ES2329202T3 - Sondas dna y cebadores amplificacion especificos de especie,especificos de genero y universales para deteccion e identif. rapidas de patogenos bacterianos y fungicos comunes y genes de resist. a antibioticos asociados de especimenes clinicos para diagnostico en lab microbiologia. - Google Patents
Sondas dna y cebadores amplificacion especificos de especie,especificos de genero y universales para deteccion e identif. rapidas de patogenos bacterianos y fungicos comunes y genes de resist. a antibioticos asociados de especimenes clinicos para diagnostico en lab microbiologia. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS BASADOS EN ADN, QUE EMPLEAN CEBADORES DE AMPLIFICACION O SONDAS PARA DETECTAR, IDENTIFICAR Y CUANTIFICAR EN UNA MUESTRA A ANALIZAR, ADN PROCEDENTE (I) CUALQUIER BACTERIA, (II) LAS ESPECIES STREPTOCOCCUS AGALACTIAE, STAPHYLOCOCCUS SAPROGHYTICUS, ENTEROCOCCUS FAECIUM, NEISSERIA MENINGITIDIS, LISTERIA MONOCYTOGENES Y CANDIDA ALBICANS, Y (III) CUALQUIER ESPECIE DEL GENERO STREPTOCOCCUS, STAPHYLOCOCCUS, ENTEROCOCCUS, NEISSERIA Y CANDIDA. SE DESCRIBEN ASIMISMO PROCEDIMIENTOS BASADOS EN ADN QUE EMPLEAN DICHOS CEBADORES DE AMPLIFICACION O DICHAS SONDAS PARA DETECTAR, IDENTIFICAR Y CUANTIFICAR, EN UNA MUESTRA A ANALIZAR, GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS SELECCIONADOS A PARTIR DEL GRUPO FORMADO POR BLA TEM , BLA ROB , BLA SHV , BLA OXA , BLAZ, A ADB, AACC1, AACC2, AACC3, AACA4, AAC6''-IIA, ERMA, ERMB, ERMC, MECA, VANA, VANB, VANC,SATA, AAC(6''-APG(2''''), AAD(6''), VAT, VGA, MSRA, SUL E INT. LAS CITADAS ESPECIES MICROBIANAS, GENEROS Y GENES DE RESISTENCIA SON TODOS ELLOS RELEVANTES CLINICAMENTE Y SE ENCUENTRAN NORMALMENTE EN DIVERSAS MUESTRAS CLINICAS. DICHOS ENSAYOS BASADOS EN ADN SON RAPIDOS, PRECISOS Y SE PUEDEN UTILIZAR EN LABORATORIOS DE MICROBIOLOGIA CLINICA PARA DIAGNOSTICOS DE RUTINA. DICHAS NUEVAS HERRAMIENTAS DE DIAGNOSTICO DEBEN SER UTILES PARA MEJORAR LA VELOCIDAD Y PRECISION DE DIAGNOSTICO DE INFECCIONES MICROBIANAS, PERMITIENDO POR TANTO TRATAMIENTOS MAS EFECTIVOS. SE REIVINDICAN TAMBIEN KITS DE DIAGNOSTICO PARA (I) LA DETECCION UNIVERSAL Y CUANTIFICACION DE BACTERIAS Y/O (II) LA DETECCION, IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION DE LAS ESPECIES Y/O GENEROS BACTERIANOS Y FUNGICOS ANTERIORMENTE MENCIONADOS, Y/O (III) LA DETECCION, IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION DE LOS GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS DESCRITOS ANTERIORMENTE.
Description
Sondas de DNA y cebadores de amplificación
específicos de especie, específicos de género y universales para la
detección e identificación rápidas de patógenos bacterianos y
fúngicos comunes y genes de resistencia a antibióticos asociados de
especímenes clínicos para el diagnóstico en laboratorios de
microbiología.
Habitualmente, las bacterias se identifican por
su capacidad para utilizar diferentes sustratos como fuente de
carbono y nitrógeno mediante el uso de análisis bioquímicos tales
como el sistema API20E^{TM} (bioMérieux). Para el análisis de la
sensibilidad, los laboratorios clínicos de microbiología utilizan
métodos entre los que se incluyen la difusión en disco, la dilución
en agar y la microdilución en caldo. Aunque la identificación
basada en un análisis bioquímico y de sensibilidad antibacteriana es
rentable, se requieren como mínimo dos días para obtener los
resultados preliminares ya que son necesarias dos incubaciones
nocturnas sucesivas para identificar las bacterias a partir de
muestras clínicas, así como para determinar su sensibilidad a
agentes antimicrobianos. Existen diversos sistemas automatizados
comerciales (por ejemplo el sistema MicroScan de Dade Diagnostics
Corp. y el sistema Vitek de bioMérieux), los cuales utilizan equipos
caros y sofisticados para lograr una mayor rapidez en la
identificación microbiana y en el análisis de sensibilidad (Stager y
Davis, 1992, Clin. Microbiol. Rev. 5:302-327).
Estos sistemas requieren períodos de incubación más cortos, haciendo
así posible realizar la mayoría de las identificaciones bacterianas
y los análisis de sensibilidad en menos de 6 horas. Sin embargo,
estos sistemas más rápidos requieren siempre el aislamiento primario
de las bacterias como cultivo puro, un proceso que requiere como
mínimo 18 horas para un cultivo puro o 2 días para un cultivo
mixto. El sistema de identificación más rápido existente, el sistema
autoSCAN-Walk-Away^{TM} (Dade
Diagnostics Corp.) identifica especies bacterianas tanto
gram-negativas como gram-positivas a
partir de inóculos normalizados en tan sólo 2 horas y proporciona
patrones de sensibilidad a la mayoría de los antibióticos en 5,5
horas. Sin embargo, este sistema tiene un porcentaje
particularmente alto (del 3,3 al 40,5%) de identificaciones no
concluyentes en especies bacterianas distintas a
Enterobacteriaceae (Croizé J., 1995, Lett. Infectiol. 10:
109-113; York y col., 1992, J. Clin. Microbiol.
30:2903-2910). Para Enterobacteriaceae, el
porcentaje de identificaciones no concluyentes está entre un 2,7 y
un 11,4%.
En los laboratorios de microbiología se aísla e
identifica de forma rutinaria una gran variedad de bacterias y
hongos a partir de muestras clínicas. Las tablas 1 y 2 indican la
incidencia de los patógenos bacterianos y fúngicos más
frecuentemente aislados a partir de diversos tipos de muestras
clínicas. Con frecuencia estos patógenos se asocian a infecciones
humanas nosocomiales y de origen comunitario y, por tanto, se
consideran de una gran importancia clínica.
La mayor parte de las muestras clínicas que se
reciben en los laboratorios clínicos de microbiología son muestras
de orina y sangre. En el laboratorio de microbiología del Centre
Hospitalier de l'Université Laval (CHUL), la orina y la sangre
representan alrededor de un 55% y un 30%, respectivamente, de las
muestras recibidas (tabla 3). El 15% restante de muestras clínicas
consiste en diversos fluidos biológicos, entre los que se incluyen
esputos, pus, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial y otros
(tabla 3). Las infecciones del aparato urinario, las vías
respiratorias y la corriente sanguínea son normalmente de etiología
bacteriana y requieren una terapia antimicrobiana. De hecho, todas
las muestras clínicas recibidas en el laboratorio clínico de
microbiología se analizan de forma rutinaria para la identificación
de bacterias y el análisis de la sensibilidad.
La búsqueda de patógenos en muestras de orina es
tan mayoritaria habitualmente en un laboratorio de microbiología
que se ha desarrollado un sinnúmero de análisis. Sin embargo, el
principal estándar sigue siendo el método clásico de cultivo
semicuantitativo en placas, en el que se extiende 1 \mul de orina
en líneas sobre placas y se incuba durante 18-24
horas. A continuación, se cuentan las colonias para determinar el
número total de unidades formadoras de colonias (UFC) por litro de
orina. Una infección urinaria (IU) bacteriana se asocia normalmente
a un recuento bacteriano de 10^{7} UFC/l o más en orina. Sin
embargo, son posibles las infecciones con menos de 10^{7} UFC/l
en orina, especialmente en pacientes con un gran incidencia de
enfermedades o en aquellos cateterizados (Stark y Maki, 1984, N.
Engl. J. Med. 311:560-564). Es importante el hecho
de que aproximadamente un 80% de las muestras de orina analizadas
en los laboratorios clínicos de microbiología se consideran
negativas (es decir, un recuento bacteriano inferior a 10^{7}
UFC/l; tabla 3). Las muestras de orina que dan positivo en cultivo
se caracterizan además mediante análisis bioquímicos estándar para
identificar el patógeno bacteriano y se analizan también en cuanto
a la sensibilidad a los antibióticos. El análisis bioquímico y de
sensibilidad requiere normalmente 18-24 horas de
incubación.
La existencia de métodos de screening de orina
precisos y rápidos permitiría una identificación más rápida de las
muestras negativas y un tratamiento y una gestión de la asistencia
al paciente más eficaces. Se han comparado algunos métodos de
identificación rápida (sondas de DNA Flash Track^{TM},
UTIscreen^{TM}, Uriscreen^{TM} y otros) con métodos bioquímicos
estándar más lentos, basados en el cultivo de los patógenos
bacterianos. Aunque son mucho más rápidos, estos análisis rápidos
presentaban una baja sensibilidad y una mala especificidad, así
como un gran número de resultados falso negativo y falso positivo
(Koening y col., 1992, J. Clin. Microbiol.
30:342-345; Pezzio y col., 1992, J. Clin. Microbiol.
30:640-684).
Las muestras de sangre recibidas en el
laboratorio de microbiología se envían siempre para su cultivo. Los
sistemas de cultivo de sangre pueden ser manuales, semiautomatizados
o completamente automatizados. El sistema BACTEC (de Becton
Dickinson) y el sistema BacTAlert (de Organon Teknika Corporation)
son los dos sistemas de cultivo de sangre automatizados de uso más
extendido. En estos sistemas se incuban frascos de cultivo de
sangre en condiciones óptimas para el crecimiento bacteriano. El
crecimiento bacteriano se observa de forma continua para detectar
positivos anticipados mediante detectores de crecimiento bacteriano
de alta sensibilidad. Una vez detectado el crecimiento, se realiza
una tinción Gram directamente a partir del cultivo de sangre y a
continuación se utiliza para inocular placas de agar nutrientes.
Posteriormente se realizan, con sistemas automatizados como los
arriba descritos, una identificación bacteriana y un análisis de
sensibilidad a partir de las colonias bacterianas aisladas.
Normalmente, los frascos se consideran negativos si no se detecta
crecimiento después de 6 a 7 días de incubación. Normalmente, la
inmensa mayoría de los cultivos de sangre dan negativo. Por
ejemplo, el porcentaje de cultivos de sangre negativos en el
laboratorio de microbiología del CHUL durante el período de febrero
de 1994 a enero de 1995 fue de un 93,1%
(tabla 3).
(tabla 3).
Al recibirse en el laboratorio clínico de
microbiología, todos los fluidos corporales que no son ni sangre ni
orina y proceden de sitios normalmente estériles (por ejemplo
líquido cefalorraquídeo, sinovial, pleural, pericárdico y otros) se
procesan para su examen microscópico directo y cultivo subsiguiente.
De nuevo, la mayoría de las muestras clínicas dan negativo en el
cultivo (tabla 3).
En lo que se refiere a las muestras clínicas que
no proceden de sitios estériles, tales como muestras de esputo o
heces, el diagnostico de laboratorio mediante cultivo es más
problemático debido a la contaminación por la flora habitual. Los
patógenos bacterianos potencialmente asociados a la infección se
purifican eliminando los contaminantes y a continuación se
identifican como se describe más arriba. Está claro que la detección
universal de bacterias no sería útil para el diagnóstico de
infecciones bacterianas en estos sitios no estériles. Por otra
parte, los ensayos basados en DNA para la detección e identificación
de especies o géneros, así como para la detección de genes de
resistencia a los antibióticos, a partir de estas muestras
resultarían muy útiles y ofrecerían diversas ventajas en
comparación con los métodos de identificación y análisis de
sensibilidad clásicos.
Existe una clara necesidad de análisis de
diagnóstico rápidos y precisos para la detección e identificación
bacterianas directamente a partir de muestras clínicas. Las
tecnologías basadas en DNA son rápidas y precisas y ofrecen un gran
potencial para mejorar el diagnóstico de enfermedades infecciosas
(Persing y col., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology:
Principles and Applications, American Society for Microbiology,
Washington, D.C.). Las sondas de DNA y los cebadores de
amplificación objeto de la presente invención son aplicables para
la detección y la identificación de bacterias y hongos directamente
a partir de cualesquiera muestras clínicas, tales como cultivos de
sangre, sangre, orina, esputo, líquido cefalorraquídeo, pus y
muestras de otro tipo (tabla 3). Los análisis basados en DNA
propuestos en esta invención son superiores, tanto en rapidez como
en precisión, a los métodos bioquímicos estándar utilizados
actualmente para el diagnóstico rutinario de cualesquiera muestras
clínicas en los laboratorios de microbiología. Dado que estos
análisis se realizan en aproximadamente sólo una hora, proporcionan
a los clínicos nuevas herramientas de diagnóstico que deberían
contribuir a aumentar la eficacia de las terapias con agentes
antimicrobianos. Con estos ensayos pueden analizarse también
muestras clínicas de organismos que no son humanos (por ejemplo
otros primates, aves, plantas, mamíferos, animales de granja,
ganado y otros).
De todas las muestras clínicas recibidas para el
diagnóstico de rutina, aproximadamente un 80% de las muestras de
orina e incluso más (alrededor de un 95%) de otros tipos de muestras
clínicas dan negativo en lo que se refiere a la presencia de
patógenos bacterianos (tabla 3). Sería también deseable, además de
identificar bacterias a nivel de especie o de género en una muestra
dada, cribar la alta proporción de muestras clínicas negativas con
un análisis que detectase la presencia de cualquier bacteria (es
decir detección bacteriana universal). Un análisis de screening de
este tipo podría basarse en la amplificación de DNA mediante PCR de
una diana genética hallada en todas las bacterias. Con este ensayo,
no se amplificarían las muestras negativas para las bacterias. Por
otra parte, con este ensayo, las que diesen positivo para las
bacterias proporcionarían una señal de amplificación positiva.
Un análisis de diagnóstico rápido debería tener
una repercusión considerable en la gestión de infecciones. La
tecnologías de sonda de DNA y amplificación de DNA ofrecen diversas
ventajas en comparación con los métodos convencionales para la
identificación de patógenos y genes de resistencia a los
antibióticos a partir de muestras clínicas (Persing y col., 1993,
Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications,
American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Ehrlich and
Greenberg, 1994, PCR-based Diagnostics in Infectious
Disease, Blackwell Scientific Publications, Boston, MA). No es
necesario cultivar los patógenos bacterianos, por lo que los
organismos pueden detectarse directamente a partir de las muestras
clínicas, reduciendo así el tiempo correspondiente al aislamiento y
la identificación de patógenos. Además, los ensayos basados en DNA
tienen una mayor precisión en la identificación bacteriana que los
sistemas de identificación fenotípicos utilizados actualmente,
basados en análisis bioquímicos. En los laboratorios clínicos de
microbiología se utilizan actualmente tecnologías basadas en DNA
comerciales, principalmente para la detección y la identificación de
patógenos bacterianos exigentes, tales como Mycobacterium
tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, así
como para la detección de diversos virus (Podzurski y Persing,
Molecular detection and identification of microorganisms.
En: P. Murray y col., 1995, Manual of Clinical
Microbiology, ASM press, Washington D.C.). Existen también otros
ensayos basados en DNA comerciales que se utilizan para ensayos de
confirmación de cultivo.
Otros han desarrollado ensayos basados en DNA
para la detección y la identificación de patógenos bacterianos que
son objeto de la presente invención: Staphylococcus spp.
(patente US 5 437 978), Neisseria spp. (patente US 5 162 199
y publicación de patente europea nº EP 0 337 896 131) y Listeria
monocytogenes (patentes US 5 389 513 y 5 089 386). Sin embargo,
los análisis de diagnóstico descritos en estas patentes están
basados o bien en genes de rRNA o bien en dianas genéticas
diferentes de las descritas en la presente invención.
Aunque existen kits o métodos de diagnóstico ya
utilizados en los laboratorios clínicos de microbiología, aún
existe la necesidad de una alternativa ventajosa en relación con los
métodos de identificación en cultivo convencionales, con el fin de
mejorar la precisión y la rapidez del diagnóstico de las infecciones
bacterianas comunes. Además de ser mucho más rápidos, los análisis
de diagnóstico basados en DNA son más precisos que los análisis
bioquímicos estándar utilizados en la actualidad para el
diagnóstico, ya que el genotipo bacteriano (por ejemplo nivel de
DNA) es más estable que el fenotipo bacteriano (por ejemplo nivel
metabólico).
El conocimiento de las secuencias genómicas de
las especies bacterianas y fúngicas aumenta continuamente, como
atestigua el número de secuencias disponibles en las bases de datos.
A partir de las secuencias asequibles en las bases de datos no
pueden obtenerse indicios de su potencial con fines diagnósticos.
Para determinar quiénes son buenos candidatos con fines de
diagnóstico podrían seleccionarse secuencias para ensayos basados
en DNA con el fin de (i) la detección y la identificación
específicas de especies de patógenos bacterianos o fúngicos
comunes, (ii) la detección y la identificación específicas de género
de patógenos bacterianos o fúngicos comunes, (iii) la detección
universal de patógenos bacterianos o fúngicos y/o (iv) la detección
y la identificación específicas de genes de resistencia de los
antibióticos. Todos los tipos anteriores de ensayos basados en DNA
pueden realizarse directamente a partir de cualquier tipo de muestra
clínica o a partir de un cultivo microbiano.
En la publicación de patente WO 96/08502
describíamos secuencias de DNA adecuadas para (i) la detección y la
identificación específicas de especie de 12 patógenos bacterianos
clínicamente importantes, (ii) la detección universal de bacterias
y (iii) la detección de 17 genes de resistencia a los antibióticos.
Esta solicitud de patente en tramitación junto con la presente
describía secuencias de DNA patentadas y secuencias de DNA
seleccionadas de bases de datos (en ambos casos fragmentos de como
mínimo 100 pares de bases), así como sondas de oligonucleótidos y
cebadores de amplificación procedentes de estas secuencias. Todas
las secuencias de ácidos nucleicos descritas en esta solicitud de
patente entran en la composición de kits y métodos de diagnóstico
capaces de a) detectar la presencia de bacterias, b) detectar
específicamente la presencia de 12 especies bacterianas y 17 genes
de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, estos métodos y kits
requieren una mejora, dado que el kit y el método ideales deberían
ser capaces de diagnosticar casi el 100% de los patógenos
microbianos y de los genes de resistencia a los antibióticos. Por
ejemplo, las infecciones causadas por Enterococcus faecium
se han convertido en un problema clínico debido a su resistencia a
muchos antibióticos. Es deseable tanto la detección de estas
bacterias como la evaluación de sus perfiles de resistencia.
Conviene señalar que la publicación de patente francesa
FR-A-2,699,539 describe la secuencia
del gen de la vancomicina B, gen que puede obtenerse de cepas de
Enterococcus faecium resistentes a este antibiótico. Además
de esto, también son deseables nuevas secuencias de DNA (sondas y
cebadores) capaces de reconocer los mismos patógenos microbianos y
otros adicionales, o los mismos genes de resistencia a los
antibióticos y otros adicionales, con el fin de detectar más genes
diana y complementar nuestros perfiles de resistencia. Además de
esto, también son deseables nuevas secuencias de DNA (sondas y
cebadores) capaces de reconocer los mismos patógenos microbianos y
otros adicionales, o los mismos genes de resistencia a los
antibióticos y otros adicionales, con el fin de detectar más genes
diana y complementar nuestra solicitud de patente anterior.
El documento
US-A-5,523,205 revela la detección
de Listeria monocitogenes empleando cebadores obtenidos del gen
hlyA tomado de la secuencia que codifica Listeriolisina O.I.
El documento
FR-A-2 699 539 revela el gen de la
vancomicina B y la proteína de Enterococcus faecalis
V583.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método específico, ubicuo y sensible que utiliza
sondas y/o cebadores de amplificación para determinar la presencia
y/o la cantidad de ácidos nucleicos según se define en las
reivindicaciones 1 a 16.
En una forma de realización específica, el
método hace uso de fragmentos de DNA (fragmentos patentados y
fragmentos obtenidos de bases de datos) seleccionados por su
capacidad para detectar de forma sensible, específica y ubicua los
ácidos nucleicos bacterianos o fúngicos establecidos como
objetivo.
En una forma de realización especialmente
preferente se han derivado de los fragmentos de DNA más largos
oligonucleótidos de como mínimo 12 nucleótidos de longitud, que se
han utilizado en el presente método como sondas o cebadores de
amplificación.
Los oligonucleótidos patentados (sondas y
cebadores) son también otro objeto de la invención.
También son objeto de la presente invención kits
de diagnóstico que comprenden sondas o cebadores de amplificación
para la detección de una especie o género microbiano
seleccionado(a) del grupo consistente en especies de
Streptococcus, Streptococcus agalactiae, especies de
Staphylococcus, Staphylococcus saprophyticus,
especies de Enterococcus, Enterococcus faecium,
especies de Neisseria, Neisseria meningitidis,
Listeria monocytogenes, especies de Candida y
Candida albicans.
También son objeto de esta invención kits de
diagnóstico que comprenden además sondas o cebadores de
amplificación para la detección de un gen de resistencia a los
antibióticos seleccionado del grupo consistente en bla_{tem},
bla_{rob}, bla_{shv}, bla_{oxa}, blaZ, aadB, aacC1, aacC2,
aacC3, aacA4, aac6'-IIa, ermA, ermB, ermC, mecA,
vanA, vanB, vanC, sat4,
aac(6')-aph(2''), aad(6'), vat,
vga, msrA, sul e int.
También son objeto de esta invención kits de
diagnóstico que comprenden además sondas o cebadores de
amplificación para la detección de cualquier especie bacteriana o
fúngica, además comprendiendo o no comprendiendo sondas y cebadores
para los genes de resistencia a los antibióticos arriba
enumerados.
En una forma de realización preferente, dicho
kit permite la detección y la identificación, por separado o
simultáneamente, de las especies o géneros microbianos y los genes
de resistencia a los antibióticos arriba enumerados y la detección
de cualquier bacteria.
En los métodos y kits arriba indicados, las
reacciones de amplificación pueden incluir a) reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), b) reacción en cadena de la ligasa, c)
amplificación basada en secuencias de ácido nucleico, d)
replicación de secuencia autosostenida, e) amplificación de
desplazamiento de cadena, f) amplificación de señal de DNA
ramificado, g) amplificación mediada por transcripción, h)
tecnología de sonda de ciclo (CPT), i) PCR anidada o j) PCR
multiplex.
En una forma de realización preferente se
utiliza un protocolo PCR como reacción de amplificación.
En una forma de realización especialmente
preferente se proporciona un protocolo PCR que comprende, para cada
ciclo de amplificación, una etapa de emparejamiento de 30 segundos a
45-55ºC y una etapa de desnaturalización de sólo un
segundo a 95ºC, sin dejar tiempo específico para la etapa de
elongación. Este protocolo PCR se ha normalizado para que sea
adecuado en reacciones PCR con todos los pares de cebadores
seleccionados, lo que facilita enormemente el análisis, ya que
todas las muestras clínicas pueden analizarse con cebadores PCR
universales, específicos de especie, específicos de género y de gen
de resistencia a los antibióticos bajo condiciones de ciclo
uniformes. Además, en los ensayos PCR multiplex pueden utilizarse
diversas combinaciones de pares de cebadores.
Nuestro objetivo es desarrollar un análisis o
kit rápido para descartar rápidamente todas las muestras negativas
en lo que se refiere a células bacterianas y posteriormente detectar
e identificar las especies y géneros bacterianos y/o fúngicos
arriba indicados y determinar rápidamente la resistencia bacteriana
a antibióticos. Aunque las secuencias de los genes de resistencia a
los antibióticos seleccionados están disponibles en bases de datos
y se han utilizado para desarrollar análisis basados en DNA para su
detección, nuestro planteamiento es único porque representa una
mejora de enorme importancia en relación con los métodos de
diagnóstico basados en cultivos bacterianos, actualmente el
principal estándar. Utilizando un método de amplificación para la
detección e identificación bacterianas simultáneas y la detección de
genes de resistencia a los antibióticos, no es necesario cultivar
la muestra clínica antes de analizarla. Además, se ha desarrollado
un protocolo PCR modificado para detectar todas las secuencias de
DNA diana en aproximadamente una hora bajo condiciones de
amplificación uniformes. Este procedimiento salvará vidas gracias a
la optimización del tratamiento, disminuirá la resistencia a los
antibióticos porque se recetarán menos antibióticos, reducirá el uso
de antibióticos de amplio espectro, que son caros, disminuirá los
gastos globales de asistencia sanitaria, evitando o acortando las
hospitalizaciones, y disminuirá el tiempo y los gastos asociados al
análisis de los laboratorios clínicos.
En los métodos y kits descritos más abajo, las
sondas de oligonucleótido y los cebadores de amplificación se han
obtenido de secuencias más grandes (es decir fragmentos de DNA de
como mínimo 100 pares de bases). Todos los fragmentos de DNA se han
obtenido bien de fragmentos patentados o bien de bases de datos. Los
fragmentos de DNA seleccionados de bases de datos se utilizan por
vez primera en un método de detección según la presente invención,
dado que se han seleccionado por su potencial para el
diagnóstico.
Para el experto en la materia es evidente que de
los fragmentos patentados o las secuencias de base de datos
seleccionadas pueden obtenerse otras secuencias de oligonucleótidos
apropiadas para (i) la detección bacteriana universal, (ii) la
detección e identificación de las especies y los géneros microbianos
arriba indicados y (iii) la detección de genes de resistencia a
antibióticos distintos a los enumerados en el anexo VI. Por ejemplo,
las sondas o los cebadores de oligonucleótidos pueden ser más
cortos o más largos que los elegidos; también pueden seleccionarse
en alguna otra parte de los fragmentos de DNA patentados o de las
secuencias seleccionadas de bases de datos; también pueden ser
variantes del mismo oligonucleótido. Si el DNA diana o una variante
del mismo se hibrida con un oligonucleótido determinado, o si el DNA
diana o una variante del mismo puede amplificarse mediante un par
de cebadores de PCR de oligonucleótidos determinados, la proposición
recíproca también es verdad: un DNA diana determinado puede
hibridarse con una variante de sonda de oligonucleótido o
amplificarse mediante una variante de cebador PCR de
oligonucleótido. Como alternativa, los oligonucleótidos pueden
diseñarse a partir de cualesquiera secuencias de fragmentos de DNA
para su uso en métodos de amplificación distintos a PCR. Por
consiguiente, la esencia de esta invención es la identificación de
fragmentos de DNA genómicos o no genómicos universales, específicos
de especie, específicos de género y específicos de gen de
resistencia, que se utilizan como fuente de sondas de
oligonucleótido y/o cebadores de amplificación
específicos(as) y ubicuos(as). Aunque la selección y
evaluación de los oligonucleótidos adecuados para fines de
diagnóstico requiere mucho esfuerzo, para el experto en la materia
es muy posible obtener, a partir de los fragmentos de DNA
seleccionados, oligonucleótidos distintos a los enumerados en el
anexo VI adecuados para fines de diagnóstico. Si un fragmento
patentado o una secuencia de base de datos se selecciona por su
especificidad y ubicuidad, aumenta la probabilidad de que los
subconjuntos del mismo o de la misma sean también específicos y
ubicuos.
Dado que un gran porcentaje de las muestras
clínicas dan negativo en lo que se refiere a las bacterias (tabla
3), se seleccionaron, a partir de secuencias patentadas y
procedentes de bases de datos, fragmentos de DNA con un alto
potencial para la selección de sondas o cebadores de oligonucleótido
universales. Los cebadores de amplificación se seleccionan a partir
de un gen altamente conservado en bacterias y hongos y se utilizan
para detectar la presencia de cualquier patógeno bacteriano en
muestras clínicas con el fin de determinar rápidamente
(aproximadamente en una hora) si la muestra en cuestión da positivo
o negativo en cuanto a bacterias. El gen seleccionado, designado
tuf, codifica una proteína (EF-Tu)
involucrada en el proceso de traducción durante la síntesis
proteínica. En las alineaciones de secuencias del gen tuf
utilizadas para obtener los cebadores universales se incluyen
secuencias tanto patentadas como procedentes de bases de datos
(ejemplo 1 y anexo I). Esta estrategia permite el cribado rápido de
las numerosas muestras clínicas negativas (alrededor de un 80% de
las muestras recibidas, véase la tabla 3) presentadas para su
análisis bacteriológico. Las tablas 4, 5 y 6 proporcionan una lista
de las especies bacterianas o fúngicas utilizadas para analizar la
especificidad de los cebadores PCR y las sondas de DNA. La tabla 7
incluye una breve descripción de todos los ensayos específicos de
especie, específicos de género y universales objeto de la presente
invención. Las tablas 8, 9 y 10 proporcionan información importante
sobre las secuencias patentadas y procedentes de bases de datos
seleccionadas con fines de diagnóstico.
Con el fin de seleccionar las secuencias
adecuadas para la detección y la identificación específicas de
especie o específicas de género de bacterias y hongos o, como
alternativa para la detección universal de bacterias, se
seleccionaron secuencias de bases de datos (GenBank, EMBL y
Swiss-Prot) en base a su potencial para fines de
diagnóstico, según la información de las secuencias y los análisis
informáticos realizados con estas secuencias. Inicialmente se
analizaron cuidadosamente todos los datos de secuencias disponibles
para las especies o los géneros microbianos establecidos como
objetivo. Se seleccionaron para el análisis PCR las secuencias
génicas que, en base a la información de las secuencias y la
comparación de las secuencias con el gen correspondiente de otras
especies o géneros microbianos, realizada con los programas del
Genetics Computer Group (GCG, Wisconsin), parecían ser las más
prometedoras para fines diagnósticos. De las secuencias de bases de
datos seleccionadas se eligieron los cebadores de amplificación PCR
óptimos mediante el software de análisis de cebadores Oligo^{TM}
4.0 (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.). Los cebadores
elegidos se analizaron en ensayos PCR en cuanto a su especificidad
y ubicuidad para las especies o los géneros microbianos diana. En
general, la identificación de las secuencias de bases de datos a
partir de las cuales se seleccionaron los cebadores de amplificación
adecuados para la detección e identificación específicas de especie
o específicas de género supuso un análisis informático y un
análisis PCR de diversas secuencias génicas candidatas antes de
obtener un par de cebadores específico y ubicuo para las especies o
los géneros microbianos diana. El anexo VI muestra la lista de pares
de cebadores PCR específicos y ubicuos seleccionados. Los anexos I
a V y los ejemplos 1 a 4 ilustran la estrategia utilizada para
seleccionar cebadores PCR específicos de género, específicos de
especie y universales a partir de las secuencias de tuf o a
partir del gen recA.
Los fragmentos de DNA secuenciados por nosotros
o seleccionados de bases de datos (GenBank y EMBL) se utilizaron
como fuente de oligonucleótidos con fines de diagnóstico. Para esta
estrategia se analizó, en cuanto a su especificidad y ubicuidad,
por PCR y ensayos de hibridación descritos más abajo, una serie de
sondas o cebadores de oligonucleótido adecuados procedentes de
diversos fragmentos de DNA genómicos (tamaño superior a 100 pb)
seleccionados de bases de datos. Es importante señalar que las
secuencias de bases de datos se seleccionaron en base a su
potencial para ser específicas de especie, específicas de género o
universales para la detección de bacterias u hongos, de acuerdo con
la información disponible de las secuencias y exhaustivos análisis y
que, en general, se tuvieron que analizar varias secuencias de base
de datos candidatas para obtener la especificidad, ubicuidad y
sensibilidad deseadas.
Las sondas y los cebadores de amplificación de
oligonucleótidos procedentes de fragmentos específicos de especie
seleccionados de secuencias de bases de datos se sintetizaron con un
sintetizador de DNA automatizado (Perkin-Elmer
Corp., Applied Biosystems Division). Antes de la síntesis, se
evaluaron todos los oligonucleótidos (sondas para hibridación y
cebadores para la amplificación de DNA) en cuanto a su idoneidad
para la hibridación o la amplificación de DNA mediante una reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) por medio de análisis informáticos,
en los que se utilizaron programas estándar (esto es programas de
Genetics Computer Group (GCG) y el software de análisis de
cebadores Oligo^{TM} 4.0). La idoneidad potencial de los pares de
cebadores de PCR se evaluó también antes de la síntesis,
comprobando la ausencia de características no deseadas tales como
elongaciones grandes de un nucleótido y una gran proporción de
residuos de G o C en el extremo 3' (Persing y col. 1993, Diagnostic
Molecular Microbiology: Principles and Applications, American
Society for Microbiology, Washington, D.C.).
Los cebadores o las sondas de oligonucleótidos
pueden proceder de cualquiera de las dos cadenas del DNA de doble
hebra. Los cebadores o las sondas pueden constar de las bases A, G,
C o T o análogas y pueden degenerarse en una o más posiciones de
nucleótido escogidas. Los cebadores o las sondas pueden tener
cualquier longitud adecuada y pueden seleccionarse en cualquier
parte de las secuencias de DNA procedentes de fragmentos patentados
o de secuencias de bases de datos seleccionadas, adecuadas para (i)
la detección universal de bacterias, (ii) la detección y la
identificación específicas de especie de Enterococcus faecium,
Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Staphylococcus
saprophyticus, Streptococcus agalactiae y Candida
albicans, (iii) la detección específica de género de especies
de Streptococcus, especies de Enterococcus, especies
de Staphylococcus y especies de Neisseria o (iv) la
detección de los 26 genes de resistencia a los antibióticos
clínicamente relevantes arriba mencionados.
Las variantes para un gen bacteriano diana
determinado se dan de forma natural y son atribuibles a la variación
de secuencias dentro del gen en cuestión durante la evolución
(Watson y col., 1987, Molecular Biology of the Gene, 4ª ed., The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Menio Park, CA: Lewin, 1989,
Genes IV, John Wiley & Sons, Nueva York, NY). Por ejemplo,
distintas cepas de la misma especie bacteriana pueden tener una o
más variaciones de nucleótidos en el sitio de hibridación del
oligonucleótido. El técnico en la materia conoce bien la existencia
de variantes de secuencias de DNA bacterianas o fúngicas para un gen
específico y el hecho de que la frecuencia de las variaciones en
las secuencias depende de la presión selectiva durante la evolución
sobre un producto génico determinado. La detección de una secuencia
variante para una región entre dos cebadores PCR puede comprobarse
secuenciando el producto de amplificación. Para demostrar la
presencia de variantes de secuencia en el sitio de hibridación del
cebador se ha de amplificar una diana de DNA mayor con cebadores
PCR fuera de dicho sitio de hibridación. La secuenciación de este
fragmento de mayor tamaño permitirá detectar la variación de
secuencia en este sitio. Una estrategia similar puede aplicarse para
comprobar variantes en el sitio de hibridación de una sonda. En la
medida en que la divergencia entre las secuencias diana o una parte
de las mismas no afecta a la especificidad y a la ubicuidad de los
cebadores de amplificación o las sondas, el DNA bacteriano variante
se halla dentro del alcance de esta invención. Las variantes de las
sondas o cebadores seleccionados pueden utilizarse también para
amplificar o hibridar un DNA variante.
Se determinó la secuencia de nucleótidos de una
porción de genes tuf para diversas especies bacterianas y
fúngicas. Para la secuenciación de las secuencias de tuf
bacteriano se utilizaron los cebadores de amplificación SEQ ID.
NOs: 107 y 108, que amplifican una porción del gen tuf de
aproximadamente 890 pb. Para la secuenciación de secuencias de
tuf fúngico se utilizaron los cebadores de amplificación SEQ
ID NO s: 109 y 172, que amplifican una porción del gen tuf
de aproximadamente 830 pb. Ambos pares de cebadores pueden
amplificar genes tufA y tufB. Esto no es
sorprendente, puesto que estos dos genes son casi idénticos. Por
ejemplo, los genes tufA y tufB completos de E.
coli difieren en sólo 13 posiciones de nucleótidos (Neidhardt y
col., 1996, Escherichia coli and Salmonella: Cellular and
Molecular Biology, 2ª ed., American Society for Microbiology Press,
Washington, D.C.). Estos cebadores de amplificación están
degenerados en varias posiciones de nucleótido y contienen inosinas
para permitir la amplificación de una gran variedad de secuencias de
tuf. La estrategia utilizada para seleccionar estos
cebadores de amplificación es similar a la ilustrada en el anexo I
para la selección de cebadores universales. Los cebadores de
amplificación SEQ ID NO s: 107 y 108 podrían utilizarse para
amplificar los genes tuf de cualquier especie bacteriana. Los
cebadores de amplificación SEQ ID NO s: 109 y 172 podrían
utilizarse para amplificar los genes tuf de cualquier especie
fúngica.
Los genes tuf se amplificaron
directamente a partir de cultivos bacterianos o de levaduras
mediante el siguiente protocolo de amplificación: se transfirió un
\mul de suspensión celular directamente a 19 \mul de una
mezcla de reacción PCR que contenía KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton
X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2,5 mM, 1 \muM de cada
uno de los 2 cebadores, 200 \muM de cada uno de los cuatro dNTP,
0,5 unidades de Taq DNA polimerasa (Promega Corp., Madison,
WI). Las reacciones PCR se sometieron a ciclación usando un
termociclador MJ Research PTC-200 (MJ Research Inc.,
Watertown, Mass.) de la siguiente manera: 3 minutos a 96ºC seguidos
de 30-35 ciclos de 1 minuto a 95ºC para la etapa de
desnaturalización, 1 minuto a 30-50ºC para la etapa
de emparejamiento y 1 minuto a 72ºC para la etapa de elongación.
Posteriormente se resolvieron veinte microlitros de la mezcla
amplificada por PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al
1,5%. A continuación, se visualizó el gel mediante una tinción con
azul de metileno (Flores y col., 1992 Biotechniques, 13:
203-205). El tamaño de los productos de
amplificación se estimó mediante comparación con una escalera de
peso molecular de 100 pb. La banda correspondiente al producto de
amplificación específico (es decir aproximadamente 890 u 830 pb
para secuencias de tuf bacterianas o fúngicas
respectivamente) se escindió del gel de agarosa y se purificó
mediante el kit de extracción de gel OIAquick^{TM} (QIAGEN Inc.,
Chatsworth, CA). A continuación se utilizó el fragmento de DNA
purificado con gel directamente en el protocolo de secuenciación.
Ambas cadenas del producto de amplificación de genes tuf se
secuenciaron mediante el método de secuenciación de terminación de
cadena de didesoxinucleótido utilizando un secuenciador de DNA
automatizado de Applied Biosystems (modelo 373A) con su
PRISM^{TM} Sequenase® Terminator Double-stranded
DNA Sequencing Kit (Perkin-Elmer Corp., Applied
Biosystems Division, Foster City, CA). Todas las reacciones de
secuenciación se realizaron usando los cebadores de amplificación
(SEQ ID NO s: 107, 109 y 172) y 100 ng por reacción de amplicón
purificado con gel. Para asegurar que la secuencia determinada no
contuviese errores atribuibles a la secuenciación de los artefactos
de PCR, se secuenciaron dos preparaciones del producto de
amplificación de tuf purificado con gel procedentes de dos
amplificaciones PCR independientes. Para todas las especies
microbianas diana, las secuencias determinadas para ambas
preparaciones de amplicón fueron idénticas. Además, las secuencias
de ambas cadenas eran 100% complementarias, confirmando así la gran
precisión de la secuencia determinada. Todas las secuencias de
tuf determinadas mediante la estrategia anterior se
encuentran en la lista de secuencias (es decir SEQ ID NO s: 118 a
146). La tabla 13 indica las especies microbianas de origen y la
procedencia de cada secuencia de tuf de la lista de
secuencias.
La alineación de las secuencias de tuf
determinadas por nosotros o seleccionadas de bases de datos revela
claramente que la longitud de la porción secuenciada de los genes
tuf es variable. Puede haber inserciones o deleciones de
varios aminoácidos. Esto explica por qué el tamaño del producto de
amplificación de tuf secuenciado era variable tanto para las
especies bacterianas como para las especies fúngicas. Entre las
secuencias de tuf determinadas por nuestro grupo encontramos
inserciones y deleciones que sumaban hasta 5 aminoácidos o 15
nucleótidos. Por consiguiente, las posiciones de nucleótido
indicadas en la parte superior de cada uno de los anexos I a V no
se corresponden con secuencias de tuf con inserciones o
deleciones.
Habría que señalar también que las diversas
secuencias de tuf por nosotros determinadas contenían
ocasionalmente degeneraciones. Estos nucleótidos degenerados
corresponden a variaciones de secuencia entre los genes tufA
y tufB, ya que los cebadores de amplificación amplifican
ambos genes tuf. Estas variaciones de nucleótidos no son
atribuibles a errores de incorporación de nucleótidos por la
taq DNA polimerasa, ya que las secuencias de ambas cadenas
eran idénticas y también porque las secuencias determinadas con
ambas preparaciones de los amplicones de tuf purificados con
gel eran idénticas.
Las secuencias de tuf determinadas por
nosotros o seleccionadas de bases de datos se utilizaron para
seleccionar cebadores de PCR para (i) la detección universal de
bacterias, (ii) la detección y la identificación específicas de
genero de Enterococcus spp. y Staphylococcus spp. y
(iii) la detección y la identificación específicas de la especie
Candida albicans. La estrategia utilizada para seleccionar
estos cebadores PCR estaba basada en el análisis de alineaciones
múltiples de diversas secuencias de tuf. Para más detalles
sobre la selección de los cebadores PCR a partir de las secuencias
de tuf, consultar los ejemplos 1 a 3 y a los anexos I a
IV.
La comparación de la secuencia de nucleótidos
para el gen recA de diversas especies bacterianas, entre las
que se incluían 5 especies de estreptococos, permitió la selección
de cebadores PCR específicos para Streptococcus. Para más
detalles sobre la selección de cebadores de PCR a partir de
recA, consultar el ejemplo 4 y el anexo V.
Se obtuvieron secuencias de DNA con un potencial
de codificación desconocido para la detección e identificación
específicas de la especie Staphylococcus saprophyticus
mediante el método de PCR con cebado aleatorio
(AP-PCR).
La AP-PCR es un método que puede
utilizarse para generar sondas de DNA específicas para
microorganismos (Fani y col., 1993, Mol. Ecol.
2:243-250). A continuación se expone una descripción
del protocolo AP-PCR utilizado para aislar, a
partir de Staphylococcus saprophyticus, un fragmento de DNA
genómico específico de la especie. Se analizaron sistemáticamente
veinte cebadores de oligonucleótidos diferentes de 10 nucleótidos de
longitud (incluidos todos ellos en el kit para
AP-PCR OPAD (Operon Technologies Inc., Alameda, CA))
con DNA de 3 cepas bacterianas de Staphylococcus
saprophyticus (todas obtenidas de la American Type Culture
Collection (ATCC): números 15305, 35552 y 43867), así como con DNA
de otras cuatro especies de estafilococo (Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990,
Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970 y Staphylococcus
hominis ATCC 35982). Para todas las especies bacterianas se
realizó la amplificación a partir de una suspensión bacteriana
ajustada a un estándar 0,5 McFarland, que corresponde a
aproximadamente 1,5 x 10^{8} bacterias/ml. Se transfirió un
\mul de la suspensión bacteriana normalizada directamente a 19
\mul de una mezcla de reacción PCR que contenía KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton
X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2,5 mM, 1,2 \muM de
sólo uno de los 20 cebadores de AP-PCR OPAD
diferentes, 200 \muM de cada uno de los cuatro dNTP y 0,5
unidades de Taq DNA polimerasa (Promega Corp., Madison, WI).
Las reacciones PCR se sometieron a una ciclación en un
termociclador MJ Research PTC-200 (MJ Research Inc.)
de la siguiente manera: 3 minutos a 96ºC seguidos de 35 ciclos de 1
minuto a 95ºC para la etapa de desnaturalización, 1 minuto a 32ºC
para la etapa de emparejamiento y 1 minuto a 72ºC para la etapa de
elongación. Se realizó una etapa final de extensión de 7 minutos a
72ºC después de los 35 ciclos para asegurar la extensión completa
de los productos PCR. Posteriormente se resolvieron veinte
microlitros de la mezcla amplificada por PCR mediante
electroforesis en un gel de agarosa al 2% que contenía 0,25
\mug/ml de bromuro de etidio. El tamaño de los productos de
amplificación se estimó mediante comparación con una escalera de
peso molecular de 50 pb.
Se observaron patrones de amplificación
específicos para Staphylococcus saprophyticus con el cebador
de AP-PCR OPAD-9 (SEQ ID NO: 25).
La amplificación con este cebador mostraba sistemáticamente una
banda correspondiente a un fragmento de DNA de aproximadamente 450
pb para todas las cepas de Staphylococcus saprophyticus
analizadas, pero en ningún caso para las otras cuatro especies de
estafilococo analizadas. Este patrón específico de especie se
confirmó analizando 10 aislados clínicos más de S.
saprophyticus seleccionados de la colección de cultivos del
laboratorio de microbiología del CHUL, así como cepas seleccionadas
de las especies bacterianas gram-positivas
indicadas en la tabla 5.
La banda correspondiente al amplicón de
aproximadamente 450 pb, que era específica y ubicua para S.
saprophyticus en base a la AP-PCR, se escindió
del gel de agarosa y se purificó con el kit de extracción de gel
OIAquick^{TM} (QIAGEN Inc.). El fragmento de DNA purificado con
gel se clonó en el sitio de clonación T/A del vector plásmido pCR
2.1^{TM} (Invitrogen Inc.) usando T4 DNA-ligasa
(New England BioLabs). Los plásmidos recombinantes se transformaron
en células competentes de E. coli DH5\alpha mediante
procedimientos estándar. El aislamiento del DNA plásmido se realizó
por el método de Bimboim y Doly (Nucleic Acids Res.
7:1513-1523) para preparaciones a pequeña escala.
Todas las preparaciones de DNA plásmido se digirieron con la
endonucleasa de restricción EcoRI para asegurar la presencia
del inserto de AP-PCR de aproximadamente 450 pb en
los plásmidos recombinantes. Posteriormente se realizó una
preparación de DNA plásmido a gran escala y altamente purificado a
partir de dos clones seleccionados, que según se había comprobado
llevaban el inserto de AP-PCR, por medio del kit de
purificación de plásmidos QIAGEN. Estas preparaciones plasmídicas se
utilizaron para la secuenciación de DNA automatizada.
Las dos cadenas del inserto de
AP-PCR procedente de los dos clones seleccionados se
secuenciaron por el método de secuenciación de terminación de
cadena de didesoxinucleótido con los cebadores de secuenciación SP6
y T7, mediante un secuenciador de DNA automatizado de Applied
Biosystems según se describe más arriba. El análisis de las
secuencias obtenidas reveló que las secuencias de DNA para ambas
cadenas de cada clon eran 100% complementarias. Además, demostró
que las secuencias completas determinadas para cada clon eran ambas
idénticas. Estos datos de secuenciación confirman el 100% de
precisión para la secuencia de 438 pb determinada (SEQ ID NO: 29).
Mediante el software de análisis de cebadores Oligo^{TM} 4.0, se
seleccionaron cebadores de amplificación óptimos a partir del
fragmento de DNA de Staphylococcus saprophyticus de
AP-PCR secuenciado. Las secuencias de cebador
seleccionadas se analizaron en ensayos PCR para comprobar su
especificidad y ubicuidad (tabla 7). Estos cebadores de PCR eran
específicos, ya que no había amplificación con DNA de especies
bacterianas distintas de las S. saprophyticus seleccionadas
de las tablas 4 y 5. Además, este ensayo por PCR fue ubicuo, ya que
con el mismo se amplificaron eficazmente 245 de 260 cepas de S.
saprophyticus. Utilizado en combinación con otro ensayo de PCR
específico de S. saprophyticus, que es objeto de nuestra
solicitud de patente pendiente U.S. (N.S. 08/526,840) y PCT
(PCT/CA/95/00528) junto con la presente, la ubicuidad alcanza el
100% para estas 260 cepas.
Para la amplificación de DNA por el ampliamente
utilizado método de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), se
obtuvieron pares de cebadores a partir de fragmentos de DNA
patentados o de secuencias procedentes de bases de datos. Antes de
la síntesis, se analizaron los pares de cebadores potenciales con el
software Oligo^{TM} 4.0 con el fin de comprobar que fueran buenos
candidatos para la amplificación por PCR.
Durante la amplificación del DNA por PCR se
utilizan dos cebadores de oligonucleótido que se unen
respectivamente a cada cadena del DNA diana desnaturalizado con
calor procedente del genoma bacteriano, con el fin de amplificar
in vitro, de manera exponencial, el DNA diana mediante ciclos
térmicos sucesivos que permiten la desnaturalización del DNA, el
emparejamiento de los cebadores y la síntesis de nuevas dianas en
cada ciclo (Persing y col., 1993, Diagnostic Molecular
Microbiology: Principles and Applications, American Society for
Microbiology, Washington, D.C.).
En resumen, los protocolos de PCR fueron como
sigue: se amplificaron muestras clínicas tratadas o suspensiones
bacterianas o fúngicas normalizadas (véase más abajo) en 20 \mul
de una mezcla de reacción PCR que contenía KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), MgCl_{2} 2,5 mM, 0,4
\muM de cada cebador, 200 \muM de cada uno de los cuatro dNTP y
0,5 unidades de Taq DNA-polimerasa (Promega),
combinada con el anticuerpo TaqStart^{TM} (Clontech Laboratories
Inc., Palo Alto, CA). El anticuerpo TaqStart^{TM}, que es un
anticuerpo monoclonal neutralizador de la Taq
DNA-polimerasa, se añadió a todas las reacciones PCR
para aumentar la especificidad y la sensibilidad de las
amplificaciones (Kellogg y col., 1994, Biotechniques
16:1134-1137). El tratamiento de las
muestras clínicas varía con el tipo de muestra analizada, dado que
la composición y el nivel de sensibilidad requeridos son distintos
para cada tipo de muestra. Consiste en un protocolo rápido para
lisar las células bacterianas y eliminar los efectos de inhibición
de la PCR (véase el ejemplo 11 de una preparación de muestra de
orina). Para la amplificación a partir de cultivos bacterianos o
fúngicos, las muestras se añadieron directamente a la mezcla de
amplificación PCR sin ninguna etapa de tratamiento previo (véase el
ejemplo 10). Se utilizaron secuencias de cebador obtenidas de
regiones altamente conservadas del gen de RNA ribosómico 16S
bacteriano con el fin de proporcionar un control interno para todas
las reacciones PCR. Como alternativa, el control interno se obtuvo
de secuencias que no se hallan en microorganismos ni en el genoma
humano. El control interno se integró en todas las reacciones de
amplificación para comprobar la eficacia de los ensayos PCR y
asegurar la ausencia de una inhibición de PCR significativa. El
control interno obtenido de rRNA resultó útil también para
controlar la eficacia de los protocolos de lisis bacteriana.
A continuación, se sometieron las reacciones PCR
a una ciclación térmica (3 minutos a 95ºC, seguidos de 30 ciclos de
1 segundo a 95ºC para la etapa de desnaturalización y 30 segundos a
55ºC para la etapa de emparejamiento-extensión) con
un termociclador PTC-200 (MJ Research Inc.) y
posteriormente se analizaron mediante electroforesis en gel de
agarosa teñido con bromuro de etidio estándar. El número de ciclos
realizados para los ensayos PCR varía según el nivel de
sensibilidad requerido. Por ejemplo, el nivel de sensibilidad
requerido para la detección microbiana directamente a partir de
muestras clínicas es mayor para las muestras de sangre que para las
muestras de orina, ya que la concentración de microorganismos
asociada a la septicemia puede ser mucho menor que la asociada a
una infección del aparato urinario. Por consiguiente, para la
detección directa en muestras de sangre se requieren ensayos PCR
más sensibles con más ciclos térmicos. De modo similar, los ensayos
PCR realizados directamente a partir de cultivos bacterianos o
fúngicos pueden ser menos sensibles que los ensayos PCR realizados
directamente a partir de muestras clínicas, ya que el número de
organismos diana es normalmente mucho menor en las muestras
clínicas que en los cultivos microbianos.
Es evidente que pueden utilizarse otros métodos
para la detección de productos de amplificación específica, que
pueden ser más rápidos y prácticos para el diagnóstico de rutina.
Tales métodos pueden estar basados en la detección de fluorescencia
después de la amplificación (por ejemplo sistema TaqMan^{TM} de
Perkin Elmer o Amplisensor^{TM} de Biotronics). Los métodos
basados en la detección de fluorescencia son particularmente
prometedores para la utilización en diagnósticos de rutina, ya que
son muy rápidos, cuantitativos y pueden automatizarse (ejemplo
14).
La detección y la identificación de patógenos
microbianos pueden realizarse también mediante una hibridación en
soporte sólido o en líquido, utilizando sondas de DNA internas
específicas de especie que hibriden un producto de amplificación.
Tales sondas pueden generarse a partir de cualesquiera productos de
amplificación de DNA específicos de especie o específicos de género
objeto de la presente invención. Como alternativa, las sondas
internas para la detección e identificación de especies o géneros
pueden obtenerse de los amplicones producidos mediante el ensayo de
amplificación universal. Las sondas de oligonucleótido pueden
marcarse con biotina o con digoxigenina o con cualesquiera otras
moléculas reporter.
Para asegurar la eficacia de la PCR puede
utilizarse glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO) u otros disolventes
afines, con el fin de aumentar la sensibilidad de la PCR y superar
los problemas asociados a la amplificación de un DNA diana con un
alto contenido en GC o que forma fuertes estructuras secundarias
(Dieffenbach y Dveksier, 1995, PCR Primer: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Los
rangos de concentración para el glicerol y el DMSO son
5-15% (v/v) y 3-10% (v/v)
respectivamente. Para la mezcla de reacción PCR, los rangos de
concentración para los cebadores de amplificación y MgCl_{2} son
0,1-1,5 \muM y 1,5-3,5 mM
respectivamente. También pueden utilizarse modificaciones del
protocolo de PCR estándar utilizando cebadores externos y anidados
(es decir PCR anidada) o utilizando más de un par de cebadores (es
decir PCR multiplex) (Persing y col., 1993, Diagnostic Molecular
Microbiology: Principles and Applications, American Society for
Microbiology, Washington, D.C.). Para más detalles sobre los
protocolos PCR y de detección de amplicones, véanse los ejemplos 9
a 14.
El técnico en la amplificación de DNA ya conoce
la existencia de otros procedimientos de amplificación rápidos,
tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la
amplificación mediada por transcripción (TMA), la replicación de
secuencia autosostenida (3SR), la amplificación basada en secuencias
de ácido nucleico (NASBA), la amplificación de desplazamiento de
cadena (SDA), DNA ramificado (bDNA) y la tecnología de sonda de
ciclo (CPT) (Lee y col., 1997 Nucleic Acid Amplification
Technologies: Application to Disease Diagnosis, Eaton Publishing,
Boston, MA; Persing y col., 1993, Diagnostic Molecular Microbiology:
Principles and Applications, American Society for Microbiology,
Washington, D.C.). El alcance de esta invención no está limitado al
uso de la amplificación PCR, sino que incluye el uso de cualquier
método de amplificación de ácido nucleico rápido o cualquier otro
procedimiento que pueda utilizarse para aumentar la rapidez y la
sensibilidad de los análisis. También se hallan dentro del alcance
de esta invención todos los oligonucleótidos adecuados para la
amplificación de ácidos nucleicos mediante planteamientos distintos
a la PCR y obtenidos a partir de los fragmentos de DNA específicos
de especie, específicos de género y universales, así como a partir
de las secuencias de genes de resistencia a los antibióticos
seleccionadas incluidos(as) en este documento.
En los experimentos de hibridación, los
oligonucleótidos de cadena simple (tamaño inferior a 100
nucleótidos) tienen algunas ventajas en relación con las sondas de
fragmentos de DNA para la detección de bacterias, tales como la
facilidad de síntesis en grandes cantidades, la uniformidad de los
resultados de un lote a otro y la estabilidad química. En resumen,
para las hibridaciones, los oligonucleótidos se marcaron en el
extremo 5' con el radionucleótido
\gamma-^{32}P(dATP) utilizando T4
polinucleótido-quinasa (Pharmacia) (Sambrook y
col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El
radionucleótido no incorporado se eliminó haciendo pasar el
oligonucleótido marcado a través de una columna Sephadex
G-50^{TM}. Como alternativa, los oligonucleótidos
se marcaron con biotina bien enzimáticamente en sus extremos 3' o
bien incorporada directamente durante la síntesis en sus extremos
5', o con digoxigenina. El técnico en la materia comprenderá que es
posible utilizar medios de marcado distintos a los tres marcadores
anteriores.
A continuación se analizó cada sonda de
oligonucleótido en cuanto a su especificidad mediante hibridación a
DNA de diversas especies bacterianas y fúngicas seleccionadas de las
tablas 4, 5 y 6. Todas las especies bacterianas o fúngicas
analizadas tenían probabilidad de ser patógenos asociados a
infecciones comunes o contaminantes potenciales que pueden aislarse
de muestras clínicas. Todos los DNA diana se liberaron de células
bacterianas utilizando tratamientos químicos estándar para lisar
las células (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY). Posteriormente se desnaturalizó el DNA por métodos
convencionales y a continuación se fijó de forma irreversible a un
soporte sólido (por ejemplo membranas de nailon o nitrocelulosa) o
se dejó libre en solución. Los DNA diana de cadena simple fijados
se hibridaron a continuación con las células de sonda de
oligonucleótido (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY). Las condiciones de prehibridación fueron: en
NaCl 1 M + sulfato de dextrano al 10% + SDS al 1% + 100 \mug/ml
de DNA de esperma de salmón, a 65ºC, durante 15 minutos. La
hibridación se realizó en una solución de prehibridación fresca que
contenía la sonda marcada a 65ºC durante la noche. Las condiciones
del lavado poshibridación fueron las siguientes: dos veces en 3X
SSC que contenía SDS al 1%, dos veces en 2X SSC que contenía SDS al
1% y dos veces en 1X SSC que contenía SDS al 1% (todos estos lavados
se realizaron a 65ºC durante 15 minutos) y un lavado final en 0,1X
SSC que contenía SDS al 1% a 25ºC durante 15 minutos. Una
autorradiografía de los filtros lavados permitió la detección de
sondas hibridadas de forma selectiva. La hibridación de la sonda a
un DNA diana específico indicaba un alto grado de similitud entre
las secuencias de nucleótidos de estos dos DNA, debido al gran
rigor de los lavados.
Una sonda de oligonucleótido se consideraba
específica sólo si hibridaba únicamente DNA de las especies o
géneros de los que había sido aislada. Posteriormente, las sondas de
oligonucleótido que resultaron ser específicas se analizaron en
cuanto a su ubicuidad (es decir, las sondas ubicuas reconocían todos
o la mayor parte de los aislados de la especie o el género diana)
mediante hibridación a DNA microbiano procedente de aislados
clínicos de las especies o géneros de interés, incluyendo cepas de
ATCC. Los DNA de las cepas de especies o géneros diana se
desnaturalizaron, se fijaron a membranas de nailon y se hibridaron
como se describe más arriba. Las sondas se consideraban ubicuas si
hibridaban específicamente el DNA de como mínimo un 80% de los
aislados de las especies o géneros diana.
La especificidad de cebadores y sondas de
oligonucleótido, bien obtenidos de los fragmentos de DNA
secuenciados por nosotros o bien seleccionados de bases de datos,
se analizó mediante amplificación de DNA o mediante hibridación con
especies bacterianas o fúngicas seleccionadas de las enumeradas en
las tablas 4, 5 y 6, según se describe en las dos secciones
anteriores. Posteriormente, los oligonucleótidos que resultaron ser
específicos se analizaron en cuanto a su ubicuidad mediante
amplificación (para los cebadores) o mediante hibridación (para las
sondas) con DNA bacteriano procedente de aislados de las especies o
géneros diana. En la tabla 7 se resumen los resultados de los
análisis de especificidad y ubicuidad con los cebadores de
oligonucleótido. La especificidad y la ubicuidad de los ensayos PCR
realizados utilizando los pares de cebadores de amplificación
seleccionados se analizaron directamente a partir de cultivos
(véanse los ejemplos 9 y 10) de especies bacterianas o fúngicas.
Los diversos ensayos PCR específicos de especie
y específicos de género objeto de la presente invención son todos
específicos. Para los ensayos PCR específicos de especie o género
bacteriano, esto quiere decir que no fue posible amplificar DNA
aislado de una gran variedad de especies bacterianas distintas a la
especie o el género bacteriano(a) diana y seleccionadas de
las tablas 4 y 5. Para el ensayo PCR específico de Candida
albicans, esto quiere decir que no hubo amplificación con DNA
genómico de las especies fúngicas enumeradas en la tabla 6, así como
con diversas especies bacterianas seleccionadas de las tablas 4 y
5.
Los diversos ensayos de PCR específicos de
especie y específicos de género objeto de la presente invención son
también todos ubicuos (tabla 7). (i) Los ensayos PCR específicos de
especie para E. faecium, L. monocytogenes, S. saprophyticus, S.
agalactiae y C. albicans amplificaron DNA genómico de
todas o la mayor parte de las cepas de las especies diana
analizadas, que se habían obtenido de diversas fuentes y que son
representativas de la diversidad dentro de cada especie diana
(tabla 7). La identificación de especie de todas estas cepas estaba
basada en métodos bioquímicos clásicos utilizados de forma rutinaria
en los laboratorios clínicos de microbiología. (ii) Los ensayos PCR
específicos de género para Enterococcus spp.,
Staphylococcus spp., Streptococcus spp. y
Neisseria spp. amplificaron DNA genómico de todas o la mayor
parte de las cepas de los géneros diana analizados, que representan
todas las especies bacterianas de importancia clínica para cada
género diana. Estas cepas se obtuvieron de diversas fuentes y son
representativas de la diversidad dentro de cada género diana. De
nuevo, la identificación de especie de todas estas cepas estaba
basada en métodos bioquímicos clásicos utilizados de forma
rutinaria en los laboratorios clínicos de microbiología. Más
concretamente, los cuatro ensayos PCR específicos de género
amplificaron las siguientes especies: (1) El ensayo específico de
enterococo amplificó eficazmente DNA de las 11 especies de
enterococo analizadas, incluyendo E. avium, E. casseliflavus, E.
dispar, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. flavescens, E.
gallinarum, E. hirae, E. mundtii y E. raffinosus. (2) El
ensayo específico de Neisseria amplificó eficazmente DNA de
las 12 especies de neisseria analizadas, incluyendo N. canis, N.
cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. gonorrhoeae, N. lactamica,
N. meningitidis, N. mucosa, N. polysaccharea, N. sicca, N.
subflava y N. weaveri. (3) El ensayo específico de
Staphylococcus amplificó eficazmente DNA de 13 de las 14
especies de estafilococo analizadas, incluyendo S. aureus, S.
auricularis, S. capitis, S. cohnii, S. epidermidis, S. haemolyticus,
S. hominis, S. lugdunensis, S. saprophyticus, S. schleiferi, S.
simulans, S. warneri y S. xylosus. La especie de
estafilococo que no pudo ser identificada es S. sciuri. (4)
Finalmente, el ensayo específico de Streptococcus amplificó
eficazmente DNA de las 22 especies de estreptococo analizadas,
incluyendo S. agalactiae, S. anginosus, S. bovis, S.
constellatus, S. crista, S. dysgalactiae, S. equi, S. gordonii, S.
intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguis, S.
pneumoniae, S. pyogenes, S. salivarius, S. sanguis, S. sabrinus, S.
suis, S. uberis, S. vestibularis y S. viridans. Por otra
parte, el ensayo específico de Streptococcus no amplificó 3
de 9 cepas de S. mutans y 1 de 23 cepas de S.
salivarius, presentando así una ligera falta de ubicuidad para
estas dos especies de estreptococo.
En el anexo VI se enumeran todos los cebadores
de amplificación específicos y ubicuos para cada especie o género
microbiano diana o gen de resistencia a los antibióticos
investigado. Pueden existir divergencias en los fragmentos de DNA
secuenciados, en la medida en que la divergencia de estas secuencias
o de una parte de las mismas no afecta a la especificidad de las
sondas o los cebadores de amplificación. El DNA bacteriano variante
se halla dentro del alcance de la invención.
Todos los cebadores de amplificación de PCR
enumerados en el anexo VI se analizaron en cuanto a su especificidad
y ubicuidad utilizando cepas de referencia y aislados clínicos
procedentes de diversos lugares geográficos. Las 351 cepas de
referencia utilizadas para analizar la amplificación y para los
ensayos de hibridación (tablas 4, 5 y 6) se obtuvieron de (i) la
American Type Culture Collection (ATCC): 85%, (ii) el Laboratoire de
santé publique du Québec (LSPQ): 10%, (iii) los Centers for Disease
Control and Prevention (CDC): 3%, (iv) la National Culture Type
Collection (NCTC): 1% y (v) otros laboratorios de referencia de todo
el mundo: 1%. Estas cepas de referencia son representativas de (i)
90 especies bacterianas gram-negativas (169 cepas;
tabla 4), (ii) 97 especies bacterianas
gram-positivas (154 cepas; tabla 5) y (iii) 12
especies fúngicas (28 cepas; tabla 6).
La resistencia a los antibióticos complica el
tratamiento y con frecuencia lleva a errores terapéuticos. Además,
el uso excesivo de antibióticos conlleva inevitablemente a la
aparición de una resistencia bacteriana. Nuestro objetivo es
proporcionar a los clínicos, en aproximadamente una hora, la
información necesaria para recetar tratamientos óptimos. Además de
la identificación rápida de muestras clínicas negativas con análisis
basados en DNA para la detección bacteriana universal y la
identificación de la presencia de un patógeno específico en las
muestras positivas con análisis basados en DNA específicos de
especie y/o específicos de género, los clínicos necesitan también
información oportuna sobre la capacidad del patógeno bacteriano para
resistir a los tratamientos con antibióticos. Creemos que la
estrategia más eficaz para evaluar rápidamente la resistencia
bacteriana a los antimicrobianos es detectar directamente, a partir
de las muestras clínicas, los genes de resistencia a los
antibióticos más comunes y clínicamente relevantes (es decir
análisis basados en DNA para la detección de genes de resistencia a
los antibióticos). Dado que las secuencias de los genes bacterianos
de resistencia a los antibióticos más importantes y comunes están
disponibles en las bases de datos, nuestra estrategia era utilizar
la secuencia de una porción o de la totalidad del gen de resistencia
para diseñar cebadores o sondas de oligonucleótido específicos, los
cuales se utilizarán como base para el desarrollo de análisis
rápidos basados en DNA. En la lista de secuencias se indica la
secuencia de cada uno de los genes bacterianos de resistencia a los
antibióticos seleccionados en base a su relevancia clínica (es decir
gran incidencia e importancia). Las tablas 9 y 10 resumen algunas
características de los genes de resistencia a los antibióticos
seleccionados. Nuestro planteamiento es único, ya que la detección
de genes de resistencia a los antibióticos y la detección e
identificación de bacterias se lleva a cabo simultáneamente en
ensayos multiplex en condiciones de amplificación PCR uniformes
(ejemplo 13).
El anexo VI proporciona una lista de todos los
cebadores de amplificación seleccionados de 26 genes de resistencia
a los antibióticos clínicamente relevantes analizados en ensayos
PCR. Los diversos ensayos PCR para la detección e identificación de
genes de resistencia a los antibióticos se validaron analizando
varios aislados bacterianos resistentes de los que se sabía
llevaban el gen establecido como objetivo y que se habían obtenido
de diversos países. Se analizó también un gran número de cepas que
no llevaban el gen de resistencia establecido como objetivo, para
asegurar que todos los ensayos fuesen específicos. Hasta aquí, todos
los ensayos de PCR para genes de resistencia a los antibióticos son
altamente específicos y han detectado todas las cepas bacterianas
resistentes de control de las que se sabe llevan el gen establecido
como objetivo. En las tablas 11 y 12 se presentan los resultados de
algunos estudios clínicos para validar la serie de ensayos PCR para
la detección e identificación de genes de resistencia a los
antibióticos y correlacionar estos ensayos basados en DNA con
métodos estándar de análisis de sensibilidad a los
antimicrobianos.
antimicrobianos.
En el laboratorio de microbiología rutinario, un
alto porcentaje de las muestras clínicas enviadas para la
identificación bacteriana dan negativo en cultivo (tabla 4). Por
tanto, el análisis de muestras clínicas con cebadores de
amplificación universales o sondas universales para detectar la
presencia de bacterias antes de la identificación específica y el
cribado de las numerosas muestras negativas resulta útil, puesto que
ahorra gastos y puede orientar rápidamente la gestión clínica de
los pacientes. Por consiguiente, se sintetizaron varios cebadores
de amplificación y varias sondas a partir de porciones altamente
conservadas de secuencias bacterianas de los genes tuf
(tabla 8). La selección de cebadores universales se basó en una
alineación múltiple de secuencias construida con secuencias
determinadas por nosotros o seleccionadas de secuencias disponibles
en bases de datos según se describe en el ejemplo 1 y el
anexo 1.
anexo 1.
Para la identificación de secuencias procedentes
de bases de datos adecuadas para la detección universal de
bacterias, aprovechamos el hecho de que están disponibles las
secuencias genómicas completas de dos microorganismos distantes
(esto es Mycoplasma genitalium y Haemophilus
influenzae). Una comparación de la secuencia de aminoácidos
para todas las proteínas codificadas por el genoma de estos dos
microorganismos distantes llevó a la identificación de proteínas
altamente homólogas. Un análisis de estas proteínas homólogas
permitió seleccionar algunos candidatos prometedores para el
desarrollo de ensayos universales basados en DNA para la detección
de bacterias. Dado que actualmente está disponible en bases de datos
la secuencia de nucleótidos completa de varios otros genomas
microbianos, el técnico en la materia podría llegar a las mismas
conclusiones comparando secuencias genómicas distintas a las de
Mycoplasma genitalium y Haemophilus influenzae. El gen
tuf seleccionado codifica una proteína
(EF-Tu) involucrada en el proceso de traducción
durante la síntesis proteínica. Posteriormente se realizó un
análisis exhaustivo de secuencia de nucleótidos con las secuencias
del gen tuf disponibles en bases de datos, así como con
nuevas secuencias de tuf por nosotros determinadas según se
describe más arriba. Todos los análisis informáticos de aminoácidos
y secuencias de nucleótidos se realizaron con los programas del
GCG. Posteriormente se seleccionaron cebadores de PCR óptimos para
la amplificación universal de bacterias por medio del programa
Oligo^{TM}. Los cebadores seleccionados estaban degenerados en
varias posiciones de nucleótidos y contenían diversas inosinas para
permitir la amplificación de todas las especies bacterianas
clínicamente relevantes (anexo I). La inosina es un análogo de
nucleótido capaz de unirse específicamente a cualquiera de los
cuatro nucleótidos A, C, G o T. Los oligonucleótidos degenerados
consisten en una mezcla de oligonucleótidos con dos o más de los
cuatro nucleótidos A, C, G o T en el sitio de desapareamiento. La
inclusión de inosina y/o de degeneraciones en los cebadores de
amplificación permite una tolerancia de desapareamiento, haciendo
así posible la amplificación de una colección mayor de secuencias
de nucleótidos diana (Dieffenbach y Dveksler, 1995 PCR Primer: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Plainview,
NY).
NY).
Las condiciones de amplificación con los
cebadores universales fueron idénticas a las utilizadas para los
ensayos de amplificación específicos de especie y específicos de
género, excepto porque la temperatura de emparejamiento fue de 50ºC
en lugar de 55ºC. Este ensayo de PCR universal fue específico y casi
ubicuo para la detección de bacterias. La especificidad para las
bacterias se comprobó amplificando el DNA genómico aislado de las
12 especies fúngicas enumeradas en la tabla 6, así como el DNA
genómico de Leishmania donovani, Saccharomyces cerevisiae y
linfocitos humanos. Ninguna de las preparaciones de DNA eucariota
arriba indicadas pudo amplificarse mediante el ensayo universal, lo
que sugiere que este análisis es específico para bacterias. La
ubicuidad del ensayo universal se comprobó amplificando DNA
genómicos de 116 cepas de referencia que representan 95 de las
especies bacterianas de mayor relevancia clínica. Estas especies se
seleccionan de entre las especies bacterianas enumeradas en las
tablas 4 y 5. Descubrimos que 104 de estas 116 cepas podían
amplificarse. Las especies bacterianas que no fue posible
amplificar pertenecen a los siguientes géneros:
Corynebacterium (11 especies) y Stenotrophomonas (1
especie). Recientemente se ha llevado a cabo la secuenciación de los
genes tuf de estas especies bacterianas. Estos datos de
secuenciación se utilizan para seleccionar nuevos cebadores
universales que puedan ser más ubicuos. Estos cebadores están en
proceso de análisis. Observamos también que para varias especies
era necesario bajar la temperatura de emparejamiento a 45ºC con el
fin de lograr una amplificación eficaz. Estas especies bacterianas
incluyen Gemella morbilbrum, Listeria spp. (3 especies) y
Gardnerella vaginalis. Es importante señalar que las 95
especies bacterianas seleccionas de las tablas 4 y 5 con el fin de
analizar la ubicuidad del ensayo universal incluyen todas las
especies bacterianas de mayor relevancia clínica asociadas a
diversas infecciones humanas de origen comunitario o adquiridas en
hospitales (infecciones nosocomiales). En las tablas 1 y 2 se
indican los patógenos bacterianos y fúngicos de mayor
importancia
clínica.
clínica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos y anexos siguientes tienen la
finalidad de ilustrar los diversos métodos y compuestos de la
invención y no la de limitar el alcance de la misma.
Los diversos anexos muestran las estrategias
utilizadas para la selección de cebadores de amplificación a partir
de secuencias de tuf o a partir del gen recA: (i) El
anexo I ilustra la estrategia utilizada para la selección de los
cebadores de amplificación universales a partir de secuencias de
tuf. (ii) El anexo II muestra la estrategia utilizada para
la selección de los cebadores de amplificación específicos para el
género Enterococcus a partir de secuencias de tuf.
(iii) El anexo III ilustra la estrategia utilizada para la
selección de los cebadores de amplificación específicos para el
género Staphylococcus a partir de secuencias de tuf.
(iv) El anexo IV muestra la estrategia utilizada para la selección
de los cebadores de amplificación específicos para la especie
Candida albicans a partir de secuencias de tuf. (v) El
anexo V ilustra la estrategia utilizada para la selección de los
cebadores de amplificación específicos para el género
Streptococcus a partir de secuencias de recA. (vi) El
anexo VI contiene una lista de todos los pares de cebadores
seleccionados. Como se muestra en estos anexos, los cebadores de
amplificación seleccionados pueden contener inosinas y/o
degeneraciones. La inosina es un análogo de nucleótido capaz de
unirse específicamente a cualquiera de los cuatro nucleótidos A, C,
G o T. Como alternativa se utilizaron oligonucleótidos degenerados,
que consisten en una mezcla de oligonucleótidos con dos o más de los
cuatro nucleótidos A, C, G o T en el sitio de desapareamiento. La
inclusión de inosina y/o degeneraciones en los cebadores de
amplificación permite una tolerancia de desapareamiento, haciendo
así posible la amplificación de una colección mayor de secuencias
de nucleótidos diana (Dieffenbach y Dveksler, 1995 PCR Primer: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,
Nueva York).
\newpage
Ejemplo
1
Como se muestra en el anexo I, la comparación de
secuencias de tuf procedentes de diversas especies
bacterianas y eucariotas permitió la selección de cebadores PCR
universales para la detección de bacterias. La estrategia utilizada
para diseñar los cebadores PCR se basó en el análisis de una
alineación múltiple de diversas secuencias de tuf. Esta
alineación múltiple de secuencias incluye secuencias de tuf
de 38 especies bacterianas y 3 especies eucariotas, bien
determinadas por nosotros o bien seleccionadas de bases de datos
(tabla 13). Un análisis meticuloso de esta alineación múltiple de
secuencias permitió la selección de las secuencias de cebador que
se conservan dentro de las eubacterias pero que discriminan
secuencias de eucariotas, haciendo así posible la detección
universal de bacterias. Como se muestra en el anexo I, los cebadores
seleccionados contienen diversas inosinas y degeneraciones. Esto
era necesario ya que existe un polimorfismo relativamente alto
entre las secuencias de tuf bacterianas, a pesar del hecho de
que este gen está altamente conservado. De hecho, entre las
secuencias de tuf determinadas por nosotros encontramos
muchas variaciones de nucleótidos, así como algunas deleciones y/o
inserciones de aminoácidos. Los cebadores universales seleccionados
eran específicos y ubicuos para las bacterias (tabla 7). De las 95
especies bacterianas de mayor importancia clínica analizadas, 12 no
se amplificaron. Estas especies pertenecen a los géneros
Corynebacterium (11 especies) y Stenotrophomonas (1
especie). Los cebadores universales no amplificaron DNA de origen no
bacteriano, incluyendo DNA humano y otros tipos de DNA
eucariota.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Como se muestra en los anexos 2 y 3, la
comparación de secuencias de tuf procedentes de diversas
especies bacterianas permitió la selección de cebadores PCR
específicos para Enterococcus spp. ó Staphylococcus
spp. La estrategia utilizada para diseñar los cebadores PCR se basó
en el análisis de una alineación múltiple de diversas secuencias de
tuf. Estas alineaciones múltiples de secuencias incluyen las
secuencias de tuf de cuatro especies bacterianas
representativas seleccionadas de cada género diana, así como
secuencias de tuf de especies de otros géneros bacterianos
estrechamente relacionados. Un análisis meticuloso de estas
alineaciones permitió la selección de secuencias de oligonucleótido
que se conservan dentro del género diana pero que discriminan
secuencias de otros géneros estrechamente relacionados, haciendo así
posible la detección y la identificación específicas de género y
ubicuas del género bacteriano diana.
Para la selección de cebadores específicos para
Enterococcus spp. (anexo II), hemos secuenciado una porción
de aproximadamente 890 pb de los genes tuf de Enterococcus
avium, E. faecalis, E. faecium y E. gallinarum. Todas
las demás secuencias de tuf utilizadas en la alineación
fueron secuenciadas por nosotros o bien seleccionadas de bases de
datos. El análisis de esta alineación de secuencias llevó a la
selección de un par de cebadores específico y ubicuo para
Enterococcus spp. (tabla 7). Todas las 11 especies de
enterococo analizadas se amplificaron eficazmente sin excepciones y
no se produjo amplificación con DNA genómico de especies
bacterianas de otros géneros.
Para la selección de cebadores específicos para
Staphylococcus spp. (anexo III), hemos secuenciado también
una porción de aproximadamente 890 pb de los genes tuf de
Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus y
S. simulans. Todas las demás secuencias de tuf
utilizadas en la alineación fueron secuenciadas por nosotros o bien
seleccionadas de bases de datos. El análisis de esta alineación de
secuencias llevó a la selección de dos pares de cebadores
específicos y ubicuos para Staphylococcus spp. (tabla 7). El
anexo III muestra la estrategia utilizada para seleccionar uno de
estos dos pares de cebadores PCR. Para seleccionar el otro par de
cebadores se utilizó la misma estrategia. De las 14 especies de
estafilococo analizadas, una (S. sciuri) no pudo
amplificarse mediante los ensayos PCR específicos de
Staphylococcus realizados con cualquiera de estos dos pares
de cebadores. En lo que se refiere a los ensayos PCR realizados con
cualquiera de estos dos pares de cebadores, no se produjo
amplificación con DNA de especies de otros géneros bacterianos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Como se muestra en el anexo IV, la comparación
de secuencias de tuf procedentes de diversas especies
bacterianas y eucariotas permitió la selección de cebadores PCR
específicos para Candida albicans. La estrategia utilizada
para diseñar los cebadores PCR se basó en el análisis de una
alineación múltiple de diversas secuencias de tuf. Esta
alineación múltiple de secuencias incluye secuencias de tuf
de cinco especies fúngicas representativas seleccionadas del género
Candida, determinadas por nuestro grupo (esto es C.
albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis y C.
tropicalis), así como secuencias de tuf de otras especies
fúngicas estrechamente relacionadas. Se incluyeron también
secuencias de tuf de diversas especies bacterianas. Un
análisis meticuloso de esta alineación de secuencias permitió la
selección de cebadores a partir de la secuencia de tuf de
C. albicans; estos cebadores discriminan secuencias de otras
especies de Candida estrechamente relacionadas y otras
especies fúngicas, haciendo así posible la detección y la
identificación específicas de especie y ubicuas de C.
albicans (tabla 7). Todas las 88 cepas de Candida
albicans analizadas se amplificaron eficazmente sin excepciones
y no se produjo amplificación con DNA genómico de otras especies
fúngicas o bacterianas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
(Comparativo)
Como se muestra en el anexo V, se utilizó la
comparación de las diversas secuencias del gen recA
bacteriano disponibles en bases de datos (GenBank y EMBL) como base
para la selección de cebadores PCR específicos y ubicuos para el
género bacteriano Streptococcus. Dado que las secuencias del
gen recA están disponibles para muchas especies bacterianas,
incluyendo cinco especies de estreptococos, fue posible elegir
secuencias bien conservadas dentro del género Streptococcus,
pero distintas a las secuencias de recA de otros géneros
bacterianos. En los casos en que existían desapareamientos entre las
secuencias del gen recA de las cinco especies de
Streptococcus, se incorporó un residuo de inosina al cebador
(anexo V). Los cebadores seleccionados, que contenían todos una
inosina y ninguna degeneración, eran específicos y ubicuos para las
especies de Streptococcus (tabla 7). Este ensayo PCR
amplificó sin excepciones las 22 especies de estreptococo
analizadas. Sin embargo, el ensayo específico de
Streptococcus no amplificó DNA de 3 de las 9 cepas de S.
mutans y de 1 de las 3 cepas de S. salivarius. No se
produjo amplificación con DNA genómico de otros géneros bacterianos
(tabla 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se determinó la secuencia de nucleótidos de una
porción de los genes tuf de diversas especies bacterianas o
fúngicas utilizando el método de secuenciación de terminación de
cadena de didesoxinucleótido (Sanger y col., 1977, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 74:5463-5467). La secuenciación se
realizó con un secuenciador de DNA automatizado de Applied
Biosystems (modelo 373A) con su PRISM^{TM} Sequenase® Terminator
Double-stranded DNA Sequencing Kit
(Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Division,
Foster City, CA). La estrategia de secuenciación no discrimina los
genes tufA y tufB porque los cebadores de
secuenciación hibridan eficazmente ambos genes tuf
bacterianos. Estas secuencias de DNA se muestran en la lista de
secuencias (SEQ ID NO s: 118 a 146). La presencia de varios
nucleótidos degenerados en las diversas secuencias de tuf
determinadas por nuestro grupo (tabla 13) corresponde a las
variaciones de secuencia entre tufA y tufB.
A partir de los fragmentos de DNA patentados
indicados o de secuencias procedentes de bases de datos se
seleccionaron, mediante el programa Oligo^{TM}, sondas y
cebadores de amplificación de oligonucleótido que se sintetizaron
con un sintetizador de DNA ABI automatizado (modelo 391,
Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Division)
utilizando la química de la fosforamidita.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Todos los oligonucleótidos se marcaron en el
extremo 5' con \gamma-^{32}P(dATP) con T4
polinucleótido-quinasa (Pharmacia) según se ha
descrito anteriormente. El marcador podría ser también no
radioactivo.
Todas las sondas de oligonucleótido marcadas se
analizaron en cuanto a su especificidad mediante hibridación DNA de
diversas especies bacterianas y fúngicas seleccionadas de las tablas
4, 5 y 6 según se ha descrito anteriormente. Las sondas específicas
de especie o específicas de género eran aquellas que hibridaban sólo
a DNA de especies o géneros microbianos de los cuales habían sido
aisladas. Las sondas de oligonucleótido que resultaron ser
específicas se sometieron a análisis de ubicuidad como se explica a
continuación.
A continuación se utilizaron sondas de
oligonucleótido específicas en los análisis de ubicuidad con cepas
de las especies o géneros diana, incluyendo cepas de referencia y
otras cepas obtenidas de diversos países y que son representativas
de la diversidad dentro de cada especie o género diana. Se
transfirieron DNAs cromosómicos de los aislados a membranas de
nailon y se hibridaron con sondas de oligonucleótido marcadas, como
se ha descrito para los análisis de especificidad. Las baterías de
aislados construidas para cada especie o género diana contienen
cepas ATCC de referencia así como una variedad de aislados clínicos
obtenidos de diversas fuentes. Las sondas ubicuas eran aquellas que
hibridaban a como mínimo un 80% de los DNA de la batería de aislados
clínicos de las especies o géneros diana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Igual que el Ejemplo 6, excepto que se utiliza
para la identificación microbiana un pool de sondas de
oligonucleótido específicas, (i) con el fin de aumentar la
sensibilidad y asegurar un 100% de ubicuidad o (ii) con el fin de
identificar simultáneamente más de una especie y/o género
microbiano. La identificación microbiana podría llevarse a cabo a
partir de cultivos microbianos o directamente a partir de cualquier
muestra clínica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Igual que el Ejemplo 6, excepto que las
bacterias o los hongos se detectaron directamente a partir de
muestras clínicas. Toda muestra biológica se cargó directamente en
un aparato de transferencia puntual y las células se lisaron in
situ para la detección y la identificación de bacterias u
hongos. Las muestras de sangre debían heparinizarse para evitar que
la coagulación afectara a la carga apropiada de las mismas en un
aparato de transferencia puntual.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se utilizó la técnica PCR para aumentar la
sensibilidad y la rapidez de los ensayos. Los grupos de cebadores
se analizaron en ensayos PCR realizados directamente a partir de
colonias bacterianas o a partir de una suspensión bacteriana
normalizada (véase el ejemplo 10) para determinar su especificidad y
ubicuidad (tabla 7). En el anexo VI se dan ejemplos de pares de
cebadores de PCR específicos y ubicuos.
La especificidad de todos los pares de cebadores
de PCR seleccionados se analizó contra DNA de diversas especies
bacterianas y fúngicas seleccionadas de las tablas 4, 5 y 6, como se
ha descrito anteriormente. A continuación, los pares de cebadores
que resultaron ser específicos para cada especie o género se
analizaron en cuanto a su ubicuidad para asegurar que cada grupo de
cebadores pudiera amplificar como mínimo un 90% de los DNA de una
batería de aislados de las especies o géneros diana. Las baterías de
aislados construidas para cada especie contenían cepas ATCC de
referencia y diversos aislados clínicos procedentes de todo el
mundo, que son representativos de la diversidad dentro de cada
especie o género.
Deberían tomarse las precauciones habituales
para evitar resultados falso positivo de la PCR (Kwok e Higuchi,
1989, Nature, 239:237-238). Para controlar el
arrastre de la PCR pueden utilizarse métodos destinados a inactivar
productos de amplificación de PCR, tales como inactivación mediante
uracil-N-glucosilasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se realizaron ensayos PCR directamente a partir
de una colonia bacteriana o bien a partir de una suspensión
bacteriana, estando esta última ajustada a un estándar McFarland de
0,5 (que corresponde a aproximadamente 1,5 x 10^{8}
bacterias/ml). En el caso de la amplificación directa a partir de
una colonia, se transfirió una porción de una colonia mediante una
barra de plástico directamente a 20 \mul de una mezcla de reacción
PCR que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH
9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2,5 mM, 0,4
\muM de cada cebador, 200 \muM de cada uno de los cuatro dNTP y
0,5 unidades de Taq DNA polimerasa (Promega) combinada con
el anticuerpo TaqStart^{TM} (Clontech Laboratories Inc.). Para la
suspensión bacteriana se añadió 1 \mul de la suspensión celular a
19 \mul de la misma mezcla de reacción PCR. Para la identificación
a partir de cultivos de levaduras se añadió directamente a la
reacción PCR 1 \mul de un estándar McFarland 1,0 (que corresponde
a aproximadamente 3,0 x 10^{8} bacterias/ml) concentrado 100 veces
mediante centrifugación. Esta etapa de concentración para las
células de levadura se llevó a cabo debido a que un McFarland 0,5
para células de levadura tiene aproximadamente 200 veces menos
células que un McFarland 0,5 para células bacterianas.
A continuación se sometieron las reacciones PCR
a una ciclación térmica (3 minutos a 95ºC, seguidos de 30 ciclos de
1 segundo a 95ºC para la etapa de desnaturalización y 30 segundos a
55ºC para la etapa de emparejamiento-extensión) con
un termociclador PTC-200. Después se analizaron los
productos de amplificación de PCR mediante electroforesis en gel de
agarosa estándar (2%). Los productos de amplificación se
visualizaron en geles de agarosa que contenían 0,25 \mug/ml de
bromuro de etidio bajo UV a 254 nm. Todo el ensayo PCR puede
completarse en aproximadamente una hora.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se utilizaron secuencias de cebador obtenidas de
regiones altamente conservadas del gen de RNA ribosómico 16S
bacteriano para proporcionar un control interno para todas las
reacciones PCR. Como alternativa, el control interno se obtuvo de
secuencias que no se hallaban en microorganismos ni en el genoma
humano. El control interno se integró en todas las reacciones de
amplificación para comprobar la eficacia de los ensayos PCR y
asegurar la ausencia de una inhibición de PCR significativa. El
control interno obtenido de rRNA resultó útil también para
controlar la eficacia de los protocolos de lisis bacteriana. El
control interno y las amplificaciones específicas de especie o
específicas de género se realizaron simultáneamente en ensayos PCR
multiplex.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Para la amplificación PCR realizada directamente
a partir de muestras de orina, se mezcló 1 \mul de orina con 4
\mul de una solución de lisis que contenía KCl 500 mM,
tris-HCl 100 mM (pH 9,0), triton
X-100 al 1%. Después de una incubación de como
mínimo 15 minutos a temperatura ambiente, se añadió directamente a
19 \mul de la mezcla de reacción PCR 1 \mul de la muestra de
orina tratada. La concentración final de los reactivos de PCR era
KCl 50 mM, tris 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al
0,1%, MgCl_{2} 2,5 mM, 0,4 \muM de cada cebador, 200 \muM de
cada uno de los cuatro dNTP. Además, cada 20 \mul de reacción
contenían 0,5 unidades de Taq DNA-polimerasa
(Promega) combinada con el anticuerpo TaqStart^{TM} (Clontech
Laboratories Inc.).
Las estrategias para el control interno, la
amplificación por PCR y la detección de los amplicones en gel de
agarosa son las descritas anteriormente en el Ejemplo 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
La presencia de genes de resistencia a
antibióticos específicos de aparición frecuente y clínicamente
relevantes se identifica mediante los protocolos de amplificación
PCR o hibridación arriba descritos. Los oligonucleótidos
específicos utilizados como base para los análisis basados en DNA se
seleccionan de las secuencias de genes de resistencia a los
antibióticos. Estos análisis, que permiten una evaluación rápida de
la resistencia bacteriana a agentes antimicrobianos, pueden
realizarse directamente a partir de muestras clínicas, a partir de
una suspensión bacteriana normalizada o a partir de una colonia
bacteriana y su fin es complementar el análisis de diagnóstico para
la detección universal de bacterias, así como para la detección y la
identificación microbianas específicas de especie y específicas de
género.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Igual que los Ejemplos 10 y 11, excepto que los
ensayos se realizaron por PCR multiplex (esto es utilizando varios
pares de cebadores en una única reacción PCR) con el fin de alcanzar
una ubicuidad del 100% para el o los patógenos específicos
establecidos como objetivo. Para especies o géneros más
heterogéneos, puede ser necesaria una combinación de pares de
cebadores de PCR para detectar e identificar todos los
representantes de las especies o géneros diana.
Los ensayos PCR multiplex podrían utilizarse
también para (i) detectar simultáneamente varias especies y/o
géneros microbianos(as) o, como alternativa, (ii) para
detectar e identificar simultáneamente patógenos bacterianos y/o
fúngicos y detectar genes de resistencia a antibióticos específicos,
bien directamente a partir de una muestra clínica o bien a partir
de cultivos bacterianos.
En lo que se refiere a estas aplicaciones, los
métodos de detección de amplicones deberían adaptarse para
diferenciar los diversos amplicones producidos. Podría utilizarse
una electroforesis en gel de agarosa estándar, ya que discrimina
los amplicones en base a sus tamaños. Otra estrategia útil para este
fin sería la detección con diversos colorantes fluorescentes que
emiten a distintas longitudes de onda. Los colorantes fluorescentes
pueden acoplarse cada uno a un oligonucleótido específico unido a un
extintor de fluorescencia, que se degrada durante la amplificación,
para liberar los colorantes fluorescentes (por ejemplo
TaqMan^{TM}, Perkin Elmer).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
El técnico en la materia comprenderá que pueden
utilizarse alternativas distintas a la electroforesis en gel de
agarosa estándar (Ejemplo 10) para revelar los productos de
amplificación. Tales métodos pueden estar basados en la
polarización de fluorescencia o en la detección de fluorescencia
después de la amplificación (por ejemplo Amplisensor^{TM},
Biotronics; TaqMan^{TM}, Perkin-Elmer Corp.) o en
otros marcadores tales como biotina (sistema SHARP Signal^{TM},
Digene Diagnostics). Estos métodos son cuantitativos y pueden
automatizarse. Uno de los cebadores de amplificación o una sonda de
oligonucleótido interna específica del o los amplicones obtenidos
de los fragmentos de DNA específicos de especie, específicos de
género o universales se acopla a los colorantes fluorescentes o a
cualquier otro marcador. Los métodos basados en la detección de
fluorescencia son particularmente adecuados para el análisis de
diagnóstico, ya que son rápidos y flexibles, existiendo colorantes
fluorescentes que emiten a distintas longitudes de onda.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Los cebadores de amplificación específicos de
especie, específicos de género, universales y de genes de
resistencia a los antibióticos pueden utilizarse en otros
procedimientos de amplificación rápidos, tales como la reacción en
cadena de la ligasa (LCR), la amplificación mediada por
transcripción (TMA), la replicación de secuencia autosostenida
(3SR), la amplificación basada en secuencias de ácido nucleico
(NASBA), la amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), la
tecnología de sonda de ciclo (CPT) y el DNA ramificado (bDNA), o
cualesquiera otros métodos para aumentar la sensibilidad del
análisis. Las amplificaciones pueden realizarse a partir de
cultivos bacterianos aislados o directamente a partir de cualquier
muestra clínica. Por tanto, el alcance de esta invención no está
limitado al uso de las secuencias de DNA de la lista de secuencias
adjunta sólo para la PCR, sino que también incluye el uso de
cualquier procedimiento para detectar específicamente DNA
bacteriano y que pueda utilizarse para aumentar la rapidez y
sensibilidad de los análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Un kit de análisis contendrá juegos de sondas
específicos para cada especie o género microbiano(a), así
como un juego de sondas universales. El kit se proporciona en forma
de componentes de análisis, consistentes en el juego de sondas
universales marcadas con marcadores no radioactivos, así como sondas
específicas de especie o específicas de género para la detección de
cada patógeno de interés en tipos específicos de muestras clínicas.
El kit incluirá también reactivos de análisis necesarios para
realizar la prehibridación, la hibridación, las etapas de lavado y
la detección de híbridos. Por último, se incluirán componentes de
análisis para la detección de genes de resistencia a los
antibióticos conocidos (o derivados de los mismos). Por supuesto,
el kit incluirá muestras estándar para su uso como controles
negativos y positivos para cada análisis de hibridación.
Los componentes que han de incluirse en los kits
estarán adaptados a cada tipo de muestra y para detectar patógenos
de aparición frecuente en ese tipo de muestra. También se incluirán
reactivos para la detección universal de bacterias. Basándose en
los sitios de infección, pueden desarrollarse los siguientes kits
para la detección específica de patógenos:
- -
- Un kit para la detección universal de patógenos bacterianos o fúngicos a partir de toda muestra clínica conteniendo juegos de sondas específicos para regiones altamente conservadas de los genomas microbianos.
- -
- Un kit para la detección de patógenos microbianos recuperados de muestras de orina que contiene 5 componentes de análisis específicos (juegos de sondas para la detección de Enterococcus faecium, especies de Enterococcus, Staphylococcus saprophyticus, especies de Staphylococcus y Candida albicans).
- -
- Un kit para la detección de patógenos respiratorios que contiene 3 componentes de análisis específicos (juegos de sondas para la detección de especies de Staphylococcus, especies de Enterococcus y Candida albicans).
- -
- Un kit para la detección de patógenos recuperados de muestras de orina que contiene 10 componentes de análisis específicos (juegos de sondas para la detección de especies de Streptococcus, Streptococcus agalactiae, especies de Staphylococcus, Staphylococcus saprophyticus, especies de Enterococcus, Enterococcus faecium, especies de Neisseria, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes y Candida albicans). Este kit puede aplicarse también para la detección e identificación directas a partir de cultivos de sangre.
- -
- Un kit para la detección de patógenos causantes de la meningitis que contiene 5 componentes de análisis específicos (juegos de sondas para la detección de especies de Streptococcus, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, especies de Neisseria y especies de Staphylococcus).
- -
- Un kit para la detección de genes de resistencia a los antibióticos clínicamente importantes que contiene juegos de sondas para la detección específica de como mínimo uno de los 26 genes siguientes asociados a la resistencia a los antibióticos: bla_{tem}, bla_{rob}, bla_{shv}, bla_{oxa,} blaZ, aadB, aacC1, aacC2, aacC3, aacA4, aac6'-IIa, ermA, ermB, ermC, mecA, vanA, vanB, vanC, satA, aac(6')-aph(2''), aad(6'), vat, vga, msrA, sul e int.
- -
- También pueden desarrollarse otros kits adaptados a la detección de patógenos de la piel, heridas abdominales o cualesquiera otras infecciones clínicamente relevantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Igual que el Ejemplo 16, excepto que los kits de
análisis contienen todos los reactivos y controles para realizar
ensayos de amplificación de DNA. Los kits de diagnóstico estarán
adaptados a la amplificación por PCR (u otros métodos de
amplificación) directamente a partir de muestras clínicas o bien a
partir de cultivos microbianos. Se incluirán los componentes
necesarios para (i) la detección bacteriana universal, (ii) la
detección e identificación bacterianas y/o fúngicas específicas de
especie y específicas de género y (iii) la detección de genes de
resistencia a los antibióticos.
Los ensayos de amplificación podrían realizarse
en tubos o bien en placas de microtitulación con múltiples
pocillos. Para los ensayos en placas, los pocillos contendrán los
cebadores de amplificación específicos y los DNA control y la
detección de los productos de amplificación será automatizada. En
los kits para análisis directamente a partir de muestras clínicas
se incluirán reactivos y cebadores de amplificación para la
detección bacteriana universal. En los kits para el análisis
directo a partir de cultivos bacterianos o fúngicos, así como en
los kits para el análisis directo a partir de cualquier tipo de
muestra clínica, se incluirán los componentes necesarios para la
detección e identificación bacterianas y/o fúngicas específicas de
especie y específicas de género, así como para la detección
simultánea de genes de resistencia a antibióticos.
Los kits estarán adaptados al uso con todo tipo
de muestra según se describe en el Ejemplo 16 para los kits de
diagnóstico basados en la hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Se entiende que el uso de las sondas y los
cebadores de amplificación descritos(as) en esta invención
para la detección e identificación bacterianas y/o fúngicas no está
limitado a las aplicaciones de microbiología clínica. De hecho,
creemos que otros sectores podrían beneficiarse también de estas
nuevas tecnologías. Por ejemplo, estos análisis podrían ser
utilizados por las industrias para el control de calidad de
alimentos, agua, aire, productos farmacéuticos u otros productos
que requieran un control microbiológico. Estos análisis podrían
aplicarse también para detectar e identificar bacterias u hongos en
muestras biológicas de organismos que no sean humanos (por ejemplo
otros primates, aves, plantas, mamíferos, animales de granja, ganado
y otros). Estas herramientas de diagnóstico podrían ser también muy
útiles para fines de investigación, incluyendo pruebas clínicas y
estudios epidemiológicos.
En el texto precedente se ha descrito esta
invención y es evidente que pueden realizarse modificaciones en la
misma. Estas modificaciones se definen en las reivindicaciones
adjuntas.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Anexo
I
\vskip1.000000\baselineskip
Anexo
II
\newpage
Anexo
III
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Anexo
IV
\newpage
Anexo V:
(comparativo)
\vskip1.000000\baselineskip
Anexo
VI
\newpage
Anexo
VI
\newpage
Anexo
VI
\newpage
Anexo
VI
\newpage
Anexo
VI
\newpage
Anexo
VI
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INFECTIO DIAGNOSTIC (I.D.I.) INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2050, BOULEVARD RENE LEVESQUE OUEST, 4E ETAGE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: STE-FOY
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: QUEBEC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): G1V 2KB
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (418) 681-4343
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: (418) 681-5254
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BERGERON, MICHEL G.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2069 RUE BRULARD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: SILLERY
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: QUEBEC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): G1T 1G2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: PICARD, FRANCOIS J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1245, RUE DE LA SAPINIERE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: CAP-ROUGE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: QUEBEC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): G1Y 1A1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: OUELLETTE, MARC
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1035 DE PLOERMEL
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: SILLERY
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: QUEBEC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): G1S 3S1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: ROY, PAUL H.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 28, RUE CHARLES GARNIER
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LORETTEVILLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: QUEBEC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): G2A 3S1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SONDAS DE DNA Y CEBADORES DE AMPLIFICACIÓN ESPECÍFICOS DE ESPECIE, ESPECÍFICOS DE GÉNERO Y UNIVERSALES PARA LA DETECCIÓN Y LA IDENTIFICACIÓN RÁPIDAS DE PATÓGENOS BACTERIANOS Y FÚNGICOS COMUNES Y GENES DE RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS ASOCIADOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 174
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0. Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/743,637
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-NOV-1996
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Enterococcus faecium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTTTAGCA ACAGCCTATC AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Enterococcus faecium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAACTTCTT CCGGCACTTC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Listeria monocytogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCGGCTATA AATGAAGAGG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Listeria monocytogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCGATGAT GCTATGGCTT T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGCGGTAT TGTTTGGTGG T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGCGGCCT TTAATAATTT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Staphylococcus saprophyticus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATCGAATT CCACATGAAG GTTATTATGA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Staphylococcus saprophyticus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGCTTCTCC CTCAACAATC AAACTATCCT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus agalactiae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTCACCAGC TGTATTAGAA GTA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus agalactiae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTCCCTGAA CATTATCTTT GAT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Candida albicans
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAGAAGGTT GGTTACAACC CAAAGA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Candida albicans
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTCTTACC AGTAACTTTA CCGGAT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACTGACAAA CCATTCATGA TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACTTCGTCA CCAACGCGAA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGCGCGGT ATGGTCGGTT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGACGTTG GAAGTGGTAA AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGTGTTGAA CGTGGTCAAA TCAAA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTRTGTGGTGT RATWGWRCCA GGAGC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAACGTGGW CAAGTWTTAG CWGCT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCATTTCWG TACCTTCTGG TAAGT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAATTGCAG GNAAATTGAT TGA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTACGCATGG CNTGACTCAT CAT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACNKKNACNG GNGTNGARAT GTT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 18
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAYRTTNTCNC CNGGCATNAC CAT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGCTTCTCC
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 600 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Enterococcus faecium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Enterococcus faecium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.920 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Listeria monocytogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 415 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 28:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 438 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Staphylococcus saprophyticus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 768 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus agalactiae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 30:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 421 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 213 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus gordonii
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 32:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 692 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus mutans
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 33:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.204 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 34:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 981 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 312 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus salivarius
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 36:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATGTGGCG CGGTATTATC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCAGTGTTA TCACTCATGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGAATGAAG CCATACCAAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCAGCAATA AACCAGCCAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTACCATGAG CGATAACAGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCATTCAGT TCCGTTTCCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCTGCTGC AGTGGATGGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTCTGCTT TGTTATTCGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGCCAACA TCGTGGAAAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGAATTTGG CTTCTTCGGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGATACAGA AACGGGACAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAATCTTTT TCAGGCAGCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGTTTGA AGGGTTTATT ATAAG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTAGTGT GTTTAGAATG GTGAT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTTCAACAC CTGCTGCTTT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGACCACTTT TATCAGCAAC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAATAGTT GAAATGCTCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCTGTTAC AACGGACTGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTATGATCT CGCAGTCTCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGTCACCG TAATCTGCTT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATTCTCGAT TGCTTTGCTA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAAATGCT TCTCAAGATA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGATTATG GCTACGGAGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCAGTGTGA TGGTATCCAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTCTTGAT GAAGTGCTGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGTCTATT CCTCGCACTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATGAGAAGG CAGGATTCGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTTCTCTC GAAGGCTTGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGTTGCTGT TCAATGATCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTTTGAAC CATGTACACG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTAGAGGTC TAGCCCGTGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGGGATAA CGACTGTATG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAAAGATGA TAGGCCGGTG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTGTCATA TTGTCTTGCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTATCTTCG GCGGTTGCTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTATCGGC TTCCCATTCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATAGAAGC AGCAGGACAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGATGGATG CGGAAGATAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTTATGTA TGAACAAATG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGACTTTWG TGATCCCTTT TGA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCAATCATT GCACAAAATC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCCCTCT ATTTGGTGGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCCAAGCCA GTAAAGCTAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTTTTTCA ACTTCTTCCA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCATAGAATG GATGGCTCAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTACTATT GCACCATCCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATAAGGGC ATACCAAAAA TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTAACATT TGTGGCATTA TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGGAAGAT GAAGTTTTTA GA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTTACTCC AATAATTTGG CT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTCATCTAT TCAGGATGGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 88:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGCAACAT TCTTTGTGAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 89:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTGCCTGAA GAAGGTATTG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTGTTACTT CACCACCACT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATCTTATCG TTGAGAAGGG ATT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACACTTGG CTTAGGATGA AA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATCTGATT GTTGAAGAAG GATT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTTACTCTT GGTTTAGGAT GAAA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGTTGATC ACGATAATTT CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTTTTAGC AAACCCGTAT TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACAGGTGAA TTATTAGCAC TTGTAAG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTGCTGTTA ATATTTTTTG AGTTGAA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 99:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 99:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGATCGAAA TCCAGATCC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 100:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 100:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCTCGGTT TTCTGGAAG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 101:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 101:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGTCATAC ATGTGATGG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 102:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 102:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGTTACCC GAGAGCTTG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 103:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 103:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTAAGCGTGC ATAATAAGCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 104:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 104:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGCGATTAC TTCGCCAACT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 105:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 105:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTACTAAGC TTGCCCCTTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 106:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 106:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAGGCAGC AATTATGAGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 107:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 18
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 107:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAYATGATNA CNGGNGCNGC NCARATGGA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 108:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 108:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCNACNGTNC KNCCRCCYTC RCG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 109:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 18
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 109:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCARYTNATHG TNGCNGTNAA YAARATGGA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 110:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 831 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 110:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 111:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 846 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 111:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 112:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 555 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 112:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 113:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 732 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 113
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 114:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 738 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 114:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 115:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 735 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 115:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 116:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.029 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 116:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 117:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.031 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 117:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 118:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 809 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Abiotrophia adiacens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 118:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 119:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Abiotrophia defectiva
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 119:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 120:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 754 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Candida albicans
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 120:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 121:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 753 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Candida glabrata
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 121:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 122:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 752 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Candida krusei
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 122:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 123:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 754 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Candida parapsilosis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 123:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 124:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 753 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Candida tropicalis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 124:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 125:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 814 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium accolens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 125:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 126:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 814 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium diphteriae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 126:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 127:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 814 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium genitalium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 127:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 128:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 814 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium jeikeium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 128:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 129:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 748 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium pseudodiphteriticum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 129:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 130:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 813 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Corynebacterium striatum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 130:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 131:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Enterococcus avium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 131:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 132:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Enterococcus faecalis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 132:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 133:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 774 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Enterococcus faecium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 133:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 134:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 809 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Enterococcus gallinarum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 134:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 135:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 823 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Gardnerella vaginalis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 135:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 136:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Listeria innocua
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 136:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 137:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 818 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Listeria ivanovii
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 137:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 138:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Listeria monocytogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 138:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 139:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Listeria seeligeri
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 139:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 140:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 814 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Staphylococcus aureus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 140:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 141:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 814 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Staphylococcus epidermidis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 141:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 142:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Staphylococcus saprophyticus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 142:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 143:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Staphylococcus simulans
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 143:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 144:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus agalactiae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 144:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 145:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 145:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 146:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus salivarius
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 146:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 147:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 897 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Agrobacterium tumefaciens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 147:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 148:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 885 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Bacilus subtilis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 148:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 149:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 882 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Bacteroides fragilis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 149:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 150:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 888 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Borrelia burgdorferi
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 150:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 151:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 894 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brevibacterium linens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 151:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 152:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 888 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Burkholderia cepacia
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 152:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 153:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Chlamydia trachomatis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 153:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 154:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 154:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 155:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Fibrobacter succinogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 155:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 156:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 894 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Flavobacterium ferrugineum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 156:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 157:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Haemophilus influenzae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 157:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 158:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 906 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Helicobacter pylori
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 158:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 159:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Micrococcus luteus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 159:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 160:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 160:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 161:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma genitalium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 161:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 162:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria gonorrheae
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 162:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 163:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Rickettsia prowazekii
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 163:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 164:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Salmonella typhimurium
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 164:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 165:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 881 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Shewanella putida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 165:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 166:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 897 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Stigmatella aurantiaca
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 166:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 167:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 894 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptococcus pyogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 167:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 168:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 897 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Thiobacillus cuprinus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 168:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 169:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 894 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Treponema pallidum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 169:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 170:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 891 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Ureaplasma urealyticum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 170:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 171:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 909 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Wolinella succinogenes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 171:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 172:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 18
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 172:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTARTCNGTRA ANGCYTCNAC RCACAT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 173:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 173:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTTTAGCAG AACAGGATGA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE SEQ ID NO 174:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 174:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATAATTCC ATATCCTCCG
\hfill20
Claims (28)
1. Método que utiliza como mínimo un
oligonucleótido para determinar o detectar la presencia y/o la
cantidad de uno o más ácidos nucleicos bacterianos y/o fúngicos en
una muestra, donde los citados uno o más ácidos nucleicos o
variantes o partes de los mismos comprenden una región diana
seleccionada que puede hibridarse con dicho como mínimo un
oligonucleótido; comprendiendo dicho método:
- a)
- poner en contacto la citada muestra con dicho como mínimo un oligonucleótido, que se hibrida a:
- i)
- como mínimo 12 nucleótidos de cada una de las secuencias de nucleótidos bacterianas definidas en el grupo consistente en SEQ ID NO 118, 119 y 125-171 o una secuencia complementaria de las mismas;
- ii)
- como mínimo 12 nucleótidos de cada una de las secuencias de nucleótidos fúngicas definidas en el grupo consistente en SEQ ID NO 120-124 o una secuencia complementaria de las mismas;
- \quad
- para llevar a cabo una reacción de amplificación o un ensayo de hibridación; y
- b)
- detectar la presencia, la cantidad, o ambas, de oligonucleótidos hibridados o productos amplificados en a) como indicio de la presencia, la cantidad, o ambas, de dichos uno o más ácidos nucleicos.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho como mínimo un oligonucleótido
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el
grupo consistente en SEQ ID NO 23, 24, 107, 108, 109 y 172.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, que
además comprende la utilización de como mínimo un oligonucleótido
para determinar la presencia y/o la cantidad de uno o más ácidos
nucleicos de una especie y/o un género bacteriano(a) y/o
fúngico(a) seleccionado(a) de entre el grupo
consistente en Enterococcus faecium, Listeria monocytogenes,
Neisseria meningitidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus
agalactiae, Candida albicans, género Enterococcus,
género Neisseria, género Staphylococcus, género
Streptococcus y género Candida, caracterizado
porque dicho como mínimo un oligonucleótido para determinar la
presencia y/o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de especies
bacterianas y fúngicas se hibrida específicamente a como mínimo 12
nucleótidos de una y sólo una de las secuencias de nucleótidos
seleccionadas del grupo consistente en:
- \quad
- SEQ ID NO 26 o una secuencia complementaria de la misma, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Enterococcus faecium;
- \quad
- SEQ ID NO 27 o una secuencia complementaria de la misma, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Listeria monocytogenes;
- \quad
- SEQ ID NO 28 o una secuencia complementaria de la misma, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Neisseria meningitidis;
- \quad
- SEQ ID NO 29 o una secuencia complementaria de la misma, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Staphylococcus saprophyticus;
- \quad
- SEQ ID NO 30 o una secuencia complementaria de la misma, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Streptococcus agalactiae;
- \quad
- SEQ ID NO 120 o una secuencia complementaria de la misma, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Candida albicans;
- \quad
- o caracterizado porque dicho como mínimo un oligonucleótido para determinar la presencia y/o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de un género bacteriano y/o fúngico se hibrida específicamente a como mínimo 12 nucleótidos de una y sólo una del grupo específico de género de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo consistente en:
- \quad
- SEQ ID NO 131 a 134 o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos del género Enterococcus;
- \quad
- SEQ ID NO 31 o una secuencia complementaria de la misma, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos del género Neisseria;
- \quad
- SEQ ID NO 140 a 143 o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos del género Staphylococcus;
- \quad
- SEQ ID NO 32 a 36 o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos del género Streptococcus; y
- \quad
- SEQ ID NO 120 a 124 o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos del género Candida.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado porque la presencia y/o la cantidad de dichos
uno o más ácidos nucleicos de especies y/o géneros
bacterianos(as) y fúngicos(as) se determina utilizando
como mínimo un oligonucleótido que comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo consistente en:
- \quad
- SEQ ID NO 1 y 2, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Enterococcus faecium;
- \quad
- SEQ ID NO 3 y 4, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Listeria monocytogenes;
- \quad
- SEQ ID NO 5 y 6, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Neisseria meningitidis;
- \quad
- SEQ ID NO 7 y 8, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Staphylococcus saprophyticus;
- \quad
- SEQ ID NO 9 y 10, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Streptococcus agalactiae;
- \quad
- SEQ ID NO 11 y 12, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de Candida albicans;
- \quad
- SEQ ID NO 13 y 14, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de uno o más miembros del género Enterococcus;
- \quad
- SEQ ID NO 15 y 16, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de uno o más miembros del género Neisseria;
- \quad
- SEQ ID NO 17 a 20, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de uno o más miembros del género Staphylococcus; y
- \quad
- SEQ ID NO 21 y 22, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para determinar la presencia o la cantidad de uno o más ácidos nucleicos de uno o más miembros del género Streptococcus.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, que comprende además la
utilización de como mínimo un oligonucleótido para determinar la
presencia de un ácido nucleico de uno o más genes de resistencia a
los antibióticos bacterianos seleccionados del grupo consistente en
bla_{tem}, bla_{shv}, bla_{rob}, bla_{oxa}, blaZ, aadB,
aacC1, aacC2, aacC3, aac6'-IIa, aacA4,
aad(6'), vanA, vanB, vanC, msrA, satA,
aac(6')-aph(2''), vat, vga, ermA,
ermB, ermC, mecA, int y sul.
6. Método según la reivindicación 5,
caracterizado porque dichos uno o más genes de resistencia a
los antibióticos bacterianos se seleccionan del grupo consistente
en bla_{oxa}, blaZ, aac6'-IIa, vanB, vanC,
ermA, erm y ermC y porque dicho como mínimo un oligonucleótido
para determinar la presencia de un ácido nucleico de uno o más
genes de resistencia a los antibióticos bacterianos se hibrida a
como mínimo 12 nucleótidos de una o más de las secuencias de
nucleótidos seleccionadas del grupo consistente en:
- \quad
- SEQ ID NO 110 o una secuencia complementaria de la misma, para la detección de bla_{oxa};
- \quad
- SEQ ID NO 111 o una secuencia complementaria de la misma, para la detección de blaZ;
- \quad
- SEQ ID NO 112 o una secuencia complementaria de la misma, para la detección de aac6'-IIa;
- \quad
- SEQ ID NO 113 o una secuencia complementaria de la misma, para la detección de ermA;
- \quad
- SEQ ID NO 114 o una secuencia complementaria de la misma, para la detección de ermB;
- \quad
- SEQ ID NO 115 o una secuencia complementaria de la misma, para la detección de ermC;
- \quad
- SEQ ID NO 116 o una secuencia complementaria de la misma, para la detección de vanB; y
- \quad
- SEQ ID NO 117 o una secuencia complementaria de la misma, para la detección de vanC.
7. Método según la reivindicación 5,
caracterizado porque dicho como mínimo un oligonucleótido
para determinar la presencia de un ácido nucleico de uno o más
genes de resistencia a los antibióticos bacterianos comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en:
- \quad
- SEQ ID NO 37-40, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de bla_{tem};
- \quad
- SEQ ID NO 41-44, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de bla_{shv};
- \quad
- SEQ ID NO 45-48, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de bla_{rob};
- \quad
- SEQ ID NO 49-50, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de bla_{oxa};
- \quad
- SEQ ID NO 51-52, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de blaZ;
- \quad
- SEQ ID NO 53-54, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de aadB;
- \quad
- SEQ ID NO 55-56, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de aacC1;
- \quad
- SEQ ID NO 57-58, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de aacC2;
- \quad
- SEQ ID NO 59-60, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de aacC3;
- \quad
- SEQ ID NO 61-64, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de aac6'-IIa;
- \quad
- SEQ ID NO 65-66, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de aacC4;
- \quad
- SEQ ID NO 67-70, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de vanA;
- \quad
- SEQ ID NO 71-74, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de vanB;
- \quad
- SEQ ID NO 75-76, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de vanC;
- \quad
- SEQ ID NO 77-80, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de msrA;
- \quad
- SEQ ID NO 81-82, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de satA;
- \quad
- SEQ ID NO 83-86, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de aac(6')-aph(2'');
- \quad
- SEQ ID NO 87-88, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de vat;
- \quad
- SEQ ID NO 89-90, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de vga;
- \quad
- SEQ ID NO 91-92, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de ermA;
- \quad
- SEQ ID NO 93-94, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de ermB;
- \quad
- SEQ ID NO 95-96, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de ermC;
- \quad
- SEQ ID NO 97-98, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de mecA;
- \quad
- SEQ ID NO 99-102, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de int; y
- \quad
- SEQ ID NO 103-106, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de longitud o una secuencia complementaria de las mismas, para la detección de sul.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, caracterizado porque
dicha determinación se lleva a cabo simultáneamente.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, caracterizado porque se
lleva a cabo directamente a partir de una muestra de ensayo.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, caracterizado porque se
lleva a cabo directamente a partir de una muestra de ensayo
consistente en un cultivo bacteriano y/o fúngico o una suspensión
bacteriana y/o fúngica.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, caracterizado porque
dichos ácidos nucleicos se amplifican mediante un método
seleccionado del grupo consistente en:
- a)
- reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
- b)
- reacción en cadena de la ligasa (LCR),
- c)
- amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA),
- d)
- replicación de secuencia autosostenida (3SR),
- e)
- amplificación de desplazamiento de cadena (SDA),
- f)
- amplificación de señal de DNA ramificado (bDNA)
- g)
- amplificación mediada por transcripción (TMA),
- h)
- tecnología de sonda de ciclo (CPT),
- i)
- PCR anidada y
- j)
- PCR multiplex.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Método según la reivindicación 11,
caracterizado porque dichos ácidos nucleicos se amplifican
por PCR.
13. Método según la reivindicación 12,
caracterizado porque las condiciones de amplificación son
uniformes.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende además:
- a)
- i)
- depositar y fijar en un soporte inerte o dejar en solución el DNA bacteriano o fúngico de la muestra o de una población en esencia homogénea de bacterias u hongos aislados(as) de tal muestra, o
- ii)
- inocular dicha muestra o dicha población en esencia homogénea de bacterias u hongos aislados(as) de esta muestra en un soporte inerte,
- b)
- lisar in situ dicha muestra inoculada o dichas bacterias aisladas o dichos hongos aislados para liberar los ácidos nucleicos bacterianos o fúngicos, obteniéndose dichos ácidos nucleicos bacterianos o fúngicos, en esencia, en forma de cadena simple;
- c)
- poner en contacto dichos ácidos nucleicos de cadena simple con una sonda que comprende como mínimo 12 nucleótidos, que se hibridan selectivamente a:
- i)
- cada una de las secuencias de nucleótidos bacterianas definidas en el grupo consistente en SEQ ID NO 118, 119 y 125-171 o una secuencia complementaria de las mismas; o
- ii)
- cada una de las secuencias de nucleótidos fúngicas definidas en el grupo consistente en SEQ ID NO 120-124 o una secuencia complementaria de las mismas;
- \quad
- para formar un complejo de hibridación, y
- d)
- detectar la presencia de dicho complejo de hibridación en dicho soporte inerte o en dicha solución como indicio de la presencia, la cantidad, o ambas, de ácidos nucleicos bacterianos o fúngicos en la citada muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende además:
- a)
- tratar dicha muestra con una solución acuosa que contiene como mínimo un par de cebadores de oligonucleótido, siendo uno de dichos cebadores capaz de hibridarse selectivamente con una de las dos cadenas complementarias de cualquier DNA bacteriano o fúngico que contenga una secuencia diana, y siendo el otro de dichos cebadores capaz de hibridarse con la otra de dichas cadenas, para formar un producto de extensión que contiene la secuencia diana como molde, hibridándose dicho como mínimo un par de cebadores a como mínimo 12 nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos;
- b)
- sintetizar un producto de extensión de cada uno de dichos cebadores, conteniendo dicho producto de extensión la secuencia diana, y amplificar dicha secuencia diana, si existe, hasta un nivel detectable; y
- c)
- detectar la presencia y/o la cantidad de dicha secuencia diana amplificada como indicio de la presencia y/o la cantidad de cualquier bacteria u hongo en dicha muestra para ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Método según la reivindicación 15,
caracterizado porque dicho par de cebadores comprende un par
de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo consistente en
SEQ ID NO 23 y 24; 107 y 108; y 109 y 172.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Oligonucleótido aislado que consta de como
mínimo 12 nucleótidos de longitud y tiene la secuencia de
nucleótidos de una cualquiera de las secuencias SEQ ID NO 23, 24,
107, 108, 109 ó 172, una parte de las mismas, o una secuencia
complementaria de las mismas, que se hibrida a:
- i)
- como mínimo 12 nucleótidos de cada una de las secuencias de nucleótidos bacterianas definidas en el grupo consistente en SEQ ID NO 118, 119 y 125-171 o una secuencia complementaria de las mismas; o
- ii)
- como mínimo 12 nucleótidos de cada una de las secuencias de nucleótidos fúngicas definidas en el grupo consistente en SEQ ID NO 120-124 o una secuencia complementaria de las mismas.
18. Plásmido recombinante que comprende un ácido
nucleico como se define en la reivindicación 17.
19. Huésped recombinante que ha sido
transformado mediante un plásmido recombinante según la
reivindicación 18.
20. Huésped recombinante según la reivindicación
19, siendo dicho huésped Escherichia coli.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Kit de diagnóstico para la detección y/o la
cuantificación universales de ácidos nucleicos de una bacteria y/u
hongo, que comprende cualquier combinación adecuada de sondas y/o
cebadores consistentes en como mínimo 12 nucleótidos de las
secuencias SEQ Id NO 23, 24, 107, 108, 109 y 172, o secuencias
complementarias de las mismas, que se hibridan a:
- i)
- como mínimo 12 nucleótidos de cada una de las secuencias de nucleótidos bacterianas definidas en el grupo consistente en SEQ ID NO 118, 119 y 125-171 o una secuencia complementaria de las mismas; o
- ii)
- como mínimo 12 nucleótidos de cada una de las secuencias de nucleótidos fúngicas definidas en el grupo consistente en SEQ Id NO 120-124 o una secuencia complementaria de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Kit de diagnóstico según la reivindicación
21, caracterizado porque comprende además cualquier
combinación adecuada de sondas y/o cebadores que hibridan a como
mínimo 12 nucleótidos de una o más de las secuencias de nucleótidos
seleccionadas del grupo consistente en SEQ ID NO
110-117, secuencias complementarias de las mismas y
variantes de las mismas, para la detección y/o cuantificación de
ácidos nucleicos de cualquier combinación de genes de resistencia
bacterianos seleccionados de entre el grupo consistente en
bla_{oxa}, blaZ, aac6'-IIa, ermA, ermB, ermC,
vanC.
23. Kit de diagnóstico según la reivindicación
21 ó 22, caracterizado porque comprende además cualquier
combinación adecuada de cebadores que comprendan una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NO 1 a 22,
partes de las mismas con como mínimo 12 nucleótidos de longitud,
secuencias complementarias de las mismas y variantes de las mismas,
para la detección y/o cuantificación de ácidos nucleicos de
cualquier especie y/o género bacteriano(a) y
fúngico(a) seleccionado(a) del grupo consistente en
Enterococcus faecium, Listeria monocytogenes, Neisseria
meningitidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus
agalactiae, Candida albicans, especies de Enterococcus,
especies de Neisseria, especies de Staphylococcus y
especies de Streptococcus.
24. Kit de diagnóstico para la detección y/o la
cuantificación universales de ácidos nucleicos de una bacteria y/u
hongo, que comprende cualquier combinación adecuada de cebadores que
constan de como mínimo 12 nucleótidos de longitud seleccionados por
alineación de nucleótidos conservados de como mínimo dos secuencias
seleccionadas del grupo consistente en SEQ ID NO 118 a 171,
secuencias complementarias de las mismas y variantes de las mismas,
y que comprende además un par de cebadores que constan de como
mínimo 12 de longitud y comprenden una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NO 23, 24, 107, 108,
109 y 172, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos de
longitud o secuencias complementarias de las mismas, para la
detección y/o la cuantificación simultáneas de ácidos nucleicos de
cualquier bacteria u hongo.
25. Kit de diagnóstico según la reivindicación
23, caracterizado porque comprende además cualquier
combinación adecuada de cebadores que comprendan una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NO 37 a
106, 173 y 174, partes de las mismas de como mínimo 12 nucleótidos
de longitud, secuencias complementarias de las mismas y variantes
de las mismas, para la detección y/o la cuantificación simultáneas
de ácidos nucleicos de cualquier gen de resistencia a los
antibióticos bacteriano seleccionado del grupo consistente en
bla_{tem}, bla_{rob}, bla_{shv}, bla_{oxa}, blaZ, aadB,
aacC1, aacC2, aacC3, aacA4, aac6'-IIa,
aad(6'), ermA, ermB, ermC, mecA, vanA, vanB, vanC, satA,
aac(6')-aph(2''), vat, vga, msrA,
sul e int.
26. Oligonucleótido aislado según cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 20, constando dicho oligonucleótido de 12
a 29 nucleótidos de longitud.
27. Kit de diagnóstico según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25, caracterizado porque dichas sondas
y/o dichos cebadores tienen 12 a 29 nucleótidos de longitud.
28. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, 15 y 16, en el que se utiliza
amplificación multiplex.
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