JPH09285294A - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法Info
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- JPH09285294A JPH09285294A JP8100809A JP10080996A JPH09285294A JP H09285294 A JPH09285294 A JP H09285294A JP 8100809 A JP8100809 A JP 8100809A JP 10080996 A JP10080996 A JP 10080996A JP H09285294 A JPH09285294 A JP H09285294A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エシェリヒア属に属する微生物のＬ−グル
タミン酸の生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グ
ルタミン酸の製造法を提供する。 【解決手段】エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代
謝拮抗物質に耐性を有し、かつα−ケトグルタル酸デヒ
ドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した微生物を液体
培地で培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法。
タミン酸の生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グ
ルタミン酸の製造法を提供する。 【解決手段】エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代
謝拮抗物質に耐性を有し、かつα−ケトグルタル酸デヒ
ドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した微生物を液体
培地で培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によりＬ−
グルタミン酸を製造するために使用される微生物および
該微生物を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造
法に関する。Ｌ−グルタミン酸は食品、医薬品等として
重要なアミノ酸である。
グルタミン酸を製造するために使用される微生物および
該微生物を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造
法に関する。Ｌ−グルタミン酸は食品、医薬品等として
重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】従来Ｌ−グルタミン酸は主としてブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属またはミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるグルタミン酸生産菌また
はそれらの変異株を用いた発酵法により製造されてきた
（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５
頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、スト
レプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方
法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナ
ス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ
属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８
５７号）等が知られている。従来の方法によりＬ−グル
タミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需
要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率
的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められてい
る。
バクテリウム属、コリネバクテリウム属またはミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるグルタミン酸生産菌また
はそれらの変異株を用いた発酵法により製造されてきた
（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５
頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、スト
レプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方
法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナ
ス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ
属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８
５７号）等が知られている。従来の方法によりＬ−グル
タミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需
要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率
的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められてい
る。
【０００３】エシェリヒア・コリはその増殖速度の大き
さおよび遺伝子解析の進み方から、将来的に優れたＬ−
グルタミン酸生産菌として利用される可能性を有してい
るが、従来の報告ではエシェリヒア・コリによるＬ−グ
ルタミン酸の蓄積量は２．３ｇ／ｌと極めて低いレベル
にあった（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５０巻、１６４〜
１６５頁、１９６１年）。ところが最近、α−ケトグル
タル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「α−ＫＧＤＨ」と略
すことがある）活性が欠損もしくは低下した変異株が高
いグルタミン酸生産能を有することが報告された（仏国
特許公開２６８０１７８号）。
さおよび遺伝子解析の進み方から、将来的に優れたＬ−
グルタミン酸生産菌として利用される可能性を有してい
るが、従来の報告ではエシェリヒア・コリによるＬ−グ
ルタミン酸の蓄積量は２．３ｇ／ｌと極めて低いレベル
にあった（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５０巻、１６４〜
１６５頁、１９６１年）。ところが最近、α−ケトグル
タル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「α−ＫＧＤＨ」と略
すことがある）活性が欠損もしくは低下した変異株が高
いグルタミン酸生産能を有することが報告された（仏国
特許公開２６８０１７８号）。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エ
シェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能
を向上させ、より安価でかつ効率的なＬ−グルタミン酸
の製造法を提供することにある。
シェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能
を向上させ、より安価でかつ効率的なＬ−グルタミン酸
の製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、エシェリ
ヒア属に属する微生物によるＬ−グルタミン酸の製造法
について鋭意研究を重ねた結果、エシェリヒア属に属
し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物にアス
パラギン酸代謝拮抗物質に対する耐性を付与することに
より、そのＬ−グルタミン酸生産性を向上させ本発明を
完成するに至った。
ヒア属に属する微生物によるＬ−グルタミン酸の製造法
について鋭意研究を重ねた結果、エシェリヒア属に属
し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物にアス
パラギン酸代謝拮抗物質に対する耐性を付与することに
より、そのＬ−グルタミン酸生産性を向上させ本発明を
完成するに至った。
【０００６】本発明は以下の通りである。 （１）エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有す
る微生物。 （２）エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつα−ケトグルタル酸デヒドロゲ
ナーゼ活性が欠損もしくは低下した前記（１）記載の微
生物。 （３）アスパラギン酸代謝拮抗物質が、アスパラギン酸
βヒドロキサメートである前記（１）または（２）記載
の微生物。 （４）前記（１）ないし（３）記載の微生物を液体培地
に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−
グルタミン酸の製造法。
物質に耐性を有し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有す
る微生物。 （２）エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつα−ケトグルタル酸デヒドロゲ
ナーゼ活性が欠損もしくは低下した前記（１）記載の微
生物。 （３）アスパラギン酸代謝拮抗物質が、アスパラギン酸
βヒドロキサメートである前記（１）または（２）記載
の微生物。 （４）前記（１）ないし（３）記載の微生物を液体培地
に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−
グルタミン酸の製造法。
【０００７】
【０００８】本発明に用いられるエシェリヒア属に属す
る微生物としては、例えばエシェリヒア・コリがあげら
れる。具体的には次のような株があげられる。 エシェリヒア・コリ Ｋ−１２ （ＡＴＣＣ１０７９８） エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５） エシェリヒア・コリ Ｂ （ＡＴＣＣ１１３０３） エシェリヒア・コリ Ｗ （ＡＴＣＣ ９６３７）
る微生物としては、例えばエシェリヒア・コリがあげら
れる。具体的には次のような株があげられる。 エシェリヒア・コリ Ｋ−１２ （ＡＴＣＣ１０７９８） エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５） エシェリヒア・コリ Ｂ （ＡＴＣＣ１１３０３） エシェリヒア・コリ Ｗ （ＡＴＣＣ ９６３７）
【０００９】本発明に用いられるアスパラギン酸代謝拮
抗物質とは、エシェリヒア属に属する微生物の生育を阻
害し、その生育阻害がＬ−アスパラギン酸の添加により
回復する物質である。または、Ｌ−アスパラギン酸生合
成系に関与する酵素の発現を抑制する作用または該酵素
の活性を阻害する作用を有し、その抑制または阻害がＬ
−アスパラギン酸の添加により回復する物質である。
抗物質とは、エシェリヒア属に属する微生物の生育を阻
害し、その生育阻害がＬ−アスパラギン酸の添加により
回復する物質である。または、Ｌ−アスパラギン酸生合
成系に関与する酵素の発現を抑制する作用または該酵素
の活性を阻害する作用を有し、その抑制または阻害がＬ
−アスパラギン酸の添加により回復する物質である。
【００１０】アスパラギン酸代謝拮抗物質としては、た
とえばアスパラギン酸βヒドロキサメート、α−メチル
アスパラギン酸、β−メチルアスパラギン酸、システイ
ンスルフィン酸、ジフルオロコハク酸、ハダシン等があ
げられる。アスパラギン酸代謝拮抗物質は市販のものを
用いることができる。
とえばアスパラギン酸βヒドロキサメート、α−メチル
アスパラギン酸、β−メチルアスパラギン酸、システイ
ンスルフィン酸、ジフルオロコハク酸、ハダシン等があ
げられる。アスパラギン酸代謝拮抗物質は市販のものを
用いることができる。
【００１１】本発明の微生物は、エシェリヒア属に属
し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ
−グルタミン酸生産能を有する微生物である。かかる性
質を有していれば、他の栄養要求性、他の薬剤抵抗性を
有する微生物も本発明に用いることができる。
し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ
−グルタミン酸生産能を有する微生物である。かかる性
質を有していれば、他の栄養要求性、他の薬剤抵抗性を
有する微生物も本発明に用いることができる。
【００１２】アスパラギン酸代謝拮抗物質耐性株の誘導
は親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘発剤（例え
ばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（以下、「ＮＧ」と略す）、エチルメタンスルホン酸
等）で処理した後、親株が生育できないような濃度のア
スパラギン酸代謝拮抗物質を含む寒天培地で生育可能な
菌株を採取すればよい。
は親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘発剤（例え
ばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（以下、「ＮＧ」と略す）、エチルメタンスルホン酸
等）で処理した後、親株が生育できないような濃度のア
スパラギン酸代謝拮抗物質を含む寒天培地で生育可能な
菌株を採取すればよい。
【００１３】アスパラギン酸代謝拮抗物質耐性株は、野
生株よりアスパラギン酸代謝拮抗物質に強い耐性を有す
る株のことである。
生株よりアスパラギン酸代謝拮抗物質に強い耐性を有す
る株のことである。
【００１４】エシェリヒア属に属し、Ｌ−グルタミン酸
生産能を有する微生物としては、例えばα−ケトグルタ
ル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した微生
物があげられる。
生産能を有する微生物としては、例えばα−ケトグルタ
ル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した微生
物があげられる。
【００１５】エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタル
酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した微生物
およびその取得方法は、特開平5-244970号公報及び特開
平7-203980号公報に記載されている。具体的には次のよ
うな株があげられる。 エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５３） エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５４） エシェリヒア・コリＡＪ１２９４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４８８１）
酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した微生物
およびその取得方法は、特開平5-244970号公報及び特開
平7-203980号公報に記載されている。具体的には次のよ
うな株があげられる。 エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５３） エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５４） エシェリヒア・コリＡＪ１２９４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４８８１）
【００１６】エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃ
Ａ：：Ｋｍrは、エシェリヒア・コリＷ３１１０のαー
ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子（以下、「ｓ
ｕｃＡ遺伝子」と略す）が破壊されて得られた株であ
り、αＫＧＤＨ完全欠損株である。Ｗ３１１０ｓｕｃ
Ａ：：Ｋｍrは以下の様にして取得されたものである。
Ａ：：Ｋｍrは、エシェリヒア・コリＷ３１１０のαー
ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子（以下、「ｓ
ｕｃＡ遺伝子」と略す）が破壊されて得られた株であ
り、αＫＧＤＨ完全欠損株である。Ｗ３１１０ｓｕｃ
Ａ：：Ｋｍrは以下の様にして取得されたものである。
【００１７】既に明らかにされているｓｕｃＡ遺伝子の
塩基配列（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１
巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）に基づいてプライ
マーを合成し、エシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体
ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりｓｕｃＡ遺伝子を増
幅する。増幅されたｓｕｃＡ遺伝子のコーディング領域
内に薬剤耐性遺伝子（本発明ではカナマイシン耐性遺伝
子）を挿入し、機能を失ったｓｕｃＡ遺伝子を作成す
る。ついで相同組換えを利用してＷ３１１０の染色体上
のｓｕｃＡ遺伝子を、薬剤耐性遺伝子が挿入されその機
能を失ったｓｕｃＡ遺伝子（ｓｕｃＡ：：Ｋｍr）に置
換する。
塩基配列（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１
巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）に基づいてプライ
マーを合成し、エシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体
ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりｓｕｃＡ遺伝子を増
幅する。増幅されたｓｕｃＡ遺伝子のコーディング領域
内に薬剤耐性遺伝子（本発明ではカナマイシン耐性遺伝
子）を挿入し、機能を失ったｓｕｃＡ遺伝子を作成す
る。ついで相同組換えを利用してＷ３１１０の染色体上
のｓｕｃＡ遺伝子を、薬剤耐性遺伝子が挿入されその機
能を失ったｓｕｃＡ遺伝子（ｓｕｃＡ：：Ｋｍr）に置
換する。
【００１８】αＫＧＤＨ欠損株は上記の様な遺伝子工学
的な手法による以外にも通常の変異処理方法によっても
分離出来る。例えばＸ線や紫外線の照射、或いはＮＧ等
の変異誘発剤で処理した後、以下の性質に基づいてαＫ
ＧＤＨ欠損株を分離することができる。
的な手法による以外にも通常の変異処理方法によっても
分離出来る。例えばＸ線や紫外線の照射、或いはＮＧ等
の変異誘発剤で処理した後、以下の性質に基づいてαＫ
ＧＤＨ欠損株を分離することができる。
【００１９】αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変
異株は好気的培養条件下ではグルコースを含む最少培地
で生育できないか、もしくは生育速度が著しく低下す
る。ところが同一条件でも最少培地にコハク酸またはリ
ジン及びメチオニンを添加すると通常の生育が可能とな
る。また嫌気的培養条件下ではグルコースを含む最少培
地でも生育が可能である（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、第１０５巻、１８２〜１９０頁、１９６９
年）。
異株は好気的培養条件下ではグルコースを含む最少培地
で生育できないか、もしくは生育速度が著しく低下す
る。ところが同一条件でも最少培地にコハク酸またはリ
ジン及びメチオニンを添加すると通常の生育が可能とな
る。また嫌気的培養条件下ではグルコースを含む最少培
地でも生育が可能である（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、第１０５巻、１８２〜１９０頁、１９６９
年）。
【００２０】エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３８５３）は、α−ＫＧＤＨ活性が低下
し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下した変異
株である。
ＲＭ ＢＰ−３８５３）は、α−ＫＧＤＨ活性が低下
し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下した変異
株である。
【００２１】エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３８５４）は、α−ＫＧＤＨ活性が低下
し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下し、ａｃ
ｅオペロンの発現が構成的になった性質を併せ持つ変異
株である。
ＲＭ ＢＰ−３８５４）は、α−ＫＧＤＨ活性が低下
し、さらにＬ−グルタミン酸の分解活性が低下し、ａｃ
ｅオペロンの発現が構成的になった性質を併せ持つ変異
株である。
【００２２】エシェリヒア・コリＡＪ１２９４９（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４８８１）は、エシェリヒア・コリＷ３１
１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr に、フォスフォエノールピルベ
ートカルボキシラーゼ遺伝子およびグルタメートデヒド
ロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドが導入されて得られ
た株である。
ＲＭ ＢＰ−４８８１）は、エシェリヒア・コリＷ３１
１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr に、フォスフォエノールピルベ
ートカルボキシラーゼ遺伝子およびグルタメートデヒド
ロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドが導入されて得られ
た株である。
【００２３】上記の株のように、ＫＧＤＨ活性が欠損も
しくは低下した性質に加えてグルタミン酸分解能が低下
した性質、マレートシンターゼ（ａｃｅＢ）、イソシト
レートリアーゼ（ａｃｅＡ）、イソシトレートデヒドロ
ゲナーゼ・フォスファターゼ（ａｃｅＫ）オペロンの発
現が構成的になった性質、および／または、フォスフォ
エノールピルベートカルボキシラーゼおよびグルタメー
トデヒドロゲナーゼが増強された性質を併せ持つ変異株
は、一層高いＬ−グルタミン酸生産能を有することから
好ましい。
しくは低下した性質に加えてグルタミン酸分解能が低下
した性質、マレートシンターゼ（ａｃｅＢ）、イソシト
レートリアーゼ（ａｃｅＡ）、イソシトレートデヒドロ
ゲナーゼ・フォスファターゼ（ａｃｅＫ）オペロンの発
現が構成的になった性質、および／または、フォスフォ
エノールピルベートカルボキシラーゼおよびグルタメー
トデヒドロゲナーゼが増強された性質を併せ持つ変異株
は、一層高いＬ−グルタミン酸生産能を有することから
好ましい。
【００２４】本発明の微生物は、エシェリヒア属に属
し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ
−グルタミン酸生産能を有する微生物である。例えば以
下のものがある。 エシェリヒア・コリＡＪ１３１９９（ＦＥＲＭ Ｐ−１
５５７３）
し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ
−グルタミン酸生産能を有する微生物である。例えば以
下のものがある。 エシェリヒア・コリＡＪ１３１９９（ＦＥＲＭ Ｐ−１
５５７３）
【００２５】エシェリヒア・コリＡＪ１３１９９は、病
原性のない野生株エシェリヒア・コリＷ３１１０より誘
導されたエシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋ
ｍrを親株として通常の変異処理方法によって得られた
もので、アスパラギン酸βヒドロキサメートに耐性な変
異株である。
原性のない野生株エシェリヒア・コリＷ３１１０より誘
導されたエシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋ
ｍrを親株として通常の変異処理方法によって得られた
もので、アスパラギン酸βヒドロキサメートに耐性な変
異株である。
【００２６】本発明におけるＬ−グルタミン酸生産用培
地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じて
アミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
の栄養培地である。合成培地または天然培地のいずれも
使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源
は、培養される菌の利用可能なものならばいずれの種類
を用いてもよい。
地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じて
アミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
の栄養培地である。合成培地または天然培地のいずれも
使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源
は、培養される菌の利用可能なものならばいずれの種類
を用いてもよい。
【００２７】炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノ
ース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が
用いられ、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独
あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。
ル、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノ
ース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が
用いられ、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独
あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。
【００２８】窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が用いられる。
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が用いられる。
【００２９】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が用
いられ、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株
を培養する場合には要求される栄養素を補添する事が必
要である。
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が用
いられ、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株
を培養する場合には要求される栄養素を補添する事が必
要である。
【００３０】無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が用いられる。
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が用いられる。
【００３１】培養方法は、発酵温度２０ないし４５℃、
ｐＨを５ないし９に制御しつつ通気培養を行う。培養中
にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、
アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０
時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著
量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
ｐＨを５ないし９に制御しつつ通気培養を行う。培養中
にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、
アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０
時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著
量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００３２】培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸
を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよ
い。例えば培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する
方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって
採取される。
を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよ
い。例えば培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する
方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって
採取される。
【００３３】
【実施例】次に実施例によって本発明をさらに詳細に説
明する
明する
【００３４】
【実施例１】αＫＧＤＨ欠損株の作出 （１）エシェリヒア・コリＷ３１１０のｓｕｃＡ遺伝子
およびジヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラー
ゼ遺伝子のクローニング エシェリヒア・コリＫ１２株のｓｕｃＡ遺伝子およびジ
ヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラーゼ遺伝子
（以下、「ｓｕｃＢ遺伝子」と略す）の塩基配列は既に
明らかにされている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、
第１４１巻、３５１〜３７４頁、１９８４年）。報告さ
れている塩基配列に基づいて配列表配列番号１から４に
示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＷ３１１
０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりｓｕ
ｃＡ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子をそれぞれ増幅した。
およびジヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラー
ゼ遺伝子のクローニング エシェリヒア・コリＫ１２株のｓｕｃＡ遺伝子およびジ
ヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラーゼ遺伝子
（以下、「ｓｕｃＢ遺伝子」と略す）の塩基配列は既に
明らかにされている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、
第１４１巻、３５１〜３７４頁、１９８４年）。報告さ
れている塩基配列に基づいて配列表配列番号１から４に
示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コリＷ３１１
０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりｓｕ
ｃＡ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子をそれぞれ増幅した。
【００３５】合成したプライマーのうち、ｓｕｃＡ遺伝
子の増幅に用いたプライマーは、配列表配列番号１およ
び２に示される。配列表配列番号１はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５４頁、１９８４年に記
載されているｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列図上の４５番目
から６５番目の塩基に至る配列に相当し、配列表配列番
号２はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３
６４頁、１９８４年に記載されているｓｕｃＢ遺伝子の
塩基配列図上の３１７３番目から３１９３番目までの配
列に相当する。
子の増幅に用いたプライマーは、配列表配列番号１およ
び２に示される。配列表配列番号１はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３５４頁、１９８４年に記
載されているｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列図上の４５番目
から６５番目の塩基に至る配列に相当し、配列表配列番
号２はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１４１巻、３
６４頁、１９８４年に記載されているｓｕｃＢ遺伝子の
塩基配列図上の３１７３番目から３１９３番目までの配
列に相当する。
【００３６】またｓｕｃＢ遺伝子の増幅に用いたプライ
マーは、配列表配列番号３および４に示される。配列表
配列番号３は同報文の３５４頁に記載されているｓｕｃ
Ａ遺伝子の塩基配列図上の２１７９番目から２１９８番
目までの配列に、配列表配列番号４は同報文３６４頁に
記載されているｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列図上の４５６
６番目から４５９１番目の配列に相当する。なお、ｓｕ
ｃＡ遺伝子とｓｕｃＢ遺伝子はオペロンをなすことが明
らかにされている。
マーは、配列表配列番号３および４に示される。配列表
配列番号３は同報文の３５４頁に記載されているｓｕｃ
Ａ遺伝子の塩基配列図上の２１７９番目から２１９８番
目までの配列に、配列表配列番号４は同報文３６４頁に
記載されているｓｕｃＢ遺伝子の塩基配列図上の４５６
６番目から４５９１番目の配列に相当する。なお、ｓｕ
ｃＡ遺伝子とｓｕｃＢ遺伝子はオペロンをなすことが明
らかにされている。
【００３７】ｓｕｃＡ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子をＰ
ＣＲで増幅する際の鋳型とした染色体ＤＮＡはエシェリ
ヒア・コリＷ３１１０株から常法（生物工学実験書、日
本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）
により調製した。
ＣＲで増幅する際の鋳型とした染色体ＤＮＡはエシェリ
ヒア・コリＷ３１１０株から常法（生物工学実験書、日
本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）
により調製した。
【００３８】ＰＣＲ反応は、ＰＣＲテクノロジー（ヘン
リーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）
８頁に記載されている標準反応条件を用いた。
リーエーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）
８頁に記載されている標準反応条件を用いた。
【００３９】生成したＰＣＲ産物の末端をＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼにより平滑にし、ベクターｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＶサイトにクローニングした。ｐＢＲ３２２に増
幅したｓｕｃＡ遺伝子をクローン化したものをｐＢＲ−
ｓｕｃＡと名づけ、ｓｕｃＢ遺伝子をクローン化したも
のをｐＢＲ−ｓｕｃＢと名づけた。ついでこれらプラス
ミドを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を常法
（生物工学実験書、日本生物工学会編、１３９頁、培風
館、１９９２年）により形質転換し、形質転換株からそ
れぞれプラスミドを調製し、クローン化されているＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図を作成した。報告されているｓｕ
ｃＡ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子の制限酵素地図と比較
し、クローン化されている遺伝子が同一地図を有するこ
とを確認した。
リメラーゼにより平滑にし、ベクターｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＶサイトにクローニングした。ｐＢＲ３２２に増
幅したｓｕｃＡ遺伝子をクローン化したものをｐＢＲ−
ｓｕｃＡと名づけ、ｓｕｃＢ遺伝子をクローン化したも
のをｐＢＲ−ｓｕｃＢと名づけた。ついでこれらプラス
ミドを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を常法
（生物工学実験書、日本生物工学会編、１３９頁、培風
館、１９９２年）により形質転換し、形質転換株からそ
れぞれプラスミドを調製し、クローン化されているＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図を作成した。報告されているｓｕ
ｃＡ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子の制限酵素地図と比較
し、クローン化されている遺伝子が同一地図を有するこ
とを確認した。
【００４０】次にｐＢＲ−ｓｕｃＢをＫｐｎＩ及びＥｃ
ｏＲＩで消化し、ｓｕｃＢ遺伝子を含むＫｐｎＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を調製し、一方、ｐＢＲ−ｓｕｃＡを同様に
ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで消化した後、大きい方のＤＮＡ
断片を調製し、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結
し、ｐＢＲ−ｓｕｃＡＢを作成した（図１）。
ｏＲＩで消化し、ｓｕｃＢ遺伝子を含むＫｐｎＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を調製し、一方、ｐＢＲ−ｓｕｃＡを同様に
ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで消化した後、大きい方のＤＮＡ
断片を調製し、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結
し、ｐＢＲ−ｓｕｃＡＢを作成した（図１）。
【００４１】（２）エシェリヒア・コリＷ３１１０の染
色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子の破壊 図２にエシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡ上
のｓｕｃＡ遺伝子の破壊するための手順を示した。
色体ＤＮＡ上のｓｕｃＡ遺伝子の破壊 図２にエシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡ上
のｓｕｃＡ遺伝子の破壊するための手順を示した。
【００４２】まずｐＢＲ−ｓｕｃＡＢをＫｐｎＩで消化
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより両末端を平滑にし
た。一方、ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア社製）をＰｓｔＩ
で消化し、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を
調製後、両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末
端にした。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐ
ＢＲ−ｓｕｃＡ：：Ｋｍrを作成し、ついで本プラスミ
ドからカナマイシン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−
ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を調製し、この直鎖状ＤＮＡ断片
を用いてエシェリヒア・コリ ジェネティック ストッ
ク センター（米国エール大学）から入手したエシェリ
ヒア・コリＪＣ７６２３株を常法（生物工学実験書、日
本生物工学会編、１３９頁、培風館、１９９２年）によ
り形質添加し、ＪＣ７６２３株の染色体ＤＮＡ上のｓｕ
ｃＡ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の挿入されたｓｕ
ｃＡ遺伝子（ｓｕｃＡ：：Ｋｍr）に組換えられた株を
２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地（バクト
トリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト
５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２、寒天１５ｇ
／ｌ）上で選択した。エシェリヒア・コリＪＣ７６２３
株はｒｅｃＢ-、ｒｅｃＣ-、ｓｂｃＢ-の形質を有して
いるため直鎖状のＤＮＡを用いて形質転換しても頻度良
く相同組換えを起こす。カナマイシン耐性株１２株を取
得し、１２株それぞれから染色体ＤＮＡを調製し、Ｋｐ
ｎＩで消化した後、ｓｕｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
プローブにしてサザンハイブリダイゼイションを行った
ところ、１２株ともそのｓｕｃＡ遺伝子がカナマイシン
耐性遺伝子の挿入されたｓｕｃＡ遺伝子に組換えられた
株であることが確認された。組換えられたことは以下の
結果によって確認できる。ｐＢＲ−ｓｕｃＡのｓｕｃＡ
遺伝子を含む２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼイションを
行うとＪＣ７６２３株の染色体ＤＮＡをＫｐｎＩで消化
した場合、ｓｕｃＡ遺伝子内にＫｐｎＩサイトが存在す
るために５．２ｋｂと６．２ｋｂの２本のバンドが検出
される。一方、カナマイシン耐性遺伝子が挿入されたｓ
ｕｃＡ遺伝子に組換えられた株ではカナマイシン耐性遺
伝子をｓｕｃＡ遺伝子内に挿入する際にＫｐｎＩサイト
が破壊されているため、その染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ消
化物では１１．４ｋｂの１本のバンドしか検出されな
い。
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより両末端を平滑にし
た。一方、ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア社製）をＰｓｔＩ
で消化し、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を
調製後、両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末
端にした。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐ
ＢＲ−ｓｕｃＡ：：Ｋｍrを作成し、ついで本プラスミ
ドからカナマイシン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−
ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を調製し、この直鎖状ＤＮＡ断片
を用いてエシェリヒア・コリ ジェネティック ストッ
ク センター（米国エール大学）から入手したエシェリ
ヒア・コリＪＣ７６２３株を常法（生物工学実験書、日
本生物工学会編、１３９頁、培風館、１９９２年）によ
り形質添加し、ＪＣ７６２３株の染色体ＤＮＡ上のｓｕ
ｃＡ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の挿入されたｓｕ
ｃＡ遺伝子（ｓｕｃＡ：：Ｋｍr）に組換えられた株を
２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬ寒天培地（バクト
トリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト
５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２、寒天１５ｇ
／ｌ）上で選択した。エシェリヒア・コリＪＣ７６２３
株はｒｅｃＢ-、ｒｅｃＣ-、ｓｂｃＢ-の形質を有して
いるため直鎖状のＤＮＡを用いて形質転換しても頻度良
く相同組換えを起こす。カナマイシン耐性株１２株を取
得し、１２株それぞれから染色体ＤＮＡを調製し、Ｋｐ
ｎＩで消化した後、ｓｕｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
プローブにしてサザンハイブリダイゼイションを行った
ところ、１２株ともそのｓｕｃＡ遺伝子がカナマイシン
耐性遺伝子の挿入されたｓｕｃＡ遺伝子に組換えられた
株であることが確認された。組換えられたことは以下の
結果によって確認できる。ｐＢＲ−ｓｕｃＡのｓｕｃＡ
遺伝子を含む２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼイションを
行うとＪＣ７６２３株の染色体ＤＮＡをＫｐｎＩで消化
した場合、ｓｕｃＡ遺伝子内にＫｐｎＩサイトが存在す
るために５．２ｋｂと６．２ｋｂの２本のバンドが検出
される。一方、カナマイシン耐性遺伝子が挿入されたｓ
ｕｃＡ遺伝子に組換えられた株ではカナマイシン耐性遺
伝子をｓｕｃＡ遺伝子内に挿入する際にＫｐｎＩサイト
が破壊されているため、その染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ消
化物では１１．４ｋｂの１本のバンドしか検出されな
い。
【００４３】このようにして得られたカナマイシン耐性
のエシェリヒア・コリＪＣ７６２３株にＰ１ファージを
感染させ、溶菌液を調製後、エシェリヒア・コリＷ３１
１０へｓｕｃＡ：：Ｋｍrを形質導入した。Ｐ１ファー
ジによる形質導入は常法（生物工学実験書、日本生物工
学会編、７５〜７６頁、培風館、１９９２年）によっ
た。カナマイシン耐性株として分離した株の代表株をＷ
３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍrと名付けた。
のエシェリヒア・コリＪＣ７６２３株にＰ１ファージを
感染させ、溶菌液を調製後、エシェリヒア・コリＷ３１
１０へｓｕｃＡ：：Ｋｍrを形質導入した。Ｐ１ファー
ジによる形質導入は常法（生物工学実験書、日本生物工
学会編、７５〜７６頁、培風館、１９９２年）によっ
た。カナマイシン耐性株として分離した株の代表株をＷ
３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍrと名付けた。
【００４４】Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株、並びに
Ｗ３１１０株のαＫＧＤＨ活性をＲｅｅｄ等の方法（メ
ソッド イン エンザイモロジー、第１３巻、５５頁、
１９６９年）により測定した。その結果を表１に示す。
Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株にはαＫＧＤＨ活性が
検出されず、Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株がαＫＧ
ＤＨ欠損株であることが確認された。
Ｗ３１１０株のαＫＧＤＨ活性をＲｅｅｄ等の方法（メ
ソッド イン エンザイモロジー、第１３巻、５５頁、
１９６９年）により測定した。その結果を表１に示す。
Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株にはαＫＧＤＨ活性が
検出されず、Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍr株がαＫＧ
ＤＨ欠損株であることが確認された。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【実施例２】ＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキサメート
耐性株の分離 エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍrを２
ＹＴ液体培地（バクトトリプトン１６ｇ／ｌ、バクトイ
ーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、
ｐＨ７．２）で一晩３７℃で培養した。培養液０．１ｍ
ｌを５ｍｌの２ＹＴ液体培地に植菌し、３７℃でさらに
３時間培養し、対数増殖期中期の菌体を集菌した。５０
ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）に懸濁
し、遠心分離により再度集菌した。再度同じ操作を行い
菌体を洗浄した後、２００ｍｇ／ＬのＮＧを含む５０ｍ
Ｍリン酸カリウムバッファーに懸濁し、３０分間静置し
た後、遠心分離により集菌した。５０ｍＭリン酸バッフ
ァーに菌体を懸濁し、遠心分離により集菌した。さらに
２度同じ操作を行い菌体を洗浄した後、ＤＬ−アスパラ
ギン酸βヒドロキサメート０．２５ｇ／ｌを含むＭ９最
少培地（グルコース５ｇ／ｌ、リン酸水素２ナトリウム
１７．１ｇ／ｌ、リン酸２水素カリウム３．０ｇ／ｌ、
塩化アンモニウム１．０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ０．５ｇ／
ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．２５ｇ／ｌ、チアミ
ン塩酸塩１ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）に塗布し、３７
℃で５〜８日間培養した。
耐性株の分離 エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍrを２
ＹＴ液体培地（バクトトリプトン１６ｇ／ｌ、バクトイ
ーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、
ｐＨ７．２）で一晩３７℃で培養した。培養液０．１ｍ
ｌを５ｍｌの２ＹＴ液体培地に植菌し、３７℃でさらに
３時間培養し、対数増殖期中期の菌体を集菌した。５０
ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）に懸濁
し、遠心分離により再度集菌した。再度同じ操作を行い
菌体を洗浄した後、２００ｍｇ／ＬのＮＧを含む５０ｍ
Ｍリン酸カリウムバッファーに懸濁し、３０分間静置し
た後、遠心分離により集菌した。５０ｍＭリン酸バッフ
ァーに菌体を懸濁し、遠心分離により集菌した。さらに
２度同じ操作を行い菌体を洗浄した後、ＤＬ−アスパラ
ギン酸βヒドロキサメート０．２５ｇ／ｌを含むＭ９最
少培地（グルコース５ｇ／ｌ、リン酸水素２ナトリウム
１７．１ｇ／ｌ、リン酸２水素カリウム３．０ｇ／ｌ、
塩化アンモニウム１．０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ０．５ｇ／
ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．２５ｇ／ｌ、チアミ
ン塩酸塩１ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）に塗布し、３７
℃で５〜８日間培養した。
【００４７】ＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキサメート
０．２５ｇ／Ｌを含むＭ９最少培地上に出現したコロニ
ーを釣り上げ、同組成のＭ９最少培地にて単コロニー分
離を行い、ＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキサメート耐
性株ＡＪ１３１９９を分離した。親株であるＷ３１１０
ｓｕｃＡ：：ＫｍrはＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキ
サメート０．２５ｇ／Ｌを含むＭ９最少培地に塗布した
場合、全く生育できず、コロニーの形成は見られなかっ
た。
０．２５ｇ／Ｌを含むＭ９最少培地上に出現したコロニ
ーを釣り上げ、同組成のＭ９最少培地にて単コロニー分
離を行い、ＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキサメート耐
性株ＡＪ１３１９９を分離した。親株であるＷ３１１０
ｓｕｃＡ：：ＫｍrはＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキ
サメート０．２５ｇ／Ｌを含むＭ９最少培地に塗布した
場合、全く生育できず、コロニーの形成は見られなかっ
た。
【００４８】
【実施例３】Ｌ−グルタミン酸生産菌の培養、及びＬ−
グルタミン酸生産 分離したＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキサメート耐性
株ＡＪ１３１９９、その親株であるＷ３１１０ｓｕｃ
Ａ：：ＫｍrをＬ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／
ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）で前培養した
後、１２０℃、１０分間蒸気殺菌した下記組成のＬ−グ
ルタミン酸生産用培地２０ｍＬを注入した５００ｍｌ容
振とう坂口フラスコに植菌して、３７℃にて糖が枯渇す
るまで振とう培養したところ表２に示すような結果を得
た。
グルタミン酸生産 分離したＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキサメート耐性
株ＡＪ１３１９９、その親株であるＷ３１１０ｓｕｃ
Ａ：：ＫｍrをＬ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／
ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）で前培養した
後、１２０℃、１０分間蒸気殺菌した下記組成のＬ−グ
ルタミン酸生産用培地２０ｍＬを注入した５００ｍｌ容
振とう坂口フラスコに植菌して、３７℃にて糖が枯渇す
るまで振とう培養したところ表２に示すような結果を得
た。
【００４９】Ｌ−グルタミン酸生産用培地 グルコース（別殺菌） ４０．０ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム（別殺菌） １．０ｇ／ｌ 硫安 ２０．０ｇ／ｌ リン酸２水素カリウム １．０ｇ／ｌ 硫酸第一鉄７水和物 １０．０ｍｇ／ｌ 硫酸マンガン５水和物 １０．０ｍｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト ２．０ｇ／ｌ チアミン塩酸塩 １０．０ｍｇ／ｌ 炭酸カルシウム（乾熱殺菌） ５０．０ｇ／ｌ ｐＨ７．０（ＫＯＨで調製）
【００５０】
【表２】
【００５１】ＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキサメート
耐性株ＡＪ１３１９９は親株に比し、グルタミン酸の蓄
積量は変わらなかったが、生育速度が高く、菌体量も多
く、培養時間が大幅に短縮され、単位時間当りのグルタ
ミン酸生産性は大幅に向上した。
耐性株ＡＪ１３１９９は親株に比し、グルタミン酸の蓄
積量は変わらなかったが、生育速度が高く、菌体量も多
く、培養時間が大幅に短縮され、単位時間当りのグルタ
ミン酸生産性は大幅に向上した。
【００５２】ＡＪ１３１９９株以外にも多数のＤＬ−ア
スパラギン酸βヒドロキサメート耐性株を分離し、実施
例３に示した方法で評価したところＡＪ１３１９９と同
様に生育速度が高く、菌体量が多く、培養時間が大幅に
短縮された株が多数見いだされた。
スパラギン酸βヒドロキサメート耐性株を分離し、実施
例３に示した方法で評価したところＡＪ１３１９９と同
様に生育速度が高く、菌体量が多く、培養時間が大幅に
短縮された株が多数見いだされた。
【００５３】
【発明の効果】本発明の方法により、エシェリヒア属に
属する変異株のＬ−グルタミン酸生産能を高めることが
でき、Ｌ−グルタミン酸を安価かつ効率的に製造するこ
とができる。
属する変異株のＬ−グルタミン酸生産能を高めることが
でき、Ｌ−グルタミン酸を安価かつ効率的に製造するこ
とができる。
【００５４】エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４は、平
成３年７月２４日に工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２
３７９が付与されている。同株は、平成４年５月１５日
にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５３が付与されている。エシェ
リヒア・コリＡＪ１２６２８は、平成３年７月２４日に
工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されて
おり、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２３８０が付与されて
いる。同株は、平成４年５月１５日にブタペスト条約に
基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５４が付与されている。エシェリヒア・コリＡＪ１
２９４９は、平成５年１２月２８日に工業技術院生命工
学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つく
ば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４０３９が付与されている。同株は、平
成６年１１月１１日にブタペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８１が付与
されている。エシェリヒア・コリＡＪ１３１９９は、平
成８年４月１８日に工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５
５７３が付与されている。
成３年７月２４日に工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２
３７９が付与されている。同株は、平成４年５月１５日
にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５３が付与されている。エシェ
リヒア・コリＡＪ１２６２８は、平成３年７月２４日に
工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されて
おり、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２３８０が付与されて
いる。同株は、平成４年５月１５日にブタペスト条約に
基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５４が付与されている。エシェリヒア・コリＡＪ１
２９４９は、平成５年１２月２８日に工業技術院生命工
学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つく
ば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４０３９が付与されている。同株は、平
成６年１１月１１日にブタペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８１が付与
されている。エシェリヒア・コリＡＪ１３１９９は、平
成８年４月１８日に工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５
５７３が付与されている。
【００５５】
配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｓｕｃＡ遺伝子増幅用
プライマー 配列 ACGCGCAAGC GTCGCATCAG G 21
プライマー 配列 ACGCGCAAGC GTCGCATCAG G 21
【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｓｕｃＡ遺伝子増幅用
プライマー ATCGGCTACG AATTCAGGCA G 22
プライマー ATCGGCTACG AATTCAGGCA G 22
【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｓｕｃＢ遺伝子増幅用
プライマー 配列 CCGGTCGCGG TACCTTCTTC 20
プライマー 配列 CCGGTCGCGG TACCTTCTTC 20
【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：エシェリヒア・コリｓｕｃＢ遺伝子増幅用
プライマー 配列 CGTAGACCGA ATTCTTCGTA TCGCTT 26
プライマー 配列 CGTAGACCGA ATTCTTCGTA TCGCTT 26
【図１】ｐＢＲ−ｓｕｃＡＢの構築図を示す。
【図２】エシェリヒア・コリＷ３１１０の染色体ＤＮＡ
上のｓｕｃＡ遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子が挿入さ
れたｓｕｃＡ遺伝子（ｓｕｃＡ：：Ｋｍr）に置き換え
る過程を示す。
上のｓｕｃＡ遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子が挿入さ
れたｓｕｃＡ遺伝子（ｓｕｃＡ：：Ｋｍr）に置き換え
る過程を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 松井 和彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸
代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ−グルタミン酸生産
能を有する微生物。 - 【請求項２】 エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸
代謝拮抗物質に耐性を有し、かつα−ケトグルタル酸デ
ヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した請求項１記
載の微生物。 - 【請求項３】 アスパラギン酸代謝拮抗物質が、アスパ
ラギン酸βヒドロキサメートである請求項１または２記
載の微生物。 - 【請求項４】 請求項１ないし３記載の微生物を液体培
地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
−グルタミン酸の製造法。
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