ES2629683T3 - B7-H1, una nueva molécula inmunorreguladora - Google Patents

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ES2629683T3 ES00983821.0T ES00983821T ES2629683T3 ES 2629683 T3 ES2629683 T3 ES 2629683T3 ES 00983821 T ES00983821 T ES 00983821T ES 2629683 T3 ES2629683 T3 ES 2629683T3
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Abstract

Un polipéptido aislado, en donde el polipéptido consiste en el resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 aminoácidos, en el resto de 290 de aminoácidos expuesto en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

Description

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DESCRIPCION
B7-H1, una nueva molecula inmunorreguladora.
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente de EE. UU. N.° 09/451.291 presentada el 30 de noviembre de 1999 y de la solicitud de patente de EE. UU. N.° 09/649.108 presentada el 28 de agosto de 2000.
Antecedentes de la invencion
La invencion esta, en general, en el campo de la inmunorregulacion, y concretamente la regulacion de la respuesta de celulas T.
Los linfocitos T de mairnferos reconocen peptidos antfgenos unidos a moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de las celulas presentadoras de antfgeno (APC). Los peptidos antigenos se generan por degradacion proteolftica de antigenos proteicos dentro de las APC. La interaccion de las celulas T con la APC y la subsiguiente respuesta de las celulas T son reguladas cualitativa y cuantitativamente por interacciones entre los receptores de la superficie celular de las celulas T tanto con mediadores solubles como con ligandos en la superficie de APC.
Los documentos post-publicados WO 01/14556 A1 y WO 01/14557 A1 describen moleculas de acido nucleico aisladas, moleculas de acido nucleico designadas B7-4, que codifican polipeptidos B7-4. Los polipeptidos B7-4 corresponden a polipeptidos B7-H1 de la presente invencion.
Sumario de la invencion
La invencion se basa en la clonacion de moleculas de ADNc humano y de raton que codifican nuevas moleculas homologas que coestimulan las respuestas de celulas T de ambas especies y sobre la caracterizacion funcional de los polipeptidos que codifican las moleculas de ADNc. El polipeptido humano se denomina hB7-H1 y el polipeptido de raton mB7-H1. El texto que hace referencia a B7-H1 sin especificar humano frente a raton se corresponde con ambas formas de B7-H1. La invencion presenta polipeptidos hB7-H1, mB7-H1, fragmentos funcionales de los polipeptidos y protemas de fusion que contienen los polipeptidos. Tambien se incluye en la invencion un anticuerpo que se une a un polipeptido B7-H1. La invencion presenta procedimientos in vitro de coestimular las respuestas de celulas T, procedimientos de cribado para compuestos que inhiben o potencian las respuestas de celulas T, y procedimientos in vitro para inhibir un efecto coestimulador de hB7-H1. Ademas, la invencion presenta el polipeptido segun la invencion para su uso como medicamento, un acido nucleico que codifica ese polipeptido para su uso como medicamento y una celula recombinante para su uso como medicamento asf como el uso de una solucion o un soporte solido que comprende el polipeptido segun la invencion en un tratamiento ex vivo de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC).
La invencion tambien incorpora un polipeptido B7-H1 aislado para uso como un medicamento cuyo polipeptido esta codificado por un ADN que incluye una secuencia de acido nucleico que (i) codifica un polipeptido con la capacidad de coestimular una celula T y (ii) hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de una secuencia que codifica un polipeptido con una secuencia de aminoacidos con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. El polipeptido B7-H1 puede incluir una secuencia amino de un resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 aminoacidos, en el resto de 290 aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. La invencion tambien abarca polipeptidos B7-H1 que incluyen una secuencia de aminoacidos con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o cualquiera de estas secuencias de aminoacidos, pero que difieren unicamente en una o mas sustituciones conservadoras. Los polipeptidos de la invencion incluyen protemas de fusion que contienen un primer dominio y al menos un dominio adicional. El primer dominio puede ser cualquiera de los polipeptidos B7-H1 descritos anteriormente o un fragmento funcional de cualquiera de estos polipeptidos. El al menos un dominio adicional puede ser una secuencia dirigida heterologa o lfder, una secuencia de aminoacidos que facilita la purificacion, deteccion o solubilidad de la protema de fusion. El segundo dominio puede ser, por ejemplo, todo o parte de una region constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig). Tambien se incluyen moleculas de acido nucleico aisladas que codifican las protemas de fusion.
Otra realizacion de la invencion es un procedimiento de coestimular una celula T que implica poner en contacto la celula T con cualquiera de los polipeptidos B7-H1 de la invencion, fragmentos funcionales de los mismos o protemas de fusion de la invencion; estas 3 clases de moleculas se denominan, por comodidad, "agentes B7-H1". El contacto puede ser mediante el cultivo de cualquiera de estos agentes B7-H1 con la celula T in vitro. Otra realizacion de la invencion es una celula recombinante para uso como un medicamento cuya celula recombinante es la progenie de una celula obtenida de un marnffero y que ha sido transfectada o transformada ex vivo con un acido nucleico que codifica cualquiera de los agentes B7-H1 de modo que la celula expresa el agente B7-H1. La celula puede ser una celula presentadora de antfgeno (APC) que expresa el agente B7-H1 en su superficie. Ademas, la APC puede ser pulsada con un antfgeno o un peptido antfgeno. Se puede sospechar que el marnffero tiene, por ejemplo, una enfermedad de inmunodeficiencia, un estado inflamatorio o una enfermedad autoinmune. Ademas, la celula T puede ser una celula T auxiliar, p. ej., una celula T que ayuda a una respuesta efectora (p. ej., un linfocito T citotoxico (CTL) o anticuerpo de celula B). Una respuesta de anticuerpo puede ser, por ejemplo, una respuesta de anticuerpo IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE o IgA. La coestimulacion de una celula T por cualquiera de los agentes B7-H1
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puede dar como resultado un aumento en el nivel de ligando CD40 en la superficie de la celula T.
La invencion incluye un procedimiento para identificar un compuesto que inhibe una respuesta inmune. El
procedimiento implica: proporcionar un compuesto de ensayo; cultivar juntos el compuesto, uno o mas agentes de
los B7-H1, una celula T y un estimulo activador de celulas T; y determinar si el compuesto de ensayo inhibe la respuesta de la celula T al estimulo, como una indicacion de que el compuesto de prueba inhibe una respuesta inmune. La invencion tambien incorpora un procedimiento para identificar un compuesto que potencia una respuesta inmune. El procedimiento implica: proporcionar un compuesto de ensayo; cultivar, juntos, el compuesto, uno o mas de los agentes B7-H1, una celula T y un estimulo activador de celulas T; y determinar si el compuesto de ensayo potencia la respuesta de la celula T al estimulo, como una indicacion de que el compuesto de ensayo potencia una respuesta inmune. En ambos de estos procedimientos, el estimulo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un receptor de celulas T o a un polipeptido CD3. Alternativamente, el estimulo puede ser un aloantfgeno o un peptido antigeno unido a una molecula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de una celula presentadora de antigeno (APC). La APC puede ser transfectada o transformada con un acido nucleico codificante del agente B7-H1 y el agente B7-H1 puede expresarse en la superficie de la APC.
La invencion tambien presenta un antisuero que comprende un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo policlonal o
monoclonal) que se une espedficamente a un polipeptido con la SEQ ID NO: 1.
"Polipeptido" y "protema" se usan indistintamente y significan cualquier cadena de aminoacidos enlazada a peptidos, independientemente de la longitud o de la modificacion postraduccional. La invencion tambien presenta polipeptidos B7-Hl con sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras incluyen tfpicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; acido aspartico y acido glutamico; asparagina, glutamina, serina y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina.
La expresion polipeptido o fragmento peptfdico "aislado" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un polipeptido o un fragmento peptfdico que o bien no tiene una contrapartida natural (p. ej., un peptidomimetico), o se ha separado o purificado de componentes que lo acompanan de forma natural, p. ej., en tejidos tales como pancreas, fngado, bazo, ovario, testmulo, musculo, tejido articular, tejido neuronal, tejido gastrointestinal o fluidos corporales tales como sangre, suero u orina. Tfpicamente, el polipeptido o fragmento peptfdico se considera "aislado" cuando esta al menos 70 %, en peso en seco, exento de las protemas y de las moleculas organicas de origen natural con las que se asocia de forma natural. Preferiblemente, una preparacion de un polipeptido (o fragmento peptfdico del mismo) de la invencion es al menos 80 %, mas preferiblemente al menos 90 %, y lo mas preferiblemente al menos 99 %, en peso seco, el polipeptido (o un fragmento peptfdico del mismo), respectivamente, de la invencion. Asf, por ejemplo, una preparacion de polipeptido x es al menos un 80 %, mas preferiblemente al menos un 90 %, y lo mas preferiblemente al menos un 99 %, en peso seco, polipeptido x. Dado que un polipeptido que es qmmicamente sintetizado esta, por su naturaleza, separado de los componentes que lo acompanan, de forma natural, el polipeptido sintetico o acido nucleico esta "aislado".
Un polipeptido aislado (o fragmento peptfdico) de la invencion puede obtenerse, por ejemplo, por extraccion de una fuente natural (p. ej., de tejidos humanos o fluidos corporales); por expresion de un acido nucleico recombinante que codifica el peptido; o por smtesis qrnmica. Un peptido que se produce en un sistema celular diferente de la fuente de la que se origina de forma natural esta "aislado", porque se separara de los componentes que de forma natural lo acompanan. El grado de aislamiento o pureza se puede medir por cualquier procedimiento apropiado, p. ej., cromatograffa en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o analisis por HPLC.
Un "ADN aislado" significa ADN exento de uno o ambos de los genes que flanquean el gen que contiene el ADN de interes en el genoma del organismo en el que se produce de forma natural el gen que contiene el ADN de interes. Por lo tanto, el termino incluye un ADN recombinante incorporado en un vector, en un plasmido o virus de replicacion autonoma, o en el ADN genomico de un procariota o eucariota. Tambien incluye una molecula separada tal como: un ADNc donde el ADN genomico correspondiente tiene intrones y, por lo tanto, una secuencia diferente; un fragmento genomico; un fragmento producido por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR); un fragmento de restriccion; un ADN que codifica una protema no se produce de forma natural, una protema de fusion o un fragmento de una protema dada; o un acido nucleico que es una variante degenerada de un acido nucleico que se produce de forma natural. Ademas, incluye una secuencia de nucleotidos recombinante que es parte de un gen fnbrido, es decir, un gen que codifica una protema de fusion. Tambien se incluye un ADN recombinante que incluye una porcion de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. De lo anterior sera evidente que el ADN aislado no significa un ADN presente de cientos a millones de otras moleculas de ADN dentro, por ejemplo, de bibliotecas de ADNc o de ADN genomico o de digestiones de restriccion de ADN genomico en, por ejemplo, una mezcla de reaccion de digestion de restriccion o una rebanada de gel electroforetico.
Tal como se usa en el presente documento, un polipeptido que "coestimula" una celula T es un polipeptido que, tras la interaccion con una molecula de superficie celular en la celula T, potencia la respuesta de la celula T. La respuesta de las celulas T que resulta de la interaccion sera mayor que la respuesta en ausencia del polipeptido. La respuesta de la celula T en ausencia del polipeptido coestimulador puede ser ninguna respuesta o puede ser una respuesta significativamente menor que en presencia del polipeptido coestimulador. Se entiende que la respuesta de la celula T puede ser una respuesta efectora (por ejemplo cTl o celula B productora de anticuerpo), una respuesta
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auxiliar que proporciona ayuda a una o mas respuestas efectoras (p. ej., CTL o celulas B productoras de anticuerpos) o una respuesta supresora.
Tal como se usa en el presente documento, un "estimulo activador" es una molecula que suministra una senal activadora a una celula T, preferiblemente a traves del receptor de celulas T espedfico del antigeno (TCR). El estimulo activador puede ser suficiente para provocar una respuesta detectable en la celula T. Alternativamente, la celula T puede requerir coestimulacion (p. ej., mediante un polipeptido B7-H1) con el fin de responder detectablemente al estfmulo activador. Ejemplos de estfmulos activadores incluyen, sin limitacion, anticuerpos que se unen al TCR o a un polipeptido del complejo CD3 que esta ffsicamente asociado con el TCR sobre la superficie de las celulas T, aloantigenos o un peptido antigeno unido a una molecula del MHC.
Tal como se usa en el presente documento, un "fragmento" de un polipeptido B7-H1 es un fragmento del polipeptido que es mas corto que el polipeptido de longitud completa. En general, los fragmentos tendran cinco o mas aminoacidos de longitud. Un fragmento antfgeno tiene la capacidad de ser reconocido y unido por un anticuerpo.
Tal como se usa en el presente documento, un "fragmento funcional" de un polipeptido B7-H1 es un fragmento del polipeptido que es mas corto que el polipeptido de longitud completa y tiene la capacidad de coestimular una celula T. Los procedimientos para establecer si un fragmento de una molecula B7-H1 es funcional son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los fragmentos de interes pueden hacerse mediante procedimientos recombinantes, sinteticos o digestivos proteoltticos. Tales fragmentos pueden despues ser aislados y ensayados para determinar su capacidad para coestimular celulas T mediante procedimientos descritos en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "ligado operativamente" significa incorporado en un constructo genetico de manera que las secuencias de control de expresion controlan eficazmente la expresion de una secuencia que codifica interes.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “anticuerpo” se refiere no solo a moleculas de anticuerpo enteras, sino tambien a fragmentos de union a antfgenos, p. ej., Fab, F(ab')2, Fv y fragmentos Fv de cadena sencilla. Tambien se incluyen anticuerpos quimericos.
Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une espedficamente" a un polipeptido B7-H1 aislado codificado por un ADN que incluye una secuencia de acido nucleico que (i) codifica un polipeptido con la capacidad de coestimular una celula T y (ii) hibrida bajo condiciones rigurosas al complemento de una secuencia que codifica un polipeptido con una secuencia de aminoacidos con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, es un anticuerpo que no se une a polipeptidos B7-1 o B7-2.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comunmente entiende un experto corriente en la tecnica a la que pertenece esta invencion. En caso de conflicto, el presente documento, incluidas las definiciones, prevalecera. Los procedimientos y materiales preferidos se describen a continuacion, aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o ensayo de la presente invencion.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion, p. ej., potenciar las respuestas inmunitarias en sujetos marnfferos, seran evidentes a partir de la descripcion siguiente, de los dibujos y de las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 es una representacion de la secuencia de nucleotidos de un fragmento de ADNc (SEQ ID NO: 5) que incluye la secuencia codificante (nucleotidos 73-942 de SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 2) de hB7-Hl.
La Fig. 2a es una representacion de la secuencia de aminoacidos de hB7-H1 (SEQ ID NO: 1). Se indican el peptido senal, el dominio similar a Ig-V, el dominio similar a Ig-C y el dominio transmembrana ("TM"). Los sitios potenciales de glicosilacion ligados a N estan indicados por *.
La Fig. 2b es una representacion de las secuencias de aminoacidos de los dominios extracelulares de hB7-H1 (SEQ ID NO: 10), B7-1 humano (hB7-1; SEQ ID NO: 11) y B7-2 humano (hB7-2; SEQ ID NO: 12) alineados para obtener la maxima homologfa. Los restos de aminoacidos identicos estan sombreados en negrita y los restos conservados estan en cajas. Los restos de cistema conservados se indican con *.
La Fig. 3 es una fotograffa de una transferencia de Northern que muestra la expresion del ARNm de hB7-H1 en diversos tejidos humanos.
La Fig. 4 es una serie de histogramas de citometna de flujo con fluorescencia bidimensionales que muestran la expresion en la superficie celular de hB7-H1 sobre celulas T CD3+ en reposo y activadas, celulas B CD19+ y monocitos CD14+.
La Fig. 5a es una serie de histogramas de citometna de flujo con fluorescencia que muestran la union de CTLA-4Ig, ICOSIg y anticuerpo espedfico para hB7-H1 para las celulas 293 transfectadas bien con un vector de control (celulas "Mock (simuladas)/293") o bien con un vector que contiene un inserto de ADNc que codifica hB7-H1 (celulas
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"hB7-H1/293") o celulas Raji.
La Fig. 5b es una serie de histogramas de citometna de flujo con fluorescencia que muestran la union de hB7-H1Ig y anticuerpo a CD28 a celulas Jurkat.
La Fig. 6a es un grafico de lmeas que muestra la capacidad de hB7-H1Ig inmovilizada para coestimular la respuesta proliferativa de celulas T humanas a anticuerpos inmovilizados espedficos para CD3 humano.
La Fig. 6b es un grafico de lmeas que muestra la capacidad de hB7-H1Ig soluble para coestimular la respuesta proliferativa de celulas T humanas a PBMC alogenicas irradiadas.
Las Fig. 7a-7d son una serie de graficos de lmeas que muestran la capacidad de hB7-H1Ig, B7-1Ig humano o anticuerpo espedfico para CD28 humano para coestimular la produccion de interleucina(IL)-10 (Fig. 7a), interferon-y (IFN-y) (Fig. 7b), IL-2 (Fig. 7c) o IL-4 (Fig. 7d) por celulas T humanas que responden a anticuerpos inmovilizados espedfico para CD3. La Fig. 7e es un grafico de lmeas que muestra la capacidad de diversas concentraciones de hB7-H1Ig para coestimular la produccion de IL-2 por celulas T humanas que responden a anticuerpos inmovilizados espedficos para CD3.
La Fig. 8a es un grafico de barras que muestra la capacidad del anticuerpo espedfico para IL-2 humana para inhibir la proliferacion de celulas T humanas inducidas por el anticuerpo espedfico para CD3 humano y coestimulado por celulas COS transfectadas con, y que expresan, hB7-H1 o B7-1.
La Fig. 8b es un grafico de barras que muestra la capacidad del anticuerpo espedfico para IL-2 humana para inhibir la produccion de IL-10 por celulas T humanas estimuladas por anticuerpo inmovilizado espedfico para cD3 humano y coestimulado bien por hB7-H1Ig o bien por B7-1Ig.
La Fig. 9a es una serie de perfiles bidimensionales de citometna de flujo con fluorescencia que muestran la proporcion relativa de celulas T en apoptosis temprana (anexina V positiva, yoduro de propidio (IP) negativo) y tardfa (anexina V positiva, IP positivo) despues de la activacion por anticuerpo inmovilizado espedfico para CD3 humano y coestimulacion con Ig de control o hB7-H1Ig.
La Fig. 9b es una serie de perfiles de citometna de flujo con fluorescencia que muestran la expresion de Fas y FasL en celulas T humanas tras la activacion por anticuerpos inmovilizados espedficos para CD3 humano y coestimulacion con Ig de control o hB7-H1Ig.
La Fig. 10 es una representacion de la secuencia de nucleotidos del ADNc que codifica mB7-H1 (SEQ ID NO: 4).
La Fig. 11 es una representacion de la secuencia de aminoacidos de mB7-H1 (SEQ ID NO: 3).
La Fig. 12a es una representacion de la secuencia de aminoacidos de mB7-H1 (SEQ ID NO: 3) alineada con la secuencia de aminoacidos de hB7-H1 (SEQ ID NO: 1). Se indican el peptido senal, el dominio similar a IgV, el dominio similar a IgC, el dominio transmembrana ("TM") y el dominio citoplasmatico ("citoplasmatico") de mB7-H1.
La Fig. 12b es una representacion de las secuencias de aminoacidos de mB7-H1, B7-1 de raton (mB7-1; SEQ ID NO: 13), B7-2 de raton (mB7-2: SEQ ID NO: 14) y mB7h/B7KF-1 (SEQ ID NO: 15) alineados para maxima homologfa. Los restos de aminoacidos identicos estan sombreados y los restos de aminoacidos conservados estan en cajas. Los restos de cistema conservados se indican con *.
La Fig. 13 es una serie de histogramas de citometna de flujo con fluorescencia que muestran niveles relativos de expresion en la superficie celular de mB7-H1 sobre celulas T CD3+ de raton en reposo y activadas, celulas B B220+ de raton y macrofagos Mac-1+ de raton.
La Fig. 14a es un grafico de lmeas que muestra la capacidad de varias concentraciones de mB7-H1Ig inmovilizada o Ig de control inmovilizada para coestimular la respuesta proliferativa in vitro de celulas T de raton a una dosis suboptima de anticuerpo inmovilizado espedfico para CD3 de raton.
La Fig. 14b es un par de graficos de lmeas que muestran la capacidad de mB7-H1Ig inmovilizada, Ig de control inmovilizada o anticuerpo soluble espedfico de CD28 de raton para coestimular la respuesta proliferativa in vitro del raton C57BL/6 de tipo salvaje ("wt") (grafico de la izquierda) o las celulas T de raton C57BL/6 deficientes en CD28 (CD28'/'") (grafico de la derecha) para dos dosis suboptimas de anticuerpo inmovilizado espedfico de CD3 de raton.
La Fig. 14c es un grafico de barras que muestra la capacidad de mB7-H1Ig inmovilizado o de Ig de control inmovilizada para coestimular la respuesta proliferativa in vitro de celulas T de raton CD4+ o CD8+ purificadas a una dosis suboptima de anticuerpo inmovilizado espedfico de CD3 de raton.
La Fig. 15a es una serie de graficos de lmeas que muestran la capacidad de mB7-H1Ig inmovilizada, de Ig de control inmovilizada o de anticuerpo soluble espedfico de CD28 de raton ("Anti-CD28") para coestimular la produccion in vitro (en los dfas uno, dos y tres despues del inicio de los cultivos) de diversas citocinas mediante celulas T C57BL/6 de raton en respuesta al anticuerpo inmovilizado espedfico para CD3 de raton.
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La Fig. 15b es un grafico de lmeas que muestra el efecto de mB7-H1Ig inmovilizada en la produccion in vitro (18, 24, 36 y 48 horas despues del inicio de los cultivos) de IL-2 mediante celulas T C57BL/6 de raton que responden al anticuerpo inmovilizado espedfico del CD3 de raton y coestimulado mediante anticuerpo soluble espedfico de CD28 ("Anti-CD28") de raton.
La Fig. 16a y la Fig. 16b son histogramas de citometna de flujo con fluorescencia que muestran falta de expresion en la superficie de B7-1 murino (Fig. 16a) y mB7-H1 (Fig. 16b) sobre celulas P815 transfectadas con un vector de expresion de control ("mock.P815").
La Fig. 17a y la Fig. 17b son histogramas de citometna de flujo con fluorescencia que muestran la expresion en la superficie de B7-1 murino (Fig. 17a) y falta de expresion en la superficie de mB7-H1 (Fig. 17b) sobre celulas P815 transfectadas con un vector de expresion que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica B7-1 ("mB7-1 + P815").
La Fig. 18a y la Fig. 18b son histogramas de citometna de flujo con fluorescencia que muestran falta de expresion en la superficie de mB7-1 (Fig. 18a) y que muestran la expresion en la superficie de mB7-H1 (Fig. 18b) sobre celulas P815 transfectadas con un vector de expresion que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica mB7-H1 ("mB7-H1+ P815").
La Fig. 19a y la Fig. 19b son graficos de lmeas que muestran la velocidad de crecimiento de tumores P815 en ratones DBA/2 inyectados subcutaneamente con celulas P815 transfectadas con un vector de expresion control (Fig. 19a) o un vector de expresion que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica mB7-H1 (Fig. 19b).
La Fig. 20a es un par de graficos de lmeas que muestran la capacidad de las celulas P815 de control simuladamente transfectadas ("mock.P815"), celulas P815 transfectadas con un vector de expresion que contiene una secuencia de ADNc que codifica mB7-H1 ("mB7-H1+ P815") o celulas P815 transfectadas con un vector de expresion que contiene una secuencia de ADNc que codifica mB7-1 ("mB7-1+ P815") para activar CTL de raton C57BL/6 aloespedfico in vitro. Las poblaciones de celulas efectoras se ensayaron para determinar la actividad citotoxica (" % de Lisis") para diversas relaciones de celulas efectoras frente a celulas diana (E/T) contra las celulas diana P815 de tipo salvaje (grafico a la izquierda) y EL4 de control (grafico a la derecha).
La Fig. 20b es un par de graficos de lmeas que muestran la capacidad de las celulas P815 de control transfectadas con testigo ("mock. P815"), celulas P815 transfectadas con un vector de expresion que contiene una secuencia de ADNc que codifica mB7-H1 ("mB7-H1+ P815") o celulas P815 transfectadas con un vector de expresion que contiene una secuencia de ADNc que codifica mB7-1 ("mB7-1+ P815") para activar CTL de raton DBA/2 espedfico de tumor in vivo. Las poblaciones de celulas efectoras se ensayaron para determinar la actividad citotoxica (" % de Lisis") para diversas relaciones E/T frente a las celulas diana de P815 de tipo salvaje (a la izquierda del grafico) y de control L1210 (a la derecha del grafico).
La Fig. 21 es un par de graficos de lmeas que muestran las respuestas proliferativas in vitro a diversas concentraciones de hemocianina de lapa californiana (KLH) de drenaje de celulas T de nodulo linfatico (grafico a la izquierda) o bazo (grafico a la derecha) de C57BL/6 inmunizadas intraperitonealmente (i.p.) con trinitrofenol (TNP) conjugado con KLH (TNP-KLH) en adyuvante de Freund incompleto y posteriormente inyectado i.p. con mB7-H1Ig o Ig de control.
La Fig. 22 es una serie de graficos de barras que muestran los niveles relativos (medidos por ELISA) de anticuerpos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgM espedficos para TNP en los sueros de ratones C57BL/6 inyectados i.p. con TNP- KLH en solucion salina tamponada con fosfato y o bien Ig de control, mB7-H1Ig o bien mB7-1Ig.
La Fig. 23a es una serie de histogramas de citometna de flujo con fluorescencia que muestran los niveles relativos de expresion en la superficie celular del ligando CD40 (CD40L) (medida por la union de un anticuerpo espedfico para CD40L de raton ("anti-CD40L")) sobre celulas T CD4+ de raton purificadas (a 4 y 24 horas despues del inicio de los cultivos) activadas por anticuerpo inmovilizado espedfico para CD3 ("anti-CD3")) de raton revestido sobre los fondos de los pocillos de cultivo de tejidos a una concentracion de 200 ng/ml y coestimulado por Ig de control inmovilizada, mB7-H1Ig inmovilizada, o anticuerpo soluble espedfico para CD28 ("anti-CD28") de raton.
La Fig. 23b es una serie de histogramas de citometna de flujo con fluorescencia que muestran los niveles relativos de expresion de la superficie celular del ligando CD40 (CD40L) (medida por la union de un anticuerpo espedfico para CD40L ("anti-CD40L") de raton sobre celulas T CD4+ purificadas (a 4 y 24 horas despues del inicio de los cultivos) activado por anticuerpo inmovilizado espedfico para CD3 de raton ("anti-CD3") revestido sobre los fondos de los pocillos de cultivo de tejidos a una concentracion de 1.000 ng/ml y coestimulado por Ig de control inmovilizada, mB7-H1Ig inmovilizada, o anticuerpo soluble espedfico para CD28 de raton ("anti-CD28").
Descripcion detallada
Utilizando cebadores de PCR con secuencias derivadas de una etiqueta de secuencia expresada (EST) que tema una homologfa significativa con B7-1 y B7-2 humana y una biblioteca de ADNc humano como una fuente de molde, se identificaron secuencias de ADNc correspondientes a regiones de un transcrito 5' y 3' de la EST. A continuacion
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se genera una molecula de ADNc (SEQ ID NO: 5) que inclma un marco de lectura abierto (ORF, en ingles) (SEQ ID NO: 2) que codifica una nueva molecula relacionada con B7 usando cebadores de PCR con secuencias derivadas de los extremos 3' y 5' y se clono.
La traduccion de la secuencia de ADNc indico que el polipeptido (SEQ ID NO: 1) que codifico (hB7-H1) es una protema transmembrana de tipo I de 290 aminoacidos que contiene un dominio similar a inmunoglobulina (Ig) V, un dominio similar a Ig C, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmatico de 30 aminoacidos. El analisis de transferencia Northern mostro una fuerte expresion del gen que codifica hB7-H1 en corazon, musculo esqueletico, placenta y pulmon, y una expresion debil en timo, bazo, rinon e tugado. La expresion era indetectable en cerebro, colon, intestino delgado y celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC).
Utilizando un antisuero producido por inmunizacion de ratones con una protema de fusion producida de forma recombinante que inclma la protema hB7-H1, la expresion por citometna de flujo con fluorescencia indico una expresion despreciable en celulas T y B en reposo. Por otra parte, aproximadamente 16 % de los monocitos CD14+ expresaron constitutivamente la molecula en su superficie. La activacion de las celulas T aumento la expresion de tal manera que aproximadamente el 30 % expresaron la hB7-H1 en la superficie celular. La activacion dio como resultado aproximadamente 90 % de los monocitos que expresan hB7-1H, pero solo aproximadamente el 6 % de celulas B lo expresaban despues de la activacion.
La transfeccion de celulas 293 dio como resultado una lmea celular que expresaba hB7-H1 (hB7-H1/293) que se uso para experimentos de union. Estos experimentos y otros con una lmea de celulas que expresan CD28 indicaron que ni CTLA4, ICOS, ni CD28 eran receptores para hB7-H1.
Los experimentos in vitro con celulas T humanas aisladas y la protema de fusion que contiene hB7-H1 indicaron que hB7-Hl no tema actividad directa sobre las celulas T, potencio ("coestimulo") las respuestas proliferativas de celulas T inducidas por ambos anticuerpos espedficos para los aloantfgenos de CD3 y MHC humanos. Esta actividad coestimuladora fue significativamente mas potente cuando el hB7-H1 se inmovilizo en los pocillos de plastico de cultivo de tejido utilizados para los cultivos que cuando lo estaba en forma de solucion. Experimentos similares indicaron que hB7-H1 tema un efecto potenciador drastico y selectivo en la produccion de interleucina(IL)-10 inducida por la activacion de celulas T. Ademas, esta actividad de potenciacion de IL-10 pareda depender de al menos pequenas cantidades de IL-2. El analisis de celulas T activadas por anticuerpo anti-CD3 y hB7-H1Ig indico que hB7-H1 mejora la apoptosis y la expresion de Fas y FasL.
Ademas, utilizando una estrategia similar a la usada para clonar ADNc de hB7-H1, se clono una molecula de ADNc que contema un ORF que codifica el B7-H1 de raton (mB7-H1), se obtuvo la secuencia de nucleotidos del ORF (SEQ ID NO: 4), y se derivo la secuencia de aminoacidos de la secuencia codificada (SEQ ID NO: 3). La mB7-H1 es exactamente de la misma longitud (290 aminoacidos) y tiene la misma estructura de dominio que hB7-H1. Ademas, mB7-H1 tiene una distribucion de tejido similar a hB7-Hl. La mB7-H1 co-estimulo la respuesta de celulas T de raton con su efecto que era mas potente sobre CD4+ que sobre celulas T CD8+. Ademas, al igual que hB7-H1, mB7-H1 coestimula la produccion de altos niveles de IL-10 mediante celulas T. La mB7-H1 tambien potencio la produccion tanto de interferon-y (IFN-y) como el factor estimulante de colonias de macrofagos de granulocitos (GM-CSF) mediante celulas T. Aunque mB7-H1 no mostro capacidad significativa para potenciar las respuestas de CTL, aumento en gran medida las respuestas de anticuerpos y, en particular, las respuestas de anticuerpo IgG2a. Por ultimo, la coestimulacion de las celulas T con mB7-H1 causo un aumento en el nivel de ligando CD40 (CD40L) sobre la superficie de las celulas T.
La B7-H1 puede ser util como un aumentador de las respuestas inmunitarias (p. ej., respuestas de celula T auxiliar y de anticuerpo) tanto in vivo como in vitro. Ademas, a la vista de (a) su capacidad para potenciar selectivamente la produccion de IL-10, (b) su capacidad para potenciar la apoptosis, y (c) su expresion en placenta y en pulmon, ambos organos normalmente protegidos de respuestas innecesarias inmunitarias e inflamatorias mediadas por celulas, la B7-H1 puede ser util en el control de estados patologicos mediados por celulas (p. ej., los inducidos por agentes infecciosos tales como Mycobacterium tuberculosis o M. leprae) u otras respuestas patologicas mediadas por celulas tales como las implicadas en enfermedades autoinmunes (p. ej., artritis reumatoides (RA), esclerosis multiple (MS) o diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM)).
Moleculas de acido nucleico B7-H1
Las moleculas de acido nucleico B7-H1 de la invencion pueden ser ADNc, ADN genomico, ADN sintetico, o ARN, y pueden ser de cadena doble o de una sola cadena (es decir, una cadena sentido o una antisentido). Los segmentos de estas moleculas tambien se consideran dentro del alcance de la invencion y pueden ser producidos, por ejemplo, por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o ser generados por tratamiento con una o mas endonucleasas de restriccion. Una molecula de acido ribonucleico (ARN) puede ser producida por transcripcion in vitro. Preferiblemente, las moleculas de acido nucleico codifican polipeptidos que, independientemente de su longitud, son solubles en condiciones fisiologicas normales. De forma natural, las formas de membrana no senan solubles.
Las moleculas de acido nucleico de la invencion pueden contener secuencias que aparecen de forma natural o secuencias que difieren de las que aparecen de forma natural, pero, debido a la degeneracion del codigo genetico,
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codifican el mismo polipeptido (por ejemplo, los polipeptidos con SEQ ID NOS: 1 y 3). Ademas, estas moleculas de acido nucleico no estan limitadas a secuencias codificantes, p. ej., pueden incluir algunas o todas las secuencias no codificantes que se encuentran aguas arriba o aguas abajo de una secuencia codificante. Incluyen, por ejemplo, la molecula de acido nucleico con SEQ ID NO: 5.
Las moleculas de acido nucleico de la invencion se pueden sintetizar (por ejemplo, mediante smtesis basada en fosforamidita) u obtenidas a partir de una celula biologica, tal como la celula de un mairnfero. As^ los acidos nucleicos pueden ser los de un humano, primate no humano (p. ej., mono), raton, rata, conejillo de indias, vaca, oveja, caballo, cerdo, conejo, perro o gato.
Ademas, las moleculas de acido nucleico de la invencion aisladas abarcan segmentos que no se encuentran como tales en el estado natural. Asf, la invencion abarca moleculas de acido nucleico recombinante (por ejemplo, moleculas de acido nucleico aisladas que codifican hB7-H1 o mB7-H1) incorporadas en un vector (por ejemplo, un plasmido o un vector vmco) o en el genoma de una celula heterologa (o en el genoma de una celula homologa, en una posicion distinta de la localizacion cromosomica natural). Las moleculas de acido nucleico recombinante y sus usos se comentan adicionalmente mas adelante.
Ciertas moleculas de acido nucleico de la invencion son moleculas antisentido o son transcritas en moleculas antisentido. Estas pueden usarse, por ejemplo, para regular a la baja la traduccion del ARNm B7-H1 dentro de una celula.
Las tecnicas asociadas con la deteccion o regulacion de genes son bien conocidas por los expertos en la tecnica y dichas tecnicas pueden usarse para diagnosticar y/o tratar trastornos asociados con la expresion aberrante de B7- H1. Las moleculas de acido nucleico de la invencion se comentan mas adelante en el contexto de su utilidad terapeutica.
Se puede identificar un gen o protema de la familia B7-H1 basado en su similitud con el gen o protema B7-H1 correspondiente, respectivamente. Por ejemplo, la identificacion se puede basar en la identidad de secuencia. La invencion presenta moleculas de acido nucleico aisladas que son al menos 50 % (o 55 %, 65 %, 75 %, 85 %, 95 % o 98 %) identicas a: (a) una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido de SEQ ID NO: 1 o 3; (b) la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 2 o 4; o (c) una molecula de acido nucleico que incluye un segmento de al menos 30 (p. ej., al menos 50, 60, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800 u 865) nucleotidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
La determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se lleva a cabo utilizando el algoritmo matematico de Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 5873-5877, 1993. Tal algoritmo se incorpora en los programas BLAStN y BLASTP de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Las busquedas de nucleotidos BLAST se realizan con el programa BLASTN, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a acidos nucleicos que codifican B7-H1. Las busquedas de protemas BLAST se realizan con el programa BLASTP, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a B7-H1. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, se utilizo Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. Cuando se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parametros por defecto de los programas respectivos (p. ej., xBlAST y NBLAST) (vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
La hibridacion tambien se puede usar como una medida de homologfa entre dos secuencias de acido nucleico. Una secuencia de acido nucleico que codifica B7-H1, o una parte de la misma, se puede usar como sonda de hibridacion segun tecnicas de hibridacion estandar. La hibridacion de una sonda B7-H1 para ADN de una fuente de ensayo (por ejemplo, una celula de mai^ero) es una indicacion de la presencia de ADN B7-H1 en la fuente de ensayo. Las condiciones de hibridacion son conocidas por los expertos en la tecnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 6.3.1-6.3.6, 1991. Las condiciones de hibridacion moderadas se definen como equivalentes a la hibridacion en 2X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 30 °C, seguido por uno o mas lavados en 1X SSC, SDS al 0,1 % a 50-60 °C. Las condiciones muy rigurosas se definen como equivalentes a la hibridacion en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 45 °C, seguido por uno o mas lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 50-65 °C.
La invencion tambien abarca: (a) vectores que contienen cualquiera de las secuencias codificantes relacionadas con B7-H1 anteriores y/o sus complementos (es decir, secuencia "antisentido"); (b) vectores de expresion que contienen cualquiera de las secuencias codificantes relacionadas con B7-H1 anteriores asociadas operativamente con cualquier elemento regulador de la transcripcion/traduccion (cuyos ejemplos se dan a continuacion) necesarios para la expresion directa de las secuencias codificantes; (c) vectores de expresion que contienen, ademas de secuencias que codifican un polipeptido B7-H1, secuencias de acido nucleico que no estan relacionadas con secuencias de acido nucleico que codifican B7-H1, tales como moleculas que codifican un reportero, marcador o un peptido senal, p. ej., fusionado con B7-H1; y (d) celulas anfitrionas disenadas geneticamente que contienen cualquiera de los vectores de expresion anteriores y expresan de este modo las moleculas de acido nucleico de la invencion.
Las moleculas de acido nucleico recombinante pueden contener una secuencia que codifica hB7-H1 o mB7-H1, o
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B7-H1 que tiene una secuencia senal heterologa. El polipeptido B7-H1 de longitud completa, un dominio de B7-H1, o un fragmento de los mismos se pueden fusionar con polipeptidos adicionales, como se describe mas adelante. De forma similar, las moleculas de acido nucleico de la invencion pueden codificar la forma madura de B7-H1 o una forma que incluye un polipeptido exogeno que facilita la secrecion.
Los elementos reguladores de transcripcion/traduccion mencionados anteriormente y que se describen adicionalmente mas adelante, incluyen, pero no se limitan a, promotores, potenciadores, operadores y otros elementos, inducibles y no inducibles, que son conocidos por los expertos en la tecnica, y que conducen o, si no, regulan la expresion genica. Tales elementos reguladores incluyen pero no se limitan al gen temprano inmediato del citomegalovirus hCMV, a los promotores tempranos o tardfos del adenovirus SV40, al sistema Jac, al sistema trp, al sistema TAC, al sistema TRC, las regiones principales de operador y promotor del fago A, las regiones de control de la protema de la capa fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato-cinasa, los promotores de la fosfatasa acida y los promotores de los factores de apareamiento a de levaduras.
De manera similar, el acido nucleico puede formar parte de un gen tubrido que codifica secuencias de polipeptidos adicionales, por ejemplo, secuencias que funcionan como un marcador o reportero. Ejemplos de genes marcadores o reporteros incluyen p-lactamasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), adenosina desaminasa (ADA), aminoglucosido fosfotransferasa (neor, G418r), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), timidina cinasa (TK), lacZ (que codifica p-galactosidasa) y xantina guanina fosforribosiltransferasa (XGPRT). Como con muchos de los procedimientos estandar asociados con la practica de la invencion, los expertos en la tecnica estaran al tanto de reactivos utiles adicionales, por ejemplo, secuencias adicionales que pueden servir a la funcion de un marcador o reportero. Generalmente, el polipeptido tubrido incluira una primera porcion y una segunda porcion; siendo la primera porcion un polipeptido B7-H1 y siendo la segunda porcion, por ejemplo, el reportero descrito anteriormente o una region constante de Ig o una parte de una region constante de Ig, p. ej., los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG2a.
Los sistemas de expresion que se pueden usar para los fines de la invencion incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresion de ADN recombinante de bacteriofago, ADN plasmido o ADN cosmido que contienen las moleculas de acido nucleico de la invencion; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces y Pichia) transformadas con vectores de expresion recombinantes de levaduras que contienen las moleculas de acido nucleico de la invencion (que contienen preferiblemente la secuencia de acido nucleico que codifica B7-H1 (p. ej., la contenida en SEQ ID NO: 1 o 3)); sistemas de celulas de insectos infectadas con vectores de expresion recombinantes de virus (por ejemplo, baculovirus) que contienen las moleculas de acido nucleico de la invencion; sistemas de celulas vegetales infectadas con vectores de expresion recombinantes de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV)) o transformadas con vectores de expresion recombinantes de plasmidos (por ejemplo, plasmido Ti) que contienen secuencias de nucleotidos B7-H1; o sistemas de celulas de mairnfero (por ejemplo, celulas CoS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38 y NIH 3T3) que albergan constructos de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamffero (por ejemplo, el promotor de metalotionema) o de virus de mamfferos (por ejemplo, el promotor tardfo del adenovirus y el promotor 7.5K del virus de la vacuna). Tambien son utiles como celulas anfitrionas las celulas primarias o secundarias obtenidas directamente de un mamffero, transfectadas con un vector plasmido o infectadas con un vector vmco.
Polipeptidos y fragmentos de polipeptidos
Los polipeptidos de la invencion incluyen hB7-H1, mB7-H1 y fragmentos funcionales de estos polipeptidos. Los polipeptidos adoptados por la invencion tambien incluyen protemas de fusion que contienen un polipeptido B7-H1 como se define en las reivindicaciones, fusionado con la secuencia de aminoacidos no vinculada. Las secuencias no vinculadas pueden ser dominios funcionales adicionales o peptidos senal. Los peptidos senal se describen con mayor detalle, y se ejemplifican, mas adelante. Los polipeptidos pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente pero con una o mas (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 12, 14, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1o0 o mas) sustituciones conservadoras.
En el presente documento se describen polipeptidos que pueden purificarse a partir de fuentes naturales (p. ej., sangre, plasma serico, tejidos o celulas tales como celulas T o cualquier celula que produzca de forma natural B7- H1). Los peptidos mas pequenos (menos de 50 aminoacidos de longitud) tambien se pueden sintetizar convenientemente por medios qmmicos estandar. Ademas, tanto los polipeptidos como los peptidos pueden producirse mediante tecnicas estandar de ADN recombinante in vitro y recombinacion in vivo/recombinacion genetica (p. ej., transgenesis), utilizando las secuencias de nucleotidos que codifican los polipeptidos o peptidos apropiados. Pueden usarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la tecnica para construir vectores de expresion que contengan secuencias de codificacion correspondientes y senales de control de transcripcion/traduccion apropiadas. Veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Ed.) [Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989] y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, [Green Publishing Associates y Wiley Interscience, NY, 1989].
Los polipeptidos y fragmentos de la invencion tambien incluyen los descritos anteriormente, pero modificados para uso in vivo mediante la adicion, en los extremos terminales de amino- y/o carboxilo-, de un agente bloqueante para
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facilitar la supervivencia del polipeptido correspondiente in vivo. Esto puede ser util en aquellas situaciones en las que los terminales de peptidos tienden a ser degradados por proteasas antes de la captacion celular. Tales agentes bloqueantes pueden incluir, sin limitacion, secuencias peptidicas adicionales vinculadas o no vinculadas que se pueden unir a los restos terminales de amino y/o carboxilo del peptido a administrar. Esto puede hacerse qmmicamente durante la smtesis del peptido o mediante tecnologfa de ADN recombinante por procedimientos conocidos por artesanos de habilidad media.
Alternativamente, los agentes bloqueantes tales como acido piroglutamico u otras moleculas conocidas en la tecnica pueden unirse a los restos terminales amino y/o carboxilo, o el grupo amino en el extremo amino o el grupo carboxilo en el extremo carboxilo puede ser sustituido por un resto diferente. Del mismo modo, los peptidos se pueden acoplar covalentemente o no covalentemente a protemas "portadoras" farmaceuticamente aceptables antes de la administracion.
Tambien son de interes los compuestos peptidomimeticos que se disenan basandose en las secuencias de aminoacidos de los fragmentos peptfdicos funcionales. Los compuestos peptidomimeticos son compuestos sinteticos que tienen una conformacion tridimensional (es decir, un "resto peptidico") que es sustancialmente igual que la conformacion tridimensional de un peptido seleccionado. El resto peptfdico proporciona el compuesto peptidomimetico con la capacidad de coestimular celulas T de una manera cualitativamente identica a la del fragmento de peptido funcional B7-H1 del que se derivo el peptidomimetico. Los compuestos peptidomimeticos pueden tener caractensticas adicionales que potencian su utilidad terapeutica, tal como una permeabilidad celular aumentada y una semivida biologica prolongada.
Los peptidomimeticos tienen tfpicamente una cadena principal que es parcial o completamente no peptfdica, pero con grupos laterales que son identicos a los grupos laterales de los restos de aminoacidos que se producen en el peptido en el que se basa el peptidomimetico. Varios tipos de enlaces qrnmicos, p. ej., ester, tioester, tioamida, retroamida, enlaces reducidos de carbonilo, dimetileno y cetometileno, se conocen en la tecnica para ser sustitutos generalmente utiles de enlaces peptfdicos en la construccion de peptidomimeticos resistentes a proteasas.
Procedimientos de coestimulacion de una celula T
Los procedimientos de la invencion implican poner en contacto una celula T con un polipeptido B7-H1 de la invencion, o un fragmento funcional del mismo, con el fin de coestimular la celula T. Dichos polipeptidos o fragmentos funcionales pueden tener secuencias de aminoacidos identicas a las secuencias de tipo salvaje o pueden contener una o mas (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 12, 14, l7, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mas) sustituciones conservadoras. El contacto puede ocurrir antes, durante o despues de la activacion de la celula T. El contacto de la celula T con el polipeptido B7-H1 sera preferiblemente sustancialmente al mismo tiempo que la activacion. La activacion puede ser, por ejemplo, exponiendo la celula T a un anticuerpo que se une al TCR o a uno de los polipeptidos del complejo CD3 que esta ffsicamente asociado con el TCR. Alternativamente, la celula T puede estar expuesta a un aloantfgeno (p. ej., un aloantfgeno de MHC) sobre, por ejemplo, una celula presentadora de antfgeno (ApC) (p. ej., una celula dendntica, un macrofago, un monocito o una celula B) o un peptido antfgeno producido por procesamiento de un antfgeno de protema por cualquiera de las APC anteriores y presentado a la celula T por moleculas de MHC en la superficie de la APC. La celula T puede ser una celula T CD4+ o una celula T CD8+. La molecula B7-H1 puede anadirse a la solucion que contiene las celulas, o puede expresarse en la superficie de una APC, p. ej., una APC que presenta un aloantfgeno o un peptido antfgeno unido a una molecula de MHC. Alternativamente, si la activacion es in vitro, la molecula B7-H1 puede unirse al suelo de un recipiente de cultivo correspondiente, p. ej., un pocillo de una placa de microtitulacion de plastico.
Los procedimientos pueden realizarse in vitro. La aplicacion in vitro de B7-H1 puede ser util, por ejemplo, en estudios cientfficos basicos de mecanismos inmunes o para la produccion de celulas T activadas para su uso en estudios sobre la funcion de las celulas T o, por ejemplo, inmunoterapia pasiva. Ademas, B7-H1 se podna anadir a ensayos in vitro (p. ej., en ensayos de proliferacion de celulas T) disenados para ensayar la inmunidad a un antfgeno de interes en un sujeto del que se obtuvieron las celulas T. Se esperana que la adicion de B7-H1 a tales ensayos diera como resultado una respuesta in vitro mas potente y, por lo tanto, mas facilmente detectable.
Las protemas B7-H1 y sus variantes son generalmente utiles como agentes terapeuticos estimuladores de la respuesta inmune. Por ejemplo, los polipeptidos de la invencion pueden usarse para el tratamiento de estados de enfermedad caracterizados por inmunosupresion: p. ej., cancer, SIDA o complejo relacionado con SIDA, otros estados inducidos vmcamente o ambientalmente, y ciertas deficiencias inmunitarias congenitas. Los compuestos tambien se pueden emplear para aumentar la funcion inmunitaria que ha sido alterada por el uso de radioterapia de farmacos inmunosupresores tales como ciertos agentes quimioterapeuticos y, por lo tanto, son particularmente utiles cuando se administran conjuntamente con tales farmacos o radioterapia. Ademas, en vista de la capacidad de B7- H1 para coestimular la produccion de niveles especialmente altos de IL-10, pueden usarse moleculas B7-H1 para tratar estados que implican respuestas inmunitarias celulares, por ejemplo, afecciones inflamatorias, p. ej., las Inducidas por agentes infecciosos tales como Mycobacterium tuberculosis o M. leprae, u otras respuestas patologicas mediadas por celulas tales como las implicadas en enfermedades autoinmunes (por ejemplo, artritis reumatoide (RA), esclerosis multiple (MS) o diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM)).
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Enfoques In Vivo
En un enfoque in vivo, al sujeto se administra el propio polipeptido B7-H1 (o un fragmento funcional del mismo). Generalmente, los compuestos de la invencion se suspenderan en un vehmulo farmaceuticamente aceptable (p. ej., solucion salina fisiologica) y se administraran por v^a oral o por infusion intravenosa o se inyectaran por via subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, intrarrectal, intravaginal, intranasal, intragastrica, intratraqueal o intrapulmonar. Se suministran preferiblemente directamente a un tejido linfoide apropiado (p. ej., bazo, nodulo linfatico o tejido linfoide asociado a mucosa (MALT)). La dosis requerida depende de la eleccion de la via de administracion, de la naturaleza de la formulacion, de la naturaleza de la enfermedad del paciente, del tamano, del peso, de la superficie espedfica, de la edad y del sexo del sujeto, de otros farmacos que se administran y del criterio del medico interviniente. Las dosis adecuadas estan en el intervalo de 0,01-100,0 |ig/kg. Se esperan amplias variaciones en la dosificacion necesaria en vista de la variedad de polipeptidos y fragmentos disponibles y de las diferentes eficacias de varias rutas de administracion. Por ejemplo, sera esperable que la administracion oral requiera dosis mas altas que la administracion por inyeccion i.v.. Las variaciones en estos niveles de dosificacion se pueden ajustar usando rutinas empmcas estandar para la optimizacion como bien se sabe en la tecnica. Las administraciones pueden ser simples o multiples (p. ej., 2- o 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150- o mas veces). La encapsulacion del polipeptido en un vehmulo de administracion adecuado (p. ej., micropartmulas polimericas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia de la administracion, particularmente por administracion oral.
Alternativamente, un polinucleotido que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido B7-H1 o el fragmento funcional se puede administrar a una celula apropiada del animal. La expresion de la secuencia codificante se dirigira preferiblemente al tejido linfoide del sujeto mediante, por ejemplo, la administracion del polinucleotido al tejido linfoide. Esto puede conseguirse mediante, por ejemplo, el uso de un vehmulo de administracion de micropartmulas o microcapsulas biodegradables polimericas, dimensionado para optimizar la fagocitosis por celulas fagodticas tales como macrofagos. Por ejemplo, pueden usarse micropartmulas de PLGA (poli-lacto-co-glicolida) de aproximadamente 1-10 |im de diametro. El polinucleotido esta encapsulado en estas micropartmulas, que son absorbidas por macrofagos y poco a poco biodegradadas dentro de la celula, liberando asf el polinucleotido. Una vez liberado, el ADN es expresado dentro de la celula. Se pretende que un segundo tipo de micropartmula no sea absorbido directamente por celulas, sino que sirva principalmente como un deposito de liberacion lenta de acido nucleico que sea absorbido por celulas solo despues de la liberacion de la micropartmula a traves de la biodegradacion. Por lo tanto, estas partmulas polimericas deben ser lo suficientemente grandes para impedir la fagocitosis (es decir, mayor de 5 |im y preferiblemente mayor de 20 |im).
Otra forma de conseguir la captacion del acido nucleico consiste en usar liposomas, preparados por procedimientos estandares. Los vectores se pueden incorporar solos en estos vehmulos de administracion o co-incorporarse con anticuerpos espedficos de tejido. Alternativamente, se puede preparar un conjugado molecular compuesto de un plasmido u otro vector unido a poli-L-lisina por fuerzas electrostaticas o covalentes. La poli-L-lisina se une a un ligando que puede unirse a un receptor en celulas diana [Cristiano et al. (1995), J. Mol. Med. 73, 479]. Alternativamente, el acceso espedfico del tejido linfoide puede conseguirse mediante el uso de elementos reguladores transcripcionales espedficos de tejido linfoide (TRE) tales como un linfocito B, un linfocito T o un TRE espedfico de celulas dendnticas. Se conocen TRE espedficos del tejido linfoide [Thompson et al., (1992), Mol. Cell. Biol. 12, 1043-1053; Todd et al., (1993), J. Exp. Med. 177, 1663-1674; Penix et al. (1993), J. Exp. Med. 178, 14831496]. La administracion de "ADN desnudo" (es decir, sin un vehmulo de administracion) a un sitio intramuscular, intradermico o subcutaneo, es otro medio para lograr la expresion in vivo.
En los polinucleotidos correspondientes (p. ej., vectores de expresion), la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido B7-H1 o el fragmento funcional de interes con una metionina iniciadora y, opcionalmente, una secuencia de acceso esta operativamente unida a una combinacion de promotor o de promotor-potenciador.
Las secuencias de aminoacidos cortas pueden actuar como senales para dirigir las protemas a compartimentos intracelulares espedficos. Por ejemplo, peptidos senal hidrofobos (p. ej., MAISGVPVlGfFIIAVLMSAQESWA (SEQ ID NO: 6)) se encuentran en el extremo amino de protemas destinadas a la ER. Aunque la secuencia KFERQ (SEQ ID NO: 7) (y otras secuencias estrechamente vinculadas) es conocida por dirigir polipeptidos intracelulares a lisosomas, otras secuencias (p. ej., MDDQRDLISNNEQLP (SEQ ID NO: 8) dirigen polipeptidos a endosomas. Ademas, se ha demostrado que la secuencia peptfdica KDEL (SEQ ID NO: 9) actua como una senal de retencion para la ER. Cada uno de estos peptidos senal, o una combinacion de los mismos, puede usarse para el trafico de los polipeptidos B7-H1 o fragmentos funcionales de la invencion segun se desee. Los ADN que codifican los polipeptidos B7-H1 o los fragmentos funcionales que contienen senales de acceso se generaran por PCR u otras tecnicas estandar de ingeniena genetica o de smtesis.
Un promotor es un TRE compuesto de una region de una molecula de ADN, tfpicamente dentro de 100 pares de bases aguas arriba del punto en donde comienza la transcripcion. Los potenciadores proporcionan especificidad de expresion en terminos de tiempo, ubicacion y nivel. A diferencia de un promotor, un potenciador puede funcionar cuando esta localizado a distancias variables desde el sitio de transcripcion, siempre que este presente un promotor. Tambien se puede colocar un potenciador aguas abajo del sitio de iniciacion de la transcripcion. Para llevar una secuencia codificante bajo el control de un promotor, es necesario situar el sitio de iniciacion de la traduccion del marco de lectura de la traduccion del peptido o polipeptido entre uno y aproximadamente cincuenta nucleotidos
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aguas abajo (3') del promotor. La secuencia codificante del vector de expresion esta operativamente ligada a una region de terminacion de la transcripcion.
Vectores de expresion adecuados incluyen plasmidos y vectores vmcos tales como el virus herpes, retrovirus, virus vacuna, virus vacuna atenuados, virus de la viruela del canario, adenovirus y virus adeno-asociados, entre otros.
Los polinucleotidos se pueden administrar en un vefnculo farmaceuticamente aceptable. Los vefnculos farmaceuticamente aceptables son vefnculos biologicamente compatibles que son adecuados para la administracion a un ser humano, p. ej., una solucion salina fisiologica. Una cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad del polinucleotido que es capaz de producir un resultado medicamente deseable (p. ej., una respuesta de celula T potenciada) en un animal tratado. Como es bien conocido en las tecnicas medicas, la dosificacion para un paciente cualquiera depende de muchos factores, que incluye el tamano del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el tiempo y la via de administracion, la salud general y otros farmacos que se administran simultaneamente. Las dosificaciones variaran, pero una dosificacion preferida para la administracion de polinucleotido es de aproximadamente 106 a 1012 copias de la molecula de polinucleotido. Esta dosis se puede administrar repetidamente, segun sea necesario. Las vfas de administracion pueden ser cualquiera de las enumeradas anteriormente.
Enfoques Ex Vivo
Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) pueden ser retiradas del paciente o un donante adecuado y expuestas ex vivo a un estfmulo activador (vease anteriormente) y un polipeptido B7-H1 o fragmento polipeptfdico (ya sea en forma soluble o unido a un soporte solido por metodologfas estandares). Las PBMC que contienen celulas T muy activadas se introducen a continuacion en el mismo paciente o en uno diferente.
Una estrategia ex vivo alternativa puede implicar la transfeccion o transduccion de celulas obtenidas del sujeto con un polinucleotido que codifican secuencias de polipeptido B7-H1 o acido nucleico que codifica un fragmento funcional descritas anteriormente. Las celulas transfectadas o transducidas se devuelven despues al sujeto. Aunque tales celulas senan preferiblemente celulas hematopoyeticas (p. ej., celulas de medula osea, macrofagos, monocitos, celulas dendnticas o celulas B), tambien podnan ser cualesquiera de una amplia gama de tipos que incluyen, sin limitacion, fibroblastos, celulas epiteliales, celulas endoteliales, queratinocitos o celulas musculares en los que actuan como una fuente del polipeptido B7-H1 o fragmento funcional mientras sobrevivan en el sujeto. El uso de celulas hematopoyeticas, que incluyen las APC anterior, sena particularmente ventajoso ya que se esperana que tales celulas alojaran, entre otros, tejido linfoide (p. ej., nodulos linfaticos o bazo) y, de ese modo, el polipeptido B7- H1 o el fragmento funcional se producinan en gran concentracion en el sitio donde ejercen su efecto, es decir, potenciacion de una respuesta inmune. Ademas, si se usan las APC, las APC que expresan la molecula B7-H1 exogena puede ser las mismas APC que presentan un aloantfgeno o peptido antfgeno a la celula T correspondiente. La B7-H1 puede ser secretada por las APC o expresada en su superficie. Antes de devolver las APC recombinantes al paciente, pueden exponerse opcionalmente a fuentes de antfgenos o peptidos antfgenos de interes, p. ej., los de tumores, microorganismos infecciosos o autoantfgenos. Los mismos constructos geneticos y secuencias de trafico descritas para el enfoque in vivo se pueden usar para esta estrategia ex vivo. Ademas, las celulas tumorales, preferiblemente obtenidas de un paciente, se pueden transfectar o transformar mediante un vector que codifica un polipeptido B7-H1 o un fragmento funcional del mismo. Las celulas tumorales, preferiblemente tratadas con un agente (p. ej., irradiacion ionizante) que destruye su capacidad proliferativa, son luego devueltas al paciente donde, debido a su expresion del B7-H1 exogeno (en su superficie celular o por secrecion), pueden estimular respuestas inmunitarias potenciadas de celulas T tumoricidas. Se entiende que las celulas tumorales que, despues de la transfeccion o de la transformacion, se inyectan en el paciente, pueden haberse obtenido tambien originalmente de un individuo distinto del paciente.
Los procedimientos ex vivo incluyen las etapas de cosecha de celulas de un sujeto, cultivar las celulas, transduccion de ellas con un vector de expresion y mantener las celulas en condiciones adecuadas para la expresion del polipeptido B7-H1 o fragmento funcional. Estos procedimientos son conocidos en la tecnica de la biologfa molecular. La etapa de transduccion se lleva a cabo mediante cualquier medio estandar utilizado para terapia genica ex vivo, incluido el fosfato de calcio, lipofeccion, electroporacion, infeccion vmca y transferencia genica biolfstica. Alternativamente, pueden usarse liposomas o micropartfculas polimericas. Las celulas que se han transducido con exito se seleccionan entonces, por ejemplo, por expresion de la secuencia codificante o de un gen resistente a farmacos. Las celulas pueden entonces ser irradiadas letalmente (si se desea) e inyectadas o implantadas en el paciente.
Procedimientos de cribado de compuestos que inhiben o potencian respuestas inmunologicas
La invencion proporciona procedimientos para ensayar compuestos (moleculas pequenas o macromoleculas) que inhiben o potencian una respuesta inmune. Tal procedimiento puede implicar, p. ej., cultivar un polipeptido B7-H1 de la invencion (o un fragmento funcional del mismo) con celulas T en presencia de un estimulo de celulas T (vease anteriormente). Los polipeptidos B7-H1 utiles incluyen aquellos con secuencias de aminoacidos identicas a las secuencias de tipo salvaje o pueden contener una o mas (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 12, l4 , 17, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1o0 o mas) sustituciones conservadoras. El polipeptido
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B7-H1 puede estar en solucion o unido a la membrana (p. ej., expresado en la superficie de las celulas T) y puede ser natural o recombinante. Los compuestos que inhiben la respuesta de celulas T seran probablemente compuestos que inhiben una respuesta inmune mientras que aquellos que potencian la respuesta de celulas T seran probablemente compuestos que potencian la respuesta inmune.
La invencion se refiere tambien al uso de B7-H1 o fragmentos funcionales del mismo para cribar compuestos inmunomoduladores que pueden interactuar con B7-H1. Un experto en la tecnica sabna como utilizar el modelado molecular estandar u otras tecnicas para identificar moleculas pequenas que se uninan a sitios interactivos de celulas T de B7-H1. Uno de tales ejemplos se proporciona en Broughton (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 392-398.
Un compuesto candidato cuya presencia requiere al menos 1,5 veces (p. ej., 2 veces, 4 veces, 6 veces, 10 veces, 150 veces, 1.000 veces, 10.000 veces o 100.000 veces) mas B7-H1 con el fin de alcanzar un nivel arbitrario definido de activacion de celulas T que en ausencia del compuesto puede ser util para inhibir una respuesta inmune. Por otra parte, un compuesto candidato cuya presencia requiere al menos 1,5 veces (por ejemplo, 2 veces, 4 veces, 6 veces, 10 veces, 100 veces, 1.000 veces, 10.000 veces o 100.000 veces) menos B7-H1 para lograr un nivel arbitrario definido de activacion de celulas T que en ausencia del compuesto puede ser util para potenciar una respuesta inmune. Los compuestos capaces de interferir con, o modular, la funcion B7-H1 son buenos candidatos para agentes inmunorreguladores inmunosupresores, p. ej., para modular una respuesta autoinmune o suprimir el rechazo del injerto alogenico o xenogenico.
Anticuerpos B7-H1
La invencion presenta anticuerpos que se unen a uno cualquiera o ambos de los polipeptidos B7-H1 o fragmentos de tales polipeptidos. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales presentes en el suero o plasma de animales (p. ej., ratones, conejos, ratas, conejillos de indias, ovejas, caballos, cabras, vacas o cerdos) que han sido inmunizados con el polipeptido B7-H1 o fragmento peptfdico correspondiente usando procedimientos, y opcionalmente adyuvantes, conocidos en la tecnica. Tales anticuerpos policlonales se pueden aislar a partir de suero o plasma por procedimientos conocidos en la tecnica. Los anticuerpos monoclonales que se unen a los polipeptidos o fragmentos anteriores estan tambien incorporados por la invencion. Los procedimientos de fabricacion y cribado de anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la tecnica.
Una vez que se ha seleccionado y clonado el hibridoma productor de anticuerpo deseado, el anticuerpo resultante puede producirse mediante una serie de procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el hibridoma puede cultivarse in vitro en un medio adecuado durante un penodo de tiempo adecuado, seguido por la recuperacion del anticuerpo deseado a partir del sobrenadante. El penodo de tiempo y el medio son conocidos o pueden ser determinados facilmente.
Ademas, los anticuerpos recombinantes espedficos para B7-H1, tales como anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, estan dentro del alcance de la invencion. Tales anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados pueden ser producidos mediante tecnicas de ADN recombinante conocidas en la tecnica, por ejemplo, utilizando procedimientos descritos en Robinson et al., publicacion de patente internacional PCT/US86/02269; Akira et al., solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, solicitud de patente europea 171.496; Morrison et al., solicitud de patente europea 173.494; Neuberger et al., solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly et al., patente de EE.UU. N° 4.816.567; Cabilly et al., solicitud de patente europea 125.023; Better et al., (1988) Science 240, 1041-43; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139, 3521-26; Sun et al., (1987) PNAS 84, 214-18; Nishimura et al., (1987) Canc. Res. 47, 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314, 446-49; Shaw et al., (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80, 1553-59; Morrison, (1985) Science 229, 1202-07; Oi et al., (1986) BioTechniques 4, 214; Winter, patente de EE.UU. N° 5.225.539; Jones et al., (1986) Nature 321, 552-25; Veroeyan et al., (1988) Science 239, 1534; y Beidler et al., (1988) J. Immunol. 141, 4053-60.
Tambien se incluyen dentro del alcance de la invencion fragmentos de anticuerpos y derivados que contienen al menos la porcion funcional del dominio de union al antfgeno de un anticuerpo que se une espedficamente a B7-H1. Los fragmentos de anticuerpo que contienen el dominio de union de la molecula pueden generarse mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: fragmentos F(ab')2 que pueden producirse por digestion con pepsina de moleculas de anticuerpo; fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de fragmentos F(ab')2; y fragmentos Fab que pueden ser generados por tratamiento de moleculas de anticuerpo con papama y un agente reductor. Vease, p. ej., National Institutes of Health, 1 Current Protocols In Immunology, Coligan et al., ed. 2.8, 2.10 (Wiley Interscience, 1991). Los fragmentos de anticuerpo tambien incluyen fragmentos Fv (p. ej., Fv de cadena sencilla (scFv)), es decir, productos de anticuerpo en los que no hay restos de aminoacidos de region constante. Tales fragmentos se pueden producir, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. N° 4.642.334 que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, no limitar, la invencion.
Ejemplo 1. Materiales y Procedimientos
Clonacion del ADNc de hB7-H1 y construccion de protemas de fusion de Ig. Los extremos 5' y 3' del ADNc de hB7-
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H1 se amplificaron por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de placenta humana sintetizada por el kit de smtesis de ADNc de PCR SMART (Clontech, Palo Alto, CA). Los pares de cebadores utilizados para la PCR se derivaron del plasmido de la biblioteca de placenta y del clon AA292201 de la etiqueta de secuencia expresada (EST). Un clon de ADNc que inclma un ORF que codifica ADNc de hB7-H1 se amplifico por PCR a partir de la misma biblioteca de ADNc mediante cebadores espedficos y se clono en el vector pcADN3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se secuencio. Las secuencias de aminoacidos de hB7-H1, B7-1 y B7-2 se analizaron utilizando el algoritmo ClustalW con la matriz BLOSUM 30 (MacVector, Oxford Molecular Group). La protema de fusion hB7-H1Ig se preparo fusionando el dominio extracelular de hB7H-1 al dominio CH2-CH3 de IgG2a de raton en el plasmido de expresion pmIgV y el constructo resultante se transfecto en celulas CHO. Tambien se uso un procedimiento analogo para la preparacion de las protemas de fusion B7-1Ig, CTLA4Ig e ICOSIg. Las protemas de fusion se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo mediante el paso sobre columnas de afinidad Protein G-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y las protemas de fusion purificadas se dializaron en PBS exenta de endotoxinas.
Transfeccion de ADN. Los plasmidos que contienen secuencias de acido nucleico que codifican hB7-H1 de longitud completa (pcADN3-hB7-H1), B7-1 (pCDM8-B7.1) o vectores parentales de control sin secuencias codificantes se transfectaron en celulas 293 o celulas COS mediante fosfato de calcio o transfeccion de DEAE-Dextrano (Promega, Madison, WI). Despues de 48 horas de incubacion, los niveles de expresion de hB7-H1 o B7-1 en transfectantes se determinaron mediante citometna de flujo con fluorescencia (FFC) con un antisuero espedfico para hB7-H1 o anticuerpo monoclonal anti-B7-1 (mAb) (PharMingen), respectivamente.
Ratones y lmeas celulares. Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 (B6), DBA/2 y BALB/c del National Cancer Institute (Frederick, MD). Los ratones CD28-/" con un fondo genetico B6 fueron generosamente proporcionados por el Dr. Moses Rodrigues (Departament of Inmunology, Mayo Clinic, Rochester, MN). Mastocitoma P815, linfoma L1210, linfoma de celulas T de raton EL4 y celulas epiteliales 293 de rinon humano se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las lmeas celulares se mantuvieron en un medio completo que contema RPMI- 1640 (Life Technologies, Rockville, MD) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS) (HyClone, Logan, UT), HEPES 25 mM, penicilina G (100 U/ml) y sulfato de estreptomicina (100 pg/ml).
Ensayos de celulas T y citocinas. Para los estudios con celulas T humanas, se aislaron PBMC de la sangre de donantes voluntarios humanos sanos mediante centrifugacion por gradiente de Ficoll-Hypaque. Las PBMC se pasaron a traves de una columna de lana de nailon para obtener celulas T purificadas (~85 % de celulas CD3+) o se sometieron a purificacion adicional (>95 % de celulas CD3+) usando un sistema de esferas magneticas MACS anti- CD4/8 (Miltenyl Biotec, Alemania). Para los ensayos de coestimulacion, celulas T purificadas a una concentracion de 1 x 105 celulas/pocillo se cultivaron por triplicado en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos de microtitulacion de fondo plano que fueron pre-revestidas durante la noche con anticuerpo espedfico para CD3 humano (HIT3a, PharMingen, Palo Alto, CA) y bien hB7-H1Ig (5 pg/ml) o Ig de control (protema de fusion purificada de IgG2a de raton o 4-1BBIg de murino). En algunos experimentos, los pocillos de microtitulacion se revistieron solo con anticuerpo espedfico para CD3 y se usaron celulas COS transfectadas con B7-1 o hB7-H1 (104 celulas/pocillo) como fuente de las moleculas coestimuladoras. Para medir la produccion de citocinas, se recogieron los sobrenadantes a las 24, 48 y 72 horas despues del inicio de los cultivos y se determinaron las concentraciones de IL-2, IL-4, IFN-y e IL-10 mediante ELISA sandwich (PharMingen) segun la Instrucciones del fabricante. Se incluyeron pocillos que conteman B7-1Ig o anticuerpo espedfico para CD28 humano (CD28.2, PharMingen) para comparacion o como un control positivo, respectivamente. La proliferacion de celulas T se determino mediante la adicion de 1,0 pCi de [3H]-timidina por pocillo al dfa 2 seguido por al menos 18 horas de cultivo adicional. La [3H]-timidina incorporada se determino usando un contador de centelleo lfquido Trilux MicroBeta (Wallac, Finlandia).
Para ensayos de reaccion de linfocitos mixtos (MLR), se co-cultivaron celulas T humanas purificadas (2 x 105 celulas/pocillo) por triplicado con PBMC humanas alogenicas (irradiadas con 4.000 rad) a 2 x 105 celulas/pocillo en presencia de HB7-H1Ig soluble o Ig de control. Cuatro dfas despues, la proliferacion de celulas T se determino por incorporacion de [3H]-timidina. Se anadio mAb neutralizante espedfico para la IL-2 humana (Clon MQ1-17H12, PharMingen) a 8 pg/ml al comienzo de los cultivos de celulas T. La polimixina B (10 pg/ml) se incluyo tambien en los ensayos de proliferacion celular y secrecion de citocinas para neutralizar completamente cualquier endotoxina contaminante.
Para los estudios con celulas T de raton, las celulas T se purificaron pasando celulas de nodulo linfatico o bazo a traves de una columna de lana de nailon. Las celulas T CD4+ o CD8+ se seleccionaron positivamente mediante clasificacion magnetica usando mAb conjugado con FITC contra CD4 o CD8 y microesferas revestidas con anticuerpo espedfico para isotiocianato de fluorescema (FITC) (MiltenyiBiotec, Auburn, CA) segun las instrucciones del fabricante. La pureza de las celulas T CD4+ y CD8+ aisladas era >95 % por FFC con mAb espedfico para CD4 y CD8 de raton, respectivamente. Las celulas T purificadas a 2 x 106/ml a partir de bazos de raton se cultivaron en placas de 96 pocillos que fueron pre-revestidas con mAb espedfico para CD3 de raton en presencia de mB7-H1Ig o IgG2a de raton de control (“Ig de control”) tambien revestido sobre los fondos de los pocillos de cultivo. Se utilizo mAb espedfico para CD28 de raton (2,5 pg/ml) en forma soluble como un coestimulador positivo de control. La proliferacion de celulas T se determino mediante la incorporacion de [3H]-timidina (1,0 pCi/pocillo) anadida 15 h antes de la cosecha de los cultivos de 3 dfas. La incorporacion de [3H]-timidina se determino mediante un contador de centelleo lfquido TriLux MicroBeta (Wallac, Turku, Finlandia). Para detectar citocinas, los sobrenadantes se
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recogieron entre las 18 y las 72 horas de cultivo y las concentraciones de IFN-y, IL-2, IL-10, IL-4 y GM-CSF se midieron mediante ELISA sandwich segun las instrucciones del fabricante (PharMingen).
Analisis de acidos nucleicos. El analisis de transferencia Northern de ARN humano se llevo a cabo utilizando membranas de transferencia Northern de tejido multiple humano comercialmente disponibles (Clontech, Palo Alto, CA). Las membranas se incubaron en solucion de hibridacion ExpressHyb (Clontech) durante 30 min a 68 °C. La sonda de ADNc cebada al azar era ADNc que codifica hB7-H1 de longitud completa (870 pb) marcada usando [32P]- dCTP. Como control se uso una sonda de ADNc de p-actina humana marcada con 32P (2,0 kb). La hibridacion se llevo a cabo durante 1 hora a 68 °C, las membranas se lavaron 3 veces en 2 x SSC que contema SDS al 0,05 %, y despues se expusieron a -80 °C a pelmula de rayos X.
La distribucion de tejido de ARNm de mB7-H1 se llevo a cabo utilizando membranas de transferencia de punto de ARN de raton de tejido multiple comercialmente disponibles (Clontech) segun las instrucciones del fabricante. La sonda de ADNc cebada al azar era ADNc que codifica mB7-H1 de longitud completa y se etiqueto usando [32P]- dCTP. La hibridacion se realizo durante 16 h a 65 °C. Despues de lavar cuatro veces con 2x SSC que contema SDS al 0,05 %, las membranas se expusieron a -80 °C a pelmulas de rayos X.
Anticuerpos y protemas de fusion. Se prepararon anticuerpos de conejo frente a la protema mB7-H1 mediante Cocalico Biologicals (Reamstown, PA) por inmunizacion de conejos con un peptido hidrofilo conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH) que abarca los aminoacidos 95-119 de mB7-H1 (“peptido 95-119”) (GNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYG) (SEQ ID NO: 16). El anticuerpo policlonal se purifico a partir de suero de conejo usando una columna de afinidad que contema material de matriz insoluble conjugado con el peptido 95-119. Ambos analisis ELISA y FFC de celulas COS transfectadas con un vector de expresion que contema ADNc que codifica mB7-H1 demostraron que el anticuerpo policlonal se uma espedficamente a mB7-H1. El mAb purificado espedfico para CD3 de raton y CD28 de raton y mAb conjugado con FITC espedfico para CD4 de raton, CD8 de raton y CD40L de raton, mAb conjugado con ficoeritrina (PE) espedfico para CD3 de raton, B220 de raton y Mac-1 de raton se adquirieron de PharMingen (San Diego, CA). El anticuerpo de cabra conjugado con FITC espedfico para IgG de conejo se adquirio de Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL). La IgG de conejo y la IgG de hamster purificadas se adquirieron de Rockland (Gilbertsville, PA).
Para preparar la protema de fusion mB7-H1Ig, ADNc que codifica el dominio extracelular mB7-H1 se genero por RT- PCR usando el cebador sentido 5'-CAGGAATTCACCATGAGGATATTTGCTG-3' (SEQ ID NO: 17) y el cebador anti- sentido 5'-CATCAGATCTATGTGAGTCCTGTTCTGTG-3' (SEQ ID NO: 18) de ARNm de celulas T de raton. Despues de la digestion con EcoRI y BglII, los productos de PCR se fusionaron con el dominio CH2-CH3 de la cadena pesada de IgG2a de raton en el plasmido de expresion pmIgV [Dong et al., (1999) Nature Med. 5, 13651369]. El plasmido resultante, pmB7-H1Ig, se transfecto en celulas CHO. Las celulas transfectadas de forma estable se cultivaron en medios de CHO sin suero (Life Technologies). El mB7-H1Ig en los sobrenadantes se purifico usando una columna de protema G-Sepharose (Pierce, Rockford, IL) y se dializo en PBS exento de LPS. La concentracion de endotoxina era menor que 1 pg/mg de protema purificada segun los ensayos de lisado de amebocitos de Limulus (CAPE COD, Woods Hoke, MA). La protema de fusion mB7-1Ig que contiene el dominio extracelular de mB7-1 fusionado al dominio CH2-CH3 de la cadena pesada de IgG-2a de raton se preparo por un procedimiento analogo.
Analisis de citometna de flujo con fluorescencia. Para preparar un antisuero espedfico para hB7-H1, los ratones fueron inmunizados con hB7-H1Ig purificado emulsionado en adyuvante de Freund completo (Sigma) y se reforzaron tres veces con hB7-H1Ig en adyuvante de Freund incompleto. Se recogio el suero y se determino la especificidad por ELISA y por tincion FACS (dilucion 1:1.000) de celulas 293 transfectadas con ADNc hB7-H1 o celulas COS. Como control se utilizo preinyeccion con suero de raton.
Para preparar celulas T y B humanas activadas, se activaron PBMC humanas recien aisladas (10 x 106 celulas/ml) con 5 |jg/ml de PHA (Sigma) o 10 jg/ml de LPS (Sigma), respectivamente. Para la preparacion de monocitos activados, se cultivaron PBMC adherentes en 1.500 UI/ml de IFN-y humano recombinante (Biosource, Camarillo, CA) y 100 ng/ml de LPS. Todos los cultivos se cosecharon y analizaron a las 48 horas. Para tincion por inmunofluorescencia directa, las celulas T se incubaron a 4 °C con 1 jg de mAb conjugado con fluorescema (FITC) o con ficoeritrina (PE) durante 30 minutos y se analizaron mediante citometna de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) con el software Cell Quest software (Becton Dickinson) como se describio anteriormente. El mAb espedfico para CD3 (UCHT1), CD4 (RPA-T4), CD8 (RPA-T8), CD14 (M5E2), CD19 (B43), CD28 (CD28.2), CD80 (BB1) se adquirieron de PharMingen. Para la tincion con inmunofluorescencia indirecta, las celulas se incubaron primero con anticuerpo anti-hB7-H1 (1:1.000), 5 jg de ICOSIg o CTLA4Ig a 4 °C. Despues de 30 minutos, las celulas se lavaron y se incubaron adicionalmente con F(ab')2 de cabra de IgG anti-humano o anti-raton, conjugado con FITC (Biosource, Camarillo, CA) o con PE (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) durante 30 minutos a 4 °C. Como Ig de control se uso la protema IgG1 humana o de raton (Sigma) o 4-1BBIg de raton (dominio extracelular 4-1BB de raton fusionado con el Fc de IgG1 humana o IgG2a de raton). En algunos experimentos, los receptores Fc se bloquearon mediante Ig humana o de raton antes de la incubacion con mAb conjugados con FITC o PE.
Para el analisis de inmunofluorescencia indirecta de celulas de raton, las celulas se incubaron con los anticuerpos a
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4 °C durante 30 minutos en presencia de mAb bloqueante espedfico para CD16/32 (receptor Fc) (Pharmingen). Las celulas se lavaron y se incubaron adicionalmente con IgG anti-conejo conjugada con FITC. Las celulas fueron tenidas despues con mAb conjugado con PE espedfico para CD3 de raton, B220 de raton o Mac-1 de raton. La fluorescencia se analizo con un citometro de flujo FACS Calibur y se analizo con el software Cell Quest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Para preparar celulas T de raton activadas, celulas T de raton purificadas con lana y nailon (>75 % de celulas CD3+) a una concentracion de 2 x 106/ml se cultivaron con mAb espedfico para CD28 de raton (5 pg/ml) y CD3 de raton (5 pg/ml). Para la preparacion de celulas B de raton activadas, se cultivaron esplenocitos de raton con LPS (10 pg/ml, Sigma, St. Louis, MO). Los macrofagos de raton se obtuvieron a partir de las cavidades peritoneales de ratones que hadan sido inyectados con tioglicolato 7 dfas antes. Para la activacion, las celulas de exudado peritoneal de raton (PEC) se cultivaron con IFN-y (10 U/ml) y LPS (100 ng/ml). Todos los cultivos se cosecharon y las celulas se analizaron a las 48 h. Para detectar la expresion de CD40L, las celulas T CD4+ se purificaron por clasificacion magnetica (vease anteriormente), se cultivaron como se indica, y se incubaron con mAb conjugado con FITC a CD40L.
Generacion de linfocitos T citotoxicos (CTL). Para generar actividad de CTL espedfica de aloantfgeno in vitro, celulas T purificadas con lana de nailon (2 5 x 106/ml) de esplenocitos B6 se estimularon en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos con celulas (2,5 x 107ml) mock.P815 irradiadas (10.000 rad), mB7-1+ P815 o mB7-H1+ P815 durante 5 dfas. Despues de la estimulacion del dfa 5, se midieron las actividades de CTL frente a P815 (H-2d) y EL4 (H-2b) en un ensayo estandar de liberacion de 51Cr [Chen et al. (1994) J. Exp. Med. 179, 523-532; Li et al. (1996) J. Exp. Med. 183, 639-644].
Para generar actividad in vivo de CTL espedfica de tumor, se inocularon subcutaneamente (s.c.) ratones DBA/2 con 1 x 106 celulas mock.P815, mB7-1+ P815, o mB7-H1+ P815. Los nodulos linfaticos drenantes se retiraron 7-10 d despues de la inyeccion del tumor y las celulas de los nodulos linfaticos suspendidas (3 x 106/ml) se volvieron a estimular en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos con celulas P815 de tipo salvaje (3 x 105/ml) irradiadas (10.000 rad) durante 5 dfas. Las celulas se cosecharon y su actividad CTL se midio en un ensayo estandar de liberacion de 51Cr frente a celulas diana tumorales P815 de tipo salvaje.
Induccion y ensayo in vivo de anticuerpo espedfico de TNP. El trinitrofenol (TNP) conjugado con KLH (TNP-KLH, 100 pg/raton) (Biosearch Technologies, Novato, CA) en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) se inyecto i.p. en ratones B6 en el dfa 0. En los dfas 1 y 4, los ratones se inyectaron i.p. con 100 pg de Ig de control, mB7-1Ig, o mB7-H1Ig. Los sueros se recogieron los dfas 7 y 14. Para medir los anticuerpos espedficos de TNP en los sueros, 0,3 mg/ml de TNP-BSA (Biosearch Technologies) se revistieron sobre los fondos de los pocillos de las placas ELISA de 96 pocillos durante la noche a 4 °C. Los sitios de union no espedficos en las placas de ELISA se bloquearon con FBS al 10% en PBS durante 90 minutos a temperatura ambiente. Despues de un lavado a fondo, las muestras (diluidas por 1/200-1/2.000 con PBS) se anadieron y se incubaron durante 2 h. Las placas se lavaron despues y a los pocillos se anadieron anticuerpos de rata con biotina espedficos para IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 de raton (PharMingen). Las placas se incubaron adicionalmente durante 1 h a temperatura ambiente. Despues de lavar las placas, a los pocillos se anadio estreptavidina conjugada con peroxidasa de rabano picante (HRP) (Caltag Laboratories, Burlingame, CA) y las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y las soluciones se midieron en todos los pocillos. A los pocillos se anadio substrato de 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (Sigma). Se midio la DO450 de las soluciones en todos los pocillos.
Proliferacion de celulas T en respuesta a KLH. Ratones B6 se inmunizaron con 100 pg de TNP-KLH en IFA s.c. o en PBS i.p. en el dfa 0 y se inyectaron i.p. con 100 pg de mB7-H1Ig o de Ig de control en los dfas 1 y 4. Para detectar respuestas de celulas T a KLH, los nodulos linfaticos drenantes y bazos se extrajeron de los ratones inmunizados el dfa 7 y 14, respectivamente. Las celulas de nodulos linfaticos o bazo en suspension se cultivaron con KLH a 1,56100 pg/ml como se indico. La proliferacion de celulas T en respuesta a KLH se determino mediante la adicion de 1 pCi/pocillo de [3H] -timidina 15 h antes de la cosecha de los cultivos el dfa 3. Se midio la incorporacion de [3H]- timidina con un contador de centelleo lfquido TriLux MicroBeta (Wallac).
Ejemplo 2. Clonacion molecular y patron de expresion del gen hB7-H1
Una busqueda de homologfa de la base de datos EST de ADNc humana usando secuencias de aminoacidos B7-1 y B7-2 humanas publicadas revelo una secuencia EST (GeneBank n.° AA292201) que codifica un homologo para moleculas B7-1 y B7-2 humanas. Las secuencias 5'- y 3'- se obtuvieron mediante varias reacciones en cadena independientes de polimerasa acoplada a transcriptasa inversa (RT-PCR) de una biblioteca de ADNc de placenta humana utilizando un vector y secuencias EST como cebadores. Un fragmento de 3.616 pb que inclma el ORF que codifica hB7-H1 se clono y secuencio (SEQ ID NO: 5) (Fig. 1). La secuencia de codificacion para hB7-H1 (SEQ ID NO: 2) abarca los nucleotidos 73-942 de la SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoacidos de hB7-H1 de longitud completa (SEQ ID NO: 1) se muestra en la Fig. 2a. El dominio extracelular de hB7-H1 tiene mayor homologfa con B7-1 (20 % de identidad de aminoacidos) que con B7-2 (15 %) (Fig. 2b), mientras que su dominio citoplasmatico es muy divergente del de B7-1 y B7-2 basado en el analisis que utiliza el software McVector 6.5. El marco de lectura abierto del gen codifica una protema transmembrana de tipo I de 290 aminoacidos que consiste en un peptido senal de 22 aminoacidos, un dominio similar a Ig V y dominios similares a Ig C, un dominio transmembrana hidrofobo y una cola citoplasmatica de 30 aminoacidos (Fig. 2a). Cuatro cistemas estructurales (marcadas con asteriscos en la Fig. 2b), que aparentemente estan implicadas en la formacion de los enlaces disulfuro de los dominios Ig V e Ig C
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estan bien conservadas en todos los miembros B7 (Fig. 2b) [Fargeas, C.A. et al. (1995) J. Exp. Med. 182, 667-675; Bajorath, J. et al. (1994) Protein Sci. 3, 2148-50; Linsley, P.S. et al. (1994) Immunity 1, 793-801; Inaba, K. et al. (l994) J. Exp. Med. 180, 1849-60; Freeman, G. J. et al. (1995) Immunity 2, 523-532]. Ademas, el resto de tirosina en B7-1 (en la posicion 87) y en B7-2 (en la posicion 82) del dominio similar a Ig V se conserva en hB7-H1 (en la posicion 81) (Fig. 2b).
El analisis por transferencia de Northern revelo que la expresion del ARNm de hB7-H1 era significativa en el corazon, musculo esqueletico, placenta y pulmon, pero era debil en timo, bazo, rinon e Idgado (Fig. 3). El ARNm de hB7-H1 no era detectable en cerebro, colon, intestino delgado y celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC). En la mayona de los tejidos en los que se detecto el ARNm de hB7-H1, se encontraron dos transcritos de aproximadamente 4,1 y 7,2 kb.
Se construyo un plasmido de expresion que contema el dominio extracelular de hB7-H1 fusionado en marco con la porcion Fc (dominios CH2 y CH3) de la IgG2a de raton. El producto resultante, protema de fusion hB7-H1Ig, se purifico a partir de los sobrenadantes de celulas CHO transfectadas con el plasmido y se uso para la inmunizacion de los ratones para preparar un antisuero espedfico de hB7-H1. El analisis por citometna de flujo con fluorescencia utilizando el antisuero espedfico para hB7-H1 mostro que las celulas T CD3+ y B CD19+ recien aisladas expresan niveles despreciables de hB7-H1 mientras que una fraccion (~16%) de monocitos CD14+ expresan de forma constituyente hB7-H1. Sin embargo, el hB7-H1 puede ser regulado al alza por activacion celular. Aproximadamente el 30 % de celulas T CD3+ tratadas con PHA y 90 % de monocitos CD14+ (tratados con IFN-D y LPS) expresan hB7- H1. Solo el 6 % de las celulas B CD19+ despues de la activacion del LPS expresan hB7-H1 (Fig. 4). Los resultados de confirmacion se obtuvieron mediante analisis por RT-PCR.
La transfeccion del plasmido pcADN3-hB7-H1 en celulas 293 (celulas B7-H1/293) condujo a la expresion de hB7-H1 como se detecto por el antisuero espedfico de hB7-H1 (Fig. 5a). La union del anticuerpo se elimino mediante la inclusion de hB7-H1Ig soluble en la mezcla de tincion (Fig. 5a, flecha), demostrando asf la especificidad del antisuero. Ni CTLA4Ig ni ICOSIg se unieron a celulas hB7-H1/293. Aunque tanto CTLA4Ig como ICOSIg se unieron a celulas Raji, la union no se bloqueo por la inclusion de hB7-H1Ig (Fig. 5a, flechas). Tomados conjuntamente con la observacion de que hB7-H1Ig no se unio a las celulas Jurkat (Fig. 5b, panel a la derecha), a pesar de su expresion constituyente de CD28 (Fig. 5b, panel a la izquierda), los resultados anteriores indican que hB7-H1 no es un ligando para CD28, CTLA-4 o ICOS.
Ejemplo 3. Coestimulacion de la proliferacion de celulas T por hB7-H1
Para evaluar si hB7-H1 coestimula el crecimiento de celulas T, las celulas T purificadas (>95 % de pureza) de PBMC de donantes humanos sanos fueron estimuladas con hB7-H1Ig en presencia de dosis suboptimas de mAb espedfico para CD3 humano. La proliferacion de celulas T en cultivos el dfa 3 se determino por incorporacion de [3H]-timidina. HB7-H1Ig, inmovilizada sobre placas de cultivo, aumento la proliferacion de celulas T hasta 10 veces en comparacion con la Ig de control en presencia de 5-20 ng/ml de mAb espedfico para CD3 humano, tambien inmovilizado sobre las placas de cultivo. En ausencia de mAb espedfico para CD3 humano, hB7-H1Ig a una concentracion de hasta 5 pg/ml no indujo proliferacion de celulas T (Fig. 6a). Si se inclrna hB7-H1Ig en los cultivos sin inmovilizacion, su efecto coestimulador disminrna significativamente. En consonancia con esta observacion, la inclusion de hB7-H1Ig soluble a niveles de 0,6-5 pg/ml en MLR alogenico aumentaba moderadamente (~2 veces) la proliferacion de celulas T (Fig. 6b). As^ hB7-H1 puede promover y coestimular respuestas proliferativas de celulas T a estfmulos de celulas T policlonales y a antfgenos alogenicos.
Ejemplo 4. La coestimulacion con hB7-H1 induce preferentemente la produccion de IL-10 y el efecto coestimulador requiere IL-2
Los niveles de IL-2, IL-4, IFN-y e IL-10 producidos por celulas T despues de la coestimulacion con hB7-H1Ig, B7-1Ig o mAb espedficos para CD28 humano se midieron en presencia de mAb espedfico para CD3 humano (Fig. 7a-7d). Al igual que B7-1Ig y anti-CD28, el anticuerpo inmovilizado hB7-H1Ig aumento espectacularmente la produccion de IL-10 por celulas T en respuesta al mAb inmovilizado espedfico para CD3 humano despues de la estimulacion durante 48 y 72 horas (Fig. 7a). La IL-10 no se detectaba si las celulas T se coestimulaban con la Ig de control inmovilizada. El nivel de IFN-y se elevaba tambien significativamente por coestimulacion con hB7-H1Ig inmovilizada (Fig. 7b). En contraste con B7-1Ig y mAb espedficos para CD28 humana, la hB7-H1Ig coestimulaba niveles bajos o insignificantes de IL-2 (Fig. 7c) e IL-4 (Fig. 7d), respectivamente. Estas observaciones eran reproducibles en seis experimentos independientes. Estos resultados muestran que la coestimulacion por hB7-H1 estimula preferentemente la produccion de IL-10.
La produccion de IL-2, aunque baja, alcanzaba su maximo a la 24 horas tras la coestimulacion de hB7-H1 (Fig. 7c), mientras que la secrecion de IL-10 empezaba a aumentar solo despues de 48 y 72 horas (Fig. 7a). El aumento de las concentraciones de hB7-H1Ig condujo a un pequeno aumento (<1 ng/ml) de secrecion de IL-2 (Fig. 7e). Para determinar las funciones de la IL-2 de produccion temprana, se ensayaron los efectos de mAb espedfico para la IL-2 humana sobre la proliferacion de celulas T y la produccion de IL-10 en la coestimulacion mediada por B7H. Similar a la proliferacion de celulas T inducida por celulas B7-1-COS y mAb inmovilizado espedfico para CD3 humano, la proliferacion de celulas T inducida por celulas hB7-H1-COS y mAb espedfico para CD3 humano se bloqueaba
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mediante la inclusion de mAb espedfico para IL-2 humana (Fig. 8a). Ademas, la secrecion de IL-10 a partir de celulas T coestimuladas por hB7-H1Ig tambien era inhibida por el mAb espedfico para la IL-2 humana (Figura 8b). Por lo tanto, la coestimulacion por hB7-H1 de tanto el crecimiento de celulas T como de la secrecion de IL-10 es un proceso dependiente de IL-2.
Ejemplo 5. La coestimulacion de hB7-H1 aumenta la apoptosis de celulas T activadas.
Para determinar el efecto de la ligadura de hB7-H1 sobre la viabilidad de celulas T activadas, la proporcion de celulas T vivas que quedaban despues de la activacion con una dosis optimamente activa de mAb espedfica para CD3 humano en presencia de hB7-H1Ig inmovilizado se determino por tincion con azul de tripano. Se observo una disminucion constante de las celulas T vivas. Al final del cultivo, las celulas T se tineron con anexina V y yoduro de propidio (IP) para distinguir la fase temprana y la fase tardfa de la apoptosis, respectivamente. Las celulas apoptoticas en fase temprana (anexina V positiva, IP negativo) se incrementaron significativamente hasta 24,8 % en presencia de hB7-H1Ig en comparacion con 14,2% en ausencia de hB7-H1Ig en 5 experimentos (P = 0,001). Un experimento representativo se muestra en la Fig. 9a (panel superior). Se obtuvieron resultados similares utilizando celulas Jurkat tratadas con hB7-H1Ig (Ig de control: 38,3% frente a hB7-H1Ig: 54,6%) (Fig. 9a, panel inferior). El aumento de la apoptosis se asocio con regulacion al alza de la expresion de Fas y FasL en celulas T coestimuladas con hB7-H1 (Fig. 9b). Estos resultados indicaron que la coestimulacion con hB7-H1 aumento moderadamente la apoptosis de celulas T inducida por la activacion, y el aumento de la apoptosis se asocio con una elevada expresion de Fas y FasL.
Ejemplo 6. Produccion de anticuerpos monoclonales espedficos para hB7-H1.
Usando protocolos estandar, se inmunizaron ratones BALB/c con hB7-H1Ig purificada y esplenocitos de los ratones inmunizados se fusionaron con celulas de mieloma de raton X63-AG8.653. Se hallo que cinco lmeas de hibridoma secretaban anticuerpos espedficos para hB7-H1 ya que, como se detecto por citometna de flujo con fluorescencia, los sobrenadantes de los cultivo de estas lmeas de hibridoma teruan positivamente celulas hB7-H1/293 pero no se tenfan celulas vector de control/293. Ademas, algunos de los anticuerpos inhibfan la actividad coestimuladora de hB7-H1.
Ejemplo 7. Clonacion Molecular y patron de expresion de un gen B7-H1 de raton (mB7-H1)
Comenzando con dos clones EST de raton superpuestos (AA823166 y AA896104), y utilizando una estrategia similar a la del gen hB7-H1, se clono un fragmento de ADNc que inclrna un ORF que codifica mB7-H1. Se obtuvo la secuencia codificante para mB7-H1 (SEQ ID NO: 4) (Fig. 10) y de ella se derivo la secuencia de aminoacidos de mB7-H1 (SEQ ID NO: 3) (Fig. 11). La longitud de mB7-H1 es identica a la de hB7-H1 y tiene los mismos restos de cistema conservados que se encuentran en hB7-H1 (vease el Ejemplo 2). Un fragmento de ADNc que codifica mB7- H1 de longitud completa se clono en el vector pcADN3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para dar mB7-H1.pcADN3.
La mB7-H1, como la hB7-H1, es una protema transmembrana de tipo I de 290 aminoacidos que tiene 69% de homologfa global de aminoacidos con hB7-H1 (Fig. 12a). Similar a otros miembros de la familia B7, mB7-H1 consiste en un dominio similar a Ig V, un dominio similar a Ig C, un dominio transmembrana hidrofobo y una cola citoplasmatica. La mB7-H1 comparte 20 % de homologfa con B7-1 de raton, 14 % con B7-2 de raton y 19 % con B7h/B7RP-1 de raton, basado en analisis que utiliza el software McVector 6.5 (Programa Clustal W) (Fig. 12b).
El analisis de ARN revelo que el ARNm de mB7-H1 es significativa en corazon, bazo, pulmon, musculo esqueletico e hngado de raton, y menos significativa pero presente en rinon, hngado, timo y tiroides de raton. Asf, el patron de expresion de ARNm mB7-H1 es similar al del ARNm B7-H1 humano. Se observo una expresion despreciable del ARNm mB7-H1 en pancreas y testmulos.
El analisis FFC utilizando el anticuerpo anti-mB7-H1 mostro que las celulas T CD3+ de raton en reposo no expresan mB7-H1 (Fig. 13, panel superior). Sin embargo, una pequena fraccion de celulas B B220+ de raton y macrofagos Mac-1 + de raton expresaron un bajo nivel de mB7-H1 (Fig. 13, panel superior). La estimulacion de celulas T de raton con anticuerpos espedficos para CD3 de raton y CD28 de raton aumento moderadamente la expresion de mB7-H1 en celulas T. La activacion de celulas B de raton con LPS y macrofagos con LPS mas IFN-y aumento significativamente la expresion de mB7-H1 en sus superficies (Fig. 13, panel inferior). Asf, mB7-H1, como hB7-H1, es una molecula inducible de la superficie celular.
Ejemplo 8. Coestimulacion de la proliferacion de celulas T de raton mediante mb7-H1.
Para investigar el efecto coestimulador de mB7-H1, celulas T de raton purificadas con lana de nailon se activaron con una dosis suboptima de mAb espedfica para CD3 de raton (revestida sobre el fondo de los pocillos de cultivo a una concentracion de 200 ng/ml) y se coestimularon con diversas concentraciones de mB7-H1Ig. La mB7-H1Ig potencio la proliferacion de celulas T hasta 5 veces mas en comparacion con la Ig de control (Fig. 14a). El efecto coestimulador del mB7-H1Ig era dependiente de la dosis y dependiente de la presencia de mAb espedfico para CD3 de raton ya que en ausencia de mAb espedfico para cD3 de raton, mB7-H1Ig (hasta una concentracion de mB7- H1Ig de 10 pg/ml) fracasaba en su intento de estimular la proliferacion de celulas T. Cuando se cultivaron celulas T de raton purificadas con lana de nailon con celulas 293 transfectadas con mB7-H1.pcADN3 o vector de control en
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presencia de dosis suboptimas de mAb espedfico para CD3 de raton, las celulas 293 transfectadas con mB7-H1 tambien potenciaron sustancialmente la proliferacion de celulas T en comparacion con la proliferacion de celulas T en presencia de celulas 293 transfectadas con el vector de control. Asf, similar a hB7-H1, la mB7-H1 coestimula la proliferacion de celulas T.
La funcion de CD28 en la coestimulacion de mB7-H1 se evaluo comparando los efectos de la coestimulacion de mB7-H1Ig en celulas T aisladas de ratones CD28-/" y de ratones normales. Se activaron celulas T de raton purificadas con lana de nailon con dos dosis suboptimas de anticuerpo espedfico para CD3 de raton (revestidas sobre el fondo de los pocillos de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una concentracion de 0,125 pg/ml o 0,25 pg/ml) y bien anticuerpo soluble espedfico para CD28 de raton (2,5 pg/ml) o bien mB7-H1Ig o Ig de control (ambos revestidos sobre el fondo de los pocillos de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una concentracion de 10 pg/ml). Como se muestra en la Fig. 14b, mientras que no hubo ningun efecto coestimulador del mAb anti- CD28 en las celulas T CD28-/", mB7-H1Ig indujo la proliferacion tanto de las celulas T CD28-/" (Fig. 14b, panel derecho) como de las CD28+/+ (“wt”; Fig. 14b, panel izquierdo) en un grado similar. Por lo tanto, mB7-H1 puede coestimular el crecimiento de celulas T de una manera independiente de CD28.
Con el fin de comprobar si mB7-H1 coestimula preferentemente celulas T CD4+ o CD8+, se estimularon celulas T CD4+ y CD8+ purificadas con mB7-H1Ig (misma concentracion que en el experimento mostrado en la Fig. 14b) y mAb espedfico para CD3 de raton (revestido sobre el fondo de los pocillos de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una concentracion de 200 ng/ml). La proliferacion de celulas T CD4+ aumento aproximadamente 10 veces por mB7-H1Ig y la proliferacion de celulas T CD8+ solo aumento 2-3 veces mB7-H1Ig (Fig. 14c). Asf, el efecto coestimulador de mB7-H1 es mas potente en celulas T CD4+ que en celulas CD8+.
Ejemplo 9. Coestimulacion de la produccion de citocinas por mB7-H1.
Se midieron los niveles de IL-10, IFN-y, IL-2, IL-4 y GM-CSF producidos por celulas T activadas con mAb espedfico para CD3 de raton y se coestimularon con mB7-H1Ig o con mAb anti-CD28. La Fig. 15a muestra que mB7-H1Ig, similar al mAb espedfico para CD28 de raton, coestimula la produccion de altos niveles de IL-10 en los cultivos el dfa 3. La IL-10 no era detectable al dfa 3 cuando las celulas T se trataron con Ig de control y con mAb espedfico para CD3 de raton, o mAb espedfico para CD3 de raton en solitario. La mB7-H1 y el mAb espedfico para CD28 de raton mejoraron la produccion de IFN-y y GM-CSF. En contraste con el mAb espedfico para CD28 de raton, que indujo altos niveles de IL-2 e IL-4, la mB7-H1Ig indujo niveles nulos o insignificantes de IL-2 e IL-4 en todos los puntos temporales (Fig. 15a). Asf, mB7-H1 y hB7-H1 coestimulan la produccion de un espectro similar de citocinas.
Dado que la IL-2 no era detectable en sobrenadantes de cultivo de los cultivos coestimulados de mB7-H1Ig, pareda posible que la ligadura de mB7-H1 inhibiera la secrecion de IL-2. Para probar esta posibilidad, se ensayo el efecto de mB7-H1 sobre la secrecion de IL-2 por celulas T se activo mediante mAb espedfico para CD3 de raton y se coestimulo con mAb espedfico para CD28 de raton. La Fig. 15b muestra que la inclusion de mB7-H1Ig inmovilizada (a concentraciones de hasta 10 pg/ml) en el cultivo dio como resultado una pequena disminucion en la produccion de IL-2 durante el penodo de cultivo de 18-48 h que era estadfsticamente insignificante; en varios experimentos repetidos nunca se observo ninguna disminucion estadfsticamente significativa. De forma similar, la mB7-H1Ig no inhibio la produccion de IL-2 en los cultivos en los que las celulas T fueron activadas por mAb espedfico para CD3 de raton en solitario (Fig. 15b). Los resultados indican, asf, que la ligadura de mB7-H1 no inhibe la produccion de IL- 2.
Ejemplo 10. Expresion de mB7-H1 en celulas tumorales P815 transfectadas y velocidad de crecimiento disminuida de las celulas P815 transfectadas en ratones.
Se transfectaron de forma estable celulas de mastocitoma P815 de raton (DBA/2) con el plasmido de expresion (mB7-H1.pcADN3) que contema la secuencia codificante para mB7-H1 usando FUGENE® (Roche, Mannheim, Alemania) segun las instrucciones del fabricante. Las celulas transfectadas se seleccionaron en medio completo que contema G418 (1 mg/ml, Life Technologies) y se clonaron posteriormente mediante dilucion limitante. Las celulas P815 que expresan mB7-H1 se identificaron mediante FFC usando la preparacion de anticuerpo policlonal anti-mB7- H1 descrita anteriormente. Se selecciono un clon representativo (mB7-H1+ P815) para estudios adicionales. Los clones P815 transfectados con el vector pcADN (mock.P815) o MB7-1 (mB7-1+ P815) se generaron de forma similar [Chen et al., (1994) J. Exp. Med. 179, 523-532]. Utilizando un anticuerpo policlonal de rata conjugado con PE espedfico para mB7-H1 ("anti-mB7H/PE"), la expresion de mB7-H1 se detecto mediante FFC en las celulas mB7H- H1+ P815 (Fig. 18b) pero no en celulas P815 transfectadas simuladamente ("mock.P815") (Fig. 16b) o celulas P815 transfectadas con un constructo que codifica B7-1 murino ("mB7-1+ P815") (Fig. 17b). Por otra parte, las celulas mB7-1+ P815 se tineron con un mAb conjugado con FITC espedfico para B7-1 murino ("anti-mB7-1-FITC") (Fig. 17a). Ademas, la inclusion del peptido mB7-H1 usado para fabricar el anticuerpo anti-mB7-H1 policlonal en la mezcla de reaccion de tincion bloqueo completamente la union del anticuerpo anti-mB7-H1 policlonal a las celulas mB7-H1+ P815.
Se inyectaron subcutaneamente (s.c.) grupos (5 ratones por grupo) de ratones DBA/2 con 2x105 celulas mock.P815 o mB7-H1+ P815. La velocidad de crecimiento de las celulas mock.P815 era significativamente mayor en 4 de los 5 ratones inyectados (Fig. 19a) que en los 5 ratones inyectados con mB7-H1+ P815 (Fig. 19b). Estos hallazgos indican
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que las celulas mB7-H1+ P815 eran significativamente mas inmunogenicas que las celulas mock.P815 y, por tanto, esa expresion de la expresion de mB7-H1 por las celulas P815 potencia su capacidad para provocar inmunidad protectora.
Ejemplo 11. La coestimulacion mB7-H1 no logra potenciar las respuestas CTL alogenicas y singenicas
Para examinar el efecto de mB7-H1 sobre la generacion de CTL alogenicos in vitro, se co-cultivaron celulas T purificadas con lana de nailon de ratones B6 (H-2b) con mock.P815 irradiado (H-2d), mB7-1+ P815 o mB7-H1+ P815 durante 5 dfas y la actividad CTL de las celulas cosechadas de los cultivos se ensayo frente a celulas diana P815 de tipo salvaje en ensayos estandar de liberacion de 51Cr en las relaciones indicadas de celulas efectoras frente a diana ("relacion E/T"). Como se representa en la Fig. 20a, celulas mB7-H1+ P815 y las celulas mock.P815 eran estimuladores mediocres de la actividad de CTL. Por el contrario, las celulas mB7-1+ P815 provocaron una fuerte actividad de CTL espedfica para P815. Los CTL inducidos por mB7-1 eran espedficos del aloantfgeno ya que no lisan las celulas diana tumorales EL4 del haplotipo H-2 (H-2b) de respuesta (B6). Asf, la expresion de mB7-H1 no facilita la generacion de CTL alogenicos.
Se ensayo la capacidad de las celulas mB7-H1+ P815 para estimular CTL espedficos de tumor P815 in vivo. Se inyectaron s.c. ratones DBA/2 con celulas mock.P815, mB7-1+ P815, o mB7-H1+ P815. Los nodulos linfaticos que drenan el tumor se extrajeron 7 dfas mas tarde y las celulas T aisladas de ellos se cultivaron con celulas P815 de tipo salvaje durante 5 dfas. Las celulas cosechadas de los cultivos se ensayaron en cuanto a la actividad de CTL frente a celulas diana P815 de tipo salvaje en un ensayo estandar de liberacion de 51Cr en las relaciones E/T indicadas (Fig. 20b). Las celulas efectoras de ratones inyectados con mB7-H1+ P815 mostraron una actividad de CTL ligeramente aumentada frente a celulas P815 en comparacion con las celulas efectoras de los ratones inyectados con mock.P815; esta diferencia en la actividad de CTL era, sin embargo, estadfsticamente insignificante. En contraste, las celulas mB7-1+ P815 provocaron una fuerte actividad de CTL. La actividad de CTL era espedfica de tumor P815 ya que las celulas diana del tumor L1210 singenico no eran lisadas. Asf, la expresion de mB7-H1 en celulas P815 no potencia la induccion de la actividad de CTL frente a antfgenos tumorales P815.
Ejemplo 12. La coestimulacion de B7-H1 amplifica respuestas de celulas T auxiliares espedficas de antfgeno, respuestas humorales dependientes de celulas T y expresion de CD40L en celulas T.
Para investigar el efecto de la coestimulacion de mB7-H1 sobre la funcion de celulas T auxiliares, se inmunizaron ratones B6 con KLH conjugado con TNP el dfa 0 y se inyectaron con mB7-H1Ig el dfa 1 y el dfa 4. Se midieron las respuestas proliferativas in vitro de las celulas T obtenidas tanto de los nodulos linfaticos como de los bazos de los ratones inmunizados a diversas concentraciones de KLH. Como se muestra en la Fig. 21, las celulas T tanto de los bazos como de los nodulos linfaticos de ratones inmunizados con TNP-KLH proliferaron en respuesta a KLH de una manera que dependfa de la dosis. La administracion de mB7-H1Ig a ratones inmunizados con TNP-KLH amplifico las respuestas proliferativas in vitro posteriores de celulas T hasta 2-3 veces. Estos resultados indican que la coestimulacion de mB7-H1 potencia las respuestas de las celulas T auxiliares in vivo.
El efecto de la coestimulacion de mB7-H1 sobre la generacion de anticuerpos espedficos de antfgeno para TNP se investigo en un sistema bien reconocido como medidor de respuestas de anticuerpos dependientes de celulas T auxiliares [Marrack y Kappler (1975) J. Immunol. 114, 1116-1155; Romano et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 72, 4555-4558]. Asf, el nivel de anticuerpos espedficos para TNP en los sueros de ratones inmunizados con TNP-KLH se midio despues del tratamiento con Ig de control, mB7-1Ig o mB7-H1Ig. En experimentos preliminares, se observo un aumento significativo en el nivel total de IgG anti-TNP en sueros de ratones inmunizados con TNP- KLH y tratados con mB7-H1Ig en comparacion con sueros de ratones inmunizados con TNP-KLH y tratados con mIg de control. Se midieron cada uno de los niveles relativos de anticuerpos anti-TNP IgM y subclases individuales de IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3) provocados por la inmunizacion con TNP-KLH y las diversas coestimulaciones. Como se muestra en la Fig. 22, la cantidad de anticuerpo IgG2a espedfico de TNP se incremento significativamente en los sueros de ratones inmunizados con TNP-KLH y se trataron con mB7-H1Ig. El efecto fue diferente del provocado por mB7-1Ig en los que los niveles de anticuerpos espedficos para TNP de otras subclases de IgG (IgG1 e IgG2b) tambien aumentaron significativamente (Fig. 22). Asf, la coestimulacion mB7-H1 potencia la proliferacion de celulas auxiliares T y las respuestas de anticuerpos dependientes de auxiliares T, particularmente las respuestas de IgG2a.
La interaccion de CD40-ligando CD40 (CD40L) en las interacciones de celula auxiliares T-celulas B es cntica para la generacion de respuestas de anticuerpos y para la conmutacion de clases de Ig [Calderhead et al., (2000) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 245, 73-99]. Se investigo el efecto de la coestimulacion con mB7-H1Ig en el nivel de CD40L en celulas T. Las celulas T CD4+ purificadas de ratones B6 se estimularon con una concentracion suboptima de mAb espedfico para CD3 de raton en presencia de mB7-H1Ig o mAb espedfico para CD28 de raton. La expresion de CD40L en celulas T se detecto con un mAb espedfico para CD40L de raton por FFC. La coestimulacion de mB7- H1Ig regulo rapidamente al alza el CD40L (25,3% despues de 4 h de incubacion) en comparacion con la coestimulacion con IgG de control (6,6 %) o anticuerpo espedfico para CD28 de raton (10,5 %) (Fig. 23a). El nivel de CD40L fue tambien mayor despues de 24 h en celulas T coestimuladas con mB7-H1Ig que en celulas T coestimuladas con Ig de control o mB7-1Ig (Fig. 23a). Se obtuvieron resultados similares usando una dosis optima de mAb espedfico para CD3 de raton para activacion (Fig. 23b). Asf, el desencadenamiento del contador-receptor
B7-H1 sobre las celulas T regulo al alza rapidamente la expresion de CD40L. La invencion esta limitada unicamente por las reivindicaciones siguientes.

Claims (26)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un polipeptido aislado, en donde el polipeptido consiste en el resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 aminoacidos, en el resto de 290 de aminoacidos expuesto en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
  2. 2. El polipeptido de la reivindicacion 1 para su uso como medicamento.
  3. 3. El polipeptido para el uso de la reivindicacion 2, en donde el medicamento es un medicamento para ser administrado a un mairnfero, en particular a un mairnfero del que se sospecha que tiene una enfermedad de inmunodeficiencia, un estado inflamatorio o una enfermedad autoinmune.
  4. 4. Un acido nucleico que codifica el polipeptido de la reivindicacion 1, en donde el acido nucleico es para uso como un medicamento.
  5. 5. Una celula recombinante que es una progenie de una celula obtenida de un mairnfero y que ha sido transfectada o transformada ex vivo con un acido nucleico que codifica el polipeptido de la reivindicacion 1, de manera que la celula expresa el polipeptido, para su uso como medicamento, en donde la celula obtenida del mairnfero no es una celula embrionaria humana y en donde la transfeccion o transformacion con el acido nucleico no es un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
  6. 6. Una celula recombinante que es una progenie de una celula obtenida de un mairnfero y que ha sido transfectada o transformada ex vivo con un ADN que comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido, en donde el acido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3,
    en donde la celula expresa el polipeptido codificado por el acido nucleico, y
    en donde la celula recombinante es para uso como un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de inmunodeficiencia, un estado inflamatorio o una enfermedad autoinmune de dicho mairnfero, en donde la celula obtenida del mairnfero no es una celula embrionaria humana y en donde la transfeccion o transformacion con el acido nucleico no es un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
  7. 7. La celula recombinante para el uso de la reivindicacion 5 o 6, en donde la celula es una celula presentadora de antfgeno (APC) y la celula expresa el polipeptido en su superficie.
  8. 8. La celula recombinante para el uso de la reivindicacion 7, en donde la APC es una APC pulsada con un antfgeno o un peptido antfgeno.
  9. 9. Un polipeptido aislado codificado por un ADN que comprende:
    un acido nucleico que codifica un polipeptido, en donde el acido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o sEq ID NO: 3,
    en donde el polipeptido aislado es para uso como un medicamento para la administracion a un mairnfero que se sospecha que tiene un estado inflamatorio.
  10. 10. Un procedimiento in vitro de poner en contacto una celula T, comprendiendo el procedimiento cultivar la celula T in vitro con el polipeptido de la reivindicacion 1.
  11. 11. Un procedimiento para identificar un compuesto que inhibe una respuesta inmune, comprendiendo el procedimiento:
    (a) proporcionar un compuesto de ensayo;
    (b) cultivar, juntos, el compuesto, un polipeptido aislado, una celula T y una molecula que suministra una senal de activacion a una celula T; y
    (c) determinar si el compuesto de ensayo inhibe la respuesta de la celula T a la molecula, como una indicacion de que el compuesto de ensayo inhibe una respuesta inmune,
    en donde el polipeptido aislado esta codificado por un ADN que comprende:
    un acido nucleico que codifica un polipeptido, en donde el acido nucleico se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o sEq ID NO: 3.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 11, en donde la molecula es un anticuerpo que se une a un receptor de celulas T o un polipeptido CD3 o en donde la molecula es un aloantfgeno o un peptido antfgeno unido a una molecula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de una celula presentadora de antfgeno (APC), en particular una APC que es transfectada o transformada con un acido nucleico que codifica el polipeptido y
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    el polipeptido es expresado en la superficie de la APC.
  13. 13. Un procedimiento de identificacion de un compuesto que potencia una respuesta immune, comprendiendo el procedimiento:
    (a) proporcionar un compuesto de ensayo;
    (b) cultivar, juntos, el compuesto, un polipeptido aislado, una celula T y una molecula que suministra una senal de activacion a una celula T; y
    (c) determinar si el compuesto de ensayo potencia la respuesta de la celula T a la molecula, como una indicacion de que el compuesto de ensayo potencia una respuesta inmune,
    en donde el polipeptido aislado esta codificado por un ADN que comprende:
    un acido nucleico que codifica un polipeptido, en donde el acido nucleico se hibrida bajo condiciones rigurosas al complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o la SeQ ID NO: 3.
  14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en donde la molecula es un anticuerpo que se une a un receptor de celulas T o a un polipeptido CD3 o en donde la molecula es un aloantigeno o un peptido antfgeno unido a una molecula de MHC en la superficie de una APC, en particular una APC que es transfectada o transformada con un acido nucleico que codifica el polipeptido, y el polipeptido es expresado en la superficie de la APC.
  15. 15. Un anticuerpo que se une a un polipeptido que consiste en el resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 aminoacidos, en el resto de 290 de aminoacidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
  16. 16. Molecula B7-H1 para uso en el tratamiento de un estado inflamatorio, artritis reumatoide (RA), esclerosis multiple (MS) o diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), en donde las moleculas B7-H1 son
    polipeptidos codificados por un ADN que incluye un acido nucleico que (i) codifica un polipeptido con la capacidad de coestimular una celula T y (ii) hibrida en condiciones rigurosas al complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o
    polipeptidos que comprenden aminoacidos que tienen la secuencia del resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 aminoacidos, en el resto de 290 aminoacidos expuesto en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o
    polipeptidos que comprenden aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o cualquiera de estos aminoacidos, pero que difieren unicamente en una o mas sustituciones conservadoras o
    fragmentos funcionales de cualquiera de estos polipeptidos, en donde un fragmento funcional de un polipeptido es un fragmento del polipeptido que es mas corto que el polipeptido de longitud completa y tiene la capacidad de coestimular una celula T o
    protemas de fusion que contienen un primer dominio y al menos un dominio adicional, en donde el primer dominio es cualquiera de los polipeptidos o fragmentos funcionales o
    cualquiera de los polipeptidos y fragmentos funcionales modificados por la adicion, en los extremos amino- y/o carboxilo-terminales, de un agente bloqueante para facilitar la supervivencia del polipeptido correspondiente in vivo o
    cualquiera de los polipeptidos y fragmentos funcionales acoplados de forma covalente o no covalente a protemas portadoras farmaceuticamente aceptables.
  17. 17. Las moleculas B7-H1 para el uso de la reivindicacion 16, en donde el estado inflamatorio es un estado inflamatorio inducido por un agente infeccioso.
  18. 18. Procedimiento de coestimular una celula T que comprende poner en contacto una combinacion que comprende un polipeptido B7-H1 y (a) un anticuerpo que se une a un receptor de celulas T (TCR) o (b) un polipeptido del complejo CD3 que esta ffsicamente asociado con el TCR con una celula T CD4+ o una celula T CD8+ in vitro, o poner en contacto una combinacion que comprende un polipeptido B7-H1 y un aloantfgeno MHC con una celula T CD8+ in vitro en donde el polipeptido B7-H1 es
    un polipeptido codificado por un ADN que comprende un acido nucleico que tiene una secuencia que (i) codifica un polipeptido con la capacidad de coestimular una celula T y (ii) se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o SeQ ID NO: 3 o
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia del resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 aminoacidos, en el resto de 290 aminoacidos expuesto en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o
    un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o cualquiera de estos aminoacidos, pero que difieren unicamente en una o mas sustituciones conservadoras o
    un fragmento funcional de cualquiera de estos polipeptidos, en donde un fragmento funcional de un polipeptido es un fragmento del polipeptido que es mas corto que el polipeptido de longitud completa y tiene la capacidad de coestimular una celula T o
    una protema de fusion que contiene un primer dominio y al menos un dominio adicional, en donde el primer dominio es cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional o
    cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional modificado por la adicion, en los extremos amino- y/o carboxilo-terminales, de un agente bloqueante para facilitar la supervivencia del polipeptido correspondiente in vivo o
    cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional acoplados de forma covalente o no covalente a una protema portadora farmaceuticamente aceptable.
  19. 19. El procedimiento de la reivindicacion 18, en donde dicho anticuerpo se une a un polipeptido del complejo CD3 que esta ffsicamente asociado con el TCR.
  20. 20. Procedimiento de coestimular una celula T que comprende poner en contacto una combinacion que comprende un polipeptido B7-H1 y (a) un aloantfgeno de mHc o (b) un anticuerpo que se une a un receptor de celulas T (TCR) o (c) un polipeptido del complejo CD3 que esta ffsicamente asociado con el TCR con la celula T in vitro, en donde el polipeptido B7-H1 esta unido al suelo de un recipiente de cultivo especialmente un pocillo de una placa de plastico de microtitulacion y en donde el polipeptido B7-H1 es
    un polipeptido codificado por un ADN que comprende un acido nucleico que tiene una secuencia que (i) codifica un polipeptido con la capacidad de coestimular una celula T y (ii) se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o SeQ ID NO: 3 o
    un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia del resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 aminoacidos, en el resto de 290 aminoacidos expuesto en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o
    un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o cualquiera de estos aminoacidos, pero que difieren unicamente en una o mas sustituciones conservadoras o
    un fragmento funcional de cualquiera de estos polipeptidos, en donde un fragmento funcional de un polipeptido es un fragmento del polipeptido que es mas corto que el polipeptido de longitud completa y tiene la capacidad de coestimular una celula T o
    una protema de fusion que contiene un primer dominio y al menos un dominio adicional, en donde el primer dominio es cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional o
    cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional modificado por la adicion, en los extremos amino- y/o carboxilo-terminales, de un agente bloqueante para facilitar la supervivencia del polipeptido correspondiente in vivo o
    cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional acoplados de forma covalente o no covalente a una protema portadora farmaceuticamente aceptable.
  21. 21. El procedimiento de la reivindicacion 20, en donde dicho anticuerpo se une a un polipeptido del complejo CD3 que esta ffsicamente asociado con el TCR.
  22. 22. Uso de una solucion o un soporte solido que comprende un polipeptido B7-H1 o fragmento polipeptfdico y una molecula que suministra una senal de activacion a una celula T en un tratamiento ex vivo de celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC), en donde el polipeptido B7-H1 es
    un polipeptido codificado por un ADN que comprende un acido nucleico que tiene una secuencia que (i) codifica un polipeptido con la capacidad de coestimular una celula T y (ii) se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o SeQ ID NO: 3 o
    un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia del resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 aminoacidos, en el resto de 290 aminoacidos expuesto en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o
    5
    10
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    25
    30
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    un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o cualquiera de estos aminoacidos, pero que difieren unicamente en una o mas sustituciones conservadoras o
    un fragmento funcional de cualquiera de estos polipeptidos, en donde un fragmento funcional de un polipeptido es un fragmento del polipeptido que es mas corto que el polipeptido de longitud completa y tiene la capacidad de coestimular una celula T o
    una protema de fusion que contiene un primer dominio y al menos un dominio adicional, en donde el primer dominio es cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional o
    cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional modificado por la adicion, en los extremos amino- y/o carboxilo-terminales, de un agente bloqueante para facilitar la supervivencia del polipeptido correspondiente in vivo o
    cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional acoplados de forma covalente o no covalente a una protema portadora farmaceuticamente aceptable.
  23. 23. El uso segun la reivindicacion 22, en donde la senal de activacion se suministra a la celula T a traves del receptor de celulas T espedfico de antfgeno (TCR).
  24. 24. El uso segun la reivindicacion 22 o 23, en donde la molecula es un anticuerpo que se une al TCR o a un polipeptido del complejo CD3 que esta ffsicamente asociado con el TCR sobre la superficie de las celulas T, un aloantfgeno o un peptido de antfgeno unido a una molecula de MHC.
  25. 25. Una protema de fusion que comprende el dominio extracelular de B7-H1 humano fusionado con la porcion Fc de IgG2a de raton (hB7-H1Ig), en donde B7-H1 es
    un polipeptido codificado por un ADN que comprende un acido nucleico que tiene una secuencia que (i) codifica un polipeptido con la capacidad de coestimular una celula T y (ii) se hibrida en condiciones rigurosas al complemento de un acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o
    un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia del resto de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 3l o 32 aminoacidos, en el resto de 290 aminoacidos expuesto en la SEQ ID NO: 1 o
    un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, o que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 pero que difieren solamente en una o mas sustituciones conservadoras o
    un fragmento funcional de cualquiera de estos polipeptidos, en donde un fragmento funcional de un polipeptido es un fragmento del polipeptido que es mas corto que el polipeptido de longitud completa y tiene la capacidad de coestimular una celula T o
    una protema de fusion que contiene un primer dominio y al menos un dominio adicional, en donde el primer dominio es cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional o
    cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional modificado por la adicion, en los extremos amino- y/o carboxilo-terminales, de un agente bloqueante para facilitar la supervivencia del polipeptido correspondiente in vivo o
    cualquiera de los polipeptidos o el fragmento funcional acoplados de forma covalente o no covalente a una protema portadora farmaceuticamente aceptable.
  26. 26. Un procedimiento para inhibir un efecto coestimulador de B7-H1 humano en celulas T, en donde dichas celulas T se ponen en contacto con anticuerpos que se unen espedficamente a un polipeptido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 in vitro, en donde dicho efecto coestimulador de B7-H1 en las celulas T comprende la mejora de una respuesta efectora, una respuesta auxiliar o una respuesta supresora de dichas celulas T.
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