ES2330320T3 - Proteina mia-2. - Google Patents

Abstract

Proteína MIA-2 humana caracterizada por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico y codificada por el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 o variantes del mismo, en la que las variantes tienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, con la condición de que a) estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según la secuencia SEC ID No. 1 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína que tiene actividad MIA-2, o b) estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y que codifican el mismo aminoácido o un aminoácido que tiene la misma actividad que el ácido nucleico de SEC ID No. 1, y c) cada proteína MIA-2 no está exclusivamente codificada por las bases 1-354 de la SEC ID No. 1 o fragmentos de la misma.

Description

Proteína MIA-2.

La presente invención se refiere a la proteína MIA-2 humana y murina, así como a los ácidos nucleicos que codifican esta proteína. La invención se refiere además a anticuerpos y aptámeros que se unen a esta proteína, así como a composiciones farmacéuticas y diagnósticas y su uso en la terapia y diagnóstico de cirrosis hepática, de fibrosis hepática o de metástasis/tumores hepáticos. La presente invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de un cultivo orgánico así como a su uso para la purificación de sangre.

La proteína MIA ("melanoma inhibitory activity" (actividad inhibidora de melanoma) también llamada CD-RAP "cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein" (proteína sensible al ácido retinoico derivada de cartílago)) expresada en condrocitos fue detectada y aislada por sus propiedades antiproliferativas in vitro en primer lugar en el sobrenadante del cultivo celular de células de melanoma. Después de purificar y secuenciar la proteína, mediante el uso del cebador degenerado por medio de RT-PCR, se clonó una parte del ADNc de MIA humana. Este fragmento de una longitud de 250 restos de ácido nucleico se empleó finalmente como sonda en un cribado de fagos, para aislar un clon de ADNc de MIA que codifica completamente (Blesch y col. 1995). Una búsqueda en bases de datos con esta secuencia no mostró entonces ninguna secuencia de genes homóloga. Actualmente se conocen las secuencias de MIA humana, murina, bovina, de rata y de pez cebra. La homología dentro de las proteínas es muy elevada, de manera que MIA es una proteína altamente conservada en la evolución (Fig. 1).

A partir de la secuencia de ADNc determinada se pudo deducir que MIA se traduce como una proteína precursora de 131 aminoácidos. La secuencia señal, una secuencia hidrófoba de 24 aminoácidos es responsable del transporte de la proteína en el retículo endoplasmático y se libera allí. A continuación, MIA es secretada por las células del espacio extracelular. La proteína madura consta de 107 aminoácidos y tiene un peso molecular de unos 11 kDa. Otros análisis de la proteína mostraron que MIA, además de la secuencia señal, posee otras cuatro zonas fuertemente hidrófobas y, estabilizada por dos puentes disulfuro intramoleculares, forma una estructura globular. Los sitios en los que MIA podría ser glicosilada (Asn-Gly-Ser/Thr; Ser-Gly) no son detectables en la proteína, de manera que es improbable una N- u O-glicosilación.

Para clarificar la importancia de MIA en el desarrollo de los condrocitos y su papel funcional, se generaron ratones de laboratorio deficientes en MIA ("knock-outs") (Moser y col., 2002 Mol Cell Biol. 2002 Mar; 22(5)1438-45).

Los ratones MIA -/- mostraron alteraciones en la organización de la matriz del cartílago, cuyo efecto en la integridad y estabilidad del cartílago fue analizado.

Hace poco tiempo se ha caracterizado la proteína OTOR homóloga de MIA (MIAL, FPD) (Cohen-Salmon y col., 2000; Rendtorff 30 y col., 2001; Robertson y col., 2000). OTOR muestra una expresión muy específica en cóclea y en el ojo. En los análisis realizados por el inventor se pudo mostrar que en los ratones deficientes ende MIA no se producía un aumento de la expresión de OTOR (Moser y col., 2002 Mol Cell Biol. 2002 Mar; 22 (5):1438-
45).

Es objeto de la patente EP 0909954 un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades del cartílago mediante la determinación de MIA, un reactivo adecuado para ello, así como el uso de anticuerpos frente a MIA para la comprobación de enfermedades del cartílago. Las secuencias de MIA-2 o su uso no se mencionan aquí.

Una parte de las secuencias de MIA-2 humana y murina se ha publicado ya (Bosserhoff, A.K. y Buettner, R; NCBI-Datenbank, Noviembre 2001 Bossehoff y col.: "Expression and Histopathology", vol. 17, Nº. 1, Enero 2002, páginas 289-300). Sin embargo, la publicación comprende solamente los pb 1-354 de la secuencia de MIA-2 humana o los pb 1-357 de la secuencia de MIA-2 murina. Las secuencias ya publicadas terminan respectivamente con el codón de parada TAA.

Por el contrario, la presente invención se basa en el objetivo de obtener una secuencia de MIA-2 que se pueda usar de forma ventajosa para el diagnóstico y terapia de diferentes lesiones hepáticas.

Este objetivo se alcanza mediante el objeto de las reivindicaciones independientes. En las reivindicaciones subordinadas se indican formas de realización ventajosas.

Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que la secuencia de MIA-2 codificante y la proteína expresada a partir de ella es mucho más larga que la secuencia ya publicada y se trata de un artefacto del codón de parada publicado. De forma inesperada, los inventores han conseguido, con la presente invención, aislar y secuenciar la mayor parte de la partes más grande de la proteína MIA-2.

Los primeros intentos del inventor mostraron una expresión selectiva de MIA-2 en el hígado murino. Esta expresión específica en el hígado se pudo confirmar también en el ser humano. Tras análisis detallados se pudo demostrar que el gen es expresado sobretodo por hepatocitos.

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El contenido de proteína MIA-2 en el hígado sirve tanto como medida del daño del tejido hepático como medida del rendimiento de la síntesis. Pruebas con a) sobrenadantes celulares de células transfeccionadas con plásmidos de expresión de MIA-2 y b) proteína MIA-2 recombinante mostraron en astrocitos hepáticos un efecto antiproliferativo y antifibrótico (la activación de astrocitos hepáticos (HSZ) es el evento clave de la fibrosis y la cirrosis hepáticas). Ensayos previos análogos con fibroblastos muestran también aquí un efecto antiproliferativo y antifibrótico. Esto apunta a un mecanismo de acción general y por tanto a un uso potencial también en tejidos no hepáticos. Mediante estimulación con diferentes citoquinas o excitación física inespecífica se pudo demostrar en modelos in vitro una elevada expresión de MIA-2 en planos ARN en una línea celular de hepatoma. Estos ensayos muestran que mediante un medio de citoquina modificado o un crecimiento reprimido, eventualmente también se puede conducir a las metástasis de tumores hepáticos a un aumento de la expresión de MIA-2.

Además, sorprendentemente se ha observado que MIA-2 es apropiada como marcador diagnóstico para la fase aguda de diferentes enfermedades (enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias como la enfermedad de Crohn, gastroenteritis, gastritis, espondilitis, miocarditis, reumatismo articular y enfermedades reumáticas). Se entiende por enfermedades infecciosas las enfermedades originadas por contagio, adhesión, invasión y multiplicación de microorganismos en un macroorganismo. En el marco de la presente invención, las enfermedades infecciosas más relevantes son la hepatitis, la tuberculosis, la malaria, la inflamación pulmonar, la borreliosis, la gripe, las infecciones por campylobacter, la gastroenteritis, la viruela, el ántrax y el tifus.

Durante una infección se produce un aumento rápido de determinadas proteínas en suero, las llamadas proteínas de fase aguda (APP). La concentración de estas APP puede ser de 10 a 100 veces superior a la concentración normal y permanece elevada durante la fase de la infección. Una de las APP más conocidas y más extendidas en clínica es la proteína C reactiva (CRP). A partir del aumento y la evolución de APP en el suero de pacientes se pueden extraer, entre otras cosas, conclusiones sobre la gravedad y la evolución de las enfermedades (infecciosas). También en algunas otras enfermedades, como las inflamaciones intestinales inflamatorias crónicas o las enfermedades reumáticas, se encuentran APP elevadas en ocasiones y se corresponden con la gravedad y la evolución de la enfermedad.

A partir del documento WO 01/75068 se conoce la secuencia de nucleótidos y aminoácidos para am728_60. El documento publica además, que esta secuencia de aminoácidos presenta un parentesco con MIA. Sin embargo, no se indica ninguna función de am728_60. La proteína se aisló de células renales, aunque no se describió una expresión específica en el hígado. Además se describen los anticuerpos dirigidos contra esta secuencia.

Ahora los inventores han descubierto que MIA2 también es una APP y como estas se puede detectar en el suero de los pacientes.

Según una primera idea fundamental, la presente invención se refiere a una proteína MIA-2 humana que se caracteriza por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico y que codifica por el ácido nucleico de SEC ID No. 1 o variantes del mismo, presentando las variantes una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, con la condición de que:

a)

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según SEC ID No. 1 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína con actividad MIA-2, o

b)

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a una degeneración del código genético y que codifican para el mismo aminoácido o un aminoácido que tiene la misma actividad que el ácido nucleico de SEC ID No. 1, y

c)

cada proteína MIA-2 no está exclusivamente codificada por las bases 1-354 de la SEC ID No. 1 o fragmentos de la misma.

Según otra idea fundamental, la presente invención proporciona una proteína MIA-2 murina que se caracteriza por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico y que codifica por el ácido nucleico de SEC ID No. 27 o variantes del mismo, presentando las variantes una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de la SEC ID No. 27 y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, con la condición de que:

a)

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según SEC ID No. 27 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína con actividad MIA-2, o

b)

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a una degeneración del código genético y que codifican para el mismo aminoácido o un aminoácido que tiene la misma actividad que el ácido nucleico de SEC ID No. 27, y

c)

cada proteína MIA-2 no está exclusivamente codificada por las bases 1-357 de la SEC ID No. 27 o fragmentos de la misma.

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La invención se refiere además a un ácido nucleico aislado humano, que comprende el ácido nucleico de SEC ID No. 1 o variantes del mismo, presentando las variantes una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de SEC ID No. 1 y codifican una proteína que se caracteriza por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico y con la condición de que:

a)

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según SEC ID No. 1 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína con actividad MIA-2, o

b)

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y que codifican para el mismo aminoácido o un aminoácido funcionalmente equivalente al ácido nucleico de SEC ID No. 1, y

c)

el ácido nucleico no consta exclusivamente a través de las bases 1-354 de la SEC ID No. 1 o fragmentos rotos de la misma.

Además, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado murino que comprende el ácido nucleico de la SEC ID No. 27 o variantes del mismo, presentando las variantes una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de SEC ID No. 27 y codificando para una proteína que se caracteriza por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, con la condición de que:

a)

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según SEC ID No. 27 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína con actividad MIA-2, o

b)

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a una degeneración del código genético y que codifican el mismo aminoácido o un aminoácido que tiene la misma actividad que el ácido nucleico de SEC ID No. 27, y

c)

el ácido nucleico no consiste exclusivamente en las bases 1-357 de la SEC ID No. 27 o fragmentos de la misma.

Las variantes de los ácidos nucleicos preparados según la invención también contienen fragmentos que comprenden más de 10, preferiblemente más de 15, más de 20, más de 25 o más de 30 y hasta 50 nucleótidos. El término oligonucleótido comprende fragmentos de 10 a 50 nucleótidos y partes de ellos. Estas secuencias se pueden preparar a partir de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos presentadas aquí, mientras éstas presenten al menos 10 nucleótidos consecutivos de las mismas. Estos oligonucleótidos se pueden emplear preferiblemente como cebadores, como se indica a continuación, por ejemplo, en RT-PCR.

Partiendo de las secuencias de ácidos nucleicos dadas a conocer anteriormente, el especialista puede comprobar mediante comparación, qué derivados y modificaciones procedentes de estos ácidos nucleicos son adecuados para procedimientos de detección, por ejemplo procedimientos de hibridación y de PCR, y cuáles no son apropiados o lo son menos. Los ácidos nucleicos y oligonucleótidos de la invención también se pueden encontrar, por ejemplo, en secuencias de ADN o ARN mayores, por ejemplo, flanqueadas por sitios de corte de enzimas de restricción.

En la técnica actual se conocen procedimientos de amplificación y detección. Sólo a modo de ejemplo remitimos aquí a los manuales de laboratorio conocidos por el especialista, que describen esta metódica, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press y todas las ediciones siguientes. Los procedimientos de PCR se describen, p. ej., en Newton, PCR, BIOS Scientific Publishers Limited, 1994 y ediciones siguientes.

Como se define arriba, se entiende en particular como "variantes" según la invención aquellos ácidos nucleicos en los que existen una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con los ácidos nucleicos definidos en SEC ID No. 1 y 27. En estos faltan preferiblemente al menos 1, o también 2, 3, 4 o más nucleótidos en uno o ambos extremos de los ácidos nucleicos o también en el interior de los ácidos nucleicos o están sustituidos por otros nucleótidos.

Los ácidos nucleicos de la presente invención comprenden también ácidos nucleicos que presentan secuencias esencialmente equivalentes a los ácidos nucleicos de las SEC ID No. 1 y 27. Los ácidos nucleicos según la invención, por ejemplo, pueden presentar al menos aproximadamente el 80%, típicamente al menos aproximadamente el 90% o el 95% de identidad de secuencia respecto a los ácidos nucleicos de SEC ID No. 1 y 27.

El término "secuencia de ácido nucleico" se refiere a un heteropolímero de nucleótidos o a la secuencia de estos nucleótidos. El término "ácido nucleico", como se usa aquí, comprende ARN, ADN, incluido ADNc, ADN genómico y sintético (o sintetizado químicamente), así como bases unidas a otros polímeros, como APN.

La invención también comprende, como se indica arriba, aquellas variantes que se hibridan con los ácidos nucleicos según la invención bajo condiciones astringentes.

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Se entiende por condiciones astringentes de hibridación y lavado en general, las condiciones de reacción bajo las que se obtienen sólo moléculas dúplex entre los oligonucleótidos y las moléculas objetivo deseadas (híbridos perfectos) o sólo se detecta el organismo objetivo deseado. Se entiende por condiciones astringentes de hibridación, en particular 0,2 x SSC (NaCl 0,03 M, citrato sódico 0,003 M, pH 7) a 65ºC. Para fragmentos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos de hasta 20 nucleótidos, la temperatura de hibridación se encuentra por debajo de 65ºC, por ejemplo sobre los 55ºC, preferiblemente sobre los 60ºC, aunque por debajo de 65ºC. Las condiciones astringentes de hibridación dependen del tamaño y la longitud del ácido nucleico y de su composición de nucleótidos y deben ser determinadas por el especialista mediante pruebas. Se consiguen condiciones astringentes moderadas, por ejemplo, a 42ºC y lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42ºC.

Las condiciones respectivas de temperatura pueden ser diferentes, dependiendo de las condiciones de ensayo seleccionadas y de las muestras de ácidos nucleicos estudiadas y por tanto se deben ajustar correspondientemente. La detección del producto de hibridación se puede realizar, por ejemplo, por autoradiografía en el caso de moléculas con marcador radioactivo o por fluorimetría cuando se utilizan moléculas con marcador fluorescente.

El especialista puede ajustar según proceda las condiciones al procedimiento de ensayo seleccionado, para conseguir condiciones astringentes moderadas y permitir un procedimiento de detección específico. Las condiciones de astringencia apropiadas se pueden determinar, por ejemplo, según hibridaciones de referencia. Se debe emplear una concentración apropiada de ácido nucleico u oligonucleótido. La hibridación debe tener lugar a una temperatura apropiada (cuanto mayor es la temperatura, más débil es el enlace de los híbridos).

Los fragmentos de los ácidos nucleicos según la invención se pueden emplear, por ejemplo, como cebadores oligonucleótido en el procedimiento de detección y el procedimiento de amplificación de los genes MIA-2 y los transcriptos génicos. El especialista puede emplear estos oligonucleótidos en procedimientos conocidos. Para ello, el ADN o el ARN de una muestra, en presencia de los mencionados genes/transcriptos génicos a estudiar, se pone en contacto con los correspondientes cebadores oligonucleótido. A continuación tiene lugar la detección del ARN o el ADN de la muestra, por ejemplo mediante técnicas PCR, que muestran la presencia de secuencias de ADN y/o ARN específicas. Todos los oligonucleótidos mencionados anteriormente se pueden emplear también como cebadores para una transcripción reversa de ARNm.

El procedimiento PCR tiene la ventaja que se pueden detectar cantidades de ADN muy pequeñas. Las condiciones de temperatura y el número de ciclos de PCR se seleccionan según el material a detectar. Las condiciones de reacción óptimas se pueden determinar de la forma conocida mediante ajustes manuales.

Los fragmentos marcadores de ADN específicos, característicos, aparecidos en el curso de la amplificación PCR a través de la extensión de secuencias cebadoras, se pueden detectar por electroforesis de gel o fluorimétricamente mediante el uso de oligonucleótidos con marcador de fluorescencia. Naturalmente, también se pueden emplear otros procedimientos de detección conocidos por el especialista.

El ADN o ARN, en particular el ARNm, de las muestras que se quieren estudiar se puede encontrar, tanto en la reacción de PCR o RT-PCR como en la reacción de hibridación, bien en forma extraída o en forma de mezclas complejas en las que el ADN o ARN que se quiere estudiar forma sólo una muy pequeña proporción de la fracción de la muestra biológica especial. Con ello, las células que se quieren estudiar se pueden encontrar en forma purificada o por ejemplo "impurificadas" en el conjunto del tejido. Con los oligonucleótidos aquí descritos se pueden realizar tanto PCR in situ como RT-PCR.

En RT-PCR se emplean los oligonucleótidos de la invención para la amplificación PCR de fragmentos en matrices de ADNc, que se obtienen tras una transcripción reversa de muestras de ARNm. Entonces la expresión se puede valorar cualitativa y cuantitativamente, junto con patrones y técnicas apropiados, como un patrón interno y PCR cuanti-
tativo.

Según una forma de realización de la invención, el ácido nucleico aislado según la invención también se une de forma funcional con una o varias secuencias reguladoras. De forma especialmente preferible se emplea el promotor de MIA-2 humano según SEC ID No. 2. Un fragmento especialmente preferible del promotor, que también es específico del hígado, comprende las bases 2241-3090 de SEC ID No. 2.

La presente invención comprende además productos de transcripción de los ácidos nucleicos mencionados anteriormente, así como ácidos nucleicos que hibridan selectivamente bajo condiciones astringentes en uno de estos productos de transcripción. Por tanto, se trata de un ADN o ARN antisentido en forma de una sonda de ADN o ARN que hibrida en un producto de transcripción, por ejemplo, ARNm y por tanto es apropiado para fines de detección.

El término "sonda", como se define aquí, viene definido por un ácido nucleico que es capaz de unirse a un ácido nucleico objetivo de una secuencia complementaria mediante uno o varios tipos de enlaces químicos, normalmente a través de apareamiento de bases complementarias, realizándose generalmente mediante enlaces de puente de hidrógeno.

Para la detección, los ácidos nucleicos según la invención presentan preferiblemente un marcaje. Ejemplos de ello son un marcaje radioactivo, marcaje de fluorescencia, marcaje con biotina, marcaje con digoxigenina, marcaje con peroxidasa o marcaje detectable con fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina se emplea como enzima marcador ya que en combinación con sustancias apropiadas permite desarrollar un reactivo colorante histoquímico sensible y un sistema de refuerzo de la señal. Los sustratos como por ejemplo p-nitrofenilfosfato, tras la rotura hidrolítica a través del enzima, producen productos de reacción coloreados, fáciles de medir fotométricamente.

En otra forma de realización de la invención, los ácidos nucleicos se encuentran unidos a una matriz de fase sólida, por ejemplo, una membrana de nylon, vidrio o plástico.

Además de los cebadores indicados arriba, para la amplificación se pueden emplear los ácidos nucleicos humanos según SEC ID No. 1, sus variantes o los productos de transcripción de los mismos, los cebadores directos o reversos según SEC ID No. 3, 4, 9 o 26. De forma análoga, para la amplificación se pueden emplear los ácidos nucleicos murinos según SEC ID No. 27, sus variantes o los productos de transcripción de los mismos, los cebadores directos o reversos según SEC ID No. 3, 7, 9 o 26. Para la amplificación del promotor de MIA-2 se pueden emplear uno o varios ácidos nucleicos según SEC ID No. 10-18.

Según otra idea fundamental, la invención se refiere a la proteína MIA-2 humana, que comprende los aminoácidos de SEC ID No. 5 o una variante de estos aminoácidos, presentando las variantes una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con los aminoácidos de SEC ID No. 5 y en que la actividad biológica de la proteína es esencialmente la misma que la actividad de la proteína MIA-2, que comprende la secuencia no modificada de SEC ID No. 5, y se caracteriza por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, no consistiendo las variantes exclusivamente en los restos aminoácido 1-119 de SEC ID No. 5.

Sin embargo, se debe tener en cuenta que la presente invención, en sus aspectos terapéuticos y diagnósticos (ver abajo), se dirige respectivamente a la secuencia completa de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos publicadas aquí, o a fragmentos de ellas, comprendiendo estos fragmentos, entre otros, también los restos aminoácido 1-119 (humano o murino) o la secuencia de ácidos nucleicos 1-354 (humana) y 1-357 (murina).

La invención se refiere además a una proteína MIA-2 murina que comprende los aminoácidos de SEC ID No. 28 o una variante de estos aminoácidos, presentando las variantes una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con los aminoácidos de SEC ID No. 28 y en que la actividad biológica de la proteína es esencialmente la misma que la actividad de la proteína MIA-2, que comprende la secuencia no modificada de SEC ID No. 8, y se caracteriza por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, no consistiendo las variantes exclusivamente en los restos aminoácido 1-119 de SEC ID No. 28.

En particular, se tienen en cuenta también en el ámbito de la presente invención las variantes de la secuencia de aminoácidos, como por ejemplo deleciones, inserciones y/o sustituciones en la secuencia que producen las llamadas modificaciones "silenciosas" (silent changes) en la molécula de proteína resultante.

Como ejemplo de ello se tienen en cuenta las modificaciones en la secuencia del ácido nucleico que tienen como consecuencia la producción de un aminoácido equivalente en un lugar prefijado. Son preferibles las sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido con propiedades químicas y/o estructurales similares, es decir, sustituciones conservativas de aminoácidos.

Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar basándose en similitudes en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza amfipática (anfífila) de los restos involucrados. Son ejemplos de aminoácidos no polares (hidrófobos), alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) comprenden arginina, lisina e histidina. Y los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido asparagínico y ácido glutámico.

Las "inserciones" o "deleciones" se mueven típicamente en el intervalo de uno a cinco aminoácidos. El grado de variación permitido se puede determinar experimentalmente mediante inserciones, deleciones o sustituciones sistemáticas de aminoácidos en una molécula de polipéptido mediante el uso de técnicas de recombinación de ADN y mediante el estudio de las variantes recombinantes obtenidas en lo referente a su actividad biológica.

Las modificaciones de nucleótidos que tienen como consecuencia una modificación de los fragmentos N terminales y C terminales de la molécula de proteína, a menudo no cambian la actividad de la proteína, porque normalmente estos fragmentos no están implicados en la actividad biológica. Además, puede ser deseable eliminar una o varias de las cisteínas presentes en la secuencia, porque la presencia de cisteínas puede tener como consecuencia la formación no deseada de multímeros cuando las proteínas se obtienen de forma recombinante, lo que complica el procedimiento de purificación y cristalización. Cada una de las modificaciones recomendadas se mueve en el ámbito de los conocimientos técnicos y científicos, igual como la determinación de la conservación de la actividad biológica de los productos codificados.

Según otra idea fundamental, la presente invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico según la invención. Este vector es preferiblemente un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la invención y una o varias secuencias reguladoras.

Se conocen numerosos vectores apropiados para el uso en la transformación de células bacterianas, por ejemplo, los vectores empleados más frecuentemente para huéspedes bacterianos son plásmidos y bacteriófagos, como por ejemplo el fago l. Tanto en células de mamífero como de insecto se pueden emplear, por ejemplo, vectores virales para la expresión de un fragmento de ADN exógeno. Ejemplos de vectores son SV40 o virus polioma.

Alternativamente, la transformación de las células huésped se puede realizar directamente mediante "ADN desnudo", sin usar un vector.

La producción de la proteína según la invención se puede realizar en células eucariotas o en células procariotas. Son ejemplos de células eucariotas las células de mamíferos, plantas, levaduras e insectos. Son células procariotas adecuadas E. Coli y Bacilus subtilis.

Las células huésped de mamíferos preferidas son células CHO, COS, HeLa, 293T, HEH o BHK o células madre adultas o embrionarias, excluyendo células madre embrionarias humanas.

Según otra idea fundamental, la presente invención se refiere a un anticuerpo o aptámero que se dirige contra un epítopo de la proteína MIA-2 murina según la invención.

El anticuerpo se selecciona preferiblemente del grupo que consta de un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo sintético.

El anticuerpo según la invención puede estar unido además a un medio tóxico y/o detectable.

El término "anticuerpo", como se usa aquí, se refiere a anticuerpos intactos, así como a fragmentos de anticuerpo que mantienen cierta capacidad de unirse selectivamente a un epítopo. Los fragmentos de este tipo incluyen, sin limitación, fragmentos de anticuerpo Fab, F(ab')2 y Fv. El término "epítopo" se refiere a cada determinante antigénico sobre un antígeno al que se une un parátopo de un anticuerpo. Los determinantes epítopo constan normalmente de grupos superficiales de moléculas químicamente activas (por ejemplo restos aminoácido o azúcar) y presentan normalmente propiedades estructurales tridimensionales, así como propiedades especiales de carga.

Los anticuerpos según la invención se pueden preparar mediante el uso de cualquier procedimiento conocido. Por ejemplo, se puede disponer de la proteína pura según la invención o un fragmento de la misma y usarlo como inmunógeno para desencadenar una reacción inmune en un animal, que produce anticuerpos específicos.

La producción de anticuerpos policlonales es bien conocida por el especialista. Véase por ejemplo Green y col., Production of Polyclonal Antisera, en Immunochemical Protocols (Manson, Herausgeber), páginas 1 - 5 (Humana Press 1992) y Coligan y col., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, en Current Protocols In Immunology, sección 2.4.1 (1992). Adicionalmente, son conocidas por el especialista diferentes técnicas de inmunología para la purificación y concentración de anticuerpos policlonales, así como anticuerpos monoclonales (Coligan y col., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994).

La preparación de anticuerpos monoclonales también es conocida por el especialista. Véase por ejemplo Köhler & Milstein, Nature 256: 495 (1975); Coligan y col., secciones 2.5.1 - 2.6.7; y Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, página 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988). En resumen, se pueden obtener anticuerpos monoclonales inyectando a ratones una composición que contiene la proteína según la invención, después se verifica la presencia de una producción de anticuerpos mediante el análisis de una muestra de suero, se extrae el bazo para la obtención de linfocitos B y estos linfocitos B se fusionan con células de mieloma para la producción de hibridomas, los hibridomas se clonan, se seleccionan los clones positivos que producen un anticuerpo monoclonal contra la proteína y se aíslan los anticuerpos a partir de los cultivos de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar a partir de cultivos de hibridoma mediante numerosas técnicas plenamente establecidas. Estas técnicas de aislamiento incluyen una cromatografía de afinidad por proteína A-sefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico. Véase por ejemplo Coligan y col., secciones 2.7.1 - 2.7.12 y sección "Immunglobulin G (IgG)", en Methods In Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79 - 104 (Humana Press 1992).

Además, según otra idea fundamental, la presente invención proporciona una célula de hibridoma producida como se describe anteriormente, que produce un anticuerpo monoclonal que presenta una especificidad de unión para una proteína MIA-2 según la invención.

La invención comprende además una composición farmacéutica que contiene un ácido nucleico según la invención, un vector según la invención, una proteína, anticuerpo o aptámero como principio activo en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los principios activos de la presente invención se usan preferiblemente en forma de una composición farmacéutica en la que se mezclan con vehículos o excipientes apropiados, para tratar o aliviar la enfermedad. Una composición de este tipo puede contener (adicionalmente a los principios activos y excipientes) agentes diluyentes, materiales de carga, sales, tampones, estabilizadores, agentes solubilizantes y otros materiales, plenamente conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" se define como un material no tóxico, que no altera la actividad de las sustancias activas del contenido o del principio activo. La elección del excipiente depende de la vía de administración.

La composición farmacéutica puede contener adicionalmente otros medios que aumentan la actividad del principio activo o completan su actividad o uso en el tratamiento. Los factores y/o medios adicionales de este tipo pueden estar incluidos en la composición para obtener una acción sinérgica o para minimizar efectos secundarios o efectos no deseados.

Las técnicas para la formulación o preparación y administración de los compuestos de la presente solicitud se encuentran en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición. Una dosis terapéutica efectiva se refiere además a una cantidad del compuesto que es suficiente para conseguir una mejora de los síntomas, por ejemplo un tratamiento, curación, prevención o mejora este tipo de condiciones. Las vías de administración apropiadas incluyen la administración oral, rectal, transmucosa o intestinal y la administración parenteral, incluyendo las inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como las inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales o intranasales. Es preferible la administración intravenosa a un paciente.

Una composición típica para una infusión intravenosa se puede preparar de manera que contenga 250 ml de solución de Ringer estéril y por ejemplo 10 mg de proteína MIA-2. Véase Remington's Pharmaceutical Science (15ª edición, Mack Publishing Company, Easton, Ps., 1980).

Las composiciones que contienen los presentes principios activos o una mezcla de ellos pueden ser administradas para un tratamiento profiláctico y/o terapéutico.

Para una aplicación terapéutica se administra la composición a un paciente que ya está aquejado de una enfermedad hepática, por ejemplo, una enfermedad hepática como cirrosis hepática, fibrosis hepática o una metástasis/tumor hepático. Las proteínas/ácidos nucleicos según la invención han demostrado ser extraordinariamente apropiadas para el tratamiento de la cirrosis hepática y la fibrosis hepática. EL gen MIA-2 según la invención y la proteína MIA-2 expresada a partir del mismo presentan en particular en el hígado, aunque también en otros tejidos como el bazo y el intestino delgado (véase tabla 1) un excelente efecto antiproliferativo y antifibrótico. Para obtener información más detallada diríjanse a la parte experimental de la solicitud.

Una cantidad, que es adecuada para alcanzar los efectos mencionados anteriormente, se define como "dosis terapéutica eficaz". Las cantidades que son efectivas para esta aplicación, dependen del grado de gravedad de la dolencia y del estado general del propio sistema inmunitario del paciente, aunque en general se encuentran entre aproximadamente 0,01 a 100 mg de proteína por dosis, usándose normalmente dosificaciones de 0,1 a 50 mg y de 1 a 10 mg por paciente. Se pueden realizar administraciones simples o múltiples, según un plan de tratamiento diario, semanal o mensual, con intensidades y patrones de dosis seleccionadas por el médico que realiza el tratamiento.

Una composición farmacéutica que contiene la proteína MIA-2 en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, puede presentar a elección otros principios activos, como por ejemplo interferones, inhibidores del sistema ACE o ligandos del receptor-g activado por proliferación (PPAR-g), que mejoran al acción antifibrótica de la proteína MIA-2.

Según otra idea fundamental, la invención comprende además una composición diagnóstica que contiene anticuerpos y aptámeros según la invención.

La invención se refiere además a un mamífero transgénico no humano en el que se inactivan una o varias de las secuencias MIA-2 según la invención. Mediante el uso de la tecnología de la recombinación homóloga se puede establecer un modelo animal knock-out que

\hbox{proporcione otros conocimientos en la etiología de las 
alteraciones hepáticas, etc.}

Preferiblemente, la invención comprende un ratón transgénico en el que un ácido nucleico según la invención ha sido inactivado de forma condicional. Esto representa un caso especial en la tecnología Knock-Out. Las aplicaciones anteriores de la tecnología Knock-Out tienen como resultado fundamentalmente una inactivación constitutiva del gen que se quiere estudiar. Por eso, preferiblemente en la presente invención se usa un sistema específico del tipo de célula y regulable en el tiempo, que permite una inactivación condicional de un gen en un tejido o tipo de célula determinado, en un determinado momento. Para la inactivación condicional del gen se usa por un lado un promotor específico, que inactiva el gen deseado sólo en las células seleccionadas. Para ello, por ejemplo el promotor de MIA-2 se fusiona con una recombinasa, por ejemplo Cre a nivel de ADN. Esta construcción se usa para la preparación de mamíferos transgénicos que a continuación expresan esta recombinasa específicamente en el hígado. Los genes que se deben desactivar de forma específica para el tejido se clonan de manera que son flanqueados por secuencias de reconocimiento específicas para la recombinasa, en el caso de Cre por secuencias Iox y después se transfieren a las células ES mediante la tecnología Knock-Out. Los mamíferos resultantes de ello se cruzan con mamíferos que expresan la recombinasa, lo que conduce a la deleción específica de tejido del gen que se quiere estudiar. Mediante el uso del promotor de MIA-2 se pueden inactivar específicamente en el hígado los genes que se quieren estudiar.

Además, la presente invención comprende un mamífero transgénico en cuyo genoma se ha insertado un ácido nucleico según la invención. Por ejemplo, el promotor según la invención se puede combinar con otros ADNc. Mediante el promotor de MIA-2 se pueden sobreexpresar en el hígado otros ADNc, también aquellos que no existen naturalmente en el hígado, y se puede analizar su función. Estos métodos se pueden utilizar para la validación de dianas y la identificación de nuevos terapéuticos potenciales para el hígado.

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Según otra idea fundamental, la presente invención se refiere a un procedimiento ex vivo para el diagnóstico de daño hepático o para la determinación del rendimiento de la síntesis hepática, que comprende las etapas siguientes:

a)

proporcionar una muestra de tejido hepático o suero o una biopsia de un paciente,

b)

determinar cualitativa y/o cuantitativamente los productos de transcripción, tal y como se definen anteriormente, en la muestra, o los productos de transcripción de un ácido nucleico, que comprende los ácidos nucleicos de SEC ID No. 1 ó 27 o variantes de los mismos, presentando las variantes una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con los ácidos nucleicos de SEC ID No. 1 ó 27, con la condición de que:

-

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC ID. No. 1 ó 27 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína con una actividad MIA-2, o

-

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y que codifican el mismo aminoácido o un aminoácido funcionalmente equivalente al ácido nucleico, como el ácido nucleico de SEC ID. Nº 1 ó 27,

en que una sobreexpresión del producto de transcripción indica un daño hepático y/o un aumento del rendimiento de la síntesis hepática.

Preferiblemente, la determinación se realiza en la etapa b), por transferencia Northern, hibridación in situ o RT PCR o una combinación de los mismos. Para más información, véase también McPherson y col. (Hrsg.), PCR, A practical Approach, Oxford, IRL Press 1995.

Una RT PCR se realiza preferiblemente con los cebadores de la SEC ID No. 3 y 9 (MIA-2 humana) o 3 y 7 (MIA-2 murina).

Además, se puede realizar una determinación de MIA-2 mediante el uso de una composición diagnóstica descrita anteriormente, que presenta anticuerpos o aptámeros anti-MIA-2 o sondas de ARN o ADN específicas de MIA-2. Esto se expone a continuación:

Un procedimiento ex vivo según la invención para el diagnóstico de un daño hepático o para la determinación del rendimiento de la síntesis hepática comprende las etapas siguientes:

a)

proporcionar una muestra de tejido hepático o suero o una biopsia de un paciente,

b)

poner en contacto la muestra con un reactivo capaz de detectar la proteína MIA-2 según la SEC ID No. 5 ó 28 o una variante de estos aminoácidos, presentando la variante una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con los aminoácidos de la SEC ID No. 5 ó 28, y en que la actividad biológica de la proteína es esencialmente igual a la actividad de la proteína MIA-2, que comprende la secuencia no modificada de la SEC ID No. 5 ó 28 y estando caracterizada por una expresión específica en el hígado y una acción antiproliferativa y antifibrótica,

c)

determinar cualitativa y/o cuantitativamente la proteína MIA-2 en la muestra, en que la presencia y la cantidad de la proteína MIA-2 hace referencia al daño hepático y/o a un aumento del rendimiento de la síntesis hepática.

Según una forma de realización preferible, el reactivo es un anticuerpo que está dirigido contra un epítopo de la proteína MIA-2.

Este anticuerpo se selecciona preferiblemente del grupo consistente en un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo sintético, y preferiblemente está unido a un medio detectable.

En particular, los procedimientos de diagnóstico mencionados arriba se emplean para un potencial daño hepático, como una cirrosis hepática, fibrosis hepática o una metástasis/tumor hepático.

La composición farmacéutica según la invención se emplea en particular en la terapia antifibrótica, ver más arriba, aunque en particular en el tratamiento de la cirrosis hepática o la fibrosis hepática o en el tratamiento de metástasis/tumores hepáticos.

Un procedimiento para la preparación de un cultivo orgánico puede comprender las etapas siguientes:

a)

proporcionar hepatocitos de mamífero en un medio de crecimiento

b)

poner en contacto los hepatocitos de mamífero con una proteína MIA-2 como se define arriba

c)

aislar el cultivo orgánico producido.

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En la etapa a) se emplean en particular hepatocitos humanos o porcinos.

El cultivo orgánico así producido se puede emplear de forma ventajosa para la purificación sanguínea ex vivo de pacientes que a causa de un daño hepático presentan una función hepática insuficiente.

La presente invención se describe a continuación según varias figuras y los ejemplos adjuntos, que sin embargo no limitan el alcance de la invención, sino que solamente la ilustran.

La Figura 1 muestra una comparación de las secuencias de ADNc de MIA, OTOR, MIA-2 y TANGO humanas.

a)

alineación de la secuencia de cuatro secuencias ADNc homólogas de MIA.

b)

homología entre los miembros de la familia genética MIA a nivel ADNc, representado como árbol genealógico. El árbol ha sido construido usando el programa DNAman basándose en la alineación de la región codificante completa. La longitud de cada línea horizontal es proporcional al grado de divergencia de la secuencia de ADNc.

La Figura 2 muestra una comparación de las secuencias peptídicas de MIA, OTOR, MIA-2 y TANGO humanas.

a)

alineación de la secuencia de cuatro secuencias homólogas de aminoácidos MIA. Los restos cistina conservados se marcan con un recuadro. Los restos marcados con un asterisco (*) son importantes para el núcleo hidrófobo del dominio SH3.

b)

Kyte-Dolittle analiza la hidrofobia de los homólogos de la proteína MIA. La columna muestra las secuencias señal de elevada hidrofobia.

La Figura 3 muestra una comparación entre todas las secuencias disponibles de la familia genética MIA

a)

la homología entre todos los miembros de la familia genética MIA al nivel de las proteínas se representa como un árbol genealógico. Las especies se abrevian como sigue: h = humana, b = bovina, m = murina, r = rata, bf = rana toro, c = gallina. El árbol ha sido construido usando el programa DNAman basándose en la alineación de la secuencia de aminoácidos derivada. Para excluir los efectos perjudiciales de los péptidos señal N-terminales variables, sólo se compararon las secuencias de la proteína madura. Tetraodin-MIA y pez cebra TANGO sólo están disponibles como clones parciales.

b)

comparación de aminoácidos de todos los miembros disponibles de las familias del gen MIA. Las secuencias de aminoácidos se indican en código de una letra, los números muestran los restos respecto al aminoácido inicial de la proteína madura sin la secuencia señal. En las filas inferiores se muestran restos idénticos; las similitudes se señalan mediante *.

c)

Kyte-Dolittle muestra la estructura completa altamente conservada en diferentes especies.

La Figura 4 muestra la organización genómica de la familia humana de genes MIA.

La estructura intrón-exón se ha construido mediante el ajuste de la secuencia de ADNc a la región genómica equivalente. Los exones e intrones se representan respectivamente mediante recuadros o líneas. La cantidad de recuadros muestra la longitud de cada exón. La secuencia genómica TANGO humana aún está incompleta.

La Figura 5 muestra la hibridación in-situ de ARN en secciones de embriones de ratón (día 12,5 y 14,5 del estado embrionario).

La Figura 6 muestra la influencia de MIA-2 en la proliferación de HSZs activadas.

La Figura 7 muestra la detección de la expresión de MIA 2 mediante RT-PCR en diferentes tejidos humanos y murinos.

La Figura 8 muestra la expresión de MIA 2 en hepatocitos humanos primarios.

Figura 9: en pacientes de hepatitis con fibrosis leve se expresa significativamente menos MIA-2 que en pacientes de hepatitis con fibrosis avanzada.

Figura 10: Se ha aislado ARN de hepatocitos humanos primarios y se ha analizado la expresión de ARNm para MIA-2, antitripsina alfa-1 (alfa1-AT), macrogobulina alfa-2 (alfa2-MG), glicoproteína ácida alfa-1 (alfa1-AG) y antiquimotripsina alfa-1 (alfa1-ACT) mediante PCR semicualitativo. Para el análisis de RT-PCR se han empleado respectivamente 1 ml de la misma preparación de ADNc. La PCR ha transcurrido en 28 ciclos.

Secuencias cebadoras

alfa1-AT dir: GGG AGA GAC CCT TTG AAG TCA (SEQ ID NO: 29)

y alfa1-AT rev: AAG AAG ATG GCG GTG GCA T; (SEQ ID NO:30)

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alfa2-MG dir: CAG TGG AGA AGG AAC AAG CG (SEQ ID NO:31)

y alfa2-MG rev: TTGGTG GCA GTT TCA GGG ATA; (SEQ ID NO:32)

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\vskip1.000000\baselineskip

alfa1-AG dir: ACA CCA CCT ACC TGA ATG TCC (SEQ ID NO:33)

y alfa1-AG rev: ACT CTC CCA GTT GCT CCT TG; (SEQ ID NO:34)

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\vskip1.000000\baselineskip

alfa1-ACT dir: GCC CAT AAT ACC ACC CTG ACA (SEQ ID NO:35)

y alfa1-ACT rev: TAC AGC CTC TTG GCA TCC TC. (SEQ ID NO:36).

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En general, los enfoques terapéuticos según la invención se pueden describir como sigue:

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a) Marcadores de fibrosis/Parámetro para lesiones hepáticas

Tanto para la terapia como para la predicción del curso de enfermedades hepáticas y por tanto, entre otros, también para los estudios de cribado y previsión, es de una importancia decisiva conocer la dimensión de la enfermedad hepática. La dimensión de la inflamación y la dimensión de la fibrosis son medidas decisivas del daño del tejido hepático. El patrón por excelencia y en definitiva también el único parámetro fiable existente hasta el momento para estos planteamientos es el análisis histológico de, por ejemplo, tejido hepático extraído mediante biopsia. Sería deseable, ya que para los pacientes sería esencialmente menos molesto, el análisis de los correspondientes parámetros del suero como parámetros fiables para la medida de la inflamación y la fibrosis hepática. También para los análisis de evolución, por ejemplo para los controles de reacción a la terapia, estos parámetros serían de una importancia decisiva, ya que aquí no es posible una extracción repetida de tejido.

Hasta el momento no existen parámetros de fibrosis con suficiente sensibilidad y especificidad, que permitan y justifiquen una aplicación en clínica.

Las transaminasas en suero, por ejemplo, en enfermedades hepáticas virales crónicas, reflejan sólo de forma insuficiente, y en muchos pacientes no lo hacen en absoluto, la medida de la reacción de inflamación hepática.

La reacción de fibrotización como correlación para una "cicatrización" tras la lesión o irritación del tejido transcurre de forma relativamente uniforme generalmente en la mayoría de tejidos y como reacción a diferentes agentes nocivos. Así, la fibrotización aparece, por ejemplo, en los riñones, los pulmones, el intestino o en la piel a consecuencia de inflamaciones crónicas. También en estas enfermedades o sistemas orgánicos es válido lo mismo que en las enfermedades hepáticas: 1) El conocimiento de la medida de la fibrosis es importante para las estrategias de prevención y tratamiento 2) para ello serían de ayuda los parámetros serológicos, pero no existen en la forma apropiada.

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b) Marcador tumoral

Una de las complicaciones más graves de las enfermedades hepáticas avanzadas es la aparición del carcinoma hepatocelular (HCC), que muy a menudo conduce a la muerte (es la 4ª causa más frecuente de muerte por cáncer). También los tumores extrahepáticos metastatizan a menudo en el hígado. El cribado de dichos tumores o metástasis se realiza en este momento de forma suficiente sólo mediante el correspondiente diagnóstico por imágenes. La confirmación del diagnóstico se realiza exclusivamente mediante biopsia y examen histológico de los procesos correspondientes. Sería deseable disponer de parámetros fiables del suero, tanto para el cribado como para el diagnóstico. Para las metástasis de tumores extrahepáticos no hay nada de este tipo, para los tumores hepáticos (carcinoma hepatocelular HCC) sólo hay, por ejemplo con la AFP (alfa-feto-proteína), parámetros con sensibilidad y especificidad insuficientes (Lun-Xiu Qin, Zhao-You Tang, World J Gastroenterol 2002; 8(3):385-392; Matsumura M y col. J Hepatol 1999; 31:332-339). Por tanto, la secuencia MIA-2 preparada desde ahora según la presente invención puede servir como un excelente marcador tumoral.

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c) Terapia antifibrótica

Actualmente, la única terapia antifibrótica eficaz para enfermedades hepáticas crónicas es la interrupción de la causa patofisiológica de la enfermedad. No existen formas de terapia seguras para contener el avance de la fibrotización hepática ante agentes nocivos persistentes o para hacer retroceder una fibrosis o cirrosis hepática ya manifiesta.

Como se describe abajo en a), también es válida una analogía para otros sistemas orgánicos diferentes del hígado. Aquí también faltan buenas estrategias terapéuticas antifibróticas y las estrategias terapéuticas potenciales para enfermedades hepáticas se podrían emplear también en otros sistemas orgánicos.

Como se ha indicado, actualmente para los ámbitos de aplicación mencionados

a)

marcadores de fibrosis

b)

marcadores para daño/rendimiento de síntesis hepáticos

c)

marcadores para tumores hepáticos y metástasis hepáticas de tumores extrahepáticos

d)

terapia antifibrótica

prácticamente no existen posibilidades de solución suficientes, aunque en clínica serían necesarias con urgencia. También aquí MIA-2 abre un gran número de nuevos enfoques.

En los ensayos con animales se obtienen éxitos aislados y algunos fármacos y diagnósticos se han probado en el marco de estudios clínicos. Aunque como se describe arriba, por el momento no hay formas de terapia seguras ni parámetros diagnósticos fiables.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación de MIA-2

Ejemplo 1a

Clonación del ADNc de MIA-2 que codifica para la proteína MIA-2

Para la amplificación del ADNc de MIA2 se realiza una RT-PCR con cebadores específicos (SEC ID No. 3 y SEC ID No. 4 o SEC ID No. 9 para la secuencia humana, así como SEC ID No. 3 y SEC ID No. 7 o SEC ID No. 9 en el caso de la secuencia murina). Para ello se aísla ARN de tejido hepático humano o murino y después se transcribe con ayuda de una transcripción inversa en ADNc. A continuación este ADNc se emplea en una reacción PCR con los correspondientes cebadores de oligonucleótido MIA2 (ver arriba). El producto de PCR se clona mediante una clonación de extremo romo (blunt-end) en el vector pPCR-Script (Stratagene, catálogo nº 211188).

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Ejemplo 1b

Clonación del promotor de MIA-2

Mediante un cebador de PCR específico se amplificó como molde el promotor de MIA-2 con ADN genómico y se clonó en los sitios de restricción Bgl II y Hind III en el vector pGL3 básico (Promega). Para la amplificación PCR se emplearon las siguientes SEC ID No. 10 a SEC ID No. 17 como cebador "directo" y SEC ID No. 18 como "cebador reverso".

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Ejemplo 2

Expresión recombinante de MIA-2 humana in vitro

Para la traducción in vitro se clona el ADNc MIA-2 o mutantes de MIA-2 más apropiados para determinadas aplicaciones (más estables, con mayor afinidad al sustrato) en un sistema de expresión eucariótico. Los vectores disponen, además de los motivos necesarios para la amplificación y obtención en E. Coli, de un promotor T7 y una secuencia de terminación T7, y disponen además de sitios de corte apropiados para la clonación de ADNc MIA-2 (p. Ej., pIVEX2.3-MCS, Roche). En el caso de pIVEX2.3-MCS se amplificó MIA-2 mediante el cebador SEC ID No. 19 y SEC ID No. 9 y a continuación se clonó en el vector mediante NdelI y Bam HI. Con sistemas de traducción in vitro disponibles comercialmente (RT-System, Roche; ECL cell in vitro translation system, Amersham Pharmacia Biotech; PROTEINscript-PRO, Ambion) se prepara la proteína MIA-2 recombinante mediante el plásmido de expresión clonado. La detección de la expresión se realiza mediante anticuerpos específicos en transferencia Western o con ELISA.

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Ejemplo 3

Expresión recombinante de MIA-2 humana en células eucariotas

Ejemplo 3a

Expresión recombinante de MIA-2 en células de mamífero

Para la expresión de MIA-2 en células de mamífero se clona el ADNc para MIA-2, de forma preferible MIA-2 humana (SEC ID No. 1 o SEC. ID No. 20) en un vector de expresión apropiado. Este vector de expresión se transcribe en células de mamífero y tiene un sistema promotor-potenciador eficiente para producir cantidades suficientes de proteína MIA-2 (en caso de usar fragmentos de ADN MIA-2 genómicos, esto es necesario, ya que MIA-2 sólo está activa en determinados tipos de células, por ejemplo, hepatocitos, y no permite una expresión ubicuitaria; sin embargo, se puede producir una expresión ubicuitaria mediante expresión homóloga in vitro). Dichos promotores y potenciadores se aíslan frecuentemente de virus como, por ejemplo, SV40, hcMV, polioma o retrovirus. Alternativamente se pueden usar también sistemas promotor-potenciador que son específicos del tejido o inducibles, por ejemplo: promotores WAP, MMTV o inmunoglobulina, como por ejemplo el promotor metalotioneina. El vector de expresión proporciona el ADNc MIA-2 (en caso que se use este), señales dador y aceptor splice para el procesado de ARN y una cola poliA. Por ejemplo, pCDNA3 (Invitrogen, San Diego, EUA), es un vector de expresión adecuado. En el único sitio de restricción EcoRI se clona el ADNc MIA-2 tras introducir el enlace EcoRI, comprobándose mediante otros análisis de restricción con enzimas de restricción apropiados, que MIA-2 se ha clonado en la orientación correcta en el vector de expresión. Un procedimiento análogo se emplea para otros vectores de expresión, como por ejemplo pCMX-pL1 (Umesono y col., Cell 65 (1991) 1255-1266) o pSG5 (Stratagene, LaJolla, EUA). En el caso del vector de expresión pCMX-MIA2 se ha amplificado MIA2 mediante los cebadores SEC ID No. 18 y SEC ID No. 19 y a continuación se ha clonado en el vector mediante ligación EcoRI o extremo romo (blunt end).

El ADN del plásmido de expresión así obtenido se prepara a partir de E. coli. A continuación se transfectan y seleccionan las células de mamífero, con los métodos correspondientes óptimos para las respectivas líneas celulares. (Methods of Enzimology 186 (Gene Expression Technology), ed. David V. Goeddle, Academic Press 1991, sección V). Como células de mamífero se pueden emplear células CHO, COS, 3T3, MeIIm. En la expresión de MIA-2 se ha podido detectar proteína MIA-2 en el sobrenadante del cultivo celular.

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Ejemplo 3b

Expresión recombinante de MIA-2 en células de insectos

Para la expresión de MIA-2 en células de insectos se clona el ADNc para MIA-2, de forma preferible MIA-2 humana (SEC ID No. 20 o SEC ID No. 1) en un vector de expresión apropiado, que deriva de AcMNPV (virus multicápside de la nucleopolihedrosis Autographa californica) o BmNPV (nucleopolihedrovirus Bombyx mori). En primer lugar, el ADNc MIA-2 se clona de manera que MIA-2 es regulada por un promotor fuerte, que está activo en las células de insectos. Dicho promotor sería poIH (polihedrin) o p10 (D. R. O'Reilly, L. K. Miller y V. A. Luckow, Baculovirus expression Vectors - A Laboratory Manual (1992), W. H. Freeman & Co., New York). Para expresar MIA-2 con la ayuda de poIH se realiza lo siguiente: un fragmento de ADNc que codifica para MIA-2 (SEC ID No. 20 o SEC ID No. 1) se clona en un vector de transferencia, p. ej.: pVL1393 (D. R. O'Reilly, L. K. Miller y V. A. Luckow, Baculovirus expression Vectors - A Laboratory Manual (1992), W. H. Freeman & Co., New York) mediante ligación blunt end. Este vector de transferencia está disponible comercialmente (BD Pharmingen, San Diego, California o Invitrogen Corporation, San Diego, California). El plásmido de transferencia pVL1393-MIA-2 así obtenido se transfecta en E. coli K12 para su multiplicación y se aísla el ADN plasmídico según métodos habituales (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, y todas las ediciones siguientes). La transferencia del ADN MIA-2 del plásmido de transferencia en el vector Baculovirus se realiza mediante recombinación homóloga según métodos establecidos (D. R. O'Reilly, L. K. Miller y V. A. Luckow, Baculovirus expression Vectors - A Laboratory Manual (1992), W. H. Freeman & Co., New York). Para ello se mezclan 0,5 mg de ADN BD BaculoGold^{TM} (el ADN de Baculovirus AcNPV linealizado, modificado con una deleción letal y expresión lacZ, que es controlado por el promotor poIH, está disponible comercialmente en BD Pharmingen (nº de pedido 21484P) y 2 mg de MIA-2 pVL1393, se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente y a continuación se mezclan con 1 ml de una solución de Hepes 125 mM pH 7,1, CaCl2 125 mM y NaCl 140 mM. Esta mezcla se deposita en 2x106 células de insectos SF9 (Invitrogen, nº de pedido B825-01 o BD Pharmingen, nº de pedido 551407) en una placa de cultivo con un diámetro de 60 mm, que se ha recubierto previamente con 1 ml de medio de Grace con FBS al 10% (suero fetal bovino). Tras 4 horas de incubación a 4ºC se elimina el medio que contiene el ADN y las células se cultivan en medio fresco a 27ºC durante 4 días. Los Baculovirus recombinantes así obtenidos se purifican dos veces mediante desarrollo de placas (D. R. O'Reilly, L. K. Miller y V. A. Luckow, Baculovirus expression Vectors - A Laboratory Manual (1992), W. H. Freeman & Co., New York). De este modo, los Baculovirus recombinantes que contienen MIA-2 se pueden diferenciar por carecer de expresión lacZ y por tanto no tienen actividad galactosidasa. Con los Baculovirus recombinantes que expresan MIA-2 así obtenidos se infectan células SF9 (MOI = 20 pfu/célula)según los métodos habituales (D. R. O'Reilly, L. K. Miller y V. A. Luckow, Baculovirus expression Vectors - A Laboratory Manual (1992), W. H. Freeman & Co., New York).

Las células se cultivan durante al menos 36 horas a 27ºC en medio libre de suero (p. ej. BD BaculoGold Max-XP Insect Cell Medium, BD Pharmingen, nº de pedido 551411). A continuación se eliminan los sobrenadantes celulares, el virus se separa del sobrenadante por ultracentrifugación (Beckmann Ti 60 Rotor, 30,000 rpm). Después se filtra el sobrenadante a través de filtros Microcon 100 (Amicon, límite de exclusión 100 kD). La solución de MIA-2 así obtenida se pude usar directamente con finalidades de análisis o se puede seguir purificando.

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Ejemplo 4

Expresión recombinante de MIA-2 humana libre de fusión en Escherichia coli

Clonación de ADNc de MIA-2 en un vector de expresión de E. coli: para la clonación de ADNc de MIA-2 se ha empleado un sistema de expresión adecuado, como por ejemplo el sistema de expresión T7 de la empresa Novagen (Studier y Moffat, J. Mol. Bio. 189 (1986), 113-130) o el sistema vectorial pQE40, pGST o similares (p. ej., de la empresa Qiagen, nº cat. 33403). Como ADN de partida se ha empleado el vector pBS con ADNc de MIA-2 inserido (SEC ID No. 20 o SEC ID No. 1). El ADNc de MIA-2 se ha modificado de manera que es posible una expresión eficiente en el sistema E. coli. Los cebadores para la amplificación de MIA-2 contienen sitios de corte que permiten una inserción del ADNc en sistemas vectoriales apropiados. Tras la amplificación el producto de PCR se corta con los correspondientes enzimas de restricción, permitiendo de este modo la clonación en el vector preparado (separado y protegido de la re-ligación mediante desfosforilación). Tras la ligación, la construcción del inserto de MIA-2 y el vector se transforma en E. coli y se aísla la construcción correcta. Tras concluir la clonación, la secuencia de nucleótidos se comprueba mediante secuenciación de ADN (Sanger y col. PNAS 74 (1977), 5463-67) con cebadores específicos de MIA-2 (SEC ID No. 21 y 22).

El plásmido de expresión se transfecta en una cepa apropiada de E. coli, como p. ej. BL21 (DE3). Son apropiadas las cepas de E. coli que presentan una expresión suficiente de represor lac, y por tanto son inducibles. El cromosoma de las bacterias BL21 contiene el gen para la T7-ARN-polimerasa, que es controlado por el promotor lac. Por consiguiente, la expresión de la polimerasa se puede inducir mediante isopropil-b-D-tiogalactósido (IPTG). El gen MIA-2 es controlado por un promotor T7. La inducción con IPTG transcurre a consecuencia de la expresión de MIA-2.

Para la alimentación de la cepa recombinante bacteriana, a un medio apropiado como por ejemplo medio LB en un volumen apropiado, i.d.R. 1,5 1, se añaden 100 mg/ml de ampicilina y se siembra con una única colonia.

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Medio LB (11)

\quad

10 g de triptona

\quad

5 g de extracto de levadura

\quad

10 g de NaCl

El cultivo se agita a 37ºC y 160-200 rpm. Para una DO600 de 0,6 el cultivo se induce con IPTG 1 mM y después se incuba durante otras 4-5 horas a 37ºC hasta que se alcanzan densidades celulares de DO600 3-3,5. La recogida de las células se ha realizado mediante centrifugación a 10.000 g.

El pellet de bacterias se recoge en 5 ml de tampón de lisis (NaPO_{4} 0,1 M, NaCl 300 mM, pH 7,5) y las bacterias se liberan mediante triple congelación y 10 min de tratamiento en ultrasonidos. Los componentes insolubles se eliminan por centrifugación.

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Purificación de MIA-2

La proteína recombinante se puede purificar a través de purificación cromatográfica de la proteína de fusión o mediante la purificación cromatográfica que aprovecha las propiedades de MIA-2. La parte de fusión se puede separar mediante una proteasa. El material de las columnas con la proteína unida se ha lavado ahora tres veces con el tampón de lisis y tres veces con el tampón de lavado (Na_{2}PO_{4} 0,1 M, NaCl 300 mM, glicerina 20%, pH 6,1) y a continuación se trata con 3 ml de PBS con proteasa. La suspensión se incuba durante la noche a 37ºC para la separación entre MIA-2 y la parte de fusión. Tras el centrifugado del material de las columnas se retira el sobrenadante, la cantidad de MIA-2 se determina en un gel de SDS-PAGE 20% y se emplea para los análisis correspondientes. La proteína es estable a -20ºC durante al menos un mes. El análisis de pureza y la determinación del peso molecular se realizó con electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.

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Ejemplo 5

Expresión recombinante de MIA-2 humana en E. coli como proteína de fusión

El ADNc de MIA-2 se clona en un vector de expresión E. coli, como se describe en el ejemplo 4, estando presente adicionalmente una proteína de fusión como p. ej., DHFR, His-Tag o GFP. Para poder separar MIA-2 proteolíticamente de la proteína de fusión se insertó un fragmento de ADN, que lleva un sitio de reconocimiento p. ej., para la proteasa IgA (Ser Arg Pro Pro/Ser) entre la proteína de fusión y MIA-2. La expresión se realiza tal como se describe en el ejemplo 4. MIA-2 se puede purificar mediante la proteína de fusión según los métodos habituales. La proteína recombinante se puede purificar por purificación cromatográfica de la proteína de fusión o por purificación cromatográfica que aprovecha las propiedades de MIA-2. El material de las columnas con la proteína unida se lava tres veces con el tampón de lisis y tres veces con el tampón de lavado (p. ej., Na_{2}PO_{4} 0,1 M, NaCl 300 mM, glicerina 20%, pH 6,1). Tras el centrifugado del material de las columnas se retira el sobrenadante, la cantidad de MIA-2 se determina en un gel SDS-PAGE 20% y se emplea para los análisis correspondientes. La proteína es estable a -20ºC durante el menos un mes. El análisis de electroforesis de gel de poliacrilamida-SDS dio como resultado que la proteína presenta una pureza elevada.

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Ejemplo 6

Detección de MIA-2 en diferentes tejidos y líneas celulares

Por un lado, la expresión de MIA-2 en determinadas células, precisamente ARNm de MIA-2, se detecta con los métodos habituales de hibridación de ácidos nucleicos, p. ej., análisis de transferencia Northern, hibridación in situ,
hibridación Dot o Slot Blot y métodos derivados de estos (Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory
Approach (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Nucleic Acid Hybridisation - A practical approach (1985), eds. B. D. Hames y S. J. Higgins, IRL Press; In situ Hybridisation - A practical approach (1993), ed. D. Wilkinson, IRL Press). Por otro lado, la expresión se puede detectar mediante cebadores específicos para MIA-2 mediante RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en transcriptasa reversa) (PCR Protocols - A guide to Methods and Applications (1990), eds. M. A. Innis, D. H. Gelfand, JJ. Sninsky, T. J. White, Academic Press INc; PCR - A practical approach (1991), eds. M. J. McPherson, P. Quire, G. R. Taylor (1991), IRL Press). Para la hibridación in situ de MIA-2 sobre cortes finos de tejido se preparó según los métodos habituales una ribosonda marcada P33 a partir de los 390 nucleótidos N-terminales (véase SEC ID No. 23). Tras la hibridación y el lavado astringente se expusieron las películas sobre los cortes hasta seis días. La Figura 5 muestra una hibridación de ARN in situ de MIA-2 sobre cortes finos de tejido de embriones de ratón (día 12,5 y 14,5 del estadio embrionario). El ARN de MIA-2 se expresa específicamente en el hígado.

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Detección de la expresión de ARN de MIA-2 mediante RT-PCR

La Figura 7 muestra la expresión de ARN de MIA-2 en diferentes tejidos normales de ratón y humano. Para el estudio de la expresión específica del tejido se ha aislado todo el ARN de las muestras de tejido de ratones C57BL/6. Se puede aislar todo el ARN según el método de Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159 o con kits comerciales, como p. ej., RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Alemania, nº de pedido 75142). Unos 0,4 cm^{3} de tejido se homogeneizan en tampón de lisis mediante tres ciclos de congelación-descongelación y tratamiento de ultrasonidos. El ARN se separa del tampón de lisis con ayuda de columnas RNeasy. 1/10 del ARN así obtenido se emplea en el análisis de RT-PCR. Las muestras de ARN humano se compraron a Clontech (Heidelberg, Alemania) y Ambion (Austin, EUA). El ARN se transcribe en ADNc con ayuda de cebadores dN6 y una transcriptasa reversa. La síntesis de las primeras hebras de ADNc se realizó en un volumen total de 20 ml con los componentes siguientes: 2 mg de ARN completo, 1 mg de cebador dN6 (Pharmacia, Freiburg, Alemania), 4 ml 5x tampón de primera hebra (Invitrogen Corporation, San Diego, EUA), 2 ml de DTT 10 mM, 1 ml de dNTPs 10 mM y 1 ml de Superscript Plus (Invitrogen Corporation, San Diego, EUA). La RT-PCR se realizó de forma semi-cuantitativa, empleándose el cebador para b-actina (SEC ID No. 24 y 25) como gen no regulado para la estandarización. También se pueden emplear otros genes no regulados para la estandarización, como p. ej. hipoxantin-fosforibosil-transferasa (HPRT, receptor transferrina, 18S ARN, Porfobilinógeno deaminasa (PB-GD), b2-microglobulina, 5-aminolevulinato sintasa (ALAS) o Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Alternativamente al RT-PCR clásico o semi-cuantitativo, se puede realizar un PCR cuantitativo con ayuda de Lightcyclers (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) o ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

La RT-PCR clásica o semi-cuantitativa se puede realizar en cualquier termociclador PCR habitual, como p. ej. PTC-200 (Biozym, Hess. Oldendorf, Alemania) o GeneAmp® PCR System 9700 de 96 pocillos (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) u otro termociclador. En una reacción RT-PCR típica se emplean 3 ml de ADNc. La PCR transcurrió en 32 ciclos, constando cada ciclo de una fase de desnaturalización (30 seg. a 94ºC), una fase de alineamiento (45 seg. a 58-62ºC) y una fase de síntesis (1 min a 72ºC). Para finalizar la reacción se incubó 5 minutos más a 72ºC. Los productos de PCR así obtenidos se separaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 1,8%, se tiñeron con bromuro de etidio y se documentaron fotográficamente. Para RT-PCR específica de MIA-2 se emplearon los cebadores siguientes, para humanos SEC ID No. 3 (cebador directo de MIA-2 5' ATGGCAAAATTTGGCGTTC) y SEC ID No. 26 (cebador reverso de MIA-2 5'-CCTGCCCACAAATCTTCC) y para ratones SEC ID No. 3 (cebador directo de MIA-2 5'-ATGGCAAAATTTGGCGTTC) y SEC ID No. 7 (cebador reverso de MIA-2 5'- CCTGCCCACAAATCTTCT).

MIA-2 se expresa en los mismos tejidos en humanos y en ratones, con una expresión más intensa en el hígado.

Se estudiaron varias líneas celulares con respecto a la expresión de MIA-2 (Figura 8). MIA-2 se expresa con intensidad exclusivamente en hepatocitos.

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Ejemplo 7

Análisis funcionales del efecto de MIA-2 en células Ito (Figura 6)

Para determinar la proliferación de las líneas celulares ensayadas, se siguió su crecimiento durante 5 días mediante contaje celular. El día 1 se siembran las células con 2x104 células/pocillo en una placa de 24 pocillos. El día 0 se realiza el tratamiento con MIA-2 (100 ng/ml - 5 mg/ml) o un control, en los días siguientes se cuentan las células por duplicado. La determinación de la proliferación se realiza con el test XTT disponible comercialmente, de la empresa Roche (nº cat. 1-465-015). MIA-2 inhibe la proliferación de las células Ito.

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Ejemplo 8

Detección de la expresión diferencial de MIA-2 en comparación entre tejidos hepáticos sanos y modificados

Con ayuda de la metódica mostrada en el ejemplo 6 se puede estudiar la expresión génica diferencial de MIA-2. Para el análisis se usan tejidos, líquidos tisulares y sangre (suero) de pacientes con diferentes enfermedades hepáticas. Se aisló el ARN de biopsias de hígado de pacientes y se analizó por RT-PCR. En pacientes de hepatitis con fibrosis leve se expresa significativamente menos MIA-2 que en pacientes de hepatitis con fibrosis avanzada (véase Figura 9).

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet EP 0909954 A [0007]

\bullet WO 0175068 A [0016]

\bullet DE 10248248 [0131]

\bullet DE 10305082 [0131]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

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\bulletBossehoff et al. Expression and Histopathology, Januar 2002, vol. 17 (1), 289-300 [0008]

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<110> Scil Proteins GmbH

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<120> Proteína MIA-2

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<130> P16412

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<150> DE 10248248.9

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<151> 2002-10-16

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<150> DE 10305082.5

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<151> 2003-02-07

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<160> 36

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 1626

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip0,8cm

1

\hskip0,8cm

2

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<210> 2

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<211> 3090

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\hskip0,8cm

3

\hskip0,8cm

4

\hskip0,8cm

5

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<210> 3

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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atggcaaaat ttggcgttc

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19

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<210> 4

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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taaaaataaa ttatgtttaa aaataa

\hfill

26

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<210> 5

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<211> 541

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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\hskip0,8cm

6

\hskip0,8cm

7

\hskip0,8cm

8

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<210> 6

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<211> 1554

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<212> ADN

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<213> Mus

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<400> 6

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\hskip0,8cm

9

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<210> 7

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<211> 18

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<212> ADN N

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<213> Mus

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<400> 7

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cctgcccaca aatcttct

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18

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<210> 8

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<211> 850

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\hskip0,8cm

10

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<210> 9

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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aattcactat cttcattgtc

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20

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<210> 10

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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gacagatctg ggtctcattg tgcctaggtt

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30

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<210> 11

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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gacagatcta cccatctctc tgtgcctca

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29

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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gacagatcctt cagagagttg gtgtgaagg

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29

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<210> 13

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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gacagatctc agggtctcac tctgrcacg

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29

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<210> 14

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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gacagatctg gaatacctga cactgcaga

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29

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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gacaagctta caagcaaccg ggaatcc

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27

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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33

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<211> 32

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<213> Homo sapiens

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32

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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gatgaattct caaagacaaa gaaagtcag

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29

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<211> 357

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggcaaaat ttggcgttca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttataaaaat aaattatgtt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggaatcctg tggcatccat gaaac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaaacgcag ctcagtaaca gtccg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgcccaca aatcttcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1628

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

13

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 517

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

14

\hskip0,8cm

15

\hskip0,8cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggagagacc ctttgaagtc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagaagatgg cggtggcat

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtggagaa ggaacaagcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggtggcag tttcagggat a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaccaccta cctgaatgtc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actctcccag ttgctccttg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccataata ccaccctgac a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacagcctct tggcatcctc

\hfill

20

Claims (23)

1. Proteína MIA-2 humana caracterizada por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico y codificada por el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 o variantes del mismo, en la que las variantes tienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, con la condición de que

a)

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según la secuencia SEC ID No. 1 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína que tiene actividad MIA-2, o

b)

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y que codifican el mismo aminoácido o un aminoácido que tiene la misma actividad que el ácido nucleico de SEC ID No. 1, y

c)

cada proteína MIA-2 no está exclusivamente codificada por las bases 1-354 de la SEC ID No. 1 o fragmentos de la misma.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Proteína MIA-2 murina caracterizada por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico y codificada por el ácido nucleico de la SEC ID No. 27 o variantes del mismo, en la que las variantes tienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de la SEC ID No. 27 y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, con la condición de que

a)

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según la secuencia SEC ID No. 27 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína que tiene actividad MIA-2, o

b)

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y que codifican el mismo aminoácido o un aminoácido que tiene la misma actividad que el ácido nucleico de SEC ID No. 27, y

c)

cada proteína MIA-2 no está exclusivamente codificada por las bases 1-357 de la SEC ID No. 27 o fragmentos de la misma.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Ácido nucleico aislado que comprende el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 o variantes del mismo, en el que las variantes tienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 y codifican una proteína caracterizada por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, con la condición de que

a)

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según la secuencia SEC ID No. 1 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína que tiene actividad MIA-2, o

b)

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y que codifican el mismo aminoácido o un aminoácido que tiene la misma actividad que el ácido nucleico de SEC ID No. 1, y

c)

el ácido nucleico no consiste exclusivamente en las bases 1-354 de la SEC ID No. 27 o fragmentos de la misma.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Ácido nucleico aislado que comprende el ácido nucleico de la SEC ID No. 27 o variantes del mismo, en el que las variantes tienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de la SEC ID No. 27 y codifican una proteína caracterizada por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, con la condición de que

a)

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico según la secuencia SEC ID No. 27 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína que tiene actividad MIA-2, o

b)

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y que codifican el mismo aminoácido o un aminoácido que tiene la misma actividad que el ácido nucleico de SEC ID No. 27, y

c)

el ácido nucleico no consiste exclusivamente en las bases 1-357 de la SEC ID No. 27 o fragmentos de la misma.

5. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 3 ó 4 unido además funcionalmente con una o más secuencias reguladoras, en el que el promotor de MIA-2 humano según la SEC ID No. 2 se utiliza preferiblemente como secuencia reguladora.

6. Promotor de MIA-2 que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID No. 2.

7. Ácido nucleico que es un producto transcripcional de uno de los ácidos nucleicos según las reivindicaciones 3-5 o que se hibrida selectivamente con dicho producto de transcripción bajo condiciones astringentes y es un ADN o ARN antisentido.

8. Proteína MIA-2 humana que comprende el aminoácido de la SEC ID No. 5 o una variante de este aminoácido, en la que las variantes tienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el aminoácido de la SEC ID No. 5 y en la que la actividad biológica de la proteína es sustancialmente la misma que la actividad de la proteína MIA-2 que comprende la secuencia no modificada de SEC ID No. 5, y que está caracterizada por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, en la que las variantes no consisten exclusivamente en los residuos de aminoácidos 1-118 de la SEC ID No. 5.

9. Proteína MIA-2 murina que comprende el aminoácido de la SEC ID No. 28 o una variante de este aminoácido, en la que las variantes tienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el aminoácido de la SEC ID No. 28 y en la que la actividad biológica de la proteína es sustancialmente la misma que la actividad de la proteína MIA-2 que comprende la secuencia no modificada de SEC ID No. 28, y que está caracterizada por una expresión específica en el hígado y un efecto antiproliferativo y antifibrótico, en la que las variantes no consisten exclusivamente en los residuos de aminoácidos 1-119 de la SEC ID No. 28.

10. Vector que comprende un ácido nucleico según una o más de las reivindicaciones 3-7 y que es preferiblemente un plásmido.

11. Célula huésped que ha sido transformada con un vector según la reivindicación 10 y que es preferiblemente una célula eucariota, más preferiblemente una célula de mamífero, preferiblemente una célula madre adulta o embrionaria, una célula vegetal, una célula de levadura o una célula de insecto, incluso más preferiblemente una célula CHO, COS, HeLa, 293T, HEH o BHK o una célula procariota, preferiblemente E. coli o Bacillus subtilis, en la que se excluyen las células madre embrionarias humanas.

12. Anticuerpo o aptámero que es específico para un epítopo de la proteína MIA-2 según la reivindicación 2 ó 9, en el que el anticuerpo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo sintético y está opcionalmente unido a una sustancia tóxica y/o una sustancia detectable.

13. Composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico según una o más de las reivindicaciones 3-7 o de un vector según la reivindicación 10 en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable o una dosis terapéuticamente eficaz de una proteína según la reivindicación 1 u 8 en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otras sustancias activas como, por ejemplo, interferones, inhibidores del sistema ACE o ligandos del receptor g activado por proliferación (PPAR-g).

14. Composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende un anticuerpo o un aptámero según la reivindicación 12.

15. Mamífero no humano transgénico, preferiblemente un ratón transgénico, en el que se inactivó, preferiblemente de forma condicional, un ácido nucleico según la reivindicación 4, o que tiene un ácido nucleico según la reivindicación 6 insertado en su genoma.

16. Método ex vivo para el diagnóstico de daño hepático o para la determinación del rendimiento de la síntesis hepática, que comprende las etapas de:

a)

proporcionar una muestra de tejido hepático o suero o una biopsia de un paciente,

b)

determinar cualitativa y/o cuantitativamente los productos de transcripción según la reivindicación 7, o los productos de transcripción de un ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 ó 27 o variantes del mismo, en el que las variantes tienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con el ácido nucleico de la SEC ID No. 1 ó 27, con la condición de que:

-

estas variantes se hibridan con un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC ID No. 1 ó 27 bajo condiciones astringentes y además con la condición de que estas variantes codifican una proteína que tiene actividad MIA-2, o

-

estas variantes presentan cambios de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y que codifican el mismo aminoácido o un aminoácido funcionalmente equivalente al ácido nucleico de SEC ID No. 1 ó 27,

en la muestra,

en el que una sobreexpresión de los productos de transcripción indica un daño hepático y/o un aumento del rendimiento de la síntesis hepática.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la determinación en la etapa b) se lleva a cabo mediante el uso de transferencia Northern, hibridación in situ o RT PCR, en el que la RT PCR se lleva a cabo preferiblemente mediante la utilización de los cebadores de las SEC ID Nos. 3, 4, 7, 9, 26 ó 29-36, o una combinación de los mismos, o

en el que la determinación en la etapa b) se lleva a cabo con el uso de una composición según la reivindicación 14.

18. Método ex vivo para el diagnóstico de daño hepático o para la determinación del rendimiento de la síntesis hepática, que comprende las etapas de:

a)

proporcionar una muestra de tejido hepático o suero o una biopsia de un paciente,

b)

poner en contacto la muestra con un reactivo capaz de detectar la proteína MIA-2 según la reivindicación 8 ó 9, preferiblemente mediante la utilización de un anticuerpo según la reivindicación 12 o un anticuerpo que es específico para un epítopo de la proteína MIA-2 según la reivindicación 1 u 8,

c)

determinar cualitativa y/o cuantitativamente la proteína MIA-2 en la muestra,

en el que la presencia y la cantidad de la proteína MIA-2 indican un daño hepático y/o un aumento del rendimiento de la síntesis hepática.

19. Método según una o más de las reivindicaciones 16-18, en el que el daño hepático es cirrosis del hígado, fibrosis hepática o una metástasis/tumor hepático.

20. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 13, para la fabricación de un medicamento para la terapia antifibrótica o para el tratamiento de la cirrosis del hígado o la fibrosis hepática.

21. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 13 y/o 14, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de metástasis/tumores hepáticos.

22. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 12 o un anticuerpo dirigido contra un epítopo de la proteína MIA-2 según la reivindicación 1 u 8, para el diagnóstico ex vivo de daño hepático o para la determinación del rendimiento de la síntesis hepática.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que el daño hepático es cirrosis del hígado, fibrosis hepática o una metástasis/tumor hepático.