ES2156199T5 - Polipeptido inductor de la produccion de interferon-gamma, anticuerpos monoclonales y composicion para el tratamiento o la prevencion de enfermedades sensibles al interferon-gamma. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN POLIPEPTIDO QUE TIENE UN PESO MOLECULAR DE 18,500 (MAS MENOS) 3,000 DALTONS EN SDS-PAGE Y UN PL DE 4.9 (MAS MENOS) 1.0 SOBRE CROMATOENFOCADO. EL POLIPEPTIDO INDUCE FUERTEMENTE LA PRODUCCION DE IFN-{GA} POR CELULAS INMUNOCOMPETENTES CON SOLAMENTE UNA PEQUEÑA CANTIDAD, Y NO PROVOCA SERIOS EFECTOS COLATERALES INCLUSO CUANDO SE ADMINISTRA A LOS HUMANOS EN UNAS DOSIS RELATIVAMENTE ALTAS. SE PREPARA UTILIZANDO UN ANTICUERPO MONOCLONAL OBTENIDO A PARTIR DE HIBRIDOMAS, Y SE INCORPORA EN AGENTES PARA EL TRATAMIENTO Y/O LA PREVENCION DE TUMORES MALIGNOS, ENFERMEDADES VIRALES, ENFERMEDADES POR INFECCION BACTERIANA Y ENFERMEDADES INMUNES.

Description

Polipéptido inductor de la producción de interferón-\gamma, anticuerpos monoclonales y composición para el tratamiento o la prevención de enfermedades sensibles al interferón-\gamma.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido que induce la producción de interferón-\gamma (de aquí en adelante abreviado como "IFN-\gamma") por células inmunocompetentes, un anticuerpo monoclonal específico para el polipéptido, y un agente para enfermedades susceptivas que contiene el polipéptido como un ingrediente efectivo.

Descripción de la técnica anterior

El IFN-\gamma es una proteína que tiene actividades antivirales, antioncóticas e inmunorreguladoras, y está producido por células inmunocompetentes estimuladas con antígenos o mitógenos. Debido a estas actividades biológicas, se esperó utilizar el IFN-\gamma como un agente antitumoral desde el comienzo del descubrimiento, y se estudió energéticamente en ensayos clínicos como un agente terapéutico para tumores malignos incluyendo en general tumores cerebrales. Las preparaciones de IFN-\gamma comercialmente asequibles en la actualidad se clasifican ordinariamente en 2 grupos, esto es, IFN-\gammas naturales producidos por células inmunocompetentes e IFN-\gammas recombinantes producidos por transformantes preparados por introducción en microorganismos de la especie Escherichia coli de DNAs que codifican los IFN-\gammas. En los ensayos clínicos anteriores, cada uno de dichos IFN-\gammas se administra a los pacientes como un "IFN-\gamma exógeno".

Entre estos IFN-\gammas, los IFN-\gammas son producidos habitualmente por cultivo de células inmunocompetentes establecidas en medios de cultivo nutrientes suplementados con inductores de IFN-\gamma para producir IFN-\gammas, y purificación de los IFN-\gammas producidos. Es sabido que el tipo de inductores de IFN-\gamma influencia grandemente el rendimiento de producción de IFN-\gamma, la facilidad de la purificación del IFN-\gamma, y la seguridad de los productos finales. Generalmente, se utilizan mitógenos tales como concanavalina A (Con A), Lens culinaris, Phytolacca americana,endotoxina y lipopolisacárido. Estos mitógenos, sin embargo, tienen los problemas de sus diversidades moleculares y de calidad dependiendo de sus orígenes y métodos de purificación, teniendo también dificultades de rendimiento en una cantidad deseada y con una inducibilidad de IFN-\gamma constante. Además, la mayoría de estos mitógenos induce efectos secundarios desfavorables cuando se administran a cuerpos vivos, y algunos de ellos incluso muestran toxicidad. Por lo tanto, es sustancialmente dificultoso inducir la producción de IFN-\gamma por la administración directa de dichos mitógenos a los cuerpos vivos.

Los presentes inventores encontraron en hígado de ratón una sustancia que induce la producción de IFN-\gamma a través de sus investigaciones sobre citoquinas producidas por células de mamíferos. Ellos aislaron la sustancia utilizando una diversidad de métodos de purificación que comprendían cromatografía de columna como técnica principal, estudiaron las propiedades y características, y revelaron que la realidad era una proteína que tenía las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(1)

Peso molecular

Muestra un peso molecular de 19.000\pm5.000 daltons por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sodio (SDS-PAGE);

(2)

Punto isoeléctrico (pI)

Muestra un punto isoeléctrico de 4,8\pm1,0 mediante cromatoenfoque;

(3)

Secuencia parcial de amino ácidos

Tiene las secuencias parciales de amino ácidos de las SEQ ID NOs: 4 y 5; y

(4)

Actividad biológica

Induce la producción de INF-\gamma por células inmunocompetentes.

Puede concluirse que la realidad es una nueva sustancia porque no se conocía ninguna proteína con estas propiedades fisicoquímicas Los presentes inventores continuaron los estudios sobre células hepáticas de ratón y encontraron que el DNA de la sustancia constaba de 471 pares de bases y codificaba la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 3.

1

En base a estos hallazgos, los presentes inventores continuaron adicionalmente con estudios sobre células hepáticas humanas y obtuvieron un DNA que codifica otra nueva sustancia que induce la producción de IFN-\gamma, por células inmunocompetentes. Ellos revelaron que la realidad era un polipéptido y después descodificaron su DNA para encontrar que tenía la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1.

2

Ellos introdujeron el DNA en Escherichia coli para expresar el polipéptido y producirlo en el cultivo en un rendimiento considerablemente alto.

Como se describió anteriormente, el polipéptido tiene la propiedad de inducir la producción de IFN-\gamma, por células inmunocompetentes, y se espera utilizar en una diversidad de campos como un inductor de IFN-\gamma, agente antiviral, agente antitumoral, agente antibacteriano, agente inmunorregulador, y agente mejorador de las plaquetas sanguíneas. En general, se requiere inevitablemente el desarrollo de métodos para purificar eficazmente polipéptidos biológicamente activos en unos que tengan una pureza relativamente alta, y para analizar muchas muestras simultáneamente, cuando los polipéptidos deban ser incorporados en productos farmacéuticos. Aunque el material más adecuado que hace posible esa purificación y análisis es un anticuerpo monoclonal, ninguno de los cuales es específico para el polipéptido que se ha obtenido.

Recientemente, se han desarrollado algunos productos farmacéuticos, que contienen como un ingrediente activo citoquinas tales como interferón-\alpha, interferón-\beta, TNF-\alpha, TNF-\beta, interleuquina 2 e interleuquina 12, así como también IFN-\gamma, y otros están bajo explotación por empleo actual. Estos productos farmacéuticos pueden utilizarse como un agente antitumoral, agente antiviral, antiséptico, y agente inmunorregulador, y, si es necesario, pueden utilizarse junto con otros medicamentos.

A diferencia de los productos farmacéuticos sintetizados químicamente, los productos farmacéuticos citados anteriormente tienen como la mayor característica la propiedad de ser fácilmente administrables a los pacientes durante un período de tiempo relativamente corto sin inducir graves efectos secundarios, pero tienen los inconvenientes de que sus efectos terapéuticos son generalmente relativamente bajos, y de que si se utilizan solos no son capaces de remitir o curar sustancialmente las enfermedades, variando dependientemente de los tipos de enfermedades y síntomas a tratar. Por lo tanto, dichos productos farmacéuticos se utilizan actualmente como un agente suplementario para los agentes sintetizados químicamente en el tratamiento de enfermedades graves tales como tumores malignos, o se utilizan como un medio para prolongar la vida del paciente.

Compendio de la invención

A la vista de lo anterior, un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo polipéptido que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un DNA codificante del polipéptido.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un DNA recombinante replicable que contiene el DNA y un vector auto-replicable.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un transformante obtenible por introducción del DNA recombinante en un huésped apropiado.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para la preparación del polipéptido utilizando el transformante.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal específico para el polipéptido.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para la preparación del anticuerpo monoclonal.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un método de purificación para la purificación del polipéptido utilizando el anticuerpo monoclonal.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método de detección para analizar el polipéptido utilizando el anticuerpo monoclonal.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un agente farmacéutico para enfermedades susceptibles al IFN-\gamma.

El primer objeto de la presente invención se consigue mediante la reivindicación 1.

El segundo objeto de la presente invención se consigue mediante un DNA que codifica el polipéptido.

El tercer objeto de la presente invención se consigue mediante un DNA recombinante replicable que contiene el DNA y un vector auto-replicable.

El cuarto objeto de la presente invención se consigue mediante un transformante obtenible por introducción del DNA recombinante replicable en un huésped apropiado.

El quinto objeto de la presente invención se consigue mediante un procedimiento para la preparación de la proteína que comprende la introducción del DNA recombinante en un huésped, el cultivo del transformante en un medio de cultivo nutriente, y la recolección de la proteína formada a partir del cultivo resultante.

El sexto objeto de la presente invención se consigue mediante un anticuerpo monoclonal que es específico de la reivindicación 1.

El séptimo objeto de la presente invención se consigue mediante un hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal.

El octavo objeto de la presente invención se consigue mediante un procedimiento para la preparación del anticuerpo monoclonal que comprende cultivar el hibridoma capaz de producir el anticuerpo in vitro, esto es, en un medio de cultivo nutriente, o in vivo, esto es, en el cuerpo de un animal, y recoger el anticuerpo a partir del cultivo resultante o del fluido corporal.

El noveno objeto de la presente invención se consigue mediante un método de purificación para el polipéptido que comprende poner en contacto el anticuerpo monoclonal con una mezcla que contiene el polipéptido e impurezas para adsorber el polipéptido, y desorber el polipéptido del anticuerpo.

El décimo objeto de la presente invención se consigue mediante un método para la detección del polipéptido que comprende poner en contacto muestras con el anticuerpo monoclonal y hacerlos reaccionar inmunológicamente.

El undécimo objeto de la presente invención se consigue mediante un agente farmacéutico que contiene el polipéptido como un ingrediente efectivo.

La invención será descrita ahora con más detalle, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos anexos, en los que:

Fig. 1 es un patrón de elución por HPLC de un fragmento peptídico obtenido por tripsinización de una proteína procedente de hígado de ratón.

Fig. 2 es una figura de la estructura del presente pHIGIF de DNA recombinante.

Fig. 3 es una figura de la estructura del pKGFHH2 del DNA recombinante.

Fig. 4 es una figura de la transferencia Western que muestra la reactividad del presente polipéptido purificado y la interleuquina 12 con el presente anticuerpo monoclonal H-1mAb.

HIGIF cDNA: cDNA que codifica el presente polipéptido.

KGFHH2 cDNA: cDNA que codifica el presente polipéptido.

Ptac: promotor tac.

rrnBT1T2: terminador del operón de RNA de ribosoma.

GST: gen de glutatión S transferasa.

AmpR: gen resistente a ampicilina.

pBR322ori: sitio de iniciación de la replicación de Escherichia coli.

Como se describió anteriormente, el polipéptido de acuerdo con la presente invención tiene una secuencia de amino ácidos que difiere de aquella de los polipéptidos convencionales, e induce la producción de IFN-\gamma cuando se le deja solo o junto con un cofactor para actuar sobre células inmunocompetentes.

El DNA de acuerdo con la presente invención expresa la producción del presente polipéptido por introducción del DNA dentro de un vector auto-replicable para formar un DNA recombinante, y, generalmente, introducción del DNA recombinante en un huésped capaz de proliferar sin dificultad pero incapaz de producir el polipéptido.

Generalmente, el DNA recombinante replicable de acuerdo con la presente invención expresa la producción del presente polipéptido mediante la introducción del mismo dentro de un huésped capaz de proliferar sin dificultad pero incapaz de producir el polipéptido.

El transformante produce el presente polipéptido cuando se cultiva.

El presente polipéptido es fácilmente obtenido en una cantidad deseada por cultivo del transformante de acuerdo con el presente procedimiento.

La presente invención se basa en el hallazgo de un nuevo polipéptido que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. Durante los estudios sobre citoquinas producidas a partir de células de mamíferos, los presentes inventores encontraron que existía en hígado de ratón una nueva proteína capaz de inducir la producción de IFN-\gamma. Ellos aislaron la proteína utilizando dos o más métodos de purificación comprendiendo principalmente cromatografía de columna y determinaron la secuencia parcial de amino ácidos. En base a la secuencia, sintetizaron químicamente un cebador utilizando como molde un mRNA aislado de célula hepáticas de ratón, y trataron la proteína con la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción (RT-PCR) en presencia del cebador para recoger fragmentos de DNA que codifican parcialmente la proteína. Utilizando los fragmentos de DNA como una sonda, ellos estudiaron energéticamente una biblioteca de cDNA que se había preparado alternativamente a partir del mRNA, y obtuvieron un fragmento de DNA que constaba de 471 pares de base y que tenía la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3. La descodificación de la secuencia de bases reveló que la proteína, aislada de hígado de ratón constaba de 157 amino ácidos y tenía una secuencia de amino ácidos en SEQ ID NO: 3, donde el símbolo "Xaa" significa "metionina" o "treonina".

En base a estos hallazgos, los presentes inventores estudiaron adicionalmente el mRNA procedente de células hepáticas humanas, y encontraron que existía un nuevo gen que codificaba un polipéptido el cual inducía la producción de IFN-\gamma mediante células inmunocompetentes. El gen contiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2, y la descodificación del mismo reveló que codificaba un polipéptido que tenía la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1 donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina".

SEQ ID NO: 2:

3

Las técnicas utilizadas para revelar la secuencia de amino ácidos y las secuencias de bases de las SEQ ID Nos: 1 y 2 se resumen en lo que sigue:

(1)

Se aisló una proteína, que induce la producción de IFN- \gamma, por células inmunocompetentes, a partir de células hepáticas de ratón y se purificó altamente mediante combinación de métodos de purificación convencionales que comprendían la cromatografía como técnica principal;

(2)

La proteína purificada resultante se digirió con tripsina, y se aislaron 2 fragmentos polipeptídicos a partir de la mezcla resultante y se determinó la secuencia de amino ácidos;

(3)

A partir de células hepáticas de ratón, se recogió un mRNA y se sometió como molde a la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para obtener fragmentos de DNA en presencia de un oligonucleátido como cebador el cual se había sintetizado químicamente en base a las anteriores secuencias parciales de amino ácidos. Los fragmentos cribaron utilizando un oligonucleótido como sonda la cual se había sintetizado químicamente en base a estas secuencias parciales de amino ácidos, seguido por recolección de un fragmento de DNA que codifica parcialmente la proteína;

(4)

Se marcó una biblioteca de cDNA y se hibridó con la biblioteca de cDNA resultante preparada con el mRNA como molde, seguido por la selección de un transformante que mostraba una fuerte hibridación;

(5)

Se aisló un cDNA a partir del transformante, y se determinó y descodificó la secuencia de bases. La comparación de la secuencia de amino ácidos descodificada y de la secuencia parcial de amino ácidos reveló que la proteína tenía la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 3, y, en ratón, la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 3 codifica la secuencia de amino ácidos;

(6)

Se preparó un fragmento de DNA que tenía la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 3, se marcó y se hibridó con una biblioteca de cDNA que se había preparado utilizando como molde un mRNA procedente de células hepáticas humanas, seguido por la selección de un transformante que mostraba una fuerte hibridación; y

(7)

Se preparó el cDNA a partir del transformante, se determinó la secuencia de bases y se descodificó, revelando que el presente polipéptido, un polipéptido humano, incluía aquellos con la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1 codificada por la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2.

A través de una larga investigación, los presentes inventores encontraron el presente polipéptido el cual induce la producción de INF-\gamma por células inmunocompetentes, y, como es evidente a partir de la SEQ ID NO: 1, difiere de los polipéptidos conocidos convencionalmente. El presente polipéptido incluye polipéptidos naturales y recombinantes en tanto que tengan la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1.

El presente polipéptido puede prepararse por cultivo, en medios de cultivo nutrientes, de transformantes que contengan DNAs codificantes del polipéptido, y recoger el polipéptido producido a partir de los cultivos resultantes. Los transformantes utilizables en la presente invención pueden obtenerse, por ejemplo, introduciendo en los huéspedes DNAs que tengan la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2, secuencias de bases homólogas de la mismas, y secuencias complementarias de estas secuencias de bases. Pueden reemplazarse una o más bases en esas secuencias de bases con otras bases por medio de la degeneración del código genético sin alternar la secuencia de aminoácidos del presente polipéptido. Para expresar la producción del polipéptido en huéspedes utilizando dichos DNAs, pueden reemplazarse una o más bases en las secuencias de bases que codifican el presente polipéptido con otras bases.

Puede utilizarse cualquier DNA en la presente invención en tanto que tenga una de esas secuencias de bases independientemente de su origen, esto es, aquellos procedentes de fuentes naturales o los sintetizados artificialmente. Las fuentes naturales incluyen, por ejemplo, células hepáticas humanas a partir de las cuales es obtenible el gen, conteniendo el DNA con la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 6

4

El procedimiento de preparación es como sigue: Fraccionar un mRNA de hígado humano comercialmente asequible suplementado con poli (A) sobre un tampón con gradiente de sacarosa para aislar el mRNA purificado. Dejar actuar una transcriptasa inversa y una polimerasa sobre el mRNA como molde para formar un cDNA de doble hebra, introducir el cDNA en un vector auto-replicable apropiado, e introducir el DNA recombinante resultante en un huésped apropiado tal como Escherichia coli. Cultivar el transformante resultante en un medio de cultivo nutriente, y recoger los transformantes proliferados que contienen el DNA codificante del presente polipéptido por el método de hibridación de colonias. El DNA de acuerdo con la presente invención es obtenible por tratamiento de los transformantes con métodos convencionales. Para producir artificialmente el presente DNA, por ejemplo, se prepara por síntesis química basada en la secuencia de la SEQ ID NO: 2, o por introducción de un DNA que codifica la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1 en un vector apropiado para formar un DNA recombinante, introduciendo el DNA recombinante en un huésped apropiado, cultivando el transformante resultante en un medio de cultivo nutriente, aislando las células proliferadas del cultivo, y recogiendo los plásmidos que contienen el DNA objetivo de las células.

Generalmente, el DNA se introduce en los huéspedes en la forma de un DNA recombinante. Dicho DNA recombinante contiene habitualmente el DNA y un vector auto-replicable, y puede ser fácilmente preparado por tecnología de DNA recombinante en general si solamente se está manejando el DNA. Ejemplos de tal vector auto-replicable son los vectores plasmídicos tales como pKK223-2, pGEX-2T, pRL-\lambda, pBTrp2 DNA, pUB110, YEpI3, plásmido Ti, plásmido Ri, y pBI121. Entre estos vectores se utilizan adecuadamente el pKK223-2, pGEX-2T, pRL-\lambda, pBTrp2 DNA, pUB110 y YEpl3 cuando el presente DNA se expresa en procariotas tales como levaduras y otros microorganismos de la especie Escherichia coli y Bacillus subtilis, mientras que el plásmido Ti, plásmido Ri y pBI121 se utilizan adecuadamente para la expresión en células animales y vegetales.

Para introducir el presente DNA en estos vectores, pueden utilizarse arbitrariamente los métodos convencionales utilizados en este campo: Los genes conteniendo el presente DNA y los vectores autoreplicables se rompen con enzimas de restricción y/o ultrasonidos, y los fragmentos de DNA resultantes y los fragmentos del vector se ligan. Al romper los genes y vectores, las enzimas de restricción que actúan específicamente sobre los nucleótidos, más particularmente, las enzimas de restricción de tipo II tales como Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal 1, Xba 1, Sac 1 y Pst 1, facilitan la ligación de los fragmentos de DNA y los fragmentos del vector. Para ligar los fragmentos de DNA y los fragmentos de vector, primero, si es necesario, se anhelan, después se tratan con una DNA ligasa in vivo o in vitro. Los DNAs recombinantes así obtenidos pueden ser fácilmente introducidos en huéspedes apropiados, y esto posibilita la replicación ilimitada de los DNAs por cultivo de los transformantes.

Los DNAs recombinantes utilizables en la presente invención pueden introducirse en huéspedes apropiados tales como levaduras y otros microorganismos de las especies Escherichia coli y Bacillus subtilis: Cuando se utilizan como huésped los microorganismos de la especie Escherichia coli, se cultivan en presencia de los DNAs recombinantes e iones calcio, y se emplean el método de las células competentes y el método del protoplasto cuando se utilicen los microorganismos de la especie Bacillus subtilis como un huésped. Para clonar los transformantes objeto, los mismos se seleccionan por el método de hibridación de colonias o por cultivo de la totalidad de transformantes en medios de cultivo nutrientes, y seleccionar aquellos que producen polipéptidos capaces de inducir la producción de IFN-\gamma, por células inmunocompetentes.

Los transformantes así obtenidos producen el presente polipéptido intracelularmente o extracelularmente cuando se cultivan en medios de cultivo nutrientes. Ejemplos de tales medios de cultivo nutrientes son aquellos en forma de líquido generalmente que contienen fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, y minerales, así como amino ácidos y/o vitaminas como micronutrientes. Las fuentes de carbono utilizables en la presente invención incluyen sacáridos tales como almidón, hidrolizados de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa. Las fuentes de nitrógeno utilizables en la presente invención incluyen compuestos orgánicos e inorgánicos que contienen nitrógeno tales como amoníaco y sus sales, urea, nitratos, peptona, extracto de levadura, soja desgrasada, licor de maceración de maíz, y extracto de ternera. Los transformantes se inoculan en medios de cultivo nutrientes y se incuban a una temperatura de 25-65ºC y a un pH de 5-8 durante aproximadamente 1-10 días bajo condiciones aerobias por el método de agitación-aireación, etc., para obtener cultivos que contienen el presente polipéptido. Aunque los cultivos pueden utilizarse intactos como un inductor de IFN-\gamma los mismos, si es necesario, se someten a ultrasonicación y/o enzimas de lisis celular para romper las células, seguido por filtración o centrifugación de las suspensiones resultantes para separar intactas las células y los desechos de las células, y purificación adicional de los sobrenadantes resultantes conteniendo el presente polipéptido. Los métodos de purificación utilizables en la presente invención son, por ejemplo, aquellos que se utilizan generalmente en este campo para purificar sustancias biológicamente activas, esto es, concentración, salificación, diálisis, sedimentación separadora, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatoenfoque, electroforesis en gel e isoelectroforesis, y, si es necesario, pueden utilizarse dos o más de ellas en combinación. Las soluciones purificadas resultantes conteniendo el presente polipéptido pueden ser concentradas y/o liofilizadas en líquidos o sólidos para adaptarse a los usos finales.

Como se describió anteriormente, el presente polipéptido tiene una actividad inductora de la producción de INF-\gamma por células inmunocompetentes. Debido a esto, el presente polipéptido puede utilizarse arbitrariamente como agente terapéutico y/o profiláctico, por ejemplo, aquellos para enfermedades víricas tales como SIDA y condyloma acuminatum; tumores malignos tales como cáncer renal, granuloma, micosis fungoides y tumor cerebral; y trastornos inmunes tales como reumatismo articular y alergia.

El presente polipéptido se deja coexistir en medios de cultivo de cultivo nutrientes para inducir la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, o se administra directamente a mamíferos para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades susceptibles al IFN-\gamma. En lo primero, se suspenden leucocitos separados de sangre periférica de mamíferos, o células inmunocompetentes establecidas tales como células HBL-38, células Mo, células Jurkat, células HuT78, células EL4 y células L12-R4, en medios de cultivo nutrientes conteniendo desde aproximadamente 0,1 ng hasta aproximadamente un \mug por ml, preferiblemente, aproximadamente 1-100 ng por ml del presente polipéptido para inducir la producción de IFN-\gamma. Si es necesario, dicho medio de cultivo nutriente puede ser suplementado con estimulantes de células T tales como mitógeno, interleuquina 2, y anticuerpos anti-CD 3, y las células se cultivan a una temperatura de aproximadamente 30-40ºC y a un pH de aproximadamente 5-8 durante aproximadamente 1-100 horas mientras el medio se va reemplazando con medios recientes. El IFN-\gamma puede obtenerse de los cultivos resultantes por uno o más métodos convencionales utilizados generalmente para purificar biológicamente sustancias activas, por ejemplo, concentración, salificación, diálisis, sedimentación separadora, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatoenfoque, electroforesis en gel, e isoelectroforesis.

Para tratar y/o prevenir las enfermedades susceptibles al IFN-\gamma el presente agente inductor de IFN-\gamma, se administra directamente a mamíferos: Por ejemplo, los agentes inductores de IFN-\gamma se administran oralmente a mamíferos después de formularse en las formas apropiadas, o se inyectan a los mamíferos intradérmicamente, subcutáneamente, muscularmente, intravenosamente o peritonealmente. Los mamíferos a los cuales se puede administrar el presente polipéptido, no están restringidos a humanos, e incluyen otros animales tales como ratones, ratas, hamsters, conejos, perros, gatos, vacas, caballos, animales de pelo, ovejas, cerdos y monos. Dado que el presente polipéptido tiene una fuerte inducibilidad de IFN-\gamma y una toxicidad extremadamente baja, induce fácilmente la producción de IFN-\gamma con tan sólo una pequeña cantidad sin provocar efectos secundarios graves incluso cuando se administra a mamíferos en una dosis relativamente alta. Así, el presente polipéptido induce ventajosamente una cantidad deseada de IFN-\gamma suavemente sin controlar estrictamente el nivel de dosificación. Ni que decir tiene que el presente polipéptido cumplimenta la seguridad requerida para un producto farmacéutico.

El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención reacciona específicamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos específica.

El hibridoma de acuerdo con la presente invención produce el anticuerpo monoclonal cuando se cultiva in vitro.

La preparación del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención facilita la producción del anticuerpo en la cantidad deseada.

El método de purificación del polipéptido de acuerdo con la presente invención lo recupera eficazmente con una calidad relativamente elevada a partir de una mezcla que contiene el polipéptido e impurezas.

En el método de detección de acuerdo con la presente invención, solamente el polipéptido reacciona inmunológicamente en las muestras. Cuando se mide el nivel de inmunorreacción por una técnica apropiada, el polipéptido puede ser evaluado cualitativamente o cuantitativamente.

El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención son aquellos que son específicos para el polipéptido con la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1 independientemente de su fuente, origen y clase.

El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención puede obtenerse utilizando el polipéptido o sus fragmentos antigénicos: Por ejemplo, se puede obtener el anticuerpo mediante preparación de hibridomas utilizando células de mamíferos capaces de proliferación infinita y células productoras de anticuerpos recogidas de mamíferos inmunizados con los fragmentos, seleccionando los clones de hibridomas capaces de producir el anticuerpo monoclonal, y cultivar los clones in vivo o in vitro.

El polipéptido, como un antígeno, puede obtenerse por cultivo de transformantes en los que introdujo un DNA codificante de la secuencia de amino ácido de la SEC ID NO: 1 fue introducida, y, generalmente, se utilizan intactos o en una forma parcialmente purificada. Los fragmentos antigénicos pueden prepararse hidrolizando químicamente o enzimáticamente un polipéptido total o parcialmente purificado, o sintetizándolos mediante síntesis peptídica en base a la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1.

El método de inmunización utilizable en la presente invención incluye los convencionales: Por ejemplo, se inyectan en mamíferos intravenosamente, intradérmicamente, subcutáneamente o intraperitonealmente los antígenos solos o en combinación con adyuvantes adecuados, y se suministran durante un período de tiempo prescrito. En la presente invención, puede utilizarse cualquier mamífero sin restricción especial en tanto que puedan obtenerse células productoras del anticuerpo deseado independientemente de la especie, peso y sexo del mamífero. En general, se utilizan roedores tales como ratas, ratones y hamsters, y a partir de los mismos se selecciona el animal más adecuado al tiempo que se evalúa la compatibilidad con las células de los mamíferos anteriores capaces de proliferación infinita. Dependiendo de las especies y el peso de los animales utilizados, la dosis total de los antígenos está generalmente comprendida dentro del intervalo de aproximadamente 5-500 \mug por animal y se administra en 2-5 veces con un intervalo de 1-2 semanas. A los 3-5 días de la administración final, se extrae el bazo del animal y se dispersa en una suspensión de células de bazo como células productoras del anticuerpo.

Las células productoras de anticuerpo y las células de mamífero obtenidas en lo que antecede se fusionan en una mezcla de fusión celular conteniendo los hibridomas objeto. Las células de mamífero capaces de proliferación infinita incluyen cepas de células procedentes de mieloma de ratón tales como células P3-NS1-Ag4-1 células (ATCC TIB18), células P3-X63-Ag8 (ATCC TIB9), células SP2/O-Ag14 (ATCC CRL1581), y mutantes de las mismas. El método de fusión celular utilizable en la presente invención incluye los convencionales utilizando un pulso eléctrico y un acelerador de la fusión celular tal como polietilén glicol y el virus sendai (HVJ): Por ejemplo, se suspenden las células productoras de anticuerpo y dichas células de mamífero en una relación de aproximadamente 1:1 a 1:10 en un medio de fusión conteniendo aceleradores de la fusión, y se incuban a aproximadamente 30-40ºC durante aproximadamente 1-5 min. Se utilizan preferiblemente medios convencionales tales como medio esencial mínimo (MEM), medio RPMI 1640 Y Medio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), como medio de fusión sin adición de sueros tales como suero de ternera.

Para seleccionar los hibridomas objeto, la mezcla de fusión celular resultante se transfiere a un medio de selección tal como medio HAT, y se incuba a aproximadamente 30-40ºC durante aproximadamente 3 días a 3 semanas para matar las células excepto los hibridomas. Los hibridomas se cultivan de la forma habitual, y los anticuerpos segregados en los cultivos se ensayan en cuanto a su reactividad con el polipéptido. Los ejemplos de tales ensayos son los convencionales para detectar anticuerpos tales como un inmunoensayo enzimático, radioinmunoensayo, y bioensayo. Por ejemplo, "Tan-Clone-KotaiJikken-Manual (Experimental Manual for Monoclonal Antibody)", editado por Sakuji TOYAMA y Tamie ANDO, publicado por Kodansha Scientific, Ltd., Tokyo, Japan, pp. 105-152 (1991) describe una variedad de los mismos. Los hibridomas, los cuales producen anticuerpos que son específicos para el polipéptido, son fácilmente clonados por dilución limitada para obtener el hibridoma de acuerdo con la presente invención.

El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención puede obtenerse cultivando el hibridoma in vivo, esto es, en mamíferos, o in vitro. Pueden utilizarse los métodos de cultivo convencionales para cultivar células mamífero: Por ejemplo, en el caso del cultivo in vivo, se recoge el anticuerpo monoclonal a partir del ascites y lo sangre del animal. Los hibridomas H-1 y H-2, como se describe más adelante, tienen una productibilidad mejorada del anticuerpo monoclonal y tienen la característica de ser fácilmente cultivados in vivo e in vitro. Pueden utilizarse los métodos convencionales utilizados en general para purificar anticuerpos para recoger el anticuerpo monoclonal a partir de los cultivos, y del ascites y sangre de los animales. Ejemplos de tales métodos incluyen salificación, diálisis, filtración, concentración, centrifugación, sedimentación separadora, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC), electroforesis en gel, e isoelectroforesis, y, si es necesario, pueden utilizarse dos o más de ellas en combinación. Los anticuerpos monoclonales purificados resultantes pueden concentrarse o secarse para dar los productos en la forma de un líquido o de un sólido para adaptarse a su uso final.

El presente anticuerpo monoclonal es extremadamente útil para la purificación del presente polipéptido en cromatografía de inmunoafinidad. Dicha técnica de purificación comprende poner en contacto el anticuerpo monoclonal con una mezcla que contiene el polipéptido e impurezas tales como proteínas distintas del polipéptido para adsorber el polipéptido sobre el anticuerpo, y desorber el polipéptido del anticuerpo. Estas etapas se llevan a cabo generalmente en un sistema acuoso. El anticuerpo monoclonal se utiliza generalmente en una forma inmovilizada a portadores gel insolubles en agua que se empaquetan en columnas cilíndricas. Los cultivos de los transformantes o sus productos parcialmente purificados se alimentan a las columnas para adsorber sustancialmente el polipéptido sobre el anticuerpo monoclonal. El polipéptido se desorbe fácilmente del anticuerpo por alteración del pH en el entorno del anticuerpo. Por ejemplo, en el caso de utilizar un anticuerpo monoclonal de la clase IgG, el polipéptido adsorbido se desorbe y eluye a partir de las columnas a un pH ácido, habitualmente, un pH de 2-3, mientras que en el caso de utilizar un anticuerpo monoclonal de la clase IgM, el polipéptido se desorbe y eluye a partir de las columnas a un pH alcalino, habitualmente, un pH de 10-11.

El método de purificación de acuerdo con la presente invención consigue un nivel de purificación del polipéptido relativamente alto con sólo un coste de elaboración y tiempo mínimos. Como se describió anteriormente, el polipéptido tiene una actividad inductora de la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, y el polipéptido purificado puede utilizarse como un inductor de IFN-\gamma para cultivo celular para producir IFN-\gamma, y se utiliza en el tratamiento y/o prevención de enfermedades víricas tales como SIDA y condiloma, tumores malignos tales como cáncer renal, granuloma, micosis fungoides, y tumores cerebrales, y enfermedades inmunes tales como el reumatismo articular y la alergia. Si el polipéptido tiene una actividad mejoradora de la citotoxicidad de las células asesinas, puede utilizarse junto con la interleuquina 2 y/o el factor de necrosis tumoral para mejorar el efecto terapéutico y reducir los efectos secundarios en el tratamiento de la inmunidad adoptiva para tumores malignos incluyendo tumores sólidos tales como cáncer de pulmón, cáncer renal y cáncer de mama.

El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención tiene una aplicabilidad relativamente amplia para una diversidad de campos que requieren la detección del polipéptido. Cuando se utiliza en inmunoensayos de marcado tales como radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, e inmunoensayo fluorescente, el anticuerpo monoclonal puede detectar cualitativamente y cuantitativamente el polipéptido en las muestras de forma instantánea y segura. En tales ensayos, el anticuerpo monoclonal se marca, por ejemplo, con radioisótopos, enzimas y/o sustancias fluorescentes antes de su uso. El anticuerpo reacciona específicamente con el polipéptido para mostrar una inmunoreacción, y detecta de forma segura solamente tan sólo una ligera cantidad del polipéptido en las muestras midiendo el nivel de la inmunorreacción para estas sustancias marcadas. Cuando se compara con el bioensayo, el inmunoensayo de marcado tiene las siguientes características: Puede analizar muchas muestras simultáneamente, reduce el tiempo del análisis y el coste de elaboración, y proporciona datos con una seguridad relativamente elevada. Así, el presente método de detección es útil para controlar las etapas de producción del polipéptido y para el control de calidad de los productos finales. Aunque la presente invención no describe en detalle las técnicas para el marcado del anticuerpo de monoclonal ni para el análisis de marcado porque no se refieren en si mismas con tal invención, estas técnicas se describen en detalle en "Enzyme Immunoassay", editado por P. Tijssen, traducido por Eiji ISHIKAWA, publicado por Tokyo-Kagaku-Dojin, pp. 196-348 (1989).

El presente agente, para enfermedades susceptibles, induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes cuando se administra a humanos, y ejerce un efecto terapéutico y/o profiláctico sobre enfermedades susceptibles al IFN-\gamma. Cuando el polipéptido tiene mejoradora de la citotoxicidad de células asesinas o inductora de la formación de células asesinas, ejerce un fuerte efecto en el tratamiento de enfermedades graves incluyendo tumores malignos.

El polipéptido utilizado en la presente invención tiene la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1 (donde el símbolo "Xaa" representa "isoleucina" o "treonina") e induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. Cualesquiera polipéptidos, por ejemplo, aquellos aislados de fuentes naturales por cultivo celular y aquellos sintetizados artificialmente por tecnología de DNA recombinante y síntesis peptídica pueden utilizarse en la presente invención en tanto que tengan las propiedades y secuencias de amino ácidos.

Desde el punto de vista económico, la tecnología del DNA recombinante se utiliza ventajosamente en la presente invención: De acuerdo con esta tecnología, se introducen los DNAs codificantes de esas secuencias de amino ácidos en huéspedes apropiados procedentes de microorganismos y animales para obtener transformantes que son después cultivados de manera habitual en medios de cultivo nutrientes, y los cultivos resultantes se purifican por técnicas convencionales utilizadas para la purificación de citoquinas para obtener el polipéptido objeto.

Como se describió anteriormente, el polipéptido tiene la propiedad de inducir la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. Cuando se administra a humanos, el presente agente para enfermedades susceptibles induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes en el cuerpo, y ejerce un efecto terapéutico y/o profiláctico satisfactorios sobre las enfermedades susceptibles al IFN-\gamma. El polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1 tiene las propiedades de mejorar la citotoxicidad de las células asesinas tales como las células NK, células LAK (células asesinas activadoras de linfoquina), células T citotóxicas, y de inducir la formación de las células asesinas, así como también tiene la propiedad de inducir la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, de modo que las células asesinas tratan y/o previenen las enfermedades susceptibles al polipéptido. Así, la expresión "enfermedades susceptibles" como se refiere en la presente memoria significa enfermedades que en general incluyen enfermedades susceptibles al IFN-\gamma y aquellas que pueden ser directa o indirectamente tratadas y/o prevenidas por los IFN-\gammas y/o las células asesinas: Por ejemplo, enfermedades virales tales como hepatitis, síndrome de herpes, condiloma, y SIDA; enfermedades bacterianas tales como Candidiasis y malaria; tumores malignos sólidos tales como cáncer renal, micosis fungoides, y enfermedad granulomatosa crónica; tumores malignos de las células sanguíneas tales como leucemia de las células T del adulto, leucemia mielógena crónica, y leucemia maligna; y enfermedades inmunes tales como alergia y reumatismo. Cuando el polipéptido se utiliza junto con interleuquina 3, ejerce un fuerte efecto sobre el tratamiento o la remisión de la leucemia y el mieloma, así como también de la leucopenia y trombopenia inducida por las radiaciones y los agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de tumores malignos.

El presente agente puede utilizarse ámpliamente en el tratamiento y/o prevención de las enfermedades susceptibles antedichas como un agente antitumoral, agente antiviral, antiséptico, agente inmunoterapéutico, agente aumentador de las plaquetas, y agente aumentador de los leucocitos. Aunque varía dependientemente de los tipos de agente utilizados para tales fines y enfermedades susceptibles a tratar, el presente agente se procesa generalmente como un agente en la forma de un líquido, pasta, o sólido que contiene el polipéptido en una cantidad de 0,000001-100% p/p, preferiblemente, 0,0001-0,1% p/p, en base al sólido seco (d.s.b.).

El presente agente puede utilizarse intacto o procesado en composiciones por mezclado con un portador, adyuvante, excipiente, diluyente, y/o estabilizante fisiológicamente aceptables tales como albúmina de suero, gelatina, sacáridos incluyendo maltosa y trehalosa, etc., y, si es necesario, mezclando adicionalmente con una o más sustancias biológicamente activas distintas tales como interferon-\alpha, interferon-\beta, interleuquina 2, interleuquina 3, interleuquina 12, TNF-\alpha, TNF-\beta, carboquona, ciclofosfamida, aclarrubicina, tiotepa, busulfan, ancitabina, citarabine, 5-fluoruracilo, 5-flúor-1-(tetrahidro-2-furil)uracilo, metotrexato, actinomicina D, cromomicina A3, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina C, vincristina, vinblastina, L-asparaginasa, radio-oro coloidal, Krestin®, picibanil, lentinano, y vacuna de Maruyama. Entre estas combinaciones, la que consta del polipéptido y la interleuquina 2 es específicamente útil porque la interleuquina 2 actúa como un cofactor para el polipéptido cuando el polipéptido induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. El uso de la combinación del polipéptido y de una interleuquina 2 humana natural o recombinante induce un nivel prescrito de producción de IFN-\gamma incluso cuando el polipéptido no induzca sustancialmente la producción de IFN-\gamma, por células inmunocompetentes.

El uso de la combinación del polipéptido y la interleuquina 12 consigue un nivel más grande de inducibilidad del IFN-\gamma que no podría conseguirse fácilmente por el uso de uno solo de ellos.

El presente agente para enfermedades susceptibles incluye aquellos en una forma de dosificación unitaria que constituye un medicamento conformado y físicamente separado adecuado para la administración, y que contiene el polipéptido en una dosis diaria o en una dosis de 1/40 para varias veces (hasta 4 veces) de la dosis diaria. Ejemplos de tales medicamentos son inyecciones, líquidos, polvos, gránulos, tabletas, cápsulas, sublinguales, soluciones oftálmicas, gotas nasales, y supositorios.

El presente agente puede ser administrado oralmente o parenteralmente a los pacientes, y, como se describe en lo que sigue, puede utilizarse para activar células antitumorales in vitro. En ambas administraciones, el agente ejerce un efecto satisfactorio en el tratamiento y/o prevención de enfermedades susceptibles. Aunque varía dependientemente de los tipos de enfermedades susceptibles y de sus síntomas, el agente puede administrarse oralmente a los pacientes o administrarse parenteralmente a los tejidos intradérmicos, tejidos subcutáneos, músculos, y venas de los pacientes a una dosis comprendida dentro del intervalo de aproximadamente 0,1/50 mg/descarga, preferiblemente, aproximadamente un \mug/descarga a un mg/descarga, 1-4 veces/día o 1-5 veces/semana, durante un día hasta un año.

El agente de acuerdo con la presente invención también puede utilizarse en la denominada "inmunoterapia antitumoral" empleando interleuquina 2. Generalmente, la inmunoterapia antitumoral se clasifica ordinariamente en (i) un método para administrar directamente interleuquina 2 al cuerpo de los pacientes con tumores malignos, y (ii) un método para introducir células antitumorales activadas in vitro mediante interleuquina 2 (inmunoterapia adoptiva). El efecto inmunoterapéutico puede ser mejorado significativamente cuando se administra junto con el polipéptido. En el método (i), el polipéptido se administra a pacientes en una cantidad de aproximadamente 0,1 \mug/descarga/adulto hasta un mg/descarga/adulto a 1-10 veces simultáneamente o antes de la administración de interleuquina 2. La dosis de interleuquina 2 se establece generalmente a una dosis dentro del rango de aproximadamente 10.000 a 1.000.000 unidades/descarga/adulto, aunque varía dependientemente de los tipos de tumores malignos, síntomas de los pacientes, y la dosis del polipéptido. Aunque en el método (ii), se cultivan células mononucleares y linfocitos, recogidos de pacientes con tumores malignos, en presencia de interleuquina 2 y aproximadamente un ng hasta un mg del polipéptido por 1x10^{6} células de estas células sanguíneas. Después de cultivar durante un período prescrito de tiempo, se recogen las células NK y las células LAK procedentes del cultivo, y se introducen en el cuerpo del paciente. Las enfermedades que pueden tratarse mediante la presente inmunoterapia antitumoral son, por ejemplo, tumores malignos sólidos tales como cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer gástrico, carcinoma de tiroides, cáncer de la lengua, carcinoma de vejiga, coriocarcinoma, hepatoma, cáncer prostático, carcinoma de útero, laríngeo, cáncer de pulmón, cáncer de mama, melanoma maligno, sarcoma de Kaposi, tumor cerebral, neuroblastoma, tumor de ovario, tumor testicular, osteosarcoma, cáncer de páncreas, cáncer renal, hipernefroma, hemangioendotelioma, y tumores malignos de las células sanguíneas tales como leucemia y linfoma maligno.

Los siguientes Ejemplos explican la presente invención, y la tecnología recombinante utilizada en ellos es por si misma conocida convencionalmente en el campo: Por ejemplo, dicha tecnología está descrita por J. Sumbrook y col. en "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª edición (1989), publicada por Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, y por Masami MURAMATSU in "Laboratory Manual for Genetic Engineering" (1988), publicada por Maruzen Co., Ltd., Tokyo, Japón.

Ejemplo A-1

Preparación del polipéptido purificado

A 600 ratones CD-1 hembras, de 8 semanas de edad, se les inyectaron intraperitonealmente un mg/ratón de Corynebacterium parvum (ATCC 11827) que se había precalentado a 60ºC durante una hora, y los ratones se alimentaron de la forma habitual durante 7 días y se inyectaron intravenosamente con un \mug/ratón de un lipopolisacárido purificado procedente de Escherichia coli. Sobre 1-2 horas después de la inyección intravenosa, se sacrificaron los ratones para recoger su sangre, seguido por separación de sus hígados, rompiendo los hígados con un homogeneizador en volúmenes de 8 veces de tampón fosfato 50 mM (pH 7,3), y se extrajo la suspensión resultante. El extracto resultante se centrifugó a aproximadamente 8.000 rpm durante 20 minutos, y un volumen de aproximadamente 9 L del sobrenadante se mezcló con un sulfato de amonio saturado en tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) para dar un grado de saturación de 45% p/v. La solución resultante se dejó estar a 4ºC durante 18 horas y se centrifugó a aproximadamente 8.000 rpm durante 30 min, para obtener aproximadamente 19 L de sobrenadante conteniendo el presente polipéptido.

El sobrenadante se alimentó a una columna empaquetada con aproximadamente 4,6 L de "PHENYL SEPHAROSE" (fenil sefarosa), un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala Sweden, que se había equilibrado con tampón fosfato 50 mM (pH 7,3) conteniendo sulfato de amonio uno M, y la columna se lavó con una preparación reciente del mismo tampón, y se alimentó a una SV (velocidad espacial) de 0,57 con un gradiente lineal de tampón comprendido entre 1 M y 0,2 M de sulfato de amonio en tampón fosfato 50 mM (pH 7,3). Las fracciones conteniendo el presente polipéptido eluidas en sulfato de amonio 0,8 M se recogieron y reunieron en aproximadamente 4,8 L de solución que después se concentró con un filtro de membrana, se dializaron frente a tampón fosfato 20 mM (pH 6,5) a 4ºC durante 18 horas, y se alimentaron a una columna empaquetada con aproximadamente 250 ml de "DEAE-SEPHAROSE", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden. La columna se lavó con una preparación reciente del mismo tampón y se alimentó a una SV de 1,2 con un gradiente lineal de tampón comprendido entre 0 M y 0,2 M de cloruro de sodio en tampón fosfato 20 mM (pH 6,5) para eluir y recoger aproximadamente 260 ml de fracciones conteniendo el presente polipéptido eluido a una concentración de aproximadamente 0,13 M de cloruro de sodio.

Las fracciones conteniendo el presente polipéptido se recogieron, se reunieron, se concentraron y se dializaron frente a tampón Bis-Tris 25 mM (pH 7,1) a 4ºC durante 18 horas. La solución dializada se aplicó a una columna empaquetada con aproximadamente 24 ml de "MONO-P", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suiza, y se eluyeron con politampón 74 10% v/v (pH 4,0) mientras decrecía el pH de 7 a 4 para obtener aproximadamente 23 ml de eluato conteniendo el presente polipéptido. Se concentró el eluato, se alimentó a una columna empaquetada con "SUPER-DEX 75", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suiza, que se había equilibrado con una solución mixta (pH 7,2) conteniendo hidrógeno fosfato disódico 7 mM, dihidrógeno fosfato de sodio 3 mM, y cloruro de sodio 139 mM, y se sometió a cromatografía de filtración en gel para eluir fracciones, conteniendo el presente polipéptido a alrededor de 19.000 daltons, con una preparación reciente de la misma solución. Las fracciones se recogieron y se concentraron para uso en el Ejemplo A-2. El rendimiento del presente polipéptido fue de aproximadamente 0,6 \mug/ratón.

\newpage

Ejemplo A-2

Secuencia parcial de aminoácidos del polipéptido

Una porción de una solución acuosa conteniendo el polipéptido purificado en el Ejemplo A-1 se concentró hasta un volumen de aproximadamente 50 \mul, que después se mezcló con 25 \mul de una solución que contenía 3% p/v de SDS, 60% v/v de glicerol, y 60 mg/ml de ditiotreitol. La mezcla resultante se incubó a 50ºC durante 30 min, se dispuso sobre gel de poliacrilamida al 15% p/v, y se sometió a electroforesis de la forma habitual. El gel resultante se tiñó absorbiéndolo en una solución mixta de una solución acuosa de ácido acético al 10% v/v y metanol acuoso al 50% v/v conteniendo 0,1% p/v azul brillante de coomassie R 250, se destiñó por lavados repetidos del gel con una solución mixta de metanol acuoso al 12% v/v y solución acuosa de ácido acético al 7% v/v, y se lavó absorbiéndolo en agua destilada durante 18 horas. Se cortó una porción del gel, que estaba teñida con azul brillante de coomassie y contenía el presente polipéptido, y se liofilizó.

El gel liofilizado se absorbió en 0,6 ml de una solución que constaba de hidrógeno carbonato de sodio 100 mM conteniendo 2 \mug/ml de "TPCK TRYPSIN", cloruro de calcio 0,5 mM y solución acuosa de Tween 20 al 0,02% v/v, seguido por incubación a 37ºC durante 18 horas para tripsinizar la proteína. El material resultante se centrifugó para obtener un sobrenadante, mientras que el precipitado resultante se absorbió en un ml de trifluoracetato acuoso al uno % v/v conteniendo Tween 20 al 0,001% v/v, se sacudió durante 4 horas a temperatura ambiente, y se centrifugó para obtener un sobrenadante. El precipitado nuevamente formado se trató sucesivamente similarmente como antes con trifluoracetato acuoso 70 v/v conteniendo 0,001 v/v de Tween 20 y con acetonitrilo acuoso al 50% v/v para obtener un sobrenadante. El sobrenadante resultante y el sobrenadante ya obtenido anteriormente se reunieron y se concentraron para dar 250 \mul que después se filtraron centrífugamente.

La solución acuosa resultante conteniendo los fragmentos peptídicos se alimentó en "HPLC ODS-120T", una columna para HPLC comercializada por Tosoh Corporation, Tokyo, Japón, la cual había sido previamente equilibrada con trifluoracetato acuoso al 0,1% v/v, y la columna se lavó con triflúor acetato acuoso al 0,1% v/v, y se alimentó con triflúor acetato al 0,1% v/v a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min mientras que la concentración de acetonitrilo acuoso se aumentaba de 0% v/v hasta 70% v/v y la concentración del péptido en el eluato se monitorizó mediante un espectrofotómetro a longitudes de onda de 214 nm y 280 nm. Las fracciones eluidas a aproximadamente 75 min y aproximadamente 55 min después del inicio de la elución se recogieron respectivamente (de aquí en adelante denominadas "fragmento peptídico A" y "fragmento peptídico B"). El patrón de elución fue el de la Fig. 1.

Los fragmentos peptídicos A y B se analizaron en "MODEL 473 A", un secuenciador de proteínas comercializado por Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, USA, y revelaron tener las secuencias de amino ácidos de las SEQ ID NOs: 4 y 5.

Ejemplo A-3

Secuencia de Bases del DNA codificante de la proteína y secuencia de amino ácidos del polipéptido

Ejemplo A-3-1

Preparación del RNA completo

Se pesaron tres g de células hepáticas de ratón húmedas, preparadas de forma similar al método del Ejemplo A-1, se embebieron en 20 ml de una solución mixta que contenía isotiocianato de guanidina 6 M, citrato de sodio 10 mM, y 0,5 p/v de SDS, y se rompieron con un homogeneizador. Se inyectaron tubos de centrifugación de treinta y cinco ml con 25 ml de EDTA 0,1 M (pH 7,5) conteniendo cloruro de cesio 5,7 M, y se depositaron 10 ml de la suspensión celular homogeneizada sobre la parte superior de las soluciones en los tubos, seguido por centrifugación de los tubos a 25.000 rpm durante 20 horas para recoger fracciones de RNA. Las fracciones se reunieron, se distribuyeron en tubos de centrifugación de 15 ml, y se mezclaron con volúmenes iguales de una solución mixta de cloroformo e isobutanol (= 4:1 en volumen). Los tubos se hicieron vibrar durante 5 min y se centrifugaron a 4ºC y a 10.000 rpm durante 10 min, y las capas acuosas formadas se recogieron, se reunieron, se mezclaron con volúmenes de 2,5 veces de etanol, y se dejaron estar a -20ºC durante 2 horas para precipitar los RNAs completos. El precipitado se recogió, se reunió, se lavó con etanol acuoso al 75% v/v, y se disolvió en 0,5 ml de agua destilada esterilizada para uso en el Ejemplo A-3-2. El rendimiento de los RNAs fue de aproximadamente 4 mg, d.s.b.

Ejemplo A-3-2

Preparación de fragmentos de DNA parcialmente codificantes del polipéptido

Se mezcló un \mug de los RNAs completos del Ejemplo A-3-1 con 4 \mul de cloruro de magnesio 25 mM, 2 \mul de una solución que constaba de tampón 10xPCR, tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,3) y cloruro de potasio 500 mM, 8 \mul de una mezcla de dNTP uno mM, un \mul de una solución conteniendo una unidad/\mul de inhibidor de RNasa, un \mul de una solución conteniendo 2,5 unidades/\mul de transcriptasa inversa, y un \mul de un hexámero random 2,5 \muM, y se mezcló adicionalmente con agua para dar un volumen total de 20 \mul. La solución mixta se dispuso en tubos de reacción de 0,5 ml, y, de la forma habitual, se incubaron sucesivamente a 25ºC durante 10 min, a 42ºC durante 30 min, a 99ºC durante 5 min, y a 5ºC durante 5 min para efectuar la reacción de la transcriptasa inversa, seguido por recuperación de una solución acuosa conteniendo la primera hebra de cDNA.

A 20 \mul de la solución acuosa se añadieron 4 \mul de cloruro de magnesio 25 mM, 8 \mul de tampón 10xPCR, 0,5 \mul de una solución conteniendo 2,5 unidades/\mul de DNA polimerasa AmpliTaq comercializada por Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, USA, y un pmol de cada uno de los cebadores 1 y 2 como cebador en sentido o un cebador anti-sentido. La solución mixta se llevó a un volumen de 100 \mul con agua destilada esterilizada, y, de la forma habitual, se incubó sucesivamente a 94ºC durante un min, a 45ºC durante 2 min, a 72ºC durante 3 min de una forma cíclica durante 40 ciclos para ampliar un fragmento de DNA, que codifica parcialmente el presente polipéptido, utilizando la primera hebra de cDNA como un molde. Los cebadores 1 y 2 eran oligonucleótidos, que se sintetizaron químicamente en base a las secuencias de amino ácidos de Pro-Glu-Asn-Ile-Asp-Asp-Ile y Phe-Glu-Asp-Met-Thr-Asp-Ile en las SEQ ID NOs: 4 y 5, tenían las secuencias de 5'-ATRTCRTCDATRTTYTCNGG-3' y 5' TTYGARGAYATGACNGAYAT-3'.

Una porción del producto de PCR resultante se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa al 2% p/v, se transfirió a una película de nylon, se fijó con hidróxido de sodio 0,4 N, se lavó con 2 x SSC, se secó al aire, se embebió en una solución de prehibridación conteniendo 5xSSPE, 5 x solución de Denhardt, 0,5% p/v de SDS y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, y se incubó a 65ºC durante 3 horas. Se sintetizó un oligonucleótido como una sonda 1 que tenía una secuencia de bases de 5'-TTYGARGARATGGAYCC-3' basada en la secuencia de amino ácidos Phe-Glu-Glu-Met-Asp-Pro de la SEQ ID NO: 4, y se marcó con [\gamma^{32}P]ATP y polinucleótido quinasa T4.

SEQ ID NO: 4:

\sa{Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile}

\sac{Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys}

La película de nylon se embebió en una solución que contenía un pmol de la sonda 1, 5xSSPE, 5 x solución de Denhardt, 0,5% p/v de SDS, y 100 \mug/ml de un DNA de esperma de salmón desnaturalizado, y se incubó a 45ºC durante 24 horas para efectuar la hibridación. La película de nylon resultante se lavó con 6xSSC y se autorradiografió de la forma habitual y reveló que el producto de PCR contenía el fragmento de DNA objeto.

El producto de PCR residual se mezcló con 50 ng de "pT7 BLUE T", un vector plasmídico comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japón, una cantidad adecuada de T4 ligasa, y se mezcló adicionalmente con ATP 10 mM hasta dar una concentración de uno mM, seguido por la incubación a 16ºC durante 18 horas para insertar el fragmento de DNA en el vector plasmídico. El DNA recombinante así obtenido se introdujo en Escherichia coli cepa NoVa Blue, un microorganismo de la especie Escherichia coli comercializada por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suiza, para obtener un transformante que después se inoculó en una placa de medio que contenía 10 g/l de bactotriptona, 2,5 g/l de cloruro de sodio, 15 g/l de bacto-agar, 100 mg/l de ampicilina, 40 mg/l de X-Gal y 23,8 mg/l de isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranósido (de aquí en adelante abreviado como "IPTG"), y se incubó a 37ºC durante 24 horas para formar colonias. Se colocó una película de nylon de la forma habitual sobre una placa de medio y se dejó estar durante aproximadamente 30 segundos para adherir las colonias a la misma. La película de nylon fue después desprendida de la placa y embebida durante 7 min en una solución que contenía hidróxido de sodio 0,5 N y cloruro de sodio 1,5 M para efectuar la lisis celular. Después de esto, la película de nylon se embebió adicionalmente durante 3 min en tampón Tris-HCl 0,5 M (pH 7,2) que contenía cloruro de sodio 1,5 M, se lavó con 2xSSC, se embebió en hidróxido de so dio 0,4 N durante 20 min para fijar el DNA, se lavó con 5xSSC, se secó al aire, se embebió en una solución de prehibridación que contenía 5xSSPE, 5 x solución de Denhardt, 0,5% p/v de SDS, y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, y se incubó a 65ºC durante 3 horas. Las colonias formadas sobre la película de nylon se hibridaron de la forma habitual con la sonda 1, se lavaron con 6xSSC, y se autorradiografiaron similarmente como antes, seguido por selección de los transformantes que se hibridaron fuertemente con la sonda 1.

Los transformantes se inocularon en caldo L (pH 7,2) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se incubaron a 37ºC durante 18 horas, seguido por recolección de las células a partir del cultivo y recolección del DNA recombinante por el método convencional álcali-SDS. El análisis del método didesoxi reveló que el DNA recombinante contenido en un fragmento de DNA que constaba de las secuencias de bases correspondientes a las bases posicionadas entre desde la 85 hasta la 281 de la SEQ ID NO: 3.

Ejemplo A-3-3

Preparación del mRNA

Se colocaron 0,05 ml de una solución acuosa que contenía los RNAs completos del Ejemplo A-3-1 en un tubo de ensayo, se mezclaron con 0,5 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) conteniendo EDTA uno mM y 0,1% p/v de SDS, y se llevó el volumen hasta un ml con agua destilada esterilizada. A la mezcla se añadió un ml de "OLIGOTEX-dT30 SUPER", un oligo-d(T)_{30} látex comercializado por Nippon Roche K.K., Tokyo, Japón, seguido por la incubación a 65ºC durante 5 min para desnaturalizar los RNAs y el enfriamiento durante 3 min en un baño helado con hielo. La mezcla resultante se mezcló con 0,2 ml de cloruro de sodio 5 M, se incubó a 37ºC durante 10 min, y se centrifugó a 10.000 rpm a 25ºC durante 10 min. Se suspendió el precipitado en forma de un pellet en 0,5 ml de agua destilada esterilizada, y se incubó a 65ºC durante 5 min para extraer el mRNA del oligo-d(T)_{30} látex. El rendimiento del mRNA fue de aproximadamente 5 \mug.

Ejemplo A-3-4

Preparación de la biblioteca de cDNA

Se preparó una biblioteca de cDNA a partir del mRNA del Ejemplo A-3-3 utilizando "cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS", un kit de clonación de cDNA comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA. Los procedimientos fueron como sigue: A un tubo de reacción de 1,5 ml se añadieron sucesivamente 4 \mul de una solución para sintetizar la primera hebra de cDNA, un \mul de solución de pirofosfato de sodio, un \mul de una solución de inhibidor de ribonucleasa de placenta humana, 2 \mul de mezcla de desoxinucleósido trifosfato, y un \mul de cebado oligo-d(T)_{16}. La mezcla resultante se mezcló con 2 \mul de mRNA del Ejemplo A-3-3, se llevó el volumen hasta 19 \mul con agua destilada esterilizada, se mezcló con un \mul de una solución que contenía 20 unidades de transcriptasa inversa, y se incubó a 42ºC durante 40 min para obtener una mezcla de reacción que contenía la primera hebra de cDNA.

La mezcla así obtenida se mezcló con 37,5 \mul de una solución para sintetizar la segunda hebra de cDNA, 0,8 unidades de ribonucleasa H procedente de Escherichia coli, 23 unidades de DNA polimerasa, y el volumen se llevó hasta 100 \mul con agua destilada esterilizada. La mezcla resultante se incubó sucesivamente a 12ºC durante 60 min y a 22ºC durante 60 min, se mezcló con 2 unidades de DNA polimerasa de T4, y se incubó a 37ºC durante 10 min para obtener una mezcla de reacción que contenía la segunda hebra de cDNA. A la mezcla de reacción se añadieron 4 \mul de EDTA 0,25 M (pH 8,0) para suspender la reacción, y la mezcla resultante se extrajo de la forma habitual con fenol y cloroformo y se trató con etanol para precipitar el cDNA objeto, seguido por la recuperación del precipitado.

Al cDNA así obtenido se añadieron 2 \mul de tampón L/K, 250 pmoles de adaptador de Eco RI, y 2,5 unidades de DNA ligasa de T4 por este orden, y la solución resultante se llevó a un volumen de hasta 20 \mul con agua destilada esterilizada, y se incubó a 15ºC durante 16 horas para ligar el adaptador de Eco RI a los dos extremos del cDNA. La mezcla de reacción se mezcló con 2 \mul de EDTA 0,25 M para inactivar la enzima residual, y se sometió a cromatografía de tamices moleculares para separar el adaptador de Eco RI intacto. Al producto resultante se añadieron 40 \mul de tampón L/K, 80 unidades de polinucleótido quinasa de T4, y la mezcla se llevó hasta un volumen de 400 \mul con agua destilada esterilizada, seguido por incubación a 37ºC durante 30 minutos para metilar los sitios de ruptura de Eco RI. La mezcla resultante se extrajo con fenol y cloroformo y se trató con etanol para precipitar el DNA objetivo, seguido por recuperación del DNA. Al DNA se añadieron 1,5 \mul de tampón L/K conteniendo una cantidad adecuada de \lambdagt 10 brazos, y 2,5 unidades de DNA ligasa de T4, y la solución resultante se llevó hasta un volumen de 15 \mul con agua destilada esterilizada, se incubó a 15ºC durante 16 horas para efectuar la ligación, y se sometió a un método convencional de empaquetamiento in vitro para obtener un fago que contenía un \lambdaDNA recombinante.

Ejemplo A-3-5

Clonación del DNA recombinante

Un cultivo sembrado de la cepa de Escherichia coli NM514 se infectó de la forma habitual con el fago del Ejemplo A-3-4, y las células infectadas se inocularon en una placa de agar (pH 7,0) conteniendo 10 g/l de bacto-triptona, 5 g/l de extracto de bacto-levadura, 10 g/l de cloruro de sodio y 15 g/l de bacto-agar, y se incubó a 37ºC durante 16 horas para formar placas. La placa de agar se cubrió con una película de nylon y se dejó estar durante aproximadamente 30 segundos para adherirse a las placas. La película de nylon se desprendió de la placa y, sucesivamente se embebió en una solución acuosa que contenía hidróxido de sodio 0,5 M y cloruro de sodio 1,5 M durante 7 min y en tampón Tris-HCl 0,5 M (pH 7,0) conteniendo cloruro de so dio 1,5 M durante 3 minutos. La película de nylon se lavó con 2 x SSC, se aireó, se embebió en hidróxido de sodio 0,4 N durante 20 min, se lavó con 5 x SSC, se secó al aire, se embebió en una solución conteniendo 5 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, SDS 0,5% p/v, y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y se incubó a 65ºC durante 3 horas. Después de esto, se incubó la película de nylon resultante en una solución que contenía una cantidad adecuada de fragmento de DNA con la sonda 2 obtenida en el Ejemplo A-3-2 y se marcó con 32P mediante "READY PRIMEDNA LABELLING SYSTEM", un kit marcador de DNA comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, 5 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, SDS 0,5% p/v y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, y la mezcla se incubó a 60ºC durante 20 horas para efectuar la hibridación. El producto resultante se sometió a radioautografía de forma similar a la anterior para seleccionar los clones de DNA del fago que se hibridaron fuertemente con la sonda 2.

Con técnicas convencionales, se ampliaron los clones en Escherichia coli, seguido por extracción con un DNA recombinante procedente de las células. El DNA recombinante se rompió con Eco RI, una enzima de restricción. El vector plasmídico pUC19 (ATCC 37254) se rompió con la misma enzima de restricción, y los fragmentos de DNA rotos resultantes y los fragmentos plasmídicos se ligaron con DNA ligasa para obtener un DNA recombinante que después se introdujo en la cepa JM109 de Escherichia coli (ATCC 53323) por el método de células competentes convencional para obtener un transformante.

Ejemplo A-3-6

Determinación de la secuencia de bases de DNA y secuencia de amino ácidos del polipéptido

Se inoculó el transformante del Ejemplo A-3-5 en caldo L (pH 7,2) y se cultivó a 37ºC durante 18 horas bajo condiciones de sacudida. Se recogieron las células proliferadas resultantes y se trataron con el método convencional del álcali-SDS para obtener un DNA recombinante que contenía el DNA de acuerdo con la presente invención. El análisis en un secuenciador automático utilizando un fluorfotómetro reveló que el DNA recombinante contiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 3. La descodificación de la secuencia de bases indicó que codificaba la secuencia de amino ácidos en la SEQ ID NO: 3. La secuencia de amino ácido contiene las secuencias parciales de amino ácidos de la SEQ ID NOs: 4 y 5 correspondientes a los amino ácidos situados desde el 79 hasta el 103 y desde el 26 hasta el 43 en la SEQ ID NO: 3, y esto significa que en ratón el polipéptido que tiene la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 3 está también codificado por el DNA en la SEQ ID NO: 3 donde el símbolo "Xaa" significa "metionina" o "treonina".

SEQ ID NO: 5:

\sa{Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu}

\sac{Pro Gln}

En los siguientes Ejemplos A-4 a A-7, se preparó un cDNA, que codificaba otro polipéptido que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, a partir de mRNA de hígado humano utilizando como sonda un fragmento de DNA de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 3. El cDNA se analizó en cuanto a la secuencia de bases y se descodificó para determinar la secuencia de amino ácidos del polipéptido. Se dejó expresar el cDNA en Escherichia coli, seguido por estudio de las características y propiedades del polipéptido formado.

Ejemplo A-4

Secuencia de bases del DNA codificante del polipéptido y secuencia de amino ácidos del polipéptido

Ejemplo A-4-1

Preparación de una biblioteca de cDNA

Se preparó una biblioteca de cDNA a partir de un RNA de hígado humano suplementado con "POLY A", un producto comercializado por Clonatec-BIOSOFT, Paris Cedex, France, utilizando "cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS", un kit de clonación de cDNA comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA. Los procedimientos fueron como sigue: En un tubo de reacción de 1,5 ml se añadieron sucesivamente 10 \mul de una solución para sintetizar la primera hebra de cDNA, 2,5 \mul de pirofosfato de sodio uno mM, 2,5 \mul de una solución conteniendo un \mug/l de un inhibidor de ribonucleasa de placenta humana, 5 \mul de una solución conteniendo un \mug/l de una mezcla de un desoxinucleótido trifosfato, 2,5 \mul de una solución conteniendo un \mug/l del cebador oligo-dT, 5 \mul de un RNA de hígado humano suplementado con poli (A) y se llevó el volumen hasta 45 \mul con agua destilada esterilizada. Después de esto, la mezcla resultante se mezcló con 5 \mul de una solución conteniendo 100 unidades de una transcriptasa inversa, y se incubó a 42ºC durante 40 min para obtener una mezcla de reacción que contenía la primera hebra de cDNA.

A la mezcla de reacción se añadieron 93,5 \mul de una solución para sintetizar la segunda hebra de cDNA, 4 unidades de ribonucleasa H procedente de Escherichia coli, 115 unidades de DNA polimerasa, y se llevó el volumen hasta 250 \mul con agua destilada esterilizada. La mezcla resultante se incubó sucesivamente a 12ºC durante 60 min, a 22ºC durante 60 min, y a 70ºC durante 10 min, se mezcló con 10 unidades de T4 polimerasa, y se incubó adicionalmente a 37ºC durante 10 min. A la mezcla de reacción se añadieron 10 \mul de EDTA 0,25 M (pH 8,0) para suspender la reacción, y la mezcla resultante se extrajo de la forma habitual con fenol y cloroformo, y se trató con etanol para precipitar la segunda hebra de cDNA objeto seguido por recuperación del precipitado.

A la segunda del cDNA así obtenido se añadieron 2 \mul de tampón L/K (pH 8,0), 250 pmoles de adaptador de EcoRI, y 2,5 unidades de DNA ligasa de T4, y la solución resultante se llevó hasta un volumen de 20 \mul con agua destilada esterilizada, y se incubó a 15ºC durante 16 horas para ligar el adaptador de Eco RI a los dos extremos del cDNA. La mezcla resultante se mezcló después con 2 \mul de EDTA 0,25 M para suspender la reacción, y se sometió a cromatografía de tamices moleculares para separar el adaptador de Eco RI intacto. Al producto resultante se añadieron 40 \mul de tampón L/K (pH 8.0) y 80 unidades de polinucleótido quinasa de T4, y la mezcla se llevó hasta un volumen de 400 \mul con agua destilada esterilizada, seguido por la incubación a 37ºC durante 30 min para metilar los sitios de ruptura de Eco RI. La mezcla resultante se extrajo con fenol y cloroformo y se trató con etanol para precipitar el cDNA objeto, seguido por recuperación del cDNA. Al cDNA se añadieron 1,5 \mul de tampón L/K (pH 8,0) conteniendo una cantidad adecuada de brazos \lambdagt 10, y 2,5 unidades de DNA ligasa de T4, y la solución resultante se llevó hasta un volumen de 15 \mul con agua destilada esterilizada, se incubó a 15ºC durante 16 horas para efectuar la ligación, y se sometió a un método de empaquetado in vitro para obtener un fago que contenía un \lambdaDNA recombinante.

Ejemplo A-4-2

Clonación del DNA recombinante

Un cultivo sembrado de una cepa de Escherichia coli NM514 se infectó de la forma habitual con el fago del Ejemplo A-4-1, y las células infectadas se inocularon en una placa de agar (pH 7,0) conteniendo 10 g/l de bacto-tripton, 5 g/l de extracto de bacto-levadura, 10 g/l de cloruro de sodio, y 15 g/l de bacto-agar, y se incubó a 37ºC durante 16 horas para formar placas. De acuerdo con el método convencional, se cubrió la placa de agar con una película de nylon y se dejó estar durante aproximadamente 30 segundos para adherirla a las placas. Después de esto, se desprendió la película de nylon de la placa, y se embebió sucesivamente en una solución acuosa que contenía hidróxido de sodio 0,5 N Y cloruro de sodio 1,5 M durante 7 min y en tampón Tris-HCl 0,5 M (pH 7,0) conteniendo cloruro de sodio 1,5 M durante 3 min. La película de nylon se lavó con 2 x SSC, se secó al aire, se embebió en hidróxido de sodio 0,4 N durante 20 min, se lavó con 5 x SSC, se secó al aire, se embebió en una solución que contenía 5 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, 0,5% p/v de SDS y DNA de esperma de salmón desnaturalizado, y se incubó a 65ºC durante 3 horas. Para clonar el DNA recombinante objeto, se marcó un fragmento de DNA que tenía la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 3 con ^{32}P mediante "READY PRIME DNA LABELLING SYSTEM", una kit marcador de DNA comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, para obtener la sonda 3. Los procedimientos fueron como sigue: Se colocaron en un tubo de reacción de 1,5 ml 25 ng de un fragmento de DNA preparado por el método del Ejemplo A-3-5, se llevó hasta un volumen de 45 \mul de agua destilada esterilizada, se incubó a 95ºC durante 3 min, y se transfirió a otro tubo de reacción. Se añadieron cinco \mul de solución de [\alpha-^{32}P]dCTP al tubo de reacción, y se marcó incubándolo a 37ºC durante 30 min. Después de esto, el producto resultante conteniendo el fragmento de DNA marcado se sometió a cromatografía de tamices moleculares convencional para separar intacto el [\alpha-^{32}P].

La película de nylon anterior se embebió en una solución mixta que contenía 5 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, 0,5% p/v de SDS, y 100 \mug/ml de un DNA de esperma de salmón desnaturalizado, y la mezcla se incubó a 60ºC durante 20 horas para efectuar la hibridación, y se incubó adicionalmente a temperatura ambiente en 6 x SSC durante 20 min y en 2 x SSC durante 20 min. El producto resultante se lavó y se sometió a autorradiografía de forma similar a la anterior para seleccionar los clones de DNA del fago que se había hibridado fuertemente con la sonda 3. Con técnicas convencionales, se ampliaron los clones de DNA en Escherichia coli, seguido por la extracción de un DNA recombinante procedente de las células. El DNA recombinante se rompió con Eco RI, una enzima de restricción. El vector plasmídico pUC19 (ATCC 37254) se rompió con la misma enzima de restricción, y los fragmentos de DNA rotos y los fragmentos del plásmido se ligaron con DNA ligasa para obtener un DNA recombinante que después se introdujo en la cepa JM109 de Escherichia coli (ATCC 53323) mediante el método de células competentes convencional para obtener un transformante que contenía el presente DNA.

Ejemplo A-4-3

Determinación de la secuencia de bases y de la secuencia de aminoácidos del polipéptido

El transformante del Ejemplo A-4-2 se inoculó en caldo L (pH 7,2) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina, y se cultivó a 37ºC durante 18 horas bajo condiciones de sacudida. Las células proliferadas se recogieron por centrifugación y se trataron con el método convencional del álcali-SDS para extraer un DNA recombinante. El análisis de la secuencia de bases en un secuenciador automático utilizando un fluorómetro reveló que el DNA recombinante contenía la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 6. La secuencia de amino ácidos estimable a partir de la secuencia de bases se muestra también en la SEQ ID NO: 6, y esto indica que el presente polipéptido tiene una secuencia de amino ácidos, por ejemplo, la de la SEQ ID NO: 1, y que el polipéptido está codificado por el DNA de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2. En la SEQ ID NO: 6, el amino ácido que se muestra por "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina".

Ejemplo A-5

Preparación de DNA recombinante y transformante

En un tubo de reacción de 0,5 ml se añadieron 8 \mul de cloruro de magnesio 25 mM, 10 \mul de tampón 10 x PCR, 8 \mul de una mezcla de dNTP uno mM, 0,5 \mul de una solución conteniendo 2,5 unidades/\mul de Ampli-Taq DNA polimerasa, y un ng del DNA recombinante del Ejemplo A-4-2. La mezcla resultante se mezcló con cantidades adecuadas de 2 oligonucleótidos, como un cebador de secuencia o un cebador anti-sentido, que tiene las secuencias de bases representadas por 5'-CGAGGGATCCTACTTTGGCAAGCTTG-3' y 5'-CAAGGAATTCCTAGTCTTCGTTTTG-3' que se habían sintetizado químicamente en base a las secuencias de bases próximas al N- y C-terminales de la SEQ ID NO: 1, y el volumen se llevó hasta 100 \mul con agua destilada esterilizada. La mezcla resultante se incubó sucesivamente de la forma habitual a 94ºC durante un minuto, a 60ºC durante 2 min, y a 72ºC durante 3 min, y este ciclo de incubación se repitió durante 40 veces para obtener un producto PCR que se después se escindió con Bam HI y Eco RI como enzimas de restricción para obtener un fragmento de Bam HI-Eco RI DNA. El fragmento de Bam HI-Eco RI DNA se mezcló con una cantidad adecuada de agua destilada esterilizada. La solución se mezcló con 10 ng de "pGEX-2T", un vector plasmídico comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden, que se había escindido previamente con Bam HI y Eco RI DNA como enzima de restricción, 10 \mul de 10 x tampón de ligación, y una cantidad adecuada de ATP 10 mM para dar una concentración final de uno mM, seguido por incubación a 16ºC durante 18 horas para obtener el pHIGIF de DNA recombinante replicable.

El pHIGIF de DNA recombinante se introdujo en la cepa DH5\alpha de Escherichia coli comercializada por Toyobo Co., Ud., Tokyo, Japón, y el transformante resultante "HIGIF" se inoculó en caldo L (pH 7,2) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina, y se incubó a 37ºC durante 18 horas bajo condiciones de sacudida. El cultivo resultante se centrifugó para obtener los transformantes que después se sometieron al método convencional del álcali-SDS para extraer el pHIGIF de DNA recombinante. El análisis del pHIGIF recombinante en el método didesoxi reveló que, como se muestra en la Fig. 2, el "cDNA de HIGIF" o el cDNA de la SEQ ID NO: 2 se ligaba a los sitios en el sentido de los genes para el promotor Tac y la glutation S-transferasa.

Ejemplo A-6

Producción del polipéptido procedente del transformante

El transformante HIGIF del Ejemplo A-5 se inoculó en caldo T (pH 7,2) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina, y se incubó a 37ºC durante 18 horas bajo condiciones de sacudida para obtener un cultivo sembrado. Se dispusieron dieciocho alícuotas L de una preparación reciente de caldo T (pH 7,2) en fermentadores de recipientes de 30-L, se inocularon con un uno % v/v del cultivo de siembra, y se cultivaron a 37ºC bajo condiciones de aireación-agitación. Durante el proceso de cultivo, se muestreó y monitorizó el cultivo en cuanto a su absorbancia a una longitud de onda de 650 nm, y, cuando la absorbancia llegó hasta aproximadamente 1,5, se añadió IPTG al cultivo hasta proporcionar 0,1 mM. Después de esto, se incubó adicionalmente el cultivo durante otras 5 horas y se centrifugó para separar las células procedentes del cultivo. Las células se suspendieron en una solución mixta (pH 7,2) conteniendo cloruro de sodio 139 mM, hidrógeno fosfato disódico 7 mM, y dihidrógeno fosfato sódico 3 mM, se trató de la forma habitual con ultrasonidos, y se centrifugó para obtener un sobrenadante.

El sobrenadante se alimentó a una columna empaquetada con "GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden, que había sido previamente equilibrada con una solución mixta (pH 7,2) conteniendo cloruro de sodio 139 mM, hidrógeno fosfato disódico 7 mM y dihidrógeno fosfato sódico 3 mM. Se lavó la columna con una preparación reciente de la misma solución mixta, y se añadieron 100 U de trombina a un ml del gel en la columna para efectuar la reacción de ruptura enzimática mientras se dejaba estar la columna a temperatura ambiente durante 16 horas. Se alimentó la columna con una preparación reciente de la misma solución mixta para eluir el producto de reacción, y el eluato se alimentó a una columna empaquetada con "SUPERDEX 75", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden, seguido por recolección de las fracciones correspondientes próximas a 18.500 daltons. Las fracciones se reunieron, se concentraron y se liofilizaron para obtener un pro-
ducto sólido que contenía el presente polipéptido con un rendimiento de aproximadamente 80 \mug por un L del cultivo.

Ejemplo A-7

Propiedades fisicoquímicas del polipéptido

Ejemplo A-7-1

Peso molecular

De acuerdo con el método reportado por U. K. Laemmli en Nature, Vol. 227, pp. 680-685 (1970), el polipéptido purificado preparado por el método del Ejemplo A-6 se sometió a electroforesis en un gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) poliacrilamida libre de agente reductor para mostrar principalmente una única banda de proteína con una inducibilidad de IFN-\gamma en una posición correspondiente a aproximadamente 18.500\pm3.000 daltons. Las proteínas marcadoras utilizadas en este experimento fueron albúmina de suero de ternera (PM = 67.000 daltons), ovoalbúmina (PM = 45.000 daltons), inhibidor de tripsina de soja (PM = 20.100 daltons), y \alpha-lactalbúmina (PM = 14.400 daltons).

Ejemplo A-7-2

Punto isoeléctrico

El polipéptido purificado en el Ejemplo A-6 se cromatoenfocó para mostrar un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,9\pm1,0.

Ejemplo A-7-3

Secuencia de amino ácidos conteniendo el N-terminal

El polipéptido purificado del Ejemplo A-6 se analizó en un "MODEL 473 A", un secuenciador de proteínas comercializado por Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, USA, y reveló que tenía la estructura en la que un péptido, "Gly-Ser-", se copulaba con un resto de tirosina en la secuencia de amino ácidos N-terminal de la SEQ ID NO: 7 mediante la adición de glutation S-transferasa y mediante la ruptura con trombina.

SEQ ID NO: 7:

\sa{Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser}

Ejemplo A-7-4(a)

Actividad biológica

A partir de ratones hembras C3H/HeJ, de 8 semanas de edad, se extrajeron sus bazos que después se suspendieron en medio RPMI 1640 libre de suero (pH 7,4), y las células resultantes se lavaron con una preparación reciente del mismo medio, y se embebieron en solución Gey (pH 8,0) para efectuar la hemolisis. Las células de bazo resultantes se suspendieron en medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con 10% v/v de suero de ternera para dar una densidad de células de 1 x 10^{7} células/ml. Se distribuyeron alícuotas de diez ml de la suspensión celular en discos petri de plástico, de 9 cm de diámetro, y se incubaron a 37ºC durante una hora en un incubador con 5% v/v de CO_{2}. Solamente se recogieron las células que sobrenadaban en los cultivos resultantes y se lavaron con medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con suero de ternera al 10% v/v para uso en el siguiente ensayo para inducción de IFN-\gamma.

Las células de bazo de ratón se suspendieron en medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con 10% v/v de suero de ternera para dar una densidad celular de 1 x 10^{7} células/ml, y se inyectaron alícuotas de 0,15 ml de ello en microplacas de 96 pocillos, seguido por adición a cada pocillo de 0,05 ml de una solución de un polipéptido purificado diluido con una preparación reciente del mismo medio, e incubación de las células con o sin la adición de 0,05 ml de 2,5 \mug/ml de concanavalina A o 50 unidades/ml de interleuquina 2, e incubación del producto resultante a 37ºC durante 24 horas en un incubador con un 5% v/v de CO_{2}. Después de completarse el cultivo, el sobrenadante resultante en cada pocillo se muestreó tomando 0,1 ml para analizar la actividad del IFN-\gamma formado con inmunoensayo enzimático. Como control, se proporcionó un sistema similar al sistema anterior y se trató de forma similar como antes excepto porque no se utilizaba el polipéptido purificado, concanavalina A e interleuquina 2. Como patrón de IFN-\gamma se utilizó una preparación de IFN-\gamma de ratón Gg02-901-533, obtenida del National Institute of Health, USA, y se expresó la actividad con unidades internacionales (IU). Los resultados fueron los de la Tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

	Producción de IFN-\gamma por células de bazo de ratón (UI/ml)
Concentración	Muestra	Muestra más	Muestra más
de la muestra		concanavalina A	interleuquina 2
(\mug/ml)
10,00	12	138	118
3,33	6	88	55
1,11	5	56	16
0,37	5	21	12
0,12	5	12	10
0,04	5	11	7
0	0	4	1
Nota: En la Tabla "Muestra" significa el presente polipéptido.

Ejemplo A-7-4(b)

Inducción de la producción de IFN-\gamma, a partir de linfocitos humanos

Utilizando una jeringa que contenía heparina, se recogió sangre de un donante sano la cual se diluyó después 2 veces con medio RPMI 1640 libre de suero (pH 7,4), Y se depositó una capa sobre ficoll. Se centrifugó el producto resultante a 2.000 rpm durante 20 min para obtener linfocitos que después se lavaron con medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con 10% v/v de suero de ternera, se suspendió en una preparación reciente del mismo medio para dar una densidad celular de 5 x 10^{6} células/ml, y se trató de forma similar a la del Ejemplo A-7-4(a) excepto porque se utilizó un patrón de IFN-\gamma humano, Gg23-901-530, obtenido del National Institute of Health, USA, como patrón de IFN-\gamma. Los resultados fueron los de la Tabla 2.

TABLA 2

	Producción de IFN-\gamma por linfocitos humanos (UI/ml)
Concetración	Muestra	Muestra más	Muestra más
de la muestra		concanavalina A	interleuquina 2
(\mug/ml)
10,00	191	479	1.182
3,33	169	576	1.419
1,11	168	426	1.106
0,37	150	296	739
0,12	74	193	390
0,04	36	137	324
0	1	11	24
Nota: En la Tabla "Muestra" significa el presente polipéptido.

Los resultados de las Tablas 1 y 2 evidencian que el presente polipéptido tiene una actividad inductora de la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes de mamíferos incluyendo humanos y ratones. En los grupos de control, no se encontró ninguna producción significativa de IFN-\gamma mientras que en los sistemas con el polipéptido se observó una producción significativa de IFN-\gamma. Esta actividad del polipéptido está fuertemente aumentada cuando se utiliza en combinación con concanavalina A o interleuquina 2 como cofactor.

Ejemplo A-7-4(c)

Producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes

Se recogió sangre fresca de voluntarios sanos con jeringas heparinizadas, y se diluyó con medio RPMI 1640 libre de suero (pH 7,4) 2 veces. La sangre diluida se depositó sobre Ficoll y se centrifugó para obtener linfocitos que después se lavaron con medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con 10% v/v de suero de ternera fetal, y se suspendió en una preparación reciente del mismo medio para dar una densidad de células de 5 x 10^{6} células/ml. La suspensión celular se distribuyó en microplacas de 96 pocillos en una cantidad de 0,15 ml/pocillo.

El polipéptido obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 se diluyó para dar una concentración apropiada de medio RPMI 1640 (pH 7,4) suplementado con 10% v/v de suero de ternera, y la solución diluida se distribuyó en las microplacas en una cantidad de 0,05 ml/pocillo, seguido por adición a las microplacas de 0,05 ml/pocillo de una preparación reciente del mismo medio suplementado con o sin 2,5 \mug/ml de concanavalina A o 50 unidades/ml de una interleuquina 2 humana recombinante, y se incubaron las microplacas a 37ºC durante 24 horas en un incubador bajo condiciones de un 5% v/v de CO_{2}. Después del cultivo, se muestrearon 0,1 ml de sobrenadante del cultivo en cada pocillo y se analizaron en cuanto al contenido de IFN-\gamma mediante inmunoensayo enzimático convencional. Como control, se proporcionó un sistema libre del polipéptido, y se trató de forma similar a la anterior. Los resultados fueron los de la Tabla 3. En la Tabla, el contenido de IFN-\gamma se calibró utilizando Gg23-901-530, un Internacional Standard (Patrón Internacional) para Interferón, Humano (HuIFN-\gamma), obtenido del National Institute of Health, Bethesda, MD, USA, y se expresó en unidades internacionales (IU).

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TABLA 3

	Producción de IFN-\gamma por linfocitos (UI/ml)
Concentración	Polipéptido	Polipéptido más	Polipéptido más
del polipéptido		0,5 \mug/ml de	10 U/ml de
(ng/ml)		concanavalina A	interleuquina 2
0	0	0	0
1,6	1\pm2	92\pm32	184\pm12
8,0	3\pm1	220\pm21	397\pm31
40,0	6\pm4	380\pm34	526\pm28
200,0	14\pm6	549\pm105	637\pm99

Los resultados de la Tabla 3 muestran que los linfocitos como células inmunocompetentes producen IFN-\gamma cuando el polipéptido actúa sobre ellas. Como es evidente por los resultados, el uso de la combinación del polipéptido y la interleuquina 2 o la concanavalina A como cofactor mejora la producción de IFN-\gamma.

Ejemplo A-7-4(d)

Mejora de la citotoxicidad por células NK

Se recogió sangre fresca de voluntarios sanos con jeringas heparinizadas, y se diluyó 2 veces con tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) conteniendo cloruro de sodio 140 mM. La sangre se depositó sobre PERCOLL, y el producto resultante se centrifugó, y además se sometió a centrifugación en gradiente de PERCOLL para obtener linfocitos de alta densidad.

Los linfocitos se suspendieron en medio RPMI 1640 (pH 7,2) conteniendo 10 \mug/ml de kanamicina, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M, y suero de ternera fetal al 10% v/v para dar una densidad celular de 1 x 10^{6} célula/ml, y la suspensión se distribuyó en microplacas de 12 pocillos en una cantidad de 0,5 ml/pocillo. Se diluyó apropiadamente un polipéptido obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 con una preparación reciente del mismo medio, y la solución diluida se distribuyó en las microplacas en una cantidad de 1,5 ml/pocillo, seguido por la distribución en las microplacas de 0,5 ml/pocillo de una preparación reciente del mismo medio con o sin 50 unidades/ml de interleuquina 2 recombinante humana, se incubaron las microplacas en un incubador a 37ºC durante 24 horas bajo unas condiciones de 5% v/v de CO_{2}, se lavaron las microplacas con tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) conteniendo cloruro de sodio 140 mM para obtener linfocitos cultivados conteniendo células NK como células efectoras. Se distribuyeron células K-562 (ATCC CCL 243), procedentes de leucemia mielógena crónica humana, como una célula diana susceptible a las células NK que se había marcado de la forma habitual con ^{51}Cr, en microplacas de 96 pocillos para dar 1 x 10^{4} células/pocillo, y se añadieron células efectoras a cada pocillo en la relación ((células efectoras):(células diana)) de 2,5:1, 5:1 ó 10:1, y se incubaron en un incubador a 37ºC durante 4 horas bajo unas condiciones de 5% v/v de CO_{2}. De acuerdo con el método convencional, se midió la radioactividad de cada sobrenadante en cada pocillo para contar las células diana muertas. En cada sistema, se calculó el porcentaje de las células diana muertas a las células diana para determinar el nivel de citotoxicidad. Los resultados fueron los de la Tabla 4.

TABLA 4

		Citotoxicidad (%)
Concentración de	Concentración de	(Célula efectora):(célula diana)
polipéptido (pM*)	interleuquina 2
	(unidades/ml)
		2,5:1	5:1	10:1
0	0	22	35	65
0	10	30	48	73
0,5	0	23	36	66
0,5	10	32	50	75
5	0	25	39	68
5	10	35	52	78
50	0	29	47	73
50	10	41	59	85
500	0	37	50	83
500	10	52	70	93
Nota: * En la Tabla, el símbolo "pM" significa 10^{-12} M.

Los resultados de la Tabla 4 muestran que el polipéptido tiene una actividad mejoradora de la citotoxicidad por las células NK. Como se muestra en la Tabla 4, la coexistencia de interleuquina 2 mejora más la citotoxicidad.

\newpage

Ejemplo A-7-4(e)

Inducción de la formación de células LAK

De acuerdo con la forma convencional, se dispusieron células Raji marcadas con ^{51}Cr (ATCC CCL 86) procedentes de linfoma de Burkitt humano como una célula diana no susceptible a las células K, en microplacas de 96 pocillos para dar 1 x 10^{4} células/pocillo, y se cultivó durante 72 horas. Se añadieron a las microplacas linfocitos cultivados, conteniendo células LAK como células efectoras preparadas de forma similar a la del Ejemplo A-7-4(d), y células diana en una relación de 5:1,10:1 ó 20:1, y las microplacas se incubaron en un incubador a 37ºC durante 4 horas bajo unas condiciones de 5% v/v de CO_{2}. Después de esto, se midió la radioactividad de cada sobrenadante en cada pocillo, y se calculó la citotoxicidad (%) de forma similar a la del Ejemplo A-7-4(d). Los resultados fueron los de la Tabla 5.

TABLA 5

Concentración de	Concentración de	Citotoxicidad (%)
polipéptido	interleuquina 2	(Célula efectora): (célula diana)
(pM*)	(unidades/ml)	5:1	10:1	20:1
0	0	11	21	34
0	10	15	28	38
0,5	0	13	22	35
0,5	10	17	31	43
5	0	15	23	39
5	10	19	34	48
50	0	20	25	44
50	10	23	42	54
500	0	27	34	57
500	10	31	54	67
Nota: * En la Tabla, el símbolo "pM" significa 10^{-12} M.

Los resultados de la Tabla 5 muestran que el polipéptido tiene una actividad inductor a de la formación de células LAK. Como se muestra en los resultados, la coexistencia de interleuquina 2 mejora más la inducción.

Ejemplo A-7-4(f)

Ensayo de toxicidad aguda

De acuerdo con la forma convencional, se administró un polipéptido purificado obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 percutáneamente, peroralmente o intraperitonealmente a ratones de 8 semanas de edad. Como resultado, la LD_{50} del polipéptido purificado fue de aproximadamente un mg/kg o superior independientemente de las vías de administración. Esto evidencia que el polipéptido puede incorporarse de forma segura en productos farmacéuticos para la administración a humanos.

Como es bien conocido, los IFN-\gammas se relacionan profundamente con biofilaxis humana a través de la protección infecciosa frente a bacterias, actividad inhibidora del crecimiento para tumores malignos, y actividad inmunorreguladora. Como se describió anteriormente, los IFN-\gammas se han desarrollado como un agente para enfermedades humanas susceptibles, y se estudiaron sustancialmente las enfermedades objeto, dosis, vías de administración, y seguridad. Como se describe en "Cytokines in Cancer Therapy", editado por Frances R. Balkwill, traducido por Yoshihiko WATANABE (1991), publicado por Tokio-Kagaku-Dojin, Tokyo, Japón, se reporta que se obtuvieron resultados casi satisfactorios cuando se aplicó el tratamiento utilizando células asesinas tales como células NK y células LAK sobre una diversidad de enfermedades incluyendo inmunoterapia antitumoral. Recientemente, se observó existe una relación entre el efecto terapéutico y la inducción de células matadoras o la mejora de la citotoxicidad por células asesinas utilizando citoquinas. Por ejemplo, T. FUJIOKA reportó en "British Journal 0f Urology", Vol. 73, No.1, pp.23-31 (1994) que, en la inmunoterapia antitumoral utilizando células LAK e interleuquina 2, la interleuquina 2 induce fuertemente la formación de células LAK y ejerce una destacable actividad inhibidora de las metástasis cancerosas sobre cánceres humanos sin inducir graves efectos secundarios.

Así, se revela que los IFN-\gammas y las células asesinas se relacionan profundamente con el tratamiento y/o prevención de una diversidad de enfermedades humanas, y contribuyen grandemente a su tratamiento completo o remisión. En estas circunstancias y como es evidente de los resultados de los Ejemplos A-7-4(c) y A-7-4(f), el polipéptido induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes, y mejora la citotoxicidad por células NK o induce la formación de células LAK sin provocar graves efectos secundarios. Estos hechos muestran que para enfermedades susceptibles puede administrarse el presente polipéptido repetidamente a humanos sin inducir graves efectos secundarios, y ejerce un efecto satisfactorio en el tratamiento y/o prevención de enfermedades estrechamente relacionadas con los IFN-\gammas y las células asesinas.

Ejemplo B-1

Preparación del Hibridoma H-1

Ejemplo B-1-1

Preparación del transformante KGFHH2

En un tubo de reacción de 0,5 ml se añadieron 8 \mul de cloruro de magnesio 25 mM, 10 \mul de 10 x tampón PCR, un \mul de mezcla de dNTP 25 mM, un \mul de 2,5 unidades/\mul de AmpliTaq DNA polimerasa, un ng de un DNA recombinante conteniendo la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 8 preparado a partir del clon de DNA del fago y conteniendo un DNA codificante del polipéptido en la SEQ ID NO: 1, y una cantidad adecuada de un cebador en sentido y un cebador anti-sentido representado por 5'-ATAGAATTCAAATGTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3', sintetizado químicamente en base a una secuencia de amino ácidos próxima al N- y C-terminales de la SEQ ID NO: 1, y 5'ATAAAGCTTCTAGTCTTCGTTTTGAAC-3', y la solución de la mezcla se aumentó de volumen con agua destilada esterilizada para dar un volumen total de 100 \mul. La solución de la mezcla se incubó sucesivamente de la forma habitual a 94ºC durante un minuto, a 43ºC durante un min, y a 72ºC durante un min, y esta incubación secuencial se repitió 3 veces. La mezcla resultante se incubó además sucesivamente a 94ºC durante un min, a 60ºC durante un min, y a 72ºC durante un min, y esta incubación secuencial se repitió 40 veces para efectuar la reacción PCR.

La mezcla de reacción de PCR resultante y "pCR-Script SK (+)", un vector plasmídico comercializado por Stratagene Cloning Systems, California, USA, se ligaron con DNA ligasa para obtener un DNA recombinante que después se introdujo con célula competente dentro de ``Escherichia coli XL-1 Blue MRF"Kan", un microorganismo comercializado por Stratagene Cloning Systems, California, USA, para transformar el microorganismo. El transformante así obtenido se inoculó en caldo L (pH 7,2) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina, y se cultivó a 37ºC durante 18 horas bajo condiciones de sacudida, seguido por centrifugación del cultivo resultante para recoger los transformantes proliferados, y se aislaron los DNAs recombinantes con el método convencional alcalino-SDS. Una parte de los DNAs recombinantes fue proporcionada y analizada por el método didesoxi y reveló que contenía un DNA el cual tenía sitios de ruptura de Eco RI e HindIII en los extremos 5'- y 3'- de la SEQ ID NO: 8, un codon metionina que inicia la síntesis del polipéptido y posiciona en los sitios correspondientes a aquellos antes y después de los extremos N- y C- de la SEQ ID NO: 8, y un codon TAG que termina la síntesis del polipéptido.

SEQ ID NO: 8:

5

Los DNAs recombinantes residuales se rompieron con enzimas de restricción Eco RI e Hind III, y se ligaron 0,1 \mug del fragmento de DNA resultante de Eco RI-Hind III obtenido con "DNA LIGATlON KIT Version 2", un kit de ligación de DNA comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japón, y 10 ng de "pKK223-3", un vector plasmídico comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suiza, que había sido previamente escindido con las enzimas de restricción anteriores, incubándolos a 16ºC durante 30 min para obtener un DNA recombinante replicable "pKGFHH2". Utilizando el método de células competentes, se transformó la cepa Y1090 de Escherichia coli (ATCC 37197) con el pKGFHH2 de DNA recombinante replicable, y el transformante formado "KGFHH2" se inoculó en caldo L (pH 7,2) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina, y se incubó a 37ºC durante 18 horas bajo condiciones de sacudida. El cultivo resultante se centrifugó para recoger los transformantes proliferados, y se trató una porción de los mismos con el método convencional SDS-alcalino para extraer el pKGFHH2 de DNA recombinante. Como se muestra en la Fig. 3, el análisis del método didesoxi reveló que, en el pKGFHH2 de DNA recombinante, el cDNA de KGFHH2 que contenía la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 8 se ligó en el sentido de un promotor
Tac.

Ejemplo B-1-2

Producción del polipéptido a partir del transformante KGFHH2

Un caldo L (pH 7,2) conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina, se esterilizó mediante autoclavado, se enfrió a 37ºC, se inoculó con el transformante KGFHH2 en el Ejemplo B-1-1, y se incubó a la misma temperatura durante 18 horas bajo condiciones de sacudida para obtener un cultivo sembrado. Se dispusieron dieciocho L de una preparación reciente del mismo medio en un fermentador con un recipiente de 20-L, se estilizó de forma similar a la anterior, se enfrió a 37ºC, se inoculó con uno % v/v del cultivo de siembra, y se cultivó a la misma temperatura durante 8 horas bajo condiciones de aireación y agitación. El cultivo resultante se centrifugó para recoger las células las cuales fueron después suspendidas en una solución mixta (pH 7,3) que constaba de cloruro de sodio 150 mM, hidrógeno fosfato disódico 16 mM, y dihidrógeno fosfato de sodio 4 mM, se rompieron con ultrasonidos y se centrifugaron para separar los desechos celulares para obtener un sobrenadante.

Se añadió sulfato amónico al sobrenadante hasta dar una concentración de 40% p/v y se disolvió hasta homogeneidad, y la solución se centrifugó para obtener un sobrenadante. El sobrenadante se mezcló primero con tampón fosfato 150 mM (pH 6,6) conteniendo sulfato de amonio 1,5 M, después se alimentó a una columna empaquetada con "PHENYL SEPHAROSE", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suiza, que había sido previamente equilibrada con tampón fosfato 10 mM (pH 6,6) conteniendo sulfato de amonio 1,5 M, seguido por lavado de la columna con una preparación reciente del mismo tampón, y alimentación de la columna con un tampón con gradiente de sulfato de amonio comprendido entre 1,5 M Y 0 M en tampón fosfato 10 mM (pH 6,6).

Las fracciones que eluyeron alrededor de sulfato de amonio 1,0 M se reunieron, se filtraron por membrana, se dializaron frente a tampón fosfato 10 mM (pH 6,5) a 4ºC durante 18 horas, y se alimentaron a una columna empaquetada con "DEAE 5PW", un producto comercializado por Tosoh Corporation, Tokyo, Japón, que se había equilibrado previamente con tampón fosfato 10 mM (pH 6,5), seguido por lavado de la columna con una preparación reciente del mismo tampón, y alimentación a la columna de un tampón con gradiente lineal de cloruro de sodio oscilando entre 0 M Y 0,2 M en tampón fosfato 10 mM (pH 6,5) mientras se recogían las fracciones que eluían con cloruro de sodio 0,05 M.

Después de esto, se concentraron las fracciones con una membrana y se alimentaron a una columna empaquetada con "SUPER DEX 75", un producto de Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suiza, que se había equilibrado con salino tamponado con fosfato (de aquí en adelante abreviado como "PBS"), seguido por alimentación a la columna con una preparación reciente de PBS para recoger las fracciones correspondientes a aproximadamente 18.500 daltons. Así, se obtuvo una solución acuosa que contenía aproximadamente 5,2 mg de una proteína purificada. El rendimiento total a través de la purificación fue de aproximadamente el 10%.

La proteína purificada se analizó y se encontró que tenía las siguientes propiedades fisicoquímicas: Cuando se sometía a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS bajo condiciones reductoras, la proteína purificada aparecía como una banda principal de proteína que tenía una inducibilidad de IFN-\gamma en una posición correspondiente a 18.500\pm3.000 daltons, al tiempo que daba un pI de 4,9:1:1,0 en cromatoenfoque. La secuencia de amino ácidos conteniendo el N-terminal de la proteína purificada tenía la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 9 igual a la de la SEQ ID NO: 1 donde la metionina se acoplaba a su N-terminal.

SEQ ID NO: 9:

\sa{Met Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser}

\newpage

Ejemplo B-1-3

Preparación del hibridoma H-1

Se inyectaron intraperitonealmente ratones BALB/c, de 10 semanas de edad, con 20 \mug/ratón de un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, junto con adyuvante completo de Freund. Los ratones se inyectaron además dos veces con la misma dosis a un intervalo de 2 semanas y se inyectaron intravenosamente con la misma dosis una semana después de la inyección final, y se extrajeron sus bazos y se suspendieron para obtener una suspensión celular.

Se suspendieron las células de bazo y células SP2/0-Ag14 de mieloma de ratón (ATCC CRL 1581) en medio RPMI 1640 (pH 7,2) precalentado a 37ºC a densidades celulares de 3 x 10^{4} células/ml y 1 x 10^{4} células/ml, respectivamente, y se centrifugaron para recoger el sedimento. Se añadió, gota a gota al sedimento a lo largo de un minuto, un ml de un medio RPMI 1640 libre de suero (pH 7,2), conteniendo 50% p/v de polietilén glicol con un peso molecular promedio de 1.500 daltons, y la mezcla se incubó a 37ºC durante un minuto, seguido por adición gota a gota a la mezcla de un medio RPMI 1640 libre de suero (pH 7,2) hasta dar un volumen total de 50 ml, se centrifugó la mezcla y se recogió el sedimento formado. El sedimento así obtenido se suspendió en un medio HAT, se distribuyó en microplacas de 96 pocillos en una cantidad de 200 \mul/pocillo, y se incubó a 37ºC durante una semana, seguido por selección de los hibridomas.

La cantidad de los anticuerpos segregados en el sobrenadante en cada pocillo se analizó por inmunoensayo enzimático en base a la inmunorreacción de los anticuerpos y un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, y se seleccionaron los hibridomas capaces de producir anticuerpos, que reaccionaban fuertemente con el polipéptido purificado. Se obtuvo de la forma habitual una célula H-1 de hibridoma clonado capaz de producir el presente anticuerpo monoclonal, obtenido por tratamiento repetido de estos hibridomas con dilución limitante.

Ejemplo B-2

Preparación del anticuerpo monoclonal H-1mAb y análisis por la técnica de transferencia Western

Ejemplo B-2-1

Preparación del anticuerpo monoclonal H-1mAb

Se suspendieron células H-1 de hibridoma por el método del Ejemplo B-1-3 en medio RPMI 1640 (Ph 7,2) suplementado con suero de ternera al 5% v/v para dar una densidad de células de aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml, y se incubaron en un incubador a 37ºC bajo unas condiciones de 5% v/v de CO_{2} mientras crecía el cultivo. Cuando la densidad de células del cultivo alcanzó un nivel prescrito, se inyectaron intraperitonealmente 1 x 10^{7} células/ratón de las células H-1 de hibridoma proliferadas a ratones BALB/c, de 8 semanas de edad, que habían sido previamente inyectados intraperitonealmente con 0,5 ml/ratón de pristano, seguido por alimentación de los ratones de la forma habitual durante una semana.

Se recogieron los ascites de los ratones, se diluyeron con PBS por 3 veces, se mezclaron con sulfato de amonio para dar un grado de saturación de 50% p/v, se les dejó estar a 4ºC durante 24 horas, y se centrifugaron para recoger el sedimento. El sedimento se dializó frente a una solución acuosa de dihidrógeno fosfato de potasio 20 mM (pH 6,7) a 4ºC durante la noche, y se alimentó a una columna de hidroxiapatita que había sido previamente equilibrada con una preparación reciente de la misma solución acuosa, seguido por alimentación a la columna de tampón (pH 6,7) de dihidrógeno fosfato de potasio en gradiente lineal comprendido entre 20 mM y 300 mM para obtener una solución acuosa que contenía el presente anticuerpo monoclonal H-1mAb. El rendimiento fue de aproximadamente 5 mg por ratón. El análisis convencional reveló que el anticuerpo pertenecía a la clase de IgG_{1}.

Ejemplo B-2-2

Análisis por la técnica de transferencia de Western

Un \mug de un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, se añadió a una solución mixta que constaba de 100 mg de ditiotreitol, 0,5 ml de solución acuosa de SDS al 10% p/v, y un ml de glicerol, y la mezcla se incubó a 37ºC durante una hora y se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. El gel resultante se transfirió de forma habitual a una membrana de nitrocelulosa que después se embebió en un sobrenadante del cultivo de células de hibridoma H-1 durante una hora, y se lavó con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) conteniendo 0,05% v/v de tween 20 para separar las cantidades en exceso de anticuerpo. La membrana se embebió adicionalmente durante una hora en PBS conteniendo un anticuerpo Ig anti-ratón preparado a partir de conejos para efectuar la inmunorreacción, se lavó con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) conteniendo 0,05% v/v de tween 20, y se embebió en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) conteniendo 0,005% v/v de peróxido de hidrógeno y 0,3 mg/ml de 3,3'-diaminobenzidina para efectuar la coloración.

Como control, se proporcionó un sistema utilizando una interleuquina 12 humana recombinante en lugar del polipéptido purificado, y se trató de forma similar a la anterior. Se emplearon albúmina de suero de ternera (PM = 67.000 daltons), ovoalbúmina (PM = 45.000 daltons), anhidrasa carbónica (PM = 30.000 daltons), inhibidor de tripsina (PM = 20.100 daltons), y \alpha-lactalbúmina (PM = 14.400 daltons) como proteínas marcadoras. Los resultados fueron los de la Fig.4.

Como es evidente de la Fig.4, el anticuerpo monoclonal H-1mAb reaccionó específicamente con el polipéptido purificado (Lane 1) obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, pero no con la interleuquina 12 humana (Lane 2). Esto evidencia que el presente anticuerpo monoclonal reacciona específicamente con el polipéptido con una secuencia de amino ácidos específica.

Ejemplo B-3

Preparación del hibridoma H-2 y un anticuerpo monoclonal H-2mAb

El hibridoma H-2, un anticuerpo monoclonal, se preparó de forma similar por el método del Ejemplo B-2-1, excepto porque se utilizaron células P3-X63-Ag8 (ATCC TIB9) en lugar de las células SP/O-14Ag.

Ejemplo B-3-2

Preparación del anticuerpo monoclonal H-2mAb

El hibridoma H-2 del Ejemplo B-3-1 se cultivó de forma similar a la del Ejemplo B-2-1, y el cultivo se purificó para obtener aproximadamente 5,6 mg del anticuerpo monoclonal H-2mAb por ratón BALB/c. El análisis convencional reveló que el anticuerpo monoclonal pertenecía a la clase de IgM, y que reaccionaba específicamente con un polipéptido purificado obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 cuando se analizó por la técnica de transferencia Western de forma similar a la del Ejemplo B-2-2.

Ejemplo B-4

Purificación del polipéptido por cromatografía de inmunoafinidad

Ejemplo B-4-1

Preparación del gel por cromatografía de inmunoafinidad

Ochenta mg de anticuerpo monoclonal H-1mAb, obtenido por el método del Ejemplo B-2-1, se pesó y se dializó frente a tampón borato 0,1 M (pH 8,5) conteniendo cloruro de sodio 0,5 M a 4ºC durante la noche. Cuatro g de "CNBr-activated Sepharose 4B" (Sefarosa 4B activada con CNBr), un portador insoluble en agua comercializado por Pharmacia LKB Biotecnology AB, Uppsala, Suiza, se hincharon con una solución acuosa de ácido clorhídrico uno M, sucesivamente se lavó con una preparación reciente del mismo tampón y tampón borato 0,1 M (pH 8,5) conteniendo 0,5 M de cloruro de sodio, se mezcló con aproximadamente 10 ml de la solución acuosa del anticuerpo monoclonal obtenido anteriormente, y se incubó sucesivamente a temperatura ambiente y a 4ºC durante la noche bajo condiciones de agitación suaves. Después de esto, el gel resultante se lavó sucesivamente con una solución acuosa de etanol amina uno M (pH 8,0), tampón borato 0,1 M (pH 8,5) conteniendo cloruro de sodio 0,5 M, Y tampón acetato 0,1 M (pH 4,0). Y estas etapas de lavado se repitieron 5 veces. Finalmente, se lavó el gel con PBS para obtener un gel para cromatografía de inmunoafinidad. El análisis convencional reveló que se habían enlazado aproximadamente 6 mg de anticuerpo monoclonal H-1mAb a un ml del gel.

Ejemplo B-4-2

Purificación del polipéptido por cromatografía de inmunoafinidad

Se empaquetaron diez ml del gel para cromatografía de inmunoafinidad en el Ejemplo B-4-1 en una columna cilíndrica de plástico, se lavaron con PBS y se alimentaron con 10 ml de una fracción eluida de fenil sefarosa conteniendo aproximadamente 0,1 mg/ml del polipéptido obtenido por el método del Ejemplo B-1-2. La columna se lavó con una preparación reciente de PBS, y se alimentó con glicina-tampón HCl 0,1 M (pH 2,5) conteniendo cloruro de sodio uno M para recoger las fracciones con una actividad inductora de IFN. Las fracciones se reunieron, se dializaron frente a PBS a 4ºC durante la noche, se concentraron, y se evaluaron en cuanto a la actividad inductora de IFN-\gamma y el contenido de proteína y se reveló que este procedimiento de purificación rendía un polipéptido purificado con una pureza del 95% p/p o superior en un rendimiento de aproximadamente 100%.

Ejemplo B-5

Detección del polipéptido por inmunoensayo enzimático

Se inmunizaron conejos de la forma habitual con un polipéptido purificado obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, y se recogió su sangre. Se aisló el anticuerpo de inmunoglobulina G de la sangre, y se disolvió en PBS para dar una concentración de 20 \mug/ml, y la solución se distribuyó en microplacas de 96 pocillos en una cantidad de 100 \mul/pocillo. Las microplacas se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas, seguido por separación de las soluciones conteniendo IgG de las microplacas, adición de PBS conteniendo albúmina de suero de ternera al uno % p/v a las microplacas en una cantidad de 200 \mul/pocillo, y dejándolo estar a 4ºC durante la noche.

Se separó el salino tamponado con fosfato de las microplacas que después se lavaron con PBS conteniendo tween 20 al 0,05% v/v, y se inyectaron con 100 \mul/pocillo de una solución preparada diluyendo apropiadamente un polipéptido purificado, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, con PBS conteniendo albúmina de suero de ternera al 0,5% p/v, seguido por reacción de la solución mixta a temperatura ambiente durante 2 horas bajo condiciones de sacudida. Las microplacas se lavaron con PBS conteniendo tween 20 al 0,05% v/v, y se inyectaron con 100 \mul/pocillo de una solución conteniendo un anticuerpo monoclonal H-1mAb marcado con biotina, seguido por reacción de la solución mixta a temperatura ambiente durante 2 horas bajo condiciones de sacudida, lavando las microplacas con PBS conteniendo Tween 20 al 0,05% v/v, inyectando con 100 \mul/pocillo de una solución conteniendo un complejo de peroxidasa de rábano picante y estreptoavidina, y haciendo reaccionar adicionalmente la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 2 horas bajo condiciones de sacudida. Después, se lavaron las microplacas con PBS conteniendo tween 20 al 0,05% v/v, y se midió la actividad de la peroxidasa de rábano picante enlazada al polipéptido purificado para absorbancia a una longitud de onda de 492 nm utilizando o-fenilendiamina como sustrato. Los resultados fueron los de la Tabla 6.

TABLA 6

Concentración de	Absorbancia	Error
polipéptido (pg/ml)	a 492 nm*	relativo (%)
1.000	1,51\pm0,05	3,3
500	0,93\pm0,05	5,4
250	0,55\pm0,03	5,5
100	0,25\pm0,02	8,0
50	0,137\pm0,007	5,1
25	0,080\pm0,007	8,8
0	0,024\pm0,007	-
Nota: El símbolo "*" significa un valor estadístico de triplete.

Como es evidente de los resultados de la Tabla 6, el método de detección de acuerdo con la presente invención evalúa de forma segura el polipéptido en el rango de aproximadamente 50-1.000 pg/ml.

Ejemplo B-6

Detección del polipéptido por radioinmunoensayo

Se inmunizaron conejos de la forma habitual con un polipéptido purificado obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, y se recogió su sangre, seguido por aislamiento del anticuerpo IgG. El anticuerpo se adsorbió de la forma habitual sobre perlitas de poliestireno para radioinmunoensayo, y se dejó estar en PBS conteniendo albúmina de suero de ternera al 2% p/v a 4ºC durante la noche para obtener un anticuerpo inmovilizado.

Se colocó una perlita en un tubo de ensayo, se embebió en 0,2 ml de una solución preparada por dilución de polipéptido purificado, obtenida por el método del Ejemplo B-1-2, con PBS conteniendo albúmina de suero de ternera al 0,5% p/v, y se dejó estar a 4ºC durante 4 horas. Después, la perlita se lavó con PBS conteniendo tween 20 al 0,05% v/v y albúmina de suero de ternera al 0,5% p/v, se embebió en 0,2 ml (1 x 10^{5} cpm) de una solución que contenía una anticuerpo monoclonal H-2mAb, obtenido por el método del Ejemplo B-3-2 y marcado con ^{123}I, y se dejó estar a 4ºC durante la noche.

Después de separar la cantidad en exceso de anticuerpo marcado con ^{125}I, la perlita se lavó con PBS conteniendo tween 20 al 0,05% v/v y albúmina de suero de ternera al 0,5% p/v, seguido por recuento de la radioactividad de la perlita en un contador gamma. Los resultados fueron los de la Tabla 7.

TABLA 7

Concentración de	Cuentas*	Error
polipéptido(pg/ml)	(cpm)	relativo (%)
1.000,0	6.900\pm200	2,9
500,0	4.100\pm20	0,5
250,0	2.390\pm50	2,1
125,0	1.590\pm70	4,4
62,5	880\pm10	1,1
0	700\pm20	-
Nota: El símbolo "*" significa un valor estadístico de triplete.

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Como es evidente de los resultados de la Tabla 7, el presente método de detección evalúa de forma segura el polipéptido en el rango de aproximadamente 100-1.000 pg/ml.

Ejemplo C-1

Solución

Un polipéptido, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, se disolvió en salino fisiológico conteniendo albúmina de suero humano al uno % p/v como un estabilizador para obtener un mg/ml de solución de polipéptido que después se esterilizó mediante un filtro de membrana para obtener una solución.

El producto, con una estabilidad satisfactoria, puede utilizarse como una inyección, una solución oftálmica, un "collunarium" (solución para instilación en las fosas nasales como lavado, pulverización o gotas) en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas, y enfermedades inmunes.

Ejemplo C-2

Inyección seca

Un polipéptido, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, se disolvió en 100 ml de salino fisiológico conteniendo gelatina purificada al uno % p/v como un estabilizante, y la solución se esterilizó de la forma habitual con un filtro de membrana. Se distribuyeron alícuotas de un ml de la solución esterilizada en viales, se liofilizaron y se sellaron con un tapón.

El producto, con una estabilidad satisfactoria, puede utilizarse como una inyección seca para el tratamiento y/o prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades bacterianas, y enfermedades inmunes.

Ejemplo C-3

Ungüento

Se disolvieron en agua destilada "HI-BIS-Wako 104", un polímero carboxivinílico comercializado por Wako Pure Chemicals, Tokyo, Japón, y una trehalosa purificada para dar concentraciones de 1,4% p/p y 2,0% p/p respectivamente, y se disolvió un polipéptido obtenido por el método del Ejemplo B-1-2 hasta homogeneidad en la solución, seguido por ajuste del pH de la solución resultante hasta pH 7,2 para obtener una pasta conteniendo aproximadamente un mg/g del polipéptido.

El producto con una dispersabilidad y estabilidad satisfactorias puede utilizarse como un ungüento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas, y enfermedades inmunes.

\newpage

Ejemplo C-4

Tableta

Un polipéptido, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, y LUMIN, esto es, [bis-4-(I-etilquinolin)] [\gamma-4'-(1-etilquinolina] pentametionin cianina, como un activador celular, se mezclaron hasta homogeneidad con "FINETOSE® ",
una \alpha-maltosa cristalina anhidra comercializada por Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japón, y la mezcla se tableteó de la forma habitual mediante una máquina de tableteado para obtener tabletas, aproximadamente 200 mg de peso cada una, conteniendo el polipéptido y el LUMIN, aproximadamente un mg de cada uno.

El producto, que tenía una capacidad de hinchamiento, estabilidad y actividad activadora de células satisfactorias, puede utilizarse como una tableta para el tratamiento y/o prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas, y enfermedades inmunes.

Ejemplo C-5

Agente inmunoterapéutico adoptivo

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de un paciente con linfoma maligno, se suspendió en medio RPMI 1640 (pH 7,2) que estaba suplementado con suero AB humano al 10% v/v y precalentado hasta 37ºC para dar una densidad celular de aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml, y se mezcló con aproximadamente 1,0 \mug/ml de un polipéptido, obtenido por el método del Ejemplo B-1-2, y aproximadamente 100 unidades/ml de una interleuquina 2 humana recombinante, seguido por incubación del producto resultante en un incubador con un 5% v/v de CO_{2} a 37ºC durante una semana, y centrifugando el cultivo resultante para recoger las células LAK.

Las células LAK así obtenidas mostraron una fuerte citotoxicidad sobre las células del linfoma cuando se introdujeron en el cuerpo del paciente donante, y ejercieron un citotoxicidad más alta que la conseguida por la inmunoterapia adoptiva utilizando interleuqina 2 sola. Se inyectaron células T citotóxicas, obtenidas similarmente por tratamiento de linfocitos invadidos dentro de los tejidos tumorales del paciente, en lugar de los linfocitos anteriores, dentro del paciente donante y dieron como resultado una acción de efecto similar al conseguido por las células LAK. El agente inmunoterapéutico adoptivo puede utilizarse arbitrariamente para tratar tumores malignos sólidos tales como cáncer renal, melanoma maligno, cáncer de colon, cáncer rectal, y cáncer de pulmón.

La presente invención está basada en el hallazgo de un nuevo polipéptido que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes. El polipéptido es una sustancia que tiene una secuencia de amino ácidos parcial o totalmente revelada, y una actividad estable inductora de la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes.

El polipéptido tiene una fuerte inducibilidad de IFN-\gamma de modo que puede inducir una cantidad deseada de producción de IFN-\gamma con solo una pequeña cantidad. El polipéptido no provoca graves efectos secundarios incluso cuando se administra en una dosis relativamente alta porque solamente tiene una toxicidad extremadamente baja. Por lo tanto, el presente polipéptido tiene la ventaja de que induce prontamente una cantidad deseada de producción de IFN-\gamma sin controlar estrictamente la dosis.

El presente anticuerpo monoclonal reacciona específicamente con el polipéptido, y es ámpliamente utilizado en la purificación y la detección del polipéptido. El anticuerpo se prepara en una cantidad deseada mediante el empleo de hibridomas.

El presente agente es susceptible de ejercer un efecto satisfactorio en el tratamiento y/o prevención de enfermedades susceptibles tales como tumores malignos, enfermedades virales, enfermedades infecciosas bacterianas y enfermedades inmunes. Adicionalmente, el agente tiene la actividad de mejorar la citotoxicidad por las células asesinas o de inducir la formación de células asesinas, y ejerce un efecto significativo en el tratamiento de enfermedades graves tales como los tumores malignos.

Así, la presente invención es una invención significativa que tiene un destacable efecto y proporciona una gran contribución en este campo.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE NOMBRE:

\vskip0.800000\baselineskip

KABUSHIKI KAISHA HAYASHIBARA SEIBUTSU KAGAKU KENKYUJO

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

POLIPÉPTIDO INDUCTOR DE LA PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN-GAMMA, ANTICUERPO MONOCLONAL ESPECÍFICO PARA DICHO POLIPÉPTIDO, Y AGENTE PARA ENFERMEDADES SUSCEPTIBLES

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: KABUSHIKI KAISHA HAYASHIBARA SEIBUTSU KAGAKU KENKYUJO

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2-3, 1-CHOME, SHIMOISHII

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: OKAYAMA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: JAPÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 700

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquetes

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: compatible IBM PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A1)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 304.203/94

\vskip0.500000\baselineskip

(B1)

FECHA PRESENTACIÓN: 15 Noviembre, 1994

\vskip0.500000\baselineskip

(A2)

NÚMERO DE REFERENCIA DE LA SOLICITUD: 10048102

\vskip0.500000\baselineskip

(B2)

FECHA PRESENTACIÓN: 18 Septiembre 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(A3)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 58.240/95

\vskip0.500000\baselineskip

(B3)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 Febrero 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(A4)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 78,357/95

\vskip0.500000\baselineskip

(B4)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 Marzo 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(A5)

NÚMERO DE REFERENCIA DE LA SOLICITUD: 10049202

\vskip0.500000\baselineskip

(B5)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 Septiembre 1995

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 157 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 471 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 471 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: ratón

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: hígado

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: 1-471 péptido entrecruzado

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: FRAGMENTO INTERNO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile}

\sac{Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: FRAGMENTO INTERNO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu}

\sac{Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1120 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: hígado

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A1)

NOMBRE/CLAVE: 1-1775'-UTR

\vskip0.500000\baselineskip

(C1)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.500000\baselineskip

(A2)

NOMBRE/CLAVE: 178-285 péptido dirigente

\vskip0.500000\baselineskip

(C2)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.500000\baselineskip

(A3)

NOMBRE/CLAVE: 286-756 péptido entrecruzado

\vskip0.500000\baselineskip

(C3)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.500000\baselineskip

(A4)

NOMBRE/CLAVE: 757-11203'-UTR

\vskip0.500000\baselineskip

(C4)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(8) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: Fragmento N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(9) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 471 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

tipo de hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

AISLADO INDIVIDUAL: hígado

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido entrecruzado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..471

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: S

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(10) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: Fragmento N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser}

Claims (48)

1. Un polipéptido de origen humano que induce la producción de IFN-\gamma por células inmunocompetentes y tiene el amino ácido como describe en la SEQ ID NO: 1 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina").

SEQ ID NO: 1

13

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que tiene un peso molecular de aproximadamente 18.500\pm3.000 daltons por electroforesis de dodecilsulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) y un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,9\pm1,0 por cromatoenfoque.

3. Un DNA que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

4. El DNA de la reivindicación 3 que tiene la secuencia de base que se describe en la SEQ ID NO: 2.

5. El DNA de la reivindicación 4, donde una o más bases de la SEQ ID NO: 2 se reemplazan con otras bases por medio de la degeneración del código genético sin alternar la secuencia de amino ácidos en la SEQ ID NO: 1 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina") que describe la secuencia de amino ácidos codificada por la SEQ ID NO: 2.

6. El DNA de la reivindicación 3, que tiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 6 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina"):

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

SEQ ID NO: 6

14

7. El DNA de la reivindicación 3, que procede de humano.

8. Un DNA recombinante replicable, que contiene un vector autorreplicable y un DNA codificante del polipéptido de la reivindicación 1.

9. El DNA recombinante replicable de la reivindicación 8, que contiene una secuencia de bases seleccionada del grupo formado por la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2 y las secuencias de bases complementarias a la SEQ ID NO: 2.

10. El DNA recombinante replicable de la reivindicación 9, donde una o más bases de la SEQ IDNO: 2 están reemplazadas con otras bases por medio de la degeneración del código genético sin alternar la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

11. El DNA recombinante replicable de la reivindicación 8, que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 6 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina").

12. El DNA recombinante replicable de la reivindicación 8, donde dicho DNA procede de humano.

13. El DNA recombinante replicable de la reivindicación 8, donde dicho vector es un vector plasmídico.

14. Un transformante obtenible por introducción en una célula huésped apropiada de un DNA recombinante replicable que contiene un vector auto-replicable y un DNA codificante del polipéptido de la reivindicación 1.

15. El transformante de la reivindicación 14, que contiene una secuencia de bases seleccionada del grupo formado por la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2 y las secuencias de bases complementarias a la SEQ ID NO: 2.

16. El transformante de la reivindicación 15, donde una o más bases de la SEQ ID NO: 2 están reemplazadas con otras bases por medio de la degeneración del código genético sin alternar la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1.

17. El transformante de la reivindicación 14, que contiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 6 (donde el símbolo "Xaa" significa "isoleucina" o "treonina").

18. El transformante de la reivindicación 14, donde dicho DNA procede de humano.

19. El transformante de la reivindicación 14, donde dicho vector es un vector plasmídico.

20. El transformante de la reivindicación 14, donde dicho huésped es un microorganismo de la especie Escherichia coli.

21. Un procedimiento para la preparación de un polipéptido, que comprende (a) cultivar en un medio de cultivo nutriente un transformante capaz de formar el polipéptido de la reivindicación 1, preparado por introducción en un huésped apropiado de un DNA recombinante replicable que contiene un vector auto-replicable y un DNA codificante del polipétido, y (b) recoger el polipéptido formado a partir del cultivo resultante.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, donde dicho DNA tiene una secuencia de bases seleccionada del grupo formado por la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2 y secuencias de bases complementarias a la SEQ ID NO: 2.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, donde una o más bases de la SEQ ID NO: 2 están reemplazadas con otras bases por medio de la degeneración del código genético sin alternar la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 1.

24. El procedimiento de la reivindicación 21, donde dicho DNA tiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 6 (donde el símbolo "XAA" significa "isoleucina" o "treonina").

25. El procedimiento de la reivindicación 21, donde dicho DNA procede de humano.

26. El procedimiento de la reivindicación 21, donde dicho vector es un vector plasmídico.

27. El procedimiento de la reivindicación 21 donde dicho huésped es un microorganismo de la especie Escherichia coli.

28. El procedimiento de la reivindicación 21, donde el polipéptido formado se purifica por una o más técnicas seleccionadas del grupo formado por concentración, salificación, diálisis, sedimentación separadora, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatoenfoque, electroforesis en gel, y electroforesis de punto isoeléctrico.

29. Un anticuerpo monoclonal que es específico para el polipéptido de la reivindicación 1.

30. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 29, que pertenece a la clase de IgG o IgM.

31. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 29.

32. Un procedimiento para la preparación de un anticuerpo monoclonal, que comprende cultivar un hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 29, ya sea en medio de cultivo nutriente o en el cuerpo de un animal, y recoger el hibridoma del cultivo resultante o del fluido corporal.

33. El procedimiento de la reivindicación 32, donde dicho anticuerpo monoclonal se recoge del cultivo o del fluido corporal mediante una o más técnicas seleccionadas del grupo formado por salificación, diálisis, filtración, concentración, centrifugación, sedimentación separadora, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, electroforesis en gel e isoelectroforesis.

34. Un procedimiento para la purificación del polipéptido de la reivindicación 1, que comprende poner en contacto una mezcla que contiene el polipéptido e impurezas con un anticuerpo monoclonal específico para el polipéptido, y desorber el polipéptido adsorbido sobre el anticuerpo monoclonal.

35. El procedimiento de la reivindicación 34, donde dicho anticuerpo monoclonal está enlazado a un portador insoluble en agua.

36. Un método para detectar el polipéptido de la reivindicación 1, que comprende una etapa de poner en contacto un anticuerpo monoclonal específico para el polipéptido con una muestra para efectuar una inmunorreacción.

37. El método de la reivindicación 36, donde el anticuerpo monoclonal está marcado con un miembro seleccionado del grupo formado por una sustancia radioactiva, una enzima y una sustancia fluorescente.

38. Un agente para enfermedades susceptibles, que contiene el polipéptido de la reivindicación 1, como un ingrediente efectivo.

39. El agente de la reivindicación 38, donde el polipéptido mejora la citotoxicidad por células asesinas y/o induce la formación de células asesinas.

40. El agente de la reivindicación 39, donde dicha célula asesina es un miembro seleccionado del grupo formado por células NK, células LAK (células asesinas activadoras de linfoquina), y células T citotóxicas.

41. El agente de una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, que contiene una o más sustancias adicionales biológicamente activas.

42. El agente de la reivindicación 41, donde dichas sustancias biológicamente activas son agentes antitumorales y citoquinas.

43. El agente de una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 42, que contiene como estabilizador uno o más miembros seleccionados del grupo formado por albúmina de suero, gelatina, maltosa y trehalosa.

44. Un agente inmunoterapéutico antitumoral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 43.

45. Un agente antitumoral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 43.

46. Un agente antiviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 43.

47. Un antiséptico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 43.

48. El agente de una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 47, que contiene 0,000001-100% p/p del polipéptido, en base a sólido seco.