ES2329099T3 - Fragmento polipeptidico aislado que induce produccion de interferon-gamma y un fragmento de adn aislado que codifica dicho polipeptido. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN FRAGMENTO PEPTIDICO AISLADO DE UN POLIPEPTIDO HUMANO, QUE TIENE UNA SECUENCIA AMINOACIDA SEQ ID NO: 1, DONDE XAA EN EL RESIDUO AMINOACIDO 73 DE LA SEQ ID NO:1 ES ISOLECUCINA O TREONINA. DICHO FRAGMENTO INDUCE LA PRODUCCION DE IFN- GA POR CELULAS INMUNOCOMPETENTES.

Description

Fragmento polipeptídico aislado que induce producción de interferón-\gamma y un fragmento de ADN aislado que codifica dicho polipéptido.

El IFN-\gamma es una proteína que tiene actividades antivirales, antioncóticas e inmunorreguladoras y se produce por células inmunocompetentes estimuladas con antígenos o mitógenos. Debido a estas actividades biológicas, se espera usar el IFN-\gamma como un agente antitumoral desde el comienzo del descubrimiento y se estudió activamente en experimentos clínicos como un agente terapéutico para tumores malignos en general que incluyen tumores cerebrales. Las preparaciones de IFN-\gamma disponibles en el mercado en la actualidad se clasifican en líneas generales en 2 grupos, es decir, IFN-\gamma naturales producidos por células inmunocompetentes e IFN-\gamma recombinantes producidos por transformantes preparados introduciendo en los microorganismos de la especie Escherichia coli ADN que codifican los IFN-\gamma naturales. En los experimentos clínicos anteriores, cualquiera de tales IFN-\gamma se administra a pacientes como un "IFN-\gamma exógeno".

Entre estos IFN-\gamma, los IFN-\gamma naturales se producen habitualmente cultivando células inmunocompetentes establecidas en medios de cultivo nutritivo complementado con inductores de IFN-\gamma para producir los IFN-\gamma y purificando los IFN-\gamma producidos. Se sabe que el tipo de inductores de IFN-\gamma influye enormemente en el rendimiento de la producción de IFN-\gamma, la facilitación de la purificación de IFN-\gamma y la seguridad de los productos finales. Generalmente, se usan mitógenos tales como concanavalina A (Con A), Lens culinaris, Phytolacca americana, endotoxinas y lipopolisacáridos. Sin embargo, estos mitógenos tienen problemas por sus diversidades moleculares y cualitativas que dependen de sus orígenes y métodos de purificación, y tienen asimismo dificultades de producción en una cantidad deseada y con una inductibilidad de IFN-\gamma constante. Además, la mayoría de estos mitógenos inducen efectos secundarios desfavorables cuando se administran a organismos vivos y algunos de ellos incluso muestran toxicidad. Por lo tanto, es sustancialmente difícil inducir la producción de IFN-\gamma por la administración directa de tales mitógenos a organismos vivos.

Los presentes inventores encontraron en hígado de ratón una sustancia que induce la producción de IFN-\gamma por sus investigaciones sobre citocinas producidas por células de mamífero. Aislaron la sustancia usando una diversidad de métodos de purificación que comprendían cromatografía en columna como una técnica principal, estudiaron las propiedades y características y describieron que la realidad es una proteína que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(1)

Peso molecular

\quad

Muestra un peso molecular de 19.000\pm5.000 dalton en electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sódico (SDS-PAGE);

(2)

Punto isoeléctrico (pI)

\quad

Muestra un punto isoeléctrico de 4,8\pm1,0 por cromatoenfoque;

(3)

Secuencia parcial de aminoácidos

\quad

Tiene las secuencias parciales de aminoácidos en las SEC ID Nº: 4 y 5; y

(4)

Actividad biológica

\quad

Induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

Puede concluirse que la realidad es una sustancia novedosa ya que no se conocía ninguna proteína con estas propiedades fisicoquímicas. Los presentes inventores continuaron los estudios sobre células hepáticas de ratón y encontraron que el ADN de la sustancia consiste en 471 pares de bases y codifica la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 3.

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SEC ID Nº: 3:

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1

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Basándose en estos hallazgos, los presentes inventores continuaron adicionalmente estudios en células hepáticas humanas y obtuvieron un ADN que codifica otra sustancia novedosa que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. Describieron que la realidad es un polipéptido y después descodificaron su ADN para encontrar que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1.

SEC ID Nº: 1:

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2

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Introdujeron el ADN en Escherichia coli para expresar el polipéptido y producir el mismo en el cultivo con un rendimiento considerablemente alto.

Como se ha descrito anteriormente, el polipéptido tiene la propiedad de inducir la producción de INF-\gamma por células inmunocompetentes y se espera usar en una diversidad de campos como un inductor de INF-\gamma, agente antiviral, agente antitumoral, agente antibacteriano, agente inmunorregulador y agente mejorador de plaquetas. En general, se requiere inevitablemente el desarrollo de métodos para purificar eficazmente polipéptidos biológicamente activos hasta unos que tengan una pureza relativamente alta y para ensayar muchas muestras de manera simultánea cuando los polipéptidos deban incorporarse en productos farmacéuticos. Aunque el material más adecuado que permite esta purificación y ensayo es un anticuerpo monoclonal, no se ha obtenido ninguno que sea específico para el polipéptido.

Recientemente, se han desarrollado algunos productos farmacéuticos, que contienen como ingrediente eficaz citocinas tales como interferón-\alpha, interferón-\beta, TFN-\alpha, TFN-\beta, interleucina 2 e interleucina 12, así como IFN-\gamma y otros están aprovechándose para su uso real. Estos productos farmacéuticos pueden usarse como un agente antitumoral, agente antiviral, agente antiséptico e inmunorregulador y, si es necesario, pueden usarse junto con otros medicamentos.

A diferencia de los productos farmacéuticos sintetizados químicamente, los productos farmacéuticos que se han mencionado anteriormente tienen como característica más importante un carácter de administrase fácilmente a pacientes durante un periodo de tiempo relativamente largo sin inducir efectos secundarios graves, pero tienen la desventaja de que sus efectos terapéuticos generalmente son relativamente bajos y si se usan solos, no pueden remitir o curar sustancialmente enfermedades, variando dependientemente de los tipos de enfermedades y síntomas a tratar. Por lo tanto, tales productos farmacéuticos se usan actualmente como un agente suplementario para agentes sintetizados químicamente en el tratamiento de enfermedades graves tales como tumores malignos, o se usan como un medio para prolongar la vida del paciente.

La presente invención proporciona una composición para reaccionar específicamente con un polipéptido de origen humano, que comprende como un ingrediente eficaz un anticuerpo monoclonal que reconoce el polipéptido junto con un vehículo del anticuerpo monoclonal; induciendo dicho polipéptido la producción de IFN-gamma por células inmunocompetentes y comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina").

La presente invención también proporciona un método para hacer reaccionar específicamente un polipéptido de origen humano con un anticuerpo monoclonal, que comprende una etapa de poner en contacto el polipéptido con un anticuerpo monoclonal que reconoce el polipéptido; induciendo dicho polipéptido la producción de IFN-gamma por células inmunocompetentes y comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina").

En este documento se describe un fragmento peptídico aislado de un polipéptido humano, teniendo dicho polipéptido humano una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, donde Xaa en el resto aminoácido 73 de la SEC ID Nº: 1 es isoleucina o treonina e induciendo la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

En este documento se describe una colección aislada de fragmentos peptídicos que están contenidos en un polipéptido humano, teniendo dicho polipéptido humano una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, donde Xaa en el resto aminoácido 73 de la SEC ID Nº: 1 es isoleucina o treonina, e induciendo la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

En este documento se describe un fragmento de ADN aislado de un ADN de la SEC ID Nº: 2, codificando dicho ADN de la SEC ID Nº: 2 un polipéptido humano que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompe-
tentes.

En este documento se describe una colección aislada de fragmentos de ADN que están contenidos en un ADN de la SEC ID Nº: 2, codificando dicho ADN de la SEC ID Nº: 2 un polipéptido humano que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 e induciendo la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

La invención se describirá a continuación con más detalle, solamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Fig. 1 es un patrón de elución de HPLC de un fragmento peptídico obtenido por tripsinización de una proteína procedente de hígado de ratón.

La Fig. 2 es una figura de la estructura del presente pHIGIF de ADN recombinante.

La Fig. 3 es una figura de la estructura de pKGFHH2 de ADN recombinante.

La Fig. 4 es una figura de la transferencia de Western que muestra la reactividad del presente polipéptido purificado e interleucina 12 humana con el presente anticuerpo monoclonal H-1mAb.

ADNc de HIGIF: ADNc que codifica el presente polipéptido

ADNc de KGFHH2: ADNc que codifica el presente polipéptido

Ptac: promotor tac

rrnBT1T2: terminador del operón de ARN ribosómico

GST: gen de glutatión S transferasa.

AmpR: gen de resistencia a ampicilina

pBR322ori: sitio de inicio de la replicación de Escherichia coli

Un polipéptido de acuerdo con la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de polipéptidos convencionales e induce la producción de IFN-\gamma cuando se deja actuar solo o junto con un cofactor en células inmunocompetentes.

Un ADN de acuerdo con la presente descripción expresa la producción del presente polipéptido por introducción del ADN en un vector auto-replicable para formar un ADN recombinante, y, habitualmente, por introducción del ADN recombinante en un hospedador capaz de proliferar sin dificultad pero incapaz de producir el polipéptido.

Generalmente, un ADN recombinante replicable de acuerdo con la presente descripción expresa la producción del presente polipéptido por introducción del mismo en un hospedador capaz de proliferar sin dificultad pero incapaz de producir el polipéptido.

Un transformante produce el presente polipéptido cuando se cultiva.

El presente polipéptido se obtiene fácilmente en una cantidad deseada por cultivo del transformante de acuerdo con el presente proceso.

La presente descripción se basa en el hallazgo de un polipéptido novedoso que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. Durante los estudios de citocinas producidas por células de mamífero, los presentes inventores encontraron que en hígado de ratón existe una proteína novedosa capaz de inducir la producción de IFN-\gamma. Aislaron la proteína usando dos o tres métodos de purificación que comprenden principalmente la cromatografía en columna y determinaron la secuencia parcial de aminoácidos. Basándose en la secuencia, sintetizaron químicamente un cebador usando como un molde un ARNm aislado de células hepáticas de ratón y trataron la proteína con la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción (RT- PCR) en presencia del cebador para recoger fragmentos de ADN que codifican parcialmente la proteína. Usando los fragmentos de ADN como una sonda, estudiaron activamente una genoteca de ADNc que se preparó de manera alternativa a partir del ARNm y obtuvieron un fragmento de ADN que consiste en 471 pares de bases y que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº: 3. La descodificación de la secuencia de bases mostró que la proteína, aislada de hígado de ratón, consiste en 157 aminoácidos y tiene una secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 3, donde el símbolo "Xaa" significa "metionina" o
"treonina".

Basándose en estos hallazgos, los presentes inventores estudiaron adicionalmente el ARNm procedente de células hepáticas humanas y encontraron que existe un nuevo gen que codifica un polipéptido que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. El gen contiene la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 2 y la descodificación del mismo mostró que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1, donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina".

SEC ID Nº: 2:

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3

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A continuación se resumen las técnicas usadas para mostrar la secuencia de aminoácidos y las secuencias de bases de las SEC ID Nº: 1 y 2:

(1)

Se aisló una proteína, que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, de células hepáticas de ratón y se purificó altamente combinando métodos de purificación convencionales que comprendían la cromatografía como una técnica principal;

(2)

La proteína purificada resultante se digirió con tripsina y se aislaron 2 fragmentos polipeptídicos de la mezcla resultante y se determinó la secuencia de aminoácidos;

(3)

A partir de células hepáticas de ratón, se recogió un ARNm y se sometió como un molde a la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para obtener fragmentos de ADN en presencia de un oligonucleótido como cebador que se había sintetizado químicamente basándose en la anterior secuencia parcial de aminoácidos. Se exploraron los fragmentos usando un oligonucleótido como una sonda que se había sintetizado químicamente basándose en estas secuencias parciales de aminoácidos, seguido de la recogida de un fragmento de ADN que codifica parcialmente la proteína;

(4)

Se marcó una genoteca de ADNc y se hibridó con la genoteca de ADNc resultante preparada con el ARNm como un molde, seguido de la selección de un transformante que mostró una fuerte hibridación;

(5)

Se aisló un ADNc del transformante y se determinó y se descodificó la secuencia de bases. La comparación de la secuencia de aminoácidos descodificada y la secuencia parcial de aminoácidos mostró que la proteína tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 3 y, en ratones, la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 3 codifica la secuencia de aminoácidos;

(6)

Se preparó un fragmento de ADN que tenía la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 3, se marcó e hibridó con una genoteca de ADNc que se había preparado usando como un molde ARNm procedente de células hepáticas humanas, seguido de la selección de un transformante que mostró una fuerte hibridación; y

(7)

Se preparó ADNc a partir del transformante, se determinó la secuencia de bases y se descodificó, mostrando que el presente polipéptido, un polipéptido humano, incluye aquellos con la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 codificada por la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 2.

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Mediante investigación a largo plazo, los presentes inventores encontraron un polipéptido que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes y, como es evidente a partir de la SEC ID Nº: 1, difiere de polipéptidos convencionalmente conocidos. El presente polipéptido incluye polipéptidos naturales y recombinantes siempre que tengan la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 o una homóloga a la misma. Pueden obtenerse variantes, que tengan secuencias de aminoácidos homólogas a una en la SEC ID Nº: 1, reemplazando uno o más aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 con otros aminoácidos sin alterar la actividad biológica inherente del presente polipéptido. Dependiendo de los hospedadores en los que se introducen los ADN, incluso cuando se usan los mismos ADN, y de los componentes y las condiciones de temperatura y pH del cultivo para los transformantes que contienen el ADN, pueden formarse variantes que carezcan de uno o más aminoácidos cerca de los extremos N y/o C en la SEC ID Nº: 1, o que contengan adicionalmente uno o más aminoácidos cerca del extremo N en la SEC ID Nº: 1 por la modificación de enzimas internas de los hospedadores después de la expresión del ADN, mientras que se mantienen las propiedades biológicas inherentes del polipéptido. El presente polipéptido incluye tales variantes siempre que induzcan la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

El presente polipéptido puede prepararse cultivando en medio de cultivo nutritivo transformantes que contienen los ADN que codifican el polipéptido y recogiendo el polipéptido producido de los cultivos resultantes. Los transformantes útiles en la presente invención pueden obtenerse, por ejemplo, introduciendo en los hospedadores ADN que tengan la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 2, secuencias de bases homólogas de las mismas y complementarias a estas secuencias de bases. Pueden reemplazarse una o más bases en esas secuencias de bases con otras bases por medio de la degeneración del código genético sin alterar la secuencia de aminoácidos del presente polipéptido. Para expresar la producción del polipéptido en hospedadores usando tales ADN, pueden reemplazarse con otras bases una o más bases en las secuencias de bases que codifican el presente polipéptido o sus variantes.

Puede usarse cualquier ADN en la presente descripción siempre que tenga una de estas secuencias de bases independientemente de su origen, es decir, los de fuentes naturales o los sintetizados artificialmente. Las fuentes naturales incluyen, por ejemplo, células de hígado humano a partir de las cuales puede obtenerse el gen, que contiene el ADN con la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 6.

\newpage

SEC ID Nº: 6:

4

El procedimiento de preparación es el siguiente: Fraccionar un ARNm de hígado humano disponible en el mercado suplementado con poli (A) en un tampón de gradiente de sacarosa para aislar el ARNm purificado. Dejar actuar una transcriptasa inversa y una polimerasa sobre el ARNm como un molde para formar un ADNc bicatenario, introducir el ADNc en un vector auto-replicable apropiado e introducir el ADN recombinante resultante en un hospedador apropiado tal como Escherichia coli. Cultivar el transformante resultante en un medio de cultivo nutritivo y recoger los transformantes proliferados que contienen el ADN que codifica el presente polipéptido por el método de hibridación de colonias. El ADN de acuerdo con la presente descripción puede obtenerse por tratamiento de los transformantes con métodos convencionales. Para producir artificialmente el presente ADN, por ejemplo, se prepara por la síntesis química basada en la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 2 o introduciendo un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 en un vector apropiado para formar un ADN recombinante, introduciendo el ADN recombinante en un hospedador apropiado, cultivando el transformante resultante en un medio de cultivo nutritivo, aislando las células proliferadas del cultivo y recogiendo los plásmidos que contienen el ADN objetivo de las células.

Generalmente, el ADN se introduce en los hospedadores en forma de un ADN recombinante. Tal ADN recombinante contiene habitualmente el ADN y un vector auto-replicable y puede prepararse fácilmente por tecnología de ADN recombinante en general si solamente se dispone de ADN. Son ejemplos de tal vector auto-replicable los vectores plasmídicos tales como pKK223-2, pGEX-2T, pRL-\lambda, ADN pBTrp2, pUB110, YEp13, plásmido Ti, plásmido Ri y pBI121. Entre estos vectores, pKK223-2, pGEX-2T, pRL-\lambda, ADN pBTrp2, pUB110 y YEp13 se usan adecuadamente cuando el presente ADN se expresa en procariotas tales como levaduras y otros microorganismos de las especies Escherichia coli y Bacillus subtilis, mientras que el plásmido Ti, plásmido Ri y pBI121 se usan adecuadamente para la expresión en células animales y vegetales.

Para introducir el presente ADN en estos vectores, pueden usarse arbitrariamente métodos convencionales usados en este campo: Los genes que contienen el presente ADN y los vectores auto-replicables se escinden con enzimas de restricción y/o ultrasonido y los fragmentos de ADN resultantes y los fragmentos del vector se ligan. Para escindir genes y vectores, las enzimas de restricción que actúan específicamente sobre los nucleótidos, más particularmente, las enzimas de restricción de tipo II tales como Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Xba I, Sac I y Pst I, facilitan la ligación de los fragmentos de ADN y los fragmentos del vector. Para ligar fragmentos de ADN y fragmentos del vector, en primer lugar, si es necesario, se hibridan, después se tratan con una ADN ligasa in vivo o in vitro. Los ADN recombinantes obtenidos de esta manera pueden introducirse fácilmente en hospedadores apropiados y esto permite la replicación ilimitada de los ADN por cultivo de los transformantes.

Los ADN recombinantes útiles en la presente descripción pueden introducirse en hospedadores apropiados tales como levaduras y otros microorganismos de las especies Escherichia coli y Bacillus subtilis: Cuando se usan como un hospedador microorganismos de la especie Escherichia coli, se cultivan en presencia de los ADN recombinantes e iones calcio y se usa el método de las células competentes y el método del protoplasto cuando se usan microorganismos de la especie Bacillus subtilis como un hospedador. Para clonar los transformantes objetivo, se seleccionan por el método de hibridación de colonias o por cultivo de todos los transformantes en medio de cultivo nutritivo y seleccionando los que producen polipéptidos capaces de inducir la producción de IFN-\gamma por células inmunocompe-
tentes.

Los transformantes obtenidos de esta manera producen el presente polipéptido intracelular o extracelularmente cuando se cultivan en medio de cultivo nutritivo. Son ejemplos de tales medios de cultivo nutritivos aquellos en forma de líquido en general que contienen fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y minerales, así como aminoácidos y/o vitaminas como micronutriente. Las fuentes de carbono útiles en la presente descripción incluyen sacáridos tales como almidón, hidrolizados de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa. Las fuentes de nitrógeno útiles en la presente invención incluyen compuestos orgánicos e inorgánicos que contienen nitrógeno tales como amoniaco y sus sales, urea, nitratos, peptona, extracto de levadura, soja desgrasada, agua de macerado de maíz y extracto de carne. Los transformantes se inoculan en medio de cultivo nutritivo y se incuban a una temperatura de 25-65ºC y a un pH de 5-8 durante aproximadamente 1-10 días en condiciones aerobias por el método de agitación-aireación, etc., para obtener cultivos que contengan el presente polipéptido. Aunque los cultivos pueden usarse intactos como un inductor de IFN-\gamma, se someten, si es necesario, a ultrasonicación y/o a enzimas de lisis celular para romper las células, seguido de filtración o centrifugación de las suspensiones resultantes para retirar las células intactas y los restos celulares y purificación adicional de los sobrenadantes resultantes que contienen el presente polipéptido. Los métodos de purificación útiles en la presente descripción son, por ejemplo, los que se usan generalmente en este campo para purificar sustancias biológicamente activas, es decir, concentración, desalación, diálisis, sedimentación separadora, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatoenfoque, electroforesis en gel e isoelectroforesis y, si es necesario, pueden usarse dos o más de las mismas en combinación. Las soluciones purificadas resultantes que contienen el presente polipéptido pueden concentrase y/o liofilizarse en líquidos o sólidos para satisfacer los usos finales.

Como se ha descrito anteriormente, el presente polipéptido tiene una actividad inductora de la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. Debido a esto, el presente polipéptido puede usarse arbitrariamente como agente terapéutico y/o profiláctico, por ejemplo, para enfermedades virales tales como SIDA y condiloma acuminado; tumores malignos tales como cáncer renal, granuloma, micosis fungoide y tumor cerebral; y trastornos inmunes tales como reumatismo articular y alergia.

El presente polipéptido se deja coexistir en medio de cultivo nutritivo para inducir la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, o se administra directamente a mamíferos para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades susceptibles a IFN-\gamma. En el primer caso, se suspenden leucocitos separados de sangre periférica de mamífero o células inmunocompetentes establecidas tales como células HBL-38, células Mo, células Jurkat, células HuT78, células EL4 y células L12-R4, en medio de cultivo nutritivo que contiene de aproximadamente 0,1 ng a aproximadamente un \mug por ml, preferiblemente, aproximadamente 1-100 ng por ml del presente polipéptido para inducir la producción de IFN-\gamma. Si es necesario, tal medio de cultivo nutritivo puede complementarse con estimulantes de células T tales como mitógeno, interleucina 2 y anticuerpo anti-CD 3, y las células se cultivan a una temperatura de aproximadamente 30-40ºC y a un pH de aproximadamente 5-8 durante aproximadamente 1-100 horas mientras el medio se va reemplazando con otro reciente. El IFN-\gamma puede obtenerse de los cultivos resultantes por uno o más métodos convencionales usados generalmente para purificar sustancias biológicamente activas, por ejemplo, concentración, desalación, diálisis, sedimentación separadora, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatoenfoque, electroforesis en gel e isoelectroforesis.

Para tratar y/o prevenir enfermedades susceptibles a IFN-\gamma, el presente agente inductor de IFN-\gamma se administra directamente a mamíferos: por ejemplo, los agentes inductores de IFN-\gamma se administran por vía oral a mamíferos después de formularse en formas apropiadas, o se inyectan en mamíferos por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía muscular, por vía intravenosa o por vía peritoneal. Los mamíferos, a los que puede administrase el presente polipéptido, no están restringidos a seres humanos e incluyen otros animales tales como ratón, rata, hámster, conejo, perro, gato, vaca, caballo, cabra, oveja, cerdo y mono. Ya que el presente polipéptido tiene una fuente inductibilidad de IFN-\gamma y una toxicidad extremadamente baja, induce fácilmente la producción de IFN-\gamma con solamente una pequeña cantidad sin causar efectos secundarios graves incluso cuando se administra a mamíferos en una dosis relativamente alta. Por tanto, el presente polipéptido induce ventajosamente una cantidad deseada de IFN-\gamma fácilmente sin controlar estrictamente el nivel de dosis. No es necesario decir que el presente polipéptido cumple con la seguridad requerida para un producto farmacéutico.

La composición que comprende un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención reacciona específicamente con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.

El hibridoma de acuerdo con la presente descripción produce el anticuerpo monoclonal cuando se cultiva in vitro.

La preparación del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente descripción facilita la producción del anticuerpo en una cantidad deseada.

El método de purificación del polipéptido de acuerdo con la presente descripción recupera eficazmente el mismo con una calidad relativamente alta de una mezcla que contiene el polipéptido e impurezas.

En el método de detección de acuerdo con la presente descripción, solamente el polipéptido reacciona inmunológicamente en las muestras. Cuando se mide el nivel de inmunorreacción mediante una técnica apropiada, el polipéptido puede ensayarse cualitativa o cuantitativamente.

El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente descripción incluye los que en general son específicos para el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 o una homóloga a la misma incluyendo al menos los diez primeros aminoácidos como se representa en la SEC ID Nº: 1, independientemente de su fuente, origen y clase. Los aminoácidos homólogos incluyen los que se obtienen reemplazando uno o más aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 con otros aminoácidos, añadiendo uno o más aminoácidos a los extremos N y/o C en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, o perdiendo uno o más aminoácidos en los extremos N y/o C de la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1, sin perder sustancialmente la actividad de inducción de la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

El anticuerpo monoclonal útil en la composición y el método de la presente invención puede obtenerse usando el polipéptido o sus fragmentos antigénicos: por ejemplo, puede obtenerse el anticuerpo preparando hibridomas usando células de mamífero capaces de proliferación infinita y células productoras de anticuerpos recogidas de mamíferos inmunizados con los fragmentos, seleccionando clones de hibridomas capaces de producir el anticuerpo monoclonal y cultivando los clones in vivo o in vitro.

Puede obtenerse el polipéptido como un antígeno cultivando transformantes en los que se introdujo un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 y o una homóloga y, generalmente, se usan intactos o en una forma parcialmente purificada. Los fragmentos antigénicos pueden prepararse hidrolizando químicamente o enzimáticamente un polipéptido purificado completamente o parcialmente, o sintetizarse mediante síntesis peptídica basándose en la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1.

El método de inmunización útil incluye los convencionales: Por ejemplo, se inyectan a mamíferos antígenos en solitario o en combinación con adyuvantes adecuados por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía subcutánea o por vía intraperitoneal y se suministran durante un periodo prescrito. Puede usarse cualquier mamífero sin restricción especial siempre que puedan obtenerse células productoras de anticuerpo deseadas independientemente de la especie, peso y sexo del animal. En general, se usan roedores tales como ratas, ratones y hámsteres y de los cuales se selecciona el animal más adecuado mientas que se evalúa la compatibilidad con las anteriores células de mamífero capaces de proliferación infinita. Dependiendo de la especie y el peso de los animales usados, la dosis total de los antígenos está generalmente en el intervalo de aproximadamente 5-500 \mug por animal y se administra en 2-5 veces con un intervalo de 1-2- semanas. A los 3-5 días después de la administración final, se extrae el bazo del animal y se dispersa en una suspensión de esplenocitos como una célula productora de anticuerpos.

Las células productoras de anticuerpos y las células de mamífero obtenidas anteriormente se fusionan en una mezcla de fusión celular que contiene los hibridomas objetivo. Las células de mamífero capaces de proliferación infinita incluyen cepas de células de mieloma de ratón tales como células P3-NS1-Ag4-1 (ATCC T1B18), células P3-X63-Ag8 (ATCC TIB9), células SP2/O-Ag14 (ATCC CRL1581) y mutantes de las mismas. El método de fusión celular útil incluye los convencionales que usan un pulso eléctrico y un acelerador de fusión celular tal como polietilenglicol y el virus sendai (HVJ): por ejemplo, se suspenden células productoras de anticuerpos y tales células de mamífero en una proporción de aproximadamente 1:1 a 1:10 en medio de fusión que contiene aceleradores de fusión y se incuban a aproximadamente 30-40ºC durante aproximadamente 1-5 min. Se usan preferiblemente medios convencionales tales como medio esencial mínimo (MEM), medio RPMI 1640 y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove (MDMI), como un medio de fusión sin adición de sueros tales como suero de ternero.

Para seleccionar los hibridomas objetivo, la mezcla de fusión celular resultante se transfirió a un medio de selección tal como medio HAT y se incubó a aproximadamente 30-40ºC durante aproximadamente de 3 días a 3 semanas para matar células excepto los hibridomas. Los hibridomas se cultivaron de manera habitual y los anticuerpos secretados en los cultivos se ensayaron para la reactividad con el polipéptido. Son ejemplos de dicho ensayo los convencionales para detectar anticuerpos tales como un inmunoensayo enzimático, radioinmunoensayo y bioensayo. Por ejemplo, "Tan-Clone-Kotai-Jikken-Manual (Manual Experimental para Anticuerpos Monoclonales)" editado por Sakuji TOYAMA y Tamie ANDO, publicado por Kodanska Scientific, Ltd., Tokio, Japón, págs. 105-152 (1991) describe una diversidad de los mismos. Los hibridomas, que producen anticuerpos que son específicos para el polipéptido, se clonan fácilmente por dilución limitante para obtener el hibridoma de acuerdo con la presente invención.

El anticuerpo monoclonal útil en la composición y el método de la presente invención puede obtenerse cultivando el hibridoma in vivo, es decir, en animales, o in vitro. Para el cultivo pueden usarse métodos convencionales para cultivar células de mamífero: por ejemplo, en caso de cultivo in vivo, el anticuerpo monoclonal se recoge de ascitis y/o sangre del animal. Los hibridomas H-1 y H-2 como se describe a continuación tienen una productibilidad mejorada del anticuerpo monoclonal y tienen un carácter de cultivarse fácilmente in vivo e in vitro. Pueden usarse métodos convencionales usados para purificar anticuerpos en general para recoger el anticuerpo monoclonal de los cultivos y de la ascitis y sangre de los animales. Los ejemplos de tales métodos incluyen desalación, diálisis, filtración, concentración, centrifugación, sedimentación separadora, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), electroforesis en gel e isoelectroforesis y, si es necesario, pueden usarse dos o más de los mismos en combinación. Los anticuerpos monoclonales purificados resultantes pueden concentrase o secarse para dar productos en forma de un líquido o un sólido para satisfacer su uso final.

El presente anticuerpo monoclonal es extremadamente útil para purificar el presente polipéptido por cromatografía de inmunoafinidad. Tal técnica de purificación comprende poner en contacto el anticuerpo monoclonal con una mezcla que contiene el polipéptido e impurezas tales como proteínas distintas al polipéptido para adsorber el polipéptido sobre el anticuerpo y desorber el polipéptido del anticuerpo. Estas etapas se realizan generalmente en un sistema acuoso. El anticuerpo monoclonal se usa generalmente en una forma inmovilizada en soportes de gel insolubles al agua que están envasados en columnas cilíndricas. Los cultivos de transformantes o sus productos parcialmente purificados se suministran a las columnas para adsorber sustancialmente el polipéptido sobre el anticuerpo monoclonal. El polipéptido se desorbe fácilmente del anticuerpo alternando el pH alrededor del anticuerpo. Por ejemplo, en el caso de usar un anticuerpo monoclonal de la clase IgG, el polipéptido adsorbido se desorbe y eluye de las columnas a un pH ácido, habitualmente, un pH de 2-3, mientras que en el caso de usar un anticuerpo monoclonal de la clase IgM, el polipéptido se desorbe y eluye de las columnas a un pH alcalino, habitualmente, un pH de 10-11.

El método de purificación consigue un nivel de purificación relativamente alto del polipéptido con solamente el coste de trabajo y tiempo mínimo. Como se ha descrito anteriormente, el polipéptido tiene una actividad de inducción de la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes y el polipéptido purificado puede usarse como un inductor de IFN-\gamma para que el cultivo celular produzca IFN-\gamma y usarse en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades víricas tales como SIDA y condiloma, tumores malignos tales como cáncer renal, granuloma, micosis fungoide y tumor cerebral y enfermedades inmunes tales como reumatismo articular y alergia. Si el polipéptido tiene una actividad mejoradora de la citotoxicidad celular de células asesinas, puede usarse junto con interleucina 2 y/o factor de necrosis tumoral para mejorar el efecto terapéutico y reducir los efectos secundarios en el tratamiento de inmunidad adoptiva para tumores malignos que incluyen tumores sólidos tales como cáncer de pulmón, cáncer renal y cáncer de mama.

El anticuerpo monoclonal tiene una aplicabilidad relativamente amplia a una diversidad de campos que requieren la detección del polipéptido. Cuando se usa en inmunoensayos marcados tales como radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático e inmunoensayo fluorescente, el anticuerpo monoclonal puede detectar el polipéptido cualitativa y cuantitativamente en las muestras de manera instantánea y precisa. En tales ensayos, el anticuerpo monoclonal se marca, por ejemplo, con radioisótopos, enzimas y/o sustancias fluorescentes antes del uso. El anticuerpo reacciona específicamente con el polipéptido para mostrar una inmunorreacción y detecta con exactitud solamente una ligera cantidad del polipéptido en las muestras midiendo el nivel de la inmunorreacción para estas sustancias marcadas. Si se compara con el bioensayo, el inmunoensayo marcado tiene las siguientes características: puede ensayar muchas muestras simultáneamente, reducir el tiempo de ensayo y el coste de trabajo y proporcionar datos con una precisión relativamente alta. Por tanto, el presente método de detección es útil para controlar las etapas de producción del polipéptido y para el control de calidad de los productos finales. Aunque la presente descripción no describe con detalle las técnicas para el marcado del anticuerpo monoclonal o para el ensayo marcado porque en sí mismas no se refieren a tal invención, estas técnicas se describen con detalle en "Enzyme Immunoassay", editado por P. Tijssen, traducido por Eiji ISHIKAWA, publicado por Tokyo-Kagaku-Dojin, págs. 196-348 (1989).

El presente agente para enfermedades susceptibles induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes cuando se administra a seres humanos y ejerce un efecto terapéutico y/o profiláctico sobre enfermedades susceptibles a IFN-\gamma. Cuando el polipéptido tiene una actividad mejoradora de la citotoxicidad de células asesinas o inductora de la formación de células asesinas, ejerce un fuerte efecto en el tratamiento de enfermedades graves que incluyen tumores malignos.

El polipéptido del fragmento aislado usado en la presente descripción tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 (donde el símbolo "Xaa" en el resto aminoácido 73 es "isoleucina" o "treonina") e induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. Los ejemplos de una secuencia de aminoácidos homóloga incluyen los que se corresponden con la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 donde uno o más aminoácidos se sustituyen con otros aminoácidos, en la que se añaden uno o más aminoácidos a los extremos N y/o C y donde uno o más aminoácidos en los extremos N y/o C son defectuosos. Puede usarse en la presente descripción cualquier polipéptido, por ejemplo, los aislados de fuentes naturales por cultivo celular o los sintetizados artificialmente por tecnología de ADN recombinante y síntesis peptídica, siempre que tengan las secuencias de aminoácidos y propiedades requeridas.

Desde el punto de vista económico, la tecnología de ADN recombinante se usa ventajosamente en la presente descripción: de acuerdo con la tecnología, los ADN que codifican estas secuencias de aminoácidos se introducen en hospedadores apropiados procedentes de microorganismos y animales para obtener transformantes que después se cultivan de manera habitual en medios de cultivo nutritivos y los cultivos resultantes se purifican por técnicas convencionales usadas para purificar citocinas para obtener el polipéptido objetivo.

Como se ha descrito anteriormente, el polipéptido tiene la propiedad de inducir la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. Cuando se administra a seres humanos, el presente agente para enfermedades susceptibles induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes en el cuerpo y ejerce un efecto terapéutico y/o profiláctico satisfactorio sobre enfermedades susceptibles a IFN-\gamma. El polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 tiene propiedades de mejorar la citotoxicidad de células asesinas tales como células NK, células LAK (células asesinas activadoras de linfocina), células T citotóxicas y de inducir la formación de células asesinas, así como tiene la propiedad de inducir la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, de modo que las células asesinas tratan y/o previenen las enfermedades susceptibles al polipéptido. Por tanto, la expresión "enfermedades susceptibles" como se denomina en la presente memoria descriptiva significa enfermedades en general que incluyen enfermedades susceptibles a IFN-\gamma y las que pueden tratarse directa o indirectamente y/o prevenirse por IFN-\gamma y/o células asesinas: Por ejemplo, enfermedades virales tales como hepatitis, síndrome de herpes, condiloma y SIDA; enfermedades bacterianas tales como Candidiasis y malaria; tumores malignos sólidos tales como cáncer renal, micosis fungoide y enfermedad granulomatosa crónica; tumores malignos de células sanguíneas tales como leucemia de células T del adulto, leucemia mielógena crónica y leucemia maligna; y enfermedades inmunes tales como alergia y reumatismo. Cuando el polipéptido se usa junto con interleucina 3, ejerce un fuerte efecto sobre el tratamiento o la remisión de la leucemia o el mieloma, así como de la leucopenia y trombopenia inducidas por radiaciones y agentes quimioterapéuticos para tratar tumores malignos.

El presente agente puede usarse ampliamente en el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades susceptibles que se han mencionado anteriormente como un agente antitumoral, agente antiviral, antiséptico, agente inmunoterapéutico, agente aumentador de plaquetas y agente aumentador de leucocitos. Aunque varía dependientemente de los tipos de agentes usados para tales propósitos y enfermedades susceptibles a tratar, el presente agente se procesa generalmente en un agente en forma de un líquido, pasta o sólido que contiene el polipéptido en una cantidad del 0,000001-100% p/p, preferiblemente, del 0,0001-0,1% p/p, sobre una base sólida seca (d.s.b.).

El presente agente puede usarse intacto o procesado en composiciones por mezclado con un vehículo, adyuvante, excipiente, diluyente y/o estabilizante fisiológicamente aceptable tal como albúmina sérica, gelatina, sacáridos que incluyen maltosa y trehalosa, etc. y, si es necesario, mezclando adicionalmente con una o más sustancias biológicamente activas adicionales tales como interferón-\alpha, interferón-\beta, interleucina 2, interleucina 3, interleucina 12, TNF-\alpha, TNF-\beta, carboquona, ciclofosfamida, aclarubicina, tiotepa, busulfán, ancitabina, citarabina, 5-fluorouracilo, 5-fluoro-1-(tetrahidro-2-furil)uracilo, metotrexato, actinomicina D, cromomicina A3, daunorubicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina C, vincristina, vinblastina, L-asparaginasa, coloide de radioisótopo de oro, Krestin®, picibanil, lentinán y vacuna de Maruyama. Entre estas combinaciones, la que consiste en el polipéptido y la interleucina 2 es especialmente útil porque la interleucina 2 actúa como un cofactor para el polipéptido cuando el polipéptido induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. El uso de combinación del polipéptido y una interleucina 2 humana natural o recombinante induce un nivel prescrito de producción de IFN-\gamma incluso cuando el polipéptido no induce sustancialmente la producción de IFN-\gamma por células incompetentes.

El uso de combinación del polipéptido y la interleucina 12 consigue un mayor nivel de inductibilidad de IFN-\gamma que no podría conseguirse fácilmente por el uso en solitario de los mismos.

El presente agente para enfermedades susceptibles incluye aquellos en una forma de dosis unitaria que significa un medicamento formado y separado físicamente adecuado para la administración y que contiene el polipéptido en una dosis diaria o en una dosis de 1/40 a varias veces (hasta 4 veces) de la dosis diaria. Son ejemplos de tales medicamentos inyecciones, líquidos, polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, sublinguales, soluciones oftálmicas, gotas nasales y supositorios.

El presente agente puede administrase a los pacientes por vía oral o por vía parenteral y, como se describe a continuación, puede usarse para activar células antitumorales in vitro. En ambas administraciones, el agente ejerce un efecto satisfactorio en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades susceptibles. Aunque varía dependientemente de los tipos de enfermedades susceptibles y de sus síntomas, el agente puede administrase por vía oral a pacientes o administrarse por vía parenteral a los tejidos intradérmicos, tejidos subcutáneos, músculos y venas del paciente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1-50 mg/descarga, preferiblemente, de aproximadamente un \mug/descarga a un mg/descarga, 1-4 veces/día o 1-5 veces/semana, durante de un día a un año.

El agente de acuerdo con la presente descripción también puede usarse en la denominada "inmunoterapia antitumoral" usando interleucina 2. Generalmente, la terapia antitumoral se clasifica de forma general en (i) un método para administrar directamente interleucina 2 al cuerpo de pacientes con tumores malignos y (ii) un método para introducir células antitumorales activadas in vitro por interleucina 2 (inmunoterapia adoptiva). El efecto inmunoterapéutico puede mejorarse significativamente cuando se administra junto con el polipéptido. En el método (i), el polipéptido se administra a pacientes en una cantidad de aproximadamente 0,1 \mug/descarga/adulto a un mg/descarga/adulto 1-10 veces simultáneamente o antes de la administración de interleucina 2. La dosis de interleucina 2 se ajusta generalmente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 10.000 a 1.000.000 unidades/descarga/adulto, aunque varía dependientemente de los tipos de tumores malignos, síntomas de los pacientes y dosis del polipéptido. Mientras, en el método (ii) se cultivan células mononucleares y linfocitos, recogidos de pacientes con tumores malignos, en presencia de interleucina 2 y aproximadamente de un ng a un mg del polipéptido por 1x10^{6} células de estas células sanguíneas. Después de cultivar durante un periodo de tiempo prescrito, se recogieron del cultivo células NK y células LAK y se introdujeron en el cuerpo del paciente. Las enfermedades que pueden tratarse mediante la presente inmunoterapia antitumoral son, por ejemplo, tumores malignos sólidos tales como cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer gástrico, carcinoma de tiroides, cáncer de lengua, carcinoma de vejiga, coriocarcinoma, hepatoma, cáncer prostático, carcinoma de útero, laríngeo, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma maligno, sarcoma de Kaposi, tumor cerebral, neuroblastoma, tumor de ovario, tumor testicular, osteosarcomoa, cáncer de páncreas, cáncer renal, hipernefroma, hemangioendotelioma y tumores malignos de células sanguíneas tales como leucemia y linfoma maligno.

Los siguientes Ejemplos explican la presente invención y la tecnología de ADN recombinante usada en los mismos se conoce por sí misma en la técnica de manera convencional: por ejemplo, tal tecnología se describe por J. Sambrook et al. en "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª edición (1989), publicado por Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Nueva York, Estados Unidos y por Masami MURAMATSU en "Laboratory Manual for Genetic Engineering" (1988), publicado por Maruzen Co., Ltd., Tokio, Japón.

Ejemplo A-1 Preparación de polipéptido purificado

A 600 hembras de ratones CD-1, de 8 semanas de edad, se les inyectó por vía intraperitoneal un mg/ratón de Corynebacterium parvum muerto (ATCC 11827) que se había precalentado a 60ºC durante una hora y los ratones se alimentaron de la forma habitual durante 7 días y se inyectaron por vía intravenosa con un \mug/ratón de un lipopolisacárido purificado procedente de Escherichia coli. 1-2 horas después de la inyección intravenosa, se sacrificaron los ratones para recoger su sangre, seguido de la extirpación de sus hígados, rompiendo los hígados con un homogeneizador en volúmenes de factor 8 de tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) y extracción de la suspensión resultante. El extracto resultante se centrifugó a aproximadamente 8.000 rpm durante 20 min y se mezcló un sobrenadante aproximadamente de 9 l con un sulfato de amonio saturado en tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) para dar un grado de saturación del 45% p/v. La solución resultante se dejó reposar a 4ºC durante 18 horas y se centrifugó a aproximadamente 8.000 rpm durante 30 min para obtener un sobrenadante de aproximadamente 19 l que contenía el presente polipéptido.

El sobrenadante se suministró a una columna llena con aproximadamente 4,6 l de "FENIL SEPHAROSE", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala Suecia, que se había equilibrado con tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) que contenía sulfato de amonio uno M y se lavó la columna con una preparación reciente del mismo tampón y se suministró a una SV (velocidad espacial) de 0,57 con un tampón de gradiente lineal de sulfato de amonio que variaba de 1 M a 0,2 M en tampón fosfato 50 mM (pH 7,3). Las fracciones que contenían el presente polipéptido eluídas en sulfato de amonio 0,8 mM se recogieron y agruparon en una solución de aproximadamente 4,8 l que después se concentró con un filtro de membrana, se dializó frente a tampón fosfato 20 mM (pH 6,5) a 4ºC durante 18 horas y se suministró a una columna llena con aproximadamente 250 ml de "DEAE-SEPHAROSE", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala Suecia. La columna se lavó con una preparación reciente del mismo tampón y se suministró a una SV de 1,2 con un tampón de gradiente lineal de cloruro de sodio que variaba de 0 M a 0,2 M en tampón fosfato 20 mM (pH 6,5) para eluir y recoger fracciones de aproximadamente 260 ml que contenían el presente polipéptido eluído a una concentración de cloruro de sodio aproximadamente 0,13 M.

Las fracciones que contenían el presente polipéptido se recogieron, agruparon, concentraron y dializaron frente a tampón Bis-Tris 25 mM (pH 7,1) a 4ºC durante 18 horas. La solución dializada se aplicó a una columna llena con aproximadamente 24 ml de "MONO-P", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala Suecia y se eluyó con politampón 74 al 10% v/v (pH 4,0) mientras que disminuía el pH de 7 a 4 para obtener un eluato de aproximadamente 23 ml que contenía el presente polipéptido. El eluato se concentró, se suministró a una columna llena con "SUPER-DEX 75", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala Suecia, que se había equilibrado con una solución mixta (pH 7,2) que contenía hidrogenofosfato disódico 7 mM, dihidrogenofosfato sódico 3 mM y cloruro de sodio 139 mM y se sometió a cromatografía de filtración en gel para eluir fracciones, que contenían el presente polipéptido a aproximadamente 19.000 dalton, con una preparación reciente de la misma solución. Las fracciones se agruparon y se concentraron para el uso en el Ejemplo A-2. El rendimiento del presente polipéptido fue aproximadamente de 0,6 \mug/ratón.

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Ejemplo A-2 Secuencia parcial de aminoácidos del polipéptido

Se concentró una parte de una solución acuosa que contenía el polipéptido purificado en el Ejemplo A-1 hasta un volumen de aproximadamente 50 \mul que después se mezcló con 25 \mul de una solución que contenía SDS al 3% p/v, glicerol al 60% v/v y 60 mg/ml de ditiotreitol. La mezcla resultante se incubó a 50ºC durante 30 min, se colocó en gel de poliacrilamida al 15% p/v y se sometió a electroforesis de la manera habitual. El gel resultante se tiñó sumergiéndolo en una solución mixta de una solución acuosa de ácido acético al 10% v/v y metanol acuoso al 50% v/v que contenía azul brillante de coomassie R 250 al 0,1% p/v, se destiñó lavando repetidamente el gel con una solución mixta de metanol acuoso al 12% v/v y solución de ácido acético acuosa al 7% v/v y se lavó sumergiéndolo en agua destilada durante 18 horas. Se recortó una parte del gel, que se tiñó con el azul brillante de coomassie y que contenía el presente polipéptido, y se liofilizó.

El gel liofilizado se sumergió en 0,6 ml de una solución que consistía en hidrogenocarbonato sódico 100 mM que contenía 2 \mug/ml de "TPCK TRYPSIN", cloruro de calcio 0,5 mM y solución de Tween 20 acuosa al 0,02% v/v seguido de la incubación a 37ºC durante 18 horas para tripsinizar la proteína. El producto resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante, mientras que el precipitado resultante se sumergió en un ml de trifluoroacetato acuoso al uno% v/v que contenía Tween 20 al 0,001% v/v, se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente y se centrifugó para obtener un sobrenadante. El precipitado recién formado se trató sucesivamente de manera similar a anteriormente con trifluoroacetato acuoso al 70 v/v que contenía Tween 20 al 0,001 v/v y con acetonitrilo acuoso al 50% v/v para obtener un sobrenadante. El sobrenadante resultante y el sobrenadante ya obtenido anteriormente se agruparon y se concentraron hasta dar 250 \mul que después se filtraron por centrifugación.

La solución acuosa resultante que contenía fragmentos peptídicos se suministró a "HPLC ODS-120T", una columna para HPLC comercializada por Tosoh Corporation, Tokio, Japón, que se había equilibrado previamente con trifluoroacetato acuoso al 0,1 v/v y la columna se lavó con trifluoroacetato acuoso al 0,1% v/v y se suministró con trifluoroacetato al 0,1% v/v a un caudal de 0,5 ml/min mientras que la concentración de acetonitrilo acuoso se aumentaba del 0% v/v al 70% v/v y la concentración del péptido en el eluato se controlaba mediante un espectrofotómetro a longitudes de onda de 214 nm y 280 nm. Las fracciones eluídas a aproximadamente 75 min y aproximadamente 55 min después del inicio de la elución se recogieron respectivamente (en lo sucesivo denominadas en este documento "fragmento peptídico A" y "fragmento peptídico B"). El patrón de elución fue el de la Fig. 1.

Los fragmentos peptídicos A y B se analizaron en MODEL 473 A'', un secuenciador de proteínas comercializado por Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, EEUU y mostraron que tenían las secuencias de aminoácidos en las SEC ID Nº: 4 y 5.

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Ejemplo A-3 Secuencia de bases del ADN que codifica la proteína y secuencia de aminoácidos del polipéptido

Ejemplo A-3-1

Preparación de ARN completo

Se pesaron tres g de células hepáticas de ratón húmedas, preparadas de manera similar por el método del Ejemplo A-1, se sumergieron en 20 ml de una solución mixta que contenía isotiocianato de guanidina 6 M, citrato de sodio 10 mM y SDS al 0,5 p/v y se rompieron con un homogeneizador. Se inyectaron tubos de centrifugación de treinta y cinco ml con 25 ml de EDTA 0,1 M (pH 7,5) que contenía cloruro de cesio 5,7 M y se aplicaron como recubrimiento 10 ml de la suspensión celular homogeneizada en la parte superior de las soluciones en los tubos, seguido de centrifugación de los tubos a 25.000 rpm durante 20 horas para recoger fracciones de ARN. Las fracciones se agruparon, se distribuyeron en tubos de centrifugación de 15 ml y se mezclaron con volúmenes iguales de una solución mixta de cloroformo e isobutanol (= 4:1 en volumen). Los tubos se hicieron vibrar durante 5 min y se centrifugaron a 4ºC y a 10.000 rpm durante 10 min y se recogieron las capas acuosas formadas, se agruparon, se mezclaron con volúmenes de 2,5 veces de etanol y se dejaron reposar a -20ºC durante 2 horas para precipitar los ARN completos. El precipitado se recogió, se agrupó, se lavó con etanol acuoso al 75% v/v y se disolvió en 0,5 ml de agua destilada esterilizada para usar en el Ejemplo A-3-2. El rendimiento de los ARN fue aproximadamente 4 mg, d.s.b.

Ejemplo A-3-2

Preparación de fragmentos de ADN que codifican parcialmente el polipéptido

Se mezcló un \mug de los ARN completos del Ejemplo A-3-1 con 4 \mul de cloruro de magnesio 25 mM, 2 \mul de una solución que consistía en tampón de PCR 10x, tampón Tris-HCl 100 mM (pH 8,3) y cloruro de potasio 500 mM, 8 \mul de mezcla de dNTP uno mM, un \mul de una solución que contenía una unidad/\mul de inhibidor de RNasa, un \mul de una solución que contenía 2,5 unidades/\mul de transcriptasa inversa y un \mul de hexámero aleatorio 2,5 \muM y se mezcló adicionalmente con agua para dar un volumen total de 20 \mul. La solución de mezcla se puso en tubos de reacción de 0,5 ml, y, de manera habitual, se incubó sucesivamente a 25ºC durante 10 min, a 42ºC durante 30 min, a 99ºC durante 5 min y a 5ºC durante 5 min para efectuar la reacción de transcriptasa inversa, seguido de la recuperación de una solución acuosa que contenía la primera cadena de ADNc.

A 20 \mul de la solución acuosa se añadieron 4 \mul de cloruro de magnesio 25 mM, 8 \mul de tampón de PCR 10x, 0,5 \mul de una solución que contenía 2,5 unidades/\mul de ADN polimerasa AmpliTaq comercializada por Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, EEUU y un pmol de cada uno de los cebadores 1 y 2 como un cebador con sentido o un cebador anti-sentido. La solución de mezcla se llevó hasta un volumen de 100 \mul con agua destilada esterilizada, y, de manera habitual, se incubó sucesivamente a 94ºC durante un min, a 45ºC durante 2 min, a 72ºC durante 3 min, de manera cíclica durante 40 ciclos para amplificar un fragmento de ADN, que codifica parcialmente el presente polipéptido, usando la primera cadena del ADNc como un molde. Los cebadores 1 y 2 eran oligonucleótidos, que se sintetizaron químicamente basándose en las secuencias de aminoácidos Pro-Glu-Asn-Ile-Asp-Asp-Ile y Phe-Glu-Asp-Met-Thr-Asp-Ile en las SEC ID Nº: 4 y 5, tenían las secuencias de bases 5'-ATRTCRTCDATRTTYTCNGG-3' y 5'-TTYGARGAYATGACNGAYAT-3'.

Una parte del producto de PCR resultante se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa al 2% p/v, se transfirió a una película de nylon, se fijó con hidróxido de sodio 0,4 N, se lavó con SSC2x, y se secó al aire, se sumergió en una solución de prehibridación que contenía SSPE 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% p/v y 100 \mug/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado y se incubó a 65ºC durante 3 horas. Se sintetizó un oligonucleótido como una sonda 1 que tenía una secuencia de bases de 5'-TTYGARGARATGGAYCC-3' basada en la secuencia de aminoácidos Phe-Glu-Glu-Met-Asp-Pro en la SEC ID Nº: 4 y marcada con [\gamma-^{32}P] ATP y T4 polinucleótido cinasa.

SEC ID Nº: 4:

5

La película de nylon se sumergió en una solución que contenía un pmol de la sonda 1, SSPE 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% p/v y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y se incubó a 45ºC durante 24 horas para efectuar la hibridación. La película de nylon resultante se lavó con SSC 6x y se autorradiografió de manera habitual y mostró que el producto de PCR contenía el fragmento de ADN objetivo.

El producto de PCR restante se mezcló con 50 ng de "pT7 BLUE T", un vector plasmídico comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, una cantidad adecuada de T4 ligasa y se mezcló adicionalmente con ATP 100 mM hasta dar una concentración de un mM, seguido de la incubación a 16ºC durante 18 horas para insertar el fragmento de ADN en el vector plasmídico. El ADN recombinante obtenido de esta manera se introdujo en la cepa Nova Blue de Escherichia coli, un microorganismo de la especie Escherichia coli comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, para obtener un transformante que después se inoculó en una placa de medio que contenía bactotriptona 10 g/l, cloruro de sodio 2,5 g/l, agar bacto 15 g/l, ampicilina 100 mg/l, X-Gal 40 mg/l e isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranósido 23,8 mg/l (en lo sucesivo abreviado en este documento como "IPTG") y se incubó a 37ºC durante 24 horas pata formar colonias. Se aplicó como recubrimiento una película de nylon de manera habitual sobre una placa de medio y se dejó reposar durante aproximadamente 30 segundos para adherir las colonias a la misma. La película de nylon se desprendió después de la placa y se sumergió durante 7 min en una solución que contenía hidróxido de sodio 0,5 N y cloruro de sodio 1,5 M para efectuar la lisis celular. Después de esto, la película de nylon se sumergió adicionalmente durante 3 min en tampón Tris-HCl 0,5 M (pH 7,2) que contenía cloruro de sodio 1,5 M, se lavó con SSC 2x, se sumergió en hidróxido de sodio 0,4 N durante 20 min para fijar el ADN, se lavó con SSC 5x, se secó al aire, se sumergió en una solución de prehibridación que contenía SSPE 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% p/v y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 mg/ml y se incubó a 65ºC durante 3 horas. Las colonias formadas sobre la película de nylon hibridaron de manera habitual con la sonda 1, se lavaron con SSC 6x y se autorradiografiaron de manera similar que anteriormente, seguido de la selección de transformantes que hibridaron fuertemente con la sonda 1.

Los transformantes se inocularon en caldo L (pH 7,2) que contenía ampicilina 100 \mug/ml y se incubaron a 37ºC durante 18 horas, seguido de la recogida de las células del cultivo y recogida de ADN recombinante por el método convencional SDS-base. El análisis del método didesoxi mostró que el ADN recombinante contenía un fragmento de ADN que consistía en secuencias de bases correspondientes a la colocación de bases de 85 a 281 en la SEC ID N: 3.

Ejemplo A-3-3

Preparación de ARNm

Se pusieron 0,05 ml de una solución acuosa que contenía los ARN completos del Ejemplo A-3-1 en un tubo de ensayo, se mezclaron con 0,5 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía EDTA un mM y SDS al 0,1% p/v y se llevó hasta un volumen de un ml con agua destilada esterilizada. Se añadió a la mezcla un ml de "SUPER OLIGOTEX-dT30", un oligo-d(T)_{30}-látex comercializado por Nippon Roche K.K., Tokio, Japón, seguido de la incubación a 65ºC durante 5 min para desnaturalizar los ARN y el enfriamiento durante 3 min en un baño enfriado con hielo. La mezcla resultante se mezcló con 0,2 ml de cloruro de sodio 5 M, se incubó a 37ºC durante 10 min y se centrifugó a 10.000 rpm a 25ºC durante 10 min. Se suspendió el precipitado en forma de un sedimento en 0,5 ml de agua destilada esterilizada y se incubó a 65ºC durante 5 min para extraer el ARNm del oligo-d(T)_{30}-látex. El rendimiento de ARNm fue aproximadamente 5 \mug.

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Ejemplo A-3-4

Preparación de genoteca de ADNc

Se preparó una genoteca de ADNc a partir del ARNm del Ejemplo A-3-3 usando "cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS", un kit de clonación de ADNc comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, EEUU. Los procedimientos se realizaron de la siguiente manera: a un tubo de reacción de 1,5 ml se añadieron sucesivamente 4 \mul de una solución para sintetizar la primera cadena de ADNc, un \mul de solución de pirofosfato sódico, un \mul de una solución de inhibidor de ribonucleasa de placenta humana, 2 \mul de mezcla de desoxinucleósido trifosfato y un \mul de cebador oligo-d(T)_{16}. La mezcla resultante se mezcló con 2 \mul de ARNm del Ejemplo A-3-3, se llevó hasta un volumen de 19 \mul con agua destilada esterilizada, se mezcló con un \mul de una solución que contenía 20 unidades de transcriptasa inversa y se incubó a 42ºC durante 40 min para obtener una mezcla de reacción que contenía la primera cadena de ADNc.

La mezcla obtenida de esta manera se mezcló con 37,5 \mul de una solución para sintetizar la segunda cadena de ADNc, 0,8 unidades de ribonucleasa H procedente de Escherichia coli, 23 unidades de ADN polimerasa y se llevó hasta un volumen de 100 \mul con agua destilada esterilizada. La mezcla resultante se incubó sucesivamente a 12ºC durante 60 min y a 22ºC durante 60 min, se mezcló con 2 unidades de T4 ADN polimerasa y se incubó a 37ºC durante 10 min para obtener una mezcla de reacción que contenía la segunda cadena de ADNc. A la mezcla de reacción se añadieron 4 \mul de EDTA 0,25 M (pH 8,0) para suspender la reacción y la mezcla resultante se extrajo de la manera habitual con fenol y cloroformo y se trató con etanol para precipitar el ADNc objetivo, seguido de la recuperación del precipitado.

Al ADNc obtenido de esta manera se añadieron 2 \mul de tampón L/K, 250 pmol de adaptador de EcoRI y 2,5 unidades de T4 ADN ligasa en este orden y la solución resultante se llevó hasta un volumen de 20 \mul con agua destilada esterilizada y se incubó a 15ºC durante 16 horas para ligar el adaptador de Eco RI a ambos extremos del ADNc. La mezcla de reacción se mezcló con 2 \mul de EDTA 0,25 M para inactivar la enzima restante y se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar el adaptador de Eco RI intacto. Al producto resultante se añadieron 40 \mul de tampón L/K, 80 unidades de T4 polinucleótido cinasa y la mezcla se llevó hasta un volumen de 400 \mul con agua destilada esterilizada seguido de la incubación a 37ºC durante 30 min para metilar los sitios de escisión de Eco RI. La mezcla resultante se extrajo con fenol y cloroformo y se trató con etanol para precipitar el ADN objetivo, seguido de recuperación del ADN. Al ADN se añadieron 1,5 \mul de tampón L/K que contenía una cantidad adecuada de brazos \lambdagt 10 y 2,5 unidades de T4 ADN ligasa y la solución resultante se llevó hasta un volumen de 15 \mul con agua destilada esterilizada, se incubó a 15ºC durante 16 horas para efectuar la ligación y se sometió a un método de empaquetamiento in vitro convencional para obtener un fago que contenía un ADN\lambda recombinante.

Ejemplo A-3-5

Clonación del ADN recombinante

Se infectó de manera habitual un cultivo de siembra de la cepa NM514 de Escherichia coli con el fago del Ejemplo A-3-4 y las células infectadas se inocularon en una placa de agar (pH 7,0) que contenía triptona bacto 10 g/l, extracto de levadura bacto 5 g/l, cloruro de sodio 10 g/l y agar bacto 15 g/l y se incubó a 37ºC durante 16 horas para formar placas. La placa de agar se cubrió con una película de nylon y se dejó reposar durante aproximadamente 30 segundos para que las placas se adhirieran a la misma. La película de nylon se desprendió de la placa y sucesivamente se sumergió en una solución acuosa que contenía hidróxido de sodio 0,5 M y cloruro de sodio 1,5 M durante 7 min y en tampón Tris-HCl 0,5 M (pH 7,0) que contenía cloruro de sodio 1,5 M durante 3 min. La película de nylon se lavó con SSC 2x, se secó al aire, se sumergió en hidróxido de sodio 0,4 N durante 20 min, se lavó con SSC 5x, se secó al aire, se sumergió en una solución que contenía SSPE 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% p/v y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml y se incubó a 65ºC durante 3 horas. Posteriormente, se incubó la película de nylon resultante en una solución que contenía una cantidad adecuada de un fragmento de ADN como la sonda 2 obtenida en el Ejemplo A-3-2 y se marcó con ^{32}P por "READY PRIME DNA LABELLING SYSTEM", un kit marcador de ADN comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, EEUU, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% p/v y 100 \mug/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado y se incubó la mezcla a 60ºC durante 20 horas para efectuar la hibridación. El producto resultante se sometió a radioautografía de manera similar que anteriormente para seleccionar los clones de ADN del fago que hibridaron fuertemente con la sonda 2.

Con técnicas convencionales, se amplificaron los clones en Escherichia coli, seguido de extracción de un ADN recombinante de las células. El ADN recombinante se escindió con Eco RI, una enzima de restricción. El vector plasmídico pUC19 (ATCC 37254) se escindió con la misma enzima de restricción y los fragmentos resultantes de ADN escindido y los fragmentos plasmídicos se ligaron con ADN ligasa para obtener un ADN recombinante que después se introdujo en la cepa JM109 de Escherichia coli (ATCC 53323) por el método de células competentes convencional para obtener un transformante.

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Ejemplo A-3-6

Determinación de la secuencia de bases del ADN y secuencia de aminoácidos del polipéptido

Se inoculó el transformante del Ejemplo A-3-5 en caldo L (pH 7,2) y se cultivó a 37ºC durante 18 horas en condiciones de agitación. Se recogieron las células proliferadas resultantes y se trataron con el método de SDS-base convencional para obtener un ADN recombinante que contenía el ADN de acuerdo con la presente invención. El análisis en un secuenciador automático usando un fluorofotómetro mostró que el ADN recombinante contiene la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 3. La descodificación de la secuencia de bases indicó que codifica la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 3. La secuencia de aminoácidos contiene las secuencias parciales de aminoácidos en las SEC ID Nº: 4 y 5 correspondientes a las colocaciones de los aminoácidos de 79 a 103 y de 26 a 43 en la SEC ID Nº: 3 y esto significa que en ratones, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 3 está también codificado por el ADN en la SEC ID Nº: 3: donde el símbolo "Xaa" significa "metionina" o "treonina".

SEC ID Nº: 5:

6

En los siguientes Ejemplos de A-4 a A-7 se preparó un ADNc, que codifica otro polipéptido que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, a partir de ARNm de hígado humano usando como sonda un fragmento de ADN de la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 3. El ADNc se analizó para la secuencia de bases y se descodificó para determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Se dejó expresar el ADNc en Escherichia coli, seguido del estudio de las características y propiedades del polipéptido formado.

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Ejemplo A-4

Secuencia de bases del ADN que codifica el polipéptido y secuencia de aminoácidos del polipéptido

Ejemplo A-4-1

Preparación de una genoteca de ADNc

Se preparó una genoteca de ADNc a partir de un ARN de hígado humano suplementado con "POLY A", un producto comercializado por Clonatec-BIOSOFT, Paris Cedex, Francia, usando "cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS", un kit de clonación de ADNc comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, EEUU. Los procedimientos fueron los siguientes: a un tubo de reacción de 1,5 ml se añadieron sucesivamente 10 \mul de una solución para sintetizar la primera cadena de ADNc, 2,5 \mul de pirofosfato de sodio uno mM, 2,5 \mul de una solución que contenía un \mug/l de un inhibidor de ribonucleasa de placenta humana, 5 \mul de una solución que contenía un \mug/l de una mezcla de desoxinucleótido trifosfato, 2,5 \mul de una solución que contenía un \mug/l de cebador de oligo-dT, 5 \mul de un ARN de hígado humano suplementado con poli(A) y se llevó hasta un volumen de 45 \mul con agua destilada esterilizada. Posteriormente, la mezcla resultante se mezcló con 5 \mul de una solución que contenía 100 unidades de una transcriptasa inversa y se incubó a 42ºC durante 40 min hasta obtener una mezcla de reacción que contenía la primera cadena del ADNc.

A la mezcla de reacción se añadieron 93,5 \mul de una solución para sintetizar la segunda cadena del ADNc, 4 unidades de ribonucleasa H procedentes de Escherichia coli, 115 unidades de ADN polimerasa y se llevó hasta un volumen de 250 \mul con agua destilada esterilizada. La mezcla resultante se incubó sucesivamente a 12ºC durante 60 min, a 22ºC durante 60 min y a 70ºC durante 10 min, se mezcló con 10 unidades de T4 polimerasa y se incubó adicionalmente a 37ºC durante 10 min. A la mezcla de reacción se añadieron 10 \mul de EDTA 0,25 M (pH 8,0) para suspender la reacción y la mezcla resultante se extrajo de la manera habitual con fenol y cloroformo y se trató con etanol para precipitar la segunda cadena de ADNc objetivo, seguido de recuperación del precipitado.

A la segunda cadena de ADNc obtenida de esta manera se añadieron 2 \mul de tampón L/K (pH 8,0), 250 pmoles de adaptador de Eco RI y 2,5 unidades de T4 ADN ligasa y la solución resultante se llevó hasta un volumen de 20 \mul con agua destilada esterilizada y se incubó a 15ºC durante 16 horas para ligar el adaptador de Eco RI a ambos extremos del ADNc. La mezcla resultante se mezcló después con 2 \mul de EDTA 0,25 M para suspender la reacción y se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar el adaptador de Eco RI intacto. Al producto resultante se añadieron 40 \mul de tampón L/K (pH 8,0) y 80 unidades de T4 polinucleótido cinasa y la mezcla se llevó hasta un volumen de 400 \mul con agua destilada esterilizada, seguido de la incubación a 37ºC durante 30 min para metilar los sitios de escisión de Eco RI. La mezcla resultante se extrajo con fenol y cloroformo y se trató con etanol para precipitar el ADNc objetivo, seguido de recuperación del ADNc. Al ADNc se añadieron 1,5 \mul de tampón L/K (pH 8,0) que contenía una cantidad adecuada de brazos \lambdagt 10 y 2,5 unidades de T4 ADN ligasa y la solución resultante se llevó hasta un volumen de 15 \mul con agua destilada esterilizada, se incubó a 15ºC durante 16 horas para efectuar la ligación y se sometió al método de empaquetamiento in vitro convencional para obtener un fago que contenía un ADN\lambda recombinante.

Ejemplo A-4-2

Clonación del ADN recombinante

Se infectó de manera habitual un cultivo de siembra de la cepa NM514 de Escherichia coli con el fago del Ejemplo A-4-1 y las células infectadas se inocularon en una placa de agar (pH 7,0) que contenía triptona bacto 10 g/l, extracto de levadura bacto 5 g/l, cloruro de sodio 10 g/l y agar bacto 15 g/l y se incubó a 37ºC durante 16 horas para formar placas. De acuerdo con el método convencional, la placa de agar se cubrió con una película de nylon y se dejó reposar durante aproximadamente 30 segundos que las placas se adhirieran a la misma. Posteriormente, la película de nylon se desprendió de la placa y se sumergió sucesivamente en una solución acuosa que contenía hidróxido de sodio 0,5 N y cloruro de sodio 1,5 M durante 7 min y en tampón Tris-HCl 0,5 M (pH 7,0) que contenía cloruro de sodio 1,5 M durante 3 min. La película de nylon se lavó con SSC 2x, se secó al aire, se sumergió en hidróxido de sodio 0,4 N durante 20 min, se lavó con SSC 5x, se secó al aire, se sumergió en una solución que contenía SSPE 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% p/v y ADN de esperma de salmón desnaturalizado y se incubó a 65ºC durante 3 horas. Para clonar el ADN recombinante objetivo, se marcó con ^{32}P un fragmento de ADN que tenía la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 3 mediante "READY PRIME DNA LABELLING SYSTEM", un kit marcador de ADN comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, EEUU, para obtener la sonda 3. Los procedimientos fueron los siguientes: se pusieron en un tubo de reacción de 1,5 ml 25 ng de un fragmento de ADN preparado por el método del Ejemplo A-3-5, se llevaron hasta un volumen de 45 \mul de agua destilada esterilizada, se incubaron a 95ºC durante 3 min y se transfirieron a otro tubo de reacción. Se añadieron cinco \mul de solución [\alpha-^{32}P]dCTP al tubo de reacción y se marcaron incubando los mismos a 37ºC durante 30 min. Posteriormente, el producto resultante que contenía el fragmento de ADN marcado se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño convencional para eliminar el [\alpha-^{32}P] intacto.

La película de nylon anterior se sumergió en una solución de mezcla que contenía SSPE 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% p/v y 100 \mug de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y la mezcla se incubó a 60ºC durante 20 horas para efectuar la hibridación y se incubó adicionalmente a temperatura ambiente en SSC 6x durante 20 min y en SSC 2x durante 20 min. El producto resultante se lavó y se sometió a autorradiografía de manera similar a la anterior para seleccionar clones de ADN del fago que hibridaron fuertemente con la sonda 3. Con técnicas convencionales, los clones de ADN se amplificaron en Escherichia coli, seguido de la extracción de un ADN recombinante de las células. El ADN recombinante se escindió con Eco RI, una enzima de restricción. El vector plasmídico pUC19 (ATCC 37254) se escindió con la misma enzima de restricción y los fragmentos de ADN escindidos y los fragmentos plasmídicos se ligaron con ADN ligasa para obtener un ADN recombinante que después se introdujo en la cepa JM109 de Escherichia coli (ATCC 53323) por el método de células competentes convencional para obtener un transformante que contenía el presente ADN.

Ejemplo A-4-3

Determinación de la secuencia de bases y secuencia de aminoácidos de polipéptido

Se inoculó el transformante del Ejemplo A-4-2 en caldo L (pH 7,2) que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivó a 37ºC durante 18 horas en condiciones de agitación. Se recogieron las células proliferadas por centrifugación y se trataron con el método de SDS-base convencional para extraer un ADN recombinante. El análisis de la secuencia de bases en un secuenciador automático usando un fluorofotómetro mostró que el ADN recombinante contiene la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 6. La secuencia de aminoácidos estimable a partir de la secuencia de bases se muestra también en la SEC ID Nº: 6, y esto indica que el presente polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, la de la SEC ID Nº: 1 y que el polipéptido está codificado por el ADN de la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 2. En la SEC ID Nº: 6, el aminoácido que se muestra por "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina".

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Ejemplo A-5 Preparación de ADN recombinante replicable y transformante

A un tubo de reacción de 0,5 ml se añadieron 8 \mul de cloruro de magnesio 25 mM, 10 \mul de tampón de PCR 10x, 8 \mul de una mezcla de dNTP uno mM, 0,5 \mul de una solución que contenía ADN polimerasa AmpliTaq 2,5 unidades/\mul y un ng del ADN recombinante del Ejemplo A-4-2. La mezcla resultante se mezcló con cantidades adecuadas de 2 oligonucleótidos, como un cebador de secuencia o cebador anti-sentido, que tiene las secuencias de bases representadas por 5'-CGAGGGATCCTACTTTGGCAAGCTTG-3' y 5'-CAAGGAATTCCTAGTCTTCGTTTTG-3' que se habían sintetizado químicamente basándose en las secuencias próximas a los extremos N y C en la SEC ID Nº: 1 y se llevó hasta un volumen de 100 \mul con agua destilada esterilizada. La mezcla resultante se incubó sucesivamente de la manera habitual a 94ºC durante un min, a 60ºC durante 2 min y a 72ºC durante 3 min y este ciclo de incubación se repitió 40 veces para obtener un producto de PCR que después se escindió con Bam HI y Eco RI como enzimas de restricción para obtener un fragmento de ADN de Bam HI-Eco RI. El fragmento resultante de ADN de Bam HI-Eco RI se mezcló con una cantidad adecuada de agua destilada esterilizada. La solución se mezcló con 10 ng de "pGEX-2T", un vector plasmídico comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, que se había escindido previamente con Bam HI y Eco RI como enzimas de restricción, 10 \mul de tampón de ligación 10x y una cantidad adecuada de ATP 10 mM para dar una concentración final de un mM seguido de la incubación a 16ºC durante 18 horas para obtener el pHIGIF de ADN recombinante replicable.

El pHIGIF de ADN recombinante se introdujo en la cepa DH5\alpha de Escherichia coli comercializada por Toyobo Co., Ltd.,Tokio, Japón y el transformante resultante "HIGIF" se inoculó en caldo L (pH 7,2) que contenía ampicilina 50 \mul/ml y se incubó a 37ºC durante 18 horas en condiciones de agitación. El cultivo resultante se centrifugó para obtener los transformantes proliferados que después se sometieron al método de SDS-base convencional para extraer el pHIGIF de ADN recombinante. El análisis del pHIGIF recombinante por el método didesoxi mostró que como se muestra en la Fig. 2 el "ADNc de HIGIF" o el ADNc en la SEC ID Nº: 2 se ligó a los sitios cadena abajo de los genes para el promotor Tac y la glutatión S-transferasa.

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Ejemplo A-6 Producción del polipéptido a partir del transformante

El transformante HIGIF del Ejemplo A-5 se inoculó en caldo T (pH 7,2) que contenía 50 \mul/ml de ampicilina y se incubó a 37ºC durante 18 horas en condiciones de agitación para obtener un cultivo de siembra. Se pusieron alícuotas de dieciocho l de una preparación reciente de caldo T (pH 7,2) en fermentadores de tanque de 30 l, se inocularon con un un% v/v del cultivo de siembra y se cultivaron a 37ºC en condiciones de aerobiosis-agitación. Durante el cultivo, se muestreó y se controló el cultivo para absorbancia a una longitud de onda de 650 nm, y cuando la absorbancia alcanzó aproximadamente 1,5, se añadió IPTG al cultivo hasta dar 0,1 mM. Posteriormente, el cultivo se incubó adicionalmente durante otras 5 horas y se centrifugó para separar las células del cultivo. Las células se suspendieron en una solucion de mezcla (pH 7,2) que contenía cloruro de sodio 139 mM, hidrogenofosfato disódico 7 mM y dihidrogenofosfato sódico 3 mM, se trató de manera habitual con ultrasonidos y se centrifugó para obtener un sobrenadante.

El sobrenadante se suministró a una columna llena con "GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala Suecia que previamente se había equilibrado con una solución de mezcla (pH 7,2) que contenía cloruro de sodio 139 mM, hidrogenofosfato disódico 7 mM y dihidrogenofosfato sódico 3 mM. La columna se lavó con una preparación reciente de la misma solución de mezcla y se añadieron 100 U de trombina a un ml de gel en la columna para efectuar la reacción de escisión enzimática mientras que se dejaba reposar la columna a temperatura ambiente durante 16 horas. Se suministró a la columna una preparación reciente de la misma solución de mezcla para eluir el producto de reacción y el eluato se suministró a una columna llena con "SUPERDEX 75", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala Suecia, seguido de recogida de fracciones correspondientes próximas a 18.500 dalton. Las fracciones se agruparon, se concentraron y se liofilizaron para obtener un producto sólido que contenía el presente polipéptido con un rendimiento de aproximadamente 80 \mug por un l de cultivo.

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Ejemplo A-7 Propiedades fisicoquímicas del polipéptido

Ejemplo A-7-1

Peso molecular

De acuerdo con el método descrito por U. K. Laemmli en Nature, Vol. 227, págs. 680-685 (1970), el polipéptido purificado preparado por el método del Ejemplo A-6 se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico (SDS) sin agente reductor para mostrar principalmente una única banda de proteína con una inductibilidad de IFN-\gamma en una posición correspondiente a aproximadamente 18.5000\pm3.000 dalton. Las proteínas marcadoras usadas en este experimento fueron albúmina sérica de ternero (PM=67.000 dalton), ovoalbúmina (PM=45.000 dalton), inhibidor de tripsina de semilla de soja (PM=20.100 dalton) y \alpha-lactalbúmina (PM=14.400 dalton).

Ejemplo A-7-2

Punto isoeléctrico

El polipéptido purificado en el Ejemplo A-6 se sometió a cromatoenfoque para mostrar un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,9\pm1,0.

Ejemplo A-7-3

Secuencia de aminoácidos que contiene el extremo N

El polipéptido purificado en el Ejemplo A-6 se analizó en un "MODEL 473 A", un secuenciador de proteínas comercializado por Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, EEUU y mostró que tiene la estructura en la que un péptido, "Gly-Ser-", se acopla al resto de tirosina en la secuencia de aminoácidos N-terminal en la SEC ID Nº: 7 por la adición de glutatión S-transferasa y por escisión con trombina.

SEC ID Nº: 7:

7

Ejemplo A-7-4 (a)

Actividad biológica

De ratones hembra C3H/HeJ, de 8 semanas de edad, se extirparon sus bazos que después se suspendieron en medio RPMI 1640 sin suero (pH 7,4) y se lavaron las células resultantes con una preparación reciente del mismo medio y se sumergieron en solución Gey (pH 8,0) para efectuar la hemólisis. Los esplenocitos esplénicas resultantes se suspendieron en medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con suero de ternero al 10% v/v para dar una densidad celular de 1x10^{7} células/ml. Se distribuyeron alícuotas de diez ml de la suspensión celular en placas petri de plástico, de 9 cm de diámetro y se incubaron a 37ºC durante una hora en una incubadora con CO_{2} al 5% v/v. Solamente se recogieron las células que flotaban en los cultivos resultantes y se lavaron con medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con suero de ternero al 10% v/v para usar en el siguiente ensayo para inducción de IFN-\gamma.

Los esplenocitos de ratón se suspendieron en medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con suero de ternero al 10% v/v para dar una densidad celular de 1x10^{7} células/ml y se inyectaron alícuotas de 0,15 ml de los mismos en microplacas de 96 pocillos, seguido de la adición a cada pocillo de 0,05 ml de una solución de un polipéptido purificado diluido con una preparación reciente del mismo medio e incubación de las células con o sin la adición de 0,05 ml de 2,5 \mug/ml de concavalina A o 50 unidades/ml de interleucina 2 e incubación del producto resultante a 37ºC durante 24 horas en una incubadora con CO_{2} al 5% v/v. Después de finalizar el cultivo, el sobrenadante resultante en cada pocillo se muestreó tomando 0,1 ml para ensayar la actividad del IFN-\gamma formado con inmunoensayo enzimático. Como control, se proporcionó un sistema similar al sistema anterior y se trató de manera similar que anteriormente a excepción de que no se usó el polipéptido purificado, la concavalina A ni la interleucina 2. Como un patrón de IFN-\gamma se usó una preparación de IFN-\gamma de ratón Gg02-901-533, obtenida del Instituto Nacional de Salud, EEUU y se expresó la actividad en unidades internacionales (UI). Los resultados fueron los de la Tabla 1.

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TABLA 1

8

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Ejemplo A-7-4 (b)

Inducción de la producción de IFN-\gamma de linfocitos humanos

Usando una jeringa que contenía heparina, se extrajo sangre de un donante sano que se diluyó después 2 veces con medio RPMI 1640 sin suero (pH 7,4) y se aplicó sobre ficoll. El producto resultante se centrifugó a 2.000 rpm durante 20 min para obtener linfocitos que después se lavaron con medio RPMI 1640 (pH 7,4) complementado con suero de ternero al 10% v/v, se suspendió en una preparación reciente del mismo medio para dar una densidad celular de 5x10^{6} células/ml y se trató de manera similar al Ejemplo A-7-4 (a) a excepción de que se usó un patrón de IFN-\gamma humano, Gg23-901-530, obtenido del Instituto Nacional de Salud, EEUU, como un patrón de IFN-\gamma. Los resultados fueron los de la Tabla 2.

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TABLA 2

10

Los resultados en las Tablas 1 y 2 prueban que el presente polipéptido tiene una actividad de inducción de producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes de mamífero que incluyen ser humano y ratón. En los grupos de control, no se encontró ninguna producción significativa de IFN-\gamma, mientras que en los sistemas con el polipéptido se observó una producción significativa de IFN-\gamma. Esta actividad del polipéptido está fuertemente aumentada cuando se usa en combinación con concavalina A o interleucina 2 como cofactor.

Ejemplo A-7-4 (c)

Producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes

Se recogió sangre reciente de voluntarios sanos con jeringas heparinizadas y se diluyó con medio RPMI 1640 sin suero (pH 7,4) 2 veces. La sangre diluida se aplicó sobre Ficoll y se centrifugó para obtener linfocitos que después se lavaron con medio RPMI 1640 (pH 7,4) complementado con suero fetal de ternero al 10% v/v y se suspendió en una preparación reciente del mismo medio para dar una densidad celular de 5x10^{6} células/ml. La suspensión celular se distribuyó en microplacas de 96 pocillos en una cantidad de 0,15 ml/pocillo.

Se diluyó un polipéptido obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 para dar una concentración apropiada con medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con suero fetal de ternero al 10% v/v y la solución diluida se distribuyó en microplacas en una cantidad de 0,05 ml/pocillo, seguido de adición a las microplacas de 0,05 ml/pocillo de una preparación reciente del mismo medio complementado con o sin 2,5 \mug/ml de concavalina A o 50 unidades/ml de una interleucina 2 humana recombinante e incubación de las microplacas a 37ºC durante 24 horas en una incubadora en condiciones de CO_{2} al 5% v/v. Después del cultivo, se muestrearon 0,1 ml de un sobrenadante de cultivo en cada pocillo y se ensayaron para el contenido de IFN-\gamma con inmunoensayo enzimático convencional. Como control, se proporcionó un sistema sin el polipéptido y se trató de manera similar a la anterior. Los resultados fueron los de la Tabla 3. En la Tabla, el contenido de IFN-\gamma se calibró usando Gg23-901-530, un Patrón Internacional para Interferón Humano (HuIFN-\gamma), obtenido del Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, EEUU y se expresó en unidades internacionales (UI).

11

Los resultados de la Tabla 3 muestran que los linfocitos como una célula inmunocompetente produce IFN-\gamma cuando el polipéptido actúa sobre los mismos. Como es evidente a partir de los resultados, el uso de combinación del polipéptido e interleucina 2 o concavalina A como un cofactor mejoró la producción de IFN-\gamma.

Ejemplo A-7-4 (d)

Mejora de la citotoxicidad por células NK

Se recogió sangre fresca de voluntarios sanos con jeringas heparinizadas y se diluyó 2 veces con tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) que contenía cloruro de sodio 140 mM. La sangre se aplicó sobre PERCOLL y el producto resultante se centrifugó y se sometió adicionalmente a centrifugación en gradiente de PERCOLL para obtener linfocitos de alta densidad.

Los linfocitos se suspendieron en medio RPMI 1649 (pH 7,2) que contenía kanamicina 10 \mug/ml, 2-mercaptoetanol 5x10^{-5} M y suero fetal de ternero al 10% v/v para dar una densidad celular de 1x10^{6} células/ml y la suspensión se distribuyó en microplacas de 12 pocillos en una cantidad de 0,5 ml/pocillo. Se diluyó apropiadamente un polipéptido obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 con una preparación reciente del mismo medio y la solución diluida se distribuyó en las microplacas en una cantidad de 1,5 ml/pocillo, seguido de distribución a las microplacas de 0,5 ml/pocillo de una preparación reciente del mismo medio con o sin 50 unidades/ml de una interleucina 2 humana recombinante, incubación de las microplacas en una incubadora a 37ºC durante 24 horas en condiciones de CO_{2} al 5% v/v, lavado de las microplacas con tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) que contenía cloruro de sodio 140 mM para obtener linfocitos cultivados que contenían células NK como una célula efectora. Se distribuyeron células K-562 (ATCC CCL 243), procedentes de leucemia mielógena crónica humana, como una célula diana susceptible a las células NK que se había marcado de la manera habitual con ^{51}Cr, en microplacas de 96 pocillos para dar 1x10^{4} células/pocillo y se añadieron las células efectoras a cada pocillo en la proporción ((células efectoras):(células diana)) de 2,5:1, 5:1 ó 10:1 y se incubaron en una incubadora a 37ºC durante 4 horas en condiciones de CO_{2} al 5% v/v. De acuerdo con el método convencional, se midió la radioactividad de cada sobrenadante en cada pocillo para contar las células diana muertas. En cada sistema, se calculó el porcentaje (%) de las células diana muertas con respecto a las células diana para determinar el nivel de citotoxicidad. Los resultados fueron los de la Tabla 4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

12

Los resultados de la Tabla 4 muestran que el polipéptido tiene una actividad mejoradora de la citotoxicidad por células NK. Como se muestra en la Tabla 4, la coexistencia de interleucina 2 mejora más la citotoxicidad.

Ejemplo A-7-4 (e)

Inducción de la formación de células LAK

De acuerdo con la manera convencional, se pusieron células Raji marcadas con ^{51}Cr (ATCC CCL 86), procedentes de linfoma de Burkitt humano como una célula diana no susceptible a células NK, en microplacas de 96 pocillos para dar 1x10^{4} células/pocillo y se cultivaron durante 72 horas. Se añadieron a las microplacas linfocitos cultivados, que contenían células LAK como una célula efectora preparadas de manera similar al Ejemplo A-7-4 (d) y células diana en la proporción de 5:1, 10:1 ó 20:1 y las microplacas se incubaron en una incubadora a 37ºC durante 4 horas en condiciones de CO_{2} al 5% v/v. Posteriormente se midió la radioactividad de cada sobrenadante en cada pocillo y se calculó la citotoxicidad (%) de manera similar al Ejemplo A-7-4 (d). Los resultados fueron los de la Tabla 5.

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(Tabla pasa a página siguiente)

13

Los resultados de la Tabla 5 muestran que el polipéptido tiene una actividad inductora de la formación de células LAK. Como se muestra en los resultados, la coexistencia de interleucina 2 mejora más la inducción.

Ejemplo A-7-4 (f)

Ensayo de toxicidad aguda

De acuerdo con la manera convencional, se administró un polipéptido purificado obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 por vía percutánea, por vía peroral o por vía intraperitoneal a ratones de 8 semanas de edad. Como resultado, la DL_{50} del polipéptido purificado fue aproximadamente de un mg/kg o superior independientemente de las vías de administración. Esto evidencia que el polipéptido puede incorporarse de forma segura en productos farmacéuticos para la administración a seres humanos.

Como es bien conocido, los IFN-\gamma se relacionan profundamente con la biofilaxis en seres humanos a través de la protección infecciosa frente a bacterias, actividad inhibidora del crecimiento para tumores malignos y actividad inmunorreguladora. Como se ha descrito anteriormente, los IFN-\gamma se han desarrollado como un agente para enfermedades susceptibles humanas y se estudiaron sustancialmente las enfermedades objetivo, dosis, vías de administración y seguridad. Como se describe en "Cytokines in Cancer Therapy", editado por Frances R. Balkwill, traducido por Yoshihiko WATANABE (1991), publicado por Tokyo-Kagaku-Dojin, Tokio, Japón, se describe que se obtuvieron resultados casi satisfactorios cuando se aplicó el tratamiento que usa células asesinas tales como células NK y células LAK sobre una diversidad de enfermedades humanas que incluyen inmunoterapia antitumoral. Recientemente, se ha observado que existe una relación entre el efecto terapéutico y la inducción de células asesinas o la mejora de la citotoxicidad por células asesinas usando citocinas. Por ejemplo, T. FUJIOKA describió en "British Journal of Urology", Vol. 73, Nº 1, págs. 23-31 (1994) que, en la inmunoterapia antitumoral que usa células LAK e interleucina 2, la interleucina 2 indujo fuertemente la formación de células LAK y ejerció una notable actividad inhibidora de metástasis cancerosa en cánceres humanos sin inducir efectos secundarios graves.

Por tanto, se muestra que los IFN-\gamma y las células asesinas se relacionan profundamente con el tratamiento y/o la prevención de una diversidad de enfermedades humanas y contribuyen enormemente a su tratamiento o remisión completa. En estas circunstancias y como es evidente a partir de los resultados de los Ejemplos A-7-4 (c) y A-7-4 (f), el polipéptido induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes y mejora la citotoxicidad por células NK o induce la formación de células LAK sin provocar efectos secundarios graves. Estos hechos muestran que las presentes enfermedades susceptibles pueden administrarse repetidamente a seres humanos sin inducir efectos secundarios graves y ejerce un efecto satisfactorio en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades estrechamente relacionadas con IFN-\gamma y células asesinas.

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Ejemplo B-1 Preparación del Hibridoma H-1

Ejemplo B-1-1

Preparación del transformante KGFHH2

A un tubo de reacción de 0,5 ml se añadieron 8\mul de cloruro de magnesio 25 mM, 10 \mul de tampón de PCR 10x, un \mul de mezcla de dNTP 25 mM, un \mul de 2,5 unidades/\mul de ADN polimerasa AmpliTaq, un ng de ADN recombinante que contenía la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 8 preparado a partir de un clon de ADN del fago y que contenía un ADN que codifica el polipéptido en la SEC ID Nº: 1 y una cantidad adecuada de un cebador con sentido y un cebador anti-sentido representado por 5'-ATAGAATTCAAATGTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3', sintetizado químicamente basándose en una secuencia de aminoácidos próxima al extremo N y C de la SEC ID Nº: 1 y 5'-ATAAAGCTTCTAGTCTTCGTTTTGAAC-3' y la solución de la mezcla se aumentó de volumen con agua destilada esterilizada para dar un volumen total de 100 \mul. La solución de mezcla se incubó sucesivamente de manera habitual a 94ºC durante un min, a 43ºC durante un min y a 72ºC durante un min y esta incubación secuencial se repitió 3 veces. La mezcla resultante se incubó adicionalmente de manera sucesiva a 94ºC durante un min, a 60ºc durante un min y a 72ºC durante un min y esta incubación secuencial se repitió 40 veces para efectuar la reacción de PCR.

La mezcla de reacción de PCR resultante y "pCR-Script SK (+)", un vector plasmídico comercializado por Stratagene Cloning Systems, California, EEUU, se ligaron con ADN ligasa para obtener un ADN recombinante que después se introdujo con célula competente en "Escherichia coli XL-1 Blue MRF'Kan", un microorganismo comercializado por Stratagene Cloning Systems, California, EEUU, para transformar el microorganismo. El transformante obtenido de esta manera se inoculó en caldo L (pH 7,2) que contenía ampicilina 50 \mul/ml y se cultivó a 37ºC durante 18 horas en condiciones de agitación, seguido de centrifugación del cultivo resultante para recoger los transformantes proliferados y aislamiento de los ADN recombinantes con el método de SDS-base convencional. Se proporcionó una parte de los ADN recombinantes y se analizó por el método didesoxi y mostró que contenía un ADN que tiene sitios de escisión Eco RI y Hind III en los extremos 5' y 3' de la SEC ID Nº: 8, un codón de metionina que inicia la síntesis del polipéptido y se coloca en los sitios correspondientes a los anteriores y posteriores a los extremos N y C de la SEC ID Nº: 8 y un codón TAG que termina la síntesis del polipéptido.

SEC ID Nº: 8:

14

Los ADN recombinantes restantes se escindieron con enzimas de restricción Eco RI y Hind III y 0,1 \mug del fragmento de ADN Eco RI-Hind III resultante obtenido con "DNA LIGATION KIT Versión 2", un kit de ligación de ADN comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd, Tokio, Japón y 10 ng de "pKK223-3", un vector plasmídico comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, que previamente se había escindido con las anteriores enzimas de restricción, se ligaron incubándolos a 16ºC durante 30 min para obtener un "pKGFHH2" de ADN recombinante replicable. Usando el método de células competentes, se transformó la cepa Y1090 de Escherichia coli (ATCC 37197) con el pKGFHH2 de ADN recombinante replicable y el transformante formado "KGFHH2" se inoculó en caldo L (pH 7,2) que contenía ampicilina 50 \mug/ml y se incubó a 37ºC durante 18 horas en condiciones de agitación. El cultivo resultante se centrifugó para recoger los transformantes proliferados y una parte de los mismos se trató con el método SDS-alcalino convencional para extraer el pKGFHH2 del ADN recombinante. Como se muestra en la Figura 3, el análisis del método didesoxi mostró que, en el pKGFHH2 de ADN recombinante, el ADNc de KGFHH2 que contenía la secuencia de bases en la SEC ID Nº: 8 se ligó cadena abajo de un promotor Tac.

Ejemplo B-1-2

Producción del polipéptido a partir del transformante KGFHH2

Se esterilizó por autoclave un caldo L (pH 7,2) que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se enfrió a 37ºC, se inoculó con el transformante KGFHH2 del Ejemplo B-1-1 y se incubó a la misma temperatura durante 18 horas en condiciones de agitación para obtener un cultivo de siembra. Se pusieron 18 l de una preparación reciente del mismo medio en un fermentador de tanque de 20 l, se esterilizó de manera similar a la anterior, se enfrió a 37ºC, se inoculó con un % v/v de cultivo de siembra y se cultivó a la misma temperatura durante 8 horas en condiciones de aerobiosis y agitación. El cultivo resultante se centrifugó para recoger las células que después se suspendieron en una solución de mezcla (pH 7,3) que consiste en cloruro de sodio 150 mM, hidrogenofosfato disódico 16 mM y dihidrogenofosfato sódico 4 mM, se rompieron con ultrasonido y se centrifugaron para eliminar restos celulares para obtener un sobrenadante.

Se añadió sulfato de amonio al sobrenadante hasta dar una concentración del 40% p/v y se disolvió hasta homogeneidad y la solución se centrifugó para obtener un sobrenadante. El sobrenadante se mezcló primero con tampón fosfato 150 mM (pH 6,6) que contenía sulfato de amonio 1,5 M, después se suministró a una columna llena con "FENIL SEPHAROSE", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, que previamente se había equilibrado con tampón fosfato 10 mM (pH 6,6) que contenía sulfato de amonio 1,5 M, seguido de lavado de la columna con una preparación reciente del mismo tampón y suministrando a la columna un tampón de gradiente de sulfato de amonio que variaba de 1,5 M a 0 M en tampón fosfato 10 mM (pH 6,6).

Las fracciones eluídas en sulfato de amonio aproximadamente 1,0 mM se agruparon, se filtraron por membrana, se dializaron frente a tampón fosfato 10 mM (pH 6,5) a 4ºC durante 18 horas y se suministraron a una columna llena con "DEAE 5PW", un producto comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón, que previamente se había equilibrado con tampón fosfato 10 mM (pH 6,5), seguido de lavado de la columna con una preparación reciente del mismo tampón y suministrado a la columna un tampón de gradiente lineal de cloruro de sodio que variaba de 0 M a 0,2 M en tampón fosfato 10 mM (pH 6,5) mientras se recogían las fracciones que eluían en cloruro de sodio 0,05 M.

Posteriormente, las fracciones se concentraron con una membrana y se suministraron a una columna llena con "SUPER DEX 75", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, que se había equilibrado con solución salina tamponada con fosfato (en lo sucesivo abreviado en este documento como "PBS"), seguido del suministro a la columna de una preparación reciente de PBS para recoger fracciones correspondientes a aproximadamente 18.500 dalton. Por tanto, se obtuvo una solución acuosa que contenía aproximadamente 5,2 mg de una proteína purificada. El rendimiento total a lo largo de la purificación fue aproximadamente del 10%.

Se analizó la proteína purificada y se encontró que tenía las siguientes propiedades fisicoquímicas: cuando se sometía a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en condiciones reductoras, la proteína purificada aparecía como una banda de proteína principal que tenía una inductibilidad de IFN-\gamma en una posición correspondiente a 18.500\pm3.000 dalton, mientras que daba un pI de 4,9\pm1,0 por cromatoenfoque. La secuencia de aminoácidos que contenía el extremo N de la proteína purificada tenía la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 9 igual a la de la SEC ID Nº: 1 donde la metionina se acoplaba a su extremo N.

SEC ID Nº: 9:

15

Ejemplo B-1-3

Preparación del hibridoma H-1

Se inyectaron por vía intraperitoneal ratones BALB/c, de 10 semanas de edad, con 20 \mug/ratón de un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, junto con un adyuvante completo de Freund. Se inyectó adicionalmente a los ratones dos veces con la misma dosis a un intervalo de 2 semanas y por vía intravenosa se inyectaron con la misma dosis una semana después de la inyección final y se extirparon y se suspendieron sus bazos para obtener una suspensión celular.

Se suspendieron esplenocitos y células SP2/O-Ag14 de mieloma de ratón (ATCC CRL 1581) en medio RPMI 1640 (pH 7,2) precalentado a 37ºC a densidades celulares de 3x10^{4} células/ml y 1x10^{4} células/ml, respectivamente y se centrifugaron para recoger el sedimento. Se añadió gota a gota al sedimento durante un minuto, un ml de un medio RPMI 1640 sin suero (pH 7,2), que contenía polietilenglicol al 50% p/v con un peso molecular promedio de 1.500 dalton y se incubó la mezcla a 37ºC durante un min, seguido de adición gota a gota a la mezcla de un medio RPMI 1640 sin suero (pH 7,2) hasta dar un volumen total de 50 ml, se centrifugó la mezcla y se recogió el sedimento formado. El sedimento obtenido de esta manera se suspendió en medio HAT, se distribuyó en microplacas de 96 pocillos en una cantidad de 200 \mul/pocillo y se incubó a 37ºC durante una semana, seguido de selección de hibridomas.

La cantidad de anticuerpos secretados en el sobrenadante en cada pocillo se ensayó por inmunoensayo enzimático basándose en la inmunorreacción de los anticuerpos y un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 y se seleccionaron los hibridomas capaces de producir anticuerpos, que reaccionaban fuertemente con el polipéptido purificado. Se obtuvo de manera habitual una célula H-1 del hibridoma clonado capaz de producir el presente anticuerpo monoclonal tratando repetidamente estos hibridomas con dilución limitante.

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Ejemplo B-2 Preparación del anticuerpo monoclonal H-1mAb y análisis por la técnica de transferencia de Western

Ejemplo B-2-1

Preparación del anticuerpo monoclonal H-1mAb

Se suspendieron células H-1 del hibridoma obtenido por el método del Ejemplo B-1-3 en medio RPMI 1640 (pH 7,2) complementado con suero de ternero al 5% v/v para dar una densidad celular de aproximadamente 1x10^{6} células/ml y se incubó en una incubadora a 37ºC en condiciones de CO_{2} al 5% v/v mientras crecía el cultivo. Cuando la densidad celular del cultivo alcanzó un nivel prescrito, se inyectaron por vía intraperitoneal 1x10^{7} células/ratón de las células H-1 del hibridoma proliferadas a ratones BALB/c, de 8 semanas de edad, a los que previamente se había inyectado por vía intraperitoneal 0,5 ml/ratón de pristano, seguido de la alimentación de los ratones de manera habitual durante una semana.

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Se recogió ascitis de los ratones, se diluyó con PBS 3 veces, se mezcló con sulfato de amonio para dar un grado de saturación del 50% p/v, se dejó reposar a 4ºC durante 24 horas y se centrifugó para recoger el sedimento. El sedimento se dializó frente una solución acuosa de dihidrogenofosfato potásico 20 mM (pH 6,7) a 4ºC durante una noche y se suministró a una columna de hidroxiapatita que previamente se había equilibrado con una preparación reciente de la misma solución acuosa, seguido del suministro a la columna de un tampón de dihidrogenofosfato potásico de gradiente lineal (pH 6,7) que variaba de 20 mM a 300 mM para obtener una solución acuosa que contenía el presente anticuerpo monoclonal H-1mAb. El rendimiento fue aproximadamente 5 mg por ratón. El análisis convencional mostró que el anticuerpo pertenece a la clase de IgG_{1}.

Ejemplo B-2-2

Análisis por la técnica de transferencia de Western

Se añadió un \mug de un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, a una solución de mezcla que consistía en 100 mg de ditiotreitol, 0,5 ml de una solución acuosa de SDS al 10% p/v y un ml de glicerol, y se incubó la mezcla a 37ºC durante una hora y se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. El gel resultante se transfirió de manera habitual a una membrana de nitrocelulosa que después se sumergió en un sobrenadante del cultivo de células H-1 del hibridoma durante una hora y se lavó con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía tween 20 al 0,05% v/v para retirar las cantidades excesivas de anticuerpos. La membrana se sumergió adicionalmente durante una hora en PBS que contenía un anticuerpo Ig anti-ratón preparado a partir de conejos para efectuar la inmunorreacción, se lavó con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía tween 20 al 0,05% v/v y se sumergió en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía peróxido de hidrógeno al 0,005% v/v y 3,3'-diaminobencidina 0,3 mg/ml para efectuar la coloración.

Como control, se proporcionó un sistema que usa una interleucina 12 humana recombinante en lugar del polipéptido purificado y se trató de manera similar a la anterior. Se usaron albúmina sérica de ternero (PM= 67.000 dalton), ovoalbúmina (PM= 45.000 dalton), anhidrasa carbónica (PM= 30.000 dalton), inhibidor de tripsina (PM= 20.100 dalton) y \alpha-lactalbúmina (PM= 14.000 dalton) como proteínas marcadoras. Estos resultados fueron los de la Figura 4.

Como es evidente por la Figura 4, el anticuerpo monoclonal H-1mAb reaccionó específicamente con el polipéptido purificado (Carril 1) obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, pero no con la interleucina 12 humana (Carril 2). Esto prueba que el presente anticuerpo monoclonal reacciona específicamente con el polipéptido con una secuencia de aminoácidos específica.

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Ejemplo B-3 Preparación del hibridoma H-2 y anticuerpo monoclonal H-2mAb

El hibridoma H-2, un anticuerpo monoclonal, se preparó de manera similar por el método del Ejemplo B-2-1 excepto por que se usaron células P3-X63-Ag8 (ATCC TIB9) en lugar de las células SP/O-14Ag.

Ejemplo B-3-2

Preparación del anticuerpo monoclonal H-2mAb

El hibridoma H-2 del Ejemplo B-3-1 se cultivó de manera similar a la del Ejemplo B-2-1 y el cultivo se purificó para obtener aproximadamente 5,6 mg del anticuerpo monoclonal H-2mAb por ratón BALB/c. El análisis convencional mostró que el anticuerpo monoclonal pertenece a la clase de IgM y que reaccionaba específicamente con un polipéptido purificado obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 cuando se analizó por la técnica de transferencia de Western de manera similar a la del Ejemplo B-2-2.

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Ejemplo B-4 Purificación del polipéptido por cromatografía de inmunoafinidad

Ejemplo B-4-1

Preparación del gel para cromatografía de inmunoafinidad

Se pesaron ochenta mg de anticuerpo monoclonal H-1mAb, obtenido por el método del Ejemplo B-2-1 y se dializaron frente a tampón borato 0,1 M (pH 8,5) que contenía cloruro de sodio 0,5 M a 4ºC durante una noche. Se expandieron cuatro g de "Sepharose 4B activada con CNBr", un vehículo insoluble en agua comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, con un mM de solución de ácido clorhídrico acuosa, se lavó sucesivamente con una preparación reciente del mismo tampón y tampón borato 0,1 M (pH 8,5) que contenía cloruro de sodio 0,5 M, se mezcló con aproximadamente 10 ml de solución acuosa del anticuerpo monoclonal obtenido anteriormente y se incubó sucesivamente a temperatura ambiente y a 4ºC durante una noche en condiciones de agitación suave. Posteriormente, el gel resultante se lavó sucesivamente con solución acuosa de etanolamina uno M (pH 8,0), tampón borato 0,1 M (pH 8,5) que contenía cloruro de sodio 0,5 M y tampón acetato 0,1 M (pH 4,0) y estas etapas de lavado se repitieron 5 veces. Por último, el gel se lavó con PBS para obtener un gel para cromatografía de inmunoafinidad. El análisis convencional mostró que aproximadamente 6 mg de anticuerpo monoclonal H-1mAb se habían unido a un ml del gel.

Ejemplo B-4-2

Purificación del polipéptido por cromatografía de inmunoafinidad

Se rellenaron diez ml del gel para cromatografía por inmunoafinidad del Ejemplo B-4-1 en una columna cilíndrica de plástico, se lavaron con PBS y se suministraron con 10 ml de una fracción eluída de Fenil Sepharose que contenía aproximadamente 0,1 mg/ml del polipéptido obtenido por el método en el Ejemplo B-1-2. La columna se lavó con una preparación reciente de PBS y se suministró con tampón glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5) que contenía cloruro de sodio uno M para recoger fracciones con una actividad inductora de IFN-\gamma. Las fracciones se agruparon, se dializaron frente a PBS a 4ºC durante una noche, se concentraron y se ensayaron para la actividad inductora de IFN-\gamma y el contenido de proteína y mostró que este procedimiento de purificación producía un polipéptido purificado con una pureza del 95% p/p o superior en un rendimiento de aproximadamente el 100%.

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Ejemplo B-5 Detección del polipéptido por inmunoensayo enzimático

Se inmunizaron conejos de manera habitual con un polipéptido purificado obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 y se recogió su sangre. Se aisló anticuerpo G de inmunoglobulina de la sangre y se disolvió en PBS para dar una concentración de 20 \mug/ml y se distribuyó la solución en microplacas de 96 pocillos en una cantidad de 100 \mul/pocillo. Las microplacas se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas, seguido de la retirada de soluciones que contenían IgG de las microplacas, adición de PBS que contenía albúmina sérica de ternero al uno% p/v a las microplacas en una cantidad de 200 \mul/pocillo y dejándolas reposar a 4ºC durante una noche.

La solución salina tamponada con fosfato se retiró de las microplacas, que después se lavaron con PBS que contenía tween 20 al 0,05% v/v y se inyecto con 100 \mul/pocillo de una solución preparada diluyendo apropiadamente un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, con PBS que contenía albúmina sérica de ternero al 0,5% p/v, seguido de hacer reaccionar la solución de mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas en condiciones de agitación. Las microplacas se lavaron con PBS que contenía tween 20 al 0,05% v/v y se inyectaron con 100 \mul/pocillo de una solución que contenía un anticuerpo monoclonal H-1mAb marcado con biotina, seguido de hacer reaccionar la solución de mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas en condiciones de agitación, lavado de las microplacas con PBS que contenía tween 20 al 0,05% v/v, inyección con 100 \mul/pocillo de una solución que contenía un complejo de peroxidasa de rábano rusticano y estreptoavidina y haciendo reaccionar adicionalmente la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 2 horas en condiciones de agitación. Después, las placas se lavaron con PBS que contenía tween 20 al 0,05% v/v y se midió la actividad de la peroxidasa de rábano rusticano unida al polipéptido purificado por absorbancia a una longitud de onda de 492 nm usando o-fenilenodiamina como sustrato. Los resultados fueron los de la Tabla 6.

TABLA 6

16

Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 6, el método de detección de acuerdo con la presente invención ensaya con exactitud el polipéptido en el intervalo de aproximadamente 50-1.000 pg/ml.

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Ejemplo B-6 Detección del polipéptido por radioinmunoensayo

Se inmunizaron conejos de manera habitual con un polipéptido purificado obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 y se recogió su sangre, seguido de aislamiento del anticuerpo IgG. El anticuerpo se adsorbió de manera habitual en perlas de poliestireno para radioinmunoensayo y se dejó reposar en PBS que contenía albúmina sérica de ternero al 2% p/v a 4ºC durante una noche para obtener un anticuerpo inmovilizado.

Se dispuso una perla en un tubo de ensayo, se sumergió en 0,2 ml de una solución preparada diluyendo un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, con PBS que contenía albúmina sérica de ternero al 0,5% p/v y se dejó reposar a 4ºC durante 4 horas. Después se lavó la perla con PBS que contenía tween 20 al 0,05% v/v y albúmina sérica de ternero al 0,5% p/v, se sumergió en 0,2 ml (1x10^{5} cpm) de una solución que contenía un anticuerpo monoclonal H-2mAb, obtenido por el método del Ejemplo B-3-2 y se marcó con ^{125}I y se dejó reposar a 4ºC durante una noche. Después de retirar una cantidad excesiva del anticuerpo marcado con ^{125}I, se lavó la perla con PBS que contenía tween 20 al 0,05% v/v y albúmina sérica de ternero al 0,5 p/v, seguido de recuento de la radioactividad de la perla en un contador gamma. Los resultados fueron los de la Tabla 7.

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TABLA 7

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Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 7, el método de detección de la presente invención ensaya con exactitud el polipéptido en el intervalo de aproximadamente 100-1.000 pg/ml.

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Ejemplo C-1

Ejemplo de Referencia

Solución

Se disolvió un polipéptido, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, en solución salina fisiológica que contenía albúmina sérica humana al uno % p/v como un estabilizador para obtener un mg/ml de solución de polipéptido que después se esterilizó por filtro de membrana para obtener una solución.

El producto con una estabilidad satisfactoria puede usarse como una inyección, solución oftálmica y gotas nasales en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas y enfermedades inmunes.

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Ejemplo C-2

Ejemplo de Referencia

Inyección seca

Se disolvió un polipéptido, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, en 100 ml de solución salina fisiológica que contenía gelatina purificada al uno % p/v como un estabilizante y la solución se esterilizó de manera habitual con un filtro de membrana. Se distribuyeron en viales alícuotas de un ml de la solución esterilizada, se liofilizaron y se sellaron con un tapón.

El producto con una estabilidad satisfactoria puede usarse como una inyección seca para tratar y/o prevenir enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas y enfermedades inmunes.

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Ejemplo C-3

Ejemplo de Referencia

Pomada

Se disolvieron en agua destilada "HI-BIS-WAKO 104", un polímero carboxivinílico comercializado por Wako Pure Chemicals, Tokio, Japón, y una trehalosa purificada para dar concentraciones del 1,4% p/p y 2,0% p/p, respectivamente y un polipéptido obtenido por el método del Ejemplo B-1-2- se disolvió hasta homogeneidad en la solución, seguido de ajuste del pH de la solución resultante hasta un pH de 7,2 para obtener una pasta que contenía aproximadamente un mg/g del polipéptido.

El producto con una dispersabilidad y estabilidad satisfactorias puede usarse como una pomada para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas y enfermedades inmunes.

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Ejemplo C-4

Ejemplo de Referencia

Comprimido

Se mezclaron hasta homogeneidad un polipéptido, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 y LUMIN, es decir, cianina de [bis-4-(1-etilquinolina)] [\gamma-4'-(1-etilquinolina]pentametionina, como un activador celular con
"FINETOSE®", una \alpha-maltosa cristalina anhidra comercializada por Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japón y se comprimió la mezcla de manera habitual por una máquina de fabricar comprimidos para obtener comprimidos, aproximadamente de 200 mg cada uno, que contenían el polipéptido y LUMIN, de aproximadamente un mg cada uno.

El producto, que tenía una capacidad de deglución y estabilidad satisfactorias, puede usarse como un comprimido para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas y enfermedades inmunes.

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Ejemplo C-5

Ejemplo de Referencia

Agente inmunoterapéutico adoptivo

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de un paciente con linfoma maligno, se suspendieron en medio RPMI 1640 (pH 7,2) que estaba complementado con suero AB humano al 10% v/v y se precalentó hasta 37ºC para dar una densidad celular de aproximadamente 1x10^{6} células/ml y se mezcló con aproximadamente 1,0 \mug de un polipéptido, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 y aproximadamente 100 unidades/ml de una interleucina 2 humana recombinante, seguido de incubación del producto resultante en una incubadora con CO_{2} al 5% v/v a 37ºC durante una semana y centrifugando el cultivo resultante para recoger células LAK.

Las células LAK obtenidas de esta manera muestran una fuerte citotoxicidad sobre células de linfoma cuando se introducen en el cuerpo del paciente donante y ejercen una citotoxicidad mayor que la conseguida por la inmunoterapia adoptiva usando interleucina 2 sola. Se inyectaron células T citotóxicas, obtenidas de manera similar por tratamiento de linfocitos invadidos en los tejidos tumorales del paciente, en lugar de los linfocitos anteriores, dentro del paciente donante y dieron como resultado una acción de efecto similar al conseguido por las células LAK. El agente inmunoterapéutico adoptivo puede usarse arbitrariamente para tratar tumores malignos sólidos tales como cáncer renal, melanoma maligno, cáncer de colon, cáncer rectal y cáncer de pulmón.

La presente invención esta basada en el hallazgo de un polipéptido novedoso que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. El polipéptido es una sustancia que tiene una secuencia de aminoácidos parcial o totalmente mostrada y una actividad estable inductora de la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

El polipéptido tiene una fuerte inductibilidad de IFN-\gamma de manera que puede inducir una cantidad deseada de producción de IFN-\gamma con sólo una pequeña cantidad. La dosis del polipéptido no provoca graves efectos secundarios incluso cuando se administra en una dosis relativamente alta ya que solamente tiene una toxicidad extremadamente baja. Por lo tanto, el presente polipéptido tiene una ventaja ya que induce rápidamente una cantidad deseada de producción de IFN-\gamma sin controlar estrictamente la dosis.

El presente anticuerpo monoclonal reacciona específicamente con el polipéptido y se usa ampliamente en la purificación y la detección del polipéptido. El anticuerpo se prepara en una cantidad deseada usando hibridomas.

El presente agente para enfermedades susceptibles ejerce un efecto satisfactorio en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas y enfermedades inmunes. Además, el agente tiene una actividad de mejorar la citotoxicidad por células asesinas o de inducir la formación de células asesinas y ejerce un efecto significativo en el tratamiento de enfermedades graves tales como tumores malignos.

Por tanto, la presente invención es una invención significativa que tiene un efecto destacable y proporciona una gran contribución a este campo.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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NOMBRE: KABUSHIKI KAISHA HAYASHIBARA SEIBUTSU KAGAKU KENKYUJO

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLIPÉPTIDO INDUCTOR DE LA PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN-GAMMA, ANTICUERPO MONOCLONAL ESPECÍFICO PARA DICHO POLIPÉPTIDO Y AGENTE PARA ENFERMEDAD SUSCEPTIBLE

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

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(iv)

DIRECCIÓN:

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(A)

DESTINATARIO: KABUSHIKI KAISHA HAYASHIBARA SEIBUTSU KAGAKU KENKYUJO

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(B)

CALLE: 2-3, 1 CHOME, SHIMOISHII

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(C)

CIUDAD: OKAYAMA

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(E)

PAÍS: JAPÓN

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(F):

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 700

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

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(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A1)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 304.203/94

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(B1)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 de noviembre de 1994

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(A2)

NÚMERO DE REFERENCIA DE SOLICITUD: 10048102

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(B2)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 18 de septiembre de 1995

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(A3)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 58.240/95

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(B3)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de febrero de 1995

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(A4)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 78.357/95

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(B4)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de marzo de 1995

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(A5)

NÚMERO DE REFERENCIA DE SOLICITUD: 10049202

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(B5)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 de septiembre de 1995

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 157 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácidos

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

18

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(3) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 471 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

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19

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(4) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 471 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

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(iii)

HIPOTÉTICO: No

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(iv)

ANTISENTIDO: No

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A):

ORGANISMO: ratón

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(F)

TIPO DE TEJIDO: hígado

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: 1-471 péptido mat

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(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

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20

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(5) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

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21

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(6) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

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22

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(7) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1120 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

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(iii)

HIPOTÉTICO: No

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(iv)

ANTISENTIDO: No

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A):

ORGANISMO: humano

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(F)

TIPO DE TEJIDO: hígado

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A1)

NOMBRE/CLAVE: 1-177 5' -UTR

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(C1)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

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(A2)

NOMBRE/CLAVE: 178-285 péptido líder

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(C2)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

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(A3)

NOMBRE/CLAVE: 286-756 péptido mat

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(C3)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

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(A4)

NOMBRE/CLAVE: 757-1120 3' -UTR

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(C4)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

23

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(8) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: fragmento N-terminal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

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24

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(9) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 471 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A):

ORGANISMO: humano

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(B)

AISLADO INDIVIDUAL: hígado

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido mat

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1..471

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(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

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25

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(10) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 11

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: fragmento N-terminal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

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26

Claims (2)

1. Una composición para reaccionar específicamente con un polipéptido de origen humano, que comprende como ingrediente eficaz un anticuerpo monoclonal que reconoce el polipéptido junto con un vehículo del anticuerpo monoclonal; induciendo dicho polipéptido la producción de IFN-gamma por células inmunocompetentes y comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina").

2. Un método in vitro para hacer reaccionar específicamente un polipéptido de origen humano con un anticuerpo monoclonal, que comprende una etapa de poner en contacto el polipéptido con un anticuerpo monoclonal que reconoce el polipéptido; induciendo dicho polipéptido la producción de IFN-gamma por células inmunocompetentes y comprendiendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina").