ES2328230T3 - Proceso para la preparacion de l-treonina utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas que contienen genes suca y sucb intensificados. - Google Patents

Proceso para la preparacion de l-treonina utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas que contienen genes suca y sucb intensificados. Download PDF

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Abstract

Un proceso para la producción de L-aminoácidos, seleccionados del grupo L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, que comprende la realización de los pasos siguientes: a) fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, y en la cual se sobreexpresan los genes sucA y sucB, que codifican una 2-cetoglutarato-descarboxilasa y una dihidrolipoiltranssuccinasa, las dos cuales son subunidades de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa, o secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos de dichos genes. b) concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y c) aislamiento del L-aminoácido deseado, quedando unos constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma opcionalmente en el producto.

Description

Proceso para la preparación de L-treonina utilizando cepas de la familia Enterobacteriáceas que contienen genes sucA y sucB intensificados.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un proceso para la preparación de L-aminoácidos, en particular L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriáceas en las cuales están sobreexpresados los genes sucA y sucB.
Técnica anterior
Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy particularmente en la nutrición animal.
Es conocida la preparación de L-aminoácidos por fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, se están realizando continuamente trabajos para mejorar los procesos de preparación. Las mejoras del proceso pueden referirse a las condiciones de fermentación, tales como v.g. agitación y suministro de oxígeno, o a la composición de los medios nutrientes, tal como v.g. la concentración de azúcar durante la fermentación, o la elaboración hasta la forma del producto, mediante, v.g. cromatografía de cambio iónico, o las propiedades intrínsecas de producción del microorganismo propiamente dicho.
Para mejorar las propiedades de producción de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De este modo se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como v.g. el análogo de treonina ácido \alpha-amino-\beta-hidroxivalérico (AHV) o son auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácidos, tales como v.g. L-treonina.
Se han empleado también desde hace varios años métodos de la técnica del DNA recombinante para ampliar la variedad de cepas de la familia Enterobacteriáceas que producen L-aminoácidos, por amplificación de genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos e investigación del efecto sobre la producción.
Objeto de la invención
El objeto de la invención es proporcionar nuevas medidas para la preparación mejorada por fermentación de L-treonina, L-valina, L-homoserina, L-lisina.
Sumario de la invención
La invención proporciona un proceso para la preparación fermentativa de dichos L-aminoácidos, en particular L-treonina, utilizando microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen ya en particular L-aminoácidos y en los cuales están sobreexpresados los genes sucA y sucB.
Descripción detallada de la invención
Donde se mencionan L-aminoácidos o aminoácidos en lo que sigue, esto significa uno o más aminoácidos, con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo constituido por L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina. Se prefiere particularmente L-treonina.
El término "intensificación" describe en este contexto el aumento de la actividad intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que están codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por aumento del número de copias del gen o genes, utilizando un promotor potente o un gen o alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente con actividad alta, y opcionalmente combinación de estas medidas.
Por medidas de intensificación, en particular sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incrementa en general al menos en un 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de 1000% o 2000%, basada en la de la proteína de tipo salvaje o la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
El proceso comprende la realización de los pasos siguientes:
a)
fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales los genes sucA y sucB, están sobreexpresados,
b)
concentración de dicho(s) L-aminoácido(s) en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, y
c)
aislamiento de dicho o dichos L-aminoácidos, quedando opcionalmente en el producto constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Los microorganismos que proporciona la presente invención pueden producir dichos L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de glicerol y etanol. Los mismos son representativos de la familia Enterobacteriáceas seleccionados del género Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y Serratia. Del genero Escherichia puede mencionarse en particular la especie Escherichia coli, y del género Serratia la especie Serratia marcescens.
Cepas adecuadas, que producen en particular L-treonina, del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli, son, por ejemplo
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas adecuadas productoras de L-treonina del género Serratia, en particular de la especie Serratia marcescens, son, por ejemplo
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de la familia Enterobacteriáceas que producen L-treonina tienen preferiblemente, entre otras, una o más características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo constituido por:
resistencia a ácido \alpha-amino-\beta-hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a \alpha-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido \alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6-dimetil-aminopurina, necesidad de L-metionina, opcionalmente necesidad parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, treonina-deshidrogenasa deficiente, opcionalmente capacidad para utilización de sacarosa, intensificación del operón treonina, intensificación de la homoserina-deshidrogenasa I-aspartato-quinasa I, preferiblemente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de homoserina-quinasa, intensificación de treonina-sintasa, intensificación de aspartato-quinasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de aspartato-semialdehído-deshidrogenasa, intensificación de fosfoenolpiruvato-carboxilasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de fosfoenolpiruvato-sintasa, intensificación de transhidrogenasa, intensificación del producto del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC, intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una piruvato-carboxilasa y atenuación de la formación de ácido acético.
Se ha encontrado que los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas producen dichos L-aminoácidos, en particular L-treonina, de manera incrementada después de sobreexpresión de los genes sucA y sucB.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de Escherichia coli pertenecen a la técnica anterior y pueden encontrarse también en la secuencia genómica de Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)).
\newpage
La información siguiente, entre otras, acerca de los genes sucA y sucB se conoce por la técnica anterior:
1
Las secuencias de ácido nucleico pueden encontrarse en los bancos de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EEUU), el banco de datos de secuencias de nucleótidos de los European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania o Cambridge, Reino Unido) o el banco de datos de DNA de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Los genes descritos en las referencias de texto mencionadas pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Adicionalmente, pueden utilizarse alelos de los genes que resultan de la degeneración del código genético o debidos a "mutaciones sentido" de función neutra.
Para lograr una intensificación, por ejemplo, pueden aumentarse la expresión de los genes o las propiedades catalíticas de las proteínas. Las dos medidas pueden combinarse opcionalmente.
Para conseguir una sobreexpresión, puede aumentarse el número de copias de los genes correspondientes, o pueden mutarse el promotor y la región reguladora del sitio de fijación de ribosoma aguas arriba del gen estructural. Casetes de expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural actúan del mismo modo. Con ayuda de promotores inducibles, es posible aumentar adicionalmente la expresión en el curso de la producción de L-treonina por fermentación. La expresión se mejora análogamente por medidas para prolongar la vida del m-RNA. Adicionalmente, la actividad enzimática se aumenta también por prevención de la degradación de la proteína enzimática. Los genes o constructos génicos pueden estar presentes en plásmidos con un número variable de copias, o pueden integrarse y amplificarse en el cromosoma. Como alternativa, puede conseguirse adicionalmente una sobreexpresión de los genes en cuestión por cambio de la composición de los medios y el procedimiento de cultivo.
Instrucciones en este contexto pueden ser encontradas por los expertos, inter alia, en Chang y Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), en Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en Amann y Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), en de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), en LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), en PCT/US97/13359, en Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), en Quandt y Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular.
Pueden utilizarse vectores plasmídicos que son capaces de replicación en Enterobacteriáceas, tales como v.g. vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; (Gene 69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke y Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80 (21): 6557-6561 (1983)). Una cepa transformada con un vector plasmídico, donde el vector plasmídico lleva al menos uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por sucA y sucB, o secuencias de nucleótidos que codifican éstos, pueden emplearse en un proceso de acuerdo con la invención.
Asimismo, es posible transferir mutaciones que afectan a la expresión del gen particular en diversas cepas por cambio de secuencia (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), conjugación o transducción.
Adicionalmente, puede ser ventajosa para la producción de L-treonina con cepas de la familia Enterobacteriáceas, además de la sobreexpresión de los genes sucA y sucB, la sobreexpresión de una o más enzimas del camino conocido de biosíntesis de la treonina o enzimas del metabolismo anaplerótico o enzimas para la producción de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reducido o enzimas de la glicólisis o enzimas PTS o enzimas del metabolismo del
azufre.
Así, por ejemplo, pueden sobreexpresarse al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
\bullet
\vtcortauna el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
\bullet
\vtcortauna el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa (WO 99/18228),
\bullet
\vtcortauna el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231(2), 332-336 (1992)),
\bullet
\vtcortauna el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
\bullet
\vtcortauna los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158, 647-653 (1986)),
\bullet
\vtcortauna el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina (EP-A-0 994 190),
\bullet
\vtcortauna el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa (WO 02/06459),
\bullet
\vtcortauna el gen rhtC que imparte resistencia a treonina (EP-A-1 013 765),
\bullet
\vtcortauna el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína exportadora de treonina (WO 01/92545),
\bullet
\vtcortauna el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11, 5257-5266 (1983); Gene 23, 199-209 (1983)),
\bullet
\vtcortauna el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)),
\bullet
\vtcortauna el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)),
\bullet
\vtcortauna el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)),
\newpage
\bullet
\vtcortauna el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la fosfohistidina-protein-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
\bullet
\vtcortauna el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
\bullet
\vtcortauna el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
\bullet
\vtcortauna el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986)),
\bullet
\vtcortauna el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina (Journal of Biological Chemistry 266: 10768-10774 (1991)),
\bullet
\vtcortauna el gen mopB que codifica la chaperona de 10 Kd (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-12419 (1986)), y es conocido también por el nombre groES,
\bullet
\vtcortauna el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
\bullet
\vtcortauna el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
\bullet
\vtcortauna el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A (Journal of Bacteriology 170: 3150-3157 (1988)),
\bullet
\vtcortauna el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987)),
\bullet
\vtcortauna el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
\bullet
\vtcortauna el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
\bullet
\vtcortauna el gen cysH del operón cysJIH que codifica adenilil-sulfato-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
\bullet
\vtcortauna el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana exterior de la célula (Journal of Molecular Biology 163 (4): 513-532 (1983)),
\bullet
\vtcortauna el gen malE que codifica la proteína periplásmica de fijación del transporte de maltosa (Journal of Biological Chemistry 259 (16): 10606-10613 (1984)),
\bullet
\vtcortauna el gen pykF que codifica piruvato-quinasa I estimulada por fructosa (Journal of Bacteriology 177 (19): 5719-5722 (1995)),
\bullet
\vtcortauna el gen pfkB que codifica 6-fosfofructoquinasa II (Gene 28 (3): 337-342 (1984)),
\bullet
\vtcortauna el gen talB que codifica transaldolasa B (Journal of Bacteriology 177 (20): 5930-5936 (1995)),
\bullet
\vtcortauna el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (Molecular Microbiology 24 (2): 355-371 (1997)),
\bullet
\vtcortauna el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global del factor sigmaE (Molecular Microbiology 24 (2): 355-371 (1997)),
\bullet
\vtcortauna el gen sodA que codifica superóxido-dismutasa (Journa1 of Bacteriology 155 (3): 1078-1087 (1983)),
\bullet
\vtcortauna el gen phoB del operón phoBR que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho (Journal of Molecular Biology 190 (1): 37-44 (1986)),
\bullet
\vtcortauna el gen phoR del operón phoBR que codifica la proteína sensora del regulón pho (Journal of Molecular Biology 192 (3): 549-556 (1986)),
\bullet
\vtcortauna el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa (Biochemistry 24 (22): 6245-6252 (1985)) y
\bullet
\vtcortauna el gen sucD del operón sucABCD que codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa (Biochemistry 24 (22): 6245-6252 (1985)).
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, puede ser ventajosa para la producción de L-treonina, además de la sobreexpresión de los genes sucA y sucB, la eliminación de uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
\bullet
\vtcortauna el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
\bullet
\vtcortauna el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
\bullet
\vtcortauna el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA (Número de Acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.),
\bullet
\vtcortauna el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP (Número de Acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.),
\bullet
\vtcortauna el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990)),
\bullet
\vtcortauna el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (Nucleic Acids Research 14(13): 5449-5460 (1986)),
\bullet
\vtcortauna el gen aceA que codifica la enzima isocitrato-liasa (Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)),
\bullet
\vtcortauna el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-251 (1995))) que es conocido también como el gen mlc,
\bullet
\vtcortauna el gen fruR que codifica el represor fructosa (Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)), y es conocido también con el nombre de gen cra y
\bullet
\vtcortauna el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38} (WO 01/05939), y es conocido también con el nombre de gen katF.
\vskip1.000000\baselineskip
En este contexto, el término "atenuación" describe la reducción o eliminación de la actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que están codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por utilización de un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima correspondiente con una actividad baja o desactiva la enzima (proteína) correspondiente o gen, y opcionalmente combinación de estas medidas.
Por medidas de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce en general a 0 hasta 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la producción de dichos L-aminoácidos, en particular L-treonina, además de la sobreexpresión de los genes sucA y sucB, eliminar reacciones secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse en el proceso de lotes (cultivo discontinuo), el proceso de lote alimentado (proceso de alimentación), o el proceso de realimentación repetida (proceso de alimentación repetitivo). Un sumario de métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer los requerimientos de las cepas particulares de manera adecuada. Descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos se contienen en el libro de texto "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., EEUU, 1981).
Azúcares y carbohidratos, tales como v.g. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente celulosa, aceites y grasas, tales como v.g. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos tales como v.g. ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como v.g. glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como v.g. ácido acético pueden utilizarse como la fuente de carbono. Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o como una mezcla.
Compuestos orgánicos nitrogenados, tales como peptonas, extractos de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de semilla de soja y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pueden utilizarse como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.
Ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato dipotásico o las sales correspondientes que contienen sodio pueden utilizarse como la fuente de fósforo. El medio de cultivo debe comprender adicionalmente sales de metales, tales como v.g. sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, sustancias esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas, pueden emplearse además de las sustancias arriba mencionadas. Adicionalmente, pueden añadirse al medio de cultivo precursores adecuados. Las sustancias de partida mencionadas pueden añadirse al cultivo en la forma de un lote simple, o pueden alimentarse durante el cultivo de manera adecuada.
Compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, pueden emplearse de manera adecuada para controlar el pH del cultivo. Antiespumantes, tales como v.g. ésteres poliglicólicos de ácidos grasos, pueden emplearse para controlar el desarrollo de espuma. Sustancias adecuadas que tienen una acción selectiva, v.g. antibióticos, pueden añadirse al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como v.g. aire. La temperatura del cultivo es usualmente 25ºC a 45ºC, y preferiblemente 30ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se ha formado un máximo de L-aminoácidos o L-treonina. Esta meta se alcanza usualmente dentro de 10 horas a 160 horas.
El análisis de L-aminoácidos puede realizarse por cromatografía de intercambio aniónico con derivación de ninhidrina subsiguiente, como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)), o puede tener lugar por HPLC en fase inversa como ha sido descrito por Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
El proceso de acuerdo con la invención se utiliza para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, tales como, por ejemplo, L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, en particular L-treonina.
La presente invención se explica con mayor detalle a continuación con ayuda de ejemplos de realización.
El medio mínimo (M9) y medio completo (LB) para Escherichia coli utilizados han sido descritos por J.H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de DNA plasmídico de Escherichia coli y todas las técnicas de restricción, ligación, Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevan a cabo por el método de Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A no ser que se indique otra cosa, la transformación de Escherichia coli se lleva a cabo por el método de Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación para la preparación de cepas y transformantes es 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Construcción del plásmido de expresión pTrc99AsucAB
Los genes sucA y sucB de E. coli K12 se amplifican utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y oligonucleótidos sintéticos. Partiendo desde la secuencia de nucleótidos de los genes sucA y sucB en E. coli K12 MG1655 (Número de Acceso AE000175, Blattner et al. (Science 277:1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Las secuencias de los iniciadores se modifican de tal manera que se forman sitios de reconocimiento para enzimas de restricción. La secuencia de reconocimiento para XbaI se selecciona para el iniciador sucAB1 y la secuencia para HindIII para el iniciador sucAB2, que están marcadas por subrayado en las secuencias de nucleótidos que se muestran a continuación:
2
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655 empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aproximadamente 4100 pb de tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en condiciones PCR estándar (Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con DNA-polimerasa Pfu (Promega Corporation, Madison, EE.UU.).
El producto PCR se liga de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el vector pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se transforma en la cepa de E. coli TOP10. La selección de las células portadoras de plásmido tiene lugar sobre agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector pCR-Blunt II-TOPO-sucAB se escinde con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y, después de separación en gel de agarosa al 0,8%, se aísla el fragmento sucAB con ayuda del Kit de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con las enzimas HindIII y XbaI y se lleva a cabo la ligación con el fragmento sucAB aislado.
La cepa de E. coli XL1-BlueMRF' (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se transforma con el lote de ligación y las células portadoras del plásmido se seleccionan en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de ampicilina. La clonación satisfactoria puede demostrarse después de aislamiento del DNA plasmídico por restricción de control con las enzimas BglI, HpaI y PstI. El plásmido se designa pTrc99AsucAB (Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Preparación de L-treonina con la cepa MG442/pTrc99AsucAB
La cepa de E. coli MG442 productora de L-treonina se describe en la memoria descriptiva de patente US-A-4278765 y está depositada como CMIM B-1628 en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de expresión pTrc99AsucAB descrito en el Ejemplo 1 y con el vector pTrc99A, y las células portadoras del plásmido se seleccionan en agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De este modo se forman las cepas MG442/pTrc99AsucAB y MG442/pTrc99A. Se multiplican luego adicionalmente las colonias individuales seleccionadas en medio mínimo con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O, 1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, y 50 mg/l ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba en cultivos discontinuos de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Para esto, se inoculan 10 ml del medio de precultivo de la composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, y 50 mg/l ampicilina y el lote se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se transinoculan en 10 ml de medio de producción (25 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. La formación de L-treonina por la cepa de partida MG442 se investiga del mismo modo, pero sin que tenga lugar adición alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y reacción post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la Tabla 1.
TABLA 1
3
Breve descripción de la figura
Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AsucAB que contiene los genes sucA y sucB.
Los datos de longitud deben entenderse como datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones utilizadas tienen el significado siguiente:
\bullet
\vtcortauna Amp: resistencia a ampicilina
\bullet
\vtcortauna lacI: gen para la proteína represora del promotor trc
\bullet
\vtcortauna Ptrc: región promotora trc, inducible por IPTG
\bullet
\vtcortauna sucA: región codificante del gen sucA
\bullet
\vtcortauna sucB: región codificante del gen sucB
\bullet
\vtcortauna 5S: región de rRNA 5S
\bullet
\vtcortauna rrnBT: región terminadora de rRNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción tienen el significado siguiente
\bullet
\vtcortauna BglI: endonucleasa de restricción de Bacillus globigii (ATCC 49760)
\bullet
\vtcortauna HindIII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
\bullet
\vtcortauna HpaI: endonucleasa de restricción de Haemophilus parainfluenzae
\bullet
\vtcortauna PstI: endonucleasa de restricción de Providencia stuartii
\bullet
\vtcortauna XbaI: endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación L-aminoácidos utilizando cepas de la familia Enterobacteriáceas que contienen un gen sucA o sucB intensificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 020291BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sucAB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
4 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sucAB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
5

Claims (53)

1. Un proceso para la producción de L-aminoácidos, seleccionados del grupo L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, que comprende la realización de los pasos siguientes:
a)
fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, y en la cual se sobreexpresan los genes sucA y sucB, que codifican una 2-cetoglutarato-descarboxilasa y una dihidrolipoiltranssuccinasa, las dos cuales son subunidades de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa, o secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos de dichos genes.
b)
concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y
c)
aislamiento del L-aminoácido deseado, quedando unos constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma opcionalmente en el producto.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, para la preparación de L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en la cual se sobreexpresa(n) adicionalmente al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
2.1
el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
2.2
el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
2.3
el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa,
2.4
el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa,
2.5
los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
2.6
el gen rhtB que codifica una proteína que imparte resistencia a homoserina,
2.7
el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa,
2.8
el gen rhtC que codifica una proteína que imparte resistencia a treonina,
2.9
el gen thrE que codifica la proteína exportadora de treonina,
2.10
el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa
2.11
el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II,
2.12
el gen pgm, que codifica fosfoglucomutasa,
2.13
el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa,
2.14
el gen ptsH que codifica la fosfohistidina-protein-hexosa-fosfotransferasa,
2.15
el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,
2.16
el gen crr que codifica el componente IIA específico de glucosa,
2.17
el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,
2.18
el gen lrp, que codifica el regulador del regulón leucina,
2.19
el gen mopB, que codifica la chaperona de 10 kD,
2.20
el gen ahpC, que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
2.21
el gen ahpF, que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,
2.22
el gen cysK, que codifica cisteína-sintasa A,
2.23
el gen cysB, que codifica el regulador del regulón cys,
2.24
el gen cysJ, que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,
2.25
el gen cysI, que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,
2.26
el gen cysH, que codifica adenilil-sulfato-reductasa,
2.27
el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana exterior de la célula,
2.28
el gen malE, que codifica la proteína periplásmica de fijación del transporte de maltosa,
2.29
el gen pykF, que codifica piruvato-quinasa I estimulada por fructosa,
2.30
el pfkB gene que codifica 6-fosfofructoquinasa II,
2.31
el gen talB que codifica transaldolasa B,
2.32
el gen rseA, que codifica una proteína de membrana que actúa como regulador negativo de la actividad de sigmaE,
2.33
el gen rseC, que codifica un regulador global del factor sigmaE,
2.34
el gen sodA, que codifica superóxido-dismutasa,
2.35
el gen phoB que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho,
2.36
el gen phoR que codifica la proteína sensora del regulón pho,
2.37
el gen sucC que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa,
2.38
el gen sucD que codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde, para la preparación de L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en la cual se elimina(n) al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
3.1
el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
3.2
el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
3.3
el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA de E. coli, cuando dicho organismo es Escherichia coli,
3.4
el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP de E. coli, cuando dicho organismo es Escherichia coli,
3.5
el gen pckA que codifica fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa,
3.6
el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
3.7
el gen aceA que codifica isocitrato-liasa,
3.8
el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
3.9
el gen fruR que codifica el represor fructosa,
3.10
el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38}.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Microorganismos recombinantes del género Escherichia, que producen L-treonina, y en donde al menos:
a)
el operón thrABC, cuyos genes codifican aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa, y
b)
los genes sucA y sucB, que codifican una 2-cetoglutarato-descarboxilasa y una dihidrolipoiltranssuccinasa, las dos cuales son subunidades de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa, o secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos de dichos genes, están sobreexpresados.
5. Microorganismos de acuerdo con la reivindicación 4, en donde los microorganismos se originan de la especie E. coli.
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