ES2329227T3 - Alelos de gen de la glucoquinasa de la bacteria corineforme. - Google Patents
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Abstract
Secuencias de nucleótidos de ADN replicables procedentes de la bacteria coryneforme y que codifican para la glucoquinasa (de SEQ ID No. 2) donde la L-alanina en la posición 213 es sustituida por L-valina.
Description
Alelos del gen de la glucoquinasa de la bacteria
corineforme
La invención proporciona alelos del gen de la
glk de la bacteria corineforme que codifican para las variantes de
la glucoquinasa, y procesos para para la producción de la
L-lisina por fermentación usando bacterias que
contienen tales alelos.
El aminoácido L-lisina es usado
en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la
industria de productos alimenticios y, muy especialmente, en la
alimentación de los animales.
Se conoce que los aminoácidos son producidos por
fermentación de cepas de bacteria corineforme, especialmente
Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia, se
realizan constantemente intentos para mejorar los procesos de
producción. Las mejoras a los procesos pueden referirse a las
medidas relacionadas a la fermentación, tales como, por ejemplo, la
agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios de
nutrición, tal como, por ejemplo, la concentración de azúcar
durante la fermentación, o la preparación de la forma de producto
por, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, o las
propiedades de rendimiento intrínsecas del propio microorga-
nismo.
nismo.
Para mejorar las propiedades de rendimiento de
tales microorganismos son empleados métodos de mutagénesis,
selección y selección de mutantes. Tales métodos producen cepas que
son resistentes a los antimetabolitos o son auxotróficas para
metabolitos que son importantes en términos de regulación, y que
producen aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el análogo de
lisina
S-(2-aminoetil)-L-cisteína
(AEC).
Durante varios años, los métodos de la
tecnología de ADN recombinante han sido también usados para mejorar
las cepas que producen L-aminoácidos de cepa de
Corynebacterium, amplificando los genes de biosíntesis de
aminoácidos individuales e investigando el efecto en la producción
de aminoácidos.
La secuencia de nucleótidos de los genes que
codifican para la glucoquinasa de Corynebacterium glutamicum
puede encontrarse en la solicitud de patente WO 01/00844 bajo el
Código de Identificación RXA02149 como Secuencia No. 23.
La secuencia de nucleótidos de los genes que
codifican para la glucoquinasa de Corynebacterium glutamicum
también puede encontrarse en la solicitud de patente
EP-A-1108790 como Secuencia No. 3484
y como Secuencia No. 7066.
La secuencia de nucleótidos ha sido también
depositada en el banco de datos del Centro Nacional para la
Información de Biotecnología (NCBI) de la Biblioteca Nacional de
Medicina (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo el número de Acceso AX064897 y
bajo el Número de Acceso AX123568.
La acción favorable de la sobreexpresión del gen
de la glk en la producción de lisina se muestra en
EP-A-1106694.
Los inventores se propusieron el objeto de
proporcionar nuevas medidas para la producción mejorada de
L-lisina por fermentación.
Cuando la L-lisina o lisina es
mencionada de aquí en adelante, se entiende que significa no
solamente las bases sino también las sales, tales como, por
ejemplo, monohidrocloruro de lisina o sulfato de lisina.
La invención proporciona secuencias de
nucleótidos replicables (ADN) procedentes de la bacteria
coryneforme, especialmente Corynebacterim glutamicum, y que
codifican para la enzima glucoquinasa, donde las secuencias de
aminoácidos asociadas en la SEQ ID No.2 contiene en la posición 213
L-valina.
La invención también proporciona una secuencia
de nucleótidos replicable (ADN) procedente de la bacteria
coryneforme, especialmente Corynebacterium glutamicum, y que
codifica para la enzima glucoquinasa, donde la secuencia de
aminoácidos asociada contiene L-valina en la
posición 213, se muestra en la SEQ ID No. 4.
La invención también proporciona una secuencia
de nucleótidos replicable (ADN) procedente de la bacteria
coryneforme, especialmente Corynebacterium glutamicum, y que
codifica para la enzima glucoquinasa, la secuencia base de la misma
contiene timina en la posición 638, se muestra en la SEQ ID No.
3.
La invención también proporciona plásmidos
(vectores) que contienen las secuencias de nucleótidos de acuerdo
con la invención y opcionalmente se replican en la bacteria
coryneforme.
La invención también proporciona la bacteria
coryneforme que contiene las secuencias de nucleótidos de acuerdo
con la invención y en la cual las secuencias de nucleótidos que
codifican para la glucoquinasa están opcionalmente en forma
sobreexpresada, donde las secuencias de aminoácidos asociadas
contienen L-valina en la posición 213 de la SEQ ID
No. 2.
La sobreexpresión se entiende que significa un
incremento en la concentración intracelular o la actividad de las
glucoquinasas de acuerdo con la invención.
Por las mediciones de la sobreexpresión, la
actividad o concentración de la proteína correspondiente es
generalmente incrementada en al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%,
150%, 200%, 300%, 400% ó 500%, hasta el máximo de 1000% ó 2000%,
basado en la actividad o concentración de la proteína en el
microorganismo de partida.
Para lograr la sobreexpresión, el número de
copias de los genes correspondientes puede ser incrementado, o
puede ser mutado el promotor y la región de regulación o el sitio de
unión del ribosoma, el cual es localizado aguas arriba del gen
estructural. Los cassetes de expresión insertados aguas arriba de
los genes estructurales tienen el mismo efecto. Por medio de los
promotores inducibles es posible además incrementar la expresión en
el curso de la producción de L-lisina por
fermentación. La expresión es también mejorada por las mediciones
para prolongar la vida del ARN-m. Además, la
actividad enzimática es también incrementada por la prevención de
la degradación de la proteína enzimática. Los genes o las
construcciones genéticas pueden también estar presentes en los
plásmidos con un número de copias diferentes o estar integrados y
amplificados en el cromosoma. Alternativamente, la sobreexpresión
de los genes en cuestión puede también ser logrado cambiando la
composición del medio y la manera en que el cultivo se lleva a
cabo.
Para incrementar el número de copias de los
alelos de la glk de acuerdo con la invención, los plásmidos que son
replicados en la bacteria coryneforme son adecuados. Muchos vectores
plasmídicos conocidos, tales como, por ejemplo, pZ1 (Menkel y
otros, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:
549-554), pEKEx1 (Eikmanns y otros, Gene
102:93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen
y otros, Gene 107:69-74 (1991)) están basados
en los plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores
plasmídicos, tales como, por ejemplo, aquellos que están basados en
pCG4 (US-A 4,489,160) o pNG2
(Serworld-Davis y otros, FEMS Microbiology
Letters 66,119-124 (1990)) o pAG1
(US-A 5,158,891), pueden ser usados de la misma
manera.
Para incrementar el número de copias es también
posible usar el método de la amplificación de genes cromosomal,
como ha sido descrito, por ejemplo, por Reinscheid y otros,
(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132
(1994)) para la duplicación o amplificación del operón
hom-thrB. En ese método, el gen completo o alelo es
clonado dentro de un vector plasmídico que es capaz de replicarse en
el hospedero (típicamente E. coli), pero no en C.
glutamicum. Los vectores adecuados son, por ejemplo, pSUP301
(Simon y otros, Bio/Technology 1, 784-791
(1983)), pK18mob o pk19mob (Schäfer y otros, Gene 145,
69-73 (1994)), pGEM-T (Promega
Corporation, Madison, WI, EE.UU.), pCR2.1-TOPO
(Shuman, Journal of Biological Chemistry
269:32678-84 (1994); US-A
5,487,993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard y
otros, Journal of Molecular Biology, 234:
534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf y otros,
Journal of Bacteriology 173:4510-4516 (1991)) o
pBGS8 (Spratt y otros, Gene 41: 337-342
(1986)). El vector plasmídico que contiene el gen o alelo que se
amplifica, es a continuación transferido a la cepa deseada de C.
glutamicum por conjugación o transformación. El método de
conjugación es descrito, por ejemplo en Schäfer y otros,
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759
(1994)). Los métodos de transformación son descritos, por ejemplo,
en Thierbach y otros, (Applied Microbiology and
Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch y
otros, (FEMS Microbiological Letters 123,343-347
(1994)). Después de la recombinación homóloga por medio de un
evento de "entrecruzamiento", la cepa resultante contiene al
menos dos copias del gen o alelo en cuestión.
La invención proporciona secuencias de
nucleótidos (ADN) replicables, especialmente endógenas, procedentes
de la bacteria coryneforme y que codifican para la enzima
glucoquinasa, donde en la secuencia de aminoácidos asociada la
L-alanina en la posición 213 de la SEQ ID No. 2 se
sustituye por L-valina, mostrada en la SEQ ID No.
4. La invención también proporciona secuencias de nucleótidos (ADN)
replicables preferiblemente endógenas, procedentes de la bacteria
coryneforme y que codifican para la enzima glucoquinasa, la
secuencia de base asociada que contiene timina en la posición 638,
mostrada en la SEQ ID No.3.
"Genes endógenos" o "secuencias de
nucleótidos endógenos" son entendidos como los genes o
secuencias de nucleótidos presentes en la población de una
especie.
La invención se relaciona también con los
vectores (plásmidos) que contienen las mencionadas secuencias de
nucleótidos y opcionalmente se replican en la bacteria
coryneforme.
También están reivindicadas las bacterias
coryneformes en las cuales las mencionadas secuencias de nucleótidos
que codifican para la enzima glucoquinasa, están preferiblemente en
la forma sobreexpresada.
La invención proporciona un proceso para la
producción de L-lisina o de nutrientes que contienen
L-lisina, en el cual los siguientes pasos son
generalmente llevados a cabo:
- a)
- fermentación de la bacteria coryneforme que contiene secuencias de nucleótidos endógenas que codifican para la enzima glucoquinasa, donde en las secuencias de aminoácidos asociadas la L-alanina en la posición 213 ha sido sustituida por L-valina.
- \quad
- Los alelos del gen endógeno de glucoquinasa son sobreexpresados en condiciones adecuadas para la formación de la enzima glucoquinasa.
- b)
- concentración de la L-lisina en el licor de fermentación,
- c)
- aislamiento de la L-lisina o del nutriente que contiene L-lisina del licor de la fermentación, opcionalmente
- d)
- con los constituyentes del licor de la fermentación y/o la biomasa (> 0 a 100%).
La forma salvaje del gen de la glk está
contenida en las cepas tipo salvaje de la bacteria coryneforme,
especialmente del género Corynebacterium. Esto se muestra en la SEQ
ID No. 1. La proteína de tipo salvaje se muestra en la SEQ ID No.
2.
Del género Corynebacterium, mención especial
debe ser hecha a la especie Corynebacterium glutamicum, que
es conocida en el campo del especialista. Las cepas de tipo salvaje
conocidas de la especie Corynebacterium glutamicum son, por
ejemplo,
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Las cepas que tienen la designación "ATCC"
pueden ser obtenidas de la American Type Culture Collection
(Manassas, VA, EE.UU.). Las cepas que tienen la designación
"FERM" pueden ser obtenidas del Instituto Nacional de
Tecnología y Ciencia Industrial Avanzada (AIST Tsukuba Central 6,
1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki,
Japón). La mencionada cepa de Corynebacterium
thermoaminogenes (FERM BP-1539) se describe en
US-A-5,250, 434.
Para la producción de los alelos de la glk de
acuerdo con la invención que codifica para las variantes de
glucoquinasa, caracterizada por una sustitución de
L-alanina por L-valina en la
posición 213 de la SEQ ID No. 2, son usados los métodos de
mutagénesis descritos en el arte anterior.
Es posible usar para la mutagénesis convencional
procesos in vivo de mutagénesis usando sustancias
mutagénicas, tal como, por ejemplo,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
o la luz ultravioleta.
También es posible usar para la mutagénesis
métodos in vitro, tal como, por ejemplo, el tratamiento con
hidroxilamina (Miller, J. H.: A short Course in Bacterial Genetics.
A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and
Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, 1992) u oligonucleótidos mutagénicos (T. A. Brown:
Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, 1993) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
como se describe en el manual de Newton y Graham (PCR, Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994).
Instrucciones adicionales para la producción de
mutaciones se pueden encontrar en el arte anterior y en los libros
de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, por
ejemplo, el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik",
6^{ta} edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995),
el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Cuando los métodos in vitro son usados,
el gen de la glk descrito en el arte anterior es amplificado por
medio de la reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADN
total aislado de una cepa tipo salvaje y es opcionalmente clonado
en vectores plasmídicos adecuados, y el ADN es posteriormente
sometido al proceso de mutagénesis. El experto en la materia
encontrará las instrucciones para la amplificación de secuencias de
ADN por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
entre otro en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis:
A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en
Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Alemania, 1994). Los alelos de la glk adecuados son seleccionados
posteriormente y estudiados usando los procesos anteriormente
descritos.
La invención proporciona un nuevo alelo de la
glk que codifica para una variante de la glucoquinasa, dicho alelo
es mostrado en la SEQ ID No. 3.
Los alelos de la glk de acuerdo con la invención
pueden ser transferidos en cepas adecuadas por el método de
sustitución de genes, como es descrito en Schwarzer y Pühler
(Bio/Technology 9,84-87 (1991)) o
Peters-Wendisch y otros, (Microbiology
144,915-927 (1998)). En ese método, el alelo de la
glk apropiado es clonado en un vector que no es replicativo para
C. glutamicum, tal como, por ejemplo, pKl8mobsacB o
pKl9mobsacB (Jäger y otros, Journal of Bacteriology 174:
5462-65 (1992)) o pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen,
Holanda; Bernard y otros, Journal of Molecular Biology, 234:
534-541 (1993)) y el vector es a continuación
transferido en el huésped deseado de C. glutamicum por
transformación o conjugación. La incorporación de la mutación se
logra después de la recombinación homóloga por medio de un primer
evento de "entrecruzamiento" que efectúa la integración y un
segundo evento adecuado de "entrecruzamiento" que efectúa un
corte en el gen objetivo o la secuencia objetivo.
Puede ser adicionalmente ventajoso para la
producción de L-aminoácidos, además el uso de alelos
de la glk de acuerdo con la invención, al mismo tiempo para
incrementar, especialmente sobreexpresar, una o más enzimas de la
ruta de biosíntesis en cuestión, de la glicólisis, de la ruta
anaplerótica, del ciclo del ácido cítrico, del ciclo de la pentosa
fosfato, de la exportación de aminoácidos y, opcionalmente, las
proteínas reguladoras. El uso de los genes endógenos es
generalmente preferido.
"Genes endógenos" o "secuencias de
nucleótidos endógenos" son entendidos como los genes o secuencias
de nucleótidos y alelos presentes en la población de una
especie.
El término "incremento" en este contexto
describe el aumento de la actividad intracelular de una o más
enzimas (proteínas) en un microorganismo que son codificadas por el
ADN correspondiente, por ejemplo, aumentando el número de copias
del gen o los genes, usando un promotor fuerte o usando un gen o
alelo que codifica para una enzima (proteína) correspondiente que
tiene un alto nivel de actividad, y, opcionalmente, combinando esas
mediciones.
Mediante las mediciones del incremento,
especialmente la sobreexpresión, la actividad o concentración de la
proteína correspondiente es generalmente aumentada en al menos 10%,
25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ó 500%, hasta el
máximo de 1000% ó 2000%, basado en aquella de la proteína del tipo
salvaje o en la actividad o concentración de la proteína en el
microorganismo de partida.
Por consiguiente, para la producción de
L-lisina, además de utilizar la variante del gen de
la glk, también es posible al mismo tiempo incrementar,
especialmente sobreexpresar, uno o más genes seleccionados del
grupo
- \bullet
- el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335),
- \bullet
- el gen gag que codifica para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- \bullet
- el gen eno que codifica para la enolasa (EP-A-1090998),
- \bullet
- el gen tpi que codifica para la triosa fosfato isomerasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- \bullet
- el gen pgk que codifica para la 3-fosfoglicerato quinasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- \bullet
- el gen zwf que codifica para la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (JP-A-09224661, EP-A-1108790, WO 01/70995, WO 01/98472, WO 01/04322),
- \bullet
- el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa (DE-A-198 31 609, EP-A-1108790),
- \bullet
- el gen mqo que codifica para la malato quinona oxidorreductasa (Molenaar y otros, European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998), EP-A-1038969),
- \bullet
- el gen lysC que codifica para una aspartato kinasa resistente a retroalimentación (No. de Acceso P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- \bullet
- el gen lysE que codifica para la proteína de exportación de lisina (DE-A-195 48 222, Vrljic y otros, Molecular Microbiology 22 (5), 815-826 (1996)),
\global\parskip0.930000\baselineskip
- \bullet
- el gen zwal que codifica para la proteína Zwal (EP-A-1111062),
- \bullet
- el gen gnd que codifica para la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (WO 01/71012),
- \bullet
- el gen opcA que codifica para una subunidad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Secuencia No. 79 de WO 01/00844; WO 01/04322).
El incremento de la
6-fosfogluconato deshidrogenasa también puede ser
logrado, entre otras cosas, por las sustituciones de
aminoácidos, tales como, por ejemplo, por la sustitución de la
L-prolina por L-serina,
L-leucina, L-isoleucina o
L-treonina en la posición 158 de la proteína
enzimática, y/o por la sustitución de la L-serina
por L-fenilalanina o L-tirosina en
la posición 361 de la proteína enzimática.
El incremento de la sub-unidad
de la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, para los que el gen opcA codifica, puede también
ser logrado, entre otras cosas, por las sustituciones de
aminoácidos, tales como, por ejemplo, por la sustitución de la
L-serina por L-fenilalanina o
L-tirosina en la posición 312 de la proteína
enzimática.
Esto puede también ser ventajoso para la
producción de L-lisina, además del uso de los alelos
del gen glk de acuerdo con la invención, al mismo tiempo para
atenuar, especialmente disminuir la expresión de, uno o más genes
endógenos seleccionados de entre el grupo
- \bullet
- el gen pck que codifica para la fosfoenol piruvato carboxiquinasa (EP-A-1094111),
- \bullet
- el gen pgi el gen que codifica para la glucosa-6-fosfato isomerasa (EP-A-1087015, WO 01/07626, EP-A-1108790),
- \bullet
- el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa (EP-A-1096013),
- \bullet
- el gen zwa2 que codifica para la proteína Zwa2 (EP-A-1106693),
- \bullet
- el gen fda que codifica para la fructosa-1,6-bifosfato aldolasa (No.de Acceso X17313; von der Osten y otros, Molecular Microbiology 3 (11), 1625-1637 (1989)),
- \bullet
- el gen hom que codifica para la homoserina deshidrogenasa (EP-A-0131171),
- \bullet
- el gen thrB que codifica para la homoserina quinasa (Peoples, O. W., y otros, Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72) y
- \bullet
- el gen pfkB que codifica para la fosfofructoquinasa (Secuencia No. 57 de WO 01/00844).
El término "atenuación" en este contexto
describe la disminución o exclusión de la actividad intracelular de
una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que son
codificados por el ADN correspondiente, por ejemplo, usando un
promotor débil o usando un gen o alelo que codifica para una enzima
correspondiente que tiene un bajo nivel de actividad, o por
inactivación de los genes o enzima (proteína) correspondientes, y,
opcionalmente, combinando esas mediciones.
Mediante las mediciones de la atenuación, la
actividad o concentración de la proteína correspondiente es
generalmente reducida de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ó 0 a
5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje,
o de la actividad o concentración de la proteína en el
microorganismo de partida.
La atenuación de la fosfofructoquinasa puede
también ser lograda, entre otros, por las sustituciones de
aminoácidos, tales como, por ejemplo, por la sustitución de la
L-leucina por L-alanina,
L-glicina o L-prolina en la
posición 109 de la proteína enzimática.
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención también forman parte de la invención y pueden ser
cultivados de manera continua o discontinua por el proceso en lotes
o por lote alimentado o el proceso por lotes alimentados repetido
para los propósitos de la producción de
L-aminoácidos. Un resumen de los métodos de cultivo
conocidos es descrito en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de
Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a ser utilizado deberá
cumplir de una manera adecuada los requisitos de las cepas en
cuestión. Las descripciones de los medios de cultivo para varios
microorganismos serán encontradas en el libro de texto "Manual of
Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de
Bacteriología (Washington DC, EE.UU., 1981).
Pueden ser utilizados como fuente de carbono
azúcares y carbohidratos, tales como, por ejemplo, glucosa,
sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa,
aceites y grasas, tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite
de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos,
tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido
linoleico, alcoholes, tales como, por ejemplo, glicerol y etanol, y
ácidos orgánicos, tal como, por ejemplo, ácido acético. Esas
sustancias pueden ser usadas individualmente o en forma de una
mezcla.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Pueden ser usados como fuente de nitrógeno los
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas,
extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de
maceración de maíz, harina de soya y urea o compuestos inorgánicos,
tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio,
carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno
pueden ser utilizadas individualmente o en forma de una mezcla.
Pueden ser utilizados como fuente de fósforo el
ácido fosfórico, dihidrógeno fosfato de potasio o hidrógeno
fosfato de dipotasio o las sales correspondientes que contienen
sodio. El medio de cultivo también debe contener sales de metales,
tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro,
que son necesarias para el crecimiento. Por último, las sustancias
esenciales de crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas,
pueden ser usadas además de las sustancias mencionadas
anteriormente. Los recursores adecuados pueden también ser añadidos
al medio de cultivo. Las mencionadas sustancias pueden ser añadidas
al medio de cultivo en forma de un solo lote, o pueden ser
alimentadas adecuadamente durante el cultivo.
Para controlar el pH del cultivo, compuestos
básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio,
amoníaco o agua de amoníaco, o compuestos ácidos, tales como ácido
fosfórico o ácido sulfúrico, son usados oportunamente. Para
controlar el desarrollo de espuma, anti-espumantes,
tales como, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de poliglicol,
pueden ser usados. Para mantener la estabilidad de los plásmidos,
sustancias adecuadas que tienen una acción selectiva, tales como,
por ejemplo, los antibióticos, pueden ser añadidos al medio. Para
mantener las condiciones aerobias, oxígeno o mezclas de gases que
contienen oxígeno, tal como, por ejemplo, aire, son introducidos en
el cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente de 20ºC a 45ºC
y preferentemente de 25ºC a 40ºC. El cultivo es continuado hasta
que la cantidad máxima del producto deseado se ha formado. Este
objetivo es normalmente alcanzado en un período de 10 horas a 160
horas.
Los métodos de determinación de
L-aminoácidos son conocidos del arte anterior. El
análisis puede ser llevado a cabo, por ejemplo, como se describe en
Spackman y otros, (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
por cromatografía de intercambio aniónico con posterior derivación
de ninhidrina, o puede ser llevado a cabo por HPLC en fase reversa,
como se describe en Lindroth y otros, (Analytical Chemistry
(1979) 51: 1167-1174).
El proceso de acuerdo con la invención es usado
para la producción de L-lisina por fermentación.
La concentración de L-lisina,
puede opcionalmente ser ajustada al valor deseado por la adición de
L-lisina.
La presente invención es explicada con mayor
detalle a continuación por medio de ejemplos de realización.
La cepa DM1454 de Corynebacterium
glutamicum fue preparada a partir de C. glutamicum
ATCC13032 por mutagénesis no dirigida repetida, selección y
selección de mutantes. La cepa es resistente al análogo de la lisina
S-(2-aminoetil)-L-cisteína.
El ADN cromosomal es aislado a partir de la cepa
DM1454 por los métodos convencionales (Eikmanns y otros,
Microbiology 140: 1817-1828 (1994)). Por medio de la
reacción en cadena de la polimerasa, una sección de ADN que lleva
el gen o alelo de la glk es amplificado. Sobre la base de la
secuencia del gen glk conocido para C. glutamicum (Secuencia
Nº 3484 y Secuencia Nº 7066 de
EP-A-1108790), los siguientes
oligonucleótidos cebadores son seleccionados para la PCR:
glk_XL-A1 (SEQ ID Nº 6):
5' ga tct aga-gct tct cga cga tcc gat cc
3'
\vskip1.000000\baselineskip
glk_XL-A2 (SEQ ID Nº 7):
5' ga tct aga-cat tat ctg cgg tgc ggt cc
3'
Los cebadores conocidos son sintetizados por MWG
Biotech (Ebersberg, Alemania), y la reacción PCR es llevada a cabo
de acuerdo con el método estándar de PCR de Innis y otros,
(PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic
Press). Los cebadores permiten la amplificación de una sección de
ADN que tiene una longitud de aproximadamente 1.65 kb y que lleva
el gen o alelo de la glk. Además, los cebadores contienen la
secuencia para un sitio de corte de la endonucleasa de restricción
XbaI, que está marcado en la secuencia de nucleótidos que se
muestra arriba subrayada.
El fragmento de ADN amplificado que tiene una
longitud de aproximadamente de 1.65 kb, que lleva el alelo de la
glk de la cepa DM1454, es identificado por electroforesis en un gel
de agarosa 0.8%, aislado a partir del gel y purificado por métodos
convencionales (QIAquick Extracción Gel Kit, Qiagen, Hilden).
La secuencia de nucleótidos del fragmento
amplificado de ADN, o producto de la PCR, es determinada por
secuenciación por MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). La secuencia
del producto de la PCR se muestra en la SEQ ID Nº 5. La secuencia
de la región que codifica, además se muestra en la SEQ ID No. 3. La
secuencia de aminoácidos de la proteína glucoquinasa asociada,
determinada por medio del programa Patentin, se muestra en la SEQ ID
No. 4.
En la posición 638 de la secuencia de
nucleótidos de la región que codifica el alelo de la glk de la cepa
DM1454 está la timina base (SEQ ID No. 3). En la posición
correspondiente del gen de tipo salvaje está la citosina base (SEQ
ID No. 1).
En la posición 213 de la secuencia de
aminoácidos de la proteína glucoquinasa de la cepa DM1454 está el
aminoácido valina (SEQ ID No. 4). En la posición correspondiente de
la proteína de tipo salvaje está el aminoácido alanina (SEQ ID No.
2).
El alelo de la glk, que contiene la timina base
en la posición 638 de la región que codifica y, en consecuencia,
los códigos para una proteína glucoquinasa que contiene el
aminoácido valina en la posición 213 de la secuencia de
aminoácidos, es referido de aquí en adelante como alelo de la
glk_A213V. En la designación "glk_A213V", A represen-
ta alanina, V representa L-valina y 213 indica la posición de la sustitución de aminoácidos (ver SEQ ID No. 2 y 4).
ta alanina, V representa L-valina y 213 indica la posición de la sustitución de aminoácidos (ver SEQ ID No. 2 y 4).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de ADN de aproximadamente 1.65 kb
en longitud que es descrito en el Ejemplo 1 y fue preparado por
medio de la PCR y que lleva el alelo glk_A213V es insertado en el
cromosoma de la cepa DSM5715 de C. glutamicum por medio de
mutagénesis de sustitución con la ayuda del sistema sacB descrito en
Schäfer y otros, (Gene, 14, 69-73 (1994)).
Este sistema permite la preparación o selección de sustituciones de
alelos que tienen lugar por recombinación homóloga. La cepa
DSM5715 es un mutante de Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 que requiere leucina, resistente a aminoetilcisteína y que
produce L-lisina. La cepa se describe en
EP-A-0435 132.
Con este fin, el fragmento glk_A213V de
aproximadamente 1.65 kb de tamaño es cortado con la endonucleasa de
restricción XbaI, identificado por electroforesis en un gel de
agarosa 0.8% y, a continuación, aislado del gel y purificado por
métodos convencionales (QIAquick Extracción Gel Kit, Qiagen,
Hilden).
El vector de clonación movilizable pKl8mobsacB
es digerido con la enzima de restricción XbaI y los extremos son
defosforilados con fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina,
Boehringer Mannheim, Alemania). El vector preparado entonces se
mezcla con el fragmento glk_A213V de aproximadamente 1.6 kb y el
lote es tratado con T4-ADN ligasa
(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania).
La cepa de E. coli S17-1
(Simon y otros, Bio/Technology 1:
784-791,1993) es a continuación transformada con el
lote de ligazón (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach.
Vol. 1. ILR-Press, Cold Spring Harbor, Nueva York,
1989). La selección de las células que llevan el plásmido es
llevada a cabo por plaqueo del lote de transformación en agar LB
(Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2^{da} ed. Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) suplementado con
25 mg/1 de kanamicina.
El ADN del plásmido es aislado a partir de un
transformante por medio del Kit QIAprep Spin Miniprep de Qiagen y
es chequeado por corte de restricción con la enzima BamHI y
posterior electroforesis en gel de agarosa. El plásmido es nombrado
pK18mobsacB_glk_A213V y se muestra en la Figura 1.
El vector pK18mobsacB_glk_A213V mencionado en el
Ejemplo 2.1 es transferido en la cepa DSM5715 de C.
glutamicum por conjugación de acuerdo con un protocolo de
Schäfer y otros, (Journal of Microbiology 172:
1663-1666 (1990)). El vector no puede replicarse
independientemente en DSM5715 y es solamente retenido en la célula
si ha sido integrado en el cromosoma como resultado de un evento de
recombinación. La selección de transconjugados, es decir, de clones
que tienen integrados pK18mobsacB_glk_A213V, es llevada a cabo
plaqueando el lote de conjugación en agar LB (Sambrook y
otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^{da} Ed. Cold
Spring Harbor, Nueva York, 1989) suplementado con 15 mg/1 de
kanamicina y 50 mg/1 de ácido nalidíxico. Los transconjugados
resistentes a la kanamicina son extendidos en placas de agar LB con
25 mg/1 de kanamicina e incubados durante 24 horas a 33ºC. Para la
selección de mutantes en los que el corte del plásmido ha tenido
lugar como resultado de un segundo evento de recombinación, los
clones son cultivados de modo no selectivo, en medio líquido LB
durante 30 horas, a continuación se extienden en LB agar con 10%
sacarosa e incubados durante 16 horas.
El plásmido pK18mobsacB_glk_A213V, al igual que
el plásmido de partida pK18mobsacB, contiene, además del gen de
resistencia a la kanamicina, una copia del gen sacB que codifica
para levan sacarosa de Bacillus subtilis. La expresión
inducible a sacarosa conduce a la formación de levan sacarosa, que
cataliza la síntesis del producto levan, que es tóxico para C.
glutamicum. Por lo tanto, solamente aquellos clones en los que
el pKl8mobsacB_glk_A213V integrado se ha cortado como resultado de
un segundo evento de recombinación crece en agar LB con sacarosa.
En dependencia de la posición de la ocurrencia de la segunda
recombinación en relación con el sitio de la mutación, la
sustitución del alelo o la incorporación de la mutación tienen lugar
en el corte, o la copia original permanece en el cromosoma del
hospedero.
Aproximadamente de 40 a 50 colonias son
evaluadas para el fenotipo "crecimiento en presencia de
sacarosa" y "no crecimiento en presencia de kanamicina". En
las 4 colonias que exhiben el fenotipo "crecimiento en presencia
de sacarosa" y "no crecimiento en presencia de kanamicina",
una región del gen glk, a partir de la secuenciación del cebador
gll (SEQ ID No. 8), que avanza la mutación A213V es secuenciada por
GATC Biotech AG (Constance, Alemania) para demostrar que la
mutación del alelo de la glk_A213V está presente en el cromosoma. El
cebador gll usado para esto es sintetizado por GATC Biotech AG:
Gl1 (SEQ ID ID No. 8):
5'gga aca tga tgc caa ctc ag 3'
De esta manera un clon es identificado que
contiene la timina base en la posición 638 de la región que codifica
del gen glk y consecuentemente posee el alelo glk_A213V. Este clon
es referido como la cepa DSM5715glk_A213V.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa DSM5715glk_A213V de C.
glutamicum obtenida en el Ejemplo 2 es cultivada en un medio
nutriente adecuado para la producción de lisina, y es determinado
el contenido de lisina en el sobrenadante de cultivo.
Con este fin, la cepa es primero incubada en
placa de agar durante 24 horas a 33ºC. A partir del cultivo de la
placa de agar, un cultivo preliminar es inoculado (10 ml de medio en
un frasco Erlenmeyer de 100 ml). El medio MM es usado como el medio
para el cultivo preliminar. El cultivo preliminar es incubado en un
agitador durante 24 horas a 33ºC a 240 rpm. A partir del cultivo
preliminar, un cultivo principal es inoculado, para que la DO
inicial (660 nm) del cultivo principal sea DO 0.1. El medio MM es
también usado para el cultivo principal.
- CSL
- 5 g/1
- MOPS
- 20 g/1
- Glucosa (autoclaveada separadamente)
- 50 g/1
Sales:
- (NH_{4})_{2}SO_{4})
- 25 g/1
- KH_{2}PO_{4}
- 0.1 g/1
- MgSO_{4} * 7 H_{2}O
- 1.0 g/1
- CaCl_{2} * 2 H_{2}O
- 10 mg/1
- FeSO_{4} * 7 H_{2}O
- 10 mg/l
- MnSO_{4} * H_{2}O
- 5.0 mg/l
- Biotina (esterilizado por filtración)
- 0.3 mg/1
- Tiamina * HCl (esterilizado por filtración)
- 0.2 mg/1
- L-leucina (esterilizada por filtración)
- 0.1 g/1
- CaCO_{3}
- 25 g/1
CSL (licor de maceración de maíz), MOPS (ácido
morfolinopropanosulfónico) y la solución de sal son ajustados a pH
7 con agua de amoníaco y son autoclaveadas. El sustrato estéril y la
solución de vitaminas y el CaCO_{3} autoclaveado seco son
añadidos.
El cultivo tiene lugar en un volumen de 10 ml en
un frasco Erlenmeyer de 100 ml con bafles. El cultivo tiene lugar a
33ºC y 80% de humedad.
Después de 72 horas, la DO es determinada a una
medida de longitud de onda de 660 nm utilizando un Biomek 1000
(Beckmann Instruments GmbH, Munich). La cantidad de lisina formada
es determinada por medio de un analizador de aminoácido de
Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y detección con derivación
post-columna con ninhidrina.
El resultado del ensayo se muestra en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
Las abreviaturas y nombres utilizados tienen los
siguientes significados. Donde los números de los pares de bases
son dados, ellos son valores aproximados que son obtenidos dentro
del alcance de las medidas de reproducibilidad.
- Kan:
- gen de resistencia a la kanamicina
- BamHI:
- sitio de corte de la enzima de restricción BamHI
- XbaI:
- sitio de corte de la enzima de restricción XbaI
- glk:
- alelo de la glk_A213V
- sacB:
- gen sacB
- RP4-mob:
- región mob que tiene el origen de replicación para el transfer (oriT)
- oriV:
- origen de replicación V
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Alelos del gen de la glk de la
bacteria coryneforme
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 010479 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 969
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(969)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gen glk del tipo salvaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 969
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(969)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> alelo de la glk
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (638)..(638)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sustitución de citosina por
timina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1655
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_interpretación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1655)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Producto de la PCR del alelo de la glk (=alelo
glk_A213V)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> alelo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (215)..(1183)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> alelo de la glk
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (852)..(852)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sustitución de citosina por
timina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_interpretación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador glk_XL-A1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctagagc ttctcgacga tccgatcc
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_interpretación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador glk_XL-A2
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgatctagaca ttatctgcgg tgcggtcc
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_interpretación
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<222> (1)..(20)
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador gl1
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaacatgat gccaactcag
\hfill
Claims (9)
1. Secuencias de nucleótidos de ADN replicables
procedentes de la bacteria coryneforme y que codifican para la
glucoquinasa (de SEQ ID No. 2) donde la L-alanina en
la posición 213 es sustituida por L-valina.
2. Secuencia de nucleótidos de ADN replicables
de acuerdo con la reivindicación 1, la secuencia base que contiene
timina en la posición 638 se muestra en la SEQ ID No. 3.
3. Vectores plasmídicos que contienen la
secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2
y que opcionalmente se replican en la bacteria coryneforme.
4. Bacterias coryneformes que contienen
secuencias de nucleótidos de ADN de acuerdo con las reivindicaciones
1-3.
5. Bacterias coryneformes de acuerdo con la
reivindicación 4 donde las secuencias de nucleótidos que codifican
dicha glucoquinasa están en una forma sobreexpresada.
6. Proceso para la producción de
L-lisina o de nutrientes que contienen
L-lisina, en el que los siguientes pasos son
llevados a cabo:
- a)
- fermentación de la bacteria coryneforme que contiene secuencias de nucleótidos endógenas que codifican para un polipéptido que tiene la actividad enzimática de la glucoquinasa, dicho polipéptido comprendiendo la secuencia de aminoácido de SEQ ID No: 2, donde la L-alanina en la posición 213 ha sido sustituida por L-valina,
- b)
- aislamiento de la L-lisina o del nutriente que contiene L-lisina a partir del licor de la fermentación donde la bacteria coryneforme forma la L-lisina.
7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 6
donde dichas secuencias de nucleótidos endógenas están
sobreexpresadas.
8. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 6
ó 7 que comprende el uso de microorganismos en el que además los
genes de la ruta de la biosíntesis de la L-lisina
están adicionalmente sobreexpresados.
9. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones
6-8 que comprende el uso de microorganismos en los
que al menos alguna de las rutas metabólicas que reduce la
formación de L-lisina están excluídas.
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