 4. El día se sacrificaron los ratones, se recolectaron los nodos de linfa drenados de los rumores (TDLN), y se estimularon las células obtenidas de los TDLN in vitro durante cuatro días con células C3 irradiadas (Fig. 3A) o con células EL4E7 irradiadas (Fig. 3B). Se reunieron los TDLN de 2-3 ratones en cada grupo. Se analizaron las células recolectadas de los cultivos de estimulación por la actividad citolítica en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr en 4 horas contra células EL4, EL4E7, RMA-S, RMA-S pulsadas con péptido E7 ("RMA-S + E7"), o células objetivo C3.

La Fig. 4A es una serie de histogramas FFC bidimensionales que muestran el enlazamiento con las células (obtenidas a partir de cultivos creados como se describe para la Fig. 3) de mAb específico para CD8 y tetrámeros de moléculas de clase H-2D^{b} enlazadas con el péptido E7 (49-57) ("D^{b}/E7"). Los datos obtenidos con células de ratones inyectados con células C3 se muestran en los dos paneles de la parte superior y los datos obtenidos con las células de ratones inyectados con células EL4E7 se muestran en los dos paneles de la parte inferior. Los ratones fueron inyectados ya sea con mAb 2A (paneles de la izquierda) o con IgG de rata (paneles de la derecha). Los círculos dentro de los histogramas indican el área de acceso para detectar células que enlazan tanto al mAb específico de CD8 como al tetrámero D^{b}/E7.

La Fig. 4B es un gráfico de barras que muestra el número relativo de células (en las poblaciones de células descritas en la Fig. 4A) que enlazan tanto al mAb específico de CD8 como al tetrámero D^{b}/E7 ("% de CD8+/Tetrámero E7^{+}"). Por lo tanto, las células eran de cultivos creados a partir de ratones inyectados con: células C3 e IgG de rata ("C3 + IgG de Rata": histograma de la parte superior izquierda en la Fig. 4A); células C3 y mAb 2A ("C3 + 2A", histograma de la parte superior derecha en la Fig. 4A); células EL4E7 e IgG de rata ("EL4E7 + IgG de Rata"; histograma de la parte inferior izquierda en la Fig. 4A); y células EL4E7 y mAb 2A ("EL4E7 + 2A"; histograma de la parte inferior derecha en la Fig. 4A).

Las Fig. 5A y 5B son gráficas de barras que muestran el número relativo de células que enlazan tanto al mAb específico de CD8 como al tetrámero D^{b}/E7 ("% de CD8+/Tetrámero E7^{+}") en nodos de linfa de ratones tratados de la siguiente manera. Se inmunizaron ratones normales (Fig. 5B) o ratones inyectados en forma s. c. (en un costado) siete días antes con 1 x 10^{3} células C3 (Fig. 5A) por medio de una inyección s. c. en el otro costado con 50 \mug del péptido E7 (49-57) (o el péptido de control Vp2) emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Se inyectaron los ratones inyectados con el péptido Vp2 y algunos de los ratones inyectados con el péptido E7 (49-57) en forma i. p. con 100 \mug del mAb 2A ("Vp2 + 2A" y "E7 + 2A", respectivamente) al día siguiente, y cuatro días después, inmunización. Otros ratones inyectados con el péptido E7 (49-57) fueron inyectados en forma i. p. con 100 \mug de IgG de rata ("E7 + IgG de Rata") al día siguiente, y cuatro días después, inmunización. Siete días después de la inmunización con péptido se sacrificaron los ratones y se removieron los nodos de linfa que drenan el sitio de la inmunización. Se reunieron los nodos de linfa de 2-3 ratones por grupo. Se prepararon suspensiones de células a partir de los nodos de linfa y se determinó el número relativo de células que enlazan tanto CD8 como al tetrámero D^{b}/E7 ("% de CD8+/Tetrámero E7^{+}") como se describió anteriormente para la Fig. 4.

La Fig. 6 es un escaterograma que muestra (en ratones tratados como se describe más adelante) (i) el número de ratones que nunca desarrollaron tumores palpables y (ii) el número de semanas después de la inyección de las células tumorales que habían transcurrido cuando fueron sacrificados los ratones indicados, es decir, cuando los tumores en los ratones alcanzaron un diámetro promedio de 15 mm. Los ratones fueron tratados de la siguiente manera. Todos los ratones fueron inyectados en forma s. c. con 1 x 10^{6} células C3 el día 0. El día 7, se inmunizaron la mitad de los ratones en forma s. c. con el péptido E7 (49-57) y la otra mitad con el péptido de control Vp2 (121-130) emulsionado en IFA. Los días 7 y 10, se inyectaron los ratones en forma i. p. ya sea con 100 \mug de mAb 2A ("2A") o con IgG de rata ("IgG de Rata"). Se evaluó el tamaño del tumor semanalmente para cada ratón y se sacrificaron los ratones cuando el diámetro promedio del tumor alcanzó los 15 mm (círculos sin relleno). Los ratones que padecían de tumores menores a 15 mm de diámetro promedio de tumor al final del experimento (semana 13) están indicados por círculos sin relleno. Los ratones que nunca desarrollaron tumores palpables están indicados por círculos con relleno en la parte superior de la figura.

Las Figs. 7A y 7B son curvas de supervivencia que muestran la supervivencia de ratones ("% de Supervivencia") de ratones tratados de la siguiente manera. Los ratones fueron inyectados en forma intravenosa (i. v.) ya sea con 1 x 10^{6} células TC-1 (Fig. 7A) o con 1 x 10^{5} células B16-F10 el día 0. El día 3, los ratones fueron inyectados en forma s. c. ya sea con péptido OVA de control o (círculos), el péptido E7 (49-57) ("E7") (triángulos en la Fig. 7A), o con el péptido trp-2 (triángulos en la Fig. 7B) (50 \mug del péptido indicado emulsionado en IFA en cada costado). El día 3 y el día 6 se inyectaron los ratones con 100 \mug ya sea del mAb 2A ("2A") o de IgG de rata. Se observaron diariamente los ratones durante el transcurso de todo el experimento. Se combinaron los datos de supervivencia de dos experimentos llevados a cabo en forma idéntica.

La Fig. 8 es una serie de gráficas lineales que muestran el crecimiento de tumores en ratones inyectados en forma s. c. (en un costado) con células tumorales SCCVII el día 0. El día 4, se dividieron los ratones en cuatro grupos (5 ratines por grupo) que fueron tratados de la siguiente manera. Los días 4 y 11, se inyectaron los ratones en los primeros dos grupos en forma s. c. en el otro costado con células dendríticas "cebadas" in vitro con células SCCVII (paneles de la parte inferior). Los días 4, 7, 11 y 14, se inyectaron los ratones en el primer grupo en forma i. p. con 100 \mug de IgG de rata (panel de la parte inferior derecha; "RAT Ig DC/XRT") y se inyectaron los ratones en el segundo grupo en forma i. p. con 100 \mug de mAb 2A (panel de la parte inferior izquierda; "4 1 BB/2A DC/XRT"). Los días 4, 7, 11 y 14 se inyectaron los ratones en el tercero y cuarto grupo con 100 \mug de IgG de rata (panel de la parte superior derecha; "RAT Ig") y 100 \mug de mAb 2A (panel de la parte superior izquierda; "4 1 BB/2A"), respectivamente. Se monitoreó el tamaño del tumor (diámetro promedio; "Tamaño Promedio del Tumor"). Cada línea en las gráficas representa un solo ratón.

La Fig. 9 es una gráfica lineal que muestra la proliferación ("Incorporación de ^{3}H-Thy") en recuentos por minuto ("cpm") de células T humanas purificadas a través de nylon-lana, estimuladas con anticuerpo específico para CD3 humanas (colocadas sobre el fondo de los pozos de placas para cultivo de tejidos de 96 pozos en las concentraciones indicadas) y ya sea mAb 5.9 ("\alpha-h41BB (5.9)"), mAb 5.10 ("\alpha-h41BB (5.10)"), un anticuerpo comercialmente disponible específico para 4-1 BB humana ("\alpha-h41BB"), o IgG de ratón ("mIgG"), cada uno recubriendo el fondo de los pozos de las placas de cultivo para tejido de 96 pozos en una concentración de 10 \mug/ml.

La Fig. 10 es una curva de supervivencia que muestra la supervivencia ("% de Supervivencia") de ratones B6 tratados de la siguiente manera. Los ratones fueron inyectados en forma intravenosa (i. v.) con 5 x 10^{5} células B16-F10 el día 0. Los días 3, 7 y 11 los ratones fueron inyectados en forma s. c. con células irradiadas B16-F10 que expresan GM-CSF recombinante (triángulos), o no fueron tratados (círculos). Los días 4, 7, 10, 12 y 15, se inyectaron los ratones con 100 \mug ya sea del mAb 2A ("2A") (círculos rellenos y triángulos) o con IgG de rata (círculos no rellenos y triángulos). Se observaron diariamente los ratones durante el transcurso de todo el experimento.

La Fig. 11 es una serie de histogramas de FFC mono y bidimensionales que muestran la dispersión delantera de la luz ("FSC") y la proporción relativa de células que expresan CD25 y que expresan CD69 en CD8+, nodo de linfa reunido de tetrámero OVA+ y células T de bazo de ratones C57BL/6 (B6) que habían sido inyectados con células linfoideas de ratón transgénico OT-1 y ya sea un péptido de control (histogramas de la parte superior) o el péptido OVA (histogramas de la parte inferior). Los histogramas de FFC bidimensionales (paneles el lado izquierdo) muestran los números relativos de células que expresan CD8 (eje X) y que expresan al receptor transgénico de células T (TCR) de OT-1 (tetrámero OVA+) (eje Y). Se encerraron las células que expresan CD8 y al TCR transgénico de OT-1 (como se indica por medio del círculo en la parte superior del histograma bidimensional de FFC) y se analizaron las poblaciones encerradas por FSC (mostrado en los primeros histogramas en una sola dimensión de FFC) y las proporciones relativas de células que expresan CD69 (mostrado en los segundos histogramas en una sola dimensión de FFC) y las células que expresan CD25 (mostrado en los terceros histogramas en una sola dimensión de FFC). Los números en los histogramas bidimensionales de FFC indican las proporciones de células que expresan CD8, de células que expresan al TCR transgénico de OT-1 en las células reunidas de bazo y de nodo de linfa de los dos grupos de ratones.

La Fig. 12A es un par de gráficas de barras que muestran el promedio de los números totales (y desviaciones estándar) ("OT-1 Total") de células que expresan al TCR transgénico de OT-1 en células de bazo y de nodo de linfa reunidas de ratones B6 individuales (3 por grupo) que fueron inyectadas con células linfoideas de ratón transgénico OT-1 y o bien la solución salina amortiguada con fosfato (PBS) (panel izquierdo; "Naïve") o el péptido OVA (panel derecho; "Anérgico"), seguido diez días después por un reto ya sea con un péptido de control ("-") o el péptido OVA ("+"). Se sacrificaron los ratones, se removieron los bazos y los nodos de linfa, y se reunieron las suspensiones de células preparadas separadamente a partir de cada ratón dos días después del reto. Se analizaron las células por la expresión del TCR transgénico de OT-1 y CD8 por FFC y se calcularon los números totales de células que expresan al TCR transgénico de OT-1 en las diferentes preparaciones de células.

La Fig. 12B es un par de histogramas de FFC que muestran las proporciones relativas de células que expresan CD69 (panel izquierdo) y CD25 (panel derecho) de los ratones descritos para la Fig. 12A que habían recibido una inyección inicial y habían sido retadas con el péptido OVA. Se muestran las células coloreadas con CD69 o CD25 por medio de contornos no rellenos y aquellas coloreadas con un anticuerpo isotipo de control se muestran por medio de los contornos rellenos.

La Fig. 12C es una gráfica de barras que muestra la cantidad de interferón \gamma (IFN \gamma) (pg por ml por 1.000 células que expresan al TCR transgénico de OT-1) producido (después de cultivar durante 72 horas en presencia del péptido OVA) por las células anérgicas (barra no rellena) y naïve (barra rellena) descritas para la Fig. 12A que habían sido inicialmente inyectadas con PBS ("Naïve") o el péptido OVA ("Anérgico") y luego retadas con el péptido OVA.

La Fig. 13A es una gráfica lineal que muestra el promedio (y las desviaciones estándar) de los números totales de células que expresan al TCR transgénico de OT-1 ("OT-1 Total") en células de bazo y de nodo de linfa reunidas de ratones B6 individuales (3 ratones por grupo) en diferentes momentos ("Tiempo (días)") después de una inyección con células linfoides de ratón transgénico OT-1 y o bien PBS o el péptido OVA ("OVA"). El día de la inyección del péptido OVA (o PBS), y nuevamente tras días después, los ratones fueron inyectados o bien con IgG de rata de control ("IgG de rata") o anticuerpo monoclonal anti-CD137 (mAb) ("2A").

La Fig. 13B es un par de gráficas de barras que muestran la proliferación relativa in vitro (panel izquierdo) y la cantidad de interleuquina 2 (IL-2) (panel derecho) producida in vitro por células de bazo preparadas a partir de ratones individuales B6 (3 ratones por grupo) descritos para la Fig. 13A 10 días después de la inyección con el péptido OVA (o PBS). Se calcularon los números de células que expresan al TCR transgénico de OT-1 en las preparaciones de células de bazo y los datos para la proliferación se expresan como el promedio (y las desviaciones estándar) de los recuentos por minuto (cpm) de la [^{3}H]-Timidina incorporada por 1.000 células que expresan TCR transgénico de OT-1 en los cultivos de ensayo ("\Deltacpm/OT-1 (10^{3})") y los datos para la producción de IL-2 se expresan como los promedios (y las desviaciones estándar) de las cantidades (en pg/ml) de IL-2 producida por célula que expresa TCR transgénico de OT-1 ("IL-2 (pg ml^{-1}/10^{3} de OT-1") en los cultivos de ensayo.

La Fig. 13C es un par de histogramas de FFC que muestran la proporción relativa de células coloreadas con un mAb anti-VLA (contornos no rellenos) o un mAb isotipo de control (contornos rellenos) en células de bazo de los ratones descritos para la Fig. 13A que habían sido inyectados con el péptido OVA después de un reto (diez días después de la inyección inicial con el péptido OVA) con el péptido OVA (panel de la derecha) o un péptido de control.

La Fig. 14A es una gráfica lineal que muestra los promedios (y las desviaciones estándar) de los números totales de células que expresan al TCR transgénico de OT-1 ("células de OT-1/ratón") en células de bazo y de nodo de linfa reunidas de ratones B6 individuales (3 ratones por grupo) que habían sido inyectados con células linfoides de ratón transgénico OT-1 y con el péptido OVA, y diez días después de la inyección del péptido OVA, retados ya sea con el péptido OVA ("OVA") o un péptido de control ("péptido de control") e inyectados ya sea con IgG de rata de control ("IgG de rata") o con anticuerpo monoclonal anti-CD137 (mAb) ("2A"). Los ensayos fueron llevados a cabo en los días indicados después del reto ("Tiempo (día)").

La Fig. 14B es una gráfica de barras que muestra los promedios (y las desviaciones estándar) de los números totales de células que expresan al TCR transgénico de OT-1 ("células de OT-1/ratón") en células de bazo y de nodo de linfa reunidas de ratones B6 individuales (3 ratones por grupo) que habían sido inyectados con células linfoides de ratón transgénico OT-1 y con el péptido OVA, y diez días después de la inyección del péptido OVA, retados con las combinaciones indicadas del péptido OVA ("OVA") o un péptido de control ("péptido de control") e IgG de rata de control o mAb anti-CD137 ("2A"). El ensayo fue llevado a cabo 3 días después de los retos.

La Fig. 14C es un par de histogramas que muestran la proporción relativa de células coloreadas con un mAb anti-CD25 (contornos no rellenos) o un mAb isotipo de control (contornos rellenos) en las células de los ratones descritos para la Fig. 14B que fueron retados con OVA e inyectados ya sea con mAb anti-CD137 ("2A"; panel derecho) o IgG de rata de control ("IgG de rata"; panel izquierdo).

La Fig. 14D es un par de gráficas lineales que muestran la actividad citotóxica ("% de Lisis") de diferentes poblaciones de células contra células objetivo EL4 pulsadas con el péptido OVA (panel izquierdo) y las células objetivo EL4 de control (panel derecho). Los ratones B6 fueron inyectados con células linfoides de ratón transgénico OT-1 y el péptido OVA y diez días después de la inyección del péptido OVA fueron retados con el péptido OVA ("OVA") e inyectados con mAb anti-CD137; cinco días después del reto y de la inyección de mAb se seleccionaron las células que expresan al TCR transgénico de OT-1 por medio de FACS y se las utilizó como células efectoras ("Anérgicas (OVA + 2A)") en los ensayos de citotoxicidad. Se seleccionaron y analizaron también por FACS dos poblaciones de células que expresan TCR transgénico de OT-1 de control. Una población fue de ratones que habían sido tratados en forma idéntica a la primera población descrita excepto porque, en vez de recibir una inyección inicial del péptido OVA, los ratones recibieron una inyección de un péptido de control ("OVA + 2A"). Se obtuvo una segunda población de ratones que habían sido tratados en forma idéntica a la primera población descrita excepto porque, en vez de recibir una inyección inicial del péptido OVA, los ratones recibieron una inyección de un péptido de control, y, en vez de ser inyectados con mAb anti-CD137 al momento del reto con el péptido OVA, los ratones fueron inyectados con IgG de rata de control ("OVA + IgG de rata"). Una población adicional efectora de control consistió de células que expresan TCR transgénico de OT-1 seleccionadas por FACS a partir de nodos de linfa y de bazo de ratones transgénicos no tratados OT-1 TCR ("Naïve").

La Fig. 15A es una serie de gráficas lineales que muestran la incidencia de tumores en ratones DBA/2 después de inmunización ya sea únicamente con adyuvante incompleto de Freund ("IFA") o con IFA y un epítopo del péptido P1A ("P1A") y retados con células tumorales P815R. El día de la inmunización, y nuevamente tres días después se inyectaron ratones inmunizados con péptido P1A ya sea con mAb anti-CD137 ("2A") o con IgG de rata de control ("IgG de rata"). Todos los ratones fueron retados con las células tumorales P815R 10 días después de la inmunización y se observó la incidencia del tumor y la regresión en periodos de tiempo indicados después del reto del tumor ("Días después de la inoculación del tumor").

La Fig. 15B es un par de gráficas lineales que muestran la incidencia de tumores en ratones DBA/2 después de la inmunización con IFA y un epítopo del péptido P1A y del reto con células tumorales P815R. Los ratones fueron inmunizados con IFA y el péptido P1A y fueron retados con las células tumorales P815R 10 días después de la inmunización. Tres días después del reto del tumor, y nuevamente tres días después, se inyectaron los ratones ya sea con mAb anti-CD137 ("2A") o IgG de rata de control ("IgG de rata") y se observó la incidencia del tumor y la regresión en los períodos de tiempo indicados después del reto del tumor ("Días después de la inoculación del tumor").

Descripción detallada

La invención se basa en el hallazgo de que el tratamiento de los ratones que padecen de un tumor débilmente inmunogénico con un anticuerpo agonístico específico para 4-1BB de múrido y un fragmento de péptido de un polipéptido expresado por el tumor resultó en la regresión del tumor. Además, el tratamiento de ratones que padecen de un segundo tumor débilmente inmunogénico r con el mismo anticuerpo 4-1BB y células dendríticas autólogas "cebadas" in vitro con células del tumor resultó en la regresión del tumor. Los inventores también han descubierto que suministrando un estímulo inmunogénico y una señal mediada por 4-1BB a una célula T CD8+ no solamente evita la inducción de anergia en una célula T CD8+, sino que puede revertir también, parcial o completamente, la anergia ya establecida en una célula T CD8+. Estos hallazgos indican que el tratamiento de individuos mamíferos que tienen (o están en riesgo de tener) cáncer o una enfermedad infecciosa con un anticuerpo agonístico específico para 4-1BB y un estímulo inmunogénico específico de célula T específico para el cáncer relevante o el microorganismo infeccioso resultarán en una mejor respuesta inmunitaria para el cáncer o el agente infeccioso. Tal respuesta inmunitaria mejorada será preferiblemente, aunque no necesariamente, profiláctica y/o terapéutica para la enfermedad relevante.

Métodos para Activar una Respuesta Inmunitaria

La invención presenta métodos para activar respuestas inmunitarias en mamíferos en los cuales las células del sistema inmunitario están expuestas a (a) un antígeno para el cual es específico un receptor de una célula T y (b) un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB. La exposición de las células al antígeno puede ocurrir antes, durante o después de la exposición al anticuerpo para enlazamiento de 4-1BB. Las dos exposiciones serán preferiblemente sustancialmente simultáneas.

Las respuestas que se mejoran por medio de los métodos de la invención pueden ser cualquier respuesta inmunitaria. Las respuestas mejoradas son preferiblemente respuestas de células T. Sin embargo, ya que las respuestas que producen anticuerpos de células B dependen generalmente de la actividad auxiliar de células T CD4+ activadas, el mejoramiento de una respuesta de una célula auxiliar de célula T CD4+ puede resultar indirectamente en el mejoramiento de una respuesta de un anticuerpo de célula B. En forma similar, las actividades de otras células del sistema inmunitario (por ejemplo, monocitos/macrófagos, granulocitos (por ejemplo, neutrófilos), y células asesinas naturales) son reguladas por células T. Por lo tanto, se pueden utilizar los métodos de la invención para mejorar las respuestas de cualquiera o de todos estos tipos de células.

La invención también proporciona métodos para prevenir la inducción de anergia en células r o reversar la anergia en células T que ya se han tornado anérgicas. En estos métodos se ponen en contacto las células T relevantes con un antígeno para el cual es específico un receptor de células T y un anticuerpo para enlazamiento de 4-1BB. El contacto de las células T con el antígeno puede ocurrir antes, durante, o después del contacto de las células T con el agente de enlazamiento de 4-1BB.

Como se lo utiliza aquí, "un estímulo inmunogénico" es un estímulo suministrado a una célula T a través del receptor de la célula T específica del antígeno (TCR) expresado sobre la superficie de la célula T. Más comúnmente, pero no necesariamente, tal estímulo es suministrado en la forma de un antígeno para el cual es específico el TCR. Aunque tales antígenos serán generalmente proteína, también pueden ser carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o moléculas híbridas que tienen componentes de dos o más de estos tipos de moléculas, por ejemplo, glicoproteínas o lipoproteínas. Sin embargo, se puede suministrar también el estímulo inmunogénico por medio de otros ligandos agonísticos del TCR tal como anticuerpos específicos para componentes del TCR (por ejemplo, cadena \alpha del TCR o regiones variables de la cadena \beta) o anticuerpos específicos para el complejo CD3 asociado con el TCR. Estímulos inmunogénicos (como se los utiliza aquí) no incluyen estímulos no específicos de antígeno suministrados, por ejemplo, por citoquinas (por ejemplo, interleuquina 12), factores de crecimiento, moléculas coestimuladoras, o moléculas de adhesión. Aunque tales estímulos pueden ser explotados en los métodos de la invención, no constituyen el estímulo inmunogénico requerido. Los antígenos útiles como estímulos inmunogénicos incluyen aloantígenos (por ejemplo, un aloantígeno de MHC), por ejemplo, sobre una célula que presenta antígeno (APC) (por ejemplo, una célula dendrítica (DC), un macrófago, un monocito, o una célula B). DC de interés son DC de interdigitación y no DC folicular, DC folicular presenta antígeno para células B. Por conveniencia, las DC de interdigitación son denominadas aquí como DC. Los métodos para aislar DC de tejidos tales como sangre, médula ósea, bazo, o nodo linfático son conocidos en el arte, ya que son métodos para generarlas in vitro a partir de células precursoras en tales tejidos. También son útiles como estímulos inmunogénicos antígenos de polipéptido y epítopos de péptido derivados de ellos. Polipéptidos no procesados son procesados por APC en epítopos de péptido que son presentados como células T sensibles en la forma de completos moleculares con moléculas MHC sobre la superficie de las APC. Los estímulos inmunogénicos útiles también incluyen una fuente de antígeno tal como un lisado ya sea de células tumorales o de células infectadas con un microorganismo infeccioso de interés. APC (por ejemplo, DC) pre expuestas (por ejemplo, por medio de cocultivo) a péptidos antigénicos, epítopos peptídicos de tales polipéptidos o lisados de tumor (o células infectadas) también pueden ser utilizadas como estímulos inmunogénicos. Tales APC también pueden ser "cebadas" con antígeno por medio de cultivo con una célula cancerosa o una célula infectada de interés; las células cancerosas o infectadas pueden opcionalmente ser irradiadas o calentadas (por ejemplo, hervidas) antes del cultivo de cebado. Además, las APC (especialmente DC) pueden ser "cebadas" ya sea con ARN total, ARNm, o ARN aislado que codifica TAA.

Alternativamente, se puede proporcionar un estímulo inmunogénico en la forma de células (por ejemplo, células tumorales o células infectadas que producen el antígeno de interés). Además, se pueden proporcionar estímulos inmunogénicos en la forma de híbridos celulares formados por fusión de APC (por ejemplo, DC) con células tumorales [Gong y colaboradores (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(6): 2716-2718; Gong y colaboradores (1997) Nature Medicine 3(5): 558-561; Gong y colaboradores (2000) J. Immunol. 165(3): 1705-1711] o células infectadas de interés. Los métodos para fusionar células (por ejemplo, por medio de polietilén glicol, de glicoproteínas de membrana fusogénica viral, o electrofusión) son conocidos en el arte. En la discusión de estos híbridos celulares, las parejas de células tumorales o infectadas serán denominadas como las células inmunogénicas (IC). Las células o los híbridos celulares pueden ser utilizados (como estímulos inmunogénicos) no tratados o pueden ser metabólicamente inhibidos (por ejemplo, por irradiación o exposición a una droga tal como mitomicina C) a fin de reducir su habilidad para dividirse. Las células tumorales o infectadas utilizadas por si mismas como estímulo inmunogénico o como IC para la producción de híbridos celulares se derivarán, preferiblemente, pero no necesariamente, del mismo donante que aquel de la célula T. Cuando las células son de un donante diferente, preferiblemente compartirán un haplotipo del MHC con la célula T. Las APC utilizadas para formar híbridos celulares se derivarán también preferiblemente, pero no necesariamente, del mismo donante que la célula T. En la producción de híbridos celulares, se formarán preferiblemente o bien las APC o las IC, o MHC compatibles con el donante de la célula T. Alternativamente, las APC y/o las IC pueden compartir un haplotipo de MHC (es decir, ser semialogénicas) con el donante de la célula T. Sin embargo, ya que las células o los híbridos utilizados como estímulos inmunogénicos serán utilizados frecuentemente en presencia de APC del donante de células T (por ejemplo, en aplicaciones in vivo), pueden ser MHC completamente incompatibles con la célula T.

También son útiles como estímulos inmunogénicos proteína de choque térmico enlazadas a epítopos antigénicos de péptido derivados de antígenos (por ejemplo, antígenos asociados con tumores o antígenos producidos por microorganismos infecciosos) [Srivastava (2000) Nature Immunology 1(5): 363-366]. Tales complejos de proteína de choque térmico y péptido antigénico son útiles para facilitar o mejorar la absorción de péptidos antigénicos por APC. Las proteínas de choque térmico de interés incluyen, sin limitación, glicoproteína 96 (gp96), proteína de choque térmico (hsp) 90, hsp70, hsp110, proteína regulada por glucosa 170 (grp 170) y calreticulina. Los estímulos inmunogénicos pueden incluir una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o más) proteínas de choque térmico aisladas de células tumorales o de células infectadas. Tales células infectadas o tumorales son preferiblemente, pero no necesariamente, del mismo individuo (i) cuya respuesta inmunitaria va a ser mejorada por un método de la invención o (ii) de quien se obtuvieron las células T (cuya respuesta va a ser mejorada por medio de un método de la invención). Las células infectadas o tumorales se pueden obtener también, por ejemplo, de otro individuo que tiene el mismo o un tipo de tumor relacionado o infección que el del primer individuo. Alternativamente, se puede aislara la proteína de choque térmico a partir de células de mamífero que expresan un transcriptosoma preparado a partir de células tumorales o de células infectadas de interés.

Los estímulos inmunogénicos se pueden derivar a partir de un amplio rango de microorganismos infecciosos (por ejemplo, bacterias, hongos incluidas levaduras, virus, y parásitos tales como parásitos protozoarios). Los ejemplos de microorganismos relevantes incluyen, sin limitación, Mycobacteria tuberculosis, Salmonella enteriditis, Listeria monocytogenes, M. leprae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Borrelia burgdorferi, Actinobacillus pleuropneumoniae, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Yersinia enterocolitica, Bordetella pertussis, Porphyromonas gingivalis, micoplasma, Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans, Chlamydia trachomatis, Candida albicans, Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica, Toxoplasma brucei, Toxoplasma gondii, Leishmania major, virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 y 2, virus de la influenza, virus del sarampión, virus de la rabia, virus de la hepatitis A, B, y C, rotavirus, virus de papiloma, virus sincitial respiratorio, virus de inmunodeficiencia felina, virus de leucemia felina, y virus de inmunodeficiencia simia. Los ejemplos de proteínas microbianas relevantes incluyen, sin limitación, a la subunidad B de la enterotoxina inestable al calor de E. coli [Konieczny y colaboradores (2000) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 27(4): 321-332], proteínas de choque térmico, por ejemplo, la proteína de choque térmico de Y. enterocolitica 60 [Konieczny y colaboradores (2000), ver más arriba; Mertz y colaboradores (2000) J. Immunol. 164(3): 1529-1537] y proteínas de choque térmico de M. tuberculosis hsp60 y hsp 70, la proteína de la membrana exterior de Chlamydia trachomatis [Ortiz y colaboradores (2000) Infect. Immun. 68(3): 1719-1723], la proteína de la superficie exterior de B. burgdorferi [Chen y colaboradores (1999) Arthritis Rheum. 42 (9): 1813-1823], la GP63 de L. major [White y colaboradores (1999) Vaccine 17(17): 2150-2161 (y la errata publicada en Vaccine 17 (20-21): 2755)], la proteína PorB de serotipo meningocócica 15 de N. meningitidis [Delvig y colaboradores (1997) Clin. Immunol. Immunopathol. 85(2); 134-142], la proteína fimbrial 381 de P. gingivalis [Ogawa, (1994) J. Med. Microbiol. 41(5): 349-358], la proteína F de la membrana exterior de E. coli [Williams y colaboradores (2000) Infect. Immun. 68(5): 2535-2545], hemaglutininas y neuraminidasas del virus de la influenza, glucoproteínas de superficie retroviral (por ejemplo, VIH) (por ejemplo, VIH gp160/120), o proteínas gag o tat retrovirales. CTL son en virtud de su habilidad para matar células objetivo infectadas con cualquiera de una gran variedad de patógenos intracelulares (por ejemplo, virus, o bacterias intracelulares y protozoarios) mediadores potentes de inmunidad para tales patógenos. Por lo tanto, ya que los métodos de la invención son eficientes para mejorar las respuestas de CTL, pueden ser utilizados para profilaxis y/o terapia en infecciones con tales patógenos intracelulares. Además, las células T auxiliares liberan una gran variedad de citoquinas que median respuestas inflamatorias destructoras de
patógenos.

Como se indicó anteriormente, los estímulos inmunogénicos útiles en la invención pueden cualquiera entre una gran variedad de células tumorales, APC "cebadas" con células tumorales, células híbridas (ver más arriba), antígenos asociados con el tumor (TAA), epítopos de péptido de tales TAA, y APC "cebadas" con TAA o epítopos de péptido de ellos. Como se lo utiliza aquí, un "TAA" es una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) que se expresa por medio de una célula tumoral y o bien (a) difiere cualitativamente de su contraparte expresada en células normales, o (b) se expresa en un mayor nivel en células tumorales que en células normales. Por lo tanto, un TAA puede diferir (por ejemplo, en uno o más residuos aminoácidos cuando la molécula es una proteína) de, o puede ser idéntica a, su contraparte expresada en células normales. Preferiblemente no es expresada por células normales. Alternativamente, se expresa en un nivel al menos dos veces superior (por ejemplo, dos veces, tres veces, cinco veces, diez veces, 20 veces, 40 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 5000 veces, ó 15.000 veces superior) en una célula tumoral que en contrapartes normales de células tumorales. Los ejemplos de tumores relevantes que pueden ser utilizados por si mismos o como una fuente de antígeno (ver más arriba) incluyen, sin limitación, cánceres hematológicos tales como leucemias y linfomas, tumores neurológicos tales como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de seno, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales tales como cáncer gástrico o de colon, cáncer de hígado, cáncer de células renales, cáncer pancreático, tumores genitourinarios tales como cáncer de ovario, cáncer vaginal, cáncer de vejiga, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer de pene, tumores óseos, y tumores vasculares. Los TAA relevantes incluyen, sin limitación, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico prostático (PSA), MAGE (antígeno de melanoma) 1-4, 6 y 12, MUC (mucina) (por ejemplo, MUC-1, MUC-2, etc.), tirosinasa, MART (antígeno de melanoma), Pmel 17 (gp100), secuencia V del intrón GnT-V (secuencia V del intrón N-acetilglucoaminiltransferasa V), psm Ca de Próstata, PRAME (antígeno de melanoma), \beta-catenina, MUM-1-B (producto génico mutado ubicuo de melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) 1, BAGE (antígeno de melanoma) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear del Virus de Epstein-Barr) 1-6, gp75, virus de papiloma humano (HPV) E6 y E7, p53, proteína de resistencia en pulmón (LRP) Bcl-2, y Ki-67. Tanto CTL como células T auxiliares han mostrado ser efectores eficientes de inmunidad tumoral.

Cuando se administran agentes patógenos a individuos (por ejemplo, células tumorales, microorganismos infecciosos, o células infectadas con agentes infecciosos) con el propósito de analizar la eficacia del tratamiento con un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB (opcionalmente suministrado con uno o más agentes no específicos tales como citoquinas (ver más arriba)), los agentes patógenos no constituyen por si mismos un estímulo inmunogénico para los propósitos de la invención. Además, en un procedimiento que involucra la administración de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB (y opcionalmente uno o más agentes no específicos tales como citoquinas (ver más arriba)) a un individuo que hospeda agentes patógenos (por ejemplo, células tumorales, microorganismos infecciosos, o células infectadas con agentes infecciosos) adquiridos, por ejemplo, por transformación de una o más células en el individuo o por infección natural, los agentes patógenos hospedados no constituyen por sí mismos un estímulo inmunogénico para los propósitos de la invención.

El agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB puede ser un anticuerpo específico para 4-1BB. Como se lo utiliza aquí, el término "anticuerpo" se refiere no solamente a moléculas completas de anticuerpo, sino también a fragmentos para enlazamiento de antígeno, por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, Fv, y fragmentos individuales de cadena Fv. También están incluidos anticuerpos quiméricos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal (mAb), por ejemplo, el mAb 2A o los mAb 5.9 y 5.10 descritos más adelante. Alternativamente, el agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB puede ser el ligando natural 4-1BB (4-1BBL) o un fragmento funcional de 4-1BB. Como se lo utiliza aquí, un fragmento funcional de 4-1BB significa un fragmento de 4-1BB que es más corto que un 4-1BBL maduro de longitud completa y tiene al menos 10% (por ejemplo, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, ó 100% o más) de la habilidad del 4-1 BBL maduro de longitud completa para mejorar la respuesta de una célula T al antígeno de interés. Methods of testing and comparing the ability of molecules to enhance the response of T cells are known to investigators in the field, e.g., methods (or simple modifications of those) described in the Examples. While it is believed that 4-1BB-binding agents (e.g., antibodies) that bind to a domain of 4-1BB that is identical or overlapping with a domain to which 4-1BBL binds are not agonistic, the invention is not limited by any particular mechanism of action. Methods to test for agonistic activity in a candidate 4-1BB-binding agent would be essentially the same as those referred to above for testing the ability of a fragment of 4-1BBL for its ability to enhance the response of T cell to an immunogenic stimulus and thus well-known to those in the art.

Los agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB pueden ser añadidos a la solución (por ejemplo, sangre o medio de cultivo) que contiene la célula T. Alternativamente, pueden ser secretados por o expresados sobre la superficie de una célula en la vecindad de la célula T, por ejemplo, una APC que presenta un aloantígeno o un epítopo de péptido enlazado a una molécula MHC sobre la superficie de las APC. Tales células pueden ser también células tumorales, células infectadas, o los híbridos de las células descritas anteriormente. Cuando el agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB es secretado por o enlazado a la superficie de una célula, la célula puede ser, pero no necesariamente es, la misma célula que presenta un aloantígeno o un epítopo de péptido enlazado a una molécula MHC con la célula T. Los métodos de la invención requieren la provisión de una fuente exógena del agente para enlazamiento de 4-1BB. Se entiende que cuando el agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB utilizado en los métodos de la invención es uno secretado por o expresado sobre la superficie de una célula tal como una APC, célula tumoral, célula infectada, o célula híbrida, no será un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB (por ejemplo, 4-1BBL) naturalmente expresado por tales células. Cuando la única fuente de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB es aquella sobre la superficie de, o secretada por una APC, el agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB será codificado por una molécula recombinante de ácido nucleico que codifica para 4-1BB en la APC. Además, la administración fortuita a un individuo de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB presente, por ejemplo, en sangre, plasma, o suero administrado al individuo, por ejemplo, para propósitos terapéuticos, no constituye por si misma administración de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB para propósitos de la invención. Además, la presencia fortuita de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB en un medio de cultivo utilizado para cultivos de activación de células inmunes (por ejemplo, células T) no constituye por si mismo al agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB que se requiere que esté presente en los métodos in vitro para activación de células T de la invención.

Si la activación es in vitro, se puede enlazar el agente para enlazamiento de 4-1BB al fondo de un recipiente para cultivo relevante, por ejemplo, una pared de una placa plástica de microtitulación.

El agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB preferiblemente, pero no necesariamente, se enlazará a 4-1BB sobre la superficie de una célula T cuya respuesta se mejora por medio de los métodos de la invención. Sin embargo, 4-1BB se expresa sobre células diferentes a las células T, por ejemplo, células asesinas naturales (NK) y monocitos [Melero y colaboradores (1998) Cell. Immunol. 190: 167-172; Kienzle y colaboradores (2000) Int. Immunol. 12: 73-82]. De este modo, por medio del enlazamiento con tales células diferentes a las células T y provocando por lo tanto, por ejemplo, que ellas secreten citoquinas auxiliares o expresen sobre su superficie moléculas coestimuladoras y/o moléculas de adhesión, se puede mejorar la respuesta de la célula T o la respuesta de una célula espectadora (por ejemplo, una respuesta de un anticuerpo de una célula B) que es "auxiliada" por la célula T. En forma similar, el enlazamiento de un agente para el enlazamiento de 4-1BB con una célula T CD4+ puede vencer la anergia en una célula T CD4+ espectadora o en una célula T CD8+ que está expuesta también a un estímulo inmunogénico, por ejemplo, por medio de la acción de citoquinas producidas por la célula T CD4+ a las cuales se enlaza el agente para enlazamiento de 4-1BB. En forma análoga, el enlazamiento de un agente para enlazamiento de 4-1BB con una célula T CD8+ podría vencer la anergia en una célula T CD8+ espectadora o en una célula T CD4+ expuesta a un estímulo inmunogénico.

Las secuencias cortas de aminoácidos pueden actuar como señales para dirigir proteínas (por ejemplo, estímulos inmunogénicos o agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB) a compartimientos intracelulares específicos. Por ejemplo, se encuentran péptidos señal hidrófobos (por ejemplo, MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA (SEQ ID NO: 1)) en el terminal amino de proteínas destinadas para la ER. Aunque se sabe que la secuencia KFERQ (SEQ ID NO: 2) (y otras secuencias muy relacionadas) destina polipéptidos intracelulares a lisosomas, otras secuencias (por ejemplo, MDDQRDLISNNEQLP (SEQ ID NO: 3) destinan polipéptidos a endosomas. Además, la secuencia del péptido KDEL (SEQ ID NO: 4) ha mostrado que actúa como una señal de retención para la ER. Cada uno de estos péptidos señal, o una combinación de los mismos, puede ser utilizado para transportar, por ejemplo el estímulo inmunogénico o los agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB hasta compartimientos celulares apropiados. Otras secuencias señal de interés incluyen al dominio de transducción HIV_{tat} (RKKRRQRR; SEQ ID NO: 5), al homeodominio Antennapedia (RQIKIWFPNRRMKWKK; SEQ ID NO: 6) y a las secuencias señal derivadas del factor de crecimiento de fibroblastos [Lin y colaboradores (1995) J. Biol. Chem. 220: 14255-14258], transportan [Pooga y colaboradores (1998) FASEB J. 12: 67-77], y la proteína estructural de HSV-1 VP22 [Elliott y colaboradores (1997) Cell 88: 223-233]. Se pueden utilizar también secuencias de poliarginina (de 7 a 15 residuos de arginina) como dominios de translocación de membrana. Se pueden generar los ADN que codifican a los polipéptidos que contienen señales de orientación por medio de PCR u otras técnicas estándar de síntesis o de ingeniería genética.

Los estímulos de células T inmunogénicas y los agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB pueden tener las de aminoácidos de moléculas naturales o pueden tener sustituciones. Tales sustituciones serán preferiblemente sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras típicamente incluirán sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina, valina, isoleucina, y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina, y treonina; lisina, histidina, y arginina; y fenilamina y tirosina.

Los polipéptidos útiles para la invención también incluyen a aquellos descritos anteriormente, pero modificados para uso in vivo por medio de la adición, en los extremos amino y/o carboxi terminales, de un agente de bloqueo para facilitar la supervivencia del polipéptido relevante in vivo. Esto puede ser útil en aquellas situaciones en las cuales los terminales del péptido tienden a ser degradados por proteasas antes de la absorción celular. Tales agentes de bloqueo pueden incluir, sin limitación, secuencias adicionales de péptidos relacionadas o no relacionadas que pueden estar unidas a los residuos amino y/o carboxi terminales del péptido que va a ser administrado. Esto puede ser hecho ya sea químicamente durante la síntesis del péptido o por tecnología de ADN recombinante por medio de métodos familiares para aquellos capacitados en el arte.

Alternativamente, se pueden unir agentes de bloqueo tales como ácido poliglutámico u otras moléculas conocidas en el arte, a los residuos amino y/o carboxi terminales, o se pueden reemplazar el grupo amino en el terminal amino o el grupo carboxilo en el terminal carboxilo con una fracción diferente. Asimismo, los compuestos peptídicos pueden estar acoplados en forma covalente o en forma no covalente a proteínas "portadoras" farmacéuticamente aceptables antes de la administración.

También son de interés los compuestos peptidomiméticos que se diseñan con base en las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de interés. Los compuestos peptidomiméticos son compuestos sintéticos que tienen una conformación tridimensional (es decir, un "motivo de péptido") que es sustancialmente igual a la conformación tridimensional de un péptido seleccionado. El motivo del péptido le proporciona al compuesto peptidomimético la habilidad para activar una respuesta inmunitaria (en el caso de estímulos inmunogénicos) y mejora una respuesta inmune (en el caso de los agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB). Los compuestos peptidomiméticos pueden tener características adicionales que mejoran su utilidad in vivo, tal como una mayor permeabilidad celular y una vida media biológica prolongada.

Los peptidomiméticos tienen típicamente una columna vertebral que es parcial o completamente no peptídica, pero con grupos secundarios que son idénticos a los grupos secundarios de los residuos aminoácidos que se presentan en el péptido sobre el cual se basa el peptidomimético. Se conocen en el arte diferentes tipos de enlaces químicos, por ejemplo, éster, tioéster, tioamida, retroamida, carbonilo reducido, enlaces dimetileno y cetometileno por ser sustitutos generalmente útiles para enlaces peptídicos en la construcción de peptidomiméticos resistentes a la proteasa.

Las moléculas útiles como estímulos inmunogénicos y agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB pueden ser producidas por medio de cualquiera de un amplio rango de métodos conocidos en el arte. Se pueden purificar a partir de fuentes naturales (por ejemplo, a partir de cualquiera de los agentes patógenos enlistados aquí). Los péptidos más pequeños (con una longitud menor a 100 aminoácidos) y otras moléculas no proteínicas pueden ser convenientemente sintetizadas por medios químicos estándar conocidos por aquellos capacitados en el arte. Además, se pueden fabricar tanto polipéptidos como péptidos por medio de técnicas estándar de ADN recombinante in vitro y de transgénesis in vivo utilizando secuencias de nucleótidos que codifican a los péptidos o polipéptidos apropiados (ver la sección de Ácidos Nucleicos más adelante). Se pueden utilizar métodos conocidos por aquellos capacitados en el arte para construir vectores de expresión que contienen secuencias de codificación relevantes y elementos reguladores apropiados de transcripción/traducción. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) [Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989], y Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology [Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989].

Los elementos reguladores de transcripción/traducción mencionados anteriormente incluyen, pero no se limitan a promotores inducibles y no inducibles, reforzadores, operadores y otros elementos que son conocidos por aquellos capacitados en el arte y que dirigen o bien regulan la expresión génica. Tales elementos reguladores incluyen, pero no se limitan al gen temprano inmediato hCMV de citomegalovirus, a los promotores temprano o tardío del adenovirus SV40, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el operador principal y las regiones promotoras del fago A, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de ácido fosfatasa, y los promotores de los factores de apareamiento \alpha de levadura.

Los sistemas de expresión que pueden ser utilizados para propósitos de la invención incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con ADN recombinante de bacteriófago, ADN de plásmido, o vectores de expresión con ADN de cósmido que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican estímulos inmunogénicos o agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB, levadura (por ejemplo, Saccharomyces y Pichia) transformada con vectores de expresión recombinante de levadura que contienen un ácido nucleico que codifica estímulos inmunogénicos o agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen un ácido nucleico que codifica estímulos inmunogénicos o agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB; sistemas celulares de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o virus del mosaico del tabaco (TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica estímulos inmunogénicos o agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38, y NIH 3T3) que hospedan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneina) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus y el promotor 7.5K del virus de vaccinia). También son útiles como células huésped, células primarias o secundarias obtenidas directamente de un mamífero y transfectadas con un vector plásmido o infectado con un vector viral.

Las células transfectadas o transducidas con los vectores de expresión de la invención pueden ser utilizadas luego, por ejemplo, para fabricación in vitro en pequeña o gran escala de un estímulo inmunogénico o de un agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB por medio de métodos conocidos en el arte. En esencia, tales métodos involucran el cultivo de las células bajo condiciones que maximizan la producción del polipéptido y el aislamiento del polipéptido de las células o del medio de cultivo.

Para los métodos de la invención, se requiere a menudo que los estímulos inmunogénicos y/o los agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB sean purificados. Los métodos para purificar macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas) son conocidos en el arte. El grado de pureza de las macromoléculas se puede medir por medio de cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía de columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis por HPLC.

Una célula T cuya respuesta es mejorada, cuya anergia es revertida, o en la cual se evita la inducción de anergia por medio de los métodos de la invención puede ser una célula T CD4+ o una célula T CD8+. La invención no está limitada por: (a) la célula T que tiene cualquier fenotipo particular (por ejemplo, CD4+ o CD8+) o función (por ejemplo, citotoxicidad, actividad auxiliar, actividad de desviación inmunitaria, o actividad supresora); o (b) siendo las moléculas MHC por medio de las cuales se restringe la célula T, de cualquier clase particular. Aunque la mayoría de las células T con actividad citotóxica son CD8+ y reconocen epítopos de péptido enlazados a moléculas MHC de clase I, se conocen en al arte CTL CD4+ que reconocen péptidos antigénicos enlazados a moléculas MHC de clase II . También han sido descritas CTL CD4+ que reconocen péptidos enlazados a moléculas MHC de clase I y CTL CD8+ que reconocen péptidos antigénicos enlazados a moléculas MHC de clase II. Además, aunque la mayoría de las células T con actividad de desviación inmunitaria y/o auxiliar son células T CD4+ y reconocen péptidos antigénicos enlazados a moléculas MHC de clase II, estas actividades también han sido ayudadas en células T CD8+ restringidas a MHC de clase I. En forma similar, aunque la mayoría de las células T inmunosupresoras son células T CD8+, también se han demostrado células T CD4+ con actividad inmunosupresora. Los métodos de la invención son aplicables a todas estas células T. Las respuestas preferidas serán aquellas de células T CD4+ de desviación inmunitaria /auxiliares restringidas a MHC de clase II y a CLT restringidas a MHC de clase I. Las respuestas de CLT restringidas a MHC de clase I son particularmente preferidas.

Los métodos de la invención se pueden llevar a cabo in vitro.

Métodos in vitro

Las aplicaciones in vitro pueden ser útiles, por ejemplo, en estudios científicos básicos de mecanismos inmunitarios o para producción de células T activadas para uso ya sea en estudios sobre la función de las células T o, por ejemplo, en inmunoterapia pasiva. Además, se puede añadir un agente para enlazamiento de 4-1BB para ensayos in vitro (por ejemplo, en ensayos de proliferación de células T) diseñados para analizar la inmunidad a un antígeno de interés en un individuo del cual se obtuvieron las células T. Además de un agente para enlazamiento de 4-1BB para tales ensayos, se esperaría que resultara en una respuesta más potente, y por lo tanto más fácilmente detectable, in vitro. Sin embargo, los métodos de la invención serán preferiblemente ex vivo (ver más adelante).

En los métodos in vitro de la invención, se cultivan células linfoideas (que consisten de o que incluyen células T) obtenidas a partir de un individuo mamífero con cualquiera de los estímulos inmunogénicos y agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB descritos anteriormente. Las células linfoideas pueden ser de un individuo previamente expuesto a un antígeno relevante (en cualquiera de las formas descritas anteriormente); alternativamente, el donante de las células linfoideas necesita no haber sido expuesto al antígeno. Los cultivos pueden ser suplementados también con una o más citoquinas o factores de crecimiento tales como, sin limitación, interleuquina (IL-)1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, I-15, interferón \gamma (IFN-\gamma), factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), o factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). Los cultivos pueden ser "estimulados de nuevo" tan a menudo como sea necesario. Los cultivos pueden ser estimulados también en diferentes momentos para determinar si se ha logrado el nivel deseado de inmunoreactividad (por ejemplo, actividad de células T auxiliares o CTL).

Métodos Ex Vivo

En una aproximación ex vivo, se aíslan células linfoideas, incluidas células T (células T CD4+ y/o CD8+), de un individuo y se las expone a uno o más estímulos inmunogénicos y a uno o más anticuerpos agonísticos para enlazamiento de 4-1BB in vitro (ver más arriba). Tales células T pueden ser, por ejemplo, células T anérgicas en las cuales se desea reversar la anergia. Las células linfoideas pueden ser expuestas una vez o múltiples veces (por ejemplo, 2, 3, 4, 6, 8 ó 10 veces). El nivel de actividad inmunitaria (por ejemplo, actividad de CTL) en las células linfoideas se puede analizar después de una o más exposiciones. Una vez se logren la actividad deseada y el nivel de esa actividad, se introducen nuevamente las células en el individuo (o en otro individuo) a través de cualquiera de las rutas enlistadas aquí. La eficacia terapéutica o profiláctica de esta aproximación ex vivo depende de la habilidad de los linfocitos activados ex vivo para ejercer, directa o indirectamente, un efecto neutralizador o citotóxico, por ejemplo, sobre microorganismos infecciosos, células huésped infectadas con microorganismos, o células tumorales.

Una estrategia alternativa ex vivo puede involucrar transfectar o transducir células obtenidas de un individuo con uno o más polinucleótidos que codifican uno o más estímulos inmunogénicos específicos para células T y uno o más anticuerpos agonísticos para enlazamiento de 4-1BB. Las células transfectadas o transducidas son luego retornadas al individuo o a otro individuo. Aunque tales células serían preferiblemente células hemopoyéticas (por ejemplo, células de médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, o células B) podrían ser también cualquiera de una gran variedad de tipos incluyendo, sin limitación, fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, o células de musculo en las cuales actúan como una fuente de dichos uno o más estímulos inmunogénicos y uno o más agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB durante el tiempo que ellas sobrevivan en el individuo. El uso de células hemopoyéticas, que incluyen las APC anteriores, sería particularmente conveniente porque se esperaría que tales células alberguen, entre otras, a tejido linfoide (por ejemplo, nodos de linfa o bazo) y en consecuencia los estímulos inmunogénicos y los agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB serían producidos en alta concentración en el sitio donde ellas ejercen su efecto, es decir, refuerzo de una respuesta inmunitaria. Además, si se utiliza APC que expresa un transgén que codifica uno o más agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB, la APC que expresa al exógeno puede ser, pero no necesariamente, la misma APC que presenta un aloantígeno o un péptido antigénico a las células T relevantes. Los agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB pueden ser secretados por la APC o expresados sobre su superficie. Antes de la administración de APC recombinante a un individuo, ellas pueden ser opcionalmente expuestas a las fuentes anteriormente enlistadas de antígenos o péptidos antigénicos de interés, por ejemplo, aquellas de tumores o de microorganismos infecciosos. Las mismas construcciones genéticas y secuencias de transporte descritas para la aproximación in vivo pueden ser utilizadas para esta estrategia ex vivo. Además, las células tumorales o las células híbridas producidas por fusión de APC (por ejemplo, células dendríticas) y células tumorales pueden ser transfectadas o transformadas por uno o más vectores que codifican dichos uno o más agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB. Tales células, preferiblemente tratadas con un agente (por ejemplo, irradiación ionizante o mitomicina C) que merma su capacidad proliferativa, son luego administradas a un individuo con un cáncer relevante donde, debido a su expresión de los agentes agonísticos exógenos para enlazamiento de 4-1BB (sobre su superficie celular o por secreción), pueden estimular las respuestas inmunitarias tumoricidas mejoradas de las células T. Se entiende que las células tumorales las cuales, después de la transfección o la transformación con dicho agente agonístico para enlazamiento de 4-1BB que codifica ácidos nucleicos, son administradas a un individuo con cáncer pueden haber sido obtenidas a partir de un individuo diferente. En forma similar, las células tumorales utilizadas para la producción de células híbridas que expresan a dichos agentes agonísticos recombinantes para enlazamiento de 4-1BB y son administradas a un individuo con cáncer, pueden haber sido obtenidas de un individuo diferente.

Los métodos ex vivo pueden incluir las etapas de cosechar células (por ejemplo, células tumorales o APC) e un individuo, cultivar las células, transducirlas con uno o más vectores de expresión, y mantener las células bajo condiciones adecuadas para expresar al ión de dichos estímulos inmunogénicos y/o de dichos agentes agonísticos para enlazamiento de 4-1BB. Estos métodos son conocidos en el arte de la biología molecular. La etapa de transducción se logra por medio de cualquier medio estándar usado para terapia génica ex vivo, incluido fosfato de calcio, lipofección, electroporación, infección viral, y transferencia génica biolística. Alternativamente, se pueden utilizar liposomas, o micropartículas poliméricas. Las células que han sido exitosamente transducidas son luego seleccionadas, por ejemplo, por expresión de la secuencia de codificación o de un gen de resistencia a un medicamento. Las células pueden ser luego irradiadas en forma letal (si se desea) e inyectadas o implantadas en el paciente. Los métodos pueden incluir la etapa adicional de elaborar los híbridos celulares descritos anteriormente que son inyectados o implantados en el paciente.

Un estímulo inmunogénico puede ser suministrado en la forma de un epítopo de péptido y de un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB ya sea en la forma de un ácido nucleico que lo codifica o de células transformadas con un ácido nucleico que lo codifica.

Anticuerpos específicos de 4-1BB

La invención presenta anticuerpos que se enlazan específicamente con 4-1BB humana y de ratón. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales presentes en el suero o en el plasma de animales (por ejemplo, ratones, conejos, ratas, cobayos, ovejas, caballos, cabras, vacas, o cerdos que han sido inmunizados con el polipéptido relevante 4-1BB (o un fragmento de péptido del mismo) utilizando métodos, y opcionalmente adyuvantes, conocidos en el arte. Tales anticuerpos policlonales pueden ser aislados, por ejemplo de suero, plasma, o ascitis por medio de métodos conocidos en el arte. Anticuerpos monoclonales (mAb) que se enlazan a polipéptidos o fragmentos de 4-1BB son también abarcados por la invención. Estos mAb incluyen a aquellos producidos por los hibridomas 2A, 5.9, y 5.10 (ver Ejemplos).

Los métodos para elaborar y seleccionar anticuerpos monoclonales son bien conocidos en el arte. Una vez ha sido seleccionado y clonado el hibridoma deseado para producción de anticuerpos, se puede producir el anticuerpo resultante por medio de una variedad de métodos in vivo e in vitro conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede cultivar el hibridoma in vitro en un medio adecuado durante un período de tiempo adecuado, seguido por la recuperación del anticuerpo deseado del sobrenadante. El período de tiempo y el medio son conocidos o se los puede determinar fácilmente.

Adicionalmente, anticuerpos recombinantes específicos para 4-1BB, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados que contienen tanto porciones humanas como no humanas, están dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser producidos por medio de técnicas de ADN recombinante conocidas en el arte, por ejemplo, utilizando métodos descritos en Robinson y colaboradores, Publicación Internacional de Patente PCT/US86/02269; Akira y colaboradores, Solicitud Europea de Patente 184.187; Taniguchi, Solicitud Europea de Patente 171.496; Morrison y colaboradores, Solicitud Europea de Patente 173.494; Neuberger y colaboradores, Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly y colaboradores, Patente Estadounidense No. 4.816.567; Cabilly y colaboradores, Solicitud Europea de Patente 125.023; Better y colaboradores (1988) Science 240: 1041-43; Liu y colaboradores (1987) J. Immunol. 139: 3521-26; Sun y colaboradores (1987) PNAS 84: 214-18; Nishimura y colaboradores (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood y colaboradores (1985) Nature 314: 446-49; Shawy colaboradores (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-59; Morrison,(1985) Science 229: 1202-07; Oi y colaboradores (1986) BioTechniques 4: 214; Winter, Patente Estadounidense No. 5.225.539; Jones y colaboradores (1986) Nature 321: 552-25; Veroeyan y colaboradores (1988) Science 239: 1534; y Beidler y colaboradores (1988) J. Immunol. 141: 4053-60.

También están incluidos dentro del alcance de la invención fragmentos de anticuerpo y derivados que contienen al menos la porción funcional del dominio de enlazamiento del antígeno de un anticuerpo que se enlaza específicamente con 4-1BB. Los fragmentos de anticuerpo que contienen al dominio de enlazamiento de la molécula pueden ser generados por medio de técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: fragmentos F(ab')_{2} que pueden ser producidos por medio de digestión con pepsina de moléculas de anticuerpo; fragmentos Fab que pueden ser generados por reducción de los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}; y fragmentos Fab que pueden ser generados por medio de tratamiento de moléculas de anticuerpo con papaína y un agente reductor. Ver, por ejemplo, Institutos Nacionales de Salud, 1 Current Protocols In Immunology, Coligan y colaboradores, ed. 2.8, 2.10 (Wiley Interscience, 1991). Los fragmentos de anticuerpo también incluyen fragmentos de Fv (por ejemplo, Fv de una sola cadena (scFv)), es decir, productos de anticuerpo en los cuales existen pocos o ningún residuo de aminoácidos de región constante. Un fragmento de scFv es una cadena única de polipéptido que incluye tanto regiones variables de cadena liviana como de cadena pesada del anticuerpo del cual se deriva scFv. Tales fragmentos pueden ser producidos, por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 4.642.334.

Los siguientes Ejemplos pretenden ilustrar, no limitar, la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y Métodos

Modelos de tumores y péptidos. Células C3, generadas a partir de células embrionarias de ratón C57BL/6 (B6) transformadas con HPV-16-/EJras [Feltkamp y colaboradores (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2242-2249], fueron donadas por el Dr. W. Martin Kast (Loyola University, Chicago, IL). Una línea de células EL4 (EL4E7) transfectadas con ADNc que codifican al polipéptido E7 del virus 16 del papiloma humano (HPV-16) [Tindle y colaboradores (1995) Clin. Exp. Immunol. 101: 265-271] fue donada por el Dr. Germain J. P. Fernando (University of Queensland, Brisbane, Australia). La línea de células TC-1 [Liu y colaboradores (1996) Cancer Res. 56: 21-6] fue donada por el Dr. T. C. Wu (Johns Hopkins University, Baltimore, MD) y la línea de melanoma B16-F10 [Dranoff y colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3539-3543] fue donada por el Dr. Glenn Dranoff (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA). Las EL4, RMAS y S49.1 de linfoma de células T de múrido vivas eran de origen B6 y fueron adquiridas en el American Type Culture Collection (Manassas, VA). El mastocitoma regresor P815 (P815R), que había sido previamente descroto [Nieland y colaboradores (1999) J. Cell Biochem 73: 145-152], fue obtenido del Dr. W. Martin Kast, Loyola University, Chicago, IL. Todas las líneas de células fueron mantenidas en un medio de cultivo completo para tejidos de RPMI1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con suero fetal de bovino al 10% (FBS) (HyClone, Logan, UT), HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina G y 100 mg/ml de sulfato de estreptomicina.

El péptido E7 (RAHYNIVTF) (SEQ ID NO: 7) contenía al epítopo CTL restringido por H-2D^{b} mínimo [Feltkamp y colaboradores (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2242-2249] de la proteína E7 de HPV-16. El péptido trp-2 (SVYDFFVWL) (SEQ ID NO: 8) es un epítopo restringido de H-2K^{b} identificado primero en el melanoma B16 [Bloom y colaboradores (1997) J. Exp. Med.185: 453-459; Schreurs y colaboradores (2000) Cancer Res. 60: 6995-7001]. El péptido de control Vp2 (FHAGSLLVFM) (SEQ ID NO: 9) contiene un epítopo CTL restringido por H-2D^{b} derivado del Virus de la Encefalomielitis de Múrido de Theiler [Johnson y colaboradores (1999). J. Virol. 73: 3702-3708]. El péptido OVA (257-264) (SIINFEKL) (SEQ ID NO: 10) (a que se refieren los experimentos de anérgica de células T de OT-1 descritos en los Ejemplos 10-13 como el péptido "OVA") es un epítopo CTL restringido por H-2Kb derivado a partir de ovoalbúmina de pollo [Curtsinger y colaboradores (1998) J. Immunol. 160: 3236-3243; Moore y colaboradores (1988) Cell 54: 777-785]. El péptido OVA (55-62) (KVVRFDKL) (SEQ ID NO: 11) utilizado como un "péptido de control" en los experimentos de anérgica de células T de OT-1 descritos en los Ejemplos 10-13 es un epítopo CTL restringido por H-2Kb a partir de ovoalbúmina de pollo [E1-Shami y colaboradores (1999) Eur. J. Immunol. 29: 3295-3301]. El péptido P1A (35-43) (LPYLGWLVF) (SEQ ID NO: 12) es un epítopo CTL restringido por H-2Ld. Todos los péptidos fueron sintetizados por la Mayo Molecular Biology Core Facility y la pureza de los péptidos fue >90% por medio de purificación con HPLC en fase reversa. Se disolvieron los péptidos en dimetil sulfóxido (DMSO) y se los reconstituyó en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) hasta una concentración final de 1 mg/ml (5% DMSO) para administración a los ratones.

Se adquirieron ratones hembra B6 del National Cancer Institute (Frederick, MD). Se utilizaron ratones de edad similar, de 6-10 semanas de edad, para todos los experimentos. Se inyectaron células tumorales en 0,1 ml de PBS en forma subcutánea (s. c.) en los costados derechos afeitados. Los ratones recibieron 1 x 10^{6} células C3 o 4 x 10^{6} células EL4E7. Se midió el tamaño del tumor (el promedio de dos diámetros perpendiculares en mm) semanalmente como se describió previamente [Tamada y colaboradores (2000) Nature Med. 6: 283-289]. Para modelos de metástasis pulmonar, se inyectaron 1 x 10^{4} células TC-1 o 1 x 10^{5} células B16-F10 en 0,5 ml de Solución Salina Amortiguada de Hank en la vena de la cola de los ratones. Los ratones que padecían tumores subcutáneos fueron inmunizados en forma intradérmica (i. d.) al lado opuesto del tumor con 50 mg de péptido emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Los ratones que sufrían de metástasis pulmonar fueron inmunizados en forma bilateral en forma i. d. con un total de 100 mg de péptido emulsionado en IFA. Los anticuerpos administrados a los ratones fueron inyectados en forma intraperitoneal (i. p.) en 0,5 ml de PBS.

Para experimentos que involucran reto con células tumorales P815R, se inyectaron 1,5 x 10^{4} células P815R en forma intradérmica en los costados afeitados de ratones DBA/2.

Los ratones transgénicos OT-1, que habían sido previamente descritos [Strome y colaboradores (2002) Cancer Research 62: 1884-1889], fueron obtenidos con el Dr. Larry Pease, Mayo Clinic, Rochester, MN. Todas las células T CD8+ de los ratones OT-1 expresan un antígeno específico del receptor de células T (TCR) específico para el péptido OVA (257-264) enlazado a la molécula MCH clase I de H-2Kb de múrido.

Anticuerpos, tetrámeros, y proteína de fusión. Para preparar una proteína de fusión 4-1BBIg, se amplificó ADNc que codifica al dominio extracelular de 4-1BB de ratón a partir del ADNc producido de ARN aislado de células de bazo activadas con concanavalina A utilizando iniciadores específicos para la secuencia y fue fusionada con el dominio CH_{2}-CH_{3} de IgG2a de ratón en el plásmido de expresión pmIgV [Chapoval y colaboradores (2000) Nature Med. 6: 283-289]. El vector de expresión resultante fue transfectado dentro de células CHO. La proteína en los sobrenadantes del cultivo de un clon transfectado fue purificada utilizando una columna HiTrap con Sefarosa-Proteína G (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y dializada en PBS libre de lipopolisacárido.

Se generó un anticuerpo monoclonal de rata (mAb) contra 4-1 BB por medio de inmunización de una rata Lewis (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) con 4-1BBIg de ratón. Se produjeron hibridomas fusionando células de bazo de rata con células de mieloma Sp2/0 de ratón y se seleccionaron los sobrenadantes del cultivo por medio de ELISA. Se seleccionó el hibridoma que secreta al mAb 2A para experimentos adicionales. Se cultivó el hibridoma 2A en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% bajo en IgG (Life Technologies) y HEPES 25 mM y se recolectó el sobrenadante y se lo concentró utilizando un concentrador miniplaca de flujo tangencial (Millipore, Bedford, MA). Se purificó el mAb 2A a partir del sobrenadante concentrado utilizando una columna HiTrap de 5 ml con Sefarosa-Proteína G (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se dializó el mAb purificado contra PBS y se lo concentró utilizando un concentrador Centriprep (Millipore, Bedford. MA). Se determine el isotipo del mAb 2A utilizando anticuerpos biotinilados, específicos del isotipo (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Se encontró que era un anticuerpo IgG2a con cadenas livianas kappa.

El mAb purificado específico para CD3, CD28, 4-1BB de ratón, las CD8, CD69, CD25, CD49A conjugadas con fluoresceína isotiocianato (FITC), y el mAb isotipo de control, y el mAb CD8 conjugado con Cy-Cromo fueron adquiridos a PharMingen (San Diego, CA). El anticuerpo IgG antirrata de cabra conjugado con FITC fue adquirido a Biosource International (Camarillo, CA). Se utilizaron anticuerpos IgG de Rata (Sigma Chemical, Gilbertsville, PA) como controles.

Los tetrámeros de la molécula clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) H-2D^{b} de ratón enlazados ya sea al péptido E7 (H-2D^{b}-E7) o al péptido de control Vp2 (H-2D^{b}-Vp2) fueron preparados como se describió previamente [Johnson y colaboradores (1999) J. Virol. 73: 3702-3708]. En resumen, la cadena \alpha de H-2D^{b} y la microglobulina \beta_{2} humana fueron aisladas de un sistema bacteriano de expresión y posteriormente plegadas en presencia de péptido en exceso. Se desalaron y biotinilaron los complejos monoméricos plagados. Después de purificación por intercambio catiónico, se conjugaron los complejos monoméricos con estreptavidina marcada con el colorante fluorescente, ficoeritrina (PE), formando así complejos tetraméricos fluorescentes. Se purificaron luego los tetrámeros marcados con PE generados por medio de filtración por gel de exclusión por tamaño.

Se obtuvo un tetrámero compuesto de cuatro moléculas H-2Kb de ratón enlazado al péptido OVA (257-264) y marcado con PE (algunas veces denominada más adelante como "tetrámero OVA") de la NIH Tetramer Core Facility (Atlanta, GA).

Ensayo de coestimulación de células T. El método utilizado para evaluar la actividad coestimuladora del mAb ya fue descrito [Tamada y colaboradores (2000) Nature Med. 6: 283-289]. En resumen, se añadieron células T esplénicas purificadas a través de nylon-lana (NW) (2,5 x 10^{6}/ml) a places de 96 pozos que habían sido recubiertas con un mAb contra CD3 (0,1 mg/ml) y las concentraciones indicadas de IgG de rata o mAb 2A. Se evaluó la proliferación de células T por medio de la adición de 1 \muCi/pozo de [^{3}H]-timidina (^{3}H-TdR) a los cultivos de 3 días 15 horas antes de recogerlas de los cultivos sobre filtros de fibra de vidrio. Se midió la ^{3}H-TdR incorporada dentro de las células T en un contador de centelleo líquido MicroBeta TriLux (Wallac, Turku, Finlandia).

Análisis FACS y clasificación. Se seleccionaron positivamente las células T utilizando los mAb conjugados con FITC contra CD4 y CD8, microgránulos metálicos recubiertos con anticuerpo específico para FITC, y un imán según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). La pureza de las células T aisladas fue rutinariamente superior al 95%, de acuerdo a la evaluación hecha por citometría de flujo utilizando un mAb contra CD3. Las células T purificadas (2,5 x 10^{6} células/ml) de bazos de ratón fueron estimuladas en los pozos de placas de cultivo para tejidos de 24 pozos recubiertos con los mAb contra CD3 (5 \mug/ml) y CD28 (1 \mug/ml). Después de 24 horas, se recolectaron las células T y se las coloreó durante 30 min a 4ºC con 1 \mug de mAb 2A, ya sea solas o en presencia de 4-1BBIg (2 \mug/ml), en 50 ml de PBS suplementado con FBS al 3% y azida al 0,02%. Se lavaron e incubaron las células durante 30 min adicionales a 4ºC con anticuerpo de cabra conjugado con FITC específico para IgG de rata. Después de lavar las células se las fijó en paraformaldehido al 1% y se analizó la fluorescencia con un FACS (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se tiñeron células S49.1 en una forma similar. En resumen, se tiñeron 1 x 10^{6} células S49.1 ya sea con mAb 2A o con el mAb específico para 4-1BB adquirido a Pharmingen (clon 1AH2). Después de lavar, se tiñeron las células con un anticuerpo conjugado con FITC específico para IgG de rata, se las lavó, fijó y analizó.

Se recolectaron nodos de linfa que drenan del tumos (TDLN) de ratones inmunizados el día 7 y se los tiñó con complejos tetraméricos H-2D^{b}-E7 o H-2D^{b}-Vp2 marcados con PE y con CD8 conjugadas con FITC como se describió previamente [Johnson y colaboradores (1999) J. Virol. 73: 3702-3708]. Se incubaron 5 x 10^{6} células TDLN con 2,5 x 10^{-5} células C3 irradiadas con UV durante 4 días. Se colorearon posteriormente las células con los tetrámeros marcados con PE y con CD8 conjugadas con FITC. Después de un lavado extensivo, se resuspendieron las células en PBS con 750 ng/ml de yoduro de propidio. Se abrió la opción de incluir únicamente células CD8+ viables.

El análisis FACS para los experimentos de anérgica de células T de OT-1 fue realizado esencialmente como se describió anteriormente pero utilizando los reactivos de coloración indicados más adelante.

Para la clasificación por FACS de células T que expresan al TCR de OT-1, se purificaron células T de bazos y de nodos de linfa de ratones utilizando microgránulos recubiertos con anticuerpo específico para Thy1.2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, San Diego, CA). Se tiñeron posteriormente células Thy1.2+ con el tetrámero OVA descrito anteriormente. Se seleccionaron las células teñidas positivamente utilizando un Sistema de Citometría de Flujo FACSVantage (B D Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Al menos 90% de las células seleccionadas eran positivas tanto para el tetrámero OVA como para CD8+.

Ensayo para la actividad de CTL. En los experimentos sobre el tumor C3, se obtuvieron células efectoras por medio de cocultivo de células que drenan del LN con células C3 irradiadas durante 4 días. Se recolectaron las células efectoras de los cultivos y se analizó la actividad de CTL utilizando un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr a las 4 horas con proporciones de objetivos de células tumorales en el efector indicado con respecto a la célula objetivo (E:T). Se generaron células objetivo pulsadas de péptido por medio del cultivo de células objetivo con 10 \mug/ml del péptido a 28ºC durante 18 horas antes de usarlas. El ensayo CTL utilizado para los experimentos de anérgica de las células T de OT-1 fue realizado en forma similar utilizando las células objetivo indicadas más adelante.

Preparación de DC de múrido. Se prepararon DC de múrido a partir de medula ósea. Se sacrificaron los ratones y se los sumergió en etanol al 70% (EtOH). Después de remover el exceso de EtOH, se expusieron las extremidades posteriores y se dislocó la articulación de la cadera. Se removió el parenquimal del músculo y se colocaron brevemente los huesos en EtOH al 70% y luego en medio completo (CM; RPMI 1640, FBS al 10% inactivado con calor (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT), Fungizone (0,5 \mug/ml), \beta-ME (2 x 10^{-5} M), piruvato de sodio (1 mM), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), penicilina y estreptomicina (100 \mug/ml), glutamina (2 mM) y Gentamicina (50 \mug/ml)). Se cortaron ambos extremos de los huesos para exponer la médula y se utilizó una jeringa de 3 cc (llena con CM) con una aguja de calibre 25 para expeler la médula en una placa para cultivo de células de 10 mm, que contenía CM. Después de la extracción de la médula, las células separadas de los componentes estromales forzándolas a través de un tamiz de acero y, después precipitándolas por medio de centrifugación, fueron resuspendidas en 1,0 ml de medio que contenía 10 \mug/ml de mAb anticlase II (I-Ab), mAb anti-Mac 3, mAb anti-CD8a (HO2.2), mAb anti-CD45R (B220), mAb anti-CD3e, y mAb anti-GR-1 (todos de PharMingen, Inc. San Diego, CA), y se incubó sobre hielo durante 20 minutos. Se lavaron luego las células una vez y se las resuspendió en suero de conejo (diluido 1:30 en medio) (Cedarlane Laboratories, Ltd., Hornby, Ontario, Canadá) como fuente de complemento lítico en una concentración de 10^{7} células/ml y se incubó a 37ºC durante 45 minutos. Se lavaron luego las células, se las sembró en placas para cultivo de células de 100 mm con una concentración de 10^{7} células en 10 ml de CM suplementado con 10 ng/ml de factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) y 1 ng/ml de interleuquina 4 (IL-4), y se las cultivó a 37ºC. Se removieron las células no adherentes de los cultivos el día 2 y se las descartó y se recolectaron los cultivos que contenían DC altamente purificado el día 5.

Inducción de anérgica de células T. Se inyectaron en forma intravenosa (i. v.; vena de la cola) 3-7 x 10^{6} células del nodo linfático y de bazo de ratones OT-1 en ratones B6 de tipo silvestre en 0,5 ml de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) (Cellgro, Herndon, Virginia). De 12 a 24 horas después, se les suministró a los ratones experimentales 0,5 mg del péptido OVA (257-264) en forma i. v. en 0,5 ml de volumen total, mientras que a los ratones de control se les suministró péptido OVA (55-62) (o solo PBS en algunos experimentos) en una forma similar. El día de la administración del péptido, y nuevamente 3 días después, se les suministró a los ratones 100 \mug o bien de IgG de rata o mAb anti-CD 137 en forma intraperitoneal (i. p.). Se sacrificaron los ratones en diferentes momentos después de la administración del péptido y se determinó el número total de células de OT-1 presentes en el bazo y en los nodos linfáticos de cada ratón por medio de la coloración del tetrámero OVA. Para los experimentos de reestimulación, diez días después de la administración del péptido, se recolectaron los bazos de los ratones. Después de lisis de los glóbulos rojos en amortiguador de lisis Ack, se resuspendieron las células del bazo en medio de cultivo para tejidos RPMI suplementado como se describió anteriormente para el medio utilizado para cultivar líneas de células tumorales y se las sembró en placa por triplicado dentro de los pozos de una placa de 96 pozos con una densidad de 5,5 x10^{5} células por pozo en un volumen final de 200 ml por pozo. Un grupo de células no fue estimulado mientras que un segundo grupo fue reestimulado con 1 ng/ml del péptido OVA. El mismo día que fueron reestimulados los esplenocitos, se determinó la frecuencia de las células T específicas para OVA utilizando el tetrámero OVA de H-2K^{b} (257-264). De este modo, se podía calcular el número absoluto de células de OT-1 añadidas a cada pozo antes de la reestimulación in vitro. Se recolectaron los sobrenadantes de los pozos en cada grupo 48 y 72 horas después de la reestimulación y se midió la producción de IL-2 (48 h) e IFN-\gamma (72 h) por medio del ensayo de ELISA tipo sándwich siguiendo las instrucciones del fabricante (PharMingen, San Diego, California). Se evaluó la proliferación de células T por medio de la adición de 1 \muCi/pozo de [^{3}H]-timidina durante las últimas 15 horas del cultivo de 3 días. Se midió la incorporación de [^{3}H]-timidina en un contador de centelleo líquido MicroBeta TriLux (Wallac, Turku, Finlandia). Se calculó la proliferación específica de antígeno o la producción de citoquina por célula de OT-1 restando cualquier proliferación no específica (o producción de citoquina) observada en los grupos no estimulados a partir de la proliferación observada (o producción de citoquina) en los grupos estimulados con péptido. Esta fue luego dividida por el número de células de OT-1 (10^{3}) inicialmente presente en el pozo antes de la reestimulación para deducir el cambio neto en cpm (\Deltacpm) por cada 10^{3} células de OT-1.

Para medir la habilidad de anti-CD 137 para revertir la anergia, se transfirieron adoptivamente células de OT-1 dentro de destinatarios de tipo silvestre. Se indujo anergia por medio de la administración intravenosa de 0,5 mg del péptido OVA como se describió anteriormente. Alternativamente, los ratones recibieron únicamente péptido de control o PBS y fueron considerados "naïve" al momento de ser retados nuevamente con el antígeno. Diez días después los ratones recibieron 0,5 mg del péptido OVA o del péptido de control en forma intravenosa. Los ratones recibieron 100 \mug ya sea de IgG de rata o de anti-CD137. Se sacrificaron los ratones en diferentes momentos después del nuevo reto con el péptido OVA y se determinó el número de células T de OT-1 presentes en el bazo y en los nodos linfáticos de cada ratón por medio de análisis del tetrámero, como antes.

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Ejemplo 2 El mAb 2A Anti-4-1BB y su Efecto Antitumoral in vivo sobre Linfoma EL4E7 y Epitelioma C3

Se examinó la especificidad del mAb anti-4-1 BB. El anticuerpo monoclonal 2A tiñó >80% de las células T purificadas que habían sido activadas durante 24 horas por los mAb anti-CD3 y anti-CD28. El enlazamiento del anticuerpo fue específico ya que podía ser competitivamente inhibido por la inclusión de 4-1BBIg de ratón en la reacción de coloración (Fig. 1A) mientras que la inclusión de un anticuerpo de control IgG de rata no inhibió el enlazamiento (datos no mostrados). Además, mAb 2A se enlaza específicamente al linfoma S49.1 de células T de ratón que expresa constitutivamente 4-1BB (como se demostró por medio de la coloración con 1AH2, un mAb anti-4-1BB comercialmente disponible (Fig. 1B)). El mAb 2A inmovilizado también reforzó la proliferación de células T en una forma dependiente de la dosis en presencia de una dosis por debajo del óptimo de mAb anti-CD3 (Fig. 1C). Por lo tanto, 2A es un mAb coestimulador similar a otros previamente descritos [Melero y colaboradores (1997) Nature Med. 3: 682-685; Shuford y colaboradores (1997) 186: 47-55].

Para analizar si mAb 2A induce la regresión de tumores establecidos, se seleccionaron dos tumores de ratón. EL4E7 es un timoma transfectado para expresar al gen E7 de HPV-16 y C3 es una línea de células epiteliales embrionarias transformadas con HPV-16 y el oncogén ras. Ya que ambas líneas tumorales expresan al gen E7 de HPV-16, se pueden monitorear las repuestas de CTL al producto del gen E7. Para determinar el efecto antitumoral de mAb 2A, se inyectaron en forma i. p. grupos de ratones que padecen tumores establecidos EL4E7 o C3 con 2A (100 \mug) los días 7 y 10. Como se muestra en la Fig. 2, los tumores establecidos EL4E7 hicieron regresión rápidamente en los ratones inyectados con 2A mientras que los tumores crecieron progresivamente en los ratones tratados con un anticuerpo de control IgG de rata (Fig. 2). Notablemente, los tumores EL4E7 de hasta 12 mm de diámetro hicieron regresión dentro de los 7 días siguientes al tratamiento. En agudo contraste, el tratamiento de ratones que padecían de tumores C3 de menos de 4 mm de diámetro tuvo únicamente un efecto marginal. Como se muestra en un experimento representativo (Fig. 2), se presentó un retardo en el crecimiento del tumor en uno de cada cinco ratones; los tumores en los otros cuatro ratones crecieron progresivamente. Los resultados indican que, aunque mAb anti-4-1BB erradica tumores EL4E7 establecidos, los tumores C3 son refractarios al tratamiento. Esta resistencia al tratamiento es probablemente debida al tamaño del tumor o a cualquier disparidad antigénica entre los tumores.

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Ejemplo 3 La Presencia de CTL que son Ignorantes de los Antígenos E7 en Ratones que Padecen C3 está Asociada con Resistencia al Tratamiento con mAb 2A

Para entender los mecanismos fundamentales de la resistencia de los tumores C3 al tratamiento con 2A mAb, se examinó el estado de activación de CTL específicos del tumor en ratones que padecen de tumores C3. Se inocularon primero los ratones en forma subcutánea (s. c.) con células C3 y posteriormente (de 3 a 7 días después) se los trató con mAb 2A o con IgG de rata de control. Siete días después, se recolectaron TDLN, reestimuladas in vitro con células C3 irradiadas, y se analizó la actividad de los CTL de las células cosechadas de los cultivos en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr. Como se muestra en la Fig. 3A, ni EL4E7 ni C3 fueron lisadas por los TDLN activados in vitro en ratones que parecen de C3, incluso si los ratones a partir de los cuales se obtuvieron los TDLN habían sido tratados con mAb 2A. Es poco probable que la falla para detector la actividad de CTL fuera debida a insensibilidad del ensayo ya que la actividad de CTL no podía ser detectada contra células RMA-S pulsadas con el péptido E7 o las células EL4E7, siendo ambas células objetivo altamente sensibles. En agudo contraste, la actividad de CTL específica de E7 es rutinariamente detectada en TDLN aislados de ratones que padecen EL4E7; además, esta actividad de CTL específica de E7 es reforzada por el tratamiento con mAb 2A (Fig. 3B). Lo que parece ser lisis no específica de las células RMA-S de tipo silvestre en este ensayo puede ser explicada por la reciente observación de que las células EL4 y RMA-S comparten un antígeno tumoral [Van Hall y colaboradores (2000) J. Immunol. 165: 869-877].

La frecuencia de las células T específicas de E7 (49-57) en TDLN de C3 se determinó por medio de doble coloración con mAb anti-CD8 conjugado con FITC y tetrámero E7 marcado con PE. Consistente con los hallazgos sobre la actividad de CTL, menos del 0,1% de las células T CD8+ en TDLN de ratones que padecen de C3 eran específicas de E7, incluso después de reestimulación in vitro con células C3 irradiadas. Este valor representa un umbral de "CTL no detectados" en el ensayo ya que se obtuvieron también resultados similares utilizando células de ratones naïve. Además, el tratamiento con el mAb 2A falló en expandir los CTL específicos de E7 en TDLN de C3 (Fig. 4A, B). En contraste, \sim 1% de las células CD8+ fueron específicas de E7 en los LN de drenaje de ratones que padecen de EL4E7 tratados con el anticuerpo de control después de reestimulación con células C3 irradiadas. El tratamiento con mAb 2A in vivo promovió la expansión de CTL específicos de E7, como se demostró por medio de un incremento de 4 veces en la frecuencia de células T específicas de E7 (Fig. 4B). La frecuencia de CTL específicos de E7 se correlaciona por lo tanto con la actividad de CTL. Más importante aún, los resultados indican que la ausencia de CTL actives específicos de E7, en lugar de la actividad citolítica suprimida de CTL específicos, en TDLN de ratones que padecen de C3 es responsable por la inhabilidad de mAb 2A para reforzar las respuestas de las células T.

Para excluir la posibilidad de que CTL específicos de E7 sean suprimidos en ratones que padecen de C3, se examinó la actividad de CTL específica de E7 en los ratones después de inmunización con el péptido E7 (49-57) que contiene un epítopo de CTL restringido de H-2D^{b}. Siete días después de la inmunización con el péptido, se recolectaron LN de drenaje, reestimuladas con células irradiadas de C3 y se determinó la frecuencia de células T CD8+ específicas de E7 utilizando el tetrámero fluorescente E7. La inmunización con el péptido E7 provocó un incremento significativo de células que enlazaron al tetrámero E7. Tales células no pudieron ser detectadas después de la inmunización con un péptido Vp2 de control. El tratamiento con mAb 2A resultó en un incremento adicional en la frecuencia de CTL específicos de E7 (Fig. 5A). Se obtuvieron resultados similares por inmunización de ratones naive (Fig. 5B). Por lo tanto, CTL específicos de E7 están presentes en ratones que padecen de C3, pero no son ni activados ni suprimidos por las células de C3. De este modo, CTL específicos de E7 ignoran a los antígenos presentados por el tumor C3. Además, el mAb anti-4-1BB solo no es capaz de romper este estado este estado de ignorancia.

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Ejemplo 4 Regresión del Epitelioma Establecido de C3 por medio del Rompimiento de la Ignorancia de CTL con el Péptido del Epítopo E7 y mAb 2A Anti-4-1BB

Como se muestra en el Ejemplo 3, la inmunización con el péptido del epítopo E7 incrementa la frecuencia de CTL en ratones que padecen de C3. Se diseñó un experimento para analizar si la inmunización con el péptido E7 es un tratamiento efectivo para tumores establecidos C3. Se inmunizaron ratones que padecen tumores C3 durante 7 días ya sea con E7 o con el péptido Vp2 de control y se observaron los ratones al menos durante 12 semanas después del tratamiento. Luego fueron sacrificados después de que el tumor alcanzó 15 mm de diámetro. Se observó regresión tumoral únicamente en 1 de 11 (9%) ratones tratados solamente con el péptido E7. Por lo tanto, la inmunización con el péptido E7 no es suficiente para tratar tumores establecidos C3. Sin embargo, se observó regresión completa de los tumores en 11 de 15 (73%) ratones que habían recibido un tratamiento combinado con mAb coestimulador 4-1BB más el péptido E7 (COPP). Además, aquellos tumores que no hicieron regresión en ratones después del tratamiento COPP crecieron más lentamente cuando se los comparó con tumores en los grupos de control (Fig. 6). Únicamente 2 de 10 (20%) de los ratones de control tratados con mAb 2A y el péptido Vp2 de control quedaron libres de tumores. Los ratones tratados con el péptido Vp2 de control y un anticuerpo IgG de rata alcanzaron 15 mm de diámetro en 8 semanas, con la excepción de un único ratón que padecía un tumor más pequeño (<15 mm) durante más de 12 semanas (Fig. 6). Por lo tanto, el tratamiento COPP indujo efectivamente la regresión de tumores C3
establecidos.

Se determinó si el tratamiento COPP es también efectivo en el tratamiento de tumores C3 mayores. Como se resume en la Tabla 1, los ratones que padecieron de tumores C3 durante 14 días (5-8 mm de diámetro al momento del tratamiento) fueron tratados con COPP. Se observó regresión tumoral en 16 de 38 (42%) ratones. En contraste, se observó regresión tumoral en 0%, 9% y 0%, respectivamente, en ratones tratados con el péptido E7, mAb 2A solo o el Ig de control y el péptido Vp2. Los tumores que no hicieron regresión completa en los ratones que recibieron el tratamiento COPP fueron también significativamente más pequeños 21 días después del tratamiento que los tumores observados en todos los tres grupos de ratones de control.

TABLA 1 Tratamiento de ratones que padecen grande tumores C3

1

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Ejemplo 5 Efecto del Tratamiento COPP en Modelos de Metástasis de Cáncer de Pulmón TC-1 y de Melanoma B16-F10

Para determinar el efecto del tratamiento COPP con más fuerza en otros tumores poco inmunogénicos, se analizaron dos modelos de tumores. La línea tumoral TC-1 se deriva de células epiteliales primarias de pulmón cotransformadas tanto con E6 de HPV-16, con E7 de HPV-16 como con oncogenes ras [Liu y colaboradores (1996) Cancer Res. 56: 21-6]. Por lo tanto, se podría utilizar el péptido E7 como un inmunógeno. B16-F10 es una línea de melanoma altamente metastático, que presenta al péptido trp-2 restringido por H-2K^{b} [Dranoff y colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3539-3543; Bloom y colaboradores (1997) J. Exp. Med. 185: 453-459; Schreurs y colaboradores (2000) Cancer Res. 60: 6995-7001]. Se inyectaron ratones B6 en forma intravenosa (i. v.) con 10^{4} células de TC-1 para establecer metástasis pulmonar. Tres días después de la inyección del tumor, los ratones fueron inyectados en forma s. c. con el péptido E7 y en forma i. p. con el mAb 2A (COPP). Como se observó con el tumor C3, la administración solo de mAb 2A fue insuficiente para prolongar la supervivencia en ratones que padecen tumores, ya que todos los ratones murieron en el lapso de 20 días. La inmunización solamente con el péptido E7 prolongó la supervivencia, aunque todos los ratones murieron hacia el día 35. El tratamiento COPP condujo a una ventaja significativa en la supervivencia ya que todos los ratones que habían recibido tanto al péptido E7 como al mAb sobrevivieron al menos 35 días, tiempo para el cual todos los ratones en los grupos de control habían muerto (Fig. 7A). Veinte porciento de los ratones que recibieron tanto al péptido E7 como a mAb 2A (COPP) sobrevivieron durante más largo tiempo. En un segundo modelo, se inyectaron los ratones en forma i. v. con 10^{5} células B16-F10 y se los trató con COPP tres días después. Como anteriormente, el tratamiento ya sea solo con mAb 2A o con el péptido trp-2 fue inefectivo. Sin embargo, el tratamiento COPP (péptido trp-2 y mAb 2A) condujo a una ventaja significativa de supervivencia para todos los ratones y de supervivencia durante un largo período de tiempo (>90 días) en 20% de los ratones tratados. Por lo tanto, el tratamiento combinado con un péptido antigénico restringido a MHC clase I y mAb anti-4-1BB (COPP) puede ser terapéutico para tumores establecidos pobremente inmunogénicos.

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Ejemplo 6 mAb 2A Refuerza el Efecto Terapéutico de una Vacuna de Células Dendríticas

Con el propósito de determinar si un mAb agonístico específico para 4-1BB de múrido (mAb 2A) refuerza la respuesta inmunitaria antitumoral estimulada por vacunas con base en DC, se aprovechó un modelo de múrido de carcinoma de células escamosas de cabeza y de cuello. Se utilizó una línea de carcinoma de células escamosas (SCCVII) de múrido (B6) pobremente inmunogénica para estos experimentos. Se prepararon DC como se describió anteriormente. Las DC fueron "cebadas" con antígeno tumoral por medio del cultivo de DC (5 x 10^{6} por pozo) con células SCCVII irradiadas (1 x 10^{6} por pozo) en los pozos de placas de cultivo de tejido de 24 pozos durante 24 horas. Se inyectaron cuatro grupos de cinco ratones en forma s. c. (en el costado) con 2 x 10^{5} células SCCVII. Cuatro días después de la inyección de las células tumorales, se inyectaron los cuatro grupos de animales en forma s. c. en el costado contrario con las siguientes vacunas de prueba:

Grupo 1:

Las DC cebadas con SCCVII irradiadas (1 x 10^{6} DC y 3 x 10^{6} SCCVII irradiadas) e IgG de Rata (100 mg)

Grupo 2:

Las DC cebadas con SCCVII irradiadas (1 x 10^{6} DC y 3 x 10^{6} SCCVII irradiadas) y mAb 2A (100 mg)

Grupo 3:

IgG de Rata (100 mg) solamente.

Grupo 4:

mAb 2A (100 mg) solamente.

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Los ratones recibieron dos veces vacunas de prueba, efectuándose la segunda vacunación una semana después de la primera. Además de ser administrado como un componente de la vacuna, se administró el mAb 2A (o IgG de rata de control) tres días después de cada prueba de vacunación. Se midió el crecimiento del tumor en una forma blindada para determinar la eficacia terapéutica. Como se muestra en la Fig. 8, 80% de los animales tratados solamente con IgG de rata desarrollaron tumores (grupo 3; Fig. 8, panel superior derecho). En animales tratados con C "cebado" de tumor y con IgG de rata (grupo 1; Fig. 8, panel inferior derecho) o solamente con mAb 2A (grupo 4; Fig. 8, panel superior izquierdo) hubo eficacia terapéutica en 3 de 5 ratones. Sin embargo, los efectos terapéuticos más pronunciados se observaron en animales tratados con DC "cebadas" de tumor y con mAb 2A (grupo 2; Fig. 8, panel inferior izquierdo) en los cuales todos los ratones mostraron regresión tumoral. Estos datos demuestran claramente que el anticuerpo específico para 4-1BB es sinergístico con vacunas de DC "cebadas" de tumor en la estimulación de inmunidad terapéutica antitumoral.

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Ejemplo 7 Desarrollo de los mAb para 4-1BB Antihumana de Ratón

Con el propósito de generar mAb agonísticos específicos para 4-1BB humana, se utilizó una estrategia similar a aquella descrita anteriormente para la generación de mAb específicos para 4-1BB de múrido. Se modificó por medio de ingeniería genética una proteína soluble de fusión 4-1BB compuesta de un fragmento extracelular de 4-1BB humana y el dominio CH_{3}-CH_{3} de IgG1 humana. Los ratones inmunizados con esta proteína de fusión produjeron anticuerpos policlonales para 4-1BB. Se fusionaron los bazos de estos animales con mielomas SP2/0 de ratón para producir hibridomas que fueron seleccionados por medio de citometría de flujo de fluorescencia con células 293 transfectadas con ADNc que codifica 4-1BB humana. Dos hibridomas (5.9 y 5.10) que producen los mAb TgG1 mostraron coloración específica para 4-1BB humana.

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Ejemplo 8 Habilidad Coestimuladora de las Células T de los mAb para 4-1BB Antihumana de Ratón

Con el propósito de determinar si los dos mAb para 4-1BB antihumana descritos en el Ejemplo 7 tienen la habilidad para coestimular una respuesta de células T, se llevó a cabo un ensayo estándar de coestimulación in vitro. En resumen, se cultivaron células T humanas purificadas con (a) anticuerpos específicos para CD3 humana que recubrían el fondo de los pozos de placas de cultivo para tejido de 96 pozos en diferentes concentraciones y (b) diferentes concentraciones del mAb 5.9, el mAb 5.10, o IgG normal de ratón, todos recubriendo también (en una concentración de 10 \mug/ml) el fondo de los pozos de las placas de cultivo para tejido de 96 pozos. La incorporación de ^{3}H-TdR medida después de un período de cultivo de 48 horas fue utilizada para determinar la proliferación de células T (Fig. 9). Ambas 4-1BB antihumanas estimularon una proliferación significativa de células T, demostrando así el potencial coestimulador de células T de estos anticuerpos.

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Ejemplo 9 mAb Refuerza el Efecto Terapéutico de la Vacuna de Células Tumorales Irrigadas que Expresan GM-CSF Recombinante

Se llevaron a cabo experimentos con el propósito de determinar si un mAb agonístico específico para 4-1BB de múrido (mAb 2A) refuerza la respuesta inmune antimetastática estimulada por células tumorales irrigadas que expresan una citoquina recombinante. Se inyectaron cuatro grupos de cinco ratones B6 en forma i. v. con 5 x 10^{5} células de melanoma B16-F10 con el propósito de generar metástasis diseminada. Los días 3, 7, y 11 se inmunizaron los ratones en forma s. c. con 4 x 10^{6} células B16-F10 irradiadas transfectadas en forma estable con y que expresan ADNc que codifica GM-CSF de múrido (B16-GM-CSF) y los días 4, 7, 10, 12, y 15 se inyectaron los ratones en forma i. p. con 100 \mug ya sea con IgG de rata o con mAb 2A como se indica más adelante. Se generaron las células B16-GM-CSF esencialmente como se describe en Dranoff y colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3539-3543.

Grupo 1:

IgG de rata únicamente

Grupo 2:

mAb 2A únicamente

Grupo 3:

B16-GM-CSF e IgG de rata

Grupo 4:

B16-GM-CSF y mAb 2A

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Se monitoreó la supervivencia de los ratones (Fig. 10). Los ratones inmunizados con B-16-GM-CSF y mAb 2A mostraron una mejor supervivencia sobre los ratones inmunizados con B 16-GM-CSF e IgG de rata.

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Ejemplo 10 Inducción de Anergia en Células T de OT-1 CD8+ Después de Administración Intravenosa del Péptido OVA

El suministro intravenoso (i. v.) de antígeno es una aproximación establecida para inducir anergia en células T CD4+ [Valujskikh y colaboradores (2001) Transplantation 72: 685-693; Thorstenson y colaboradores (2001) J. Immunol. 167: 188-195; y Bercovici y colaboradores (1999) Eur. J. Immunol. 29: 345-354]. Después de la inyección i. v. de antígeno, las células T específicas del antígeno expuestas a una alta dosis de antígeno soluble se hicieron insensibles al antígeno; esto se demuestra por la inhabilidad de las células T para proliferar y secretar IL-2 por exposición al antígeno in vitro en presencia de APC [Jacobs y colaboradores (1994) Immunology 82: 294-300]. Este enfoque fue adaptado por los inventores para examinar la inducción de anergia en células T CD8+.

La administración intravenosa de un epítopo de péptido restringido por H-2K^{b} de ovoalbúmina (el "péptido OVA") [Deeths y colaboradores (1999) J. Immunol. 163: 102-110] a ratones B6 a los cuales se les habían transferido previamente adoptivamente células T de OT-1, condujo a la activación y expansión clonal de las células T de OT-1. Dos días después de la administración del péptido, las células de bazo y de nodo linfático reunidas de ratones que habían recibido un péptido de control o al péptido OVA fueron teñidas con tanto con anticuerpo anti-CD8 como con H-2K^{b}-OVA tetramérico (tetrámero OVA). Aunque únicamente 2,5% de las células T CD8+ fueron positivas para el tetrámero OVA (es decir, eran células T de OT-1) en los ratones tratados con péptido de control, la proporción de células T CD8+ que eran células T de OT-1 en los ratones tratados con OVA fue del 6,8% (Fig. 11). Se observe también blastogénesis de células de OT-1 en los ratones tratados con OVA, como se demostró por medio del incremento precoz de la dispersión de las células de estos ratones por medio del análisis FACS. Además, más del 50% de las células de OT-1 en los ratones tratados con OVA expresaron los marcadores de activación de las células T, CD69 y CD25
(Fig. 11).

Para determinar la capacidad de respuesta de células T de OT-1 después de exposición i. v. al péptido OVA, se retaron nuevamente en forma i. v. ratones B6 como se describió anteriormente 10 días después ya sea con péptido de control o con el péptido OVA. Para comparación, se inyectaron también ratones naïve (es decir, ratones que no habían recibido la inyección inicial del péptido OVA) ya sea con el péptido de control o con el péptido OVA. Dos días después de la administración del péptido, se recolectaron bazos y nodos linfáticos de los ratones y se determinó el número total de células de OT-1 en las muestras reunidas de bazo y de nodo linfático por medio de coloración del tetrámero OVA. Se observó una expansión superior a 4 veces en los ratones naïve tratados con OVA. En contraste, no se presentó una expansión significativa de células OT-1 por el nuevo reto con OVA en aquellos ratones que habían recibido OVA diez días antes (Fig. 12A), sugiriendo así la inducción de anergia de células T de OT-1 por la exposición inicial a OVA. A diferencia de las células T naïve de OT-1, en las cuales la expresión de CD69 y CD25 puede ser inducida después del reto antigénico, la mayoría de las células T anérgicas de OT-1 no pudieron expresar niveles significativos de CD25 después de reto antigénico, aunque se observó expresión significativa de CD69 (Fig. 12B).

Con el propósito de determinar si las células de OT-1 retuvieron o no su función efectora después de la inducción de anergia, se estimularon nuevamente esplenocitos de ratones B6 inyectados con células T de OT1 y una dosis única de OVA como se describió anteriormente con péptido OVA in vitro. Aunque las células OT-1 previamente expuestas a OVA fueron incapaces de proliferar in vivo, secretaron IFN-\gamma por reestimulación con OVA in vitro en un nivel similar a las células T naïve de OT-1 (Fig. 12C). Estas resultados indican que las células T anérgicas de OT-1 T retuvieron la habilidad para secretar IFN-\gamma después de reestimulación.

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Ejemplo 11 La señalización de CD137 evita la inducción de anérgica de las células T de OT-1

Después de la transferencia adoptiva de células de OT-1 en ratones B6 naïve y la administración del péptido OVA, se inyectaron los ratones en forma i. p. ya sea con un mAb CD137 (clon 2A) o con IgG de rata de control. Se sacrificaron los ratones en diferentes momentos hasta 21 días después de la inyección del péptido OVA y se determinó el número total de células de OT-1 presentes en los bazos y en los nodos linfáticos en cada grupo de ratones por medio de coloración del tetrámero OVA. Como se muestra en la Fig. 13A, el tratamiento con mAb anti-CD137 después de la administración de OVA condujo a un incremento aproximadamente de diez veces en el número de células de OT-1 comparado con aquellos ratones que recibieron la IgG de rata de control. Esta robusta respuesta de las células T después de la inyección de mAb CD137 condujo a una significativa esplenomegalia en los ratones tratados con mAb CD137 (no se muestran datos). En contraste, la respuesta de las células T en los ratones que recibieron la IgG de rata de control alcanzó su punto máximo 2 días después de la administración de OVA y declinó rápidamente, alcanzando la línea base el día 21. Las células de OT-1 en los ratones tratados con mAb anti-CD137 persistieron al menos durante 21 días después de la estimulación antigénica. Estos datos demuestran la habilidad de la estimulación con CD137 para promover la expansión de las células T de OT-1 in vivo.

Para determinar el efecto de la señalización de CD137 sobre la inducción de anérgica de las células T, se sacrificaron los ratones a los cuales se les habían transferido adoptivamente células T de OT-1 y que fueron inyectados ya sea con PBS, péptido OVA y mAb anti-CD137, o péptido OVA e IgG de rata de control diez días después de la administración del péptido (o PBS). El número de células de OT-1 presentes en los esplenocitos reunidos de cada grupo de ratones se determinó por medio de la coloración del tetrámero OVA. Se estimularon nuevamente posteriormente esplenocitos in vitro con una concentración óptima del péptido OVA. La proliferación de OT-1 y la secreción de IL-2 fueron medidas 72 y 48 horas después, respectivamente. La proliferación de células T de OT-1, de acuerdo a lo medido por medio de la incorporación de [^{3}H]-timidina, se determinó con base en cada célula. A diferencia de las células T naïve de OT-1 de ratones que habían recibido PBS, las células de OT-1 de ratones que recibieron al péptido OVA y al IgG de rata de control no pudieron proliferar después de nueva estimulación in vitro (Fig. 13B). Además, el análisis FACS demostró que virtualmente el 100% de las células T de OT-1 de los ratones previamente expuestos el péptido OVA expresaron al marcador de activación tardía VLA-4, en contraste con las células OT-1 en los ratones de control tratados con péptido (Fig. 13C). En agudo contraste, se observó proliferación en células T de OT-1 de aquellos ratones que recibieron mAb anti-CD137 y péptido OVA. No se observó producción de IL-2 después de reestimulación de las células anérgicas de OT-1 de los ratones tratados con el péptido OVA y mAb anti-CD 137, un hallazgo consistente con su carencia de proliferación (Fig. 13B) mientras que las células de OT-1 de los ratones tratados con anti-CD137 secretaron IL-2 en una medica comparable con OT-1 naïve (Fig. 3B); este hallazgo proporciona evidencia adicional de que la señalización de CD 137 evitó la inducción de anergia de las células T.

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Ejemplo 12 La Señalización de CD137 Revierte la Anergia de Células T de OT-1

Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la señalización de CD137 podía revertir la anergia en una célula T ya anérgica. Para abordar esta cuestión, se inyectaron en forma i. v. ratones B6 naïve a los cuales se les había transferido adoptivamente células T de OT-1 con el péptido OVA como se describió anteriormente con el propósito de inducir anergia en las células T de OT-1. Diez días después, se inyectaron los ratones en forma i. p. con mAb anti-CD137 junto con péptido OVA. Se sacrificaron los ratones 2, 5 y 10 días después del tratamiento y se determinó el número total de células T de OT-1 por medio de coloración del tetrámero OVA. Como se muestra en la Fig. 14A, se observó una marcada expansión de las células de OT-1 en los ratones expuestos a OVA que fueron tratados con mAb anti-CD137 y péptido OVA. Las células anérgicas de OT-1, sin embargo, no pudieron expandirse después de un reto posterior ya sea con el péptido OVA o con el péptido de control (Fig. 14A). Estos hallazgos indican que la señalización de CD137, además de evitar la inducción de anergia de las células T, rompe anergia en células T de OT-1 que habían sido previamente anergizadas.

Aunque los anteriores resultados indican que el mAb anti-CD137 junto con el péptido OVA pueden revertir anergia en células T de OT-1, no es claro si la señalización a través del receptor de la célula T es absolutamente necesaria para que el mAb anti-CD137 rompa anergia. Para analizar esto, se prepararon ratones con células T anérgicas de OT-1 con el péptido OVA como se describió anteriormente. Diez días después de la inyección del péptido OVA, los ratones recibieron diferentes combinaciones de péptido de control o de péptido OVA e IgG de rata de control o mAb anti-CD137. Tres días después, los ratones fueron sacrificados y se determinó el número total de células de OT-1. Se observó únicamente expansión de células de OT-1 en el grupo de ratones que recibieron tanto al péptido OVA como mAb anti-CD137 (Fig. 14B). De manera muy importante, no se observó proliferación de células T de OT-1 en el grupo de ratones que recibieron el péptido de control y mAb anti-CD137. Como se mostró anteriormente (Fig. 12B), las células anérgicas de OT-1 no pudieron expresar CD25 después del encuentro con antígeno. Sin embargo, la señalización de CD 137 restableció, al menos en parte, la habilidad de esas células para expresar CD25 (Fig. 14C). Estos datos muestran que la reversión de la anergia en células T CD8+ T por parte de mAb CD137 requiere del engranaje del TCR.

Se llevaron a cabo experimentos entonces para analizar si la actividad citolítica de las células T de OT-1 es retenida por la exposición al mAb CD137. Se seleccionaron las células de OT-1 por medio de FACS después de coloración con el tetrámero OVA de los ratones que toleran OVA 5 días después del reto con el péptido OVA y mAb CD 137 y fueron utilizadas como células efectoras en un ensayo estándar de 4 horas liberación de ^{51}Cr para citotoxicidad contra células EL4 de control y pulsadas con OVA (Fig. 14D; "Anérgicas (OVA + 2A)"). Como controles, se seleccionaron idénticamente células de OT-1 de ratones que, en vez de ser inyectados inicialmente con el péptido OVA, fueron inyectados con el péptido de control y luego 10 días después fueron retados con el péptido OVA y o bien con IgG de rata ("OVA + IgG de rata") o con mAb anti-CD137 ("OVA + 2A"); la selección de las pruebas de citotoxicidad celular, como para el grupo experimental, fueron llevadas a cabo 5 días después del reto del péptido y el tratamiento con mAb/IgG de control. Como se muestra en la Fig. 14D, se observó aproximadamente 20% de lisis específica en una relación E:T de 10 a 1 en aquellos ratones que habían recibido el IgG de control. Sin embargo, se observó un incremento en la citotoxicidad mayor a dos veces en células de OT-1 aisladas de aquellos ratones que habían recibido mAb anti-CD137. En forma muy importante, se observó un nivel similar de citotoxicidad en células de OT-1 aisladas tanto de ratones naïve como de ratones que se hicieron tolerantes, siempre que ellos recibieran mAb anti-CD 137, indicando que mAb anti-CD137 no solamente restablece la capacidad proliferativa, sino también la citotoxicidad, en células de OT-1 previamente anergizadas.

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Ejemplo 13 Señalización de CD137 en la Prevención y Reversión de la Tolerancia inducida por el Péptido P1A en Células T específicas del Tumor

Se utilizó un modelo tumoral previamente establecido para examinar el efecto de la señalización de CD137 en la prevención y la reversión de la tolerancia de las células T. P815R es una variante clonal de mastocitoma P815 altamente tumorigénico, que a diferencia del tumor progenitor P815, regresa espontáneamente después de inoculación dentro del ratón singenésico DBA/2 [Nieland y colaboradores (1999) J. Cell Biochem. 73: 145-152]. La administración de un epítopo de péptido de P1A, un autoantígeno tumoral no mutado [Van den Eynde y colaboradores (1991) J. Exp. Med. 173:1373-1384], en adyuvante incompleto de Freund (IFA) induce una falta de respuesta de células T CD8+ y promueve el crecimiento progresivo del tumor P815R [Nieland y colaboradores (1999) J. Cell Biochem. 73: 145-152]. La inyección subcutánea de células P815R en ratones DBA/2 condujo al desarrollo transitorio de tumores subcutáneos.

El día 40 después de inoculación del tumor, 80% de los ratones que fueron tratados con IFA únicamente estaban libres de tumor (Fig. 15A, panel izquierdo). En contraste, únicamente 10% de los ratones estaban libres de tumor después de la administración del péptido P1A con IgG de rata de control diez días antes del reto del tumor (Fig. 15A, panel central), sugiriendo que la inyección del péptido P1A indujo tolerancia en CTL CD8+ específicos de P1A. El tratamiento con mAb anti-CD137 junto con péptido P1A evitó el desarrollo del tumor completamente en 50% de los ratones (Fig. 15A, panel derecho); sin embargo, se observó regresión tumoral en 40% de los ratones que desarrollaron tumores, sugiriendo que el tratamiento con mAb anti-CD137 previene la inducción de anergia de células T inducida por P1A.

Para probar el efecto de mAb anti-CD 137 sobre la regresión del tumor P815R establecido provocado por anérgica inducida por el péptido P1A, primero se hicieron tolerantes los ratones con el péptido P1A en IFA durante 10 días y posteriormente fueron retados con células P815R. Tres días después del reto del tumor, los ratones recibieron IgG de rata de control o mAb anti-CD137. En ratones tratados con el IgG de rata de control, 90% de los ratones desarrollaron el crecimiento progresivo de tumores (Fig. 15B, panel izquierdo). En contraste, el tratamiento con mAb anti-CD137 condujo a regresión tumoral en 100% de los ratones (Fig. 15B, panel derecho). Estos hallazgos indican que la señalización de CD 137 puede prevenir y romper la anergia de las células T después de la administración de un péptido P1A tolerogénico, conduciendo a la regresión de tumores P815R.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet Van den Eynde y colaboradores, J. Exp. Med., 1991, vol. 173, 1373-1384 [0101].

Claims (70)

1.

\;

(a)

\hskip0.2cm

Un antígeno para el cual un receptor de célula T es específico; y

(b)

un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB

para uso como un medicamento o una combinación de medicamentos para generar una respuesta inmunitaria mejorada en un individuo.

2. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el antígeno es (a) un antígeno asociado a un tumor (TAA) o (b) un fragmento funcional de un TAA.

3. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el antígeno es un polipéptido.

4. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 2, en donde el TAA es una molécula producida por una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste de una leucemia, un linfoma, un cáncer neurológico, un melanoma, un cáncer de seno, un cáncer de pulmón, un cáncer de cabeza y de cuello, un cáncer gastrointestinal, un cáncer de hígado, un cáncer pancreático, un cáncer genitourinario, un cáncer de próstata, un cáncer de células renales, un cáncer óseo, y una célula de cáncer vascular.

5. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el antígeno es una molécula producida por un microorganismo infeccioso.

6. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 5, en donde el microorganismo infeccioso es un virus.

7. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el virus es un retrovirus.

8. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 5, en donde el microorganismo infeccioso es seleccionado del grupo que consiste de una bacteria, un hongo, y un parásito protozoario.

9. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el individuo es un humano.

10. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el antígeno es una célula dendrítica que comprende una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con un epítopo de péptido enlazado a la misma, en done el epítopo de péptido es un fragmento de un TAA o un fragmento de un polipéptido producido por un microorganismo infeccioso.

11. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 10, en donde la molécula del MHC es una molécula clase I del MHC.

12. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 10, en donde la molécula del MHC es una molécula clase II del MHC.

13. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la respuesta inmune es una respuesta de una célula T.

14. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 13, en donde la célula T es una célula T CD8+.

15. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 13, en donde la célula T es una célula T CD4+.

16. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el antígeno es una célula híbrida.

17. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 16, en donde la célula híbrida es un producto de fusión de una célula tumoral y una célula dendrítica.

18. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el antígeno es una célula tumoral, un lisado de célula tumoral, un TAA, un epítopo de péptido de un TAA, o una proteína de choque térmico enlazada al epítopo de péptido de proteína expresada por una célula tumoral.

19. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el antígeno es una célula dendrítica que ha sido incubada con células tumorales, un lisado de célula tumoral, un TAA, un epítopo de péptido de un TAA, o una proteína de choque térmico enlazada a un epítopo de péptido expresado por una célula tumoral.

20. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 18, en donde la célula tumoral es transfectada con o transformada con un ácido nucleico que codifica una citoquina o un factor de crecimiento.

\newpage

21. El antígeno y el anticuerpo de la reivindicación 20, en donde la citoquina es un factor estimulador de colonias de macrófago y granulocitos (GM-CSF).

22. (a)

\;

Un antígeno para el cual un receptor de célula T es específico y un anticuerpo agonístico para enlazamiento
{}\hskip1.6cm de 4-1BB;

(b)

un ácido nucleico que codifica al antígeno y al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB;

(c)

el antígeno y un ácido nucleico que codifica al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB; o

(d)

un ácido nucleico que codifica al antígeno y un ácido nucleico que codifica al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB para uso como un medicamento o una combinación de medicamentos para prevenir la inducción de anergia o reversar anergia en una célula T en un individuo.

23. El ácido nucleico que codifica al antígeno y el ácido nucleico que codifica al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB de la reivindicación 22, en donde el ácido nucleico que codifica al antígeno y el ácido nucleico que codifica al anticuerpo para enlazamiento de 4-1BB están en la misma molécula de ácido nucleico.

24. El ácido nucleico que codifica al antígeno y el ácido nucleico que codifica al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB de la reivindicación 22, en donde el ácido nucleico que codifica al antígeno o el anticuerpo para enlazamiento de 4-1BB es transfectado o transducido en una célula, en donde la célula es una célula, o una progenie de una célula, que antes de la transfección o de la transducción, fue obtenido a partir de un mamífero.

25. El antígeno y el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un fragmento para enlazamiento del antígeno, especialmente Fab, F(ab')_{2}, Fv o un fragmento de Fv de cadena sencilla.

26. El uso de

(a)

un antígeno para el cual es específico un receptor de células T; y

(b)

un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB

para la fabricación de un medicamento o una combinación de medicamentos para generar una respuesta mejorada de las células T en un individuo.

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27. El uso de la reivindicación 26, en donde el antígeno es (a) un antígeno asociado con el tumor (TAA) o (b) un fragmento funcional de un TAA.

28. El uso de la reivindicación 26, en donde el antígeno es un polipéptido.

29. El uso de la reivindicación 27, en donde el TAA es una molécula producida por una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste de una leucemia, un linfoma, un cáncer neurológico, un melanoma, un cáncer de seno, un cáncer de pulmón, un cáncer de cabeza y de cuello, un cáncer gastrointestinal, un cáncer de hígado, un cáncer pancreático, un cáncer genitourinario, un cáncer de próstata, un cáncer de células renales, un cáncer óseo, y una célula de cáncer vascular.

30. El uso de la reivindicación 26, en donde el antígeno es una molécula producida por un microorganismo infeccioso.

31. El uso de la reivindicación 30, en donde el microorganismo infeccioso es un virus.

32. El uso de la reivindicación 31, en donde el virus es un retrovirus.

33. El uso de la reivindicación 30, en donde el microorganismo infeccioso se selecciona del grupo que consiste de una bacteria, un hongo, y un parásito protozoario.

34. El uso de la reivindicación 26, en donde el individuo es un humano.

35. El uso de la reivindicación 26, en donde el antígeno es una célula dendrítica que comprende una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con un epítopo de péptido enlazado a la misma, en done el epítopo de péptido es un fragmento de un TAA o un fragmento de un polipéptido producido por un microorganismo infeccioso.

36. El uso de la reivindicación 35, en donde la molécula del MHC es una molécula clase I del MHC.

37. El uso de la reivindicación 35, en donde la molécula del MHC es una molécula clase II del MHC.

38. El uso de la reivindicación 26, en donde la célula T es una célula T CD8+.

39. El uso de la reivindicación 26, en donde la célula T es una célula T CD4+.

40. El uso de la reivindicación 26, en donde en antígeno es una célula híbrida.

41. El uso de la reivindicación 40, en donde la célula híbrida es un producto de fusión de una célula tumoral y una célula dendrítica.

42. El uso de la reivindicación 26, en donde el antígeno es una célula tumoral, un lisado de célula tumoral, un TAA, un epítopo de péptido de un TAA, o una proteína de choque térmico enlazada a un epítopo de péptido de proteína expresada por una célula tumoral.

43. El uso de la reivindicación 26, en donde el antígeno es una célula dendrítica que ha sido incubada con células tumorales, un lisado de células tumorales, un TAA, un epítopo de péptido de un TAA, o una proteína de choque térmico enlazada a un epítopo de péptido de proteína expresada por una célula tumoral.

44. El uso de la reivindicación 42, en donde la célula tumoral es transfectada con o transformada con un ácido nucleico que codifica a una citoquina o a un factor de crecimiento.

45. El uso de la reivindicación 44, en donde la citoquina es un factor estimulador de colonias de macrófago y granulocitos (GM-CSF).

46. El uso de

(a)

Un antígeno para el cual un receptor de célula T es específico y un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB;

(b)

un ácido nucleico que codifica al antígeno y al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB;

(c)

el antígeno y un ácido nucleico que codifica al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB; o

(d)

un ácido nucleico que codifica al antígeno y un ácido nucleico que codifica al anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB

para la fabricación de un medicamento o una combinación de medicamentos para prevenir la inducción de anergia o reversar la anergia en una célula T en un individuo.

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47. El uso de la reivindicación 46, en donde el ácido nucleico que codifica al antígeno y el ácido nucleico que codifica al anticuerpo para enlazamiento de 4-1BB están en la misma molécula de ácido nucleico.

48. El uso de la reivindicación 46, en donde el ácido nucleico que codifica al antígeno o el anticuerpo para enlazamiento de 4-1BB es transfectado o transducido en una célula, en donde la célula es una célula, o una progenie de una célula, que antes de la transfección o de la transducción, fue obtenido a partir de un mamífero.

49. El uso de acuerdo a cualquiera de la reivindicación 26 a 48, en donde el anticuerpo es un fragmento para enlazamiento del antígeno, especialmente Fab, F(ab')_{2}, Fv o un fragmento de Fv de cadena sencilla.

50. Un método in vitro para activar una célula T, comprendiendo el método cultivar una muestra de células que contiene una célula T con un antígeno para la cual es específico un receptor de células T y un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB.

51. Un método in vitro para prevenir la inducción de anergia o de revertir anergia en una célula T, comprendiendo el método poner en contacto a la célula T con:

(a)

un antígeno para el cual es específico un receptor de células T; y

(b)

un anticuerpo agonístico para enlazamiento de 4-1BB.

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52. El método de la reivindicación 51, en donde el antígeno es (a) un antígeno asociado a un tumor (TAA) o (b) un fragmento funcional de un TAA.

53. El método de la reivindicación 51, en donde el antígeno es un polipéptido.

54. El método de la reivindicación 52, en donde el TAA es una molécula producida por una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste de una leucemia, un linfoma, un cáncer neurológico, un melanoma, un cáncer de seno, un cáncer de pulmón, un cáncer de cabeza y de cuello, un cáncer gastrointestinal, un cáncer de hígado, un cáncer pancreático, un cáncer genitourinario, un cáncer de próstata, un cáncer de células renales, un cáncer óseo, y una célula de cáncer vascular.

55. El método de la reivindicación 51, en donde el antígeno es una molécula producida por un microorganismo infeccioso.

56. El método de la reivindicación 55, en donde el microorganismo infeccioso es un virus.

57. El método de la reivindicación 56, en donde el virus es un retrovirus.

58. El método de la reivindicación 55, en donde el microorganismo infeccioso se selecciona del grupo que consiste de una bacteria, un hongo, y un parásito protozoario.

59. El método de la reivindicación 51, en donde el método comprende poner en contacto a la célula T con una célula dendrítica que comprende una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con un epítopo de péptido enlazado a la misma, en done el epítopo de péptido es un fragmento de un TAA o un fragmento de un polipéptido producido por un microorganismo infeccioso.

60. El método de la reivindicación 59, en donde la molécula del MHC es una molécula clase I del MHC.

61. El método de la reivindicación 59, en donde la molécula del MHC es una molécula clase II del MHC.

62. El método de la reivindicación 51, en donde la célula T es una célula T CD8+.

63. El método de la reivindicación 51, en donde la célula T es una célula T CD4+.

64. El método de la reivindicación 51, en donde el método comprende poner en contacto a la célula T con una célula híbrida.

65. El método de la reivindicación 64, en donde la célula híbrida es un producto de fusión de una célula tumoral y una célula dendrítica.

66. El método de la reivindicación 51, en donde el método comprende poner en contacto a la célula T con una célula tumoral, un lisado de célula tumoral, un TAA, un epítopo de péptido de un TAA, o una proteína de choque térmico enlazada a un epítopo de péptido de proteína expresada por una célula tumoral.

67. El método de la reivindicación 51, en donde el método comprende poner en contacto a la célula T con una célula dendrítica que ha sido incubada con células tumorales, un lisado de células tumorales, un TAA, un epítopo de péptido de un TAA, o una proteína de choque térmico enlazada a un epítopo de péptido de proteína expresada por una célula tumoral.

68. El método de la reivindicación 66, en donde la célula tumoral es transfectada con o transformada con un ácido nucleico que codifica a una citoquina o a un factor de crecimiento.

69. El método de la reivindicación 67, en donde la citoquina es un factor estimulador de colonias de macrófago y granulocitos (GM-CSF).

70. El método de acuerdo a cualquiera de la reivindicación 50 a 69, en donde el anticuerpo es un fragmento para enlazamiento del antígeno, especialmente Fab, F(ab')_{2}, Fv o un fragmento de Fv de cadena sencilla.