ES2328106T3 - Procedimiento para producir proteina con reduccion de fosfato de manosa en la cadena de azucar y glicoproteina prducida con el mismo. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para suprimir la formación de una cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa en una levadura que pertenece al género Pichia, en el que se suprime un gen que tiene la secuencia de bases de SEC. ID Nº: 2 en el listado de secuencias y que participa al menos en la adición de fosfato de manosa a una cadena de azúcar en la cadena de azúcar similar a núcleo de una glicoproteína introduciendo mutación/mutaciones dentro de dicho gen o usando un polinucleótido que tiene una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases de dicho gen.
Description
Procedimiento para producir proteína con
reducción de fosfato de manosa en la cadena de azúcar y
glicoproteína producida con el mismo.
La presente invención se refiere al control de
la adición de fosfato de manosa a una cadena de azúcar en la
producción de proteína heteróloga usando levadura. Más
particularmente, la invención se refiere al control de una función
formadora de cadena de azúcar ácida en la cadena de azúcar similar a
núcleo de la glicoproteína contenida en una levadura que pertenece
al género Pichia. La presente invención se refiere también a
un gen que participa en la adición de fosfato de manosa a una
cadena de azúcar, un gen mutante del mismo, un vector que lleva el
gen mutante, un transformante que se ha transformado por el vector,
un procedimiento para producir una proteína con reducción de una
cadena de azúcar ácida usando un medio para controlar el gen y una
proteína con reducción de cadena de azúcar ácida preparada por el
procedimiento. Además, la invención se refiere a una proteína
codificada por el gen anterior y a un anticuerpo que reconoce la
proteína.
La producción usando un microorganismo
genéticamente modificado es ventajosa sobre la producción usando
células de mamífero con respecto a diversos puntos que incluyen el
coste de producción bajo y la técnica de cultivo alta que se ha
acumulado como la tecnología de fermentación. Recientemente, se ha
prestado atención a una levadura metilotrópica que pertenece al
género Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris) como un
huésped efectivo para producir una proteína heteróloga [Creeg,
J.M., y col., Bio/Technology 11, 905 (1993)]. Las levaduras que
pertenecen al género Pichia tienen cantidades de expresión
secretora mucho más grandes que Saccharomyces cerevisiae y
las técnicas de cultivo para ellas están establecidas, de tal forma
que se usan muy adecuadamente como levaduras para producir
industrialmente seroalbúmina humana y así sucesivamente.
En el caso de que un microorganismo se use como
un hospedador para producir una glicoproteína heteróloga, sin
embargo, es imposible añadir una cadena de azúcar que tenga la misma
estructura y composición que una glicoproteína humana y esto es un
problema. Se conocen tres tipos para cadena de azúcar unida a
asparragina de glicoproteína derivada de células de mamífero
incluyendo células humanas, es decir, tipo complejo, tipo híbrido y
tipo alta en manosa. Por otro lado, en procariotas tales como
Escherichia coli, la adición per se de cadena de
azúcar no ocurre.
Para cadenas de azúcar unidas a asparragina en
Saccharomyces cerevisiae, sólo se conoce el tipo alto en
manosa. Con respecto a cadenas de azúcar unidas a asparragina de
glicoproteína en Saccharomyces cerevisiae, se añade en el
retículo endoplásmico cadena de azúcar similar a núcleo ER
(Man8GlcNAc2) común con aquella de mamíferos y en el siguiente
procedimiento se forma una gran cantidad (30-150
moléculas) de manosa como una cadena exterior de azúcar
[Kukuruzinska, M.A. y col., Ann. Rev. Biochem. 56, 915 (1987)]. Por
lo tanto, las cadenas de azúcar de tipo altas en manosa que se han
añadido a la glicoproteína derivada de Saccharomyces
cerevisiae contienen más cantidad de manosa que aquella de una
célula de mamífero, es decir, contienen principalmente cadenas de
azúcar hipermanosiladas.
El enlace \alpha-1,3 en manosa
de la cadena de azúcar de S. cerevisiae no se encuentra en
cadenas de azúcar de mamífero incluyendo ser humano. Por lo tanto
se considera que esta estructura podría exhibir una propiedad
antígénica para seres humanos [Ballou C.E., Methods Enzymol., 185,
440-470 (1990)]. Además, el hecho de que las
cadenas de azúcar estén implicadas en diversos papeles in
vivo tales como la depuración en sangre, el mantenimiento de
estructura proteica, la contribución a la actividad y la
localización [Takeuchi, Tanpakushitu Kakusan Kouso, tema especial
"Glycoconjugate", 37, 1713 (1992)] sugiere que una proteína
heteróloga que tiene una cadena de azúcar tipo alta en manosa
producida usando S. cerevisiae tiene un problema grande en el
aspecto de la función.
Recientemente, con respecto a S.
cerevisiae, se clonó el gen OCH1 que codifica la
\alpha-1,6-manosiltransferasa que
es la enzima clave para la elongación de manosa de la cadena
exterior de azúcar [Nakayama, K. EMBO J. 11, 2511 (1992)]. Se
comunicó que en mutante doble
\Deltaoch-mnm1-mutante doble que
tiene mutaciones tanto en gen OCH1 como en gen MNN1 que codifica
una proteína que tiene una función de añadir manosa a la cadena de
azúcar similar a núcleo con el enlace \alpha-1,3,
sólo se añade cadena de azúcar similar a núcleo ER común a aquella
de mamíferos [Jigami, Y., Tanpakushitsu Kakusan Kouso, 39, 657
(1994)].
Se sabe que una cadena de azúcar de tipo manosa
se añade en levaduras que pertenecen al género Pichia en una
manera similar a aquella de S. cerevisiae, mientras que se
muestra que el número de adiciones de manosas de una levadura que
pertenece al género Pichia es menor que aquel de S.
cerevisiae y que aquella cadena de azúcar de levaduras que
pertenecen al género Pichia no contiene enlace
\alpha-1,3 que se considera que es altamente
antigénico para los seres humanos [Trimble, R.B. y col., J. Biol.
Chem. 266, 22807 (1991)]. Además, se clonó un gen homólogo al gen
OCH1 de S. cerevisiae y se confirmó que el control del gen en
cepa de levaduras que pertenece al género Pichia suprime la
elongación de la cadena de azúcar. Por lo tanto, esta cadena es
útil como un huésped para producir una glicoproteína heteróloga que
tiene una estructura de cadena de azúcar similar al tipo humano
[patente japonesa abierta a inspección pública Hei
9-3097].
Aunque se ha desarrollado una técnica que
suprime la elongación de la cadena de azúcar y permite expresar una
glicoproteína similar a la cadena de azúcar similar a núcleo ER,
queda el siguiente problema también en una levadura que pertenece
al género Pichia: una proteína heteróloga tiene una
antigenicidad causada por una cadena de azúcar ácida en el caso de
que la glicoproteína heteróloga producida usando una levadura como
un huésped se administre a seres humanos como una medicina.
Se sabe que una cadena de azúcar ácida añadida
por manosa-6-fosfato
(MAn-6-P) a una cadena de azúcar de
tipo núcleo y/o a una cadena exterior de azúcar se forma(n)
en S. cerevisiae [Hernández, L.M. y col J. Biol. Chem. 264,
13648-13659 (1989)]. Como la figura 1 ilustra, no
sólo se añade fosfato de manosa a la cadena exterior de azúcar sino
que también se añade a la cadena de azúcar similar a núcleo en S.
cerevisiae [Jigami, Y. y Ouani, Y., Biochim. Biophys. Acta,
1426, 335-345 (1999)]. Esta cadena de azúcar que
contiene el grupo fosfato no se encuentra en cadenas de azúcar de
tipo humano. Por lo tanto, es muy probable que esto tenga una
antigenicidad y se considera que esto puede ser un problema grande
en el caso de desarrollar una medicina. Con respecto a S.
cerevisiae, se han clonado y se han analizado el gen MNN4 y el
gen MNN6 como genes que participan en la transferencia de fosfato
de manosa [Odani, T. y col. Glycobiology 6, 805 (1996); Wang, X.-H.,
y col. J. Biol. Chem., 272, 18117 (1997)]. Se confirmó in
vitro que la transferencia de fosfato de manosa a la cadena de
azúcar similar a núcleo o Man5GlcNAc2 depende de Mnn6p (proteína
codificada por MNN6). Por lo tanto, se asume que el gen MNN6
codifica el cuerpo principal de fosfato de manosa transferasa.
Además, con respecto al gen MNN4, la actividad
de transferencia de fosfato de manosa se suprime en mutante mnn4 y
el contenido en fosfato está incrementado por la sobreexpresión. Por
lo tanto, el gen MNN4 se considera que es un factor que controla
positivamente la proteína Mnn6. Se puede dilucidar que la
transferencia de fosfato a una cadena de azúcar está disminuida en
levadura cuyo gen MNN4 está interrumpido por una técnica de
ingeniería genética [patente japonesa abierta a inspección pública
Hei 9-266792]. Por lo tanto, la levadura se puede
usar para producir una glicoproteína que tiene una antigenicidad
reducida para seres humanos. Sin embargo, incluso si se usa la cepa
de gen MNN4 controlado de S. cerevisiae, la cadena de azúcar
ácida en la cadena de azúcar similar a núcleo no se puede suprimir
suficientemente, con menos del 30% de la cadena de azúcar completa
siendo una cadena de azúcar ácida [Odani T. y col., Glycobiology 6,
805-810 (1996); patente japonesa abierta a
inspección pública Hei
9-266792].
9-266792].
Por otro lado, con respecto a levaduras que
pertenecen al género Pichia, sólo se han publicado unas pocas
comunicaciones que conciernen a la cadena de azúcar fosforilada de
una proteína heteróloga hasta ahora. Por ejemplo, en el dominio
kringle 2 del activador de plasminógeno tisular, se ha transferido
un grupo de fosfato de manosa al 20% de la cadena de azúcar de
Man10-14GlcNAc2 [Miele, R.G. y col. Biotechnol.
Appl. Biochem. 26, 79 (1997)]. Además, aunque el grupo fosfato de
manosa se detectó en la cadena de azúcar de
man9-14GlcNAc2 de proteasa aspártica, no se detectó
una cadena de azúcar fosforilada en cinco proteínas heterólogas
distintas investigadas al mismo tiempo [Montesino, R. y col.
Protein Exp. Purif. 14, 197 (1998)]. Por lo tanto, con respecto a
una levadura que pertenece al género Pichia, la frecuencia de
la transferencia de fosfato de manosa a una cadena de azúcar podría
ser baja, pero las cadenas de azúcar fosforiladas se detectan en
algunas proteínas heterólogas producidas de este modo. Por lo
tanto, sería deseable suprimir la adición de fosfato de manosa a la
cadena de azúcar en el caso de que sea administrada a seres humanos
como una medicina.
Montesino, R. y col. (Variation in
N-linked oligosaccharide structures on heterologous
proteins selected by the methylotropic yeast Pichia
pastoris. Protein Expression and Purification, 1998,
14(2): 197-207) comunican la caracterización
de oligosacáridos unidos en N en seis glicoproteínas ajenas
segregadas a partir de la levadura metilotrópica Pichia
pastoris. Se observó que los carbohidratos en estas proteínas
varían en tamaño, con las estructuras Man8GlcNAc2 y Man9GlcNAc2
siendo las especies más frecuentemente observadas. Las cantidades
sustanciales de estructuras de oligomanósido más cortas estaban
presentes sólo en invertasa y son comunes estructuras más largas
(hasta Man18GlcNAc2) en proteasa aspártica y enteroquinasa. Se
observaron oligosacáridos fosforilados en una proteína, proteasa
aspártica. A diferencia de oligosacáridos en glicoproteínas
seleccionadas de S. cerevisiae, no se observa ninguna
manosilación unida en alfa 1,3 en cualquiera de las seis proteínas
secretadas por P. pastoris. A partir de estos resultados, es
evidente que la mayoría de las proteínas extrañas secretadas por
P. pastoris no están sometidas a la manosilación extensiva
(hiperglicosilación) que ocurre comúnmente en proteínas segregadas
de S. cerevisiae.
Martinet, W. y col. (Modification of the protein
glycosylation pathway in the methylotrophic yeast Pichia
pastoris. Biotechnology Letters, 1998, 20(12):
1171-1177) describe el uso de una
\alpha-1,2-manosidasa de
Trichoderma reesei para modificar la glicosilación unida en N
de la levadura Pichia pastoris metilotrópica. Se observó la
expresión de glicoproteínas del virus influenza ajenas con
oligosacáridos unidos en N más extensivamente procesados cuando se
segregó \alpha-1,2-manosidasa en
el medio de cultivo. Sin embargo, la eliminación intracelular de
los residuos de manosa puede estimular actividad manosiltransferasa
y puede conducir a hiperglicosilación. La selección suicida de
[^{3H}]manosa o las altas concentraciones de ortovanadato,
usadas comúnmente para aislar mutantes de glicosilación de
Saccharomyces cerevisiae, no tienen efecto profundo en
Pichia pastoris.
Aunque el sistema de expresión que usa una
levadura que pertenece al género Pichia como un huésped es
efectivo para la producción industrial debido a su alta
productividad, el mecanismo de la transferencia de de fosfato de
manosa a la cadena de azúcar de una glicoproteína originalmente
poseída o producida, como una proteína heteróloga, por una levadura
que pertenece al género Pichia ha sido estudiada sólo
insuficientemente. Por lo tanto, con respecto a una levadura que
pertenece al género Pichia, el mecanismo de transferencia
del fosfato de manosa a una cadena de azúcar de glicoproteína es
bastante desconocido y es una cuestión importante desde el punto de
vista de evitar la antigenicidad en el desarrollo de una medicina
para administrar a seres humanos o mamíferos para suprimir la
transferencia de fosfato de manosa en un sistema de expresión de
glicoproteínas en el que la levadura que pertenece al género
Pichia se usa como un huésped.
Así, los propósitos de la presente invención son
encontrar un gen que participe en la adición de fosfato de manosa a
la cadena de azúcar de la glicoproteína derivada de una levadura que
pertenece al género Pichia y proporcionar un medio para
controlar la adición. Otros propósitos de la presente invención son
proporcionar un procedimiento para producir una proteína cuya
cadena de azúcar ácida se redujo usando una cepa de levadura que
pertenece al género Pichia en el que el gen está controlado y
producir una glicoproteína producida por el procedimiento.
Los exámenes con gran celo en el trabajo de los
solicitantes para resolver estos problemas dieron como resultado el
éxito de la clonación del gen que codifica una proteína que se
origina a partir de una levadura que pertenece al género
Pichia y participa en la adición de fosfato de manosa, el
hallazgo de que la proteína participa en la adición de fosfato de
manosa en un sistema de expresión que usa una levadura que pertenece
al género Pichia como un huésped y la confirmación de que la
cadena de azúcar ácida de la glicoproteína producida usando la cepa
de gen controlado está remarcablemente reducida y consecuentemente
alcanzaron la finalización de la presente invención.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para suprimir la formación de una cadena de azúcar que
tiene fosfato de manosa en una levadura que pertenece al género
Pichia, en el que se suprime un gen que tiene la secuencia
de bases de SEC. ID Nº: 2 en el listado de secuencias y que
participa al menos en la adición de fosfato de manosa a una cadena
de azúcar en la cadena de azúcar similar a núcleo de una
glicoproteína introduciendo mutación/mutaciones dentro de dicho gen
o usando un polinucleótido que tiene una secuencia de bases
complementaria con la secuencia de bases de dicho gen, un
polinucleótido que contiene la secuencia de bases mostrada por los
nucleótidos del 150º al 2480º de la secuencia de bases de SEC. ID
Nº: 2 en el listado de secuencias que codifica una proteína que
participa en la formación de una cadena de azúcar que tiene fosfato
de manosa en la cadena de azúcar similar a núcleo derivada de una
levadura que pertenece al género Pichia, un polinucleótido
que tiene una función reducida induciendo mutación/mutaciones al
polinucleótido, un vector recombinante que lleva el polinucleótido
que tiene una función reducida, un procedimiento para producir una
glicoproteína usando el procedimiento supresor anterior o el
transformante anterior en la producción de una glicoproteína
heteróloga por la técnica de ingeniería genética que usa una
levadura que pertenece al género Pichia como un huésped, una
glicoproteína producida por el procedimiento para producir una
glicoproteína, una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de secuencias y un
anticuerpo que reconoce específicamente la proteína.
La presente invención se describirá en detalle
más adelante.
La figura 1 ilustra la estructura de una cadena
de azúcar unida a asparragina de S. cerevisiae (símbolos:
Ans, asparragina; GNAc, N-acetilglucosamina; M,
manosa; P, fosfato) (parcialmente modificado a partir de la figura
1 en Jigami, Y. y Odani, T., Biochim. Biophys. Acta, 1426,
335-345 (1999)).
La figura 2 ilustra el plásmido pTM004 dentro
del que se ha subclonado el gen PNO1 de una levadura que pertenece
al género Pichia.
La figura 3 ilustra regiones homólogas entre el
gen PNO1 de una levadura que pertenece al género Pichia y el
gen MNN4 de S. cerevisiae.
La figura 4 ilustra el plásmido pRH101 para
expresar gen de la antitrombina III (ATIII) humana en una levadura
que pertenece al género Pichia.
La figura 5 ilustra el protocolo para construir
plásmido pTM009, en el que está controlado el gen PNO1, para
expresar ATIII humana en una levadura que pertenece al género
Pichia.
La figura 6 ilustra la preparación de cepa de
levadura 9G4 que pertenece al género Pichia, en la que está
controlado el gen PNO1, para expresar ATIII humana.
La figura 7 ilustra perfiles de cultivo de cepas
RH101 y 9G4 usando fermentadores de tanque.
La figura 8 ilustra resultados de los análisis
de (A) productos después de reacción enzimática, (B) productos
después de tratamiento ácido y (C) productos después de tratamiento
con fosfatasa ácida y fosfatasa alcalina, de ATIII recombinante
derivada de una levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia.
La figura 9 ilustra análisis estructural de
cadenas de azúcar de ATIII recombinante derivada de una levadura de
tipo natural que pertenece al género Pichia y ATIII
recombinante derivada de una cepa de gen PNO1 controlado.
Las cantidades de aplicación de (A) y (B) fueron
1/5 de aquellas de (C) y (D).
(A) Una cadena de azúcar neutral de ATIII
recombinante derivada de cepa RH101.
(B) Una cadena de azúcar neutral de ATIII
recombinante derivada de cepa 9G4.
(C) Una cadena de azúcar ácida de ATIII
recombinante derivada de cepa RH101.
(D) Una cadena de azúcar ácida de ATIII
recombinante derivada de cepa 9G4.
La figura 10 ilustra la evaluación por ELISA de
la inhibición por ATIII humana derivada de plasma en la reacción de
unión de ATIII humana recombinante inmovilizada derivada de una
levadura de tipo natural que pertenece al género Pichia o de
ATIII humana recombinante derivada de una cepa de gen PNO1
controlado con un antisuero contra ATIII humana recombinante
derivada de una levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia o antisuero contra ATIII humana recombinante
(derivada de una cepa de gen PNO1 controlado).
La proteína que participa en la formación de una
cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa según la presente
invención es aquella producida por una levadura que pertenece al
género Pichia y tiene una función para adición de fosfato de
manosa a una cadena de azúcar de una glicoproteína, en particular
para la adición de fosfato de manosa implicada en la cadena de
azúcar similar a núcleo. Una cadena de azúcar que tiene fosfato de
manosa es una cadena de azúcar ácida. Las levaduras que pertenecen
al género Pichia según la presente invención de las que se
deriva una proteína que participa en la formación de la cadena de
azúcar incluyen, por ejemplo, Pichia pastoris, Pichia
finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia
membranafaciens, Pichia methanolica, Pichia opuntiae, Pichia
thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercum, Pichia
pijperi y otras levaduras, pero no están limitadas a ellas.
Pichia pastoris (llamada P. pastoris de ahora en
adelante) se usa preferiblemente entre éstas.
Una proteína que participa en la formación de
una cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa según la presente
invención es una proteína que se deriva originalmente de una
levadura que pertenece al género Pichia y tiene una función
descrita anteriormente. Es preferiblemente una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº: 1 en el listado de
secuencias en su región N-terminal, más
preferiblemente una proteína que contiene sustancialmente la
secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de
secuencias.
Tal secuencia de aminoácidos se puede modificar
en parte sustituyendo, delecionando, insertando, y/o añadiendo uno
o más restos de aminoácidos o cadenas peptídicas hasta el punto en
que la propiedad anterior no se cambie. Una proteína según la
presente invención puede ser una proteína que tenga una homología
del 70% o más con los aminoácidos de la proteína que contiene la
secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de
secuencias y tiene una actividad de formar una cadena de azúcar
ácidos en la cadena de azúcar similar a núcleo de una glicoproteína
producida por una levadura que pertenece al género
Pichia.
Así, una proteína según la presente invención se
selecciona del grupo constituido por:
(1) una proteína mostrada por la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de secuencias;
(2) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de secuencias;
(3) una proteína que tiene una homología del 70%
o más con la secuencia de aminoácidos de la proteína anteriormente
mencionada (2) y participa en la formación de una cadena de azúcar
que tiene fosfato de manosa en la cadena de azúcar similar a núcleo
de una glicoproteína producida por una levadura que pertenece al
género Pichia; y
(4) una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº: 1 en el listado de secuencias en el
extremo N-terminal y que participa en la formación
de una cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa en la cadena de
azúcar similar a núcleo de una glicoproteína producida por una
levadura que pertenece al género Pichia.
La presente invención reivindica también un
polipéptido que tiene una secuencia constituida por cinco
aminoácidos o más consecutivos seleccionados de la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de secuencias y un
anticuerpo que reconoce inmunológicamente la proteína anterior. El
polipéptido es útil como un antígeno para obtener un anticuerpo que
reconoce específicamente la proteína anterior.
La proteína que participa en la formación de una
cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa según la presente
invención puede producirse cultivando una levadura que pertenece al
género Pichia según el procedimiento convencional,
preferiblemente bajo una condición adecuada para la proliferación de
la levadura, seguido por extracción/purificación según el
procedimiento convencional a partir de las células obtenidas. El
polipéptido se puede sintetizar en base a la secuencia de
aminoácidos ejemplificada en la presente invención o se puede
producir por la técnica de ADN recombinante convencional en base a
la secuencia básica ejemplificada en la presente invención. El
anticuerpo tal como anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal se
puede producir por procedimientos bien conocidos para producir
anticuerpos. El polipéptido anterior así preparado y un anticuerpo
que reconoce la proteína anterior, son útiles para obtener un medio
para controlar la expresión de una glicoproteína ácida en un
sistema de expresión de glicoproteínas usando una levadura que
pertenece al género Pichia como un huésped, por ejemplo,
para purificar y obtener una proteína que participe en la formación
de una cadena de azúcar ácida según la presente invención. Para
facilitar la siguiente descripción, la proteína constituida por la
secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de
secuencias de la presente invención puede llamarse "proteína
Pno1" y el gen que codifica la proteína se llama "gen
PNO1".
El gen que participa en la formación de una
cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa según la presente
invención se caracteriza por tener una secuencia de bases que
codifica la proteína Pno1 derivada de una levadura que pertenece al
género Pichia según la presente invención descrita
anteriormente. Una secuencia de bases tal es, por ejemplo, una
secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC.
ID Nº: 3 en el listado de secuencias, más preferiblemente un
polinucleótido sustancialmente desde la base 150ª hasta la base
2480ª de la secuencia de bases de SEC. ID Nº: 2 en el listado de
secuencias, aunque se puede usar cualquier secuencia de bases que
pueda codificar la proteína Pno1 según la presente invención. Una
secuencia de bases tal puede ser un polinucleótido que contiene al
menos 60 bases consecutivas a partir del extremo 5' de la secuencia
codificante de proteínas en la secuencia de bases de SEC. ID Nº: 2
en el listado de secuencias y codifica la proteína que participa en
la formación de la cadena de azúcar ácida en una levadura que
pertenece al género Pichia.
El gen se puede producir por procedimientos bien
conocidos. Por ejemplo, al menos una parte del ADN o el ADN entero
se puede producir usando un sintetizador de ADN en base a la
secuencia básica ejemplificada en la presente invención. El gen
puede también producirse por la amplificación con el procedimiento
de PCR usando el ADN cromosómico de una levadura que pertenece al
género Pichia (por ejemplo, P. pastoris).
El gen que participa en la formación de una
cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa según la presente
invención se proporciona como un gen que codifica proteína Pno1
producida por una levadura que pertenece al género Pichia
primero por la presente invención. Por lo tanto, el gen que
participa en la formación de una cadena de azúcar que tiene fosfato
de manosa según la presente invención es muy útil en dilucidar el
mecanismo de transferencia del fosfato de manosa que se ha añadido
a una cadena de azúcar de una glicoproteína en un sistema de
expresión de glicoproteínas usando una levadura que pertenece al
género Pichia como un huésped.
La proteína Pno1 según la presente invención
tiene una función de transferir fosfato de manosa a una cadena de
azúcar de una glicoproteína producida usando una levadura que
pertenece al género Pichia como un huésped y es más
antigénica frente a seres humanos comparada con una glicoproteína
derivada de una célula de mamífero. Por lo tanto, la dilucidación
del gen PNO1 según la presente invención permitiría en el futuro,
proporcionar un procedimiento para reducir o eliminar en un nivel
génico una actividad de transferencia de fosfato de manosa
originalmente poseída por una levadura que pertenece al género
Pichia para expresar/producir, usando una levadura que
pertenece al género Pichia como un huésped, una glicoproteína
heteróloga útil farmacéuticamente a la que no está añadido un grupo
fosfato de manosa. Se puede lograr reducir o eliminar la actividad
de transferencia de fosfato de manosa originalmente poseída por la
proteína Pno1 según la presente invención modificando el gen PNO1
según la presente invención tal como para suprimir al menos la
producción de un producto funcional codificado por el ADN.
Al transformante según la presente invención, se
aplica uno de los procedimientos que permite suprimir la expresión
del gen PNO1 o hacer al transformante expresar un producto que tiene
una función atenuada comparado con un producto funcional nativo
para reducir o eliminar la actividad de transferencia de fosfato de
manosa originalmente poseída por la proteína Pno1 según la presente
invención. Los procedimientos incluyen, por ejemplo, un
procedimiento en el que un polinucleótido derivado del gen PNO1 se
transforma usando un vector recombinante que lleva un
polinucleótido modificado tal como para suprimir al menos la
producción de un producto funcional codificado por el gen y un
procedimiento en el que la traducción/expresión de un producto
funcional codificado por el gen se suprime usando el oligonucleótido
antisentido contra el gen.
La interferidora de PNO1 según la presente
invención es una levadura que pertenece al género Pichia que
tiene una capacidad suprimida de transferir fosfato de manosa en la
cadena de azúcar similar a núcleo de una glicoproteína comparada
con una cepa de levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia en base a tener un gen PNO1 modificado.
El "gen PNO1 modificado" es un gen en el
que una parte de la secuencia de bases del ADN que codifica una
proteína que participa en la transferencia de fosfato de manosa a
la cadena de azúcar similar a núcleo de una glicoproteína derivada
de una levadura que pertenece al género Pichia se modifica
tal como para suprimir al menos la producción de un producto
funcional codificado por el ADN.
"Para al menos suprimir la producción de un
producto funcional" quiere decir no sólo el caso en el que no se
expresa el gen PNO1 y no se produce proteína Pno1 de tipo nativo
según la presente invención, sino también el caso en el que un
producto obtenido, incluso si se expresa, no es idéntico a la
proteína de Pno1 para la presente invención y la función está
atenuada (es decir, el caso en el que el producto no tenga ninguna
actividad de transferencia de fosfato de manosa poseída por la
proteína Pno1 de tipo nativo y el caso en el que el producto tenga
una actividad de transferencia de fosfato de manosa menor que
aquella de la proteína Pno1 nativa).
La "levadura de tipo natural que pertenece al
género Pichia" quiere decir una cepa de levadura que
pertenece al género Pichia que tiene el gen PNO1 de tipo
nativo y que mantiene la actividad de transferencia de fosfato de
manosa original.
Por lo tanto, se pueden usar cualesquiera
realizaciones para modificar un gen hasta que la realización haga
la expresión del gen imposible o reduzca la expresión, o se puede
usar un producto expresado usando gen PNO1 modificado que no tiene
ninguna actividad de transferencia de fosfato de manosa en la cadena
de azúcar similar a núcleo poseída originalmente por un producto de
gen PNO1 de tipo nativo, o se puede usar un producto que tiene una
actividad de transferencia de fosfato de manosa reducida comparada
con la actividad de transferencia de fosfato de manosa en la cadena
de azúcar similar a núcleo poseída originalmente por el producto del
gen PNO1 de tipo nativo incluso si lo hace.
Las realizaciones incluyen, por ejemplo, una
modificación en la que al menos un nucleótido se elimina de o se
inserta dentro de la secuencia de bases de ADN del gen PNO1 y de la
región promotora de PNO1 y una modificación en la que al menos un
nucleótido está sustituido en la secuencia de bases en el gen PNO1
de tipo nativo y en la región promotora de PNO1. "Región
promotora de PNO1" quiere decir un ADN que regula la expresión de
gen PNO1 en el lado 5' del gen PNO1. Las realizaciones incluyen
también una modificación en la que al menos se añade un nucleótido
en las secuencias de bases del gen PNO1 de tipo nativo y en la
región promotora de PNO1. Tal modificación mueve la fase de
lectura, de tal forma que el producto no puede expresarse o se
expresa en una cantidad reducida incluso si se expresa, o la
función del producto obtenido puede llegar a ser diferente de
aquella de un producto derivado de un ADN de tipo nativo.
Los procedimientos de modificación adecuados
incluyen un procedimiento en el que un gen marcador para una
transformación se inserta en la región codificante del gen PNO1 de
tipo nativo. Este procedimiento permite interrumpir ventajosamente
el gen PNO1 de tipo nativo y permite rastrear fácilmente un mutante
que tiene el gen PNO1 modificado usando el gen marcador introducido
como un índice. También es posible insertar un gen que codifique
una glicoproteína para producir además del gen marcador de
transformación. Esto permite modificar el gen PNO1 y expresar la
glicoproteína a producir simultáneamente en una operación.
Los genes marcadores de transformación para la
presente invención incluyen gen HIS4, gen ARG4, gen URA3, gen SUC2,
gen ADE 1, gen ADE 2, gen resistente G418, gen de resistencia a
Zeocina y así sucesivamente, de P. pastoris o de
Saccharomyces cerevisiae.
Con relación a los genes de glicoproteína,
cualesquiera glicoproteínas deseadas de codificación de ADN a
producir se pueden usar para la presente invención. Incluyen gen de
antitrombina III (ATIII), gen de fibrinógeno, gen de cofactor de
heparina II, gen de anticuerpos, gen de uroquinasa, gen de
interferón \alpha, gen de quimasa, gen inhibidor de tripsina
urinaria y así sucesivamente.
Una interferidora de PNO1 según la presente
invención se puede preparar por diversos procedimientos. Aquellos
procedimientos incluyen la modificación del gen PNO1 de tipo nativo
en una levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia o la introducción de mutación aleatoria dentro de una
levadura de tipo natural que pertenece al género Pichia
seguida por la selección de un mutante que muestra la transferencia
de fosfato de manosa suprimida comparada con una levadura de tipo
natural que pertenece al género Pichia. La modificación del
gen PNO1 de tipo nativo en una levadura de tipo natural que
pertenece al género Pichia se usa preferiblemente.
El procedimiento para preparar una cepa de
levadura modificada que pertenece al género Pichia
modificando el gen PNO1 de tipo nativo se puede llevar a cabo,
concretamente, introduciendo ADN a transducirse en una posición
específica del gen PNO1 de tipo nativo por el procedimiento de
integración específico de sitio. Un ADN transducido se integra
reemplazando el ADN de tipo nativo intrínseco de un huésped. Un
procedimiento adecuado para introducir ADN a transducirse dentro de
una posición objetivo de un huésped de levadura es preparar un
fragmento de ADN lineal en el que se elimina el interior del
fragmento de ADN del gen objetivo o se inserta un ADN de gen
marcador de selección o un fragmento de ADN de expresión génica que
codifica una glicoproteína. Así, se da dirección tal como para
causar recombinación homóloga en un sitio específico de un ADN cuyo
producto de expresión afecta la actividad de transferencia de
fosfato de manosa por la transformación.
Con el fin de suprimir al menos la producción de
un producto funcional codificado por el gen PNO1, también es
posible construir un oligonucleótido antisentido contra el gen PNO1
para usar una levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia dentro de la que se importa el oligonucleótido
antisentido. En una levadura de tipo natural que pertenece al
género Pichia dentro de la que se importa el oligonucleótido
antisentido contra el gen PNO1, la trascripción de mRNA a partir
del gen PNO1, la transferencia del mRNA transcrito del núcleo al
citoplasma y la traducción de la proteína Pno1 están inhibidas, de
tal forma que la proteína Pno1 no se sintetiza. El oligonucleótido
antisentido contra el gen PNO1 se puede sintetizar fácilmente por el
procedimiento de sintetizar ADN bien conocido preferiblemente
seleccionando una secuencia de base específica para el gen PNO1 en
base a la secuencia de bases del gen PNO1 (SEC. ID Nº: 2 en el
listado de secuencias).
La transformación de una levadura de tipo
natural que pertenece al género Pichia se puede llevar a cabo
por un procedimiento usual adoptado en el campo tal como el
procedimiento de esferoplastos [Creeg, J. M. y col. Mol. Cell Biol.
5, 3376 (1985)], el procedimiento de cloruro de litio [Ito, H. y col
J. Bacterial. 153, 163 (1983)], el procedimiento de electroporación
[Scorer, C.A. y col. J. Bio/technology 12, 181 (1994)] y así
sucesivamente.
Aunque se pueden usar cualesquiera células
huésped derivadas de levadura de tipo natural que pertenezcan al
género Pichia para la transformación, se usan preferiblemente
las levaduras metilotrópicas que pueden usar metanol eficientemente
como la única fuente de carbono y energía. Las levaduras
metilotrópicas adecuadas incluyen cepa GTS115 de P. pastoris
auxotrópica (NRRL Y-15851) (his4), cepa GS190 de
P. pastoris (NRRL Y-18014) (his4, ura3),
cepa PPF1 de P. pastoris (NRRL Y-18017)
(his4, arg4), cepa KM71H de P. pastoris (Invitrogen Co.)
(his4, aox1::ARG4, arg4), cepa SMD1168 de P. pastoris
(Invitrogen Co.) (his4, pep4), cepa SMD1168H de P. pastoris
(Invitrogen Co.) (pep4), cepa PMAD11 de P. methanolica
(Invitrogen Co.) (ade2-1), cepa PMAD16 de P.
methanolica (Invitrogen Co.) (ade2-11, pep4D,
prb1D), P. pastoris de tipo natural (NRRL
Y-11430, NRRL Y-11431,
X-33) y derivados de las mismas.
En el caso de que la célula huésped sea una cepa
que carezca de al menos un gen marcador auxotrópico que se
eliminara, es preferible usar un ADN que tenga el gen de marcador
auxotrófico que se elimine de la célula huésped para la
transducción. Un procedimiento tal tiene ventajas debido a que un
transformante (cepa de levadura modificada que pertenece al género
Pichia) cuyo gen PNO1 se modificó integrando un ADN para
transducción se puede identificar y seleccionar rápida y
simplemente. Con respecto también a una cepa de la que cualquier
gen marcador auxotrópico no esté eliminado, se puede obtener
fácilmente una cepa de levadura modificada que pertenece al género
Pichia usando un gen de resistencia a fármaco tal como un gen
de resistencia a G418 y un gen de resistencia a Zeocina como un gen
marcador de selección.
Más preferiblemente, es efectivo usar una cepa
de gen controlado de elongación de cadena de azúcar [patente
japonesa abierta a inspección pública Hei 9-3097]
como un huésped debido a que se puede producir una proteína a la
que se añade la misma cadena de azúcar similar a núcleo que a la
glicoproteína de mamíferos. Además, usar una cepa que tiene cadena
de azúcar ácida reducida en cadena exterior de azúcar como un
huésped, que se obtiene induciendo mutaciones por el tratamiento
que usa un mutágeno tal como ácido etanometilsulfónico y similares
o la exposición a radiación o a luz ultravioleta y así
sucesivamente, seguido por usar un mutante menos teñido por Azul de
Alcian [Ballow, C.E., Methods in Enzymology, 185,
440-470 (1990)], permitiría suprimir adicionalmente
la transferencia de fosfato de manosa que se ha añadido a la cadena
de azúcar similar a núcleo, de tal manera que ello sería muy
efectivo.
Se puede preparar un sistema de expresión útil
para producir una glicoproteína por diversos procedimientos que
incluyen el procedimiento para la introducción de un ADN que
codifica la glicoproteína dentro de la cepa de levadura modificada
anteriormente mencionada que pertenece al género Pichia, el
procedimiento para la transformación de una levadura de tipo
natural que pertenece al género Pichia usando el ADN
preparado insertando un ADN que codifica un gen marcador y un ADN
que codifica la glicoproteína dentro de gen PNO1 de tipo nativo, el
procedimiento para la mutación subsiguiente de un gen PNO1 de tipo
nativo poseído por una cepa de levadura recombinante que pertenece
al género Pichia teniendo un ADN que codifica la
glicoproteína para la realización del gen PNO1 modificado según la
presente invención y el procedimiento para la transformación
simultánea de una levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia usando el gen PNO1 anteriormente modificado y un ADN
que codifica una glicoproteína.
La levadura que pertenece al género
Pichia para expresar una proteína recombinante tiene, para la
dirección de fase de lectura para trascripción, al menos 1) una
región promotora, 2) un ADN que codifica una glicoproteína
sustancialmente deseada y 3) una región de terminador de
transcripción. Estos ADN se disponen de tal forma que un ADN que
codifica una glicoproteína deseada se puede transcribir a RNA, es
decir, pueden estar relacionados y funcionar cada uno respecto del
otro.
Aunque para promotores para la presente
invención se usan el promotor AOX1 (promotor para el primer gen de
la alcohol oxidasa) de P. pastoris, el promotor AOX2
(promotor para el segundo gen de la alcohol oxidasa) de P.
pastoris, el promotor DAS (promotor para el gen de la
dihidroxiacetona sintasa) de P. pastoris, el promotor P40
(promotor para el gen P40) de P. pastoris, el promotor GAPDH
(promotor para el gen de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa) de P. pastoris, el promotor para el gen de
aldehído deshidrogenasa de P. pastoris, el promotor para el
gen de folato deshidrogenasa de P. pastoris, el promotor AUG1
(promotor para el gen de alcohol oxidasa) de Pichia
methanolica y similares, preferiblemente se usa para ellos el
promotor AOX1 de P. pastoris [por ejemplo, Ellis y col. Mol.
Cell Biol., 5, 111 (1985), patente de los Estados Unidos nº.:
4.855.231], más preferiblemente se usa para ello promotor AOX2
mutante modificado tal como para potenciar la eficiencia de
expresión [Ohi, H., y col. Mol. Gen. Genet., 243,
489-499 (1994), patente japonesa abierta a
inspección pública Hei 4-299984, patente de los
Estados Unidos 5.610.036, documento EP 506.040].
Puede existir una secuencia señal de secreción
codificante de ADN antes de un ADN que codifica una glicoproteína
sustancialmente deseada. Un sistema de expresión de glicoproteína
recombinante que tiene un ADN tal permite a una glicoproteína
segregarse/producirse a partir de la célula huésped, de tal forma
que una glicoproteína deseada pueda aislarse/purificarse
fácilmente. Para la secuencia señal de secreción, se pueden usar
cualesquiera ADN que funcionen en una levadura que pertenezca al
género Pichia incluyendo un ADN que codifique una secuencia
señal de de secreción nativa relacionada con glicoproteínas, un ADN
que codifique secuencia señal de SUC2 de Saccharomyces
cerevisiae, un ADN que codifique secuencia señal de PHO1 de una
levadura que pertenezca al género Pichia, un ADN que
codifique secuencia señal de PCR1 de una levadura que pertenezca al
género Pichia, un ADN que codifique secuencia señal de factor
de apareamiento-\alpha (\alphaMF) de
Saccharomyces cerevisiae, un ADN que codifique secuencia
señal de lisozima C bovina y así sucesivamente.
Aunque cualesquiera ADN que codifiquen una
glicoproteína que tenga estructura de cadena de azúcar en la
molécula de proteína se pueden usar como un ADN que codifica una
glicoproteína sustancialmente deseable, se usan preferiblemente los
ADN que codifican glicoproteínas útiles farmacéuticamente incluyendo
ATIII, fibrinógeno, cofactor II de heparina, anticuerpo,
uroquinasa, interferón \alpha, quimasa, inhibidor de tripsina
urinaria y similares.
Para un terminador de transcripción usado para
la presente invención, se puede usar cualquier terminador de
transcripción que tenga un subsegmento que proporcione una señal de
terminación para la transcripción a partir de un promotor. Puede
ser el misma que el del gen o diferente que el del gen de una fuente
promotora, o puede obtenerse a partir de un gen que codifique una
glicoproteína.
El sistema de expresión usado para la presente
invención puede contener adicionalmente un marcador de selección
además de la secuencia de ADN anterior. Los genes marcadores de
selección usados incluyen gen HIS4, gen ARG4, gen URA3, gen SUC2,
gen Ade1, GEN ADE2, gen de resistencia a G418 y gen de resistencia a
Zeocina de P. pastoris o S. cerevisiae y así
sucesivamente.
Una cepa de levadura que pertenezca al género
Pichia transformada tal como para tener un fenotipo deseado
puede producir una glicoproteína por cultivo usando un procedimiento
usado usualmente en este campo. Cualquier condición de cultivo se
puede usar tanto como sea adecuado para proliferación de la levadura
que pertenece al género Pichia y para producción de una
glicoproteína deseada.
Después del cultivo, se puede obtener una
glicoproteína heteróloga deseada recogiendo células en el caso de
producción intercelular o recogiendo el sobrenadante de cultivo en
el caso de producción secretora, seguido por purificar usando un
procedimiento bien conocido tal como el procedimiento de
fraccionamiento, el procedimiento de intercambio iónico, el
procedimiento de filtración a través de gel, la cromatografía de
interacción hidrófoba, la cromatografía en columna de afinidad y
así sucesivamente. Preferiblemente, una glicoproteína que tenga una
cantidad más reducida de fosfato de manosa en la cadena de azúcar se
puede purificar/obtener fraccionando una fracción de cadena añadida
exterior de azúcar a partir de una fracción de cadena añadida de
azúcar similar a núcleo, seguida por recoger la última.
Las proteínas producidas usando cepa de levadura
de gen PNO1 controlado según la presente invención son aquellas que
tienen la estructura de cadena de azúcar en la molécula de proteína,
e incluyen glicoproteínas útiles farmacéuticamente, por ejemplo,
ATIII, fibrinógeno, cofactor de heparina II, anticuerpo, uroquinasa,
interferón \alpha, quimasa, inhibidor de tripsina urinaria y
similares, pero no están limitados a ellos.
La glicoproteína producida por la presente
invención se caracteriza porque la transferencia de fosfato de
manosa de al menos la cadena de azúcar similar a núcleo está
suprimida comparada con la glicoproteína derivada de una cepa de
levadura de tipo natural que pertenece al género Pichia, al
10% o menos de la cadena de azúcar total, más preferiblemente al 1%
o menos, por el decrecimiento en la cantidad de expresión o en la
función de proteína Pno1 de una cepa de levaduras que pertenece al
género Pichia. La glicoproteína producida por la presente
invención se caracteriza porque tiene antigenicidad reducida contra
los seres humanos y los mamíferos debido a que la transferencia de
fosfato de manosa se suprime al menos para la cadena de azúcar
similar a núcleo en la glicoproteína expresada que ha sido una duda
en la glicoproteína producida en el sistema de expresión de
levaduras en el caso de que se use como una medicina.
Aunque se dan más adelante ejemplos para
describir la presente invención más en detalle, la presente
invención no está limitada a ellos. Las enzimas, los reactivos y
los kits usados en los ejemplos de la presente invención están
comercialmente disponibles y se pueden usar según los procedimientos
convencionales. Se conocen bien por aquellos expertos en la técnica
o se pueden obtener de las bibliografías los protocolos usados en la
clonación de los ADN, la determinación de las secuencias de bases,
la transformación de las células huésped, el cultivo de las células
transformadas, la purificación de los productos de cultivo
resultantes y los análisis de cadena de azúcar.
Con el fin de clonar un gen que se origina a
partir de una levadura que pertenece al género Pichia y
participa en la adición de fosfato, se planeó rastrear un gen
homólogo usando, como una sonda, gen MNN4 que participa en la
transferencia de fosfato de manosa en S. cerevisiae. El gen
MNN4 de Saccharomyces cerevisiae se obtuvo primero usando el
procedimiento de PCR basado en la secuencia de ADN revelada en la
bibliografía [patente japonesa abierta a inspección pública Hei
4-26792]. La región usada como una sonda varía de la
25ª a la 2049ª siendo la 1ª la "A" del codón de iniciación.
Se sintetizaron los cebadores mostrados por las
secuencias de bases de SEC. ID Nº: 4 o de SEC. ID Nº: 5 en el
listado de secuencias. El cebador mostrado por las secuencias de
bases de SEC. ID Nº: 5 en el listado de secuencias tiene una
secuencia de reconocimiento HindIII añadida en el extremo. Se
extrajo el ADN cromosómico de la cepa AH22 de Saccharomyces
cerevisiae (a, leu2 his4 can1) [Hinnen, A. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)] con kit de extracción de ADN de
Levaduras Nucleon MiY (Amersham Pharmacia) y se amplificó por kit
de PCR Ex Taq (Takara Shuzo) usando cebadores mostrados por la
secuencia de bases de SEC. ID Nº: 4 o de SEC. ID Nº: 5 en el
listado de secuencias y se confirmó que se amplificó un fragmento de
ADN de 1,6 kb. El ADN obtenido se digirió con ScaI y HindIII y el
producto resultante se electroforetizó en agarosa y se
aisló/purificó un fragmento de 1,4 kb usando Gene Clean II
(Funakoshi) y se insertó entre los sitios de digestión ScaI y
HindIII del vector plasmídico pUC19 usando un kit de ligación de ADN
(Takara Shuzo).
El plásmido así obtenido se llamó "pTM002".
Se confirmó que el ADN amplificado usando el procedimiento de PCR
insertando dentro de pTM002 es una parte del gen MNN4 de
Saccharomyces cerevisiae determinando una parte de la
secuencia de bases de pYM002 usando un secuenciador de ADN
(Pharmacia).
Se usó un análisis de transferencia de Southern
examinando si una región que hibrida al ADN que se clona dentro de
pTM002 existe en el ADN cromosómico de una levadura que pertenece o
no al género Pichia. El ADN cromosómico de la cepa GTS115 de
P pastoris se extrajo con kit de extracción de ADN de
Levaduras Nucleon MiY (Amersham Pharmacia). El extracto obtenido se
digirió con enzimas de restricción EcoRI, NotI, SacI, SpeI, XbaI y
XhoI seguido por aplicación a electroforesis de gel de azarosa. El
gel obtenido se transfirió sobre filtro de membrana de nailon
Hybond-N después de desnaturalización con una base y
neutralización subsiguiente, seguida por fijación por irradiación
con rayos UV. La prehibridación se llevó a cabo según las
instrucciones para kit DIG-ELISA (Boehringer Manheim
GmbH).
Por otro lado, se digirió pTM002 con ScaI y
HindIII seguido por aplicación a electroforesis de gel de agarosa y
se aisló un fragmento de 1,4 kb usando Gene Clean II (Funakoshi). Se
llevó a cabo el marcado con digoxigenina según las instrucciones
para kit de marcado de ADN DIG-ELISA (Boehringer
Manheim GmbH) y se llevó a cabo hibridación usando el producto
obtenido como una sonda. El híbrido resultante se detectó según la
instrucción para el kit de DIG-ELISA después de
lavar dos veces en 0,5 x SSC, solución de SDS al 0,1% a 42ºC durante
15 minutos. Como un resultado, se detectaron bandas cuando se usó
cualquiera de los enzimas aunque ellas sean débiles: en particular
se detectó una banda de 7,5 kb cuando se usó SpeI.
Se clono un fragmento objetivo en sitio SpeI
usando \lambdaZapII (Stratagene). El vector no digerido
\lambdaZapII (Stratagene) se digirió con SpeI y se trató con
fosfatasa alcalina (Takara Shuzo). Por otro lado, se digirió el ADN
cromosómico de cepa GTS115 de levadura que pertenece al género
Pichia con SpeI seguido por aplicación de electroforesis en
gel de agarosa y se escindió la región cerca de 7,5 kb.
La fracción obtenida se purificó usando Gene
Clean II (Funakoshi) para ligar con el fragmento
\lambdaZapII/SpeI, seguido por llevar a cabo empaquetamiento
in vitro con Gigapack-GOLD3 Plus
(Stratagene). La muestra resultante se absorbió en la cepa
XL-1 Blue MRF de Escherichia coli que se hubo
preparado tal como para dar una valor de DO_{600} de 0,5 y se
sometió a ensayo una valoración en una placa NZY que contiene IPTG y
X-gal.
El fago recombinante se absorbió en la cepa
XL-1 Blue MRF de Escherichia coli y se
dispersó subsiguientemente en una placa NZY tal como para dar un
número apropiado de placas. Estas placas se movieron a una membrana
de nailon Hybond-N (Amersham Pharmacia) que se ha
marcado de tal forma que se pueda reconocer la posición y se
desnaturalizaron con una base seguida por neutralización y se
fijaron subsiguientemente. La hibridación de placa se llevó a cabo
según la instrucción para el kit de DIG-ELISA
(Boehringer Manheim) usando un fragmento de 1,4 kb como una sonda
que se obtuvo digiriendo pTM002 con ScaI y HindIII y se marcó con
digoxigenina. El lavado se llevó a cabo dos veces en SCC 0,5X,
solución al 1% de SDS a 42ºC durante 15 minutos y la detección se
llevó a cabo según la instrucción del kit DIG-ELISA.
Como un resultado, se detectaron placas que muestran reacciones
positivas.
Después de que el fago se fabricó para
amplificar, se añadieron cepa XL-1 Blue MRF y fago
auxiliar que ayuda a Ex incubando a 37ºC durante 15 minutos.
Después se añadió medio LB al cultivo durante toda una noche. El
cultivo resultante se incubó a 65ºC durante 20 minutos y se
centrifugó dando un sobrenadante, que se añadió a una suspensión de
cepa SOLR de Escherichia coli seguido por diseminación en una
placa de LB que contiene ampicilina. Un ADN de plásmido se extrajo
por el procedimiento de Mini-Prep a partir de una
colonia de E. coli que apareció. Un plásmido tal que se
insertó un fragmento de 7,5 kb en pBluescript se seleccionó y se
llamó "pTM004".
El mapa de enzimas de restricción de pTM004 se
preparó como se ilustra en figura 2. El ADN cromosómico de cepa
GTS115 de P. pastoris se digirió con EcoRI, NotI, SacI, SpeI,
XbaI y XhoI y la electroforesis se llevó a cabo en los fragmentos
resultantes preparando dos membranas de nailon sobre las que se
transfirió el gel. Después, se llevaron a cabo los análisis de
prueba de bandas de Southern en los que un fragmento de 7,5 kb
digerido con SpeI derivado de pTM004 que se purificó y marcó con
digoxigenina se usó como una sonda para una membrana y un fragmento
de 1,4 kb digerido por ScaI y HindIII derivado de pTM002 se usó como
una sonda para la otra. Como un resultado, los patrones de bandas
detectados en dos membranas estuvieron en buen acuerdo mostrando
que se clonó la región objetivo.
La secuencia de bases del fragmento clonado de
pTM004 se determinó usando un secuenciador de ADN (Pharmacia)
después de la reacción usando un kit de secuenciación de ADN de Auto
Lectura (Pharmacia). Se diseño un cebador tal como para ser capaz
de leer del lado 3' al lado 5' en base a la secuencia que se obtuvo
usando RV marcado con cebador FITC unido en el kit. El análisis de
secuencia se llevó a cabo seriamente. Se diseñó otro cebador tal
como para ser capaz de leer en dirección hacia atrás para llevar a
cabo un análisis de secuencia
Se usó ADNSIS (Hitachi Soft Engineering) para la
edición. La búsqueda de una fase de lectura abierta (ORF) en base a
la secuencia de bases obtenida (SEC. ID Nº: 2 en el listado de
secuencias) reveló que codifica una proteína constituida por 777
aminoácidos. La secuencia de aminoácidos correspondiente a la
secuencia de bases obtenida se muestra como SEC. ID Nº: 3. Esta
proteína tenía un dominio transmembrana en su lado
N-terminal. La región del aminoácido 450º al
aminoácido 606º mostró un valor de homología del 45% a la proteína
Mnn4 de Saccharomyces cerevisiae, mientras que otra región
mostró sólo un valor de homología bajo (figura 3).
Esta proteína constituida por 777 aminoácidos
era más corta que la proteína Mnn4 de Saccharomyces
cerevisiae constituida por 1137 aminoácidos. Además, la
secuencia repetida KKKKEEEE en el lado C terminal que juega un
papel importante en la función de la proteína Mnn 4 no se encontraba
en esta proteína [Jagami, Y. y Odani, T. Biochim. Biophys. Acta,
1426, 335-345 (1999)]. Aunque una parte del gen
clonado es homóloga al gen MNN4 de Saccharomyces cerevisiae,
se asume que el gen clonado tiene (una) función/funciones
distinta(s) y se llamó "gen PNO1".
La cepa de gen PNO1 controlado se preparó
examinado las propiedades de la cepa y de una proteína expresada
tal como para dilucidar la función del gen PNO1 de una cepa de
levadura que pertenece al género Pichia. Para este
propósito, el gen PNO1 en el cromosoma de una levadura que pertenece
al género Pichia se interrumpió como un medio de control. Al
mismo tiempo, se planeó preparar una cepa que expresa ATIII
(antitrombina III) humana como un ejemplo de glicoproteína.
ATIII es una proteína de cadena simple
constituida por 432 aminoácidos con un peso molecular alrededor de
58 kDa que existe en plasma humano normal a aproximadamente 150 mg/l
que tiene cuatro sitios de adición de cadena de azúcar unida a
asparragina. Tiene una actividad de inhibir un amplio intervalo de
serina proteasas tipo tripsina incluyendo trombina y factor Xa y es
un inhibidor de proteasa sérica que juega un papel importante en el
mecanismo de controlar la coagulación de la sangre. Se usó como un
material vector pRH101(figura 4) expresando gen ATIII humano
en una levadura que pertenece al género Pichia. El gen ATIII
humano se deriva de pTY007 descrito en la bibliografía [Yamauchi,
T. y col., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 600 (1992). El plásmido
para controlar gen PNO1 se preparó como se describe a
continuación.
Primero, se ligaron pTM004 digerido con PstI y
SmaI y pUC19 digerido con PstI y SmaI usando un kit de ligación de
ADN (Takara Shuzo). Se transformó célula competente de
Escherichia coli (DH5 Competent High, Toyobo). Se extrajeron
plásmidos por el procedimiento de Mini-Prep a partir
de las colonias que aparecieron y se seleccionó el plásmido
objetivo y se llamó pTM006. pTM006 se digirió con SacI y BamHI
seguido por hacer romos sus extremos usando un kit de hacer romos
los extremos de ADN (Takara Shuzo) y por llevar a cabo una
autoligación preparando pMM125.
Por otro lado, se digirió pRH101 con DraI y NaeI
aislando un fragmento que contiene gen HIS4 y unidad de expresión
ATIII que está compuesta de promotor mAOX2, secuencia líder de
secreción de SUC2, gen de ATIII humano y terminador AOX1. Además,
se digirió pMM125 con HpaI y EcoRV seguido por ligación con el
fragmento anterior conteniendo unidad de expresión de ATIII humana
y gen HIS4 y después se llevó a cabo transformación de
Escherichia coli usando célula competente de E. coli
(DH5 Competent High, Toyobo). Se extrajeron plásmidos por el
procedimiento de Mini-Prep a partir de las colonias
que aparecieron y se seleccionó el plásmido objetivo y se llamó
pTM009 (fig. 5).
Se llevó a cabo digestión de pTM009 con PstI y
SpeI seguida por transformación de cepa de levadura GTS115 que
pertenece al género Pichia usando un Kit de Transformación
Yeast Maker (Clontech) por el procedimiento del cloruro de litio.
Se dispersaron las células en una placa de selección y se incubaron
a 25ºC. Se aisló un clon que aparece a una colonia individual. El
ADN cromosómico del mismo se extrajo usando un kit de extracción de
ADN de Levaduras Nucleon MiY (Amersham Pharmacia) y se digirió con
enzima SpeI o con ambas enzimas SpeI y PstI para llevar a cabo
electroforesis y transferir a una membrana de nailon. El análisis de
prueba de bandas de Southern se llevó a cabo usando un fragmento
unido a digoxigenina de 0,6 kb obtenido digiriendo pRH101 con SacII
y SacI como una sonda de gen ATIII y un fragmento marcado con
digoxigenina de 1,5 kb obtenido digiriendo pTM004 con EcoRI como una
sonda del gen PNO1.
Se seleccionó una cepa, que dio una banda de 13
kb en la membrana usando SpeI en el caso de una sonda de gen de
ATIII y dio una banda de 8,2 kb en una membrana usando tanto SpeI
como PstI en el caso de una sonda del gen PNO1 y se llamó "cepa
9G4". La cepa 9G4 carece de 432 pares de bases de sitio HpaI a
sitio EcoRV del gen PNO1 cromosómico, donde la unidad de expresión
de ATIII y la unidad de expresión de HIS4 se insertan en vez de
ellas (figura 6).
Azul de Alcian es un tinte basado en
ftalocianina básica. La tinción con Azul de Alcian se usa como un
procedimiento simple evaluando un grado de grupo fosfato que da una
carga negativa principal en la pared celular [Ballou, C.E., Methods
in Enzymology, 185, 440-470 (1990)]. Aunque Azul de
Alcian tiñe células de tipo natural de Saccharomyces
cerevisiae, no tiñe células de mutante en el gen MNN4 de S.
cerevisiae. Estos resultados muestran que la fosforilación de
la cadena exterior de azúcar se suprimió en el último caso. Por lo
tanto, las propiedades de tinción de cepa de levadura controlada
por gen PNO1 que pertenece al género Pichia se compararon con
aquellas de una cepa de levadura de tipo natural que pertenece al
género Pichia o con aquellas de mutante en gen MNN4 de S.
cerevisiae.
Se cultivaron cada una de cepa 9G4 de gen PNO1
controlado, cepa GTS115 de levadura de tipo natural que pertenece
al género Pichia y cepa LB6-5D mutante en gen
MNN4 de Saccharomyces cerevisiae (MAT\alpha,
mnn4-1, suc2, ma1, CUP1) (ATCC 52524) en 3 ml de
medio YPD durante 72 horas. Las células se cosecharon y se tiñeron
con solución de Azul de Alcian al 0,1% en ácido clorhídrico 0,02 N a
temperatura ambiente durante 20 minutos, dando como resultado que
la cepa LB6\cdot5 permaneció blanca, mientras que las cepas GTS15
y 9G4 se tiñeron de azul en grados similares. Este resultado indicó
que la cepa de gen PNO1 controlado y la cepa LB6\cdot5 tienen
diferentes cadenas de azúcar de superficie celular, es decir, la
proteína Pno1 es diferente de la proteína Mnn4 y no participa así
en la fosforilación de cadena exterior de azúcar.
Se preparó una cepa de levadura de tipo natural
que produce ATIII humana recombinante que pertenece al género
Pichia con el fin de tener un control para la comparación con
la ATIII humana recombinante producida por la cepa de levadura de
gen PNO1 controlado que pertenece al género Pichia. Un
plásmido pRH101 de expresión de ATIII humana (fig. 4) se digirió
con SalI y se transformó en cepa GTS115 de P. pastoris usando
el procedimiento del cloruro de litio. Una cepa en la que estaba
integrada una copia de pRH101 dentro de locus del gen his4
cromosómico se seleccionó por el análisis de prueba de bandas de
Southern y se llamó "cepa RH101".
Cada una cepa de RH101 de levadura de tipo
natural que produce ATIII que pertenece al género Pichia y
cepa 9G4 de gen PNO1 controlado que produce ATIII humana se cultivó
usando un fermentador de recipiente 3\cdotL (BDM\cdot3, ABLE
corp.). Las células se dejaron proliferar en un medio que contenía
glicerol, seguido por suministrar un medio que contenía metanol
como una fuente de carbono. El grado de proliferación como se mide
por DO_{450} y la cantidad de ATIII producida como se mide por el
procedimiento de ELISA (procedimiento de ensayo inmunoabsorbente
unido a enzima), se ilustran en la figura 7. Las cepas RH101 y 9G4
mostraron perfiles similares con respecto al grado de proliferación
y a la cantidad de ATIII producida y no se observó diferencia
remarcable por controlar gen
PNO1.
PNO1.
Cada una de las cepas 9G4 y RH101 se hizo
proliferar en el fermentador de tanque hasta que un valor de
DO_{540} alcanzó 700 y se recogió el sobrenadante de cultivo.
Analizar el sobrenadante de cultivo por SDS-PAGE y
prueba de transferencia Western permitió detectar una fracción
principal de ATIII recombinante producido en la misma posición que
aquella de ATIII derivado de plasma así como una fracción menor de
polímero altamente glicosilado con respecto a ambas cepas. La
fracción principal se purificó por la cromatografía en columna de
heparina, la cromatografía de intercambio catiónico, la filtración
de gel y la ultrafiltración secuencialmente en este orden dando un
producto purificado de ATIII recombinante.
Usando el producto purificado de ATIII
recombinante producido por la cepa RH101, la cadena de azúcar se
escindió usando Glicopeptidasa F (Takara Shuzo) [Plummer, T.H. y
col., J. Biol. Chem., 259, 10700-10704 (1984)]. La
cadena de azúcar se purificó usando un kit de preparación de glicano
de cartucho de celulosa (Takara Shuzo) y el extremo reductor se
marcó con 2-aminopiridina ("piridilaminado")
[Hase, S., y col., J. Biochem., 85, 217-220
(1979)]. El análisis usando una columna de intercambio aniónico
(DEAE-5PW, Toso) [Nakagawa, H., y col., Anal.
Biochem., 226, 130-138 (1995)] reveló que la cadena
de azúcar no contenía sólo una cadena de azúcar neutral sino también
dos clases o más de cadena de azúcar ácida (fig. 8A).
Se purificó la fracción que se considera que
tiene una carga eléctrica de 1 y se hidrolizó de forma ácida con
ácido clorhídrico 0,1 N a 100ºC durante 30 minutos. Se sabe que esta
reacción escinde el enlace entre manosa (Man) y fosfato en un
extremo no reductor [Tieme, T.R. y col., Biochemistry, 10,
4121-4129 (1971)]. Después de la reacción, la
cadena de azúcar se convirtió en una cadena de azúcar ácida que
tiene un grupo fosfato en el extremo no reductor. En este momento,
la carga eléctrica llegó a ser 2 (fig. 8B). Después, se afectaron
0,6 unidades de una fosfatasa alcalina (Takara Shuzo) que es una
enzima que hidroliza el grupo fosfato terminal en una solución de
Tris-HCl 50 mM, pH 9, solución de MgCl_{2} 1 mM a
65ºC durante 3 horas. Esta reacción eliminó el grupo fosfato dando
una cadena de azúcar neutral. Así, se reveló que la cadena de azúcar
ácida que se añadió a la ATIII recombinante estaba fosforilada
(figura 8C).
Un producto purificado de ATIII recombinante
producida por cepa RH101 o cepa 9G4 se piridilaminó en una manera
similar a la descrita anteriormente. Una cadena de azúcar neutral y
una cadena de azúcar ácida se separaron una de otra por la
cromatografía en columna aniónica (DEAE-5PW, Toso).
Finalmente, los especímenes se analizaron usando una columna de
amida (Amida-80, Toso) que permite eluir cadenas de
azúcar por orden de tamaño [Tomiya, N. y col, Anal. Biochem.171,
73-90 (1988)] para comparar áreas de cadenas de
azúcar en ambas cepas.
Se estimó que las fracciones de cadenas de
azúcar neutral eran cadenas de azúcar altas en manosa que constaban
principalmente de 9 a 12 moléculas de manosa (figuras 9A y B). Se
calcularon los contenidos de cadena de azúcar ácida que se habían
añadido a ATIII recombinante derivada de cepas RH101 y 9G4 usando la
ecuación (área total de cadena de azúcar ácida)/(área total de
cadena de azúcar neutral + área total de cadena de azúcar ácida),
siendo el 26% con cepa RH101 y siendo el 1% con cepa 9G4, es decir,
el contenido de cadena de azúcar ácida estaba bastante reducido en
la última (figura 9).
Los resultados anteriores muestran que el número
de grupos fosfato añadidos a la cadena de azúcar de tipo núcleo de
la glicoproteína producida por la cepa de gen PNO1 controlado está
remarcablemente reducido comparado con aquel de la levadura de tipo
natural. El porcentaje de cadena de azúcar ácida añadida a la cadena
de azúcar similar a núcleo por cadena de azúcar total fue menor de
30 con respecto a cepa de gen MNN4 controlado de Saccharomyces
cerevisiae [patente japonesa abierta a inspección pública Hei
9-266792], mientras que el de cepa de levadura de
gen PNO1 controlado que pertenece al género Pichia fue 1, es
decir, el procedimiento según la presente invención fue más
excelente que el procedimiento convencional reduciendo la cadena
ácida de azúcar.
El grado de reducción de la cadena de azúcar
ácida añadida a la cadena de azúcar similar a núcleo con respecto a
la cepa de gen MNN4 controlado de Saccharomyces cerevisiae
fue menor que con la cepa de tipo natural [patente japonesa abierta
a inspección pública Hei 9-266792], mientras que el
de cepa de levadura de gen PNO1 controlado que pertenece al género
Pichia fue 1/26 de aquel de la cepa de tipo natural, es
decir, la cadena de azúcar ácida estaba considerablemente reducida.
La homología entre gen MNN4 de S. cerevisiae y gen PNO1 de
una levadura que pertenece al género Pichia es baja
exceptuando algunas partes y los grados de tinción de Azul de
Alcina son diferentes entre la cepa de gen MNN4 controlado de
Saccharomyces cerevisiae y la cepa de levadura de gen PNO1
controlado que pertenece al género Pichia. Por lo tanto, se
sugiere que el gen PNO1 es un gen novedoso que tiene una función
diferente de aquella del gen MNN4.
Se obtuvieron los antisueros contra cada ATIII
humana recombinante inmunizando con ATII humana recombinante
derivada de una levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia y con ATIII humana recombinante derivada de una cepa
de gen PNO1 controlado a conejos macho blancos japoneses de 12
semanas de edad (Kitayama Rabes) conjuntamente con coadyuvante de
gel de hidróxido de aluminio (SERAVA).
La inhibición de la reacción de cada antisuero
con un antígeno por ATIII humana derivada de plasma, es decir, la
inhibición de la reacción de unión de ATIII humana recombinante
inmovilizada derivada de una cepa de gen PNO1 controlado con un
antisuero por ATIII humana derivado de plasma, se evaluó por ELISA.
Como un resultado, se reveló que la inhibición tiene lugar a una
concentración menor de ATIII humana derivada de plasma en la
reacción con anticuerpo anti-ATIII humana
recombinante derivada de cepa de gen PNO1 controlado que en la
reacción con anticuerpo anti-ATIII humana
recombinante derivada de levadura de tipo natural que pertenece al
género Pichia (figura 10). Por lo tanto, se consideró que un
epítopo específico para ATIII humana recombinante derivada de una
levadura está disminuido en ATIII humana recombinante derivada de
una levadura comparado con ATIII humana recombinante derivada de
una levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia.
La presente invención proporciona una proteína
que participa en la adición de fosfato de manosa a la cadena de
azúcar de una glicoproteína derivada de una levadura que pertenece
al género Pichia y de un gen que codifica la proteína por
primera vez. Proporcionar la proteína que participa en la adición de
fosfato de manosa a la cadena de azúcar de la glicoproteína y el
gen que codifica la proteína es útil porque puede ser una base para
dilucidar el mecanismo de la adición de fosfato de manosa a la
cadena de azúcar de la glicoproteína en levaduras. La presente
invención permite proporcionar una levadura que pertenece al género
Pichia que produce una glicoproteína útil farmacéuticamente
que reduce remarcablemente la adición de fosfato a la cadena de
azúcar. Usar una cepa de levadura que pertenece al género
Pichia según la presente invención permite producción de
glicoproteína útil farmacéuticamente con reducción remarcable de la
adición de fosfato a la cadena de azúcar. Una glicoproteína
producida usando un medio según la presente invención tiene cadena
de azúcar en la que la adición de fosfato está remarcablemente
reducida, de tal forma que se considera que la glicoproteína es
menos antigénica para seres humanos y mamíferos y es útil
farmacéuticamente.
<110> WELFIDE CORPORATION
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para producción de
glicoproteína que tiene una cantidad reducida de oligosacárido
ácido y la glicoproteína producida de este modo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GP01-009
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2000-144643
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-5-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pichia pastoris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pichia pastoris
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (150)..(2483)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 777
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pichia pastoris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
Claims (14)
1. Un procedimiento para suprimir la formación
de una cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa en una levadura
que pertenece al género Pichia, en el que se suprime un gen
que tiene la secuencia de bases de SEC. ID Nº: 2 en el listado de
secuencias y que participa al menos en la adición de fosfato de
manosa a una cadena de azúcar en la cadena de azúcar similar a
núcleo de una glicoproteína introduciendo mutación/mutaciones
dentro de dicho gen o usando un polinucleótido que tiene una
secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases de dicho
gen.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que suprimir el gen anterior es suprimir el gen que contiene
la secuencia de bases mostrada por al menos 60 bases consecutivas
del extremo 5' de la secuencia de bases que codifica una proteína
en la secuencia de bases de SEC. ID Nº: 2 en el listado de
secuencias y participa en la formación de la cadena de azúcar que
tiene fosfato de manosa en una levadura que pertenece al género
Pichia.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el que la(s) mutación/mutaciones están seleccionadas
de una deleción, sustitución, inserción, y/o adición dentro del
gen.
4. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el que controlar el gen anterior es suprimir la expresión del
gen usando un polinucleótido que tiene una secuencia de bases
complementaria a la secuencia de bases del gen.
5. Un polinucleótido que contiene la secuencia
de bases mostrada por los nucleótidos del 150º al 2480º de la
secuencia de bases de SEC. ID Nº: 2 en el listado de secuencias que
codifica la proteína que participa en la formación de una cadena de
azúcar que tiene fosfato de manosa en la cadena de azúcar similar a
núcleo derivado de una levadura que pertenece al género
Pichia.
6. Un polinucleótido modificado tal como para
ser capaz de reducir la relación de la cadena de azúcar que tiene
fosfato de manosa en la cadena de azúcar similar a núcleo de una
glicoproteína respecto a la cadena de azúcar total al 10% o menos
introduciendo mutación/mutaciones tales como sustitución, deleción,
inserción, y/o adición dentro de un polinucleótido que contiene la
secuencia de bases mostrada por los nucleótidos del 150º al 2480º
de la secuencia de bases de SEC ID Nº: 2, en donde la proteína según
se codifica tiene una homología del 70% o más con los aminoácidos
de la proteína que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID
Nº: 3 en el listado de secuencias.
7. Un vector recombinante que tiene el
polinucleótido según la reivindicación 6.
8. Un transformante transformado por el vector
recombinante según la reivindicación 7.
9. Un transformante según la reivindicación 8,
en el que el huésped transformado por el vector recombinante es una
levadura que pertenece al género Pichia.
10. Un procedimiento para producir una
glicoproteína, en el que el procedimiento utiliza el procedimiento
según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 o utiliza el transformante según
la reivindicación 9 para producir una glicoproteína heteróloga por
la técnica de ingeniería genética que usa una levadura que pertenece
al género Pichia como un huésped.
11. Una proteína seleccionada del grupo
constituido por:
(1) una proteína mostrada por la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de secuencias;
(2) una proteína que contiene la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº: 3 en el listado de secuencias;
(3) una proteína que tiene una homología del 70%
o más con la secuencia de aminoácidos de la proteína (2)
anteriormente mencionada y que participa en la formación de una
cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa en la cadena de azúcar
similar a núcleo de una glicoproteína producida por una levadura que
pertenece al género Pichia; y
(4) una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID N: 1 en el listado de secuencias en el
extremo N-terminal y que participa en la formación
de una cadena de azúcar que tiene fosfato de manosa en la cadena de
azúcar similar a núcleo de una glicoproteína producida por una
levadura que pertenece al género Pichia.
12. Un anticuerpo que reconoce específicamente
la proteína según la SEC. ID Nº: 3 en el listado de secuencias.
13. Una glicoproteína que contiene fosfato de
manosa en la cadena de azúcar similar a núcleo de dicha
glicoproteína producida según un procedimiento según la
reivindicación 1, 2, 3 ó 4, caracterizada porque la
glicoproteína tiene una cantidad de fosfato de manosa en la cadena
de azúcar similar a núcleo de dicha glicoproteína que se reduce en
al menos el 90% comparada con la glicoproteína derivada de una cepa
de levadura de tipo natural que pertenece al género
Pichia.
14. Glicoproteína según la reivindicación 13,
seleccionada del grupo constituido por ATIII, fibrinógeno, cofactor
II de heparina, un anticuerpo, uroquinasa, interferón \alpha,
quimasa, e inhibidor de tripsina urinaria.
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