ES2330257T3 - Metodo para producir l-treonina. - Google Patents
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Abstract
Método para producir L-treonina que comprende: A) cultivar un microorganismo que pertenece al género Escherichia que tiene la capacidad de producir L-treonina, en un medio de fermentación que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una fuente de azufre, B) recoger L-treonina del cultivo, regulándose la concentración de azufre en el medio de modo que es de 0,35 g/l o inferior.
Description
Método para producir
L-treonina.
Campo técnico
La presente invención se refiere a una técnica
para su uso en la industria de la fermentación. Más específicamente,
la presente invención se refiere a un método producir de manera
eficaz L-treonina mediante fermentación utilizando
una bacteria Escherichia. L-treonina es uno
de los aminoácidos esenciales y es útil como componente en mezclas
nutricionales para fines médicos. Se utiliza además de diversos
modos como aditivo para piensos y como reactivo en las industrias
farmacéutica y química.
L-aminoácidos tales como
L-treonina y L-isoleucina se
producen industrialmente mediante fermentación usando bacterias
productoras de aminoácidos, tales como bacterias corineformes o
bacterias Escherichia que tienen la capacidad de producir
estos L-aminoácidos. Como estas bacterias
productoras de aminoácidos, se usan cepas bacterianas aisladas de
la naturaleza o mutantes artificiales de estas cepas bacterianas. Se
usan recombinantes de cepas bacterianas en las que se potencian
enzimas de biosíntesis de L-aminoácidos mediante
recombinación génica, etcétera, con el fin de mejorar la
productividad.
Específicamente, se conocen cepas mutantes de
bacterias Escherichia productoras de
L-treonina, tales como una cepa resistente a
6-dimetilaminopurina (patente japonesa abierta a
consulta por el público (Kokai) n.º 5-304969) y una
cepa resistente a borrelidina (publicación de patente internacional
WO98/04715). Se conocen métodos de uso de bacterias
Escherichia recombinantes para producir
L-treonina, específicamente usando una cepa en la
que se amplifica el operón de treonina usando un plásmido (documento
US5.175.107), o en la que se amplifican el gen de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa y el gen de la aspartasa usando un
plásmido (solicitud de patente estadounidense n.º 2002/0110876).
Como genes que codifican para enzimas implicadas
en la biosíntesis de L-treonina en Escherichia
coli, se conocen el gen de la aspartocinasa III (lysC),
el gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd), el
gen de la aspartocinasa I-homoserina deshidrogenasa
(thrA), el gen de la homoserina cinasa (thrB) y el
gen de la treonina sintasa (thrC), etcétera. El thrA,
thrB y thrC (thrABC) constituyen el operón de treonina.
El operón de treonina forma una estructura de atenuador, y la
expresión del mismo se inhibe por isoleucina y treonina en un medio
de cultivo. Se conoce que se mejora el rendimiento de la
fermentación cuando se elimina la secuencia líder de esta región de
atenuación o el atenuador del operón de treonina (patente
estadounidense n.º 5.538.873, Biotechnology Letters, Vol. 24, n.º
21, noviembre de 2002 y publicación de patente internacional
WO05/049808).
Hasta la fecha, los métodos para producir
L-treonina que se han desarrollado incluyen el uso
de un cultivo discontinuo usando un fermentador que contiene
inicialmente todos los nutrientes, un cultivo semicontinuo usando
un fermentador que contiene inicialmente nutrientes predeterminados
y que se alimenta de manera continua con uno o más nutrientes
adicionales (patente estadounidense n.º 5.538.873 y patente europea
n.º 593792), y un método de regulación de la concentración de
sacárido de modo que se mantiene a un nivel predeterminado o
inferior (publicación de patente internacional WO05/014840 y
publicación de patente internacional WO05/014843). Además, otro
método para producir L-treonina que se ha
desarrollado es un método de alimentación de un medio de cultivo, o
de adición de nutrientes a un medio, de modo que fuentes de carbono
y ácido fosfórico sirven como factores limitantes del crecimiento
(patente estadounidense n.º 5.763.230).
La solicitud de patente estadounidense n.º US
2005/0025878 A1 da a conocer un procedimiento para la granulación de
un aditivo para piensos tal como un producto de fermentación que
comprende aminoácidos o vitaminas.
El azufre es un factor esencial para el
crecimiento celular bacteriano y se incluye habitualmente en el
medio para la fermentación de L-treonina en forma de
sulfato de amonio. Con respecto a la producción de
L-treonina mediante fermentación; sin embargo, se
desconocen la regulación de la concentración de azufre en el medio
de fermentación y el efecto de la disminución de la concentración de
azufre.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método para producir de manera eficaz
L-treonina usando una bacteria Escherichia
que tiene la capacidad de producir L-treonina.
Los inventores de la presente invención
estudiaron diligentemente con el fin de conseguir el objeto
anterior. Como resultado, los inventores encontraron que la
concentración de azufre en el medio podría afectar a los resultados
de la fermentación, y que el rendimiento de
L-treonina durante la fermentación puede mejorarse
regulando la concentración de azufre en el medio de fermentación de
modo que se mantenga a un nivel predeterminado o inferior, y
lograron así la presente invención.
\newpage
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método para producir L-treonina que
comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género
Escherichia que tiene la capacidad de producir
L-treonina, en un medio de fermentación que
contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una fuente
de azufre, y recoger L-treonina del cultivo,
regulándose la concentración de azufre en el medio de modo que es de
0,35 g/l o inferior.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar el método tal como se describió anteriormente, en el
que el microorganismo es Escherichia coli.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar el método tal como se describió anteriormente, en el
que se modifica una enzima de biosíntesis de
L-treonina en el microorganismo de modo que la
enzima no se somete a inhibición por retroalimentación por
L-treonina.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar el método tal como se describió anteriormente, en el
que la enzima de biosíntesis de L-treonina se
selecciona del grupo que consiste en aspartocinasa, homoserina
cinasa, treonina sintasa y combinaciones de las mismas.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar el método tal como se describió anteriormente, en el
que la fuente de azufre se selecciona del grupo que consiste en
sulfatos, tiosulfatos, sulfitos, cisteína, cistina, glutatión y
combinaciones de los mismos.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar el método tal como se describió anteriormente, en el
que el método de cultivo se selecciona del grupo que consiste en un
método de cultivo discontinuo, un método de cultivo semicontinuo y
un método de cultivo continuo.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar el método tal como se describió anteriormente, en el
que el método de cultivo es un método de cultivo semicontinuo o un
método de cultivo continuo, en el que se añade un medio de
alimentación que contiene una fuente de azufre al cultivo en un
fermentador.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar el método tal como se describió anteriormente, en el
que dicho medio de alimentación contiene además una fuente de
carbono y un nutriente que tiene un efecto de estimulación del
crecimiento y, en el que se añade dicho medio de alimentación al
fermentador de manera continua o intermitente de modo que la
concentración de la fuente de carbono en el medio de cultivo se
mantiene a 30 g/l o inferior tras el final del crecimiento
logarítmico del microorganismo.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un método para producir aditivo para piensos a base de
un caldo de fermentación que comprende:
A) cultivar un microorganismo que pertenece al
género Escherichia que tiene la capacidad de producir
L-treonina, en un medio de fermentación que contiene
una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una fuente de
azufre,
B) realizar la fermentación regulándose la
concentración de azufre en el medio de modo que es de 0,35 g/l o
inferior,
C) secar el caldo de fermentación bruto hasta un
contenido en agua del 10% o inferior en peso.
La figura 1 muestra la relación entre la
cantidad de azufre añadida inicialmente al medio y el rendimiento de
L-treonina.
El método de la presente invención es un método
para producir L-treonina mediante el cultivo de un
microorganismo que pertenece al género Escherichia que tiene
la capacidad de producir L-treonina, en un medio de
fermentación que contiene una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno y una fuente de azufre de modo que se produce
L-treonina en el medio, regulándose la concentración
de azufre en el medio de modo que se mantiene a un nivel
predeterminado o inferior. En la presente invención, la expresión
"concentración de azufre" significa la concentración de la
fuente de azufre en cuanto a la concentración de átomos de
azufre.
El medio usado para la presente invención puede
ser cualquier medio siempre que sea un medio líquido que contenga
una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una fuente de
azufre como nutrientes, y el medio no está particularmente limitado
excepto porque se ajusta de modo que se mantiene la concentración de
azufre a un nivel predeterminado o inferior. La fuente de azufre
puede ser cualquier fuente que contiene azufre. Son deseables sales
de ácido sulfúrico, tales como sulfatos, tiosulfatos y sulfitos, así
como aminoácidos que contienen azufre tales como cisteína, cistina
y glutatión. Entre éstos, el sulfato de amonio es particularmente
preferible. Las sales no están particularmente limitadas, y pueden
usarse sales de amonio, sales de calcio, sales de sodio, sales de
potasio, sales de magnesio, sales de manganeso y sales de hierro.
Además, el medio puede contener solamente un tipo, o dos o más
tipos, de estas sustancias. La concentración indicada por la frase
"nivel predeterminado o inferior" es de 0,35 g/l o inferior,
preferiblemente de 0,25 g/l o inferior, de manera particularmente
preferible de 0,10 g/l o inferior de azufre en el medio de
fermentación. Una de las características de la presente invención
es que se regula la concentración de azufre en el medio de
fermentación. Para el método de la presente invención, pueden
emplearse un cultivo discontinuo, un cultivo semicontinuo y/o un
cultivo continuo, y puede regularse la concentración de azufre en
el medio para que esté en un nivel predeterminado o inferior en el
medio inicial, o limitarse para que esté en un nivel predeterminado
o inferior controlando la concentración de azufre en el medio de
alimentación o usando estas técnicas en combinación. Puede usarse la
misma fuente de azufre para el medio inicial y el medio de
alimentación, o la fuente de azufre en el medio de alimentación
puede ser diferente de la usada en el medio inicial.
En la presente invención, un cultivo
semicontinuo se refiere a un método de cultivo en el que se añade el
medio, de manera continua o intermitente, en un recipiente durante
el cultivo y no se retira el medio del recipiente antes de la
finalización del cultivo. El cultivo continuo se refiere a un método
de adición de manera continua o intermitente de un medio en un
recipiente durante el cultivo y extraer el medio del recipiente
(normalmente, en una cantidad equivalente al medio alimentado). La
expresión "medio inicial" significa un medio usado para el
cultivo discontinuo antes de que se añada el medio de alimentación
en el cultivo semicontinuo o cultivo continuo, y la expresión
"medio de alimentación" significa un medio que va a
suministrarse a un fermentador cuando se realiza un cultivo
semicontinuo o cultivo continuo. El medio de alimentación puede
contener todos o una parte de los componentes necesarios para el
crecimiento de un microorganismo. En la presente invención, la
expresión "medio de fermentación" significa un medio contenido
en un fermentador, y se recoge L-treonina de este
medio de fermentación. Además, en la presente invención, la
expresión "fermentador" significa un recipiente en el que se
realiza la fermentación de L-treonina y la forma del
mismo no está limitada. Puede usarse un tanque de fermentación o un
fermentador de tanque. Además, el volumen del fermentador no está
limitado siempre que pueda producirse y recogerse
L-treonina.
Aunque la concentración de azufre está limitada
preferiblemente a un nivel predeterminado o inferior en todo el
procedimiento de cultivo, puede limitarse durante sólo una parte del
procedimiento. Por ejemplo, cuando el método de la presente
invención incluye una fase en la que las células proliferan (fase de
crecimiento) y una fase en la que se produce
L-treonina (fase de producción de
L-treonina), es suficiente que la concentración de
azufre se limite a un nivel predeterminado o inferior en la fase de
producción de L-treonina. En la fase de crecimiento
(durante la proliferación celular), el azufre puede estar presente
en el medio en más de la cantidad predeterminada, o la
concentración de azufre puede limitarse al nivel predeterminado o
inferior. Además, durante la fase en la que se produce
L-treonina, el contenido en azufre no necesita estar
en el intervalo mencionado anteriormente en todo el periodo de esta
fase, y el contenido en azufre puede estar al nivel mencionado
anteriormente o superior durante un periodo temprano de esa fase y
puede reducirse con el tiempo de cultivo. Además, puede añadirse
azufre de manera intermitente cuando escasea. La expresión "fase
de crecimiento" usada en la presente invención significa un
periodo en el plazo de 3 horas, preferiblemente 6 horas, de manera
particularmente preferible 10 horas, desde el inicio del cultivo,
periodo durante el que se consume principalmente la fuente de
carbono para el crecimiento celular bacteriano, es decir, las
células proliferan de manera logarítmica. La expresión "fase de
producción de L-treonina" usada en la presente
invención significa un periodo tras las 3 horas iniciales,
preferiblemente 6 horas, de manera particularmente preferible 10
horas, desde el inicio del cultivo, durante el que se consume
principalmente la fuente de carbono para la producción de
L-treonina.
Es suficiente que el medio de fermentación
contenga una cantidad mínima de azufre que se requiere para el
crecimiento del microorganismo; sin embargo, la cantidad de azufre
puede escasear temporalmente. El verbo "escasear" significa
que la concentración de azufre se reduce en comparación con puntos
más tempranos en el cultivo y puede incluso volverse "0". El
término "temporalmente" significa que, por ejemplo, el azufre
puede escasear durante un periodo correspondiente a aproximadamente
el 20%, aproximadamente el 40% o aproximadamente el 60% como
máximo, de todo el periodo de fermentación. Durante el periodo en el
que el azufre escasea, aunque la concentración puede ser
temporalmente 0, el azufre está presente de manera deseable en el
medio de fermentación a una concentración de 1 \mug/l o más, 10
\mug/l o más, o 100 \mug/l o más. Por tanto, aunque la
concentración de azufre temporalmente se vuelva 0, se abarca un
cultivo de un medio que contiene azufre durante cualquier periodo
dentro de la expresión "cultivar un microorganismo que pertenece
al género Escherichia en un medio de fermentación que
contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una fuente
de azufre". La concentración de azufre en el medio de cultivo
puede medirse mediante el método de cromatografía iónica y el método
del matraz caliente.
Además, según la presente invención, la
concentración de azufre en el medio de alimentación puede ajustarse
de modo que se limita a un nivel predeterminado o inferior en el que
puede emplearse cultivo semicontinuo. Por ejemplo, cuando la
concentración de azufre se limita usando un cultivo semicontinuo, es
preferible controlar la concentración de azufre en el medio de
fermentación para que sea de 0,35 g/l o inferior, de manera deseable
de 0,25 g/l o inferior, de manera más deseable de 0,10 g/l o
inferior.
Los ejemplos de la fuente de carbono usada en la
presente invención incluyen sacáridos tales como glucosa, glicerol,
fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, hidrolizado de
almidón y melaza. Se prefieren particularmente glucosa y sacarosa.
Además, ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido cítrico, y
alcoholes tales como etanol también pueden usarse solos o en
combinación con otra fuente de carbono. Además, el material de
partida de la fuente de carbono puede ser melaza de caña, melaza de
remolacha, melaza concentrada y melaza de cítricos, e hidrolizados
de materiales de partida naturales tales como celulosa, almidón,
maíz, cereal y tapioca. Además, el dióxido de carbono disuelto en
un medio de cultivo también puede usarse como fuente de carbono.
Estas fuentes de carbono pueden usarse en el medio inicial y/o en
el medio de alimentación. El medio puede contener uno o más tipos
de estas fuentes de carbono. Además, la misma fuente de carbono
puede usarse para el medio inicial y el medio de alimentación, o la
fuente de carbono del medio de alimentación puede ser diferente de
la del medio inicial. Por ejemplo, puede usarse glucosa en el medio
inicial, mientras que puede usarse sacarosa en el medio de
alimentación.
Los ejemplos de la fuente de nitrógeno usada en
la presente invención incluyen amoniaco, sales de amonio tales como
sulfato de amonio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, fosfato
de amonio, acetato de amonio y urea, nitratos, etcétera. También
pueden utilizarse como la fuente de nitrógeno gas amoniaco y
amoniaco acuoso que se usan para ajustar el pH. Además, también
pueden utilizarse peptona, extracto de levadura, extracto de carne,
extracto de malta, aguas de maceración de maíz, hidrolizado de soja,
etcétera. El medio puede contener uno o más tipos de estas fuentes
de nitrógeno. Estas fuentes de nitrógeno también pueden usarse en el
medio inicial y/o en el medio de alimentación. Además, la misma
fuente de nitrógeno puede usarse tanto en el medio inicial como en
el medio de alimentación, y la fuente de nitrógeno del medio de
alimentación puede ser diferente de la del medio
inicial.
inicial.
Además, el medio de la presente invención
contiene preferiblemente una fuente de ácido fosfórico además de
una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y azufre. Como la
fuente de ácido fosfórico pueden utilizarse dihidrogenofosfato de
potasio, hidrogenofosfato de dipotasio y polímeros de fosfato tales
como ácido pirofosfórico.
Además, el medio de la presente invención puede
contener un factor de estimulación del crecimiento (un nutriente
que tiene un efecto de estimulación del crecimiento) además de una
fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y azufre. Factores de
estimulación del crecimiento que pueden usarse incluye metales
traza, aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, así
como peptona, casaminoácido, extracto de levadura, hidrolizado de
proteína de soja.
Los ejemplos de los metales traza incluyen
hierro, manganeso, magnesio, calcio, potasio, sodio, etcétera. Los
ejemplos de las vitaminas incluyen vitamina B_{1}, vitamina
B_{2}, vitamina B_{6}, ácido nicotínico, amida del ácido
nicotínico, vitamina B_{12}, etcétera. Estos factores de
estimulación del crecimiento pueden estar contenidos en el medio
inicial o en el medio de alimentación.
Además, cuando se usa un mutante auxótrofo que
requiere un aminoácido o similar para el crecimiento del mismo, es
preferible añadir el nutriente requerido al medio. En particular,
puesto que la ruta biosintética de L-treonina se
potencia con frecuencia y la capacidad de degradar
L-treonina se atenúa con frecuencia en las bacterias
productoras de L-treonina que pueden usarse para la
presente invención tal como se describe a continuación, se añaden
preferiblemente L-lisina,
L-homoserina, L-isoleucina,
L-metionina o una combinación de las mismas.
El medio inicial y el medio de alimentación
pueden tener las mismas composiciones o diferentes. Además, el
medio inicial y el medio de alimentación pueden tener las misma
concentración de azufre o diferente. Además, cuando el medio de
alimentación se añade en múltiples fases, la composición del medio
de alimentación añadido en cada fase puede ser la misma o
diferente.
El cultivo se realiza preferiblemente con
aireación, preferiblemente a una temperatura de fermentación de 20
a 45ºC, de manera particularmente preferible a de 33 a 42ºC. La
concentración de oxígeno se ajusta preferiblemente a del 5 al 50%,
más preferiblemente a aproximadamente el 10%. Además, la aireación
se realiza preferiblemente con el pH ajustado a de 5 a 9. Si se
reduce el pH durante el cultivo, por ejemplo, pueden añadirse
carbonato de calcio o un álcali tal como gas amoniaco y amoniaco
acuoso para neutralizar el cultivo. Cuando el cultivo se realiza en
tales condiciones, preferiblemente durante aproximadamente de 10 a
120 horas, se acumula una cantidad notable de
L-treonina en el medio de cultivo. La concentración
de L-treonina acumulada no está limitada siempre
que pueda aislarse y recogerse L-treonina del medio,
y es de 50 g/l o superior, de manera deseable de 75 g/l o superior,
de manera más deseable de 100 g/l o superior.
En la presente invención, el cultivo del
microorganismo puede realizarse mediante cultivo de siembra y/o un
cultivo principal con el fin de inducir la acumulación de
L-treonina superior a un cierto nivel. El cultivo
de siembra puede realizarse agitando, usando un matraz o similar, o
un cultivo discontinuo. El cultivo principal puede realizarse como
cultivo semicontinuo o un cultivo continuo. Alternativamente, tanto
el cultivo de siembra como el cultivo principal pueden realizarse
como cultivo discontinuo.
En estos métodos de cultivo, cuando la
concentración de L-treonina alcanza un nivel
predeterminado, puede retirarse parte del caldo de fermentación, y
puede añadirse medio reciente para repetir el cultivo. Como el
medio reciente, se prefiere un medio que contiene una fuente de
carbono y un nutriente que tiene un efecto de estimulación del
crecimiento (factor de estimulación del crecimiento), y
preferiblemente contiene azufre a una concentración predeterminada
o inferior. La expresión "concentración predeterminada o
inferior" significa que el medio que va añadirse se ajusta de
modo que la concentración de azufre en el medio de fermentación se
vuelve de 0,35 g/l o inferior, de manera deseable de 0,25 g/l o
inferior, de manera más deseable de 0,10 g/l o inferior. Como la
fuente de carbono, se prefieren glucosa, sacarosa y fructosa. Como
el factor de estimulación del crecimiento, se prefieren fuentes de
nitrógeno, ácido fosfórico, aminoácidos, etcétera. Como la fuente
de nitrógeno, pueden usarse amoniaco, sales de amonio tales como
sulfato de amonio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, fosfato
de amonio, acetato de amonio y urea, nitratos, etcétera. Además,
como la fuente de ácido fosfórico, pueden usarse dihidrogenofosfato
de potasio e hidrogenofosfato de dipotasio. En cuanto a los
aminoácidos, cuando se usa una cepa mutante auxótrofa, es
preferible complementar con el aminoácido requerido.
Cuando se realiza cultivo semicontinuo o cultivo
continuo según la presente invención, la adición del medio de
alimentación puede suspenderse de manera intermitente, de modo que
se suspenda temporalmente el suministro de sacárido o nutrientes.
La adición del medio de alimentación se suspende preferiblemente
durante, como máximo, el 30%, de manera deseable el 20%, de manera
particularmente deseable el 10%, del tiempo de alimentación. El
"tiempo de alimentación" significa el periodo desde el inicio
de la primera adición del medio de alimentación hasta el final de
la última adición del medio de alimentación. La suspensión de la
adición de medio de alimentación puede ser inferior al 30% y, lo
más preferiblemente, inferior al 10%. Cuando el medio de
alimentación se añade de manera intermitente, el medio de
alimentación puede añadirse inicialmente a lo largo de un tiempo
predeterminado, y la segunda y adiciones siguientes pueden
controlarse de modo que se empiece cuando se detecte mediante un
ordenador un aumento en el pH o la concentración de oxígeno
disuelto. Tal detección se produce normalmente tras el agotamiento
de la fuente de carbono en el medio de fermentación durante un
periodo de adición/suspensión antes de un cierto periodo adición y,
por tanto, la concentración de sustrato en el tanque de cultivo debe
mantenerse de manera automática y sistemática a un bajo nivel
(patente estadounidense n.º 5.912.113).
El medio de alimentación usado para el cultivo
semicontinuo es preferiblemente un medio que contiene una fuente de
carbono y un nutriente que tiene un efecto de estimulación del
crecimiento (factor de estimulación del crecimiento), y puede
contener azufre de modo que la concentración de azufre en el medio
de fermentación se mantiene a una concentración predeterminada o
inferior. La expresión "concentración predeterminada o
inferior" tal como se usa en el presente documento significa que
el medio añadido se ajusta de modo que la concentración de azufre
en el medio de fermentación se mantiene a una concentración de 0,35
g/l o inferior, de manera deseable de 0,25 g/l o inferior, de
manera más deseable de 0,10 g/l o inferior. Aunque la concentración
de azufre del propio medio de alimentación puede estar dentro o
fuera del intervalo de concentración mencionado anteriormente, está
preferiblemente dentro del intervalo de concentración mencionado
anteriormente.
Como la fuente de carbono, se prefieren glucosa,
sacarosa y fructosa. Como el factor de estimulación del crecimiento,
se prefieren fuentes de nitrógeno, ácido fosfórico, aminoácidos,
etcétera. Como la fuente de nitrógeno, pueden usarse amoniaco,
sales de amonio tales como sulfato de amonio, carbonato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio, acetato de amonio y urea,
nitratos, etcétera. Además, como la fuente de ácido fosfórico,
pueden usarse dihidrogenofosfato de potasio e hidrogenofosfato de
dipotasio. En cuanto a los aminoácidos, cuando se usa una cepa
mutante auxótrofa es preferible complementar con el aminoácido
requerido. Además, el medio de alimentación puede ser de un tipo, o
una mezcla de dos o más tipos de medios. Cuando se usan dos o más
tipos de medios de alimentación, los medios pueden mezclarse y
añadirse usando un recipiente de alimentación, o usando dos o más
recipientes de alimentación.
Además, cuando se realiza un cultivo
semicontinuo, la adición se realiza preferiblemente de modo que la
cantidad de sacárido no supera 30 g/l, preferiblemente 20 g/l, más
preferiblemente 10 g/l, de todo el medio de fermentación o medio de
cultivo semicontinuo. En particular, la concentración de sacárido se
controla preferiblemente para que esté dentro del intervalo de
concentración mencionado anteriormente tras la finalización del
crecimiento logarítmico del microorganismo. La velocidad de
alimentación de la fuente de carbono puede controlarse mediante el
método descrito en la patente estadounidense n.º 5.912.113. Además,
el sacárido y el ácido fosfórico se alimentan preferiblemente de
modo que las concentraciones son tales que el sacárido y el ácido
fosfórico son factores limitantes del crecimiento celular
bacteriano. El ácido fosfórico está presente en el medio de
alimentación de modo que la razón fósforo/carbono (P/C) es de 2 o
inferior, preferiblemente de 1,5 o inferior, más preferiblemente de
1 o inferior (patente estadounidense n.º 5.763.230).
Cuando se usa el método de cultivo continuo para
la presente invención, el medio puede retirarse y añadirse
simultáneamente, o puede extraerse una parte del medio y entonces
puede añadirse el medio. Además, el método puede ser también un
método de cultivo continuo de retirada del medio de cultivo que
contiene L-treonina y células bacterianas y
reciclado solamente de las células al fermentador (patente francesa
n.º 2669935). Como el método de adición de manera continua o
intermitente de una fuente de nutriente, se usa el mismo método que
se usa en el cultivo semicontinuo.
Cuando el medio de cultivo se retira de manera
intermitente, se recoge una parte de L-treonina
cuando la concentración de L-treonina alcanza un
nivel predeterminado y se añade medio reciente para continuar el
cultivo. Además, en cuanto a la cantidad del medio reciente que va
añadirse, la cantidad final del medio total en el cultivo tras la
adición del medio reciente es igual a la cantidad del medio de
cultivo antes de la extracción. El término "igual" tal como se
usa en el presente documento significa de aproximadamente el 93 al
107% de la cantidad del medio de cultivo antes de la extracción.
Cuando el medio de cultivo se retira de manera
continua, se empieza la retirada preferiblemente al mismo tiempo
que, o tras, la adición del medio nutriente. Por ejemplo, el tiempo
de partida es, como máximo, de 5 horas, preferiblemente de 3 horas,
más preferiblemente de 1 hora, tras el inicio de la adición. Además,
la cantidad de retirada del medio de cultivo es preferiblemente
igual a la cantidad del medio añadido.
El método de cultivo continuo de reutilización
de las células bacterianas es un método de retirada de manera
intermitente o continua del medio de fermentación cuando la
concentración de aminoácido alcanza un nivel predeterminado,
retirando solamente L-treonina y recirculando los
residuos de filtración que contienen células bacterianas en el
fermentador, y puede realizarse con referencia a, por ejemplo, la
patente francesa n.º 2669935.
El análisis de L-treonina y
otros aminoácidos puede realizarse mediante cromatografía de
intercambio aniónico seguido por derivación con ninhidrina tal como
se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry
30:1190-1206 (1958)) o mediante HPLC de fase
inversa tal como se describe en Lindroth et al. (Analytical
Chemistry 51:1167-1174).
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Puede prepararse un aditivo para piensos a base
de un caldo de fermentación producido por esta invención siguiendo
un método de separación.
Pueden usarse métodos de separación de
L-treonina tales como centrifugación, filtración,
decantación, floculación o una combinación de éstos para eliminar o
reducir la biomasa.
El caldo obtenido mediante esta invención puede
espesarse o concentrarse usando métodos conocidos tales como un
evaporador rotatorio, evaporador de capa fina, ósmosis inversa o
nanofiltración. (Documentos FR8613346B, US4.997.754, EP410005B,
JP1073646B).
El caldo concentrado se procesa entonces usando
los métodos de liofilización, secado por pulverización, granulación
por pulverización o cualquier otro procedimiento para dar un polvo
preferiblemente finamente dividido, que fluye libremente para
aditivo para piensos. Este polvo finamente dividido, que fluye
libremente puede convertirse en un producto ampliamente libre de
polvo, estable, que fluye muy libremente, de grano grueso usando
procedimientos de compactación o granulación adecuados. En general,
se elimina más del 90% de agua de esta manera de modo que la
concentración de agua del aditivo para piensos sea inferior al 10%,
preferiblemente inferior al 5% en peso.
El contenido en proteína del aditivo alimentario
puede ser inferior al 10%, preferiblemente inferior al 5% en peso,
y la concentración de L-treonina puede ser de más
del 50%, preferiblemente de más del 85%, más preferiblemente de más
del 95%. (Documentos US5.431.933, JP1214636B, US4.956.471,
US4.777.051, US4946654, US5.840358, US6.238.714,
US2005/0025878).
La etapa de separación descrita anteriormente no
ha de realizarse necesariamente, pero puede combinarse de una manera
técnicamente conveniente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias Escherichia que pueden
usarse para la presente invención son bacterias Escherichia
que tienen la capacidad de producir L-treonina, y
la expresión "capacidad de producir L-treonina"
usada en la presente invención significa la capacidad, cuando se
cultivan las bacterias en un medio, de producir
L-treonina libre en el medio, es decir, fuera de
las células, hasta un grado tal que puede recogerse
L-treonina del medio. Preferiblemente, la bacteria
Escherichia usada para la presente invención es una cepa que
se genera de modo que la cepa puede producir una cantidad de
L-treonina superior en comparación con las cepas de
tipo natural o las cepas originales. Específicamente, es preferible
que la bacteria Escherichia produzca una cantidad de
L-treonina de 30 g/l o superior, más preferiblemente
de 50 g/l o superior, de manera particularmente preferible de 75 g/l
o superior, usando un método de cultivo típico en el que la
concentración de azufre no esté ajustada.
Las cepas originales de bacterias
Escherichia usadas para obtener las bacterias
Escherichia usadas de manera adecuada en la presente
invención no están particularmente limitadas, y ejemplos específicos
de las mismas incluyen los mencionados en el trabajo de Neidbardt
et al. (Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and
Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology,
Washington D.C., 1029, Tabla 1). Entre éstas, por ejemplo, se usa
preferiblemente Escherichia coli. Ejemplos específicos de
Escherichia coli incluyen W3110 de Escherichia coli
(ATCC 27325) y MG1655 de Escherichia coli (ATCC 47076), de
las que ambas se derivan de un cepa de tipo natural prototipo K12,
etcétera.
En cuanto a la obtención de estas cepas, pueden
obtenerse de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo
(dirección: P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, Estados Unidos de
América). A cada cepa bacteriana se le proporciona un número de
registro correspondiente, y puede ordenarse cada cepa usando este
número de registro. Los números de registro correspondientes a las
cepas bacterianas se enumeran en el catálogo de la Colección
Americana de Cultivos Tipo.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación en el presente documento, se
describirá el método para conferir la capacidad de producir
L-treonina a una bacteria Escherichia.
Para conferir la capacidad de producir
L-treonina, pueden usarse métodos que se han
adoptado convencionalmente para generar bacterias
Escherichia o bacterias corineformes, tales como adquisición
de un mutante auxótrofo, cepa resistente análoga, o cepa mutante de
control de metabolismo, de las que todas tienen la capacidad de
producir L-treonina, así como construcción de una
cepa recombinante en la que se potencia la actividad de una enzima
de biosíntesis de L-treonina. Por ejemplo, puede
modificarse una cepa mutante o recombinante de modo que una enzima
de biosíntesis de L-treonina no se somete a
inhibición por retroalimentación, o puede modificarse una cepa
recombinante para potenciar la expresión de un gen de enzima de
biosíntesis de L-treonina. En la generación de
bacterias productoras de L-treonina mediante estos
métodos, pueden conferirse propiedades tales como auxotrofía,
resistencia análoga y una mutación de control metabólico o bien de
manera individual o bien en combinación. Cuando se potencia la
actividad de una enzima de biosíntesis de
L-treonina, puede potenciarse una o más de estas
actividades enzimáticas. Además, conferir las propiedades
mencionadas anteriormente y la potenciación la actividad enzimática,
tal como se mencionó anteriormente, pueden implementarse en
combinación.
Un ejemplo de un método para conferir capacidad
de producir L-treonina a una bacteria
Escherichia, o potenciar la capacidad de producir
L-treonina potenciando la actividad de una enzima de
biosíntesis de L-treonina, se explicarán a
continuación. Puede potenciarse una actividad enzimática, por
ejemplo, introduciendo una mutación en un gen que codifica para la
enzima o amplificando el gen de modo que aumente la actividad
intracelular de la enzima. Esto puede conseguirse utilizando
técnicas de recombinación génica.
Ejemplos de los genes que codifican para enzimas
de biosíntesis de L-treonina incluyen el gen de la
aspartocinasa III (lysC), el gen de la aspartato
semialdehído deshidrogenasa (asd), el gen de la aspartocinasa
I incluido en el operón de thr (thrA, nucleótidos número 337
a 2799 de la SEQ ID NO: 1), el gen de la homoserina cinasa
(thrB, nucleótidos número 2801 a 3733 de la SEQ ID NO: 1) y
el gen de la treonina sintasa (thrC, nucleótidos número 3734
a 5020 de la SEQ ID NO: 1). Entre paréntesis se muestran los nombres
abreviados de estos genes. Pueden introducirse dos o más de estos
genes en una bacteria. Pueden introducirse genes biosintéticos de
la L-treonina en una bacteria Escherichia en
la que se suprime la degradación de treonina. Los ejemplos de la
bacteria Escherichia en la que se suprime la degradación de
treonina incluyen la cepa TDH6, que es deficiente en actividad
treonina deshidrogenasa (documento EP1149911A), etcétera.
Las actividades enzimáticas de enzimas de
biosíntesis de L-treonina se inhiben por
L-treonina como el producto final. Por tanto, para
construir una bacteria productora de L-treonina, es
beneficioso modificar los genes del sistema de biosíntesis de
L-treonina de modo que las enzimas codificadas no se
sometan a la inhibición por retroalimentación por
L-treonina. Los genes thrA, thrB y
thrC mencionados anteriormente constituyen el operón de
treonina, y el operón de treonina tiene una estructura de atenuador.
La expresión del operón de treonina se inhibe por isoleucina y
treonina presentes en el medio de cultivo, y se suprime por
atenuación. La modificación mencionada anteriormente puede
conseguirse eliminando la secuencia líder en la región de atenuación
(SEQ ID NO: 6), o eliminando el atenuador (SEQ ID NO: 1)
(publicación de patente internacional WO02/26993; Biotechnology
Letters, Vol. 24, n.º 21, noviembre de 2002; publicaciones de
patente internacional WO05/049808, WO98/04715, WO03/097839). En
particular, es deseable modificar el operón de treonina de modo que
la secuencia de los nucleótidos 188 a 310 se elimine de la
secuencia de la SEQ ID NO: 1. Alternativamente, también es deseable
modificar el operón de treonina de modo que la secuencia de los
nucleótidos 148 a 310 se elimine de la secuencia de la SEQ ID NO:
1.
Existe un promotor nativo en la región en el
sentido de 5' del operón de treonina, y puede sustituirse por un
promotor no nativo (véase el documento WO98/04715).
Alternativamente, el operón de treonina puede construirse de modo
que la expresión de los genes implicados en la biosíntesis de
treonina se regula por el represor y promotor de fago lambda (véase
la patente europea n.º 0593792). Además, también puede obtenerse una
bacteria Escherichia modificada de modo que no se somete a
inhibición por retroalimentación por L-treonina
seleccionando una cepa resistente a ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV) (véase el documento WO03/097839).
Además, preferiblemente pueden estar presentes
múltiples copias del operón de treonina que se ha modificado de
modo que no se somete a inhibición por retroalimentación por
L-treonina. Alternativamente, el operón está ligado
a un promotor fuerte de modo que se aumenta la expresión. El número
de copias del operón de L-treonina puede aumentarse
amplificándolo usando un plásmido y/o transfiriéndolo en un
cromosoma usando un transposón, un fago Mu o similares (documento
US5.175.107).
Además, se usa preferiblemente un gen de la
aspartocinasa III (lysC) que se ha modificado de modo que no
se somete a inhibición por retroalimentación por
L-lisina. Puede obtenerse un gen lysC de este
tipo mediante el método descrito en la patente estadounidense n.º
5.932.453.
Además de las enzimas de biosíntesis de
L-treonina, también es preferible potenciar la
expresión de genes relacionados con la ruta glicolítica, el ciclo
del TCA, o la cadena respiratoria, genes que regulan la expresión
de un gen y genes de captación de sacáridos. Los ejemplos de los
genes que tienen un efecto sobre la producción de
L-treonina incluyen el gen de la transhidrogenasa
(pntAB) (patente europea n.º 733712), el gen de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa (pepC) (publicación de patente
internacional WO95/06114, documento US2005-0136518),
el gen de la fosfoenolpiruvato sintasa (pps) (patente
europea n.º 877090) y el gen de la piruvato carboxilasa de
bacterias corineformes o Bacillus (publicación de patente
internacional WO99/18228; publicación de patente europea n.º
1092776).
Además, también es preferible potenciar la
expresión de un gen que confiere resistencia a la
L-treonina, o un gen que confiere resistencia a la
L-homoserina, o ambas en combinación con un huésped.
Los ejemplos de un gen que confiere resistencia incluyen el gen
rhtA (Res. Microbiol., marzo de 2003, 154(2):
123-35), el gen rhtB (publicación de patente
europea n.º 0994190), el gen rhtC (publicación de patente
europea n.º 1013765), el gen yfiK y el gen yeaS
(publicación de patente europea n.º 1016710). Además, los métodos
para conferir resistencia a la L-treonina a un
huésped se describen en la publicación de patente europea n.º
0994190 y la publicación de patente internacional WO90/04636.
Las actividades de enzimas codificadas por los
genes mencionados anteriormente pueden aumentarse potenciando la
expresión de los genes, por ejemplo, aumentando los números de
copias de los genes en las células usando técnicas de recombinación
génica. Por ejemplo, un fragmento de ADN que contiene un gen diana
puede ligarse a un vector que funciona en un microorganismo
huésped, preferiblemente un vector de tipo multicopia y puede
transformarse el microorganismo huésped con este ADN de vector.
Cuando se usa un gen de Escherichia coli
como el gen diana, puede obtenerse preparando cebadores mediante
referencia a la secuencia génica conocida en MG1655 o W3110 de
Escherichia coli registradas en GenBank y realizando una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando ADN cromosómico de
Escherichia coli como molde (véase White, T. J. et
al., Trends Genet. 5, 185 (1989)). También pueden obtenerse los
genes diana de otros microorganismos a partir de ADN cromosómicos o
bibliotecas de ADN cromosómico de los microorganismos mediante PCR
usando cebadores preparados basándose en la información génica
conocida para los microorganismos o información de secuencia de
GenBank, o hibridación usando un oligonucleótido preparado basándose
en la información de secuencia mencionada anteriormente como sonda.
Puede prepararse ADN cromosómico a partir de un microorganismo
donador, por ejemplo, mediante el método de Saito y Miura (véase H.
Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963); Text for
Bioengineering Experiments, editado por la Society for Bioscience
and Bioengineering, Japón, págs. 97-98, Baifukan,
1992), etcétera.
Además, puesto que las secuencias de nucleótidos
de genes que codifican para una enzima diana pueden variar
dependiendo de las especies de bacterias Escherichia o cepas
bacterianas, el gen diana usado para la presente invención no se
limita a genes conocidos o secuencias génicas registradas en
GenBank, y puede ser un gen modificado artificialmente o mutante.
Un gen modificado o mutante de este tipo pueden codificar para una
proteína que tiene una secuencia que incluye sustituciones,
deleciones, inserciones, adiciones o similares, de uno o varios
residuos de aminoácido en uno o más sitios, siempre que la función
de la proteína diana codificada, es decir, la capacidad de
producción de L-treonina, pueda mejorarse mediante
amplificación del gen. El número que significa el término
"varios" usado en el presente documento varía dependiendo de
las posiciones de los residuos de aminoácido en la estructura
tridimensional de la proteína y los tipos de los residuos de
aminoácido. Sin embargo, es específicamente de 1 a 20,
preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 5.
La sustitución mencionada anteriormente es
preferiblemente una sustitución conservativa, que es una mutación
neutra que no provoca ningún cambio funcional. La mutación
conservativa es una mutación en la que la sustitución se produce
entre Phe, Trp y Tyr cuando el sitio de sustitución es un aminoácido
aromático, entre Leu, Ile y Val cuando el sitio de sustitución es
un aminoácido hidrófobo, entre Gln y Asn cuando el sitio de
sustitución es un aminoácido polar, entre Lys, Arg e His cuando el
sitio de sustitución es un aminoácido básico, entre Asp y Glu
cuando el sitio de sustitución es un aminoácido ácido, y entre Ser y
Thr cuando el sitio de sustitución es un aminoácido que tiene grupo
hidroxilo. Más específicamente, los ejemplos de la sustitución
conservativa incluyen la sustitución de Ala por Ser o Thr,
sustitución de Arg por Gln, His o Lys, sustitución de Asn por Glu,
Gln, Lys, His o Asp, sustitución de Asp por Asn, Glu o Gln,
sustitución de Cys por Ser o Ala, sustitución de Gln por Asn, Glu,
Lys, His, Asp o Arg, sustitución de Glu por Gly, Asn, Gln, Lys o
Asp, sustitución de Gly por Pro, sustitución de His por Asn, Lys,
Gln, Arg o Tyr, sustitución de Ile por Leu, Met, Val o Phe,
sustitución de Leu por Ile, Met, Val o Phe, sustitución de Lys por
Asn, Glu, Gln, His o Arg, sustitución de Met por Ile, Leu, Val o
Phe, sustitución de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile o Leu, sustitución de
Ser por Thr o Ala, sustitución de Thr por Ser o Ala, sustitución de
Trp por Phe o Tyr, sustitución de Tyr por His, Phe o Trp y
sustitución de Val por Met, Ile o Leu.
Además, también puede usarse un gen homólogo,
siempre que tenga la misma función que el gen diana.
Específicamente, el gen homólogo debe codificar para una proteína
que tiene una homología del 80% o más, preferiblemente del 90% o
más, más preferiblemente del 95% o más, de manera particularmente
preferible del 97% o más, con respecto a la secuencia de una
proteína conocida. Además, puesto que la degeneración de un gen
varía dependiendo del huésped en el que se introduce el gen, puede
usarse un gen con sustituciones de codones que pueden usarse
fácilmente en un huésped. De manera similar, siempre que la
capacidad de producir L-treonina del gen diana
pueda mejorarse mediante amplificación del gen, puede extenderse o
acortarse el gen o bien en el extremo N-terminal o
bien en el extremo C-terminal. La longitud de la
extensión o acortamiento es, por ejemplo, de 50 o inferior,
preferiblemente de 20 o inferior, más preferiblemente de 10 o
inferior, de manera particularmente preferible de 5 o inferior, en
cuanto al número de residuos de aminoácido. Más específicamente, la
proteína puede tener una secuencia de aminoácidos que se acorta en
5-50 residuos de aminoácido o bien en el extremo
N-terminal y/o bien en el extremo
C-terminal.
Puede obtenerse un gen homólogo al gen diana
modificando la secuencia de nucleótidos mediante, por ejemplo,
mutagénesis de sitio específico, de modo que la proteína codificada
incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de
residuos de aminoácido en un sitio específico. Además, también puede
obtenerse un gen de este tipo mediante tratamientos de mutación
conocidos, tal como se describe a continuación. Los ejemplos de
estos tratamientos de mutación incluyen un método de tratamiento de
la secuencia de nucleótidos del gen diana in vitro con
hidroxilamina o similares, un método de tratamiento de un
microorganismo que tiene el gen, por ejemplo, una bacteria
Escherichia, con irradiación UV o un agente de mutagénesis
típico tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) o metanosulfonato de etilo (EMS), y un método de introducción
de una mutación mediante PCR propensa a error. Además, las
sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones, inversiones,
mencionadas anteriormente o similares, de residuos de aminoácido
incluyen mutaciones que se producen de manera natural (mutante o
variante), tales como mutaciones basándose en diferencias
individuales y/o diferencias de especies del microorganismo que
tiene el gen diana. Si estos genes codifican para una proteína que
mejora la capacidad de producir L-treonina cuando
se aumentan sus noveles de expresión puede confirmarse, por ejemplo,
introduciendo estos genes en una cepa de tipo natural o una cepa
que tiene capacidad de producir L-treonina de
Escherichia coli y examinando si se mejora la capacidad de
producir
L-treonina.
L-treonina.
El gen diana también puede ser ADN que hibrida
con una secuencia de nucleótidos diana, o una secuencia
complementaria de la misma, o una sonda preparada a partir de estas
secuencias en condiciones rigurosas y que codifica para una
proteína que mejora la capacidad de producir
L-treonina de bacterias Escherichia
potenciando la expresión. Las "condiciones rigurosas" a las
que se hace referencia en el presente documento incluyen las
condiciones en las que se forma un denominado híbrido específico y
no se forma un híbrido no específico. Es difícil expresar de manera
clara esta condición usando cualquier valor numérico. Sin embargo,
por ejemplo, las condiciones rigurosas incluyen condiciones en las
que ADN que tienen alta homología, por ejemplo, ADN que tienen una
homología del 50% o más, preferiblemente del 60% o más, más
preferiblemente del 70% o más, más preferiblemente del 80% o más,
más preferiblemente del 90% o más, de manera adicionalmente
preferible del 95% o más, lo más preferiblemente del 97% o más,
hibridan entre sí, pero ADN que tienen una homología inferior a las
anteriores no hibridan entre sí. Alternativamente, las condiciones
rigurosas se muestran a modo de ejemplo lavando una vez,
preferiblemente de 2 a 3 veces, en condiciones para hibridación a
una concentración de sal que son típicas para el lavado en
hibridación de tipo Southern, es decir, 1 x SSC, SDS al 0,1% a 60ºC,
preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 68ºC.
Entonces, se prepara un ADN recombinante ligando
el gen diana amplificado mediante PCR a un ADN de vector que puede
funcionar en la célula de un microorganismo huésped. Un vector de
este tipo incluye un vector que puede replicarse de manera autónoma
en la célula del microorganismo huésped. Los ejemplos del vector que
puede replicarse de manera autónoma en células Escherichia
coli incluyen pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398,
pACYC184, (pHSG y pACYC están disponibles de Takara Bio Inc.),
RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW está disponible de Nippon Gene),
etcétera.
Un ADN recombinante preparado tal como se
describió anteriormente puede introducirse en un microorganismo
mediante un método de transformación conocido. Los ejemplos incluyen
un método de tratamiento de células receptoras con cloruro de
calcio de modo que aumenta la permeabilidad de ADN, que se ha
notificado para K-12 de Escherichia coli
(Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), un método de
preparación de células competentes a partir de células que están en
la fase de crecimiento seguido por la introducción del ADN en las
mismas, que se ha notificado para Bacillus subtilis (Duncan,
C. H., Wilson, G. A. y Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)),
etcétera. Además de éstos, puede usarse un método de preparación de
células receptoras de ADN en protoplastos o esferoplastos, que
pueden captar fácilmente ADN recombinante, seguido por la
introducción del ADN recombinante en las células receptoras de ADN,
lo que se conoce que puede aplicarse a Bacillus subtilis,
actinomicetos y levaduras (Chang, S. y Cohen, S. N., Molec. Gen.
Genet., 168, 111, 1979; Bibb, M. J., Ward, J. M. y Hopwood, O. A.,
Nature, 274, 398, 1978; Hinnen, A., Hicks, J. B. y Fink, G. R.,
Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).
Puede conseguirse aumentar el número de copias
de un gen introduciendo múltiples copias del gen en el ADN
cromosómico de un microorganismo. Con el fin de introducir múltiples
copias, puede llevarse a cabo recombinación homóloga usando una
secuencia cuyas múltiples copias existen en un ADN cromosómico como
dianas. Ya que secuencias cuyas múltiples copias existen en un ADN
cromosómico, pueden usarse ADN repetitivo y repeticiones invertidas
que existen en el extremo de un elemento transponible. También puede
introducirse un gen diana en un gen innecesario en un cromosoma
mediante recombinación homóloga, o puede introducirse un gen diana
en una región innecesaria en tándem. Alternativamente, tal como se
da a conocer en la patente japonesa abierta a consulta por el
público n.º 2-109985, también es posible incorporar
un gen diana en un transposón y permitir que se transfiera para
introducir múltiples copias de los genes en un ADN cromosómico
(véase la patente estadounidense n.º 5.595.889). Puede confirmarse
si se ha transferido el gen diana a un cromosoma mediante
hibridación de tipo Southern usando una parte del gen diana como
sonda.
Adicionalmente, además de aumentar el número de
copias génicas, la expresión del gen diana puede potenciarse
sustituyendo una secuencia de control de la expresión tal como un
promotor del gen diana en un ADN cromosómico o plásmido por una más
fuerte, amplificando un regulador que aumenta la expresión, o
delecionando/atenuando un regulador que reduce la expresión tal
como se describe en la publicación de patente internacional
WO00/18935. Por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el
promotor trc, el promotor Pr derivado del fago lambda, etcétera, se
conocen como promotores fuertes. Además, el promotor del gen diana
puede modificarse para que sea más fuerte introduciendo una
sustitución de nucleótidos en la región de promotor. La evaluación
de la potencia del promotor, así como una descripción de promotores
fuertes conocidos, se exponen en Goldstein et al.
(Prokaryotic promotors in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev.,
1995, 1, 105-128). Además, se conoce que la
sustitución de un espaciador entre el sitio de unión al ribosoma
(RBS) y el codón de iniciación, en particular, la sustitución de
varios nucleótidos en la secuencia inmediatamente en el sentido de
5' del codón de iniciación, tiene un gran impacto sobre la eficacia
de la traducción de ARNm, y pueden modificarse estos nucleótidos.
También puede determinarse una región de control de la expresión
tal como un promotor usando un vector de búsqueda de promotor o un
programa de software de análisis génico tal como GENETYX. La
expresión del gen diana se potencia mediante sustitución o
modificación de estos promotores. La secuencia de control de la
expresión puede sustituirse usando, por ejemplo, un plásmido
sensible a la temperatura.
Como resultado del aumento en la actividad
mediante tales métodos, la actividad enzimática aumenta en al menos
el 10%, el 25%, el 50%, el 100%, el 200%, el 400%, el 600% o el
1000% en comparación con una cepa de tipo natural o una cepa no
modificada. Además, estas técnicas para aumentar la actividad
enzimática pueden implementarse en combinación entre sí o en
combinación con una disminución de una actividad enzimática. Los
ejemplos de bacterias Escherichia que sirven como referencia
incluyen, como cepas de tipo natural, W3110 de Escherichia
coli (ATCC 27325), MG1655 de Escherichia coli (ATCC
47076), etcétera, que se derivan de la cepa de tipo natural
prototipo K12.
Además, en la bacteria de la presente invención,
la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se deriva
de la ruta biosintética de L-treonina y que produce
un compuesto distinto de L-treonina puede reducirse
o ser deficiente. Los ejemplos de una enzima de este tipo incluyen
treonina deshidrogenasa, treonina desaminasa y treonina
deshidratasa. Cepas que tienen estas enzimas con actividad reducida
o deficiente se describen en las publicaciones de patente
internacional WO95/23864, WO96/17930, WO03/080843, WO04/087895,
etcétera.
Además, en la bacteria de la presente invención,
puede reducirse o hacerse deficiente la actividad de una enzima
implicada en la ruta glicolítica, el ciclo del TCA o la cadena
respiratoria que afecta de manera adversa a la producción de
L-treonina, una enzima que regula la expresión
génica, o una enzima de un sistema de biosíntesis de subproducto,
además de una enzima de sistema de degradación de
L-treonina. Los ejemplos de un gen que codifica
para una enzima de este tipo incluyen el gen que codifica para el
factor \sigma (sigma) de ARN polimerasa (rpoS, publicaciones de
patente internacional WO01/05939 y WO03/074719), el gen de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa (pckA, publicación de patente
internacional WO02/29080), gen de la fosfoglucosa isomerasa (pgi,
Molecular and General Genetics, 217(1):
126-31 (1989)), gen de la piruvato oxidasa (poxB,
publicación de patente internacional WO02/29080), etcétera.
Con el fin de reducir o eliminar la actividad de
una enzima tal como se describió anteriormente, puede introducirse
una mutación que reduzca o elimine la actividad intracelular de la
enzima en el gen de la enzima mencionada anteriormente en un
cromosoma mediante un tratamiento de mutación típico. Se consigue,
por ejemplo, delecionando un gen que codifica para una enzima en un
cromosoma mediante recombinación génica, modificando una secuencia
de control de la expresión tal como un promotor y la secuencia
Shine-Dalgarno (SD), etcétera. Además, también
puede conseguirse introduciendo una o más sustituciones de
aminoácidos (mutación de cambio de sentido), introduciendo un codón
de parada (mutación sin sentido), introduciendo una mutación del
marco de lectura, que añade o deleciona uno o dos nucleótidos, o
delecionando una parte o toda la región de un gen (Journal of
Biological Chemistry, 272: 8611-8617 (1997)) en una
región que codifica para una enzima en un cromosoma. Además, también
puede reducirse o eliminarse la actividad enzimática construyendo
un gen que codifica para una enzima mutante en la que se deleciona
una región codificante, y substituyendo un gen normal por este gen
en un cromosoma mediante recombinación homóloga o similar, o
introduciendo un transposón o factor de secuencia de inserción en el
gen. Además, también puede conseguirse inhibiendo la expresión con
un ARN antisentido (Proceedings of the National Academy of Sciences,
EE.UU., 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological
Chemistry, 266, 20833-20839 (1991)).
Con el fin de introducir una mutación que
reduzca o elimine la actividad de una enzima tal como se mencionó
anteriormente mediante recombinación génica, por ejemplo, se usa el
siguiente método. Puede sustituirse un gen diana por un gen de tipo
mutante en un cromosoma modificando una secuencia parcial del gen
diana para preparar un gen mutante mutado de modo que no se produce
una enzima de funcionamiento normal, y transformando una bacteria
Escherichia con un ADN que contiene este gen para producir la
recombinación del gen mutante y el gen en el cromosoma. Se conoce
tal mutación de sitio específico que utiliza sustitución génica
mediante recombinación homóloga, y los ejemplos de la misma
incluyen un método del uso de un ADN lineal, un método del uso de
un plásmido que contiene un origen de replicación sensible a la
temperatura (patente estadounidense n.º 6.303.383; patente japonesa
abierta a consulta por el público n.º 05-007491),
etcétera. Además, la mutación de sitio específico mencionada
anteriormente mediante sustitución génica que utiliza recombinación
homóloga también puede realizarse usando un plásmido que no tiene
capacidad de replicación en un huésped.
Como resultado de la disminución en la actividad
o la expresión mediante tales métodos, la actividad enzimática
disminuye en el 75%, el 50%, el 25% o el 10% en comparación con una
cepa de tipo natural o una cepa no modificada, o se elimina
completamente la actividad. Además, dos o más de estos métodos para
reducir la actividad enzimática pueden implementarse en
combinación, o pueden usarse en combinación con el aumento de la
actividad enzimática descrita anteriormente. Los ejemplos de una
bacteria Escherichia que sirve como referencia incluyen W3110
de Escherichia coli (ATCC 27325), MG1655 de Escherichia
coli (ATCC 47076), etcétera, que se derivan de una cepa de tipo
natural prototipo K12.
\newpage
La bacteria productora de
L-treonina usada para la presente invención puede
ser una cepa que se modifica de modo que puede asimilar sacarosa
como fuente de carbono. Por ejemplo, una cepa que asimila sacarosa
puede obtenerse de la cepa de H155 de E. coli mediante
transducción de P1, usando su capacidad para crecer con sacarosa
como la única fuente de carbono como índice. Una bacteria productora
de L-treonina que puede asimilar sacarosa como
fuente de carbono puede construirse mediante referencia a la
publicación de patente internacional WO90/04636.
Adicionalmente, además de la manipulación génica
mencionada anteriormente, los ejemplos del método para construir
una bacteria productora de L-treonina incluyen un
método de tratamiento de una bacteria Escherichia mediante
irradiación UV o con un agente de mutagénesis típico tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) y ácido nitroso para obtener cepas resistentes a un
L-aminoácido o análogo de
L-aminoácido o cepas auxótrofas de
L-aminoácido, y seleccionando una cepa que tiene
capacidad de producir L-treonina mejorada. Los
ejemplos de las mismas incluyen la cepa mutante resistente a
borrelidina (patente estadounidense n.º 5.939.307), la cepa mutante
resistente a ácido diaminosuccínico (publicación de patente
internacional WO00/09661), la cepa mutante resistente a
\alpha-metilserina (publicación de patente
internacional WO00/09661), la cepa mutante resistente a
fluoropiruvato (publicación de patente internacional WO00/09661), la
cepa mutante resistente a ácido acético (patente estadounidense n.º
5.919.670), la cepa mutante resistente a treonina (publicación de
patente internacional WO90/04636) y la cepa mutante resistente a AHV
(Genetika, 16: 206 (1978)).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describirán ejemplos de
bacterias Escherichia a las que se les ha conferido la
capacidad de producir L-treonina que pueden usarse
para la presente invención. Sin embargo, las bacterias que pueden
usarse para la presente invención no se limitan a estos ejemplos,
siempre que la bacteria tenga la capacidad de producir
L-treonina.
L-treonina.
Como un ejemplo de bacteria productora de
L-treonina que puede usarse para la presente
invención, se abarca la cepa VKPM B-3996 de
Escherichia coli (patente estadounidense n.º 5.175.107). Esta
cepa B-3996 de VKPM se depositó en la Colección
Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM)-(Rusia, 117545
Moscú, 1 Dorozhny proezd. 1) el 19 de noviembre de 1987 con el
número de registro de VKPM B-3996. Esta cepa
B-3996 de tiene el plásmido pVIC40 (publicación de
patente internacional WO90/04636) obtenido insertando los genes
biosintéticos de treonina (operón de treonina thrAB) en
pAYC32, que es un plásmido de vector de amplio espectro de huésped
que tiene un marcador de resistencia a estreptomicina (véase
Chistorerdov, A. Y, Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16,
161-167). En pVIC40, se elimina la inhibición por
retroalimentación de aspartocinasa I-homoserina
deshidrogenasa I codificada por thrA en el operón de treonina
por L-treonina.
Como un ejemplo de bacteria productora de
L-treonina que puede usarse para la presente
invención, también se abarca la cepa VKPM B-5318 de
Escherichia coli (patente europea n.º 0593792). La cepa VKPM
B-5318 se depositó en la Colección Nacional Rusa de
Microorganismos Industriales (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny
proezd. 1) el 3 de mayo de 1990 con el número de registro de VKPM
B-5318. Esta cepa VKPM B-5318 no
requiere isoleucina, tiene el represor C1 sensible a la
temperatura, el promotor PR y el operón de treonina. Es decir, los
genes relacionados con la biosíntesis de treonina, en los que se
delecionan la región de atenuador y la región de regulación de la
transcripción nativa, y se ubican en el sentido de 3' del gen para
la región del extremo N-terminal de la proteína Cro
de fago lambda. Además, esta cepa contiene un ADN de plásmido
recombinante que se ha construido de modo que se regula la
expresión de los genes implicados en la biosíntesis de treonina por
el represor y el promotor de fago lambda.
La 427T23 de Escherichia coli (patente
estadounidense n.º 5.631.157) también puede mostrarse a modo de
ejemplo como un ejemplo preferido de la bacteria productora de
L-treonina. La cepa 427T23 tiene homoserina
deshidrogenasa que no se somete a inhibición por retroalimentación
por L-treonina. Además, esta cepa tiene actividad
treonina desaminasa atenuada y puede usar sacarosa como fuente de
carbono. La cepa 427T23 se ha depositado en la Colección Americana
de Cultivos Tipo con el número de registro de ATCC 98082.
La kat-13 de Escherichia
coli (patente estadounidense n.º 5.175.107) también puede usarse
preferiblemente como la bacteria productora de
L-treonina. La cepa kat-13 es
resistente a borrelidina, tiene homoserina deshidrogenasa que no se
somete a inhibición por retroalimentación por
L-treonina, actividad treonina desaminasa atenuada y
puede usar sacarosa como fuente de carbono.
La cepa TDH6 de Escherichia coli (patente
japonesa abierta a consulta por el público n.º
2001-346578) transformada con genes que codifican
para enzimas de biosíntesis de treonina también puede usarse
preferiblemente como la bacteria productora de
L-treonina. La cepa TDH6 es deficiente en actividad
treonina deshidrogenasa, y se obtuvo eliminando pVIC40 que porta
los genes que codifican para las enzimas de biosíntesis de treonina
a partir de la cepa B-3996 (documento US5.631.157),
y se ha depositado en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos
Industriales (VKPM), (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd. 1) con
un número de registro de VKPM B-3420.
\newpage
Además, otros ejemplos de la bacteria productora
de L-treonina que pueden usarse para la presente
invención incluyen las siguientes cepas bacterianas:
MG-442 de Escherichia
coli (CMIMB-1628, patente estadounidense n.º
4.278.765)
VL334/pYN7 de Escherichia coli (patente
estadounidense n.º 4.278.765)
H-4225 de Escherichia
coli (FERM BP-1236, patente estadounidense n.º
5.017.483)
H-7256 de Escherichia
coli (FERM BP-2137)
DSM9807 de Escherichia coli
(KCCM-10168)
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se explicará más
específicamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin
embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se examinó el efecto de limitar
el azufre en el medio inicial del cultivo principal a una
concentración predeterminada o inferior durante la producción de
L-treonina en un cultivo semicontinuo.
Se cultivó la cepa VKPM B-5318
en un placa con medio agar LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto
de levadura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de agar) que contenía 20 mg/l de
sulfato de estreptomicina a 37ºC durante 24 horas y se rasparon de
la placa 1/10 de las células en la placa y se inocularon en 50 ml de
medio LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l
de NaCl) que contenía 20 mg/l de sulfato de estreptomicina en un
matraz con deflector para realizar un cultivo de siembra a 40ºC y
144 rpm durante 6 horas.
Tras la finalización del cultivo de siembra, se
inoculó el medio de cultivo de siembra en un volumen equivalente al
16% del volumen del medio de cultivo principal en un fermentador de
tanque de 1 l cargado con 300 ml del medio de cultivo principal y se
realizó el cultivo a 40ºC y pH 7,0. A continuación se muestra la
composición del medio de cultivo principal.
\vskip1.000000\baselineskip
Composición del medio de cultivo principal:
- Sacarosa
- 27 g/l
- Extracto de levadura
- 1,8 g/l
- KH_{2}PO_{4}
- 1,5 g/l
- NaCl
- 0,6 g/l
- MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 0,36 g/l
- FeSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 18 mg/l
- MnSO_{4}\cdot4H_{2}O
- 18 mg/l
- Sulfato de estreptomicina
- 20 mg/l
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió de manera apropiada sulfato de amonio
de modo que el contenido en azufre añadido inicialmente es de 0,78 a
0,10 g/l en cuanto al contenido en azufre.
Se ajustó el cultivo a pH 7,0 durante el cultivo
añadiendo gas amoniaco. Después de que se consumió el sacárido en el
medio, se añadieron 600 g/l de una disolución acuosa de sacarosa
para realizar un cultivo semicontinuo.
Tras 42 horas del cultivo, se determinó la
concentración de L-treonina mediante HPLC.
\newpage
Como resultado, el rendimiento de la
fermentación de L-treonina aumentó con una
disminución en azufre, y aumentó de manera notable, en particular, a
una concentración de azufre de 0,29 g/l o inferior tal como se
muestra en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, de la misma manera que en el
ejemplo 1, se cultivó la cepa VKPM B-5318 en un
placa con medio agar LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de
levadura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de agar) que contenía 20 mg/l de
sulfato de estreptomicina a 37ºC durante 24 horas, y se rasparon de
la placa 1/10 de las células bacterianas en la placa y se inocularon
en 50 ml de medio LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de
levadura, 5 g/l de NaCl) que contenía 20 mg/l de sulfato de
estreptomicina en un matraz con deflector para realizar un cultivo
de siembra a 40ºC y 144 rpm durante 6 horas.
Tras la finalización del cultivo de siembra, se
inoculó el medio de cultivo de siembra en un volumen equivalente al
16% del volumen del medio de cultivo principal en un fermentador de
tanque de 1 l cargado con 300 ml del medio de cultivo principal, y
se realizó el cultivo a 40ºC y pH 7,0. El medio de cultivo principal
tenía la misma composición que se usó en el ejemplo 1.
Se ajustó el cultivo a pH 7,0 durante el cultivo
añadiendo gas amoniaco. Después de que se consumió el sacárido en el
medio, se realizó la fermentación con la adición de un medio de
alimentación que contenía sacarosa, y se ajustó de modo que la
concentración de azufre en el medio de fermentación está a un nivel
predeterminado o inferior. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Se controló la concentración de azufre en el medio de alimentación
para que fuera de 0 a 1,22 g/l y se controló el cultivo de modo que
el medio de fermentación contiene de 0,144 a 0,548 g/l de azufre a
lo largo de todo el periodo de cultivo principal.
Como resultado, se confirmó que se mejoró el
rendimiento de L-treonina también en cultivo
semicontinuo regulando la concentración de azufre en el medio de
fermentación a 0,35 g/l o inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, el rendimiento de
la fermentación y la producción de L-treonina pueden
mejorarse en un método para producir L-treonina
mediante fermentación usando un microorganismo que pertenece al
género Escherichia que tiene la capacidad de producir
L-treonina.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para producir
L-treonina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C586-C6078
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2005-189106
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
29-06-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2006-119334
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-04-2006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5040
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)..(99)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor Sigma 70; predicho +1 inicio
en 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (104)..(132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor Sigma 70; predicho +1 inicio
en 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (139)..(219)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> factor Sigma 70; predicho +1 inicio
en 219
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (190)..(255)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido líder
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> atenuador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (273)..(307)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (337)..(2799)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> thrA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2801)..(3733)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> thrB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3734)..(5020)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> thrC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 820
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 428
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 66
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(66)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia líder
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (17)
1. Método para producir
L-treonina que comprende:
A) cultivar un microorganismo que pertenece al
género Escherichia que tiene la capacidad de producir
L-treonina, en un medio de fermentación que contiene
una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una fuente de
azufre,
B) recoger L-treonina del
cultivo, regulándose la concentración de azufre en el medio de modo
que es de 0,35 g/l o inferior.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el microorganismo es Escherichia coli.
3. Método según una cualquiera de la
reivindicación 1 ó 2, en el que se modifica una enzima de
biosíntesis de L-treonina en el microorganismo de
modo que la enzima no se somete a inhibición por retroalimentación
por
L-treonina.
L-treonina.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
la enzima de biosíntesis de L-treonina se selecciona
del grupo que consiste en aspartocinasa, homoserina cinasa, treonina
sintasa y combinaciones de las mismas.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la fuente de azufre se selecciona
del grupo que consiste en sulfatos, tiosulfatos, sulfitos, cisteína,
cistina, glutatión y combinaciones de los mismos.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el método de cultivo se selecciona
del grupo que consiste en un método de cultivo discontinuo, un
método de cultivo semicontinuo y un método de cultivo continuo.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
el método de cultivo es un método de cultivo semicontinuo o un
método de cultivo continuo y, en el que se añade un medio de
alimentación que contiene una fuente de azufre al cultivo en un
fermentador.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
dicho medio de alimentación contiene además una fuente de carbono y
un nutriente que tiene un efecto de estimulación del crecimiento y,
en el que se añade dicho medio de alimentación al cultivo en el
fermentador de manera continua o intermitente de modo que la
concentración de la fuente de carbono en el cultivo se mantiene a 30
g/l o inferior tras el final del crecimiento logarítmico del
microorganismo.
9. Método para producir aditivo para piensos a
base de un caldo de fermentación que comprende:
A) cultivar un microorganismo que pertenece al
género Escherichia que tiene la capacidad de producir
L-treonina, en un medio de fermentación que contiene
una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una fuente de
azufre,
B) realizar la fermentación regulándose la
concentración de azufre en el medio de modo que es de 0,35 g/l o
inferior,
C) secar el caldo de fermentación bruto hasta un
contenido en agua del 10% o inferior en peso.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Método según la reivindicación 9, en el que
el microorganismo es Escherichia coli.
11. Método según una cualquiera de la
reivindicación 9 ó 10, en el que se modifica una enzima de
biosíntesis de L-treonina en el microorganismo de
modo que la enzima no se somete a inhibición por retroalimentación
por
L-treonina.
L-treonina.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
la enzima de biosíntesis de L-treonina se selecciona
del grupo que consiste en aspartocinasa, homoserina cinasa, treonina
sintasa y combinaciones de las mismas.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, en el que la fuente de azufre se selecciona
del grupo que consiste en sulfatos, tiosulfatos, sulfitos, cisteína,
cistina, glutatión y combinaciones de los mismos.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13, en el que el método de cultivo se
selecciona del grupo que consiste en un método de cultivo
discontinuo, un método de cultivo semicontinuo y un método de
cultivo continuo.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
el método de cultivo es un método de cultivo semicontinuo o un
método de cultivo continuo y, en el que se añade un medio de
alimentación que contiene una fuente de azufre al cultivo en un
fermentador.
16. Método según la reivindicación 14, en el que
dicho medio de alimentación contiene además una fuente de carbono y
un nutriente que tiene un efecto de estimulación del crecimiento y,
en el que se añade dicho medio de alimentación al cultivo en el
fermentador de manera continua o intermitente de modo que la
concentración de la fuente de carbono en el cultivo se mantiene a 30
g/l o inferior tras el final del crecimiento logarítmico del
microorganismo.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 16, en el que se incluye más del 95% de
L-treonina en dicho aditivo alimentario.
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