ES2328629T3 - Pirrolopiridinas sustituidas, composiciones que las contienen, procedimiento de fabricacion y utilizacion. - Google Patents
Pirrolopiridinas sustituidas, composiciones que las contienen, procedimiento de fabricacion y utilizacion. Download PDFInfo
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Abstract
Producto que responde a la fórmula (I) siguiente: **(Ver fórmula)** en la que: 1) A y Ar son grupos fenilo sustituidos; 2) L es NH-CO-NH; 3) W es C(R6), uno de Y y Z, se elige entre N y NO, y el otro es C(R5) y; 4) R1, R5, y R6 son H; 5) Ra es H.
Description
Pirrolopiridinas sustituidas, composiciones que
las contienen, procedimiento de fabricación y utilización.
La presente invención se refiere principalmente
a compuestos químicos nuevos, particularmente a pirrolopiridinas
sustituidas, a las composiciones que las contienen, y a su
utilización como medicamentos.
Más particularmente, y según un primer aspecto,
la invención se refiere a nuevas pirrolopiridinas sustituidas
específicas que presentan una actividad anticancerosa, mediante la
modulación de la actividad de proteínas, en particular de
quinasas.
Hasta ahora, la mayoría de los compuestos
comerciales utilizados en quimioterapia plantean problemas
importantes de efectos secundarios y de tolerancia por los
pacientes. Estos efectos podrían limitarse en la medida en que los
medicamentos utilizados actúen selectivamente sobre las células
cancerosas, con exclusión de las células sanas. Una de las
soluciones para limitar los efectos indeseables de una quimioterapia
puede consistir por lo tanto en la utilización de medicamentos que
actúen sobre rutas metabólicas o elementos constitutivos de estas
rutas, expresados mayoritariamente en las células cancerosas, y que
no sean expresados o se expresen minoritariamente en las células
sanas.
Las proteínas quinasas son una familia de
enzimas que catalizan la fosforilación de grupos hidroxilos de
restos específicos de proteínas tales como restos de tirosina,
serina o treonina. Dichas fosforilaciones pueden modificar de forma
importante la función de las proteínas; así, las proteínas quinasas
tienen un papel importante en la regulación de una gran variedad de
procesos celulares, incluyendo principalmente el metabolismo, la
proliferación celular, la diferenciación celular, la migración
celular o la supervivencia celular. Entre las diferentes funciones
celulares en las que está implicada la actividad de una proteína
quinasa, algunos procesos representan dianas atractivas para tratar
las enfermedades cancerosas así como otras enfermedades.
Así, uno de los objetos de la presente invención
es proponer composiciones que tienen una actividad anticancerosa,
actuando en particular frente a las quinasas. Entre las quinasas
para las que se investiga una modulación de la actividad, se
prefieren KDR y Tie2.
Estos productos responden a la fórmula (1)
siguiente:
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en la
que:
1) A y Ar son grupos fenilo sustituidos;
2) L es
NH-CO-NH;
3) W es C(R6), uno de Y y Z, se elige
entre N y NO, y el otro es C(R5) y;
4) R1, R5, y R6 son H;
5) Ra es H.
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Las combinaciones aceptables de sustituyentes
incluyen aquellas en las que R1, R5 y R6 son H y uno de Y y Z se
elige entre N y NO.
A está sustituido ventajosamente con un primer
sustituyente seleccionado del grupo constituido por
alquilo(C1-C12),
alquilo(C1-C12) halogenado,
cicloalquilo(C3-C12),
alquileno(C2-C12),
alquinilo(C2-C12),
arilo(C8-C14),
heteroarilo(C1-C13),
O-alquilo(C1-C3),
O-Arilo(C6-C14),
O-heteroarilo(C1-C13),
S-alquilo(C1-C3),
S-Arilo(C6-C14),
S-heteroarilo(C1-C13),
estando cada uno sustituido opcionalmente con un sustituyente
elegido entre alquilo(C1-C3), halógeno,
O-alquilo(C1-C3),
N(R8)(R9); en el que R8 y R9 se eligen independientemente
entre H, alquilo(C1-C3),
alquilo(C1-C3)OH,
alquilo(C1-C3) halogenado,
alquilo(C1-C3)NH_{2},
alquilo(C1-C3)COOM,
alquilo(C1-C3)SO_{3}M, en el que
cuando R8 y R9 son diferentes simultáneamente de H, pueden estar
unidos para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones que contiene de 0 a
3 heteroátomos elegidos entre O, N y S, en el que M es H o un catión
de metal alcalino elegido entre Li, Na y K.
Además, A está también ventajosamente sustituido
con un segundo sustituyente seleccionado del grupo constituido por
F, Cl, Br, I, OH, SH, SO_{3}M, COOM, CN, NO_{2},
CON(R8)(R9), N(R8)CO(R9),
alquilo(C1-C3)-OH,
alquilo(C1-C3)-N(R8)(R9),
alquilo(C1-C3)-(R10),
alquilo(C1-C3)-COOH,
N(R8)(R9); en el que R8 y R9 se eligen independientemente
entre H, alquilo(C1-C3),
alquilo(C1-C3)OH,
alquilo(C1-C3) halogenado,
alquilo(C1-C3)NH_{2},
alquilo(C1-C3)COOM,
alquilo(C1-C3)SO_{3}M; en el que
cuando R8 y R9 son diferentes simultáneamente de H, pueden unirse
para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones que contiene de 0 a 3
heteroátomos elegidos entre O, N y S; en el que M es H o un catión
de metal alcalino elegido entre Li, Na y K; y en el que R10 es H o
un heterociclo no aromático sustituido opcionalmente, que comprende
2 a 7 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos elegidos entre N,
O
y S.
y S.
Cuando A está disustituido, los dos
sustituyentes pueden unirse entre sí para formar un ciclo de 5 a 7
eslabones que contiene de 0 a 3 heteroátomos elegidos entre N, O y
S.
Según un modo de realización preferido, A es
fenilo sustituido con al menos un grupo elegido entre halógeno,
alquilo(C1-C4),
alquilo(C1-C3) halogenado,
O-alquilo(C1-C4),
S-alquilo(C1-C4),
O-alquilo(C1-C4) halogenado,
S-alquilo(C1-C4) halogenado,
y en la que cuando A está disustituido, los dos sustituyentes pueden
unirse entre sí para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones que
contiene de 0 a 3 heteroátomos elegidos entre N, O y S.
Los productos según la invención pueden estar en
forma:
1) no quiral, o
2) racémica, o
3) enriquecida en un estereoisómero, o
4) enriquecida en un enantiómero;
alquilo(C1-C3)COOM,
alquilo(C1-C3)SO_{3}M; en el que
cuando R8 y R9 son diferentes simultáneamente de H, pueden unirse
para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones que contiene de 0 a 3
heteroátomos elegidos entre O, N y S, en el que M es H o un catión
de metal alcalino elegido entre Li, Na y K.
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Además, A está también ventajosamente sustituido
con un segundo sustituyente seleccionado del grupo constituido por
F, Cl, Br, I, OH, SH, SO_{3}M, COOM, CN, NO_{2},
CON(R8)(R9), N(R8)CO(R9),
alquilo(C1-C3)-OH,
alquilo(C1-C3)-N(R8)(R9),
alquilo(C1-C3)-(R10),
alquilo(C1-C3)-COOH,
N(R8)(R9); en el que R8 y R9 se eligen independientemente
entre H, alquilo(C1-C3),
alquilo(C1-C3)OH,
alquilo(C1-C3) halogenado,
alquilo(C1-C3)NH_{2},
alquilo(C1-C3)COOM,
alquilo(C1-C3)SO_{3}M; en el que,
cuando R8 y R9 son diferentes simultáneamente de H, pueden unirse
para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones que contiene de 0 a 3
heteroátomos elegidos entre O, N y S; en el que M es H o un catión
de metal alcalino elegido entre Li, Na y K; y en el que R10 es H o
un heterociclo no aromático sustituido opcionalmente, que comprende
2 a 7 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos elegidos entre
N,
O y S.
O y S.
Cuando A está disustituido, los dos
sustituyentes pueden unirse entre sí para formar un ciclo de 5 a 7
eslabones que contiene de 0 a 3 heteroátomos elegidos entre N, O y
S.
Según un modo de realización preferido, A es
fenilo, pirazolilo o isoxazolilo sustituido con al menos un grupo
elegido entre halógeno, alquilo(C1-C4),
alquilo(C1-C3) halogenado,
O-alquilo(C1-C4),
S-alquilo(C1-C4),
O-alquilo(C1-C4) halogenado,
S-alquilo(C1-C4) halogenado,
y en la que cuando A está disustituido, los dos sustituyentes pueden
unirse entre sí para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones que
contiene de 0 a 3 heteroátomos elegidos entre N, O y S.
Los productos según la invención pueden estar en
forma:
1) no quiral, o
2) racémica, o
3) enriquecida en un estereoisómero, o
4) enriquecida en un enantiómero;
y estar opcionalmente salificados.
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Un producto según la invención podrá utilizarse
para la fabricación de un medicamento útil para tratar un estado
patológico, en particular un cáncer.
La presente invención se refiere también a un
medicamento que comprende un producto según la invención, y a las
composiciones terapéuticas que comprenden un producto según la
invención en combinación con un excipiente farmacéuticamente
aceptable según el modo de administración elegido. La composición
farmacéutica puede presentarse en forma sólida, líquida o de
liposomas.
Entre las composiciones sólidas se pueden citar
polvos, cápsulas y comprimidos. Entre las formas orales también se
pueden incluir las formas sólidas protegidas frente al medio ácido
del estómago. Los soportes utilizados para las formas sólidas están
constituidos principalmente por soportes minerales como fosfatos,
carbonatos o soportes orgánicos como lactosa, celulosas, almidón o
polímeros. Las formas líquidas están constituidas por disoluciones,
suspensiones o dispersiones. Contienen como soporte dispersivo bien
agua, bien un disolvente orgánico (etanol, NMP u otros) o mezclas
de agentes tensioactivos y disolventes o de agentes complejantes y
disolventes.
Las formas líquidas serán preferentemente
inyectables y, debido a ello, tendrán una formulación aceptable
para dicha utilización.
Las vías de administración por inyección
aceptables incluyen las vías intravenosa, intraperitoneal,
intramuscular y subcutánea, prefiriéndose habitualmente la vía
intravenosa.
La dosis administrada de los compuestos de la
invención será adaptada por el médico en función de la vía de
administración al paciente y del estado de este último.
Los compuestos de la presente invención pueden
administrarse solos o mezclados con otros compuestos anticancerosos.
Entre las posibles asociaciones se pueden citar:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
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Es posible igualmente asociar a los compuestos
de la presente invención un tratamiento con radiaciones. Estos
tratamientos se pueden administrar de manera simultánea, separada o
secuencial. El médico adaptará el tratamiento en función de la
enfermedad a tratar.
Los productos de la invención son útiles como
agentes inhibidores de una reacción catalizada por una quinasa, en
particular FAK, KDR, Tie2, Aurora A, Aurora B y CDK2. FAK, KDR y
Tie2 son quinasas para las cuales los productos de la invención
serán particularmente útiles como inhibidores.
Las razones por las que se eligen estas quinasas
son las siguientes:
FAK es una tirosina quinasa citoplasmática que
tiene un papel importante en la transducción de la señal transmitida
por las integrinas, familia de receptores heterodiméricos de la
adhesión celular. FAK y las integrinas se colocalizan en
estructuras de la perimembrana denominadas placas de adherencia. Se
ha mostrado en numerosos tipos celulares que la activación de FAK
así como su fosforilación en restos tirosina y en particular su
autofosforilación en la tirosina 397, eran dependientes de la unión
de las integrinas a sus ligandos extracelulares y, por lo tanto,
inducidas durante la adhesión celular [Kornberg L, et al. J.
Biol. Chem. 267(33): 23439-442, (1992)]. La
autofosforilación en la tirosina 397 de FAK representa un lugar de
unión para otra tirosina quinasa, Src, mediante su dominio SH2
[Schaller et al. Mol. Cell. Biol.
14:1680-1688. 1994; Xing et al. Mol. Cell.
Biol. 5:413-421. 1994]. Src puede entonces
fosforilar FAK en la tirosina 925, incorporando así la proteína
adaptadora Grb2 e induciendo en determinadas células la activación
de la vía ras y MAP Quinasa implicada en el control de la
proliferación celular [Schlaepfer et al. Nature; 372:
786-791. 1994; Schlaepfer et al. Prog.
Biophy. Mol. Biol. 71:435-478. 1999; Schlaepfer y
Hunter, J. Biol. Chem. 272:13189-13195. 1997]. La
activación de FAK también puede inducir la vía de señalización jun
quinasa NH2-terminal (JNK) y resultar en la
progresión de las células hacia la fase G1 del ciclo celular [Oktay
et al., J. Cell. Biol.145:1461-1469. 1999].
La fosfatidilinositol-3-OH quinasa
(P13-quinasa) también se une a FAK en la tirosina
397 y esta interacción podría ser necesaria para la activación de
la P13-quinasa [Chen y Guan, Proc. Nat. Acad. Sci.
USA. 91: 10148-10152, 1994; Ling et al. J.
Cell. Biochem. 73:533-544. 1999]. El complejo
FAK/Src fosforila diferentes sustratos como la paxilina y p130CAS
en los fibroblastos [Vuori et al. Mol. Cell. Biol. 16:
2606-2613, 1996].
Los resultados de numerosos estudios sostienen
la hipótesis de que los inhibidores de FAK podrían ser útiles en el
tratamiento del cáncer. Los estudios han sugerido que FAK puede
jugar un papel importante en la proliferación y/o la supervivencia
celular in vitro. Por ejemplo, en las células CHO, algunos
autores han demostrado que la sobreexpresión de p125FAK conduce a
una aceleración de la transición G1 a S, sugiriendo que p125FAK
favorece la proliferación celular [Zhao J.-H et al. J. Cell
Biol.143:1997-2008. 1998]. Otros autores han
mostrado que las células tumorales tratadas con oligonucleótidos
anti-sentido de FAK pierden su adhesión y entran en
apoptosis (Xu et al, Cell Growth Differ.
4:413-4.18. 1996). También se ha demostrado que FAK
promueve la migración de las células in vitro. Así, los
fibroblastos deficientes en la expresión de FAK (ratón con
inactivación génica para FAK) presentan una morfología redondeada y
deficiencias en la migración celular en respuesta a señales
quimiotácticas y estos defectos se suprimen mediante una reexpresión
de FAK [D. J. Sieg et al., J. Cell Science. 112:
2677-91. 1999]. La sobreexpresión del dominio
C-terminal de FAK (FRNK) bloquea el estiramiento de
las células adherentes y reduce la migración celular in vitro
[Richardson A. y Parsons J. T. Nature. 380:
538-540. 1996]. La sobreexpresión de FAK en las
células CHO, COS o en células de astrocitoma humano favorece la
migración de las células. La implicación de FAK en la promoción de
la proliferación y de la migración de las células en numerosos
tipos celulares in vitro, sugiere el papel potencial de FAK
en los procesos neoplásicos. Un estudio reciente ha demostrado
efectivamente el aumento de la proliferación de las células
tumorales in vivo después de la inducción de la expresión de
FAK en células de astrocitoma humano [Cary L. A. et al. J.
Cell Sci. 109:1787-94. 1996; Wang D et al. J.
Cell Sci. 113:4221-4230. 2000]. Además, estudios
inmunohistoquímicos de biopsias humanas han demostrado que FAK
estaba sobreexpresada en los cánceres de próstata, mama, tiroides,
colon, melanoma, cerebro y pulmón, estando el nivel de expresión de
FAK directamente correlacionado con los tumores que presentan el
fenotipo más agresivo [Weiner T. M. et al. Lancet.
342(8878):1024-1025. 1993; Owens et
al. Cancer Research. 55: 2752-2755. 1995; Maung
K. et al. Oncogene. 18: 6824-6828. 1999; Wang
D et al. J. Cell Sci. 113:4221-4230.
2000].
KDR (Kinase insert Domain Receptor), también
llamado VEGF-R2 (Vascular Endothelial Growth Factor
Receptor 2), se expresa únicamente en las células endoteliales.
Este receptor se fija al factor de crecimiento angiogénico VEGF, y
ejerce así de mediador de una señal transduccional a través de la
activación de su dominio quinasa intracelular. La inhibición
directa de la actividad quinasa de VEGF-R2 permite
reducir el fenómeno de angiogénesis en presencia de VEGF exógeno
(Vascular Endothelial Growth Factor: factor de crecimiento vascular
endotelial) (Strawn et al., Cancer Research, 1996, vol. 56,
p.3540-3545). Este proceso se ha demostrado
principalmente mediante mutantes VEGF-R2 (Millauer
et al., Cancer Research, 1996, vol. 56,
p.1615-1620). El receptor VEGF-R2
no parece tener ninguna otra función en adultos aparte de la
vinculada a la actividad angiogénica de VEGF. Consecuentemente, un
inhibidor selectivo de la actividad quinasa de
VEGF-R2 debería demostrar poca toxicidad.
Además de este papel fundamental en el proceso
dinámico angiogénico, los resultados recientes sugieren que la
expresión de VEGF contribuye a la supervivencia de las células
tumorales después de la quimioterapia y de la radioterapia,
subrayando la sinergia potencial de los inhibidores de KDR con otros
agentes (Lee et al. Cancer Research, 2000, vol. 60,
p.5565-5570).
Tie-2 (TEK) es un miembro de una
familia de receptores con tirosina quinasa, específico de las
células endoteliales. Tie2 es el primer receptor con actividad
tirosina quinasa del que se conoce a la vez el agonista
(angiopoyetina 1 o Ang1) que estimula la autofosforilación del
receptor y la señalización celular [S. Davis et al (1996)
Cell 87, 1161-1169] y el antagonista (angiopoyetina
2 o Ang2) [P.C. Maisonpierre et al. (1997) Science 277,
55-60]. La angiopoyetina 1 puede tener un efecto
sinérgico con el VEGF en las últimas etapas de la
neo-angiogénesis [AsaharaT. Circ. Res.(1998)
233-240]. Los experimentos de inactivación génica y
las manipulaciones transgénicas de la expresión de Tie2 o de Ang1
dan lugar a animales que presentan defectos en la vascularización
[D.J. Dumont et al (1994) Genes Dev. 8,
1897-1909 y C. Suri (1996) Cell 87,
1171-1180]. La unión de Ang1 a su receptor
da lugar a la autofosforilación del dominio quinasa de Tie2 que es
esencial para la neovascularización así como para el reclutamiento
y la interacción de los vasos con los pericitos y las células
musculares lisas; estos fenómenos contribuyen a la maduración y a la
estabilidad de los vasos recién formados [P.C. Maisonpierre et
al (1997) Science 277, 55-60]. Lin et
al (1997) J. Clin. Invest. 100, 8: 2072-2078
y Lin P. (1998) PNAS 95, 8829-8834, han
mostrado una inhibición del crecimiento y de la vascularización
tumoral, así como una disminución de las metástasis de pulmón,
durante las infecciones adenovirales o inyecciones del dominio
extracelular de Tie-2 (Tek) en modelos de
xenoinjertos de tumor de mama y me-
lanoma.
lanoma.
Los inhibidores de Tie2 pueden utilizarse en las
situaciones en las que se produce una neovascularización de manera
inapropiada (es decir, en la retinopatía diabética, inflamación
crónica, psoriasis, sarcoma de Kaposi, neovascularización crónica
debida a degeneración macular, artritis reumatoide, hemoangioma
infantil y cánceres).
La progresión del ciclo celular está dirigida
frecuentemente por las quinasas dependientes de ciclina (CDK)
que se activan por una interacción con proteínas que pertenecen a
la familia de las ciclinas, activación que termina por la
fosforilación de sustratos y finalmente por la división celular.
Además, los inhibidores endógenos de las CDK que se activan
(familia de INK4 y de KIP/CIP) regulan de manera negativa la
actividad de las CDK. El crecimiento de las células normales se
debe a un equilibrio entre los activadores de las CDK (las ciclinas)
y los inhibidores endógenos de las CDK. En numerosos tipos de
cánceres, se ha descrito la expresión o la actividad aberrante de
varios de estos reguladores del ciclo celular.
La ciclina E activa la quinasa Cdk2 que actúa
entonces para fosforilar la proteína pRb (proteína del
retinoblastoma) que resulta en una acción en la división celular
irreversible y una transición hacia la fase S (PL Toogood,
Medicinal Research Reviews (2001), 21(6);
487-498. La quinasa CDK2 y puede que CDK3 son
necesarias para la progresión en la fase G1 y la entrada en la fase
S. Durante la formación del complejo con la ciclina E, mantienen la
hiperfosforilación de pRb para facilitar la progresión de la fase G1
a la fase S. En los complejos con la Ciclina A, CDK2 juega un papel
en la inactivación de E2F y es necesaria para la realización de la
fase S (TD. Davies et al. (2001) Structure 9,
389-3).
389-3).
El complejo CDK1/ciclina B regula la progresión
del ciclo celular entre la fase G2 y la fase M. La regulación
negativa del complejo CDK/Ciclina B impide a las células normales
entrar en la fase S hasta que la fase G2 se haya completado
correctamente y completamente. (K.K. Roy y E.A. Sausville Current
Pharmaceutical Design, 2001, 7, 1669-1687.
Existe un nivel de regulación de la actividad de
las CDK. Los activadores de quinasas dependientes de ciclina (CAK)
tienen una acción positiva de regulación de las CDK. CAK fosforila
las CDK en el resto treonina para rendir la enzima diana totalmente
activa.
La presencia de defectos en las moléculas que
intervienen en el ciclo celular supone la activación de las CDK y
la progresión del ciclo, siendo normal querer inhibir la actividad
de las enzimas CDK para bloquear el crecimiento celular de las
células cancerosas.
Numerosas proteínas implicadas en la segregación
de los cromosomas y en el ensamblaje del huso se han identificado
en la levadura y en drosophila. La desorganización de estas
proteínas conduce a la no segregación de los cromosomas y a husos
monopolares o desorganizados. Entre estas proteínas, determinadas
quinasas, como Aurora y Ipl1, que provienen respectivamente
de drosophila y de S. cerevisiae, son necesarias para la
segregación de los cromosomas y la separación del centrosoma. Un
análogo humano de Ipl1 de levadura se ha clonado y caracterizado
recientemente por diferentes laboratorios. Esta quinasa, denominada
aurora2, STK15 o BTAK pertenece a la familia de las quinasas de
serina/treonina. Bischoff et al. han mostrado que Aurora2 es
un oncogén, y que está amplificado en los cánceres colorrectales
humanos (EMBO J, 1998, 17, 3052-3065). Ésta también
se ha ejemplificado en los cánceres que implican tumores
epiteliales tales como cáncer de mama.
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El término "halógeno" hace referencia a un
elemento elegido entre F, Cl, Br e I.
El termino "alquilo" hace referencia a un
sustituyente hidrocarbonado saturado, lineal o ramificado, que
tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Los sustituyentes metilo, etilo,
propilo, 1-metiletilo, butilo,
1-metilpropilo, 2-metilpropilo,
1,1-Dimetiletilo, pentilo,
1-metilbutilo, 2-metilbutilo,
3-metilbutilo, 1,1-Dimetilpropilo,
1,2-Dimetilpropilo,
2,2-Dimetilpropilo, 1-etilpropilo,
hexilo, 1-metilpentilo,
2-metilpentilo, 1-etilbutilo,
2-etilbutilo, 3,3-Dimetilbutilo,
heptilo, 1-etilpentilo, octilo, nonilo, decilo,
undecilo, y dodecilo son ejemplos de sustituyente alquilo.
El término "alquileno" hace referencia a un
sustituyente hidrocarbonado lineal o ramificado que tiene una o
varias insaturaciones, que tiene de 2 a 12 átomos de carbono. Los
sustituyentes etilenilo, 1-metiletilenilo,
prop-1-enilo,
prop-2-enilo,
Z-1-metilprop-1-enilo,
E-1-metilprop-1-enilo,
Z-1,2-Dimetil-prop-1-enilo,
E-1,2-Dimetilprop-1-enilo,
but-1,3-dienilo,
1-metilidenil-prop-2-enilo,
Z-2-metilbut-1,3-dienilo,
E-2-metilbut-1,3-dienilo,
2-metil-1-metilidenilprop-2-enilo,
undec-1-enilo y
undec-10-enilo son ejemplos de
sustituyente alquileno.
El término "alquinilo" hace referencia a un
sustituyente hidrocarbonado lineal o ramificado que tiene al menos
dos insaturaciones que están presentes en un par de átomos de
carbono vecinos, que tiene de 2 a 12 átomos de carbono. Los
sustituyentes etinilo; prop-1-inilo;
prop-2-inilo; y
but-1-inilo son ejemplos de
sustituyente alquinilo.
El término "arilo" hace referencia a un
sustituyente aromático mono- o policíclico que tiene de 6 a 14
átomos de carbono. Los sustituyentes fenilo,
naft-1-ilo;
naft-2-ilo;
antracen-9-ilo;
1,2,3,4-tetrahidronaft-5-ilo;
y
1,2,3,4-tetrahidronaft-6-ilo
son ejemplos de sustituyente arilo.
El término "heteroarilo" hace referencia a
un sustituyente heteroaromático mono- o policíclico que tiene de 1
a 13 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos. Los sustituyentes
pirrol-1-ilo;
pirrol-2-ilo;
pirrol-3-ilo; furilo;tienilo;
imidazolilo; oxazolilo; tiazolilo; isoxazolilo; isotiazolilo;
1,2,4-triazolilo; oxadiazolilo; tiadiazolilo;
tetrazolilo; piridilo; pirimidilo; pirazinilo;
1,3,5-triazinilo; indolilo;
benzo[b]furilo; benzo[b]tienilo;
indazolilo; bencimidazolilo; azaindolilo; quinoleilo; isoquinoleilo;
carbazolilo; y acridilo son ejemplos de sustituyente
heteroarilo.
El término "heteroátomo" hace referencia
aquí a un átomo al menos divalente, diferente del carbono. N; O; S;
y Se son ejemplos de heteroátomo.
El término "cicloalquilo" hace referencia a
un sustituyente hidrocarbonado cíclico saturado o parcialmente
insaturado que tiene de 3 a 12 átomos de carbono. Los sustituyentes
ciclopropilo; ciclobutilo; ciclopentilo; ciclopentenilo;
ciclopentadienilo; ciclohexilo; ciclohexenilo; cicloheptilo;
biciclo[2.2.1]heptilo; ciclooctilo;
biciclo[2.2.2]octilo; adamantilo; y perhidronaftilo
son ejemplos de sustituyente cicloalquilo.
El término "heterociclilo" hace referencia
a un sustituyente hidrocarbonado cíclico saturado o parcialmente
insaturado que tiene de 1 a 13 átomos de carbono y de 1 a 4
heteroátomos. Preferentemente, el sustituyente hidrocarbonado
cíclico saturado o parcialmente insaturado será monocíclico y
comprenderá 4 ó 5 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos.
El término "sustituido" hace referencia a
uno o varios sustituyentes diferentes de H, por ejemplo, halógeno;
alquilo; arilo; heteroarilo, cicloalquilo; heterociclilo; alquileno;
alquinilo; OH; O-alquilo;
O-alquileno; O-arilo;
O-heteroarilo; NH_{2}; NH-alquilo;
NH-arilo; NH-heteroarilo;
N-alquilo-alquilo'; SH;
S-alquilo; S-arilo;
S(O_{2})H;
S(O_{2})-alquilo;
S(O_{2})-arilo; SO_{3}H;
SO_{3}-alquilo; SO_{3}-arilo;
CHO; C(O)-alquilo;
C(O)-arilo; C(O)OH;
C(O)O-alquilo;
C(O)O-arilo;
OC(O)-alquilo;
OC(O)-arilo; C(O)NH_{2};
C(O)NH-alquilo;
C(O)NH-arilo; NHCHO;
NHC(O)-alquilo;
NHC(O)-arilo;
NH-cicloalquilo;
NH-heterociclilo.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Los productos según la invención pueden
prepararse a partir de métodos convencionales de química orgánica.
El esquema 1 siguiente ilustra el método utilizado para la
preparación del ejemplo 1 relativo a los
6-aza-indoles sustituidos. A este
respecto, no pretende constituir una limitación del alcance de la
invención, en lo que concierne a los métodos de preparación de los
compuestos reivindicados. Preparación de los derivados
6-aza-indol-2-carboxamida
sustituidos en posición 3:
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Esquema
1
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El esquema 2 siguiente ilustra el método
utilizado para la preparación de los ejemplos que se refieren a los
7-aza-indoles sustituidos, en
particular el ejemplo 7. A este respecto, no pretende constituir una
limitación del alcance de la invención, en lo que concierne a los
métodos de preparación de los compuestos reivindicados. Preparación
de los derivados
7-aza-indol-2-carboxamida
sustituidos en posición 3:
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Esquema
2
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Los productos de fórmula general (I) en la que
Ra es diferente de H pueden obtenerse según los métodos
convencionales conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo
reemplazando el amoniaco en la aminolisis por la alquilamina
primaria correspondiente.
La presente invención tiene también por objeto
un procedimiento de preparación de los productos de fórmula (I)
tales como se han definido anteriormente, caracterizado porque un
producto de fórmula general (V) siguiente:
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sufre las etapas
siguientes:
a) halogenación en posición 3, después
\newpage
b) acoplamiento de Suzuki en posición 3, para
obtener un producto de fórmula general (III) siguiente:
después
c) amidación del éster en posición 2 para
obtener el producto de fórmula general (II) siguiente:
después
d) acilación del grupo
amino-fenilo en posición 3.
La presente invención tiene también por objeto,
como productos intermedios, los compuestos de fórmula general (II)
siguiente:
en la que Z, Y, W son tales como se
han definido anteriormente, para la preparación de los productos de
fórmula general
(I).
Los análisis LC/MS se han realizado utilizando
un instrumento Micromass modelo LCT conectado a un instrumento HP
1100. La abundancia de los productos se midió mediante un detector
de red de diodos HP G1315A en un intervalo de longitud de onda de
200-600 nm y un detector para la dispersión de la
luz Sedex 65. La obtención de los espectros de masas se realizó en
un intervalo de 180 a 800. Los datos se analizaron utilizando el
programa Micromass MassLynx. La separación se efectuó en una
columna Hypersil BDS C18, 3 \mum (50 x 4,6 mm), eluyendo con un
gradiente lineal de 5 a 90% de acetonitrilo que contiene 0,05% (v/v)
de ácido trifluoroacético (TFA) en agua que contiene 0,05% (v/v) de
TFA, en 3,5 min con un caudal de 1 mL/min. El tiempo total de
análisis, incluyendo el periodo de reequilibrio de la columna, es
de 7 min.
Los espectros de MS se han realizado en
electropulverización (ES^{+}) empleando un instrumento Platform
II (Micromass). Se describen los principales iones observados.
Los puntos de fusión se midieron por
capilaridad, en un instrumento Mettler FP62, intervalo 30ºC a 300ºC,
elevando 2ºC por minuto.
Los productos pueden purificarse por LC/MS
utilizando un sistema Waters FractionsLynx compuesto por una bomba
de gradiente Waters modelo 600, una bomba de regeneración Waters
modelo 515, una bomba de dilución Waters Reagent Manager, un
inyector automático Waters modelo 2700, dos válvulas Rheodyne modelo
LabPro, un detector de red de diodos Waters modelo 996, un
espectrómetro de masas Waters modelo ZMD y un colector de fracciones
Gilson modelo 204. El sistema estaba controlado por el programa
Waters FractionLynx. La separación se efectuó alternativamente
sobre dos columnas Waters Symmetry (C_{18}, 5 \muM, 19 x 50 mm,
referencia del catálogo 186000210), estando una columna en curso de
regeneración mediante una mezcla de agua/acetonitrilo 95/5 (v/v)
que contiene 0,07% (v/v) de ácido trifluoroacético, mientras que la
otra columna estaba en curso de separación. La elución de las
columnas se efectuó utilizando un gradiente lineal de 5 a 95% de
acetonitrilo que contiene 0,07% (v/v) de ácido trifluoroacético en
agua, con un caudal de 10 mL/min. A la salida de la columna de
separación, se separa una milésima del efluente por un LC Packing
Accurate, se diluye con alcohol metílico a un caudal de 0,5 mL/min
y se envía hacia los detectores, a razón de 75% hacia el detector de
red de diodos, y el 25% restante hacia el espectrómetro de masas.
El resto del efluente (999/1.000) se envía hacia el colector de
fracciones donde se elimina el flujo mientras que la masa del
producto esperado no se detecte por el programa FractionLynx. Se
proporcionan las fórmulas moleculares de los productos esperados al
programa FractionLynx que pone en marcha la recogida del producto
cuando la señal de masa detectada corresponde al ion
[M+H]^{+} y/o al [M+Na]^{+}. En ciertos casos,
dependiendo de los resultados de LC/MS analítica, cuando se ha
detectado un ion intenso correspondiente a [M+2H]^{++}, se
proporciona también al programa FractionLynx el valor
correspondiente a la mitad de la masa molecular calculada (PM/2).
En estas condiciones, también se pone en marcha la recogida cuando
se detecta la señal de masa del ion [M+2H]^{++} y/o
[M+Na+H]^{++}. Los productos se recogieron en tubos de
vidrio tarados. Tras ser recogidos, se evaporaron los disolventes en
un evaporador centrífugo Savant AES 2000 o Genevac HT8 y se
determinaron las masas de los productos pesando los tubos tras la
evaporación de los disolventes.
Otro objeto de la invención se refiere a los
productos de los ejemplos siguientes que ilustran de forma no
limitativa la presente invención.
A una disolución de 90 mg de
3-(4-aminofenil)-1
H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en 5 mL de tetrahidrofurano se añaden, gota a gota, 50 \muL de
2-fluoro-5-(trifluorometil)fenilisocianato.
La mezcla de reacción se agita durante 16 horas a temperatura
ambiente bajo atmósfera de argón y se concentra bajo presión
reducida. El resto obtenido se agita durante 30 minutos en 2 mL de
diclorometano. El sólido en suspensión se filtra con succión.
Después de secar en vacío, a 40ºC, se obtienen 115 mg de
3-{4-[3-(2-Fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
cuyas características son las siguientes:
IR (KBr): 3.455; 1.661; 1.602; 1.542; 1.444;
1.341; 1.312; 1.127; 1.070 y 819 cm^{-1} R.M.N. ^{1}H: 6,98 (s
ancho, 1H); 7,39 (m ancho, 1H); de 7,42 a 7,56 (m, 4H); 7,60 (d
ancho, J = 8,0 Hz, 2H); 7,74 (s ancho, 1H); 8,17 (d, J = 6,0 Hz,
1H); 8,65 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1 H); 8,82 (s, 1H); 8,94 (s ancho,
1H); 9,31 (s, 1H); 12,15 (s ancho, 1H).
Espectro de Masas (ES^{+}): m/z = 458
[M+H]^{+}
Punto de fusión: 286ºC (Köfler).
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida:
A una disolución de 600 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo en 62 mL de disolución 3N de amoniaco en metanol se añaden
11 mL de disolución acuosa de amoniaco al 22%. La mezcla de
reacción se agita durante 20 horas en un autoclave a 80ºC (12 bares)
y se concentra bajo presión reducida. El resto obtenido se diluye
en 100 mL de metanol, se trata con negro de humo y se calienta a
reflujo durante 30 minutos. La mezcla se filtra en caliente sobre
celite y se lava con 2 x 10 mL de metanol. El filtrado se concentra
bajo presión reducida para proporcionar 490 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en forma de merengue y cuyas características son las
siguientes:
Espectro de Masas (EI) m/z = 252
[M]^{+o}, m/z = 235
[M-NH_{3}]^{+o}
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo:
A una disolución de 1 g de
3-bromo-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo en 100 mL de dioxano, se añaden 773 mg de hidrocloruro del
ácido 4-aminofenil-borónico, 1,1 g
de fluoruro de potasio en 9 mL de agua. La mezcla de reacción se
agita bajo atmósfera de argón durante 15 minutos. Se añaden 425 mg
de tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) y 630 \muL de
trietilamina. La mezcla de reacción se agita durante 17 horas a
reflujo. Después de tratamiento con negro de humo y de filtración
sobre celite®, el filtrado se concentra bajo presión reducida. El
resto se purifica por cromatografía flash en una columna de sílice
(60; 35-70 \muM), eluyendo con una mezcla de
diclorometano, metanol y acetonitrilo (90/5/5 en volumen). Se
obtienen 600 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo, cuyas características son las siguientes:
Espectro de Masas (EI) m/z =281
[M]^{+o}, m/z = 235
[M-OEt]^{+o}
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3-Bromo-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo:
A una disolución de 2,24 g de
1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo en 150 mL de piridina, se añade, gota a gota, una
disolución de 3,53 g de tribromuro de piridinio en 30 mL de
piridina, a 5ºC. La mezcla de reacción se agita durante 16 horas a
una temperatura cercana a 20ºC y se lava con 500 mL de agua helada.
La suspensión se filtra. El sólido resultante se lava con agua y se
seca en estufa en vacío a 40ºC. Se obtienen 1,97 g de
3-bromo-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo, cuyas características son las siguientes:
Espectro de Masas (EI) m/z = 269
[M]^{+o}, m/z = 189 [M-Br]^{+o},
m/z = 144 [M-OEt]^{+o}
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1H-Pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo:
Se cargan en un autoclave 1,8 g de paladio sobre
carbón al 10%, y se inactivan con una corriente de argón. Se añade
una disolución de 6 g de
3-(3-nitropiridin-4-il)-2-oxo-propionato
de etilo en 72 mL de etanol absoluto. El medio de reacción se agita
3 horas a 20ºC bajo una presión de 2 bares de hidrógeno. La mezcla
se filtra sobre celite®. El filtrado se concentra bajo presión
reducida y se seca en estufa a 40ºC para proporcionar 4 g de
1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxilato
de etilo cuyas características son las siguientes:
Espectro de Masas (EI) m/z = 190 [M^{+o}], m/z
= 144 [M-OEt]^{+o}
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3-(3-Nitropiridin-4-il)-2-oxo-propionato
de etilo:
A una disolución de 930 mg de sodio en 50 mL de
etanol absoluto, se añaden rápidamente 26 mL de oxalato de dietilo.
El medio de reacción se agita 15 minutos a 20ºC. Se añade una
disolución de 3,8 g de
4-metil-3-nitropiridina
en 50 mL de etanol absoluto, gota a gota, en 1 hora. La mezcla de
reacción se agita durante 4 horas a una temperatura cercana a 20ºC,
y se concentra bajo presión reducida. El resto se recoge con 100 mL
de éter etílico y se filtra. El sólido se agita con 40 mL de ácido
clorhídrico 5N, se filtra, se lava con agua y se seca en vacío a
40ºC para proporcionar 6,2 g de
3-(3-nitropiridin-4-il)-2-oxo-propionato
de etilo con las características siguientes:
Espectro de Masas (EI) m/z = 238 [M^{+o}].
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A una disolución de 100 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en 5 mL de tetrahidrofurano se añaden, gota a gota, 54,4 \muL de
2-metoxi-5-metilfenilisocianato.
La mezcla de reacción se agita durante 16 horas a temperatura
ambiente bajo atmósfera de argón y se concentra bajo presión
reducida. El resto obtenido se agita durante 30 minutos en 2 mL de
diclorometano. El sólido en suspensión se filtra, se lava con agua
y se filtra con succión. Después de secar en vacío a 40ºC, se
obtienen 40 mg de
3-{4-[3-(2-metoxi-5-Metil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
cuyas características son las siguientes:
IR (KBr), 3.458; 3.331; 1.664; 1.595; 1.537;
1.315; 1.285; 1.213; 1.135; 1.033 cm^{-1}
R.M.N. ^{1}H: 2,24 (s, 3H); 3,86 (s, 3H); 6,75
(d ancho, J = 8,5 Hz, 1H); de 6,85 a 6,95 (m, 2H); 7,43 (d ancho, J
= 8,5 Hz, 2H); 7,46 (d, J=5,5 Hz, 1 H); 7,58 (d ancho, J = 8,5 Hz,
2H); 7,73 (s ancho, 1H); 8,02 (s ancho, 1H); 8,16 (d, J = 5,5 Hz,
1H); 8,22 (s, 1H); 8,82 (s, 1H); 9,44 (s ancho, 1H); 12,1 (s ancho,
1 H).
Espectro de Masas (IE): m/z = 415 [M^{+o}]
Punto de fusión: 227ºC.
A una disolución de 100 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en 5 mL de tetrahidrofurano se añaden, gota a gota, 45,2 \muL de
3-clorofenilisocianato. La mezcla de reacción se
agita durante 16 horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de
argón y se concentra bajo presión reducida. El resto obtenido se
agita durante 30 minutos en 2 mL de diclorometano. El sólido en
suspensión se filtra, se lava con agua y se filtra con succión. La
purificación final se realiza mediante LC/MS preparativa para
proporcionar después de secar en vacío a 40ºC 70 mg de
3-{4-[3-(3-cloro-fenil)-ureido]-fenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en forma de sal trifluoroacetato y cuyas características son las
siguientes:
IR (KBr): 3.390; 1.672; 1.592; 1.537; 1.483;
1.203; 1.138; 836; 722 cm^{-1}
R.M.N. ^{1}H: 7,03 (m, 1H); de 7,26 a 7,34 (m,
2H); de 7,42 a 7,52 (m, 3H); 7,63 (d ancho, J = 8,5 Hz, 2H); 7,74
(s ancho, 1H); 7,97 (d, J = 6,0 Hz, 1H); 8,06 (s ancho, 1H); 8,31
(d, J = 6,0 Hz, 1H); 9,03 (s ancho, 2H); 9,13 (s, 1H); 13,35 (m
extendido, 1H).
Espectro de Masas (ES^{+}): m/z = 406
[MH^{+}]
Punto de fusión: 221ºC.
A una disolución de 100 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en 5 mL de tetrahidrofurano se añaden, gota a gota, 46,2 \muL de
3-cloro-4-fluorofenilisocianato.
La mezcla de reacción se agita durante 16 horas a temperatura
ambiente bajo atmósfera de argón y se concentra bajo presión
reducida. El resto obtenido se agita durante 30 minutos en 2 mL de
diclorometano. El sólido en suspensión se filtra, se lava con agua
y se filtra con succión. La purificación final se realiza mediante
LC/MS preparativa para proporcionar después de secar en vacío, a
40ºC 105 mg de
3-{4-[3-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en forma de sal trifluoroacetato y cuyas características son las
siguientes:
IR (KBr): 3.452; 1.673; 1.601; 1.544; 1.500;
1.208; 1.143; 836; 803; 722 cm^{-1}
R.M.N. ^{1}H: De 7,32 a 7,38 (m, 2H); de 7,44
a 7,54 (m, 3H); 7,64 (d ancho, J = 8,5 Hz, 2H); 7,84 (d ancho, J =
7,5 Hz, 1H); 8,01 (d, J = 6,0 Hz, 1H); 8,09 (s ancho, 1H); 8,32 (d,
J = 6,0 Hz, 1H); 9,10 (s ancho, 2H); 9,16 (s, 1H); 13,4 (m
extendido, 1H).
Espectro de Masas (ES^{+}): m/z = 424
[MH^{+}]
Punto de fusión: 214ºC.
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A una disolución de 100 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en 5 mL de tetrahidrofurano se añaden, gota a gota, 48,3 \muL de
2-fluoro-5-metilfenilisocianato.
La mezcla de reacción se agita durante 16 horas a temperatura
ambiente bajo atmósfera de argón y se concentra bajo presión
reducida. El resto obtenido se agita durante 30 minutos en 2 mL de
diclorometano. El sólido en suspensión se filtra, se lava con agua
y se filtra con succión. La purificación final se realiza mediante
LC/MS preparativa para proporcionar después de secar en vacío, a
40ºC, 36 mg de
3-{4-[3-(2-fluoro-5-Metil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en forma de sal trifluoroacetato cuyas características son las
siguientes:
IR (KBr): 3.452; 1.675; 1.603; 1.544;1.314;
1.202; 1.144; 836; 805; 722 cm^{-1}
R.M.N. ^{1}H: 2,29 (s, 3H); 6,82 (m, 1H); 7,12
(dd, J = 8,5 y 11,5 Hz, 1H); de 7,46 a 7,51 (m, 3H); 7,62 (d ancho,
J = 8,5 Hz, 2H); de 7,97 a 8,03 (m, 2H); 8,08 (s ancho, 1 H); 8,32
(d, J=6,5 Hz, 1 H); 8,54 (d ancho, J = 2,5 Hz, 1H); 9,15 (s, 1H);
9,25 (s, 1H); 13,4 (m extendido, 1 H)
Espectro de Masas (ES^{+}): m/z = 404
[MH^{+}]
Punto de fusión: 222ºC.
A una disolución de 100 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en 5 mL de tetrahidrofurano se añaden, gota a gota, 47,8 \muL de
m-tolilisocianato. La mezcla de reacción se agita
durante 16 horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón y
se concentra bajo presión reducida. El resto obtenido se agita
durante 30 minutos en 2 mL de diclorometano. El sólido en suspensión
se filtra, se lava con agua y se filtra con succión. La
purificación final se realiza mediante LC/MS preparativa para
proporcionar después de secar en vacío, a 40ºC, 40 mg de
3-[4-(3-m-tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
en forma de sal trifluoroacetato cuyas características son las
siguientes:
IR (KBr): 3.408; 1.699; 1.595; 1.526; 1.203;
1.138; 834; 797; 724 cm^{-1}
R.M.N. ^{1}H: 2,29 (s, 3H); 6,81 (d ancho, J =
7,5 Hz, 1H); 7,17 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,25 (d ancho, J = 7,5 Hz,
1H); 7,32 (s ancho, 1 H); 7,44 (s ancho, 1H); 7,47 (d ancho, J = 8,5
Hz, 2H); 7,62 (d ancho, J = 8,5 Hz, 2H); 7,96 (m ancho, 1H); 8,06
(s ancho, 1H); 8,30 (d, J = 6,0 Hz, 1H); 8,67 (s, 1H); 8,86 (s,
1H); 9,12 (s, 1H); 13,3 (m extendido, 1 H).
Espectro de Masas (ES^{+}): m/z = 386
[MH^{+}].
A una disolución de 130 mg de
3-(4-aminofenil)-1
H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
en 5 mL de tetrahidrofurano se añaden, gota a gota, 85 \muL de
2-fluoro-5-(trifluorometil)fenilisocianato.
La mezcla de reacción se agita durante 16 horas a temperatura
ambiente bajo atmósfera de argón y se concentra bajo presión
reducida. El resto obtenido se cromatografía en columna de sílice
(eluyente diclorometano-metanol 9-1
en volumen). Las fracciones que contienen lo esperado se concentran
bajo presión reducida. Se obtienen 237 mg de
3-{4-[3-(2-fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
en la forma de un sólido blanco cuyas características son las
siguientes:
IR (KBr): 1.659; 1.623; 1.542; 1.443; 1.339;
1.316; 1.119 cm^{-1}
R.M.N. ^{1}H: 7,08 (m extendido, 1H); 7,14
(dd, J = 5,0 y 8,0 Hz, 1H); 7,40 (m, 1H); 7,46 (d ancho, J = 8,5
Hz, 2H); 7,51 (m, 1H); 7,57 (d ancho, J = 8,5 Hz, 2H); de 7,55 a
7,60 (m enmascarado, 1H); 7,92 (d ancho, J = 8,0 Hz, 1H); 8,38 (d
ancho, J = 5,0 Hz, 1 H); 8,64 (d ancho, J = 7,5 Hz, 1H); 9,01 (s
ancho, 1H); 9,36 (s ancho, 1H); 12,1 (s ancho, 1H).
Espectro de Masas (ES^{+}): m/z = 458
[M+H^{+}]
Punto de fusión: 232ºC (Köfler).
\vskip1.000000\baselineskip
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida:
A una disolución de 260 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo en 30 mL de disolución 7N de amoniaco en metanol se
añaden 5 mL de disolución acuosa de amoniaco al 22%. La mezcla de
reacción se agita durante 20 horas en un autoclave a 80ºC (12,6
bares), y se concentra bajo presión reducida. El resto obtenido se
cromatografía en columna de sílice (eluyente
diclorometano-metanol 9-1 en
volumen). Las fracciones que contienen lo esperado se concentran
bajo presión reducida. Se obtienen 140 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
en forma de un sólido amarillo claro cuyas características son las
siguientes:
Punto de fusión: 139ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo:
A una disolución de 0,64 g de
3-bromo-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo en 50 mL de tolueno y 50 ml de metanol, se añaden 1,08 g
de hidrocloruro del ácido
4-aminofenil-borónico y 0,9 ml de
trietilamina. La mezcla de reacción se agita bajo atmósfera de
argón durante 15 minutos. Sucesivamente, se añaden 144 mg de
tetraquis(trifenilfosfina)-paladio (0), 0,3 g
de cloruro de litio, 0,66 g de carbonato de sodio, y 7,5 mL de agua
destilada. La mezcla de reacción se agita durante 8 horas a reflujo.
Después de filtrar sobre celite®, el filtrado se concentra bajo
presión reducida. El resto se purifica mediante cromatografía en
columna de sílice eluyendo con una mezcla de acetato de etilo y
ciclohexano (7-3 en volumen). Se obtienen 400 mg de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo en la forma de un sólido amarillo, cuyas características
son las siguientes:
Punto de fusión: 236ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
3-Bromo-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo:
A una disolución de 3,2 g de hidrocloruro de
1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo en 165 mL de piridina, se añade, gota a gota, a 0ºC bajo
atmósfera de argón, una disolución de 5,04 g de tribromuro de
piridinio en 35 mL de piridina. La mezcla de reacción se agita a
0ºC, y se vierte en una mezcla de 250 g de hielo machacado y 750 ml
de agua destilada. La suspensión se filtra, el sólido se lava 2
veces con 25 mL de agua destilada y se seca al aire. Se obtienen
0,87 g de
3-bromo-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo en la forma de un sólido beige, cuyas características son
las siguientes:
Espectro de Masas (ES^{+}): m/z = 256
[M+H^{+}].
\vskip1.000000\baselineskip
Hidrocloruro de
1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo:
A una disolución de 4 g de hidrocloruro del
ácido
1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxílico
en 100 mL de metanol se añaden, gota a gota, 6 mL de cloruro de
tionilo a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agita
durante 5 horas a temperatura ambiente, y se concentra bajo presión
reducida. El resto obtenido se tritura en 50 mL de éter etílico, y
se seca en vacío a 40ºC. Se obtienen 3,22 g de hidrocloruro de
1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxilato
de metilo en la forma de un sólido amarillo claro que se utiliza
tal cual en la etapa siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Hidrocloruro del ácido
1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxílico:
A una disolución enfriada a -70ºC de 6,03 g de
1H-pirrolo[2,3-b]piridina
en 75 ml de THF anhidro se añaden, gota a gota, 33 mL de
disolución 1,6M de n-butil-litio en
hexano. Después de 15 minutos de agitación a -70ºC se añaden a la
disolución 20g de nieve carbónica en trozos. Se deja que alcance la
temperatura ambiente y se concentra bajo presión reducida. Se
obtienen 8,4g de un sólido blanco que se disuelve en 175 mL de
tetrahidrofurano. Esta disolución se enfría a -70ºC y se añaden,
gota a gota, 35 mL de disolución 1,5M de
t-butil-litio en hexano. Después de
30 min de agitación a -70ºC, se añaden 20 g de nieve carbónica en
trozos a la disolución. Se deja que alcance la temperatura ambiente
y se vierte esta mezcla de reacción en 50 mL de agua destilada
enfriada a 0ºC. El tetrahidrofurano se evapora bajo presión
reducida. La disolución acuosa residual se diluye con 150 mL de
agua destilada, se lava dos veces con 100 mL de diclorometano, se
acidifica hasta pH1 mediante la adición de 30 mL de una disolución
acuosa 5N de ácido clorhídrico y se concentra bajo presión reducida.
Se obtienen 10,01 g de sólido pastoso que se recristaliza en 50 mL
de metanol. El sólido obtenido se trata con una mezcla de 50 mL de
isopropanol clorhídrico 7N y 50 mL de éter isopropílico. Después de
secar al aire, se obtienen 5,71 g de hidrocloruro del ácido
1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxílico
en la forma de un sólido crema.
Espectro de Masas (IE): m/z = 162
[M^{+o}].
A una disolución mantenida a 0ºC de 50 mg de
3-{4-[3-(2-fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
en 2 mL de cloroformo se añaden, gota a gota, 0,31 mL de una
disolución 0,7M de ácido metacloroperbenzoico en cloroformo. La
disolución se agita a 0ºC durante 4 horas y a temperatura ambiente
durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluye con 3 mL de
diclorometano, se filtra sobre vidrio sinterizado Nº 4, se lava el
sólido obtenido dos veces con 3 mL de diclorometano y se seca al
aire. Se obtienen 40 mg de
3-{4-[3-(2-fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-7-oxi-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
en la forma de un sólido amarillo claro cuyas características son
las siguientes:
IR (KBr): 3.352; 1.671; 1.609; 1.545; 1.442;
1.340; 1.315; 1.239; 1.119; 1.069 y 885 cm^{-1}
R.M.N. ^{1}H: 7,16 (m, 1H); de 7,35 a 7,58 (m,
7H); 7,63 (m extendido, 1H); 7,77 (m extendido, 1H); 8,31 (d ancho,
J = 6,0 Hz, 1H); 8,65 (d ancho, J = 8,5 Hz, 1H); 8,94 (s ancho, 1H);
9,29 (s, 1H); de 12,5 a 13,2 (m muy extendido, 1H).
Espectro de masas (ES^{+}): m/z = 474
[M+H^{+}]
Punto de fusión: 220ºC (Köfler).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 66,6 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(2-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de 2-Fluoro-fenilisocianato.
Punto de fusión = 268,7ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 390
Tiempo de retención (min): 3,71.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 83,6 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(2-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de 2-Metoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 227,1ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 402
Tiempo de retención (min): 3,77.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 77,6 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(4-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
4-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 296,2ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 440
Tiempo de retención (min): 4,24.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 40,56 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(2-Cloro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
2-Cloro-5-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 188,3ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 474
Tiempo de retención (min): 4,51.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 79 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(2-Fluoro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
2-Fluoro-3-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 265,4ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 458
Tiempo de retención (min): 4,24.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 76,5 mg de sólido marrón de
3-{4-[3-(4-Fluoro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
4-Fluoro-3-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 234,7ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 458
Tiempo de retención (min): 4,22.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 78,1 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(3-Fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
3-Fluoro-5-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 257,5ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 458
Tiempo de retención (min): 4,42.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 92,3 mg de polvo marrón de
3-{4-[3-(4-TrifluoroMetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
4-Trifluorometoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 258,9ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 456
Tiempo de retención (min): 4,29.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 79 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(3,4-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
3,4-Dimetoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 223,7ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 432
Tiempo de retención (min): 3,27.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 75,9 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(2,5-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
2,5-Dimetil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 308,8ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 400
Tiempo de retención (min): 3,90.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 55,5 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(3-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de 3-Metoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 306,2ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 402
Tiempo de retención (min): 3.39.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 56,5 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(3-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
3-Trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 263,6ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 440
Tiempo de retención (min): 3,95.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 45,2 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(3,4-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
3,4-Dimetil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 274,7ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 400
Tiempo de retención (min): 3,75.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 44,9 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(2-Metoxi-5-Metil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
2-Metoxi-5-metil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 327,7ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 416
Tiempo de retención (min): 3,76.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 62,5 mg de sólido beige de
3-4-[3-(m-Tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de m-tolilisocianato.
Punto de fusión: 266ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 386
Tiempo de retención (min): 3,60.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 49,7 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(4-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de 4-Fluoro-fenilisocianato.
Punto de fusión: 299,9ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 390
Tiempo de retención (min): 3,45.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 68,4 mg de sólido beige de
3-[4-(3-p-Tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de p-tolilisocianato.
Punto de fusión: 293ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 386
Tiempo de retención (min): 3,58.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 47,1 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(4-Metil-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
4-Metil-3-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 285ºC
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 454
Tiempo de retención (min): 4,10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 47,5 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(4-Difluorometoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
4-Difluorometoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 283,5ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 438
Tiempo de retención (min): 3,64.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 59,2 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(3,5-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
3,5-Dimetoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 266,5ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 432
Tiempo de retención (min): 3,45.
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Se preparan 29,8 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(4-Cloro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
4-Cloro-3-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 311,1ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 474
Tiempo de retención (min): 4,22.
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Se preparan 33,1 mg de liofilizado amarillo de
3-{4-[3-(2,5-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
2,5-Dimetoxi-fenilisocianato.
Espectro de masas:
LC-MS-DAD-ELSD:432
(+) = (M + H)(+); 430 (-) = (M - H)(-)
Tiempo de retención (min): 3,53.
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Se preparan 31,5 mg de liofilizado blanco de
3-{4-[3-(3-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de 3-Fluoro-fenilisocianato.
Espectro de masas
LC-MS-DAD-ELSD:
390(+) = (M+H)(+); 388 (-) = (M-H) (-)
Tiempo de retención (min): 3,55.
Se preparan 50 mg de sólido beige de
3-{4-[3-(2-Metoxi-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de
2-Metoxi-5-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 221ºC
(Köfler-sublimación)
Espectro de masas
LC-MS-DAD-ELSD:
470(+) = (M+H)(+) 468(-) = (M-H)(-).
Se preparan 12 mg de sólido amarillo de
trifluoroacetato de
3-{4-[3-(2-Acetilamino-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
2-Acetilamino-5-trifluorometil-fenilisocianato.
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 497
Tiempo de retención (min): 2,63.
Se preparan 25 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(2-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de 2-Metoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 216ºC (Köfler)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 402
Tiempo de retención (min): 3,06.
Se preparan 80 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(2-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
2-Trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 228ºC (Köfler)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 440
Tiempo de retención (min): 3,17.
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Se preparan 77 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(3-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
3-Trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 256ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 440
Tiempo de retención (min): 3,48.
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Se preparan 73 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(4-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de 4-Fluoro-fenilisocianato.
Punto de fusión: 271ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 390
Tiempo de retención (min): 2,93.
\vskip1.000000\baselineskip
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Se preparan 91 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(4-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
4-Trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 289ºC
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 440
Tiempo de retención (min): 3,48.
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Se preparan 76 mg de sólido amarillo de
3-[4-(3-p-Tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de p-tolilisocianato.
Punto de fusión: 277ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 386
Tiempo de retención (min): 3,13.
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Se preparan 103 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(4-Cloro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
4-Cloro-3-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 228ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 474
Tiempo de retención (min): 3,64.
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Se preparan 76 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(2-Cloro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
2-Cloro-5-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 243ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 474
Tiempo de retención (min): 3,56.
\vskip1.000000\baselineskip
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Se preparan 94 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(4-TrifluoroMetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
4-Trifluorometoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 276ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 456
Tiempo de retención (min): 3,63.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 87 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(4-Difluorometoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
4-Difluorometoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 257ºC
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 4,38
Tiempo de retención (min): 3,23.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 82 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(3,4-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
3,4-Dimetil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 230ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 400
Tiempo de retención (min): 3,32.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 87 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(3,5-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
3,5-Dimetoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 225ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 432
Tiempo de retención (min): 3,07.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 87 mg de sólido amarillo de
3-{4-[3-(2,5-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
2,5-Dimetil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 261ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 400
Tiempo de retención (min): 3,25.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 59 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(2-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de 2-Fluoro-fenilisocianato.
Punto de fusión: 242ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 390
Tiempo de retención (min): 2,41.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 63 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(3-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de 3-Fluoro-fenilisocianato.
Punto de fusión: 252ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES+): [M + H]+ = 390
Tiempo de retención (min): 2,55.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 69 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(2-Fluoro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
2-Fluoro-3-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 240ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 458
Tiempo de retención (min): 2,75.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 69 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(3-Fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
3-Fluoro-5-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 261ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 458
Tiempo de retención (min): 2,88.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 56 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(4-Fluoro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
4-Fluoro-3-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 201ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 458
Tiempo de retención (min): 2,85.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 61 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(4-Metil-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
4-Metil-3-trifluorometil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 199ºC
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 454
Tiempo de retención (min): 2,84.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 33,3 mg de liofilizado amarillo de
trifluoroacetato de
3-{4-[3-(3-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de 3-Metoxi-fenilisocianato.
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 402
Tiempo de retención (min): 2,60.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 80,5 mg de liofilizado amarillo de
trifluoroacetato de
3-{4-[3-(3,4-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
3,4-Dimetoxi-fenilisocianato.
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 432
Tiempo de retención (min): 2,27.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 90,7 mg de liofilizado amarillo de
trifluoroacetato de
3-{4-[3-(2,5-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
2,5-Dimetoxi-fenilisocianato.
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+}= 432
Tiempo de retención (min): 2,62.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 75,3 mg de sólido amarillo claro de
3-[4-(3-o-Tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de o-Tolilisocianato.
Punto de fusión: 270ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 386
Tiempo de retención (min): 2,54.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 51,1 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(4-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de 4-Metoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 275ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES+): [M + H]+ = 402
Tiempo de retención (min): 2,28.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 93 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(3-Cloro-4-Difluorometoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
3-Cloro-4-Difluorometoxi-fenilisocianato.
Punto de fusión: 267ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+}= 472
Tiempo de retención (min): 2,90.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan 61 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(3,5-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de
3,5-Dimetil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 188ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 400
Tiempo de retención (min): 2,68.
Se preparan 61 mg de sólido amarillo claro de
3-{4-[3-(3-etil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 1 a partir de
3-(4-aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida
y de 3-etil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 257ºC (Büchi
B-545)
Espectro de masas (ES^{+}): [M +
H]^{+} = 400
Tiempo de retención (min): 2,97.
Se preparan 0,8 mg de sólido blanco de
3-{4-[3-(3-etil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
como se describe en el ejemplo 7 a partir de
3-(4-Aminofenil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida
y de 3-metil-fenilisocianato.
Punto de fusión: 254ºC (Büchi)
Espectro de masas (ES^{+}):
[M+H]^{+}= 400
Tiempo de retención (min): 7,18.
La actividad inhibidora de los compuestos sobre
FAK se determina midiendo la inhibición de la autofosforilación de
la enzima utilizando un ensayo de fluorescencia de resolución
temporal (HTRF).
El ADNc completo de FAK humana, cuyo extremo
N-terminal se ha marcado con histidina, se clonó en
un vector de expresión baculovirus pFastBac HTc. La proteína se
expresó y se purificó hasta aproximadamente 70% de homogeneidad.
La actividad quinasa se determina incubando la
enzima (6,6 \mug/ml) con diferentes concentraciones de compuesto
de ensayo en un tampón Hepes 50 mM pH = 7,2, MgCl_{2} 10 mM,
Na_{3}VO_{4} 100 \muM, ATP 15 \muM durante 1 hora a 37ºC.
La reacción enzimática se detiene por adición de tampón Hepes pH =
7,0 que contiene KF 0,4 mM, EDTA 133 mM, 0,1% de BSA y el marcaje
se efectúa, durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente, por adición
en ese tampón de un anticuerpo anti-Histidina
marcado con XL665 y de un anticuerpo monoclonal fosfoespecífico de
tirosina conjugado con criptato de europio (Eu-K).
Las características de los dos fluoróforos están disponibles en G.
Mathis et al., Anticancer Research, 1997, 17, páginas
3011-3014. La transferencia de energía entre el
criptato de europio excitado hacia el aceptor XL665 es proporcional
al grado de autofosforilación de FAK. La señal de larga duración
específica de XL-665 se mide en un contador de
placas Packard Discovery. Todos los ensayos se efectúan por
duplicado y se calcula la media de los dos ensayos. La inhibición de
la actividad de autofosforilación de FAK con los compuestos de la
invención se expresa en porcentaje de inhibición respecto de un
control cuya actividad se mide en ausencia del compuesto de ensayo.
Para el cálculo del% de inhibición, se considera la relación [señal
a 665 nm/señal a 620 nm].
El efecto inhibidor de los compuestos se
determina en un ensayo de fosforilación de sustrato por la enzima
KDR in vitro mediante una técnica de centelleo (placa de 96
pocillos, NEN).
El dominio citoplasmático de la enzima KDR
humana se clonó en forma de fusión GST en el vector de expresión
baculovirus pFastBac. La proteína se expresó en las células SF21 y
se purificó hasta aproximadamente 60% de homogeneidad.
La actividad quinasa de KDR se mide en MOPS 20
mM, MgCl2 10 mM, MnCl2 10 mM, DTT 1 mM, EGTA 2,5 mM,
b-glicerofosfato 10 mM, pH = 7,2, en presencia de
MgCl_{2} 10 mM, Na_{3}VO_{4} 100 \muM y NaF 1 mM. Se añaden
10 \mul del compuesto a 70 \mul de tampón quinasa que contiene
100 ng de enzima KDR a 4ºC. La reacción se inicia añadiendo 20
\mul de disolución que contiene 2 \mug de sustrato (fragmento
SH2-SH3 de la PLC \Box expresado en forma de
proteína de fusión GST), 2 \muCi \Box ^{33}P[ATP] y ATP
2 \muM frío. Después de 1 hora de incubación a 37ºC, la reacción
se detiene añadiendo 1 volumen (100 \mul) de EDTA 200 mM. Se quita
el tampón de incubación y los pocillos se lavan tres veces con 300
\mul de PBS. La radiactividad se mide en cada pocillo utilizando
un contador de radiactividad Top Count NXT (Packard).
El ruido de fondo se determina midiendo la
radiactividad en cuatro pocillos diferentes que contienen ATP
radiactivo y el sustrato solo.
Se mide un control de actividad total en cuatro
pocillos diferentes que contienen todos los reactivos
(\gamma^{33}P-[ATP], KDR y sustrato PLC\gamma) pero en
ausencia de compuesto.
La inhibición de la actividad KDR con el
compuesto de la invención se expresa en porcentaje de inhibición de
la actividad control determinada en ausencia de compuesto.
El compuesto SU5614 (Calbiochem) (1 \muM) se
incluye en cada placa como control de inhibición.
La secuencia codificante de Tie2 humano que
corresponde a los aminoácidos del dominio intracelular
776-1124 se generó por PCR utilizando el ADNc
aislado de placenta humana como modelo. Esta secuencia fue
introducida en un vector de expresión baculovirus pFastBacGT
en forma de proteína de fusión GST.
El efecto inhibidor de las moléculas se
determina en un ensayo de fosforilación de PLC por Tie2 en presencia
de GST-Tie2 purificado hasta aproximadamente 80% de
homogeneidad. El sustrato se compone de los fragmentos
SH2-SH3 de la PLC expresada en forma de proteína de
fusión GST.
La actividad quinasa de Tie2 se mide en un
tampón MOPS 20 mM pH 7,2, que contiene MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2}
10 mM, DTT 1 mM, glicerofosfato 10 mM. En una placa de 96 pocillos
FlashPlate mantenida sobre hielo, se deposita una mezcla de
reacción compuesta por 70 \mul de tampón quinasa que contiene 100
ng de enzima GST-Tie2 por pocillo. A continuación,
se añaden 10 \muL de la molécula de ensayo diluida en DMSO a una
concentración del 10% como máximo. Para una concentración dada,
cada medida se efectúa por cuadruplicado. La reacción se inicia
añadiendo 20 \mul de disolución que contiene 2 \mug de
GST-PLC, 2 \muM de ATP frío y 1 \muCi de
^{33}P[ATP]. Después de 1 hora de incubación a 37ºC, la
reacción se detiene añadiendo 1 volumen (100 \mul) de EDTA a 200
mM. Después de eliminar el tampón de incubación, los pocillos se
lavan tres veces con 300 \muL de PBS. La radiactividad se mide en
un MicroBeta1450 Wallac.
La inhibición de la actividad Tie2 se calcula y
expresa en porcentaje de inhibición respecto de la actividad
control determinada en ausencia de compuesto.
El efecto inhibidor de los compuestos sobre las
quinasas Aurora1 y Aurora2 se determina mediante un ensayo
enzimático utilizando una detección de la radiactividad.
La actividad quinasa de Aurora 1 y Aurora 2 se
evalúa mediante la fosforilación del sustrato
Numa-histidina en presencia de ATP marcado
radiactivamente ([^{33}P]ATP) utilizando placas de 96
pocillos Flashplate en las que el quelato de níquel está fijado en
la superficie de la microplaca. La cantidad de fosfato ^{33}P
incorporado al sustrato NuMA es proporcional a la actividad de la
enzima Aurora1 o Aurora2.
Proteínas:
Las proteínas se producen en el laboratorio de
producción de proteínas del grupo
Sanofi-Aventis.
Aurora 1: complejo recombinante
Aurora-B/INCENP-C3, purificado hasta
aproximadamente el 50% cuyo extremo N-terminal de
Aurora-B se ha marcado con histidina.
Aurora 2: proteína recombinante completa que
comprende una cola de histidina en el extremo
N-terminal, se ha expresado en E. coli y se ha
purificado como máximo un 82%.
NuMA (proteína Nuclear que se asocia con el
aparato mitótico): fragmento de 424 aminoácidos, expresado en
E.coli cuyo extremo N-terminal se ha marcado con
histidina y se utilizó como sustrato para las dos enzimas
Aurora.
Protocolo:
Las microplacas utilizadas son las placas
Flash-Plate, 96 pocillos, quelato de níquel (Perkin
Elmer, modelo
SMP107).
SMP107).
Los productos a evaluar se incuban en un volumen
de reacción de 100 \muL por pocillo, en presencia de 10 nM de
Aurora 1 o Aurora 2, 500 nM de sustrato NuMA en un tampón compuesto
por 50 mM de Tris/HCl (pH 7,5), NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM
(Aurora-B) o MgCl2 10 mM (Aurora-A)
y 1 mM de DTT, a 37ºC.
En cada pocillo, se distribuyen 80 \muL del
tampón de incubación enzima/sustrato y 10 \muL del producto a
evaluar, en concentraciones variables. La reacción se inicia
mediante la adición de 1 \muM de ATP final que contiene 0,2
\muCi de [^{33}P]ATP (10 \muL). Después de 30 minutos
de incubación, la reacción se para por la simple eliminación del
tampón de reacción y cada pocillo se lava dos veces con 300 \mul
de tampón Tris/HCl. La radiactividad se mide en cada pocillo
mediante un contador de centelleo, modelo Packard, Top count.
La actividad enzimática control de Aurora se
expresa en número de cuentas por minuto obtenido a los 30 minutos
después de restar el ruido de fondo (mezcla de reacción que no
contiene enzima). La evaluación de los diversos productos ensayados
se expresa en porcentaje de inhibición de la actividad Aurora
respecto al control.
Se utilizan dos baculovirus recombinantes que
contienen las secuencias humanas que codifican respectivamente CDK2
y la CiclinaE (ésta última contiene una etiqueta
hexa-histidina en el extremo C terminal) para
co-infectar células de insecto Sf21. Dos a tres
días después del inicio de la co-infección, las
células se recogen mediante centrifugación y se conservan a -40ºC
hasta su utilización. Después de descongelar y de lisar las células
mecánicamente, se purifica el complejo presente en el sobrenadante
del lisado mediante cromatografía de afinidad sobre Níquel (IMAC),
y se conserva a -80ºC.
Se utiliza un formato en placas de 96 pocillos
recubiertos con estreptavidina para ensayar la actividad de los
compuestos sobre la actividad quinasa de CDK2/Ciclina E.
Para realizar este ensayo, se solubiliza el
sustrato peptídico biotinilado, fragmento de la proteína pRb,
(biotinil-SACPLNLPLQNNHTAADMYLSPVRSPKKKGSTTR-OH),
a la concentración 1 mM en el tampón quinasa (HEPES/NaOH 50 mM,
NaCl 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, pH 7,5) con el fin de constituir una
disolución madre que se conserva a -20ºC en forma de alicuotas de
110 \muL. El día del experimento, se descongela una alicuota de
esta disolución y se diluye en tampón quinasa que contiene 1 mM de
Ditiotreitol, que se añade inmediatamente al tampón, con el fin de
obtener una concentración 14,3 \muM. Se añaden 70 \muL de esta
disolución a cada pocillo de la Flashplate con el fin de obtener
una concentración final del sustrato de 10 \muM cuando la reacción
enzimática se realiza en un volumen final de medio de reacción de
100 \muL (véase a continuación).
\newpage
Las diluciones intermedias de inhibidores
(productos de la invención) a diferentes concentraciones se preparan
en DMSO a partir de disoluciones madre 10 mM en tubos
independientes. De esta manera, se realizan diluciones 1.000
\muM, 333,3 \muM, 111,1 \muM, 37,03 \muM, 12,35 \muM, 4,11
\muM y 1,37 \muM. Se transfiere un \muL de cada una de estas
disoluciones (ó 1 \muL de DMSO para los controles) a los pocillos
de la placa de ensayo.
A cada pocillo, se añaden 19 \mul de una
disolución de una mezcla de trifosfato de adenosina (ATP) y
ATPy^{33}P en el tampón quinasa a la concentración 5,26 \muM de
ATP total y de 52,6 \muCi/ml de ^{33}P. La reacción enzimática
se inicia mediante la adición de 10 \muL por pocillo de una
disolución de CDK2/Ciclina E 200 nM en el tampón quinasa que
contiene 1 mM de ditiotreitol (ó 10 \muL de tampón quinasa que
contiene 1 mM de ditiotreitol para los blancos de la
reacción).
Después de la adición de cada uno de los
reactivos, el volumen final de cada pocillo es 100 \muL, la
concentración final del sustrato es 10 \muM, las concentraciones
finales de los inhibidores son 10 \muM, 3,33 \muM, 1,11 \muM,
0,37 \muM, 0,123 \muM, 0,041 \muM y 0,014 \muM (según la
concentración de la dilución intermedia), la concentración final de
ATP es 1 \muM, la cantidad final de ^{33}P es 1 \muCi/pocillo,
y la concentración final del complejo CDK2/Ciclina E es 20 nM.
Después de la adición de todos los reactivos, la
placa de ensayo se incuba a 30ºC con agitación orbital a 650
rpm.
Cuando se termina la incubación, la placa se
lava tres veces con 300 \muL por pocillo de PBS (Phosphate
Buffered Saline, pH=7,4 sin calcio ni magnesio, referencia
10010-015, Gibco BRL). La incorporación de ^{33}P
en el péptido se cuantifica mediante contaje por centelleo con un
contador Packard Topcount.NXT. La actividad inhibidora de los
productos de la invención se evalúa midiendo la concentración del
inhibidor que produce una disminución de la actividad enzimática
del 50% (CI50).
Claims (18)
1. Producto que responde a la fórmula (I)
siguiente:
en la
que:
- 1)
- A y Ar son grupos fenilo sustituidos;
- 2)
- L es NH-CO-NH;
- 3)
- W es C(R6), uno de Y y Z, se elige entre N y NO, y el otro es C(R5) y;
- 4)
- R1, R5, y R6 son H;
- 5)
- Ra es H.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Producto según la reivindicación 1, en la que
Y es N.
3. Producto según la reivindicación 3, en la que
Z es N.
4. Producto según la reivindicación 3, en la que
Z es NO.
5. Producto según la reivindicación 1, en la que
A está sustituido con un primer sustituyente seleccionado del grupo
constituido por alquilo(C1-C12),
alquilo(C1-C3) halogenado,
cicloalquilo(C1-C3),
alquileno(C2-C12),
alquinilo(C2-C12),
arilo(C6-C14),
heteroarilo(C1-C13) con 1 a 4 heteroátomos,
O-alquilo(C1-C3),
O-Arilo(C1-C13),
O-heteroarilo(C1-C13),
S-alquilo(C1-C3),
S-Arilo(C1-C13),
S-heteroarilo(C1-C13),
estando cada uno sustituido opcionalmente con un sustituyente
elegido entre alquilo(C1-C12), halógeno,
O-alquilo(C1-C3),
N(R8)(R9); en el que R8 y R9 se eligen independientemente
entre H, alquilo(C1-C3),
alquilo(C1-C3)OH,
alquilo(C1-C3) halogenado,
alquilo(C1-C3)NH_{2},
alquilo(C1-C3)COOM,
alquilo(C1-C3)SO_{3}M; en el que
cuando R8 y R9 son diferentes simultáneamente de H, pueden unirse
para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones que contiene de 0 a 3
heteroátomos elegidos entre O, N y S, y en el que M es H o un
catión de metal alcalino elegido entre Li, Na y K.
6. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que A está sustituido con un segundo
sustituyente seleccionado del grupo constituido por F, Cl, Br, I,
OH, SH, SO_{3}M. COOM, CN, NO_{2}, CON(R8)(R9),
N(R8)CO(R9),
alquilo(C1-C3)-OH,
alquilo(C1-C3)-N(R8)(R9),
alquilo(C1-C3)-(R10),
alquilo(C1-C3)-COOH,
N(R8)(R9); en el que R8 y R9 se eligen independientemente
entre H, alquilo(C1-C3),
alquilo(C1-C3)OH,
alquilo(C1-C3) halogenado,
alquilo(C1-C3)NH_{2},
alquilo(C1-C3)COOM,
alquilo(C1-C3)SO_{3}M; en el que,
cuando R8 y R9 son diferentes simultáneamente de H, pueden unirse
para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones que contiene de 0 a 3
heteroátomos elegidos entre O, N y S; en el que M es H o un catión
de metal alcalino elegido entre Li, Na y K; y en el que R10 es H o
un heterociclo no aromático sustituido opcionalmente, que comprende
2 a 7 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos elegidos entre N, O y
S.
7. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 6, en la que A es fenilo sustituido con al
menos un grupo elegido entre halógeno,
alquilo(C1-C4),
alquilo(C1-C3) halogenado,
O-alquilo(C1-C3),
S-alquilo(C1-C3),
O-alquilo(C1-C3) halogenado,
S-alquilo(C1-C3) halogenado,
y en la que cuando A está disustituido, los dos sustituyentes
pueden estar unidos entre sí para formar un ciclo de 5 a 7 eslabones
que contiene de 0 a 3 heteroátomos elegidos entre N, O y S.
8. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque está en
forma:
- no quiral, o
- racémica, o
- enriquecida en un estereoisómero, o
- enriquecida en un enantiómero;
- y porque está opcionalmente salificado.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se trata
de:
3-{4-[3-(2-Fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Cloro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Fluoro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Fluoro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-Fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-TrifluoroMetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3,4-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2,5-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3,4-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Metoxi-5-Metil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-[4-(3-m-Tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-[4-(3-p-Tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Metil-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Difluorometoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3,5-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Cloro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2,5-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Metoxi-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-etil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se trata
de:
3-{4-[3-(2-Fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-7-oxi-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-2-carboxamida.
11. Producto según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se trata
de:
3-{4-[3-(2-Fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Metoxi-5-Metil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
Trifluoroacetato de
3-{4-[3-(3-cloro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
Trifluoroacetato de
3-{4-[3-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
Trifluoroacetato de
3-{4-[3-(2-fluoro-5-Metil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
Trifluoroacetato de
3-[4-(3-m-tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
Trifluoroacetato de
3-{4-[3-(2-Acetilamino-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-[4-(3-p-Tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Cloro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Cloro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-TrifluoroMetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Difluorometoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3,4-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3,5-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2,5-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-Fluoro-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(2-Fluoro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-Fluoro-5-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Fluoro-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Metil-3-trifluorometil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
Trifluoroacetato de
3-{4-[3-(3-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
Trifluoroacetato de
3-{4-[3-(3,4-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
Trifluoroacetato de
3-{4-[3-(2,5-Dimetoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-[4-(3-o-Tolil-ureido)-fenil]-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(4-Metoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-Cloro-4-Difluorometoxi-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
\newpage
3-{4-[3-(3,5-Dimetil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida,
3-{4-[3-(3-etil-fenil)-ureido]-fenil}-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-2-carboxamida.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Medicamento, caracterizado porque
comprende un producto de fórmula (I) según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, o una sal de adición de este compuesto a
un ácido farmacéuticamente aceptable, o también un hidrato o un
solvato del producto de fórmula (I).
13. Composición farmacéutica que comprende un
producto según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Utilización de un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, como agente inhibidor de
una reacción catalizada por una quinasa.
15. Utilización de un producto según la
reivindicación 14, en la que la quinasa se elige entre FAK, KDR,
Tie2, Aurora A, Aurora B, y CDK2.
16. Utilización según la reivindicación 15, en
la que la quinasa se elige entre KDR y Tie2.
17. Utilización de un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la fabricación de
un medicamento útil para tratar un estado patológico.
18. Utilización según la reivindicación 17,
caracterizado porque el estado patológico es el cáncer.
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