JP2000517174A - ケラチノサイト増殖因子―２（ｋｇｆ―２または線維芽細胞増殖因子―１２、ｆｇｆ―１２） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新しく同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、そしてまたそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポリペプチドは、ケラチノサイト増殖因子、時には以下で「ＫＧＦ−２」と呼び、以前には線維芽細胞増殖因子１２(ＫＧＦ−１２)として知られているものである。本発明はそのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。本発明はさらに、創傷治癒を促進または加速するためのＫＧＦ−２の治療的に使用にも関する。本発明は、高い活性、増加した安定性、高い収率またはよりよい溶解性を示すＫＧＦ−２の新規な変異体形にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ケラチノサイト増殖因子−２ （ＫＧＦ−２または線維芽細胞増殖因子−１２、ＦＧＦ−１２） 発明の分野 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの 製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下で「ＫＧＦ− ２」と呼び、以前から線維芽細胞増殖因子１２(ＦＧＦ−１２)としてもまた知ら れている、ケラチノサイト増殖因子−２である。本発明はまた、そのようなポリ ペプチドの作用を阻害することにも関する。本発明はさらに、創傷治癒を促進ま たは増進するための、ＫＧＦ−２の治療上の使用に関する。本発明はまた、高め られた活性、増大された安定性、より高い収率、またはより良好な溶解性を示す 、新規変異体型のＫＧＦ−２にも関する。加えて、本発明は、ＫＧＦ−２ポリペ プチドを精製する方法に関する。 発明の背景 線維芽細胞増殖因子ファミリーは、軟組織の増殖および再生に関与する増殖因 子の大きなファミリーとして現れた。それには、様々な程度の相同性をタンパク 質レベルで共有し、１つの例外はあるが、同様の広範なマイトジェンスペクトル を有するらしい幾つかのメンバー、すなわち、中胚葉および神経外胚葉起源の様 々な細胞の増殖を促進する、および／または脈管形成を促進する幾つかのメンバ ーが現在含まれる。 そのファミリーの様々なメンバーの発現パターンは、幾つかの発生段階の極め て限られた発現から様々な組織および器官における幾分遍在する発現にまで及び 、非常に様々である。メンバーは全て、ヘパリンおよび硫酸ヘパリンプロテオグ リカン並びにグリコサミノグリカンに結合して、細胞外マトリックス中に強く集 中 するらしい。ＫＧＦは、元来、配列相同性または因子精製およびクローニングに より、ＦＧＦファミリーの一員として同定された。ケラチノサイト増殖因子(Ｋ ＧＦ)は、培養されたマウスのケラチノサイトラインのマイトジェンとして単離 された(Rubin，J．S．ら，Proc．Natl．Acad．Scj．ＵＳＡ ８６：８０２−８０ ６（１９８９）)。ＦＧＦファミリーの他のメンバーとは違って、それは、間葉 から得られる細胞に対して殆ど活性を有していないが、上皮細胞の増殖を刺激す る。ケラチノサイト増殖因子遺伝子は、１９４のアミノ酸ポリペプチドをコード する(Finch，P．W．ら，Science ２４５：７５２−７５５（１９８９）)。Ｎ末 端の６４のアミノ酸は独自のものであるが、残りのタンパク質は、ｂＦＧＦに対 して約３０％の相同性を有する。ＫＧＦは、ＦＧＦファミリーの最も逸脱したメ ンバーである。その分子は、疎水性シグナル配列を有しており、効果的に分泌さ れている。翻訳後修飾には、そのシグナル配列の切断、および１つの部位でのＮ 結合型グリコシル化が含まれ、結果的には、２８kDaのタンパク質を生ずる。ケ ラチノサイト増殖因子は、皮膚および胎児の肺から得られる線維芽細胞により産 生される(Rubinら，１９８９）)。ケラチノサイト増殖因子のmRNAは、成人の腎 臓、結腸、および腸骨において発現するが、脳または肺においては発現しないこ とが見いだされた(Finch，P．W．ら，Science ２４５：７５２−７５５（１９８ ９）)。ＫＧＦは、ＦＧＦタンパク質ファミリー内の保存領域を示す。ＫＧＦは 、ＦＧＦ−２受容体に高い親和性で結合する。 損なわれた創傷治癒は、病的状態の重要な原因であって、結果的には、離開、 吻合破壊、および未治癒の創傷といったような合併症を生じ得る。正常な個体に おいては、創傷治癒は、面倒になることなく成し逐げられる。対照的に、損なわ れた治癒は、糖尿病、感染、免疫抑制、肥満、および栄養失調といったような幾 つかの状態と関連している(Cruse，P．J．およびFoord，R．，Arch．Surg．１０ ７：２０６(１９７３)；Schrock，T．R．ら，Ann．Surg．１７７：５１３（１９ ７３）；Poole，G．U.，Jr.，Surgery ９７：６３１（１９８５）；Irvin，G．L ．ら，Am Surg．５１：４１８（１９８５）)。 創傷修復は、複雑な相互作用および生物学的プロセスの結果である。正常な創 傷治癒においては、３つの段階が記載されている；急性炎症段階、細胞外マトリ ックスおよびコラーゲン合成、並びに再形成(Peacock，E．E.，Jr.，Wound Repa ir，第２版，WB Saunders，Philadelphia（１９８４）)。そのプロセスは、創傷 部位でのケラチノサイト、線維芽細胞、および炎症細胞の相互作用を伴う。 組織再生は、修復プロセスに関与する細胞の遊走および増殖を調節する、特異 的なペプチド因子により制御されるらしい(Barrett，T．B．ら，Proc．Natl．Ac ad．Sci．ＵＳＡ ８１：６７７２−６７７４（１９８５）；Collins，Ｔ．ら，N ature ３１６；７４８−７５０（１９８５）)。従って、増殖因子は、創傷、熱 傷、および他の皮膚障害の処置における有望な療法であり得る(Rifkin，D．B． およびMoscatelli，J．Cell．Biol．１０９：１−６（１９８９)；Sporn，M．B ．ら，J．Ce1ll．Biol．１０５：１０３９−１０４５（１９８７）；Pierce，G ．F．ら，J．Cell．Biochem．４５：３１９−３２６（１９９１）)。治癒プロセ スのシークエンスは、仮組織の沈着と共に、急性炎症段階の間に開始される。こ の後、再上皮形成、コラーゲン合成および沈着、線維芽細胞増殖、並びに血管新 生が起こり、これらは全て、最終的には、再形成段階を定義する(Clark，R．A． F.，J．Am．Acad．Dermatol １３：７０１（１９８５）)。これらの事象は、炎 症細胞により分泌される増殖因子およびサイトカインによって、または創傷の縁 にある細胞によって影響される(Assoian，R．K．ら，Nature(Lond.)３０９；８ ０４（１９８４）；Nemeth，G．G．ら，“Growth Factors and Their Role in W ound and Fracture Healing”，Growth Factors and Other Aspects of Wound H ealing in Biological and Clinical Implications，New York（１９８８），１ −１７頁)。 ケラチノサイト増殖因子(ＫＧＦ)(Antioniades，H．ら，Proc．Natl．Acad．S ci．ＵＳＡ ８８：５６５（１９９１）)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)(Antio niades，H．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ ８８：５６５(１９９１)；Sta iano−Coico，L．ら，Jour．Exp．Med．１７８：８６５−８７８（１９９３）) 、塩基性線維芽細胞増殖因子(bＦＧＦ)(Golden，M．A．ら，J．Clin．Invest． ８７：４０６（１９９１）)、酸性線維芽細胞増殖因子(aＦＧＦ)(Mellin，T．N ．ら，J．Invest．Dennatol．１０４：８ ５０−８５５（１９９５）、上皮増殖因子(ＥＧＥ)(Whitby，D．J．およびFergu son，W．J．，Dev．Biol．１４７：２０７（１９９１）)、トランスフォーミン グ増殖因子−α(ＴＧＦ−α)(Gartner，M．H．ら，Surg．Foruｍ４２：６４３( １９９１)；Todd，R．ら，Aｍ．J．Pathol．１３８；１３０７（１９９１）)、 トランスフォーミング増殖因子−β(ＴＧＦ−β)(Wong，D．T．W．ら，Am．J．P athol．１４３；６２２（１９８７）)、ノイ(neu)分化因子(rNDF)(Danilenko，D ．M．ら，J．Clin．Invest．９５：８４２−８５１（１９９５）)、インスリン 様増殖因子Ｉ(ＩＧＦ−Ｉ)、およびインスリン様増殖因子II(ＩＧＦ−II)(Croma ck，D．T．ら，J．Surg．Res．４２：６２２（１９８７）)を含め、幾つかのポ リペプチド増殖因子は、創傷治癒に関与するものとして同定された。 皮膚におけるrKGF−１は、上皮ケラチノサイト、毛包および脂腺内のケラチノ サイトを刺激することが報告された(Pierce，G．F．ら，J．Exp．Med．１７９： ８３１−８４０（１９９４）)。 発明の要約 本発明は、第１図［配列番号２］に示すアミノ酸配列、または細菌宿主におい て１９９４年１２月１６日にＴＣＣ寄託番号第７５９７７号として寄託されたcD NAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、ケラチノサイト増殖因子 (ＫＧＦ−２)をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子 を提供する。第１図［配列番号１］に示す、寄託されたＫＧＦ−２クローンを配 列決定することにより決定されたヌクレオチド配列は、約３５または３６のアミ ノ酸残基からなる推定リーダー配列と共に１−３の位置にある開始コドンを含む 、約２３.４kDaの推定分子量をもつ、２０８のアミノ酸残基からなるポリペプチ ドをコードするオープンリーディングフレームを含む。成熟ＫＧＦ−２のアミノ 酸配列は、第１図に示す、３６または３７〜２０８のアミノ酸残基である［配列 番号２］。 本発明のポリペプチドは、ＦＧＦのファミリーのメンバーであると推定的に同 定されており、とりわけ、そのポリペプチドは、ＦＧＦファミリーの他のメンバ ーとのアミノ酸配列相同性の結果、ＫＧＦ−２であると推定的に同定された。 本発明の一態様により、ＫＧＦ−２である新規成熟ポリペプチド、さらにはま た、その生物学的に活性で診断上または治療上有用なフラグメント、アナログ、 および誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のものである。 本発明の別の態様により、mRNA、ＤＮＡ、cDNA、ゲノムＤＮＡを含め、ヒトＫ ＧＦ−２をコードする単離された核酸分子、さらにはまた、そのアンチセンスア ナログ、およびその生物学的に活性で診断上または治療上有用なフラグメントを 提供する。 本発明の別の態様により、ＫＧＦ−２タンパク質の組換え産生における試薬と して有用なクローニングおよび発現プラスミドといったような組換えベクターの 使用によって、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法、さら にはまた、ヒトＫＧＦ−２の核酸配列を含んでなる組換え原核および／または真 核宿主細胞を提供する。 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、創傷治 癒を目的として上皮細胞増殖を刺激するために、そして毛包産生および皮膚創傷 の治癒を刺激するために利用する。ＫＧＦ−２は、手術による創傷、切除による 創傷、真皮および表皮の損傷を伴う深い創傷、眼組織の創傷、歯組織の創傷、口 腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、静脈うっ血潰瘍、熱曝 露または化学薬品から生ずる熱傷、並びに尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏症、 およびステロイド、放射線療法、並びに抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質での全 身処置と関連している合併症といったような、他の異常な創傷治癒状態を含め、 創傷治癒を刺激するのに臨床的に有用であり得る。ＫＧＦ−２を使用して、皮膚 損失後の皮膚再癒着を促進することができる。 ＫＧＦ−２を使用して、皮膚移植片の付着を増大させ、また創傷床からの再上 皮形成を刺激することができる。次のものは、ＫＧＦ−２を使用して、創傷床へ の付着を増大させることができるであろう移植片の種類である；自己移植片、人 工皮膚、ホモロガス移植片(allografts)、自己植皮片、自己表皮移植片、無血管 移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅 延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、ヘテロロガ ス移植片(heterologous graft)、ヘテロロガス移植片(xenograft)、ホモロガス 移稙片(homologous graft)、増殖性移植片、層板移植片、網状移稙片、粘膜移植 片、オリエーティールシュ移植片、大網移植片、パッチ移植片、茎状移植片、全 層移植片、中間層皮膚移植片、分層皮膚移植片。ＫＧＦ−２を使用して、皮膚強 度を促進し、また老化した皮膚の外観を改善することができる。 ＫＧＦ−２はまた、肝細胞増殖における変化、肺、胸部、膵臓、胃、小腸、お よび大腸における上皮増殖も引き起こすであろうと信じられる。ＫＧＦ−２は、 皮脂細胞、毛包、肝細胞、II型肺細胞、ムチンを産生する杯細胞、および他の上 皮細胞といったような上皮細胞、並びに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含ま れる、それらの前駆細胞の増殖を促進することができる。ＫＧＦ−２は、内皮細 胞、ケラチノサイト、および塩基性ケラチノサイトの増殖を促進することができ る。 ＫＧＦ−２を使用して、放射線、化学療法処置、またはウイルス感染から生ず る消化管毒性の副作用を減少させることもできる。ＫＧＦ−２は、小腸粘膜に対 して細胞保護作用を有し得る。ＫＧＦ−２はまた、化学療法およびウイルス感染 から生ずる粘膜炎(口潰瘍)の治癒を刺激することもできる。 ＫＧＦ−２はさらに、熱傷(すなわち、毛包、汗腺、および脂腺のレポピュレ ーション(repopulation))を含め、全体的および部分的厚さの皮膚欠損での皮膚 の完全な再生、乾癬のような他の皮膚欠損の処置において使用することができる 。ＫＧＦ−２を使用して、表皮水疱症、結果的には、口の開いた痛い水疱を生ず ることの多い、基盤となる真皮への表皮の付着における欠損を、これらの病巣の 再上皮形成を増進することにより処置することができる。ＫＧＦ−２を使用して 、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、また粘膜内層の瘢痕形成および腺粘膜お よび十二指腸粘膜内層の再生により、より迅速に治癒するのに役立てることもで きる。クローン病および潰瘍性大腸炎といったような炎症性腸疾患は、各々、小 腸または大腸の粘膜表面の破壊を生ずる疾患である。従って、ＫＧＦ−２を使用 して、粘膜表面の再表面形成を促進し、より迅速な治癒を手助けして、炎症性腸 疾患の進行を予防することができる。ＫＧＦ−２の処置は、胃腸管中での粘液の 産 生に対して重要な作用を有することが期待され、これを使用して、摂取された有 害な物質から、または手術後に腸粘膜を保護することができる。ＫＧＦ−２を使 用して、ＫＧＦ−２の発現不足と関連している疾患を処置することができる。 さらに、ＫＧＦ−２を使用して、様々な病的状態による肺への損傷を予防およ び治癒することができる。ＫＧＦ−２のような増殖因子は、増殖および分化を刺 激し、肺胞および細気管支上皮の修復を促進し、急性または慢性肺損傷を予防ま たは処置することができる。例えば、肺胞の進行性損失を生ずる気腫、および吸 入傷害(すなわち、煙の吸入から生ずる)、並びに細気管支上皮および肺胞の壊死 の原因となる熱傷は、ＫＧＦ−２で有効に処置することができる。そしてまた、 ＫＧＦ−２を使用して、II型肺細胞の増殖および分化を刺激することができ、こ れは、硝子膜疾患(例えば、乳児の呼吸窮迫症候群、および早産の乳児における 気管支肺の非形成)のような疾患を処置または予防するのに役立てることができ る。 ＫＧＦ−２は、肝細胞の増殖および分化を刺激することができ、従って、これ を使用して、硬変により引き起こされる劇症肝不全、ウイルス性肝炎および有毒 物質(すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素、および当業界で知られてい る他の肝臓毒素)により引き起こされる肝損傷といったような肝疾患および病状 を軽減または処置することができる。 加えて、ＫＧＦ−２を使用して、糖尿病の発症を処置または予防することがで きる。膵島細胞機能が幾分残存する、新たに診断されたＩおよびII型糖尿病を患 う患者において、ＫＧＦ−２を使用して、疾患の永続的な発現を軽減、遅延、ま たは予防するよう、膵島機能を維持することができるであろう。ＫＧＦ−２を膵 島細胞移植における補助物質として使用して、膵島細胞機能を改善または促進す ることができるであろう。 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提 供する。 本発明の別の態様により、ヒトＫＧＦ−２配列へ特異的にハイブリダイズする のに十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブを提供する。 本発明のさらなる態様により、治療用ペプチドとして使用することができる、 ＫＧＦ−２の模倣(ミメティック)ペプチドを提供する。模倣ＫＧＦ−２ペプチド は、ＫＧＦ−２のコグネイト受容体に結合して活性化することにより、ＫＧＦ− ２タンパク質の生物学的活性を模倣する短いペプチドである。模倣ＫＧＦ−２ペ プチドはまた、ＫＧＦ−２のコグネイト受容体に結合して阻害することもできる 。 本発明のまた別の態様により、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニス トを提供し、これを使用して、そのようなポリペプチドの作用を阻害する、例え ば、創傷治癒プロセスの間の瘢痕形成を減少させ、また腫瘍増殖、糖尿病性網膜 症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、および腫瘍増殖を予防および／または処 置することができる。 本発明のまた別の態様により、ＫＧＦ−２の核酸配列における変異、またはそ のような配列によりコードされるポリペプチドの過剰発現に関係している疾患、 もしくはその疾患に対する罹病性を検出する診断用アッセイを提供する。 本発明の別の態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペ プチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤ ＮＡベクターの製造に関係している、インビトロにおける目的に利用する方法を 提供する。 従って、本発明の一態様は、（ａ）第１図［配列番号２］における完全なアミ ノ酸配列を有する、ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ ｂ）第１図［配列番号２］において３６または３７〜２０８の位置にあるアミノ 酸配列を有する、成熟ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列; （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcDNAクローンによりコードさ れる完全なアミノ酸配列を有する、ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcDNAクローンに よりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＫＧＦ−２ポリペプチドをコード するヌクレオチド配列；および（ｅ）上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ ）における、いずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；よりな る群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる、 単離された核酸分子を提供する。 本発明のさらなる態様には、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは （ｅ）における、いずれかのヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％が同 一のヌクレオチド配列、より好ましくは、少なくとも９５％、９７％、９８％、 もしくは９９％が同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、またはス トリンジェント条件下、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ） におけるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる 、単離された核酸分子が含まれる。ハイブリダイズする、このポリヌクレオチド は、ストリンジェント条件下、Ａ残基だけからなるヌクレオチド配列、またはＴ 残基だけからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにはハイブリダイ ズしない。本発明のさらなる核酸態様は、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ） 、または（ｅ）におけるアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２のエピトープを有する 部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、単離された核 酸分子に関する。 本発明はさらに、（ａ）第１図［配列番号２］に示すリーダー配列を含め、完 全な２０８のアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；（ ｂ）第１図［配列番号２］において３６または３７〜２０８の位置にあるアミノ 酸配列を有する(リーダ−配列のない)成熟ＫＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配 列；（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcDNAクローンによりコー ドされる、リーダーを含め、完全なアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチ ドのアミノ酸配列；および（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcD NAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＫＧＦ−２ポリペプチ ドのアミノ酸配列；よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離され たＫＧＦ−２ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにはまた、上の（ ａ）、（ｂ）、（ｃ）、もしくは（ｄ）に記載したアミノ酸配列に対して、少な くとも９０％の類似性、より好ましくは、少なくとも９５％の類似性をもつアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、さらにはまた、上のアミノ酸配列に対して、少 なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも９０％が同 一のアミノ酸配列、さらにより好ましくは、９５％、９７％、９８％、もしくは ９９％が同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。 本発明のさらなる態様は、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に記載 したアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチドのエピトープを有する部分の アミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明のＫＧＦ− ２ポリペプチドのエピトープを有する部分のアミノ酸配列を有するペプチドまた はポリペプチドには、少なくとも６または７、好ましくは、少なくとも９、より 好ましくは、少なくとも約３０のアミノ酸〜約５０のアミノ酸をもつ、そのよう なポリペプチドの部分が含まれるが、上に記載した本発明のポリペプチドの全体 のアミノ酸配列までの、いずれかの長さのエピトープを有するポリペプチド、お よびその全体のアミノ酸配列が含まれる、エピトープを有するポリペプチドもま た本発明に含まれる。別の態様において、本発明は、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ ）、または（ｄ）に記載したアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチドへ特 異的に結合する、単離された抗体を提供する。 本発明の別の態様により、ＫＧＦ−２の新規変異体を記載する。これらは、Ｋ ＧＦ−２の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠失または置換することにより製造 することができる。天然の変異体は、アレル変異体と呼ばれている。アレル変異 体は、サイレントであり得る(コードされたポリペプチドには何の変化もない)か 、または変えられたアミノ酸配列を有し得る。天然のＫＧＦ−２の特性を改善ま たは変更しようとするためには、タンパク質工学を使用することができる。当業 界で知られている組換えＤＮＡ技術を使用して、新規ポリペプチドを作り出すこ とができる。ムテインおよび欠失変異体は、例えば、高められた活性、または増 大された安定性を示し得る。加えて、それらは、より高い収率で精製することが でき、少なくともある精製および保存条件下、より良好な溶解性を示す。 本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明ら かであろう。 図面の簡単な説明 次の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含さ れる本発明の範囲を限定しようとするものではない。 第１Ａ−１Ｃ図は、本発明のポリペプチドのcDNAおよび対応する推定アミノ酸 配列を説明する。最初の３５または３６のアミノ酸残基は、推定リーダー配 列(下線の部分)を表わす。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。配 列決定の不正確さは、ポリヌクレオチド配列を決定しようとする場合に共通の問 題である。３７３自動化ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems，Inc．)を 使用して、配列決定を行った。配列決定の正確さは、９７％以上が正確であると 予想される［配列番号１］。 第２Ａ−２Ｄ図は、本発明のポリペプチドと他の線維芽細胞増殖因子とのアミ ノ酸配列の比較を説明するものである［配列番号１３−２２］。 第３Ａ−３Ｄ図は、ＫＧＦ−２遺伝子に関する完全長のmRNAおよびアミノ酸配 列を示す［配列番号２３および２４］。 第４Ａ−４Ｅ図は、ＫＧＦ−２アミノ酸配列の分析を示す。α、β、回転(tur n)およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可動(flexible)領域 ；抗原指数および表面確率を示す。「抗原指数−Jameson−Wolf」というグラフ において、第１図におけるアミノ酸残基４１−１０９は、示されたＫＧＦ−２タ ンパク質の高度に抗原性の領域に対応する。疎水性領域(Hoop−Woodsプロット) は中央線以下(負の値)となるが、親水性領域(Kyte−Doolittle Plot)は、中央線 以上(正の値、例えば、アミノ酸残基４１−１０９）に見出される。そのプロッ トは、全体の２０８のアミノ酸ＯＲＦにわたっている。 第５図は、糖尿病のマウスにおける創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２の評価を示す 。創傷は、負傷した直後、および５日間連続して毎日、および８日目に測定した 。次の式を使用して、創傷閉鎖％を計算した：［１日目の領域］−［８日目の領 域］／［１日目の領域］。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／ −ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第６図は、糖尿病ではないマウスにおける創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２の評価 を示す。創傷は、負傷した直後、および５日間連続して毎日、および８日目に測 定した。次の式を使用して、創傷閉鎖％を計算した：［１日目の領域］−［８日 目の領域］／［１日目の領域］。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平 均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第７図は、糖尿病のマウスにおける創傷閉鎖の時間経過を示す。創傷領域は、 負傷した直後、および５日間連続して毎日、および８日目に測定した。値は、全 領域として表す(mM²)。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／−Ｓ ＥＭ，ｎ＝５)。 第８図は、糖尿病ではないマウスにおける創傷閉鎖の時間経過を示す。創傷領 域は、負傷した直後、および５日間連続して毎日、および８日目に測定した。値 は、全領域として表す(mM²)。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋ ／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第９図は、糖尿病のマウスに関するＫＧＦ−２に対する組織病理学的評価を示 す。スコアは、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用して、統 計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第１０図は、糖尿病ではないマウスに関するＫＧＦ−２に対する組織病理学的 評価を示す。スコアは、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用 して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第１１図は、糖尿病のマウスにおけるケラチノサイト増殖作用を示す。スコア は、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行 った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第１２図は、糖尿病ではないマウスにおけるケラチノサイト増殖作用を示す。 スコアは、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用して、統計分 析を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第１３図は、糖尿病のマウスにおける皮膚増殖作用を示す。スコアは、ブライ ンド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均 ＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第１４図は、糖尿病ではないマウスにおける皮膚増殖作用を示す。スコアは、 ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った (平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。 第１５図は、pＱＥ６０−Cys３７構築物から発現されるＤＮＡ配列およびタン パク質を示す。発現されるＫＧＦ−２タンパク質は、そのタンパク質のＮ末端に 結合した６Ｘ(ヒスチジン)タグと共に、３７の位置にあるシステインから２０８ の位置にあるセリンまでの配列を含む。 第１６図は、ラットにおける創傷治癒に対するメチルプレドニゾロンの作用を 示す。負傷してから５日目に、雄のＳＤ成体ラット(ｎ＝５)にメチルプレドニゾ ロン５mgを注射した。動物に皮膚パンチ創傷(８mM)を与えて、緩衝液または緩衝 液５０μｌ中のＫＧＦ−２溶液で５日間連続して毎日処置した。創傷は、較正さ れたJamesonカリパスで、１−５日目は毎日、および８日目に測定した。値は、 ８日目に測った測定値を表す(平均＋／−ＳＥＭ)。 第１７図は、創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２の作用を示す。雄のＳＤ成体ラット (ｎ＝５)に皮膚パンチ創傷(８mM)を与えて、負傷した日にメチルプレドニゾロン ５mgを与えた。負傷した日から始めて５日間連続して、動物を緩衝液または緩衝 液５０μｌ中のＫＧＦ−２溶液で毎日処置した。測定は、５日間連続して毎日、 および８日目に行った。創傷閉鎖を次の式により計算した：［８日目の領域］− [１日目の領域］／［１日目の領域］。１日目の領域は、６４mM²であると測定さ れ、その領域は、皮膚パンチにより成された。不対ｔ試験を使用して、統計分析 を行った(平均＋／−ＳＥＭ)。 第１８図は、糖質コルチコイドで損なわれた創傷治癒モデルにおける創傷治癒 の時間経過を示す。１日目に、雄のＳＤ成体ラット(ｎ＝５)に皮膚パンチ創傷( ８mM)を与えて、緩衝液または５０μｌ中のＫＧＦ−２溶液で５日間連続して毎 日処置した。負傷した日に、動物にメチルプレドニゾロン５mgを与えた。創傷は 、較正されたJamesonカリパスで、負傷した日から始めて５日間連続して毎日、 および８日目に測定した。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／ −ＳＥＭ)。 第１９（Ａ）図は、負傷してから５日後におけるメチルプレドニゾロンを与え ないラットの創傷治癒モデルにおける創傷領域に対するＫＧＦ−２の作用を示す 。１日目に、雄のＳＤラット(ｎ＝５)に皮膚パンチ創傷(８mM)を与えて、負傷し た日、およびその後５日間連続して毎日、緩衝液または溶液５０μｌ中のＫＧＦ −２で処置した。較正されたJamesonカリパスを使用して、創傷を測定した。不 対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ)。（Ｂ）雄のＳＤラ ット(ｎ＝６)におけるＰＤＧＦ−ＢＢおよびＫＧＦ−２の評価。全てのラットに ８mMの背側創傷およびメチルプレドニゾロン(ＭＰ)(１７mg／kg)を与えて、創傷 治癒を損なった。創傷を緩衝液または様々な濃度のＰＤＧＦ−ＢＢおよびＫＧ Ｆ−２で毎日処置した。較正されたJamesonカリパスを使用して、創傷を２、４ 、６、８、および１０日目に測定した。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行っ た(平均＋／−ＳＥ)。^*緩衝液と比較した。^**ＰＤＧＦ−ＢＢ １μｇ対ＫＧＦ −２／Ｅ３ １μg。 第２０図は、糖質コルチコイドで損なわれた創傷治癒モデルにおける創傷距離 に対するＫＧＦ−２の作用を示す。雄のＳＤラット(ｎ＝５)に皮膚パンチ創傷( ８mM)を与えて、１７mg／kgのメチルプレドニゾロンを負傷した日に与えた。５ 日間連続して毎日、および８日目に、動物を緩衝液または緩衝液５０μｌ中のＫ ＧＦ−２で処置した。創傷距離を、較正されたマイクロメーターで光学顕微鏡法 の下に測定した。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ) 。 第２１（Ａ）図は、ＫＧＦ−２による正常な一次表皮ケラチノサイト増殖の刺 激を示す。（Ｂ）は、ＫＧＦ−２Δ３３による正常な一次表皮ケラチノサイト増 殖の刺激を示す。（Ｃ）は、ＫＧＦ−２Δ２８による正常な一次表皮ケラチノサ イト増殖の刺激を示す。ヒトの正常な一次表皮ケラチノサイトを様々な濃度のＫ ＧＦ−２、ＫＧＦ−２Δ３３、またはＫＧＦ−２Δ２８と共に３日間インキュベ ートした。次いで、３つの実験全てに関して、alamarBlueを１６時間加えて、そ の細胞によりalamarBlueから変わった赤色の強度を、Ｏ．Ｄ．５７０ｎＭとＯ． Ｄ．６００nMとの間の差により測定した。各々のＫＧＦ−２タンパク質に関して 、完全なケラチノサイト増殖培地(ＫＧＭ)を含む正の対照、およびケラチノサイ ト基礎培地(ＫＢＭ)を含む負の対照を、同じアッセイプレートにおいてインキュ ベートした。 第２２（Ａ）図は、ＦＧＦＲ１bおよびＦＧＦＲ２でトランスフェクトしたBaF ３細胞における、ＫＧＦ−２およびＦＧＦ７によるチミジン取込みの刺激を示す 。ＦＧＦＲ１iiib(オープンサークル)またはＦＧＦＲ２iiib／ＫＧＦＲ(ソリッ ドサークル)でトランスフェクトしたBaF３細胞の増殖に対するＫＧＦ−２(右の パネル)およびＦＧＦ７(左のパネル)の作用を試験した。Ｙ軸は、BaF３細胞のＤ ＮＡへの[³H]チミジン取込み(cpm)の量を表す。Ｘ軸は、組織培養培地に加えた ＫＧＦ−２またはＦＧＦ７の最終濃度を表す。（Ｂ）は、ＦＧＦＲ２ iiibでトランスフェクトしたBaF３細胞における、ＫＧＦ−２Δ３３によるチミ ジン取込みの刺激を示す。（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２iiibでトランスフェクトしたBa F3細胞における、ＫＧＦ−２(白色の棒)、ＫＧＦ−２Δ３３(黒色の棒)、および ＫＧＦ−２Δ２８(灰色の棒)によるチミジン取込みの刺激を示す。 第２３図は、E．coli最適化全長のＫＧＦ−２に関するＤＮＡおよびタンパク 質配列を示す。 第２４（Ａ）および（Ｂ）図は、E．coli最適化成熟ＫＧＦ−２に関するＤＮ Ａおよびタンパク質配列を示す。 第２５図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸３６〜２０８を含んでなる、ＫＧＦ−２欠 失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第２６図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸６３〜２０８を含んでなる、ＫＧＦ−２欠 失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第２７図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸７７〜２０８を含んでなる、ＫＧＦ−２欠 失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第２８図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸９３〜２０８を含んでなる、ＫＧＦ−２欠 失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第２９図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸１０４〜２０８を含んでなる、ＫＧＦ−２ 欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第３０図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸１２３〜２０８を含んでなる、ＫＧＦ−２ 欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第３１図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸１３８〜２０８を含んでなる、ＫＧＦ−２ 欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第３２図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸３６〜１５３を含んでなる、ＫＧＦ−２欠 失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第３３図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸６３〜１５３を含んでなる、ＫＧＦ−２欠 失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列を示す。 第３４図は、ＫＧＦ−２のシステイン−３７のセリンへの変異体構築物に関す るＤＮＡ配列を示す。 第３５図は、ＫＧＦ−２のシステイン−３７／システイン−１０６のセリンへ の変異体構築物に関するＤＮＡ配列を示す。 第３６図は、雄のＳＤラット(ｎ＝５)における創傷治癒に対するＫＧＦ−２Δ ３３の作用評価を示す。動物に６mMの背側創傷を与えて、様々な濃度の緩衝液ま たはＫＧＦ−２Δ３３で４日間連続して処置した。較正されたJamesonカリパス を使用して、創傷を毎日測定した。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った( 平均＋／−ＳＥ)。^*緩衝液と比較した。 第３７図は、正常なラットにおける創傷治癒に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 を示す。雄、ＳＤ、２５０−３００ｇのラットに、全体的な厚さが６mMの背側創 傷を与えた。創傷をカリパスで測定して、手術した日から始めて４日間、様々な 濃度のＫＧＦ−２Δ３３および緩衝液で処置した。最終日に、創傷を収集した(h arvested)。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った。^*値を未処置の対照と比 較する。†値を緩衝液の対照と比較する。 第３８図は、切開による創傷における破損強度に対するＫＧＦ−２Δ３３の作 用を示す。雄の成体ＳＤラット(ｎ＝１０)に、全体的な厚さが２.５cmの切開に よる創傷を１日目に与えて、負傷した後に、緩衝液またはＫＧＦ−２(Δ３３)( １、４、および１０μｇ)の１回適用で切開内を処置した。５日目に、動物を犠 牲にして、通常の組織学および破損強度分析のために、０.５cmの創傷標本を切 除した。創傷をはさんで力を加えてインストロン皮膚表面張力計を使用して、生 体力学的試験を達成した。破損強度は、裂開前の各々の創傷により抑えられる(w ithheld)最も大きい力として定義された。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行 った(平均＋／−ＳＥ)。 第３９図は、切開による創傷における表皮の厚さに対するＫＧＦ−２(Δ３３) の作用を示す。雄の成体ＳＤラット(ｎ＝１０)に、全体的な厚さが２.５cmの切 開による創傷を１日目に与えて、負傷した後に、緩衝液またはＫＧＦ−２(Δ３ ３)(１、４、および１０μｇ)の１回適用で切開内を処置した。５日目に、動物 を犠牲にして、通常の組織学および破損強度分析のために、０.５cmの創傷標本 を切除した。創傷部位の周囲を測った６回の測定値の平均をとることにより、表 皮の厚さを測定した。測定値は、光学顕微鏡法の下に、較正されたレンズマイク ロメーターを使用して、Masson Trichromeで染色された切片に対してブラインド 観察者により測られた。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／− ＳＥ)。 第４０図は、単回の皮内注射後の表皮の厚さに対するＫＧＦ−２(Δ３３)の作 用を示す。雄の成体ＳＤラット(ｎ＝１８)に、５０μｌ中の１および４μｇの濃 度での緩衝液またはＫＧＦ−２の６回の皮内注射を日目に与えた。注射してから ２４および４８時間後に、動物を犠牲にした。表皮の厚さを、顆粒層から基底層 の底部まで測定した。約２０回の測定を注射部位に沿って行い、平均の厚さを定 量した。測定値は、光学顕微鏡法の下に、較正されたマイクロメーターを使用し て、Masson Trichromeで染色された切片に対して測定された。不対ｔ試験を使用 して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥ)。 第４１図は、BrdUスコア記録(scoring)に対するＫＧＦ−２(Δ３３)の作用を 示す。雄の成体ＳＤラット(ｎ＝１８)に、５０μｌ中の１および４μｇの濃度で のプラセボまたはＫＧＦ−２の６回の皮内注射を０日目に与えた。注射してから ２４および４８時間後に、動物を犠牲にした。犠牲にする２時間前に、動物に５ −２'−ブロモ−デオキシルジン(１００mg／kg、腹腔内)を注射した。スコア記 録は、光学顕微鏡法の下に、次のスコア記録システムを使用して、ブラインドさ れた観察者により行われた：０−３全く標識化されていない〜最小限に標識化さ れたBrdU細胞；４−６中程度の標識化；７−１０強度に標識化された細胞。不対 ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥ)。 第４２図は、ＰＡＦにより誘発される足水腫に対するＫＧＦ−２の抗炎症作用 を示す。 第４３図は、Lewisラットにおいて、ＰＡＦにより誘発される足水腫に対する ＫＧＦ−２Δ３３の抗炎症作用を示す。 第４４図は、全身照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存に対するＫＧＦ−２Δ ３３の作用を示す。２２.１ｇの雄のＢＡＬＢ／ｃマウス(ｎ＝５)に、５１９Ｒ ＡＤＳを照射した。照射する２日前、およびその後は７日間毎日、動物を緩衝液 またはＫＧＦ−２(１および５mg／kg、皮下)で処置した。 第４５図は、照射したマウスの体重に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用を示す。 ５１９Rad／分で照射する２日前に、２２.２ｇの雄のＢＡＬＢ／ｃマウス(ｎ＝ ５)に緩衝液またはＫＧＦ−２Δ３３(１、５mg／kg)を注射した。動物の体重を 毎日測って、照射してから７日間注射した。 第４６図は、全身照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率に対するＫＧＦ−２ Δ３３の作用を示す。２２.１ｇの雄のＢＡＬＢ／ｃマウス(ｎ＝７)に、５１９ ＲＡＤＳを照射した。照射する２日前、およびその後は７日間毎日、動物を緩衝 液またはＫＧＦ−２(１および５mg／kg、皮下)で処置した。 第４７図は、糖質コルチコイドで損なわれたラットモデルにおける創傷治癒に 対するＫＧＦ−２Δ３３の作用を示す。 第４８図は、BrdU標識化を使用して測定される、細胞増殖に対するＫＧＦ−２ Δ３３の作用を示す。 第４９図は、ラットの結腸における吻口手術部位に局在するコラーゲン含量に 対するＫＧＦ−２Δ３３の作用を示す。 詳細な説明 本発明の一態様により、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポ リペプチド、またはAmerican Type Culture Collection，１２３０１ ParkLawn Drive，Rockville，Maryland ２０８５２で１９９４年１２月１６日にＡＴＣＣ 寄託番号第７５９７７号として寄託されたクローンのcDNAによりコードされるポ リペプチドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。 核酸分子 特にことわらない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することにより決 定されたヌクレオチド配列は全て、自動化ＤＮＡシークエンサー(例えば、Appli ed Biosystems，Inc.製の３７３型)を使用して決定され、また本明細書中で決定 されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は全て、先の ように決定されたＤＮＡ配列の翻訳により予想された。従って、この自動化方法 により決定されたいずれのＤＮＡ配列に関しても当業界で知られているように、 本明細書中で決定されたいずれのヌクレオチド配列も、幾つかの誤りを含み 得る。自動化により決定されたヌクレオチド配列は、典型的には、配列決定され たＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％が同一で あり、より典型的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９.９％が同一で ある。実際の配列は、当業界でよく知られている手動ＤＮＡ配列決定法を含め、 他の方法により、より正確に決定することができる。当業界でも知られているよ うに、実際の配列と比較した、決定されたヌクレオチド配列における唯一の挿入 または欠失が、核酸配列の翻訳におけるフレームシフトの原因となるであろうこ とから、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予想アミノ酸配列は、 配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列とは全く異な り、そのことは、そのような挿入または欠失の位置で始まるであろう。 特にことわらない限り、本明細書中に示す「ヌクレオチド配列」は各々、デオ キシリボヌクレオチド(Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと略す)の配列として示される。し かし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」という語は、Ｄ ＮＡ分子またはポリヌクレオチドに関しては、デオキシリボヌクレオチドの配列 を意図し、またＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドに関しては、対応するリボヌ クレオチド(Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ)の配列を意図し、この場合、具体的に記した デオキシリボヌクレオチド配列におけるチミジンデオキシリボヌクレオチド(Ｔ) を各々、リボヌクレオチドのウリジン(Ｕ)で置換する。例えば、デオキシリボヌ クレオチドの略号を使用して示す配列番号１の配列を有するＲＮＡ分子に関して は、配列番号１のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣが各々、対応する リボヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣで置換され、またデオキシリボヌクレオチド のＴがリボヌクレオチドのＵで置換された配列を有するＲＮＡ分子を示すことを 意図する。 「単離された」核酸分子という語は、その天然の環境から除去された核酸分子 、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ 分子は、本発明の目的には単離されたと考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさ らなる例には、ヘテロロガス宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、または 溶液中で(部分的に、または実質的に)精製されたＤＮＡ分子が含まれる。単離さ れたＲＮＡ分子には、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロにおける Ｒ ＮＡ転写産物が含まれる。本発明による単離された核酸分子にはさらに、合成的 に製造された、そのような分子が含まれる。 本発明の単離された核酸分子には、第１図（配列番号１）に示すヌクレオチド 配列の１−３の位置にある開始コドンと共に、オープンリーディングフレーム( ＯＲＦ)を含んでなるＤＮＡ分子；第１図(最後の１７２または１７３のアミノ酸 )（配列番号２）に示す成熟ＫＧＦ−２タンパク質に関するコード配列を含んで なるＤＮＡ分子；および先に記載した配列とは実質的に異なるが、遺伝コードの 縮重により、それでもなおＫＧＦ−２タンパク質をコードする配列を含んでなる ＤＮＡ分子が含まれる。勿論、その遺伝コードは、当業界でよく知られている。 従って、先に記載した縮重変異体を発生させることは、当業者にとって通常であ ろう。 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト前立腺および胎 児の肺から得ることができる。そのポリペプチドをコードするcDNAのフラグメン トは、最初、ヒトの正常な前立腺から得られるライブラリーから単離された。そ の後、全長のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、ランダ ムにプライムされたヒト胎児の肺のcDNAライブラリーから単離された。それは、 構造上、ＦＧＦファミリーに関係している。それは、２０８のアミノ酸残基のタ ンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、このうち、最初の 約３５または３６のアミノ酸残基が推定リーダー配列であることから、成熟タン パク質は、１７３または１７２のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク質は、ヒ トケラチノサイト増殖因子に対して、２０６のアミノ酸長さにわたり、４５％の 同一性および８２％の類似性をもって、最も高度な相同性を示す。ＦＧＦファミ リーによって保存されるその配列が、本発明のタンパク質において保存されてい るのが見出されることもまた重要である。 加えて、ライブラリー由来のＫＧＦ−２cDNAの入れ子(nested)ＰＣＲから得ら れた結果は、可能性のある別のスプライスされた形のＫＧＦ−２があることを示 した。具体的には、ＫＧＦ−２のオープンリーディングフレームのＮ末端に隣接 するプライマーを使用して、０.２kbおよび０.４kbのＰＣＲ産生を様々なcDNAラ イブラリーから得た。０.２kbサイズは、ＫＧＦ−２に関して予期され る生成物であったが、０.４kbサイズは、別にスプライスされた形のＫＧＦ−２ から生じ得る。０.４kbの生成物は、胃癌、成人の睾丸、十二指腸、および膵臓 由来のライブラリーにおいて観察された。 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形であり得るか、またはＤＮＡの形で あり得、このＤＮＡには、cDNA、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。 そのＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖 または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコ ード配列は、第１図（配列番号１）に示すコード配列もしくは寄託されたクロー ンのコーディング配列と同じであるのがよく、または遺伝コードの重複または縮 重の結果として、コード配列が第１図（配列番号１）のＤＮＡもしくは寄託され たcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異なったコード配列であってもよ い。 第１図（配列番号：２）の予想成熟ポリペプチドまたは寄託されたcDNAにより コードされる予想成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、成熟ポ リペプチドに関するコード配列のみ；成熟ポリペプチドに関するコード配列、お よびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的 コード配列；成熟ポリペプチドに関するコード配列(また場合により、付加的コ ード配列)、および予想成熟ポリペプチドに関するコード配列のイントロンまた は非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列が含まれ得る 。加えて、遺伝子の５'および３'の非翻訳領域を含む、全長のmRNAが得られた( 第３図)。 当業者が認識するであろうように、先に論じた配列決定の誤りの可能性、さら にはまた、様々な既知のタンパク質におけるリーダーに関する切断部位の可変性 により、寄託されたcDNAによりコードされる実際のＫＧＦ−２ポリペプチドは、 約２０８のアミノ酸を含んでなるが、２００−２２０のアミノ酸範囲ならいずれ であってもよく；このタンパク質の実際のリーダー配列は、約３５または３６の アミノ酸であるが、約３０〜約４０のアミノ酸の範囲ならいずれであってもよい 。 従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、該ポ リペプチドに関するコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた 、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含 する。 本発明はさらに、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ チド、または寄託されたクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラ グメント、アナログ、および誘導体をコードする、先に記載したポリヌクレオチ ドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に 存在するアレル変異体、またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体で あり得る。 従って、本発明には、第１図（配列番号２）に示すものと同じ予想成熟ポリペ プチド、または寄託されたクローンのcDNAによりコードされる同じ予想成熟ポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレ オチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図（配列番号２）のポリペプ チド、または寄託されたクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラ グメント、誘導体、またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異 体には、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。 本発明には、治療用ペプチドとして使用することができる、ＫＧＦ−２の模倣 ペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。模倣ＫＧＦ−２ペプチドは 、ＫＧＦ−２のコグネイト受容体に結合して活性化することにより、ＫＧＦ−２ タンパク質の生物学的活性とよく似ている短いペプチドである。模倣ＫＧＦ−２ ペプチドはまた、ＫＧＦ−２のコグネイト受容体に結合して阻害することもでき る。ＫＧＦ−２受容体には、限定されるものではないが、ＦＧＦＲ２iiibおよび ＦＧＦＲ１iiibが含まれる。そのような模倣ペプチドは、限定されるものではな いが、ファージ展示または組み合わせ化学といったような方法から得られる。例 えば、Wrightonら，Science ２７３：４５８−４６３（１９９６）により開示さ れた模倣ＫＧＦ−２ペプチドを生成させる方法。 先に示したように、そのポリヌクレオチドは、第１図（配列番号１）に示すコ ード配列の天然に存在するアレル変異体、または寄託されたクローンのコード配 列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られ ているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠 失、または付加を有し得る、別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コ ードするポリペプチドの機能を実質的に変えない。 本発明にはまた、成熟ポリペプチドに関するコード配列が、宿主細胞からのポ リペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞から のポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ リーディングフレーム内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配 列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であって、宿主細胞により切断され て、成熟型のポリペプチドを形成するリーダー配列を有し得る。そのポリヌクレ オチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタン パク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質で あって、不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟 タンパク質が残る。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ 配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方 を有するタンパク質をコードし得る。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とする マーカー配列にフレーム内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合、 そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するた めの、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサヒスチジンタグ(tag)であって よく、または、例えば、哺乳動物宿主(例えば、ＣＯＳ−７細胞)を使用する場合 には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってもよい。そのＨＡ タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応 する(Wilson，Ｉ．ら，Cell ３７：７６７（１９８４）)。 「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の製造に関与するＤＮＡのセグメン トを意味し；それには、コード領域より前および後の領域(リーダーおよびトレ ーラー)、さらにはまた、個々のコードセグメント(エキソン)の間の介在配列(イ ントロン)が含まれる。 本発明の全長の遺伝子のフラグメントは、全長のcDNAを単離するための、およ びその遺伝子に対して高い配列類似性、または同様の生物学的活性を有する他の cDNAを単離するための、cDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプロ ーブとして使用することができる。このタイプのプローブは、少なくとも３０塩 基を有するのが好ましく、例えば、５０またはそれ以上の塩基を含み得る。その プローブを使用して、全長の転写産物、およびゲノムクローン、または調節およ びプロモーター領域、エキソン、並びにイントロンが含まれる完全な遺伝子を含 むクローンに対応するcDNAクローンを同定することもできる。スクリーニングの 例は、その既知のＤＮＡ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプローブを合成す ることにより、遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝 子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを使用し、ヒトcDNA 、ゲノムＤＮＡ、またはcDNAのライブラリーをスクリーニングして、ライブラリ ーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。 本発明のさらなる態様には、（ａ）予想リーダー配列を含め、第１図（配列番 号２）における完全なアミノ酸配列を有する、全長のＫＧＦ−２ポリペプチドを コードするヌクレオチド配列；（ｂ）第１図（配列番号２）において約３６また は３７〜２０８の位置にあるアミノ酸配列を有する、成熟ＫＧＦ−２ポリペプチ ド(リーダーを除去した全長のポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列；（ ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcDNAクローンによりコードされ るリーダーが含まれる完全なアミノ酸配列を有する、全長のＫＧＦ−２ポリペプ チドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に 含まれるcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＫＧＦ− ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）以下に記載する、いずれ かのＫＧＦ−２アナログまたは欠失変異体をコードするヌクレオチド配列；また は（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）における、いずれかの ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；に対して、少なくとも９０％が 同一のヌクレオチド配列、より好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％ 、９８％、もしくは９９％が同一のヌクレオチド配列を有するポリ ヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子が含まれる。 例えば、ＫＧＦ−２をコードする参考ヌクレオチド配列に対して、例えば、少 なくとも９５％が「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという 語は、ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードする参考ヌクレオチド配列の１００のヌ クレオチド毎につき、そのポリヌクレオチド配列に点変異が５つまで含まれ得る ことを除き、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参考配列と同一であるこ とを意図する。言いかえれば、参考ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５ ％が同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参考配 列におけるヌクレオチドの５％までは、欠失してもよいし、もしくは別のヌクレ オチドで置換されてもよく、または参考配列における全ヌクレオチドの５％まで の数のヌクレオチドを参考配列に挿入してもよい。参考配列のこれらの変異は、 参考ヌクレオチド配列の５'もしくは３'末端位、またはそれらの末端部位の間の どこかで起こり得て、参考配列におけるヌクレオチドの間に個別に、または参考 配列内部に１つまたはそれ以上の連続的な基として散在する。 実際的な問題として、個々の核酸分子がいずれも、例えば、第１図に示すヌク レオチド配列に対して、または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列に対 して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同 一であるかどうかは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Packag e，Unixのバージョン８，Genetics Computer Group，University Research Park ，５７５ Science Drive，Madison，ＷＩ ５３７１１)のような既知のコンピュ ータープログラムを従来通り使用して決定することができる。Bestfitは、Smith およびWaterman，Advances in Applied Mathematics２：４８２−４８９（１９ ８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列の間の相同性が最良の セグメントを見出す。Bestfitまたはいずれかの他のシークエンスアラインメン トプログラムを使用して、個々の配列が、本発明による参考配列に対して、例え ば、９５％が同一であるかどうかを決定する場合には、勿論、同一性のパーセン テージを参考ヌクレオチド配列の全長にわたり計算して、参考配列におけるヌク レオチドの全数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるよう、パラメ ーターを設定する。 本発明は、それらがＫＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードするかどう かにかかわらず、第１図［配列番号１］に示す核酸配列に対して、または寄託さ れたcDNAの核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９ ８％、または９９％が同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子が ＫＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえも、当業者が、 それでもなお、核酸分子を、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポ リメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)プライマーとしてどのように使用するかを知ってい るであろうからである。ＫＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードしない本 発明の核酸分子の使用には、とりわけ、（１）cDNAライブラリーにおけるＫＧＦ −２遺伝子またはそのアレル変異体を単離すること；（２）Vermaら，Human Chr omosomes：A Mannual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York（１９ ８８）に記載されているような、ＫＧＦ−２遺伝子の正確な染色体位置を得るた めの、中期染色体拡散に対するin situハイブリダイゼーション(例えば、“ＦＩ ＳＨ”)；および特定の組織におけるＫＧＦ−２ mRNA発現を検出するためのノー ザンブロット分析が含まれる。 しかし、ＫＧＦ−２タンパク質活性を有するポリペプチドを実際にコードする 、第１図［配列番号１］に示す核酸配列に対して、または寄託されたcDNAの核酸 配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９ ９％が同一である配列を有する核酸分子が好ましい。「ＫＧＦ−２活性を有する ポリペプチド」という語は、必ずしも同一であるとは限らないが、ある特定の生 物学的アッセイにおいて測定される、本発明の野生型ＫＧＦ−２タンパク質の活 性、または野生型ＫＧＦ−２タンパク質(全長のタンパク質、もしくは好ましく は、成熟タンパク質のいずれか)の活性以上に高められた活性と同様の活性を示 すポリペプチドを意図する。 ＫＧＦ−２活性のアッセイを、例えば、以下の実施例１０および１１に開示す る。これらのアッセイを使用して、部分的に精製された天然のタンパク質もしく は組換えタンパク質、または精製された天然のタンパク質もしくは組換えタンパ ク質のＫＧＦ−２活性を測定することができる。 ＫＧＦ−２は、表皮ケラチノサイトの増殖を刺激するが、線維芽細胞のような 間葉細胞の増殖は刺激しない。従って、「ＫＧＦ−２タンパク質活性を有するポ リペプチド」には、実施例１０に示すケラチノサイト増殖アッセイにおいてＫＧ Ｆ−２活性を示し、またＦＧＦ受容体イソ型１−iiibおよび２−iiib(実施例１ １)に結合するであろうポリペプチドが含まれる。活性の程度がＫＧＦ−２タン パク質の活性と同一である必要はないが、好ましくは、「ＫＧＦ−２タンパク質 活性を有するポリペプチド」は、ＫＧＦ−２タンパク質と比較した場合、実質的 に同様の活性を示すであろう(すなわち、候補となるポリペプチドは、参考ＫＧ Ｆ−２タンパク質に比べて、より優れた活性、または約１０倍以下の活性、好ま しくは、約２倍以下の活性を示すであろう)。 勿論、遺伝コードの縮重により、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配列または 第１図［配列番号１］に示す核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９ ６％、９７％、９８％、または９９％が同一である配列を有する多数の核酸分子 が、「ＫＧＦ−２タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードするであろう ことがすぐ分かるであろう。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体は全 て、同じポリペプチドをコードすることから、これは、先に記載した比較アッセ イを行うことすらなく、当業者に明らかとなるであろう。縮重変異体ではない、 そのような核酸分子に関して、妥当な数がまた、ＫＧＦ−２タンパク質活性を有 するポリペプチドをコードするであろうことも当業界でさらに分かるであろう。 これは、当業者が、タンパク質機能にほとんど著しくは影響しそうにない、また は著しく影響しそうにないアミノ酸置換(例えば、１つの脂肪族アミノ酸を、も う１つの脂肪族アミノ酸で置換すること)を十分知っているからである。 例えば、表現型によるサイレントアミノ酸置換をどのように行うかということ に関わるガイダンスは、Bowie，J．U．ら，“Deciphering the Message in Prot ein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitution”,Science ２４７：１ ３０６−１３１０（１９９０）に与えられており、この中で、著者は、アミノ酸 配列の変化に対する許容度を試験するために２つの主要な方法があることを示し ている。第１の方法は、変異が天然の選択により許容されるか、または拒絶され るかという進化のプロセスに頼っている。第２の方法は、遺伝子工学を使用して 、クローン化された遺伝子の特定の部位でアミノ酸変化を導入し、 選択またはスクリーニングして、機能を維持する配列を同定する。著者が述べて いるように、これらの試験は、タンパク質がアミノ酸置換を驚くほど許容するこ とを明らかにした。著者はさらに、どのアミノ酸変化がタンパク質のある位置で 許される可能性があるかを示している。例えば、最も埋没された(buried)アミノ 酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の僅かな特徴しか一般に保存さ れていない。他のそのような表現型によるサイレント置換は、Bowie，J．U．ら ，上記、およびその中で引用されている文献に記載されている。 本発明はさらに、配列の間に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０ ％、より好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは９６％、９７％、９ ８％、９９％の同一性がある場合に、先に記載した配列にハイブリダイズするポ リヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、先に記載し たポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書 中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列の間に、少な くとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブ リダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様において、先 に記載したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図 （配列番号１）のcDNAまたは寄託されたcDNAによりコードされる成熟ポリペプチ ドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする 。 「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」の例には、５０％ホルムア ミド、５ｘＳＳＣ(１５０ｍＭ NaCl、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム)、５０ｍ Ｍリン酸ナトリウム(ｐＨ ７.６)、５ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラ ン、および２０μｇ／ml変性されて剪断されたサケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液 中、４２℃で一晩インキュベーションした後、０.１ｘＳＳＣ中、そのフィルタ ーを約６５℃で洗浄することが含まれる。 あるいはまた、そのポリヌクレオチドは、少なくとも２０塩基、好ましくは３ ０塩基、より好ましくは少なくとも５０塩基を有するのがよく、これは、本発明 のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、また先に記載したように、それに対し て同一性を有し、また活性を保持し得るか、または保持し得ない。例えば、その ようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの発見のための、配列番 号１のポリヌクレオチドに対するプローブとして、または診断用プローブとして 、またはＰＣＲプライマーとして使用することができる。 勿論、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または第１図［配列番号１］に示す ヌクレオチド配列の、全てではないとしても、大部分に対応するポリヌクレオチ ドと同様に、参考ポリヌクレオチド(例えば、寄託されたcDNAクローン)の大きな 部分(例えば、長さが５０−７５０ntの部分)にハイブリダイズするポリヌクレオ チド、または全体の長さの参考ポリヌクレオチドにさえもハイブリダイズするポ リヌクレオチドもまた、本発明によるプローブとして有用である。「長さが少な くとも２０nt」のポリヌクレオチドの部分という語は、参考ポリヌクレオチド( 例えば、寄託されたcDNAまたは第１図［配列番号１］に示すようなヌクレオチド 配列)のヌクレオチド配列由来の２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドを意図 する。示したように、そのような部分は、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション 技術によるプローブとして、または例えば、Sambrook，J．，Fritsch，E．F．お よびManiatis，T．により編集された、Molecular Cloning，A Laboratory Mannu al，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(この開示に記載されている 内容は全て、本発明の一部を構成する)に記載されているような、ポリメラーゼ 連鎖反応(ＰＣＲ)による標的配列の増幅のためのプライマーとして診断上有用で ある。 ＫＧＦ−２ cDNAクローンは寄託されており、その決定されたヌクレオチド配 列は第１図［配列番号１］に与えられているので、ＫＧＦ−２ cDNA分子の部分 にハイブリダイズするポリヌクレオチドを作ることは、当業者にとって容易であ ろう。例えば、ＫＧＦ−２ cDNAクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断または 音波処理による剪断を容易に使用して、ＫＧＦ−２ cDNA分子の部分にハイブリ ダイズするポリヌクレオチドである、様々なサイズのＤＮＡ部分を生成させるこ とができるであろう。あるいはまた、本発明のハイブリダイズするポリヌクレオ チドは、既知の技術により、合成的に生成させることができる。勿論、ポリＡ配 列(例えば、第１図［配列番号１］に示すＫＧＦ−２ cDNAの３'末端ポリ(Ａ)域) にのみハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはＴ(もしくはＵ 残基)の相補的ストレッチ(stretch)にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、 本発明の核酸の部分にハイブリダイズさせるために使用する本発明のポリヌクレ オチドには含まれないであろう。何故なら、そのようなポリヌクレオチドは、ポ リ(Ａ)ストレッチまたはその相補物(例えば、いずれかの二本鎖cDNAクローン)を 含む、いずれの核酸分子にもハイブリダイズするであろうからである。 本発明はさらに、ＫＧＦ−２タンパク質のエピトープを有する部分をコードす るポリヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子を提供する。特に、第１ 図（配列番号２）における次のアミノ酸残基を含んでなる、ポリペプチドをコー ドする単離された核酸分子を与える。本発明の発明者らは、それらをＫＧＦ−２ タンパク質の抗原領域であると決定した： そしてまた、さらに２つのより短い予想される抗原領域、Gln７４−Arg７８、お よびGln１７０−Gln１７５がある。ＫＧＦ−２のそのようなエピトープを有する 部分を生成させる方法を、以下に詳細に記載する。 本明細書中でいう寄託は、特許手続を目的とした微生物の寄託の国際承認に関 するブダペスト条約の条件の下に維持されるであろう。これらの寄託は、単に当 業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２ の下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質に含まれるポリ ヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのア ミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載 と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、また は販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは 付与されない。 ＫＧＦ−２ポリペプチドおよびフラグメント 本発明はさらに、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ チド、または寄託されたcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプ チド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、およ び誘導体に関する。 当業者が認識するであろうように、先に論じた配列決定の誤りの可能性、さら にはまた、様々な既知のタンパク質におけるリーダーに関する切断部位の可変性 により、寄託されたcDNAによりコードされる実際のＫＧＦ−２ポリペプチドは、 約２０８のアミノ酸を含んでなるが、２００−２２０のアミノ酸範囲ならいずれ であってもよく；このタンパク質の実際のリーダー配列は、約３５または３６の アミノ酸であるが、約３０〜約４０のアミノ酸の範囲ならいずれであってもよい 。 第１図（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたcDNAによりコードされ るポリペプチドに関する場合、「フラグメント」、「誘導体」、および「アナロ グ」という用語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または 活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロタンパク 質部分の切断により活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができ るプロタンパク質が含まれる。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または 合成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであるのがよい。 第１図（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたcDNAによりコードされ るポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つまたは それ以上のアミノ酸残基が同類アミノ酸残基または非同類アミノ酸残基(好まし くは、同類アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基 が、遺伝コードによりコードされるものであってもよく、または遺伝コードによ りコードされるものでなくてもよいもの、または（ii）１つまたはそれ以上のア ミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、その ポリペプチドの半減期を増大させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)の ような、別の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは 分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロタンパ ク質配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているも のであり得る。そのようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書 中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。 「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、(一般に認識されるよ うに)同義語と見なされ、また文脈から、少なくともペプチジル結合により結合 したアミノ酸の鎖を示すことが必要な場合、各々の用語は、互換的に使用するこ とができる。「ポリペプチド」という語は、１０以上のアミノ酸残基を含む鎖に 対して本明細書中で使用する。本明細書中のオリゴペプチドおよびポリペプチド の式または配列は全て、左から右へ、またアミノ末端からカルボキシ末端の方向 で書かれている。 タンパク質の構造または機能の著しい影響なしに、ＫＧＦ−２ポリペプチドの 幾つかのアミノ酸配列を変えることができることが当業界で分かるであろう。配 列における、そのような相違が意図されるならば、活性を測定するタンパク質上 に重要な領域があることを思い出すべきである。一般に、同様の機能を果たす残 基を使用するならば、三次構造を形成する残基を置換することは可能である。他 の例においては、タンパク質の重要ではない領域で変化が起こる場合、残基の種 類は全く重要でないことがあり得る。 従って、本発明にはさらに、実質的なＫＧＦ−２ポリペプチド活性を示すＫＧ Ｆ−２ポリペプチドの変異体、または以下に論ずるタンパク質部分のようなＫＧ Ｆ−２タンパク質の領域を含むＫＧＦ−２ポリペプチドの変異体が含まれる。そ のような変異体には、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換(例えば、他 の残基を１つの親水性の残基で置換するが、一般に、強く疎水性のものを強く親 水性のものでは置換しない)が含まれる。小さな変化またはそのような「中立の 」アミノ酸置換は、一般に、活性に対してほとんど影響を有しないであろう。 別のものをあるものにする(one for another)置換、特に脂肪族アミノ酸Ala、 Val、Leu、およびIleの間での置換、ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互交換 、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGlnの間での置換、塩基性 残基LysおよびArgの交換、並びに芳香族残基Phe、Tyrの中での置換は、 同類置換として典型的に見られる。 先に詳細に示したように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可 能性がある(機能に関して著しく有害な影響を有していない可能性がある)かに関 するガイダンスは、Bowie，J．U．ら，“Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitution”，Science２４７：１３０ ６−１３１０（１９９０）に見出すことができる。 本発明には、治療用ペプチドとして使用することができる、ＫＧＦ−２の模倣 ペプチドが含まれる。模倣ＫＧＦ−２ペプチドは、ＫＧＦ−２のコグネイト受容 体に結合して活性化することにより、ＫＧＦ−２タンパク質の生物学的活性とよ く似ている短いペプチドである。模倣ＫＧＦ−２ペプチドはまた、ＫＧＦ−２の コグネイト受容体に結合して阻害することもできる。ＫＧＦ−２受容体には、限 定されるものではないが、ＦＧＦＲ２iiibおよびＦＧＦＲ１iiibが含まれる。そ のような模倣ペプチドは、限定されるものではないが、ファージ展示または組み 合わせ化学といったような方法から得られる。例えば、Wrightonら，Science２ ７３：４５８−４６３（１９９６）により開示された方法を使用して、模倣ＫＧ Ｆ−２ペプチドを生成させることができる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供するの が好ましく、好ましくは、均一となるまで精製する。 本発明のポリペプチドは、単離された形であるのが好ましい。「単離されたポ リペプチド」という語は、その天然の環境から除去されたポリペプチドを意図す る。従って、組換え宿主細胞内で産生されるポリペプチド、および／または組換 え宿主細胞内に含まれるポリペプチドは、本発明の目的には単離されたと考えら れる。組換え宿主細胞または天然源から部分的または実質的に精製されたポリペ プチドもまた意図される。 本発明のポリペプチドには、配列番号２のポリペプチド(特に、成熟ポリペプ チド)、さらにはまた、配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも９０％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性(より好ましくは、少なく とも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性)を有するポリ ペプチドが含まれ、一般に、少なくとも３０のアミノ酸、より好ましくは少なく と も５０のアミノ酸を含むポリペプチド(例えば、以下に記載する欠失変異体)のそ のような部分をもつ、そのようなポリペプチドの部分もまた含まれる。 当業界で知られているように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、ある ポリペプチドのアミノ酸配列およびその同類アミノ酸置換物を、もう１つのポリ ペプチドの配列と比較することにより決定される。 ２つのポリペプチドに関する「類似性％」とは、Bestfitプログラム(Wisconsi n Sequence Analysis Package，Unixのバージョン８，Genetics Computer Group ,University Research Park，５７５ Science Drive，Madison，ＷＩ ５３７１ １)、および類似性を決定するためのデフォールトセッティング(default settng )を使用して、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより得られ る類似性スコアを意図する。Bestfitは、SmithおよびWaterman(Advances in App lied Mathematics ２：４８２−４８９（１９８１）)の局所相同性アルゴリズム を使用して、２つの配列の間の類似性が最良のセグメントを見出す。 例えば、ＫＧＦ−２ポリペプチドの参考アミノ酸配列に対して、例えば、少な くとも９５％が「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドという語は、ＫＧ Ｆ−２ポリペプチドの参考アミノ酸配列の１００のアミノ酸毎につき、そのポリ ペプチド配列にアミノ酸変化が５つまで含まれ得ることを除き、該ポリペプチド のアミノ酸配列が参考配列と同一であることを意図する。言いかえれば、参考ア ミノ酸配列に対して、少なくとも９５％が同一のアミノ酸配列を有するポリペプ チドを得るためには、参考配列におけるアミノ酸残基の５％までは、欠失しても よいし、もしくは別のアミノ酸で置換されてもよく、または参考配列における全 アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を参考配列に挿入してもよい。参考配列 のこれらの変化は、参考アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端部位、ま たはそれらの末端部位の間のどこかで起こり得て、参考配列における残基の間に 個別に、または参考配列内部に１つまたはそれ以上の連続的な基として散在する 。 実際的な問題として、個々のポリペプチドがいずれも、例えば、第１図［配列 番号２］に示すアミノ酸配列に対して、または寄託されたcDNAクローンによりコ ードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９ ７％、９８％、または９９％が同一であるかどうかは、Bestfitプログラム(Wisc onsin Sequence Analysis Package，Unixのバージョン８，Genetics Computer G roup，University Research Park，５７５ Science Drive，Madison，ＷＩ ５３ ７１１)のような既知のコンピュータープログラムを従来通り使用して決定する ことができる。Bestfitまたはいずれかの他のシークエンスアラインメントプロ グラムを使用して、個々の配列が、本発明による参考配列に対して、例えば、９ ５％が同一であるかどうかを決定する場合には、勿論、同一性のパーセンテージ を参考アミノ酸配列の全長にわたり計算して、参考配列におけるアミノ酸残基の 全数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるよう、パラメーターを設 定する。 以下に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドを使用して、ポリクロー ナルおよびモノクローナル抗体を生じさせることができる。それらは、以下に記 載するＫＧＦ−２タンパク質発現を検出するための診断用アッセイにおいて有用 であり、またはＫＧＦ−２タンパク質機能を高め、もしくは阻害することが可能 なアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、そのようなポリ ペプチドを酵母のツーハイブリッドシステムで使用して、本発明により候補とな るアゴニストおよびアンタゴニストでもある、ＫＧＦ−２タンパク質を結合する タンパク質を「捕獲」することができる。酵母のツーハイブリッドシステムは、 FieldsおよびSong，Nature ３４０：２４５−２４６（１９８９）に記載されて いる。 別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープを有する部 分を含んでなる、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部 分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原エピトープまたは抗原エピト ープである。「免疫原エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合に、 抗体反応を誘引するタンパク質の部分として定義される。これらの免疫原エピト ープは、分子上の幾つかの場所に限られると信じられる。他方では、抗体が結合 することができるタンパク質分子の領域は、「抗原エピトープ」として定義され ている。タンパク質の免疫原エピトープの数は、一般に、抗原エピトープの数よ り少ない。例えば、Geysenら，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ ８１：３ ９９８−４００２（１９８３）を参照。 抗原エピトープ(すなわち、抗体が結合することができるタンパク質分子の領 域を含む)を有するペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、あるタンパク 質配列の部分を模倣する(mimic)比較的短い合成ペプチドは、部分的に模倣され たタンパク質と反応する抗血清を誘引することが可能であることは当業界でよく 知られている。例えば、Sutcliffe，J．G．，Shinnick，T．M．，Green，N．、 およびLearner，R．A．（１９８３）Antibodies that react with predetermine d sites on proteins．Science ２１９：６６０−６６６を参照。 タンパク質反応性血清を誘引することが可能なペプチドは、しばしば、タンパク 質の一次配列において示され、一組の簡単な化学規則により特徴付けられ、また 無傷のタンパク質の免疫優性領域(すなわち、免疫原エピトープ)にも、またはア ミノもしくはカルボキシル末端にも限られない。極めて疎水性であるペプチド、 および６つまたはより少ない残基のペプチドは、一般に、模倣されたタンパク質 に結合する抗体を誘引するのに有効ではなく；より長く、可溶性のペプチド、と りわけプロリン残基を含むペプチドは、通常、有効である。Sutcliffeら，上記 ，６６１。例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ１のポリペプチド 鎖の配列の７５％をカバーする８−３９の残基を含む、これらのガイダンスによ り設計された２０のペプチドのうち１８は、ＨＡ１タンパク質または無傷のウイ ルスと反応する抗体を誘導し；またMuLVポリメラーゼ由来の１２／１２のペプチ ド、および狂犬病糖たんぱく質由来の１８／１８は、各々のタンパク質を沈殿さ せる抗体を誘導した。 従って、本発明の抗原エピトープを有するペプチドまたはポリペプチドは、モ ノクローナル抗体を含め、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を生じ させるのに有用である。従って、抗原エピトープを有するペプチドで免疫化した ドナー由来の膵臓細胞の融合により得られるハイブリドーマの多くは、一般に、 天然のタンパク質と反応する抗体を分泌する。Sutcliffeら，上記，６６３。抗 原エピトープを有するペプチドまたはポリペプチドにより生じさせた抗体は、模 倣されたタンパク質を検出するのに有用であり、また様々なペプチドに対する抗 体は、翻訳後プロセッシングを受けるタンパク質前駆体の様々な領域の結末を追 跡するのに使用することができる。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド( 例えば、約９のアミノ酸)でさえも、より大きなペプチドを結合して置換するこ とができることが示されたことから、そのペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模 倣されたタンパク質に関する様々な定性的アッセイまたは定量的アッセイにおい て、例えば、競合アッセイにおいて使用することができる。例えば、Wilsonら， Cell ３７：７６７−７７８（１９８４），７７７を参照。本発明の抗ペプチド 抗体はまた、例えば、当業界でよく知られている方法を使用する吸着クロマトグ ラフィーによる模倣されたタンパク質の精製にも有用である。 先のガイダンスにより設計された、本発明の抗原エピトープを有するペプチド およびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、少 なくとも７、より好ましくは少なくとも９、最も好ましくは約１５〜約３０の間 のアミノ酸の配列を含むのが好ましい。しかし、約３０、４０、５０、６０、７ ０、８０、９０、１００、もしくは１５０のアミノ酸を含む、本発明のポリペプ チドのアミノ酸配列のより大きな部分、または本発明のポリペプチドの全体のア ミノ酸配列までの、いずれの長さを含んでなるペプチドもしくはポリペプチド、 およびその全体のアミノ酸配列が含まれるペプチドもしくはポリペプチドもまた 、本発明のエピトープを有するペプチドまたはポリペプチドと考えれ、模倣され たタンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、エピトー プを有するペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を与えるよ う選択し(すなわち、その配列には、比較的親水性の残基が含まれており、比較 的疎水性の配列を避けるのが好ましい)；またプロリン残基を含む配列が特に好 ましい。 ＫＧＦ−２に特異的な抗体を生成させるために使用することができる抗原ポリ ペプチドまたはペプチドの非限定的な例には、次のものが含まれる： そしてまた、さらに２つのより短い予想される抗原領域、Gln７４−Arg７８、お よびGln１７０−Gln１７５がある。 本発明のエピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分 子を使用して、組換え法を含め、ペプチドまたはポリペプチドを製造するための 、いずれかの従来の方法により製造することができる。例えば、短いエピトープ を有するアミノ酸配列を、組換え製造および精製の間、さらにはまた、免疫化の 間、担体として作用する、より大きなポリペプチドに融合させて、抗ペプチド抗 体を製造することができる。エピトープを有するペプチドはまた、化学合成の既 知の方法を使用して合成することもできる。例えば、Houghtenは、４週間未満で 製造されて特徴付けられた(ＥＬＩＳＡ型の結合試験により)ＨＡ１ポリペプチド のセグメントの１個のアミノ酸変異体である、１０−２０mgの２４８の異なった １３の残基のペプチドのような、多数のペプチドの合成の簡単な方法を記載して いる。Houghten，R．A．（１９８５）General method for the rapid solid−ph ase synthesis of large numbers of peptides：specificity of antigen−anti body interaction at the level of individual amino acids．Proc．Natl．Aca d．Sci．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５。この「同時多重ペプチド合成(ＳＭ ＰＳ)」のプロセスはさらに、Houghtenら（１９８６）の米国特許第４，６３１, ２１１号に記載されている。この方法では、様々なペプチドの固相合成のための 個々の樹脂が別々の溶媒透過性バケットに含まれており、固相法に関与する多く の同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全に手動の方法は、５００−１ ０００またはそれ以上の合成を同時に行えるようにする。Houghtenら，上記，５ １３４。 当業界でよく知られている方法により、本発明のエピトープを有するペプチド およびポリペプチドを使用して、抗体を誘導する。例えば、Sutcliffeら，上記 ；Wilsonら，上記；Chow，M．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ ８２：９１ ０−９１４；およびBittle，F．J．ら，J．Gen．Virol．６６：２３４７−２３ ５４（１９８５）を参照。。一般に、動物を遊離ペプチドで免疫化するのがよい ；しかし、そのペプチドは、カサガイヘマシアニン(ＫＬＨ)また は破傷風トキソイドといったような高分子担体に結合させることにより、抗ペプ チド抗体の力価を高めることができる。例えば、システインを含むペプチドは、 m−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)の ようなリンカーを使用して担体に結合させるのがよいが、他のペプチドは、グル タルアルデヒドのような、より一般的なリンキング剤を使用して担体に結合させ るのがよい。ウサギ、ラット、およびマウスといったような動物を、例えば、約 １００μｇのペプチド、または担体タンパク質、およびフロイントアジュバント を含むエマルションの腹腔内注射および／または皮内注射により、遊離ペプチド または担体に結合させたペプチドで免疫化する。例えば、固体表面に吸着させた 遊離ペプチドを使用するＥＬＩＳＡアッセイにより検出することができる、抗ペ プチド抗体の有用な力価を与えるために、ブースター注射が、例えば、約２週間 の間隔で数回必要とされ得る。免疫化した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の 力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当業界でよく知られている方法 による、固体担体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増大 させることができる。 本発明の免疫原エピトープを有するペプチド、すなわち、タンパク質全体が免 疫原である場合に、抗体反応を誘引するタンパク質の部分を当業界でよく知られ ている方法により同定する。例えば、Geysenら，上記は、酵素結合免疫吸着アッ セイにおいて反応させるのに十分な純度の、何百というペプチドの固形支持体上 での急速同時合成方法を開示している。次いで、合成したペプチドと抗体との相 互作用は、それらを支持体から除去することなく、容易に検出される。この方法 では、所望のタンパク質の免疫原エピトープを有するペプチドは、当業者により 通常的に同定することができる。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質に おける免疫学的に重要なエピトープは、Geysenらにより、タンパク質の全体の２ １３のアミノ酸配列をカバーする、重複する組の全ての２０８の可能なヘキサペ プチドの合成による７のアミノ酸の分折(resolution)で位置確認された。次に、 全ての２０のアミノ酸がエピトープ内の全ての位置で順次(in turn)置換された 、完全な置換された一組のペプチドを合成して、抗体との反応に特異性を与える 特定のアミノ酸を決定した。従って、この方法により、本発明のエピトープ を有するペプチドのペプチドアナログを通常的に製造することができる。Geysen （１９８７）の米国特許第４,７０８,７８１号はさらに、所望のタンパク質の免 疫原エピトープを有するペプチドを同定する、この方法を開示している。 なおさらに、Geysen（１９９０）の米国特許第５,１９４,３９２号は、問題の ある抗体の特定のパラトープ(抗原結合部位)に相補的であるエピトープのトポロ ジー的な等価物(すなわち、「ミモトープ」)であるモノマー(アミノ酸または他 の化合物)の配列を検出または決定する一般的な方法を記載している。より一般 的には、Geysen（１９８９）の米国特許第４,４３３,０９２号は、問題の特定の 受容体のリガンド結合部位に相補的であるリガンドのトポロジー的な等価物であ るモノマーの配列を検出または決定する方法を記載している。同様に、過アルキ ル化オリゴペプチド混合物に関する、Houghten，R．A．ら（１９９６）の米国特 許第５,４０８,９７１号は、直鎖状Ｃ₁−Ｃ₇−アルキルで過アルキル化されたオ リゴペプチド、並びにそのようなペプチドの組およびライブラリー、さらにはま た、問題の受容体分子に優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を 決定するために、そのようなオリゴヌクレオチドの組およびライブラリーを使用 する方法を開示している。従って、本発明のエピトープを有するペプチドの非ペ プチドアナログもまた、これらの方法により通常的に製造することができる。 当業者は、先に記載した本発明のＫＧＦ−２ポリペプチド、およびそのエピト ープを有するフラグメントを、免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの部分と組 み合わせて、キメラポリペプチドを生じ得ることを認識するであろう。これらの 融合タンパク質は、精製を容易にして、インビボにおいて増大された半減期を示 す。これは、例えば、ヒトＣＤ−４−ポリペプチドの最初の２つのドメイン、お よび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメインか らなるキメラタンパク質に関して示された(ＥＰＡ ３９４，８２７；Traunecker ら，Nature ３３１：８４−８６（１９８８）)。IgG部分によりジスルフィド結 合したダイマー構造を有する融合タンパク質もまた、モノマーＫＧＦ−２タンパ ク質またはタンパク質フラグメント単独より、他の分子を結合して中和するのに 有効であり得る(Fountoulakisら，J．Biochem．２７０：３９５８−３ ９６４（１９９５）)。 本発明により、ＫＧＦ−２の新規変異体もまた記載する。これらは、ＫＧＦ− ２の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠失または置換することにより製造するこ とができる。天然の変異体は、アレル変異体と呼ばれている。アレル変異体は、 サイレントであり得る(コードされたポリペプチドには何の変化もない)か、また は変えられたアミノ酸配列を有し得る。 天然のＫＧＦ−２の特性を改善または変更しようとするためには、タンパク質 工学を使用することができる。当業界で知られている組換えＤＮＡ技術を使用し て、新規ポリペプチドを作り出すことができる。ムテインおよび欠失は、例えば 、高められた活性、または増大された安定性を示し得る。加えて、それらは、よ り高い収率で精製することができ、少なくともある精製および保存条件下、より 良好な溶解性を示す。構築することができる変異の例を以下に示す。 アミノ末端およびカルボキシ末端の欠失 組換えＤＮＡ技術を使用して、ＦＧＦファミリーの様々なメンバーを修飾した 。ヘパリン結合に重要であるaＦＧＦおよびbＦＧＦにおいて、正に帯電した分子 を置換または欠失させた。その修飾された分子は、減少されたヘパリン結合活性 を生じた。従って、患者においてヘパリンにより隔離される修飾された分子の量 は減少し、より多くのＦＧＦが適当な受容体に到達するであろうことから力価を 増大させることが知られている(欧州特許第０ ２９８ ７２３号)。 天然のＫＧＦ−２は、水性状態において比較的不安定であり、またそれは、化 学的分解および物理的分解を受けて、プロセッシングおよび保存の間に生物学的 活性の損失を生ずる。天然のＫＧＦ−２はまた、水溶液中、高温で凝集する傾向 があり、またそれは、酸性条件下に不活性となる。 天然のＫＧＦ−２の１つまたはそれ以上の特性を改善または変更するためには 、タンパク質工学を使用することができる。Ronら，J．Biol．Chem．２６８(４) ：２９８４−２９８８（１９９３）は、たとえ３、８、または２７のアミノ末端 アミノ酸残基がなくても、ヘパリン結合活性を有する修飾ＫＧＦタンパク質を報 告した。３および８のアミノ酸の欠失は、完全な活性を有していた。より多 くのＫＧＦの欠失は、ＰＣＴ／ＩＢ９５／００９７１に記載されている。カルボ キシ末端アミノ酸の欠失は、タンパク質の活性を高め得る。１つの例は、タンパ ク質のカルボキシ末端から１０のアミノ酸残基を欠失することにより、より高い ogy ７：１９９−２１６（１９８８）)。従って、本発明の一態様は、天然のＫ ＧＦ−２ポリペプチドに比べて高められた安定性を示す、(例えば、典型的なｐ Ｈ、熱条件、または他の保存条件に曝露した場合)ＫＧＦ−２のポリペプチドア ナログ、およびそのようなアナログをコードするヌクレオチド配列を提供するこ とである。 特に好ましいＫＧＦ−２ポリペプチドを以下に示す(ナンバリングは、タンパ ク質における最初のアミノ酸(Met)で始める)： 好ましい態様には、Ｎ末端欠失のAla(６３)--Ser(２０８)(ＫＧＦ−２Δ２８) およびSer(６９)--Ser(２０８)(ＫＧＦ−２Δ３３)が含まれる。他の好ましいＮ 末端およびＣ末端欠失変異体を、本明細書の実施例１３および１６(ｃ)に記載し 、これには、Ala(３９)--Ser(２０８)；Pro(４７)--Ser(２０８)；Val(７７)--S er(２０８)；Glu(９３)--Ser(２０８)；Glu(１０４)--Ser(２０８)；Val(１２３ )--Ser(２０８)；およびGly(１３８)--Ser(２０８)が含まれる。他の好ましいＣ 末端欠失変異体には、Met(１)，Thr(３６)，またはCys(３７)--Lys(１５３)が含 まれる。 本発明には、Ｎ末端およびＣ末端の両方から欠失したアミノ酸を有する欠失変 異体もまた含まれる。そのような変異体には、先に記載したＮ末端欠失変異体お よびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせ(例えば、Ala(３９)--His(２００)、M et(４４)--Arg(１９３)、Ala(６３)--Lys(１５３)、Ser(６９２)--Lys(１５３) 等、等、等…)が含まれる。それらの組み合わせは、当業者に知られている組換 え技術を使用して製造することができる。 従って、一態様において、本発明は、Ｎ末端欠失変異体を提供する。そのよう な変異体には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の３８のＮ末端アミノ酸 残基の欠失(すなわち、少なくともMet(１)--Gln(３８)の欠失)であるが、最初の １４７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失を除いては、第１図（配列番号２）に示 すアミノ酸配列を含んでなる変異体が含まれる。あるいはまた、その欠失には、 第１図（配列番号２）の少なくとも最初の３８のＮ末端アミノ酸残基(すなわち 、少なくともMet(１)--Gln(３８)の欠失)であるが、最初の１３７以下のＮ末端 アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（配列 番号２）の少なくとも最初の４６のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７ 以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、 第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６２のＮ末端アミノ酸残基であるが、 最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、そ の欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６８のＮ末端アミノ酸残 基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。ある いはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の７６のＮ末 端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるで あろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初 の９２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基 が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少 なくとも最初の１０３のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末 端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（配 列番号２）の少なくとも最初の１２２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１ ３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。 先に記載したＮ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、先に記載した 範囲の全ての組み合わせにも関する。例えば、第１図（配列番号２）の少なくと も最初の６２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の６８以下のＮ末端アミノ酸 残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６２のＮ末端アミノ酸残 基であるが、最初の７６以下のN末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２ ）の少なくとも最初の６２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の９２以下のＮ 末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６２のＮ末 端アミノ酸残基であるが、最初の１０３以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１ 図（配列番号２）の少なくとも最初の６８のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初 の７６以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最 初の６８のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の９２以下のＮ末端アミノ酸残基 の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６８のＮ末端アミノ酸残基で あるが、最初の１０３以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２） の少なくとも最初の４６のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の６２以下のＮ末 端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最初の４６のＮ末端 アミノ酸残基であるが、最初の６８以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（ 配列番号２）の少なくとも最初の４６のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初 の７６以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失等、等、等…。 別の態様において、本発明は、Ｃ末端欠失変異体を提供する。好ましくは、該 Ｃ末端欠失変異体のＮ末端アミノ酸残基は、第１図（配列番号２）のアミノ酸残 基１(Met)、３６(Thr)、または３７(Cys)である。そのような変異体には、第１ 図（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基(Ser(２０８))である が、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失(すなわち、アミノ酸残基Glu( １５４)--Ser(２０８)の欠失)を除いては、第１図（配列番号２）に示すアミノ 酸配列を含んでなる変異体が含まれる。あるいはまた、その欠失には、第１図（ 配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の６５以下 のＣ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、第１ 図（配列番号２）の少なくとも最後の１０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後 の５５以下のＣ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失 には、第１図（配列番号２）の少なくとも最後の２０のＣ末端アミノ酸残基であ るが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた 、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最後の３０のＣ末端アミノ 酸残基であるが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あ るいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最後の４０のＣ 末端アミノ酸残基であるが、最後の５５以下のC末端アミノ酸残基が含まれるで あろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最後 の５０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基が 含まれるであろう。 先に記載したＣ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、先に記載した 範囲の全ての組み合わせに関する。例えば、第１図（配列番号２）の少なくとも 最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の１０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠 失；第１図（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最 後の２０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも 最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の３０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠 失；第１図（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最 後の４０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも 最後の１０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の２０以下のＣ末端アミノ酸残 基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最後の１０のＣ末端アミノ酸残基 であるが、最後の３０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２） の少なくとも最後の１０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の４０以下のＣ末 端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最後の２０のＣ末端 アミノ酸残基であるが、最後の３０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失等、等、等 。 また別の態様において、本発明には、Ｎ末端およびＣ末端残基の両方から欠失 したアミノ酸を有する欠失変異体もまた含まれる。そのような変異体には、先に 記載したＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせが含まれ る。そのような変異体には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の４６のＮ 末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失、お よび第１図（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最 後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失を除いては、第１図（配列番号２）に 示すアミノ酸配列を含んでなる変異体が含まれる。あるいはまた、その欠失には 、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６２、６８、７６、９２、１０３、 または１２２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ 酸残基、および第１図（配列番号２）の少なくとも最後の１０、２０、３０、４ ０、または５０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の５５以下のＣ末端アミノ 酸残基の欠失が含まれ得る。さらに、先に記載した範囲の全ての組み合わせが含 まれる。 アミノ酸の置換 本発明のさらなる態様にはまた、アミノ酸の置換も含まれる。天然の成熟ＫＧ Ｆ−２は４４の帯電した残基を含み、このうち３２は正の電荷を帯びている。タ ンパク質の三次元構造における、そのような残基の位置により、１つまたはそれ 以上の、これらの密集した残基を、負の電荷または中性の電荷を帯びたアミノ酸 で置換することは、隣接する残基の静電的相互作用を変え得、またタンパク質の 安定性の増大、および凝集性の減少を成し逐げるのに有用であり得る。タンパク 質の凝集は、活性の損失を生じ得るだけでなく、それらは免疫原であり得るので 、医薬品製剤を製造する場合に問題ともなり得る(Pinckardら，Clin．Exp．Immu nol．２：３３１−３４０（１９６７）、Robbinsら，Diabetes ３６：８３８− ８４５（１９８７）、Clelandら，Crit．Rev．Therapeutic Drug Carrier Syste ms １０：３０７−３７７（１９９３）)。いずれの修飾も、タンパク質分子の三 次構造における電荷反発を最小とするよう考えるべきである。従って、帯電した アミノ酸の、別の電荷での置換、および中性または負に帯電したアミノ酸での置 換が特に重要である。後者は、減少された正の電荷をもつタンパク質を生じて、 ＫＧＦ−２の特性を改善する。そのような改善には、天然のＫＧＦ−２タンパク 質に比べて、アナログの安定性の増大および凝集性の減少が含まれる。 アミノ酸の置換はまた、細胞表面受容体への結合の選択性を変えることもでき る。Ostadeら，Nature ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２つの既知の ＴＮＦ受容体の１つのみへのＴＮＦαの選択的結合をもたらす、あるＴＮＦα変 異体を記載している。 ＫＧＦ−２分子には、天然の変異またはヒト操作由来の、１つまたはそれ以上 のアミノ酸置換、欠失、または付加が含まれ得る。幾つかの好ましい変異の例は 、 上の表示により、例えば、Ala(４９)Glnは、第１図（配列番号２）の４９の位 置にあるAlaがGlnで置換されていることを意図する。 変化は、タンパク質の折りたたみまたは活性に著しく影響を与えない同類アミ ノ酸置換のような、僅かな性質の変化であるのが好ましい。当業者に知られてい る同類アミノ酸置換の例を以下に示す： 芳香族： フェニルアラニン； トリプトファン チロシン 疎水性： ロイシン イソロイシン バリン 極性： グルタミン アスパラギン 塩基性： アルギニン リジン ヒスチジン 酸性： アスパラギン酸 グルタミン酸 小さい： アラニン セリン トレオニン メチオニン グリシン。 勿論、当業者が行うであろうアミノ酸置換の数は、先に記載した因子を含め、 多くの因子に依存する。一般的に言うと、いずれかのあるＫＧＦ−２ポリペプチ ドに対する置換の数も、目的物により、５０、４０、３０、２０、１０、５、ま たは３を超えることはないであろう。例えば、ＫＧＦ−２のＣ末端において行わ れて、安定性を改善することができる置換の数を先に記載し、また実施例２２に 記載する。 機能に欠くことのできないＫＧＦ−２におけるアミノ酸は、部位指定変異誘発 またはアラニン走査変異誘発(CunninghamおよびWells，Science ２４４：１０８ １−１０８５（１９８９）)といったような、当業界でよく知られている方法に より同定することができる。後者の方法は、分子における全ての残基で、ただ１ つのアラニン変異を誘発する。次いで、その結果得られた変異体分子を、受容体 結合、またはインビトロおよびインビボにおける増殖活性といったような生物学 的活性に関して試験する。(実施例１０および１１を参照)。リガンド−受容体結 合にとって重要である部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識と いったような構造分析によっても決定することができる(例えば、Smithら，J．M ol．Biol．２２４：８９９−９０４（１９９２）；およびde Vosら，Science ２ ５５：３０６−３１２（１９９２）を参照)。 本発明の別の態様は、３７および１０６および１５０のアミノ酸位置にあるシ ステインに代わってのセリン置換である。奇数のシステインの数は、少なくとも １つのシステイン残基を、タンパク質に望ましくない三次構造を採択させ得る、 分子間架橋および結合に利用できることを意味する。セリン、または例えば、ア ラニンで置換されている、１つまたはそれ以上のシステインを有する新規ＫＧＦ −２タンパク質は、一般に、より高い収率の、可溶性で正確に折りたたまれたタ ンパク質で精製される。証明されてはいないが、１０６の位置にあるシステイン 残基は機能にとって重要であると信じられる。このシステイン残基は、他の全て のＦＧＦファミリーのメンバーの中でも高度に保存されている。 本発明のさらなる態様は、他のＦＧＦタンパク質との融合体またはハイブリッ ド(例えば、ＫＧＦ(ＦＧＦ−７)、bＦＧＦ、aＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６ 等)といったような、ＫＧＦ−２と他のタンパク質またはそのフラグメントとの 融合体である。そのようなハイブリッドは、ＫＧＦ(ＦＧＦ−７)に関して報告さ れている。公開されたＰＣＴ出願第９０／０８７７１号において、ＫＧＦの最初 の４０のアミノ酸残基およびＦＧＦのＣ末端部分からなるキメラタンパク質が製 造された。そのキメラは、ケラチノサイト様ＫＧＦを標的とすることが報告され たが、aＦＧＦの特徴であるが、ＫＧＦの特徴ではない、ヘパリンに対する感受 性が欠けていた。免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの部分との融合体は、し ばしば、インビボにおいて増大された半減期を示す。これは、例えば、哺乳動物 の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメインと共に、ヒトＣ Ｄ−４ポリペプチドの最初の２つのドメインからなるキメラタンパク質に関して 示された(欧州特許出願公開第３９４，８２７号；Trauneckerら，Nature ３３１ ：８４−８６（１９８８）)。ジスルフィド結合したダイマー構造を有する融合 タンパク質もまた、モノマー分子を単独で結合するのに、より有効であり得る(F ountoulakisら，J．of Biochemistry．２７０：３９５８−３９６４（１９９５ ）)。 ＫＨＦ−２の抗原／親水性部分 第４Ａ−４Ｅ図で実証したように、ＫＧＦ−２タンパク質には、４つの主要な 高度に親水性の領域がある。アミノ酸残基Gly４1--Asn７１、Lys９１--Ser１０ ９、Asn１３５--Tyr１６４、およびAsn１８１--Ala１９９［配列番号２５−２８ ］。さらなる２つのより短い予想される抗原領域、Gln７４−Arg７８、およびGl n１７０−Gln１７５がある。親水性部分は、主にタンパク質の外側(表面)にあり 、従って、これらの領域を認識する抗体に利用できることが知られている。それ らの領域はまた、ＫＧＦ−２の、その受容体への結合にも関与するらしい。これ らの領域から得られる合成ペプチドは、ＫＧＦ−２の、その受容体への結合を妨 げ、従って、そのタンパク質の機能をブロックすることができる。そのタンパク 質の親水性部分から得られる合成ペプチドもまたアゴニスト的であり得る、すな わち、ＫＧＦ−２の機能を模倣し得る。 従って、本発明はさらに、ＫＧＦ−２の親水性領域を含んでなる、単離された ポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の先に記載したＫ ＧＦ−２親水性領域を含んでなり、長さが１５０以下のアミノ酸、好ましくは、 長さが１００以下、７５以下、または５０以下のアミノ酸である。 化学的修飾 普通、タンパク質の部分ではない付加的化学部分を含むよう、ＫＧＦの野生型 およびアナログをさらに修飾することができる。それらの誘導体化部分は、その タンパク質の溶解性、生物学的半減期、または吸収を改善し得る。その部分はま た、タンパク質等の所望の副作用のいずれかを減少させる、または排除すること もできる。それらの部分に関する概要は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版，Mack Publishing Co．，Easton ，ＰＡ（１９９０）に見出すことができる。ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)は 、治療用タンパク質の製造に使用されている、そのような化学部分の１つである 。タンパク質へのＰＥＧの結合は、タンパク質分解に対して保護することが示さ れた(Sadaら，J．Fermentaiton Bioengineering ７１：１３７−１３９（１９９ １）)。あるＰＥＧ部分の結合には、様々な方法を利用できる。レビューのため には、Abuchowskiら，Enzymesas Drugs(HoucerbergおよびRobert編)３６７−３ ８３（１９８１）を参照。多くの公開された特許は、ＰＥＧの誘導体、およびそ れらを製造する方法を記載している(例えば、Onoら，米国特許第５,３４２,９４ ０号；Niteckiら，米国特許第５,０８９,２６１号；Delgadoら，米国特許第５, ３４９,０５２号)。一般に、タンパク質上に見出される反応性基によって、ＰＥ Ｇ分子をタンパク質に結合させる。なかでも、例えば、タンパク質のリジンまた はアミノ末端上のアミノ基が、この結合に便利である。 「ポリペプチドおよびペプチド」に関して、この節で引用した各々の文献の全 体の開示は、本明細書の一部を構成する。 ベクターおよび宿主細胞 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子が含まれるベクター、組換えベ クターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術によるＫＧＦ−２ポリ ペプチドまたはそのフラグメントの製造にも関する。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により、対 応する全長のポリペプチドを製造するために使用することができ；従って、その フラグメントは、全長のポリペプチドを製造するための中間体として使用するこ とができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を使用して、 本発明の全長のポリヌクレオチドを合成することができる。本発明はまた、本発 明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作さ れた宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する 。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本 発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランス フォームされ、またはトランスフェクトされる)。そのベクターは、例えば、プ ラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、 プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＫＧＦ−２遺 伝子を増幅するのに適するよう修飾された、従来の栄養培地で培養することがで きる。温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現のために選択された宿主細 胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりペプチドを製造するために使 用することができる。従って、例えば、そのポリヌクレオチドを、ポリペプチド を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませてもよい。そのよ うなベクターには、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４ ０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラス ミド;プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニ ア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病といったようなウイルス ＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主において複製 可能であって、生存可能である限り、使用することができる。 様々な方法により、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入することができる。一 般には、当業界で知られている方法により、ＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌク レアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内で あると考えられる。 発現ベクターにおけるＤＮＡ配列を適当な発現制御配列(プロモーター)に作動 可能に結合して、cDNA合成を指揮する。そのようなプロモーターの代表例として 、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．coli．lacまたはtrp、ファージλＰ_L プロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにお ける遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを挙げること ができる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および 転写終結区も含む。そのベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み 得る。 加えて、発現ベクターは、真核細胞培養にはジヒドロ葉酸レダクターゼもしく はネオマイシン耐性といったような、またはE．coliにおいてはテトラサイクリ ンもしくはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞 の選択のための表現型特性を与える、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー 遺伝子を含むのが好ましい。 先に記載したような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターま たは制御配列を含むベクターを使用し、適当な宿主をトランスフォームして、そ の宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。 適当な宿主の代表例として、E．coli、Streptomyces．Salmonella typhimuriu mといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Drosophila Ｓ2およびSpod optera Ｓf9といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはBowesメラノーマ といったような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等を挙げることができる。 適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられ る。 とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含ん でなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向 で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクター を含んでなる。この実施態様の好ましい態様において、その構築物はさらに、例 えば、その配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、調節配列を含んでな る。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、また市 販されている。例として、次のベクターを与える；細菌用:pＱＥ７０、pＱＥ６ ０、pＱＥ−９(Qiagen)、ＰＢＳ、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript) 、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、ＰＢＳks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ １８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Stratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３ −３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Pharmacia)；真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Stratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭ ＳＧ、pＳＶＬ(Pharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも 、それらが宿主において複製可能であって、生存可能である限り、使用すること ができる。 プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク ター、または選択マーカーを有する他のベクターを使用して、いずれかの所望の 遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、pＫＫ２３２−８ およびpＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lac Ｚ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、λＰ_R、Ｐ_L、およびtrpが含まれる。真核プロモーターに は、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロ ウイルス由来のＬＴＲ、並びにマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当な ベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。 さらなる態様において、本発明は、先に記載した構築物を含む宿主細胞に関す る。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低 等真核細胞であり得、またはその宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり 得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、 ＤＥＡＥ-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーシ ョンにより果たすことができる(Davis，L．ら，Basic Methods in Molecular Bi ology（１９８６）)。 宿主細胞における構築物を従来の方法で使用して、組換え配列によりコードさ れる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。 成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌 、または他の細胞において発現させることができる。そのようなタンパク質を、 本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを使用して製造するために、細胞不含 有翻訳システムもまた使用することができる。原核および真核宿主での使用に適 当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular C1oning：A L aboratory Mannual，第２版，Cold Spring Harbor，N．Y．(１９８９)により記 載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。 高等真核生物による、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エ ンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、プ ロモーターに作用して、その転写を増大させる、通常、約１０〜３００bpの、Ｄ ＮＡのシス作用性要素である。例には、bp１００〜２７０の、複製起点の後期側 にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン サー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス エンハンサーが含まれる。 小包体のルーメンへの、細胞周辺腔への、または細胞外環境への、翻訳された タンパク質の分泌には、適当な分泌シグナルを発現されるペプチドに導入するの がよい。そのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよく、または それらは、ヘテロロガスシグナルであってもよい。 そのポリペプチドは、融合タンパク質のような、修飾された形で発現させても よく、分泌シグナルだけでなく、付加的ヘテロロガス機能領域もまた含まれ得る 。例えば、付加的アミノ酸、特に帯電したアミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末 端に加えて、精製の間の、またはその後の取り扱いおよび保存の間の、宿主細胞 における安定性および持続性を改善することができる。そしてまた、そのポリペ プチドにペプチド部分を加えて、精製を容易にすることができる。そのポリペプ チドの最終製造より前に、そのような領域を除去するのがよい。なかでも、分泌 または排出を引き起こすための、安定性を改善するための、そして精製を容易に するための、ポリペプチドへのペプチド部分の付加は、よく知られており、また 当業界で通常の技術である。好ましい融合タンパク質は、受容体を可溶化するの に有用である、免疫グロブリン由来のヘテロロガス領域を含んでなる。例えば、 ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３(対応カナダ特許２０４５８６９)は、別のヒトタン パク質またはその一部と一緒に、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を 含んでなる融合タンパク質を開示している。多くの場合、治療および診断におけ る使用には、融合タンパク質におけるFc部分が完全に有利であり、従って、例え ば、改善された薬物動態学的特性を生ずる(ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２)。他方、 幾つかの使用には、融合タンパク質を記載する有利な方法で発現させ、検出して 、精製した後、Fc部分を削除できるのが望ましいであろう。これは、Fc部分が治 療および診断における使用に対して妨害物であることが証明されている場合、例 えば、融合タンパク質を免疫化のための抗原として使用すべき場合である。薬物 の発見において、例えば、hＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイス ループットスクリーニングアッセイを目的として、shＩＬ５−のようなヒトタン パク質をFc部分と融合した。D．Bennettら，Journal of Molecular Recognition ，第８巻，５２−５８（１９９５）およびK．Johansonら，The JouRNAl of Biol ogical Chemistry，第２７０巻，第１６号，９４５９−９４７１頁（１９９５） を参照。 通例、組換え発現ベクターには、複製起点、および宿主細胞のトランスフォー メーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、E．coliのアンピシリン 耐性遺伝子およびS．cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写 を指揮するために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれる であろう。そのようなプロモーターは、なかでも、３−ホスホグリセリン酸キナ ーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショ ックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造 配列は、翻訳開始および終結配列、好ましくは、細胞周辺腔または細胞外媒体へ の翻訳されたタンパク質の分泌を指揮することができるリーダー配列と共に、適 当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特 性、例えば、発現された組換え産物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末 端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。 細菌での使用に有用な発現べクターは、所望のタンパク質をコードする構造Ｄ ＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結信号と一緒に、機能的プロモーターを有 する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクター は、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増 幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複 製起点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には 、E．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、並びにPseudomonas 属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の様々な種が含まれるが、他の ものもまた、選択物質として使用することができる。 代表的であるが、非限定的な例として、細菌での使用に有用なベクターは、周 知のクローニングベクターpBR３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝要素を含んで なる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製起点 を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pKK２２３−３(Ph armacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)およびＧＥＭＩ(Promega Biotec，M adison，ＷＩ，ＵＳＡ)が含まれる。これらのpBR３２２「骨核」部分を適当なプ ロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。 適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度 まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフト または化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。 細胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により 破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。 タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音 波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれかの便利な方法に より破壊することができ、そのような方法は、当業者によく知られている。 組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物の細胞培養系もまた使 用することができる。哺乳動物の発現系の例には、Gluzman，Cell ２３：１７５ （１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、お よび適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２ ７、３Ｔ３、ＣＨＯ、HeLa、およびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物の発現ベ クターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの 必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアク セプター部位、転写終結配列、並びに５'に隣接する非転写配列もまた含んでな るであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリア デニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。 ＫＧＦ−２ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出 、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマト グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ フ ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグ ラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製すること ができる。必要に応じ、タンパク質の再生工程を使用して、成熟タンパク質の立 体配置を完成させることができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(Ｈ ＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物 であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵 母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造する ことができる。組換え製造法において使用される宿主により、本発明のポリペプ チドは、グリコシル化されてもよいし、またはグルコシル化されなくてもよい。 本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。 ＫＧＦ−２の診断上および治療上の適用 以下の節で使用するように、「ＫＧＦ−２」という語は、本明細書中に記載す る全長のＫＧＦ−２、および成熟型のＫＧＦ−２、並びに本明細書中に記載する ＫＧＦ−２アナログ、誘導体、および変異体を言うことを意図する。本発明はま た、ＫＧＦ−２核酸配列中の変異の存在に関係がある疾患、またはその疾患に対 する感受性を検出するための診断アッセイの一部としての、ＫＧＦ−２遺伝子の 使用にも関する。 ＫＧＦ−２遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、Ｄ ＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば 、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮ Ａは、検出に直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(Saikiら，Nature ３２４：１６３−１６６（１９８６）)を使用することにより、酵素的に増幅す ることができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができ る。例としては、ＫＧＦ−２をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使 用して、ＫＧＦ−２変異を同定して分析することができる。例えば、欠失および 挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検出 することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化ＫＧＦ−２の ＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化ＫＧＦ−２のアンチセンスＤＮＡ配列にハ イブリダイズすることにより同定することができる。完全にマッチしている配列 は、ＲＮアーゼＡの消化により、または融解温度の相違により、マッチしていな い二本鎖と区別することができる。 ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または変性剤を含ま ないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成 し遂げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動 により視覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、変性ホル ムアミドのグラジエントゲル上で区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡ フラグメントの移動度が、それらの特異的な融解温度または部分的な融解温度に より、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、Myersら，Science ２３０ ：１２４２（１９８５）を参照)。 特殊な位置での配列変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌ クレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法(例えば、Cottonら，ＰＮＡＳ，Ｕ ＳＡ ８５：４３９７−４４０１（１９８５）)によっても明らかとされ得る。 従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーショ ン、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用（ 例えば、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)、およびサザンブロット法といったような方 法により成し遂げることができる。 より従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in s itu分析により検出することもできる。 本発明はまた、正常な対照組織のサンプルと比べてのタンパク質の過剰発現が 、疾患(例えば、腫瘍)、または疾患に対する感受性の存在を検出することができ ることから、様々な組織におけるＫＧＦ−２タンパク質レベルの変化を検出する ための診断アッセイにも関する。宿主から得られる試料におけるＫＧＦ−２タン パク質レベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者によく知られてお り、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、Ｅ ＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡア ッセイ(Coliganら,Current Protocols in Immunology，１(２)，第６章（１９ ９１）)には、最初、ＫＧＦ−２抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナ ル抗体を製造することを含んでなる。加えて、リポーター抗体をモノクローナル 抗体に対して製造する。リポーター抗体に、放射能、蛍光、またはこの例では、 酉洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬を結合させる。試料を 宿主から採取して、固形支持体(例えば、試料中のタンパク質を結合するポリス チレン皿)上でインキュベートする。次いで、ウシ血清アルブミンのような非特 異的タンパク質とインキュベーションすることにより、皿上のタンパク質が結合 していない部位をいずれもカバーする。次に、モノクローナル抗体が、ポリスチ レン皿に付着した、いずれのＫＧＦ−２タンパク質にも結合する。結合していな いモノクローナル抗体を全て、緩衝液で洗い流す。ここで、西洋ワサビペルオキ シダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入れると、ＫＧＦ−２に結合した全て のモノクローナル抗体へのリポータ一抗体の結合が生ずる。次いで、結合してい ないリポーター抗体を洗い流す。次いで、その皿にペルオキシダーゼ基質を加え て、一定時間内に発色する量が、標準曲線に対して比べた場合、一定体積の患者 の試料中に存在するＫＧＦ−２タンパク質の量の測定値である。 競合アッセイを使用してもよく、ここでは、ＫＧＦ−２に特異的な抗体を固形 支持体に結合させ、その固形支持体に標識化ＫＧＦ−２、および宿主から得られ る試料を通過させて、例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより 検出されるレベルの量を試料中のＫＧＦ−２の量に相関させることができる。 「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイに似ている。「サンドイッ チ」アッセイでは、ＫＧＦ−２を固形支持体に通過させて、固形支持体に結合し た抗体に結合させる。次いで、二次抗体をＫＧＦ−２に結合させる。標識化した 、また二次抗体に特異的な三次抗体を固形支持体に通過させて、二次抗体に結合 させた後、量を定量することができる。 ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらの アナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対す る抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまた はモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト 化抗体、さらにはまた、Fabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物 も含まれる。当業界で知られている様々な方法を、そのような抗体およびフラグ メントの製造に使用することができる。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、そのポリペ プチドを動物に直接注射することにより、またはそのポリペプチドを動物、好ま しくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのよ うにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法 では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、全ての天然の ポリペプチドを結合する抗体を生成させるために使用することができる。次いで 、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチ ドを単離することができる。 モノクローナル抗体の製造には、連続的な細胞系培養により製造される抗体を 与える技術をいずれも使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Koh lerおよびMilstein，Nature ２５６:４９５−４９７（１９７５）)、トリオーマ (trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，Immunology Today ４ ：７２（１９８３）)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ −ハイブリドーマ技術(Coleら,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Al an R．Liss，Inc．，７７−９６頁（１９８５）)が含まれる。 単鎖抗体の製造に関して記載されている技術(米国特許第４，９４６，７７８ 号)は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適 合し得る。そしてまた、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原 ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。 本発明のポリペプチドを使用して、新たな血管成長または脈管形成を刺激する ことができる。特に、本発明のポリペプチドは、ケラチノサイト細胞の成長およ び増殖を刺激し得る。従って、本発明は、そのようなポリペプチド、またはその ようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、創 傷治癒を目的として上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するために、 そして毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために利用する方法を提供する 。 先に述べたように、本発明のポリペプチドを使用して、上皮細胞増殖を刺激す ることにより、皮膚創傷を治癒することができる。これらの創傷は、表在性のも のであっても、深在性のものであってもよく、皮膚の真皮および表皮の損傷を伴 う。従って、本発明は、個体へのＫＧＦ−２の有効量の投与を伴う、創傷治癒の 促進方法を提供する。 ＫＧＦ−２を投与する個体は、創傷を正常な速度で治癒し得るか、または治癒 が損なわれ得る。治癒が損なわれていない個体に投与する場合には、ＫＧＦ−２ を投与して、正常な治癒プロセスを増進する。治癒が損なわれた個体に投与する 場合には、ＫＧＦ−２を投与して、治癒するのが遅いか、そうでなければ、全く 治癒しない創傷の治癒を容易にする。以下に述べるように、多くの苦痛および状 態は、治癒障害を生じ得る。これらの苦痛および状態には、糖尿病(例えば、II 型真性糖尿病)、ステロイドおよび他の薬理学的物質の両方での処置、並びに虚 血性ブロックまたは傷害が含まれる。創傷治癒を損なうことが示されたステロイ ドには、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、およびメチルプレド ニゾロンが含まれる。 非ステロイド化合物(例えば、酢酸オクトレオイド)もまた、創傷治癒を損なう ことが示された。Waddell，B．ら，Am．Surg．６３：４４６−４４９（１９９７ ）。本発明は、そのような非ステロイド剤での処置を受けている個体における創 傷治癒を促進すると信じられる。 多くの増殖因子は、治癒が損なわれた個体において創傷治癒を促進することを 示した。例えば、Steed，D．ら，J．Am．Coll．Surg．１８３：６１−６４（１ ９９６）；Richard，J．ら，Diabetes Care １８：６４−６９（１９９５）；St eed，D．，J．Vasc．Surg．２１：７１−７８（１９９５）；Kelly，S．ら，Pro c．Soc．Exp．Biol．１９４：３２０−３２６（１９９０）を参照。これらの増 殖因子には、増殖ホルモン放出因子、血小板由来増殖因子、および塩基性線維芽 細胞増殖因子が含まれる。従って、本発明はまた、創傷治癒を促進する、１つま たはそれ以上の付加的増殖因子または他の物質と共に、ＫＧＦ−２の投与も包含 する。 本発明はまた、創傷を正常な速度で治癒する個体、および治癒が損なわれてい る個体の両方において、手術法により引き起こされる吻合創傷および他の創傷の 治癒を促進する方法も提供する。この方法は、吻合手術もしくは他の手術の前、 吻合手術もしくは他の手術の後、および／または吻合手術もしくは他の手術の間 に、個体へのＫＧＦ−２の有効量の投与を伴う。吻合は、例えば、腸管の中央切 片を摘出し、残りの部分を一緒に繋いで、腸管を再構築する場合に起こるような 、２つの管状構造の連結である。皮膚治癒とは違って、吻合創傷の治癒プロセス は、一般に、見たところはっきりしていない。さらに、少なくとも胃腸管におけ る創傷治癒は、合併症の不存在下で急速に起こる；しかし、合併症は、しばしば 、付加的手術による修正を必要とする。Thornton，F．およびBarbul，A．，Surg ．Clin．North Am．７７：５４９−５７３（１９９７）。 実施例２１および２８に示すように、ＫＧＦ−２での処置は、結腸吻合の後に 起こる腹膜漏出および吻合絞窄の著しい減少を引き起こす。ＫＧＦ−２は、治癒 プロセスを増進し、従って、そのような方法の後に生ずる合併症の見込みを減少 させることにより、これらの結果を引き起こすと信じられる。 従って、本発明はまた、創傷を正常な速度で治癒する個体、または治癒が損な われている個体において、吻合または他の手術法後の治癒を増進する方法であっ て、ＫＧＦ−２の有効量の投与を含んでなる方法も提供する。 本発明のポリペプチドはまた、細胞(例えば、筋細胞、神経組織を構成する細 胞、前立腺細胞、および肺細胞)の分化を刺激するために使用することもできる 。 ＫＧＦ−２は、正常な個体において、並びに尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏 症、肥満、感染、免疫抑制、およびステロイド、放射線療法、並びに抗腫瘍性薬 物および代謝拮抗物質での全身処置と関連している合併症といったような、他の 異常な創傷治癒を誘発する状態にさらされている個体において、手術による創傷 、切除による創傷、真皮および表皮の損傷を伴う深い創傷、眼組織の創傷、歯組 織の創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、静脈うっ 血潰瘍、並びに熱曝露または化学薬品から生ずる熱傷が含まれる創傷の創傷治癒 を刺激するのに臨床的に有用であり得る。ＫＧＦ−２はまた、虚血および虚血性 傷害(例えば、静脈循環系リターン(return)の障害および／または不全により引 き起こされる慢性静脈脚潰瘍)と関連している創傷の治癒を促進するのにも有用 である。 ＫＧＦ−２を使用して、皮膚損失後の皮膚再癒着を促進することもできる。加 えて、ＫＧＦ−２を使用して、表皮の張力強度および表皮の厚さを増大させるこ とができる。 ＫＧＦ−２を使用して、皮膚移稙片の付着を増大させ、また創傷床からの再上 皮形成を刺激することができる。次のものは、ＫＧＦ−２を使用して、創傷床へ の付着を増大させることができるであろう移植片の種類である；自己移植片、人 工皮膚、ホモロガス移植片、自己植皮片、自己表皮移植片、無血管移植片、ブレ アーブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮 膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、ヘテロロガス移植片、ヘ テロロガス移植片、ホモロガス移稙片、増殖性移植片、層板移植片、網状移植片 、粘膜移植片、オリエーティールシュ移植片、大網移植片、パッチ移植片、茎状 移植片、全層移植片、中間層皮膚移植片、分層皮膚移植片。ＫＧＦ−２を使用し て、皮膚強度を促進し、また老化した皮膚の外観を改善することができる。 ＫＧＦ−２はまた、肝細胞増殖、肺、胸部、膵臓、胃、小腸、および大腸にお ける上皮増殖における変化も引き起こすであろうと信じられる。ＫＧＦ−２は、 皮脂細胞、毛包、肝細胞、II型肺細胞、ムチンを産生する杯細胞、および他の上 皮細胞といったような上皮細胞、並びに皮膚、肺、肝臓、腎臓、および胃腸管内 に含まれる、それらの前駆細胞の増殖を促進することができる。従って、ＫＧＦ −２は、肝細胞の増殖および分化を刺激することができ、従って、これを使用し て、硬変により引き起こされる劇症肝不全、ウイルス性肝炎および有毒物質(す なわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素、および当業界で知られている他の肝 臓毒素)により引き起こされる肝損傷といったような肝疾患および病状を軽減ま たは処置することができる。ＫＧＦ−２を使用して、肝臓再生を刺激または促進 することもできる。 ＫＧＦ−２を使用して、ウイルス感染の処置、放射線療法、化学療法、または 他の処置から生ずる消化管毒性の副作用を減少させることもできる。ＫＧＦ−２ は、小腸粘膜に対して細胞保護作用を有し得る。ＫＧＦ−２を予防的に、または 治療的に使用して、粘膜炎を予防または減弱する、そして化学療法、他の物質、 およびウイルス感染から生ずる粘膜炎(口潰瘍、食道潰瘍、腸管潰瘍、結腸潰瘍 、直腸潰瘍、および肛門潰瘍)の治癒を刺激することもできる。従って、本発明 は また、潰瘍性大腸炎、クローン病、および粘膜が損傷される他の疾患を含め、粘 膜の疾患または病的事象を予防または処置する方法であって、ＫＧＦ−２の有効 量の投与を含んでなる方法も提供する。本発明は同様に、この損傷を引き起こす 物質またはモダリティー(modality)にかかわらず、口粘膜炎(咽頭および下咽頭 における粘膜傷害と関連している嚥下痛が含まれる)、食道粘膜炎、胃粘膜炎、 腸管粘膜炎、結腸粘膜炎、および直腸粘膜炎の予防または処置する方法を提供す る。 ＫＧＦ−２は、内皮細胞、ケラチノサイト、および塩基性ケラチノサイトの増 殖を促進することができる。従って、本発明はまた、細胞を有効量のＫＧＦ−２ と接触させることを含む、そのような細胞タイプの増殖を刺激する方法も提供す る。ＫＧＦ−２の有効量を個体に投与して、インビボにおける細胞増殖を刺激す ることができ、またはＫＧＦ−２をそのような細胞とインビトロにおいて接触さ せることができる。 本発明はさらに、尿路上皮の治癒を促進する方法であって、ＫＧＦ−２の有効 量を個体に投与することを含んでなる方法を提供する。従って、本発明は、尿路 上皮細胞(すなわち、尿路の内側を覆う細胞)を含む様々な病状の治癒または処置 を増進する方法を提供する。そのような細胞を含んでなる組織層は、カテーテル 法、手術、または細菌感染(例えば、淋病のような、性的に伝播する疾患を引き 起こす物質による感染)が含まれる多数の機構により損傷され得る。 本発明はまた、女性の生殖路における組織治癒の促進方法であって、ＫＧＦ− ２の有効量の投与を含んでなる方法も包含する。女性の生殖路における組織損傷 は、Candida感染、トリコモナス症、Gardnerella、淋病、クラミジア、マイコプ ラスマ感染、および他の性的に伝播する疾患が含まれる、広範囲にわたる様々な 状態により引き起こされ得る。 実施例１０、１８、および１９に示すように、ＫＧＦ−２は、表皮ケラチノサ イトの増殖を刺激して、表皮の肥厚を増大させる。従って、ＫＧＦ−２は、皮膚 の全体的な再生において；熱傷(すなわち、毛包、汗腺、および脂腺のレポピュ レーション)を含め、全体的および部分的厚さの皮膚欠損において；および乾癬 のような他の皮膚欠損の処置において使用することができる。 ＫＧＦ−２を使用して、表皮水疱症、結果的には、口の開いた痛い水疱を生ず ることの多い、基盤となる真皮への表皮の付着における欠損を、これらの病巣の 再上皮形成を増進することにより処置することができる。ＫＧＦ−２を使用して 、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、また粘膜内層並びに腺粘膜および十二指 腸粘膜内層の再生をより迅速に治癒するのに役立てることもできる。クローン病 および潰瘍性大腸炎といったような炎症性腸疾患は、各々、小腸または大腸の粘 膜表面の破壊を生ずる疾患である。従って、ＫＧＦ−２を使用して、粘膜表面の 再表面形成を促進し、より迅速な治癒を手助けして、炎症性腸疾患の進行を予防 または減弱することができる。ＫＧＦ−２の処置は、胃腸管中での粘液の産生に 対して重要な作用を有することが期待され、これを使用して、摂取された有害な 物質から、または手術後に腸粘膜を保護することができる。先に述べたように、 ＫＧＦ−２を使用して、腸管吻合または結腸吻合の治癒を促進することもできる 。ＫＧＦ−２をさらに使用して、ＫＧＦ−２の発現不足と関連している疾患を処 置することができる。 さらに、ＫＧＦ−２を使用して、様々な病的状態により引き起こされる肺への 損傷を予防および治癒することができる。増殖因子として、ＫＧＦ−２は、増殖 および分化を刺激し、肺胞および細気管支上皮の修復を促進し、急性または慢性 肺損傷を予防、減弱、または処置することができる。例えば、肺胞の進行性損失 を生ずる気腫、および吸入傷害(すなわち、煙の吸入から生ずる)、並びに細気管 支上皮および肺胞の壊死の原因となる熱傷は、ＫＧＦ−２を使用して有効に処置 することができる。そしてまた、ＫＧＦ−２を使用して、II型肺細胞の増殖およ び分化を刺激することができ、これは、硝子膜疾患(例えば、乳児の呼吸窮迫症 候群、および早産の乳児における気管支肺の非形成)のような疾患を処置または 予防するのに役立てることができる。 急性腎不全の３つの原因は、腎前性(例えば、心不全)、内因性(例えば、化学 療法剤により誘発される腎毒性)、および腎後性(例えば、尿管閉塞)であり、腎 尿細管細胞の壊死、尿細管腔の閉塞、および糸球体への濾液の逆流をもたらす(T hadhaniら，N．Eugl．J．Med．３３４：１４４８−１４６０（１９９６）により レビューされている)。インスリン様増殖因子Ｉ、骨形成タンパク質 −１、肝細胞増殖因子、および表皮増殖因子といったような増殖因子は、動物モ デルにおける腎疾患を回復させることに対する可能性を示した。Taubら，Cytokj ne ５:１７５−１７９（１９９３）；Vukicevicら，J．Am．Soc．Nephrol．７： １８９６（１９９６）。ＫＧＦ−２は、腎細胞の増殖および分化を刺激すること ができ、従って、これを使用して、急性および慢性腎不全といったような腎疾患 および病状、並びに末期の腎疾患を軽減または処置することができる。 ＫＧＦ−２は、胸部組織の増殖および分化を刺激することができ、それゆえに 、これを使用して、手術、外傷、または癌による胸部組織傷害の治癒を促進する ことができる。 加えて、ＫＧＦ−２を使用して、糖尿病の発症を処置または予防することがで きる。膵島細胞機能が幾分残存する、新たに診断されたＩおよびII型糖尿病を患 う患者において、ＫＧＦ−２を使用して、疾患の永続的な発現を軽減、遅延、ま たは予防するよう、膵島機能を維持することができる。ＫＧＦ−２を膵島細胞移 植における補助物質として使用して、膵島細胞機能を改善または促進することが できる。 さらに、ＫＧＦ−２の抗炎症性は、限定されるものではないが、乾癬、湿疹、 皮膚炎、および／または関節炎を含め、炎症が疾患の鍵となる病状である、急性 および慢性状態を処置するのに有利であり得る。従って、本発明は、個体におけ る炎症、および炎症を伴う疾患を予防または減弱する方法であって、ＫＧＦ−２ の有効量の投与を含んでなる方法を提供する。 ＫＧＦ−２を使用して、外傷、手術、または化学薬品由来の傷害による脳組織 の損傷の治癒を促進して、軽減することができる。 加えて、ＫＧＦ−２は、表皮の厚さを増大させることから、老化した皮膚を改 善するために、皮膚の皺を減少させるために、手術後の瘢痕形成を減少させるた めに、そのタンパク質を使用することができる。創傷組織の瘢痕形成は、しばし ば、皮膚線維芽細胞の過増殖を伴う。実施例１０に示すように、線維芽細胞増殖 は、ＫＧＦ−２により刺激されない。従って、ＫＧＦ−２は、表皮ケラチノサイ トに特異的なマイトジェンであるらしく、最小の瘢痕形成を有する創傷治癒を誘 発する。従って、本発明は、個体へのＫＧＦ−２の有効量の投与を伴う、最小の 瘢痕形成を有する創傷の治癒を促進する方法を提供する。ＫＧＦ−２は、創傷( 例えば、美容手術、鋭利な物体により引き起こされる偶発的または故意的組織外 傷)が引き起こされる前、創傷が引き起こされている間、および／または創傷が 引き起こされた後に投与するのがよい。 先に述べたように、ＫＧＦ−２はまた、ケラチノサイトおよび毛包の増殖も刺 激し、従って、これを使用して、禿げかかった頭皮からの毛髪成長、および毛髪 移植患者における毛髪成長を促進することができる。従って、本発明はさらに、 毛髪成長を促進する方法であって、毛包の産生を刺激するのに十分な量のＫＧＦ −２の投与を含んでなる方法を提供する。 本発明はまた、電離放射線、化学療法、または抗ウイルス剤での処置の作用か ら個体を保護する方法であって、ＫＧＦ−２の有効量の投与を含んでなる方法も 提供する。本発明はさらに、電離放射線、化学療法剤、または抗ウイルス剤に対 する曝露から生ずる組織損傷を処置する方法であって、ＫＧＦ−２の有効量の投 与を含んでなる方法を提供する。環境への放射性同位体の偶発的放出の結果とし て、または非侵襲的な医用診断法(例えば、Ｘ線)の間に、治療上の目的(例えば 、過増殖性傷害の処置のため)を含め、多くの理由から、個体は電離放射線に曝 露され得る。さらに、相当な数の個体が、彼らの仕事場および家庭において放射 性ラドンに曝露される。長期にわたる連続的な環境曝露を使用して、損失した平 均余命の推定値が計算された。Johnson，W．およびKearfott，K．，Health Phys ．７３：３１２−３１９（１９９７）。実施例２３に示すように、本発明のタン パク質は、放射線に曝露した動物の生存を高める。従って、ＫＧＦ−２を使用し て、放射線により誘発される傷害を患っている個体の生存率を増大させること、 致死量以下の放射線から個体を保護すること、そして過増殖性障害のような苦痛 の処置における治療上の照射割合を増大させることができる。 ＫＧＦ−２を使用して、普通、耐性がない放射線、化学療法薬、または抗ウイ ルス剤に対して個体を保護することもできる。この方法で使用する場合、または 本明細書中で特に記載する場合、ＫＧＦ−２は、放射線療法／曝露、化学療法、 または抗ウイルス剤での処置の前、放射線療法／曝露、化学療法、または抗ウイ ルス剤での処置の後、および／または放射線療法／曝露、化学療法、または抗ウ イルス剤での処置の間に投与してもよい。過増殖性障害のような、進行した段階 の苦痛を有する個体を処置する場合には、高用量の放射線および化学療法剤がと りわけ有用であり得る。 別の態様において、本発明は、放射線により誘発される口傷害および胃腸管傷 害、粘膜炎、腸管線維症、直腸炎、放射線により誘発される肺線維症、放射線に より誘発される肺炎、放射線により誘発される胸膜退縮、放射線により誘発され る造血症候群、放射線により誘発される骨髄毒性といったような状態を予防また は処置する方法であって、個体にＫＧＦ−２の有効量を投与することを含んでな る方法を提供する。 ＫＧＦ−２は、単独で使用してもよいし、または放射線もしくは他の物質に対 する保護を与える、１つまたはそれ以上のさらなる物質と組み合わせて使用して もよい。多くのサイトカイン(例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１ ２)は、そのような保護を与えることが示された。例えば、Neta，R．ら，J．Exp ．Med．１７３：１１７７（１９９１）を参照。加えて、ＩＬ−１１は、組み合 わされた照射および化学療法(Du，X．X．ら，Blood ８３：３３（１９９４）)、 並びに放射線により誘発される胸郭傷害の後、小腸粘膜細胞を保護することが示 された。Redlich，C．A．ら，J．Immun．１５７：１７０５−１７１０（１９９ ６）。幾つかの増殖因子(例えば、線維芽細胞増殖因子およびトランスフォーミ ング増殖因子β−３)はまた、放射線曝露に対する保護を与えることが示された 。Ding，I．ら，Acta ONcol．３６：３３７−３４０（１９９７）；Potten，C． ら，Br．J．Cancer ７５：１４５４−１４５９（１９９７）。 本明細書中で使用する場合、「個体」という語は、動物、好ましくは哺乳動物 (例えば、エープ、ウシ、ウマ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ネズミ、ヤギ、イヌ 、ネコ、トリ、サル、ウサギ、フェレット、クジラ、およびイルカ)、より好ま しくはヒトを意図する。 １〜３５または３６のアミノ酸をコードするＫＧＦ−２のシグナル配列を使用 して、一般には、ハイブリダイゼーションおよび／またはコンピューターサーチ アルゴリズムにより、分泌されたタンパク質を同定することができる。 ＫＧＦ−２のヌクレオチド配列を使用して、ハイブリダイゼーションにより、 ５'配列を単離することができる。次いで、その天然のプロモーター／エンハン サー配列の制御下にＫＧＦ−２遺伝子を含んでなるプラスミドは、内因性細胞お よびウイルスのＫＧＦ−２遺伝子発現トランスアクチベーターの同定を目的とし たインビトロにおける試験で使用することができる。 ＫＧＦ−２受容体に対して作用するペプチド模倣物(mimetics)を同定するため に設計された実験において、ＫＧＦ−２タンパク質を正の対照として使用する。 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡの合成、 ＤＮＡベクターの製造に関係している、インビトロにおける目的に利用する方法 、並びにヒト疾患の処置に関する診断および治療を与える目的に利用する方法を 提供する。 全長のＫＧＦ−２遺伝子のフラグメントは、全長のＫＧＦ−２遺伝子を単離す るための、およびこれらの遺伝子に対して高い配列類似性、または同様の生物学 的活性を有する他の遺伝子を単離するための、cＤＮＡライブラリーに対するハ イブリダイゼーションプローブとして使用することができる。このタイプのプロ ーブは、一般に、少なくとも２０塩基を有する。しかし、好ましくは、そのプロ ーブは、少なくとも３０塩基を有しており、一般には、５０塩基を超えないが、 それらは、より多数の塩基を有していてもよい。そのプローブを使用して、全長 の転写産物、およびゲノムクローン、または調節およびプロモーター領域、エキ ソン、並びにイントロンが含まれる完全なＫＧＦ−２遺伝子を含むクローンに対 応するcＤＮＡクローンを同定することもできる。スクリーニングの例は、その 既知のＤＮＡ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプローブを合成することによ り、ＫＧＦ−２遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝 子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを使用し、ヒトcＤ ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはcＤＮＡのライブラリーをスクリーニングして、ラ イブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。 本発明は、ＫＧＦ−２ポリペプチドに対する受容体の同定方法を提供する。そ の受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リ ガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング(Coliganら，Current Protocols in Immun．，１(２)，第５章（１９９１）)により同定することができる。好まし くは、発現クローニングを使用し、ここでは、ポリアデニル化ＲＮＡをポリペプ チドに反応する細胞から製造し、このＲＮＡから作成されたcＤＮＡライブラリ ーをプールに分けて、これを使用して、ＣＯＳ細胞、またはポリペプチドに反応 しない他の細胞をトランスフェクトする。ガラススライド上で培養した、トラン スフェクトした細胞を標識化ポリペプチドに曝露する。そのポリペプチドは、ヨ ウ素化、または部位特異的なプロテインキナーゼの認識部位の封入が含まれる様 々な方法により標識化することができる。固定およびインキュベーションに続い て、そのスライドをオートラジオグラフィー分析にかける。正のプールを同定し て、サブプールを製造し、反復サブプーリングおよび再スクリーニング法を使用 して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定受容体をコードする単一クロ ーンを得る。 別の受容体同定方法として、標識化ポリペプチドを、細胞膜または受容体分子 を発現する抽出調製物と光親和性結合させることができる。架橋物質をＰＡＧＥ 分析により分折して、Ｘ−線フィルムに曝露する。そのポリペプチドの受容体を 含む標識化複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分折して、タンパク質マ イクロシークエンシングにかけることができる。マイクロシークエンシングから 得られたアミノ酸配列を使用して、一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設 計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定受容体をコードする遺 伝子を同定することができる。 本発明は、ＫＧＦ−２の作用をアゴナイズする化合物、またはＫＧＦ−２の機 能をブロックする化合物を同定するために、化合物をスクリーニングする方法を 提供する。そのようなアッセイの例は、ケラチノサイト細胞が、普通、増殖する であろう細胞培養条件下、哺乳動物のケラチノサイト細胞、スクリーニングすべ き化合物、および³[Ｈ]チミジンを混合することを含んでなる。対照アッセイを スクリーニングすべき化合物の不在下に行い、その化合物の存在下におけるケラ チノサイト増殖量と比べて、その化合物がケラチノサイトの増殖を刺激するかど うかを決定することができる。 アンタゴニストに関してスクリーニングするためには、同じアッセイをＫＧＦ −２の存在下に準備するのがよく、ケラチノサイト増殖を妨げる化合物の能力を 測定して、アンタゴニスト能力の決定を行う。³[Ｈ]チミジンの取込みを測定す る液体シンチレーションクロマトグラフィーにより、ケラチノサイト細胞増殖量 を測定する。 別の方法では、ＫＧＦ−２受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、 その化合物の存在下に標識化ＫＧＦ−２と共にインキュベーションする。次いで 、この相互作用を高める、またはブロックする化合物の能力を測定することがで きる。あるいはまた、ＫＧＦ−２と受容体との相互作用に続いて、その化合物の 存在下または不在下において既知の第二メッセンジャーシステムの反応を測定し 、比較する。そのような第二メッセンジャーシステムには、限定されるものでは ないが、cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノ シチド加水分解が含まれる。 可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストの例には、そのポリペプチドに結合す る抗体、または幾つかの場合には、オリゴヌクレオチドが含まれる。あるいはま た、可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストは、ＫＧＦ−２受容体に結合する、 変異体型のＫＧＦ−２であり得るが、しかし、第二メッセンジャー反応は誘引せ ず、従って、ＫＧＦ−２の作用を有効にブロックする。 別の可能性のあるアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して製造される アンチセンス構築物である。アンチセンス技術を使用して、三重らせん形成また はアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ 、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づ く。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の ５'コード部分を使用して、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオ リゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺 伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん-Leeら，Nucl．Acids Res ．６：３０７３（１９７９）；Cooneyら，Science ２４１：４５６（１９８８） ；およびDervanら，Science ２５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのこと によって、転写およびＫＧＦ−２の産生を妨げる。そのアンチセンスＲＮ Ａオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてcＤＮＡにハイブリダイズして、cＤ ＮＡ分子のＫＧＦ−２ポリペプチドへの翻訳をブロックする(Antisense−OKano, J．Neurochem．５６：５６０（１９９１）；Oligodeoxynucleotides as Antisen se Inhibitors of Gene Expression,ＣＲＣ Press，Boca Raton，ＦＬ（１９８ ８）)。先に記載したオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込んで、アンチセ ンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＫＧＦ−２の産生を阻 害することができる。 可能性のあるアンタゴニスト化合物には、ＫＧＦ−２受容体の結合部位に結合 して占有し、そのことによって、その受容体をＫＧＦ−２に近づき難くすること から、正常な生物学的活性を妨げる小さな分子が含まれる。小さな分子の例には 、限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる 。 ＫＧＦ−２アンタゴニストを使用して、腫瘍における新たな血管成長または脈 管形成の誘発を妨げることができる。ＫＧＦ−２により刺激される脈管形成はま た、糖尿病性網膜症を含め、本発明のアンタゴニストにより処置することもでき る幾つかの病状、および慢性関節リウマチにおけるような病的組織の増殖の阻害 により処置することもできる幾つかの病状の原因でもある。 ＫＧＦ−２のアンタゴニストを使用して、ボーマン腔を満たす細胞塊を形成す る糸球体上皮細胞の著しい増殖により特徴付けられる、糸球体腎炎を処置するこ ともできる。 そのアンタゴニストを使用して、手術後のケロイド形成、心筋梗塞後の線維症 、または肺線維症および再狭窄と関連している線維症病変において見られる瘢痕 組織の過剰産生を阻害することもできる。ＫＧＦ−２アンタゴニストを使用して 、癌およびカポージ肉腫を含め、ＫＧＦ−２により刺激される他の増殖性疾患を 処置することもできる。 ＫＧＦ−２アンタゴニストを使用して、上皮細胞増殖により特徴付けられるブ ドウ膜炎症を有する、角膜の深葉の慢性湿潤である角膜炎を処置することもでき る。 そのアンタゴニストは、例えば、以下に記載するような、医薬的に許容され得 る担体と共に、組成物において使用することができる。 本発明のポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、医薬組成物を 構成するために、適当な医薬担体と組み合わせて使用することができる。そのよ うな組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニ スト、および医薬的に許容され得る担体もしくは賦形剤を含んでなる。そのよう な担体には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキ ストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含ま れる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。 本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１ つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ のような容器と関連して、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売 を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒ トへの投与のための製造、使用、または販売の、その当局による承認を反映する 。加えて、本発明のポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、他の 治療用化合物と共に使用することができる。 ＫＧＦ−２活性を有するポリペプチドは、１つまたはそれ以上の医薬的に許容 され得る賦形剤と組み合わせて、医薬組成物で投与することができる。ヒトの患 者に投与する場合、本発明の医薬組成物の全１日使用量は、医師により正しい医 療判断(sound medical judgment)の範囲内で決定されるであろうことが理解され るであろう。全ての個々の患者に対する具体的な治療上の有効用量レベルは、成 し遂げられるべき反応のタイプおよび程度；使用する具体的な組成物、およびも しあれば、他の物質；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事； 投与時間、投与経路、および組成物の排出速度；処置期間；具体的な組成物と組 み合わせて、または具体的な組成物と一緒に使用する薬物(例えば、化学療法剤) ；並びに医薬品業界でよく知られている同様の因子が含まれる、様々な因子に依 存するであろう。当業界で知られている適当な製剤は、Remington's Pharmaceut ical Sciences(最終版)，Mack Publishing Company，Easton，ＰＡに見出すこと ができる。 治療において使用すべきＫＧＦ−２組成物は、個々の患者の臨床的状態(とり わけ、ＫＧＦ−２単独での処置の副作用)、ＫＧＦ−２組成物を送り込む部位、 投与方法、投与計画、および担当医に知られている他の因子を考慮に入れて、良 好な医療実施と一致する方法で製剤化されて投薬されるであろう。従って、本明 細書中での目的に対するＫＧＦ−２の「有効量」(ＫＧＦ−２の有効量が含まれ る)は、そのような考慮事項により決定される。 その医薬組成物は、経口経路、局所経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経 路、関節内経路、皮下経路、鼻腔内経路、または皮内経路といったような、便利 な方法で投与することができる。その医薬組成物は、具体的な徴候を治療および ／または予防するのに有効である量で投与される。大抵の場合、投与経路および 症状等を考慮に入れて、その用量は、毎日約１μｇ／kg〜約５０mg／kg(体重)で ある。局所投与の具体的な場合、１cm²あたり０.０１μｇ〜９mgの用量を投与す るのが好ましい。 一般的な提案として、より好ましくは用量あたり非経口的に投与されるＫＧＦ −２の全医薬的有効量は、約１μｇ／kg(患者の体重)／日〜１００mg／kg(患者 の体重)／日の範囲であるが、先に述べたように、これは、治療上の判断にかか っている。連続的に与えるのなら、ＫＧＦ−２は、典型的には、例えば、ミニポ ンプを使用して、１日あたり１−４回の注射により、または連続的な皮下注入に より、約１μｇ／kg／時間〜約５０μｇ／kg／時間の用量速度で投与される。静 脈内バッグ溶液またはボトル溶液もまた使用することができる。 線維素溶解システムに影響を与えるためのＫＧＦ−２処置の経過は、ある最小 日数(マウスの場合には７日)より長く続けるならば、最適であるらしい。変化を 観察するのに必要とされる処置期間、および反応に対する処置が起こるまでの間 隔は、所望の作用によって異なるらしい。 ＫＧＦ−２はまた、持続的放出システムにより適当に投与される。持続的放出 組成物の適当な例には、賦形品の形での半透過性ポリマーマトリックス(例えば 、フィルム、またはマイクロカプセル)が含まれる。持続性放出マトリックスに は、ポリラクチド(米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１ 号)、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー(U．S idmanら，Bjopolymers ２２：５４７−５５６（１９８３）)、ポリ(２−ヒドロ キシエチルメタクリレート)(R．Langerら，J．Biomed．Mater．Res．１５：１ ６７−２７７（１９８１）、およびR．Langer，Chem．Tech．１２：９８−１０ ５（１９８２）)、エチレン酢酸ビニル(R．Langerら，同上)、またはポリ−Ｄ− (−)−３−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第１３３,９８８号)が含まれる。持続的放 出ＫＧＦ−２組成物にはまた、リポソームに閉じ込められたＫＧＦ−２も含まれ る。ＫＧＦ−２を含むリポソームは、公知の方法により製造される：独国特許第 ３,２１８,１２１号；Epsteinら，Proc．Nat1．Acad．Sci．ＵＳＡ ８２：３６ ８８−３６９２（１９８５）；Hwangら，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ ７７ ：４０３０−４０３４（１９８０）；欧州特許第５２,３２２号；欧州特許第３ ６,６７６号;欧州特許第８８,０４６号;欧州特許第１４３,９４９号；欧州特許 第１４２,６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４,４ ８５,０４５号および同第４,５４４,５４５号；並びに欧州特許第１０２,３２４ 号。通常、そのリポソームは、脂質含量が約３０mol.％コレステロールを超えお り、選択される割合が最適なＫＧＦ−２療法のために調節される、小さい(約２ ００−８００Å)単層状タイプのものである。 非経口投与に関し、一態様において、ＫＧＦ−２は、一般に、医薬的に許容さ れ得る担体(使用する用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、また その製剤の他の成分と適合する担体)と共に、それを所望の純度で混合すること により、単位用量の注射可能な形(溶液、懸濁液、またはエマルション)に製剤化 される。例えば、その製剤には、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であ ることが知られている他の化合物は含まれないのが好ましい。 一般に、その製剤は、ＫＧＦ−２を、液状担体、または微細に分割した固体担 体、またはその両方と、均一かつ密接に接触させることにより製造される。次い で、必要ならば、その生成物を所望の製剤に成形する。好ましくは、その担体は 非経口担体であり、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液であ る。そのような担体ビヒクルの例には、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデ キストロース溶液が含まれる。不揮発性油およびオレイン酸エチルといったよう な非水性ビヒクル、さらにはまた、リポソームもまた、本明細書中で有用である 。当業界で知られている適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences( 最終版)，Mack Publishing Company，Easton，ＰＡに見出すことができる。 その担体は、等張性および化学安定性を高める物質のような添加剤を少量含む のが適当である。そのような物質は、使用する用量および濃度でレシピエントに 対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機 酸またはその塩といったような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分 子量(約１０残基未満)のポリペプチド(例えば、ポリアルギニンまたはトリペプ チド)；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンといったようなタン パク質；ポリビニルピロリドンのようなポリマー；グリシン、グルタミン酸、ア スパラギン酸、またはアルギニンといったようなアミノ酸；セルロースもしくは その誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる、単糖類 、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトール またはソルビトールといったような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン ；および／またはポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧといったような 非イオン性界面活性剤が含まれる。 ＫＧＦ−２は、典型的には、そのようなビヒクル中、ｐＨ約３〜８、約０.０ １μｇ／ml〜１００mg／ml、好ましくは０.０１μｇ／ml〜１０mg／mlの濃度で 製剤化される。前述の賦形剤、担体、または安定剤の幾つかの使用は、ＫＧＦ− ２塩の形成を生ずるであろうことが理解されるであろう。 治療上の投与に使用すべきＫＧＦ−２は、無菌でなければならない。無菌は、 無菌濾過膜(例えば、０.２ミクロンの膜)を通しての濾過により容易に達成され る。治療用ＫＧＦ−２組成物は、一般に、無菌出入口を有する容器(例えば、静 脈内溶液バッグ、または皮下注射針で刺して穴をあける栓を有するバイアル)に 入れられる。 ＫＧＦ−２は、通常、単位用量または多数回用量の容器(例えば、密閉したア ンプルまたはバイアル)中、水溶液として、または再構築用の凍結乾燥させた製 剤として保存される。凍結乾燥させた製剤の例として、１０mlのバイアルを、無 菌濾過した１％(ｗ／ｖ)のＫＧＦ−２水溶液５mlで充填して、その結果得られた 混合物を凍結乾燥させる。注入溶液は、静菌注射用蒸留水を使用して、凍結乾燥 させたＫＧＦ−２を再構築することにより製造する。 投薬はまた、例えば、ＲＩＡ技術により決定されるような、予め決定された濃 度のＫＧＦ−２活性を血中で与えるよう、患者に特異的な方法で取り決めること もできる。従って、患者への投薬は、ＲＩＡ技術により測定されるような、約５ ０〜１０００ng／ml、好ましくは１５０〜５００ng／mlの、一定の進行するトラ フ(trough)血液レベルに達するよう調節することができる。 本発明の医薬組成物は、経口により、直腸により、非経口により、槽内により 、皮内により、膣内により、腹腔内により、局所により(粉末、軟膏、ゲル、ク リーム、ドロップ、もしくは経皮パッチによるものとして)、頬側により投与す ることができ、または口腔または鼻腔スプレーとして投与してもよい。「医薬的 に許容され得る担体」という語は、無毒の固形、半固形、または液状の充填剤、 希釈剤、封入物質、またはあらゆるタイプの製剤補助物質を意味する。本明細書 中で使用する場合、「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内 、皮下、および関節内の注射および注入が含まれる投与方法を言う。 ＫＧＦ−２ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニス トはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることの多い、そのようなポリペプチドのイ ンビボにおける発現によって、本発明により使用することもできる。 従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいて、ポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、そのペプチドで 処置すべき患者に、操作した細胞を与える。そのような方法は、当業界でよく知 られている。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウ イルス粒子の使用によって、当業界で知られている方法により、細胞を操作する ことができる。 同様に、例えば、当業界で知られている方法により、ポリペプチドのインビボ における発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界 で知られているように、細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをイン ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含 む、レトロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞を患者に投与する ことができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与する、これら の方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかとなるべきであろう 。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、 例 えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作する ために使用することができるアデノウイルスであってもよい。他の運搬ビヒクル の例には、ＨＳＶに基づいたベクター系、アデノ関連ウイルスベクター、および 不活性ビヒクル(例えば、デキストランで被覆したフェライト粒子)が含まれる。 先に述ベたレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスに は、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイル ス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テ ナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性 肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスといったようなレトロウイルスが含まれる。 一態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病 ウイルスから得られる。 そのベクターには、１つまたはそれ以上のプロモーターが含まれる。使用する ことができる適当なプロモーターには、限定されるものではないが、レトロウイ ルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびMillerら，Biotechniques，第７巻 ，第９号：９８０−９９０（１９８９）に記載されているヒトサイトメガロウイ ルス(ＣＭＶ)プロモーター、またはいずれかの他のプロモーター(例えば、限定 されるものではないが、ヒストン、pol III、およびβ−アクチンプロモーター が含まれる、真核細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター)が含まれる 。使用することができる他のウイルスプロモーターには、限定されるものではな いが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモーター、お よびＢ１９パルボウイルスプロモーターが含まれる。適当なプロモーターの選択 は、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかであろう。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターの制御下 にある。使用することができる適当なプロモーターには、限定されるものではな いが、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモータ ー；またはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターのようなヘテロロガスプ ロモーター；呼吸合胞体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター；MＭＴプロモーター、 メタロチオネインプロモーターといったような誘導可能なプロモーター；熱ショ ックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoＡＩプロモーター；ヒトグロ ビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイル スチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ(先に記載した、修飾 されたレトロウイルスＬＴＲが含まれる)；β−アクチンプロモーター；および ヒト成長ホルモンプロモーターが含まれる。そのプロモーターはまた、そのポリ ペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよい。 レトロウイルスプラスミドベクターを使用し、パッケージング細胞系をトラン スデュースして、プロデューサー細胞系を形成する。トランスフェクトすること ができるパッケージング細胞系の例には、限定されるものではないが、ＰＥ５０ １、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＲＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９− １７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋envＡｍ１２、お よびMiller、Human Gene Therapy １：５−１４（１９９０）(これに記載されて いる内容は全て、本発明の一部を構成する)に記載されているＤＡＮ細胞系が含 まれる。そのベクターは、当業界で知られている、いずれかの方法によって、パ ッケージング細胞をトランスデュースすることができる。そのような方法には、 限定されるものではないが、電気穿孔、リポソームの使用、およびＣａＰＯ₄沈 殿が含まれる。１つの別の方法では、レトロウイルスプラスミドベクターをリポ ソームに封入する、または脂質に結合させた後、宿主に投与することができる。 そのプロデューサー細胞系は、そのポリペプチドをコードする核酸配列が含ま れる感染性レトロウイルスベクター粒子を生成させる。次いで、そのようなレト ロウイルスベクター粒子を使用して、真核細胞をインビトロまたはインビボにお いてトランスデュースすることができる。トランスデュースされた真核細胞は、 そのポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。トランスデュース することができる真核細胞には、限定されるものではないが、胚幹細胞、胚癌細 胞、さらにはまた、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角質細胞、内 皮細胞、および気管支上皮細胞が含まれる。 染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色 体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで きる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配 列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置を マークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッ ピングは、それらの配列を病気と関連している遺伝子と関係付ける重要な第一段 階である。 簡単に言えば、cDNA由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp)を製 造することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'非翻訳領域の コンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエクソンをスパン (span)しないプライマーを迅速に選択し、従って、増幅プロセスを複雑なものと する。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリ ッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。そのプライマーに対応するヒト遺伝子 を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろ う。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰 属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて の本発明を使用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい ゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いての類似の方法で成 し逐げることができる。その染色体へマップするために同様に使用することがで きる他のマッピング方法には、in situハイブリダイゼーション、標識化フロー −ソーティッド(flow-sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染 色体に特異的なcDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによ るプレセレクションが含まれる。 cDNAクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光in situハイブリダイゼーシ ョン(ＦＩＳＨ)を使用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。 この技術は、５０または６０塩基という短いcDNAで使用することができる。この 技術のレビューのためには、Vermaら，Human Chromosomes：a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York（１９８８）を参照。 ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的 位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例え ば、V．McKusick，Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University W elch Medical Libraryを介してオンラインで利用できる)に見い出される。次い で、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析( 物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。 次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcDNAまたはゲノム配 列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てに おいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変 異は疾患の原因となるものであるらしい。 現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の分析から、疾患と関連 している染色体領域に正確に局在化したcDNAは、５０〜５００の間の可能な原因 となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング 分析および２０kbあたり１つの遺伝子を仮定する)。 本発明をさらに、次の実施例によって記載する；しかし、本発明は、そのよう な実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にこと わらない限り、重量単位である。 次の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／ または用語を記載する。 「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および ／または数字により示す。本明細書中での出発プラスミドは、市販されているか 、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により 入手可能なプラスミドから構築することができる。加えて、記載したプラスミド と同等のプラスミドは、当業界で知られており、当業者に明らかであろう。 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中のある配列にのみ作用する制限酵素を用いての ＤＮＡの触媒的切断を言う。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて おり、それらの反応条件、補因子、および他の必要条件は、当業者に知られてい るように使用した。分析を目的として、典型的には、緩衝溶液約２０μｌ中、１ μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。 プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離することを目的として、典型 的には、より大きい体積中、ＤＮＡ５〜５０μｇを２０〜２５０単位の酵素で消 化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定され ている。通常、３７℃で約１時間のインキュベーション時間が使用されるが、供 給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルア ミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。 切断したフラグメントのサイズ分離は、Goeddel，D．ら，Nucleic Acids Res ．８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲル を使用して行う。 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオ キシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を言う。そのような 合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有しておらず、従って、キナーゼ の存在下にＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチ ドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されて いないフラグメントにライゲートするであろう。 「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステ ル結合を形成するプロセスを言う(Maniatis，T.ら，同上，１４６頁)。特にこと わらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントの ほぼ等モル量の０.５μｇあたり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」) と共に、既知の緩衝液および条件を使用して達成することができる。 細胞が外因性ＤＮＡによって「トランスフォームされた」というのは、そのよ うな外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合である。外因性ＤＮＡは、細 胞のゲノムを製造する、組み込まれた(共有結合された)染色体間(inter-chromos omal)ＤＮＡであっても、または組み込まれた(共有結合された)染色体間ＤＮＡ でなくてもよい。原核生物および酵母、例えば、外因性ＤＮＡは、プラスミドの ようなエピソーム要素上に維持され得る。真核生物細胞に関して、安定してトラ ンスフォームされた細胞、または安定してトランスフェクトされた細胞は、外因 性ＤＮＡが染色体複製によって娘細胞により遺伝されるよう、外因性ＤＮＡが染 色体に組み込まれたものである。この能力は、外因性ＤＮＡを含む娘細胞集団か らなる細胞系またはクローンを確立する真核生物細胞の能力により実証される。 トランスフォーメーションの例は、Graham，F．およびVan der Eb，A．，Virolo gy ５２：４５６−４５７（１９７３））に示されている。 「トランスダクション」または「トランスデュースされた」という語は、細胞 が外来ＤＮＡを取り込み、その外来ＤＮＡをそれらの染色体に組み込むプロセス を言う。トランスダクションは、例えば、トランスフェクション(細胞がＤＮＡ を取り込む様々な技術を言う)、または感染(ウイルスを使用して、ＤＮＡを細胞 に移動する様々な技術を言う)によって行うことができる。 実施例１ ＫＧＦ−２の細菌発現および精製 まず、プロセシングされたＫＧＦ−２ cDNA(シグナルペプチド配列を含む)の ５'末端配列と３'末端配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使 って、ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５９７７を増幅する。こ の５'オリゴヌクレオチドプライマーは、 という配列を持ち、AflIII制限酵素部位を含み、その後ろに推定開始コドンから 始まるＫＧＦ−２コード配列の３０ヌクレオチドが続いている。３'配列 は、HindIII部位に相補的な配列を含み、ＫＧＦ−２の２６ヌクレオチドが続い ている。これらの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−６０(Qiagen，Inc ．，Chatsworth，CA)上の制限酵素部位と適合する。pＱＥ−６０は、抗生物質耐 性(Amp^r)、細菌複製起点(ori)、ＩＰＴＧ制御性プロモーター・オペレーター(Ｐ ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−His標識および制限酵素部位をコード する。次いで、pＱＥ−６０をNcoＩとHindIIIで消化する。増幅した配列をpＱＥ −６０に連結し、読み枠をあわせて挿入する。次いで、Sambrook，J．ら，Molec ular Cloning：A Laboratory Mannual，Cold Spring Laboratory Press（１９８ ９）に記載の手法により、その連結混合物を使って大腸菌Ｍ１５／rep4株(Qiage n，Inc．)を形質転換する。Ｍ１５／rep４は、lac Iリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性(Kan^r)をも付与するプラスミドpＲＥ Ｐ４のコピーを複数含有している。ＬＢ平板での生育能によって形質転換体を同 定し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡ を単離し、制限分析によって確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Am p(１００μｇ／ml)とKan(２５μｇ／ml)の両方を添加したＬＢ培地での液体培養 により終夜(Ｏ／Ｎ)生育する。このＯ／Ｎ培養を１：１００〜１：２５０の比率 で大量培養の接種に使用する。光学密度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)が０.４〜０.６に達 するまで細胞を生育する。次いで、ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ クトピラノシド)を最終濃度が１mMとなるように添加する。ＩＰＴＧによる誘導 は、lacＩリプレッサーを不活化してＰ／Ｏを解放し、それが遺伝子発現量の増 大につながることによる。細胞をさらに３〜４時間生育する。次いで、細胞を遠 心分離によって収集する。その細胞ペレットをカオトロピック剤６Ｍ塩酸グアニ ジン中で可溶化する。清浄化の後、タンパク質が強固に結合しうる条件下にヘパ リンアフィニティーカラムでクロマトグラフィーを行なうことにより、可溶化し たＫＧＦ−２をこの溶液から精製する(Hochuli，E．ら，J．Chromatography ４ １１：１７７−１８４（１９８４）)。ＫＧＦ−２(純度７５％)は、高塩濃度緩 衝液によりこのカラムから溶出させる。 実施例２ 先端切断型ＫＧＦ−２の細菌発現と精製 まず、先端切断型ＫＧＦ−２ポリペプチドの５'配列と３'配列に対応するＰＣ Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを使って、ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列 ＡＴＣＣ＃７５９７７を増幅する。この先端切断型は、３６アミノ酸のシグナル 配列を欠くポリペプチドからなり、メチオニンおよびアラニン残基が全長のタン パク質のアミノ酸３７を構成するシステイン残基の直前に付加されている。５' オリゴヌクレオチドプライマーは、 という配列を持ち、NcoＩ制限酵素部位を含み、その後ろにＫＧＦ−２コード配 列の２４ヌクレオチドが続いている。３'配列 は、HindIII部位に相補的な配列を含有し、ＫＧＦ−２遺伝子の２６ヌクレオチ ドが続いている。これらの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−６０(Qiag en，Inc．，Chatsworth，CA)上の制限酵素部位と適合する。pＱＥ−６０は、抗 生物質耐性(Amp^r)、細菌複製起点(ori)、ＩＰＴＧ制御性プロモーター・オペレ ータ一(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−His標識および制限酵素部 位をコードする。次いで、pＱＥ−６０をNcoＩとHindIIIで消化する。増幅した 配列をpＱＥ−６０に連結し、読み枠をあわせて挿入する。次いで、Sambrook，J ．ら，Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，Cold Spring Laboratory Pr ess（１９８９）に記載の手法により、その連結混合物を使って大腸菌Ｍ１５／r ep4株(Qiagen，Inc．)を形質転換する。Ｍ１５／rep４は、lacＩリプレッサーを 発現しカナマイシン耐性(Kan^r)をも付与するプラスミドpＲＥＰ４のコピーを複 数含有している。ＬＢ平板での生育能によって形質転換体を同定し、アンピシリ ン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分 析によって確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Amp(１００μｇ／ml )とKan(２５μｇ／ml)の両方を添加したＬＢ培地での液体培養により終夜(Ｏ／ Ｎ)生育する。このＯ／Ｎ培養を１：１００〜１：２５０の比率で大量培養の接 種に使用する。光学密度６００(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)が０．４〜０．６に達するまで細胞 を生育する。次いで、ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ ド)を最終濃度が１mMとなるように添加する。ＩＰＴＧによる誘導は、lacＩリプ レッサーを不活化してＰ／Ｏを解放し、それが遺伝子発現量の増大につながるこ とによる。細胞をさらに３〜４時間生育する。次いで、細胞を遠心分離によって 収集する。その細胞ペレットをカオトロピック剤６Ｍ塩酸グアニジン中で可溶化 する。清浄化の後、タンパク質が強固に結合しうる条件下にヘパリンアフィニテ ィーカラムでクロマトグラフィーを行なうことにより、可溶化したＫＧＦ−２を この溶液から精製する(Hochuli，E．ら，J．Chromatography ４１１：１７７− １８４（１９８４）)。ＫＧＦ−２タンパク質は、高塩濃度緩衝液によりこのカ ラムから溶出させる。 実施例３ バキュロウイルス発現系を使用するＫＧＦ−２のクローニングおよび発現 全長のＫＧＦ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５９７７を 、その遺伝子の５'配列と３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ ーを用いて増幅する。 ５'プライマーは、 という配列を持ち、BamHＩ制限酵素部位(太字部分)を含有し、その後ろに、真核 細胞における翻訳開始用の効率のよいシグナルに似た６ヌクレオチド(Kozak，M ．，J．Mol．Biol．，１９６：９４７−９５０（１９８７）)が続き、そのすぐ 後ろにＫＧＦ−２遺伝子の最初の17ヌクレオチドが続いている(翻訳開始コドン ＡＴＧに下線を引いてある)。 ３'プライマーは、 という配列を持ち、制限エンドヌクレアーゼAsp７１８の切断部位と、ＫＧＦ− ２遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な１９ヌクレオチドとを含有する。増幅した 配列を、Qiagen，Inc．，Chatsworth，ＣＡから市販されているキットを使って １％アガロースゲルから単離する。次いで、その断片をエンドヌクレアーゼBamH ＩとAsp７１８で消化した後、１％アガロースゲルで再び精製する。この断片を Ｆ２と命名する。 バキュロウイルス発現系(概要については、SumMers，M．D．およびSmith，G． E．，A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．１５５ ５（１９８７）を参照)を用いたＫＧＦ−２タンパク質の発現には、ベクターpＡ ２(pＶＬ９４１ベクターを改良したもの；後述)を使用する。この発現ベクター は、オートグラファ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強 力なポリヘドリンプロモーターと、それに続く制限エンドヌクレアーゼBamHＩお よびAsp７１８の認識部位とを含有する。効率のよいポリアデニル化のため、シ ミアンウイルス(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位が 使用される。組換えウイルスを簡単に選択するため、大腸菌由来のβ-ガラクト シダーゼ遺伝子が、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルの前に、ポリ ヘドリンプロモーターと同じ方向に挿入される。ボリヘドリン配列の両端には、 同時にトランスフェクトされる野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換え用 に、ウイルス配列が隣接する。pＲＧ１の代わりにpＡc３７３、pＶＬ９４１、pA cIM1(Luckow，V．A．およびSumMers,M．D.，Virology １７０：３１−３９)など といった他の多くのバキュロウイルスベクターも使用できるだろう。 そのプラスミドを制限酵素BamHＩおよびAsp７１８で消化する。次いで、市販 のキット(Qiagen，Inc．，Chatsworth，CA)を使って、そのＤＮＡを１％アガロ ースゲルから単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と命名する。 断片Ｆ２とプラスミドＶ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、大腸 菌ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そのプラスミド(pBacＫＧＦ−２)を含有する細 菌を、両クローニングオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより同定する。クロ ーニングした断片の配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。 リポフェクション法(Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ ８４：７４ １３−７４１７（１９８７）)を用いて、５μｇのプラスミドpBacＫＧＦ−２を 、市販の直鎖状バキュロウイルス("BaculoGold^TMバキュロウイルスＤＮＡ"；Pha rmingen，San Diego，CA)１.０μｇと同時にトランスフェクトする。 １μｇのBaculoGold^TMウイルスＤＮＡと５μｇのプラスミドpBacＫＧＦ−２を 、無血清グレース培地(Life Technologies，Inc．，Gaithersburg，MD)５０μｌ を含む微量滴定プレートの滅菌ウェル中で混合する。次いで、リポフェクチン１ ０μｌとグレース培地９０μｌを加え、混合し、室温で１５分間インキュベート する。次いで、血清を含まないグレース培地１mlの入った３５mM組織培養プレー トに接種したSf9昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に、上記トランスフェク ション混合物を滴下する。プレートを前後にゆすって、新たに加えた溶液を混合 する。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、 トランスフェクション溶液をプレートから取り除き、１０％ウシ胎児 血清を添加したグレース昆虫培地１mlを加える。そのプレートを培養器に戻し、 培養を２７℃で４日間続ける。 ４日後に上清を集め、SumMersおよびSmith(上記)の記述と同様にしてプラーク アッセイを行なう。変更点として"Blue Gal"(Life Technologies Inc.,Gaithers burg)を含むアガロースゲルを使用する。これにより青く染まったプラークの容 易な単離が可能になる。（「プラークアッセイ」に関する詳細な説明は、Life T echnologies Inc．，Gaithersburgが発行している昆虫細胞培養とバキュロウイ ルス学に関するユーザーズガイドの９〜１０頁にも認められる）。 段階希釈の４日後に、ウイルスを細胞に加え、青く染まったプラークをエッペ ンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含むその寒天を、 グレース培地２００μｌの入ったエッペンドルフチューブに再懸濁する。短い遠 心分離によって寒天を除去し、組換えバキュロウイルスを含むその上清を使って 、３５mM皿に接種したSf９細胞を感染させる。４日後に、それら培養皿の上清を 収集し、４℃で保存する。 Sf９細胞を、１０％熱非働化ＦＢＳを添加したグレース培地で生育する。その 細胞を組換えバキュロウイルスＶ−ＫＧＦ−２に感染多重度(ＭＯＩ)２で感染さ せる。６時間後、培地を除去し、メチオニンとシステインを欠くＳＦ９００II培 地(Life Technologies Inc．，Gaithersburg)に置換する。４２時間後、5μＣｉ の³⁵Ｓ−メチオニンと５μＣｉの³⁵Ｓ−システイン(Amersham)を加える。細胞を さらに１６時間培養した後、遠心分離によって収集し、標識されたタンパク質を ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって可視化する。 実施例４ 哺乳類細胞でのＫＧＦ−２タンパク質遺伝子配列の一過性発現に使用されるベ クターの大半は、ＳＶ４０複製起点を保持すべきである。これにより、ウイルス ＤＮＡ合成の開始に必要なT抗原を発現する細胞(例えば、ＣＯＳ細胞)における そのベクターの高コピー数への複製が可能になる。この目的には、他の任意の哺 乳類細胞系も使用できる。 典型的な哺乳類発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介するプロモータ ー配列、タンパク質コード配列、および転写の終結と転写物のポリアデニル化に 必要なシグナルを含有する。その他の配列には、エンハンサー、コザック(Kozak )配列、およびＲＮＡスプライシングの供与部位と受容部位が隣接した逆方向配 列がある。高効率の転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レト ロウイルス(例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩなど)の末端反復配列(ＬＴ Ｒ)、およびサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)の初期プロモーターを使って達成で きる。しかし細胞性シグナル(例えば、ヒトアクチンプロモーターなど)を使うこ ともできる。本発明の実施に好適な発現ベクターには、例えばpＳＶＬおよびpＭ ＳＧ(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pＲＳＶcat(ＡＴＣＣ ３７１５２)、pＳＶ ２ＤＨＦＲ(ＡＴＣＣ ３７１４６)、pＢＣ１２ＭＩ(ＡＴＣＣ ６７１０９)など といったベクターがある。使用できる哺乳類宿主細胞には、ヒトのヒーラ細胞、 ２８３細胞、Ｈ９細胞およびジャーカット細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およ びＣ１２７細胞、Cos１、Cos７およびＣＶ１アフリカミドリザル細胞、ウズラＱ Ｃ１−３細胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞がある。 また、遺伝子が染色体中に組込まれている安定細胞系でその遺伝子を発現させ ることもできる。ＤＨＦＲ、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどの選択 可能マーカーとの同時トランスフェクションにより、遺伝子導入された細胞の同 定と単離が可能になる。 コードされているタンパク質を大量に発現させるために、導入された遺伝子を 増幅することができる。ＤＨＦＲ(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)は、数百コピーさ らには数千コピーの目的遺伝子を保持する細胞系を開発するのに有用なマーカー である。もう１つの有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ(ＧＳ)で ある(Murphyら，Bjochem．J．２７７：２７７−２７９（１９９１）；Bebbingto nら，Bjo／Technology １０：１６９−１７５（１９９２）)。これらのマーカー を使用して哺乳類細胞を選択培地中で生育し、最も高い耐性を持つ細胞を選択す る。それらの細胞系の染色体には、増幅された遺伝子が組込まれている。チャイ ニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞は、タンパク質の生産に多用されている。 発現ベクターpＣ１とpＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター(Ｌ ＴＲ)(Cullenら，Molecular and Cellular Biology：４３８−４４７（１９８ ５年３月））とＣＭＶエンハンサーの断片(Boshartら，Cell ４１：５２１−５ ３０（１９８５））とを含む。制限酵素切断部位BamHＩ，XbaＩおよびAsp７１８ などを含む多重クローニング部位により、目的遺伝子のクローニングが容易にな る。さらにこれらのベクターは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３'イント ロン、ポリアデニル化および終結シグナルを含有する。 Ａ．ＣＯＳ細胞における組換えＫＧＦ−２の発現 プラスミドＫＧＦ−２ＨＡの発現は、次に挙げる要素帝含むベクターpcＤＮＡ Ｉ／Amp(Invitrogen)から得た：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性 遺伝子、３）大腸菌複製起点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカ ー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位。ＨＡ標識は、既に記述 されているように、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに 相当する(Wilson，I．ら，Cell ３７：７６７（１９８４）)。標的タンパク質に ＨＡ標識を融合すると、ＨＡエピトープを認識する抗体を使ってその組換えタン パク質を容易に検出できるようになる。全ＫＧＦ−２前駆体ＨＡ標識は、ＨＡ標 識と同じ読み枠で融合しているので、この組換えタンパク質の発現は、ＣＭＶプ ロモーターに支配される。 プラスミドの構築法は次の通りである。 ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５９７７を、次の２つのプラ イマーを用いるＰＣＲによって構築する。５'プライマー： は、BamHＩ部位を含み、それに開始コドンから始まるＫＧＦ−２コード配列の２ ２ヌクレオチドが続いている。３'配列： は、XhoＩ部位、ＨＡ標識およびＫＧＦ−２コード配列の最後の２６ヌクレオチ ド(停止コドンを含まない)に相補的な配列を含有する。従って、そのＰＣＲ産物 は、BamHＩ部位およびＫＧＦ−２コード配列とそれに続くXhoＩ部位、インフ レーム融合したＨＡ標識およびＨＡ標識に続く翻訳終結停止コドンを含有する。 そのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片とベクターpcＤＮＡ-３'ＨＡをBamHＩおよびXhoＩ制 限酵素で消化し、それらを連結して、pcＤＮＡ-３'ＨＡ-ＫＧＦ−２を得る。そ の連結混合物で大腸菌ＸＬ１ Blue株(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，C A)を形質転換し、その形質転換培養をアンピシリン培地平板で培養して、耐性コ ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、ＰＣＲと制限分 析によって正しい断片の存在を調べた。この組換えＫＧＦ−２を発現させるため 、ＤＥＡＥ−デキストラン法(Sambrook，J．ら，Molecular Cloning：A Laborat ory Mannual，Cold Spring Laboratory Press（１９８９）)により、ＣＯＳ細胞 に上記発現ベクターをトランスフェクトした。ＫＧＦ−２ＨＡタンパク質の発現 は、放射線標識と免疫沈降法(Harlow，E．およびLane，D.，Antibodies：A Labo ratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８８）)によって 検出した。トランスフェクションの２日後に、細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間 標識した。次いで、培養培地を集め、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０ mM NaCl、１％ＮＰ−４０、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０.５％ＤＯＣ、 ５０mM Tris，ｐＨ7.5)で溶解した(Wilson，I．ら，同上 ３７：７６７（１９８ ４）)。細胞溶解液と培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿 させた。沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。 Ｂ．ＣＨＯ発現系を使用するヒトＫＧＦ−２タンパク質の発現および精製 ＫＧＦ−２タンパク質の発現にベクターpＣ１を使用する。プラスミドpＣ１は 、プラスミドpＳＶ２-ＤＨＦＲ[ＡＴＣＣ受託番号３７１４６号]の誘導体である 。これらのプラスミドは共に、マウスＤＨＦＲ遺伝子をＳＶ４０初期プロモータ ーの制御下に含有する。これらのプラスミドをトランスフェクトされたジヒドロ 葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞その他の細胞は、化学療法剤メ トトレキセートを添加した選択培地(アルファマイナスＭＥＭ(alpha minus MEM) ，Life Technologies)中でそれらの細胞を生育することにより選択できる。メト トレキセート(ＭＴＸ)に耐性な細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅について は、詳細に報告されている(例えば、Alt，F．W．，Kellems，R．M．，Bertino， J．R．およびSchimke，R．T．,１９７８，J．Bjol．Chem．２５３：１３５７− １３７０、Hamlin，J．L．およびMa，C．,１９９０，Biochem et Biophys．Acta １０９７：１０７−１４３、Page，M．J．およびSydenham，M．A.，１９９１， Biotechnology，第９巻：６４−６８を参照)。ＭＴＸ濃度を増大させつつ培養し た細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生す ることにより、この薬物に対する耐性を発達させる。そのＤＨＦＲ遺伝子に第２ の遺伝子を連鎖させると、通常、それが同時に増幅されて過剰発現する。１,０ ００コピーを超える遺伝子を保有する細胞系を開発することが現在の技術水準で ある。その後メトトレキセートを取り除くと、細胞系は、染色体に組込まれた増 幅された遺伝子を含有する。 プラスミドpＣ１は、目的遺伝子を発現させるために、ラウス肉腫ウイルスの 末端反復配列(ＬＴＲ)の強力なプロモーター(Cullenら，Molecular and Cellula r Biology，１９８５年３月：４３８−４４７０)とヒトサイトメガロウイルス( ＣＭＶ)の前初期遺伝子のエンハンサーから単離される断片(Boshartら，Cell ４ １：５２１−５３０，１９８５)とを含有する。このプロモーターの下流には、 遺伝子の組込みを可能にする次の単一制限酵素切断部位がある：BamHＩ、PvuII 、およびNruI。このプラスミドは、それらクローニング部位の後ろに、３種類全 ての読み枠で翻訳停止コドンを含有し、それに続いてラットプレプロインスリン 遺伝子の３'イントロンとポリアデニル化部位を含む。発現には、ヒトβ-アクチ ンプロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、その他のウイルス(例 えば、ＨＩＶやＨＴＬＶＩ)に由来する末端反復配列などといった、他の高効率 プロモーターも使用できる。mＲＮＡのポリアデニル化には、ヒト成長ホルモン やグロビン遺伝子などに由来する他のシグナルも同様に使用できる。 染色体に組込まれた目的遺伝子を保有する安定細胞系は、gpt、Ｇ４１８、ま たはハイグロマイシンなどの選択可能マーカーとの同時トランスフェクションに よって選択できる。まず最初は、２種類以上の選択可能マーカー(例えば、Ｇ４ １８とメトトレキセート)を使用すると有利である。 プラスミドpＣ１を制限酵素BamHＩで消化した後、ウシ腸ホスファターゼを 使って、当技術分野で知られる手法により脱リン酸化する。次いで、そのベクタ ーを1％アガロースゲルから単離する。 ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ番号７５９７７を、その遺伝子の ５'配列と３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅 する。 ５'プライマーは、 という配列を持ち、これは、BamHＩ制限酵素部位と、それに続く第１図のＫＧＦ −２配列の２１塩基とを含有する。後述するように、発現ベクターに挿入される と、ヒトＫＧＦ−２をコードする増幅断片の５'末端は、効率のよいシグナルペ プチドを与える。Kozak，M．,J．Mol．Biol．１９６：９４７−９５０（１９８ ７）に記述されているような真核細胞における翻訳開始の効率のよいシグナルは 、この構築物のベクター部分に適切に配置されている。 ３'プライマーは、 という配列を持ち、これは、BamHＩ制限部位と、それに続いて第１図に記載のＫ ＧＦ−２コード配列の最後の２６ヌクレオチド(停止コドンを含まない)に相補的 なヌクレオチドとを含有する。 増幅された断片を上述のように１％アガロースゲルから単離した後、制限エン ドヌクレアーゼBamHＩで消化し、再び１％アガロースゲルで精製する。 次いで、単離した断片と脱リン酸化したベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結 する。次いで大腸菌ＨＢ１０１細胞を形質転換し、プラスミドpＣ１を含む細菌 を同定する。挿入された遺伝子の配列と向きをＤＮＡ配列決定によって確認する 。 ＣＨＯ-ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクション 活性なＤＨＦＲ酵素を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェク ションに使用する。リポフェクチン法(Felgnerら,上記)を用いて、5μｇの発現 プラスミドpＣ１を０.５μｇのプラスミドpＳＶneoと同時にトランスフェクトす る。プラスミドpＳＶ２-neoは、優勢選択可能マーカー(Ｇ４１８を含む抗生物質 群に対する耐性を付与する酵素をコードするTn5由来の遺伝子neo)を含有する。 その細胞を、１mg／mlＧ４１８を添加したアルファマイナスＭＥＭに接種する。 ２日後、細胞をトリプシン処理し、ハイブリドーマクローニングプレート(Grein er,Germany)に接種し、１０〜１４日間培養する。この期間の後、単一クローン をトリプシン処理し、異なる濃度のメトトレキセート(２５nM、５０nM、１００n M、２００nM、４００nM)を使って、それらを６ウェルペトリ皿に接種する。最高 濃度のメトトレキセートで成長するクローンを、さらに高いメトトレキセート濃 度(５００nM、１μＭ、２μＭ、５μＭ)を含む新しい６ウェルプレートに移す。 クローンが１００μＭ濃度で成長するまで、同じ操作を繰り返す。 所望の遺伝子産物の発現は、ウェスタンブロット分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥによ って分析する。 実施例５ 組換えＫＧＦ−２のインビトロにおける転写および翻訳 ＫＧＦ−２の昆虫細胞発現に使用したpＡ２ベクター中のクローン化ＤＮＡか らＰＣＲ産物を得る。このＰＣＲに使用したプライマーは次の通りである： 第一のプライマーは、ＡＴＧ開始コドンの５'側にＴ３プロモーターの配列を 含有する。第二のプライマーは、ＫＧＦ−２オープンリーディングフレームの３ '末端に相補的であり、停止コドンの逆方向相補鎖をコードする。 得られたＰＣＲ産物をQiagenから市販されているキットを使って精製する。そ のＤＮＡ０.５μｇを試験管内転写翻訳反応のテンプレートとして使用する。こ の反応は、ＴＮＴという名称でPromegaから市販されているキットを使って行な う。アッセイは、放射活性標識されたメチオニンを基質とし、示された試薬体積 の１／２しか使用しない点と反応を３３℃で１.５時間進行させる点以外は、そ のキットの使用説明書に記述されているように行なう。 ５μｌの反応液を変性１０−１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動的に分 離する。そのゲルを体積比６：３：１の水：メタノール:酢酸混合液中で３０分 間固定する。次いで、そのゲルを加熱下に真空乾燥した後、Ｘ線フィルムに１６ 時間曝露する。そのフィルムを現像すると、概念的に翻訳されたＫＧＦ−２に相 当するサイズを持つ放射活性タンパク質バンドの存在が示されることから、クロ ーニングされたＫＧＦ−２のcDNAが予想されるサイズのタンパク質をコードする オープンリーディングフレームを含むことが強く示唆される。 実施例６ 遺伝子療法による発現 皮膚生検によって対象から線維芽細胞を得る。得られた組織を組織培養培地に 入れ、小片に分割する。小さい組織塊を組織培養フラスコの湿表面に置き、各フ ラスコに約１０片ずつ入れる。そのフラスコを上下逆さにし、密閉して、室温に 終夜放置する。室温で２４時間後、そのフラスコを逆さにし、組織塊をフラスコ の底に固定したまま、新鮮な培地(例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、および ストレプトマイシンを含むハムＦ１２培地)を加える。次いで、これを３７℃で 約１週間培養する。この時点で、新鮮な培地を加え、以後、数日毎に交換する。 さらに２週間培養すると、線維芽細胞の単層が生じる。その単層をトリプシン処 理して、より大きなフラスコに移す。 モロニーネズミ肉腫ウイルスの末端反復配列が隣接したpＭＶ−７(Kirschmeie r，P．T．ら，ＤＮＡ７：２１９−２５（１９８８）)をEcoRＩとHindIIIで消化 した後、ウシ腸ホスファターゼで処理する。その線状ベクターをアガロースゲル で分画し、ガラスビーズを用いて精製する。 本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ５'末端配列と３'末端配 列に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。その５'プライマーは、EcoR Ｉ部位を含有し、３'プライマーはさらに、HindIII部位を含む。モロニーネズミ 肉腫ウイルス線状骨格と、増幅したEcoRＩおよびHindIII断片とを、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼの存在下に等量ずつ混合する。得られた混合物を、上記二断片の連結に 適した条件下に維持する。その連結混合物を用いて細菌ＨＢ１０１ を形質転換し、目的の遺伝子がベクターに正しく挿入されていることを確認する ために、それをカナマイシン含有寒天上で平板培養する。 両種性pＡ３１７またはＧＰ＋am１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血 清(ＣＳ)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改良イーグル 培地(ＤＭＥＭ)中、コンフルエント密度まで組織培養する。次いで、上記遺伝子 を含有するＭＳＶベクターをその培地に加え、パッケージング細胞をそのベクタ ーで形質導入する。パッケージング細胞は、上記遺伝子を含有する感染性ウイル ス粒子を産生するようになる(このパッケージング細胞を産生細胞と呼ぶ)。 形質導入された産生細胞に新鮮な培地を加えた後、コンフルエントな産生細胞 の１０cmプレートから培地を収集する。感染性ウイルス粒子を含有するその消費 済み培地をミリポアフィルターに通して、剥離した産生細胞を除去し、その培地 を使って線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞のサブコンフルエント(sub-confl uent)プレートから培地を除去し、産生細胞から得た培地にすばやく置換する。 この培地を除去し、新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が高ければ、事実上 全ての線維芽細胞が感染され、選択の必要はないだろう。力価が極めて低い場合 は、neoやHisなどの選択可能マーカーを持つレトロウイルスベクターを使用する 必要がある。 次いで、操作した上記線維芽細胞を、そのまま、もしくはサイトデックス(Cyt odex)３マイクロキャリアービーズ上でコンフルエントに成長させた後、宿主に 注射する。その線維芽細胞は、上記タンパク質産物を産生するようになっている 。 実施例７ 糖尿病マウスモデルにおける創傷治癒のＫＧＦ−２による刺激 ケラチノサイト増殖因子２(ＫＧＦ−２)が治癒過程を加速することを立証する ために、創傷治癒の遺伝性糖尿病マウスモデルを使用した。db+／db+マウスにお ける全層創傷治癒モデルは、よく特徴づけられた臨床に関連する再現性ある創傷 治癒障害モデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮(contraction)よりもむし ろ肉芽組織の形成と再上皮化に依存する(Gartner，M．H．ら，J．Surg．Res 52 ：389（１９９２）；Greenhalgh，D．G．ら，Am．J．Pathol． １３６：１２３５（１９９０）)。 この糖尿病動物は、II型真性糖尿病に観察される特性の多くを持つ。ホモ接合 性(db+／db+)マウスは、その正常なヘテロ接合性(db+／+m)同腹仔と比較して、 肥満している。突然変異糖尿病(db+／db+)マウスは、染色体４に単一の常染色体 劣性突然変異(db+)を持つ(Colemanら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ７７:２８ ３−２９３（１９８２）)。動物は、多食、煩渇多飲および多尿を示す。突然変 異糖尿病マウス(db+／db+)は、血糖値が高く、インスリンレベルが増大している かまたは正常であって、細胞性免疫が抑制されている(Mandelら，J．Immunol． １２０：１３７５（１９７８）；Debray−Sachs，M．ら，Clin．Exp．Immunol． ５１(１)：１−７（１９８３）；Leiterら，Am．J．of Pathol．１１４：４６− ５５（１９８５）)。これらの動物では、末梢神経障害、心筋合併症、微小血管 損傷、基底膜肥厚および糸球体濾過異常が記述されている(Norido，F．ら，Exp ．Neurol．83(２)：２２１−２３２（１９８４）；Robertsonら，Diabetes ２９ (１)：６０−６７（１９８０）；Giacomelliら，Lab Invest．４０(４)：４６ ０−４７３（１９７９）；Coleman，D．L．，Diabetes ３１(付録)：１−６（１ ９８２）)。これらホモ接合性糖尿病マウスは、ヒトII型糖尿病と同様にインス リンに対して耐性な高血糖症を発症する(Mandelら，J．Immunol．１２０：１３ ７５−１３７７（１９７８）)。 これらの動物に観察される特徴は、このモデルにおける治癒がヒト糖尿病で観 察される治癒に類似しうることを示唆している(Greenhalghら，Am．J．of Patho l．１３６：１２３５−１２４６（１９９０）)。この試験の結果から、ＫＧＦ− ２が糖尿病および非糖尿病ヘテロ接合性同腹仔における全層創傷に対して強力な 刺激作用を持つことが明らかになった。ＫＧＦ−２処置動物では、再上皮化と、 真皮内での肉芽組織、コラーゲン細線維の増加に対する著しい効果が観察された 。増殖因子類の外因的適用は、炎症性細胞を創傷に引き寄せることにより肉芽組 織形成を加速しうる。 動物 この試験では、遺伝性糖尿病メスＣ５７ＢＬ／KsJ(db+／db+)マウスとその 非糖尿病(db+／+m)ヘテロ接合性同腹仔を使用した(Jackson Laboratories)。こ れらの動物は６週齢で購入し、試験の開始時点で８週齢だった。動物は個別に飼 育し、水と食物を無制限に摂取させた。すべての操作は、無菌技術を使って行な った。実験は、Human Genome Sciences，Inc．の社内動物実験委員会(Instituti onal Animal Care and Use ComMittee)の規則と指針および動物実験ガイドライ ン(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)に従って行なっ た。 ＫＧＦ−２ 創傷治癒試験に使用した組換えヒトＫＧＦ−２は、大腸菌発現ベクター系(pＱ Ｅ−９；Qiagen)の１つpＱＥ６０−Cys３７から過剰発現させ、精製した。この 構築物から発現されるタンパク質は、３７番目のシステインから２０８番目のセ リンまでよりなるＫＧＦ−２で、そのタンパク質のＮ末端に結合した６×(Ｈis) 標識を持つ(配列番号２９−３０)(第１５図)。純度９５％を超える組換え物質を 含有する画分を実験に使用した。ケラチノサイト増殖因子２は、１００mMトリス (８.０)と６００mM NaClを含む賦形剤中に調剤した。原液の最終濃度は、８０μ ｇ／mLおよび８μｇ／mLとした。希釈液は、同じ賦形剤を使って原液から調製し た。 手術創形成 創傷の形成は、過去に報告されている方法に従って行なった(Tsuboi，R．およ びRifkin，D．B．，J．Exp.Med．１７２：２４５−２５１（１９９０）)。簡単 に述べると、創傷形成の日に動物をアバーティン(脱イオン水に溶解した２,２, ２−トリブロモエタノールと２−メチル−２−ブタノール)(０.０１mg／mL)の腹 腔内注射によって麻酔した。その動物の背中を剃毛し、皮膚を７０％エタノール 溶液とヨウ素で洗浄した。創傷形成に先立って手術領域を滅菌ガーゼで乾燥させ た。次いで、キーズ(Keyes)組織穿孔具を使って８mMの全層創傷を形成させた。 創傷の拡大を排除するため、創傷形成直後に、周囲の皮膚を穏やかに引き伸ばし た。実験期間中は、創傷を開放状態にしておいた。処置の適 用は、創傷形成の日に開始して５日間連続して局所的に行なった。処置に先立ち 、創傷を滅菌食塩水とガーゼスボンジを使って穏やかに洗浄した。 手術の日とその後の２日置きに、創傷を目視検査し、一定の距離から写真撮影 した。創傷の閉鎖は、第１−５日の毎日と第８日に行なった計測によって決定し た。創傷は、較正済ジェームソン(Jameson)キャリパーを使って水平および垂直 方向に計測した。肉芽組織がもはや視認できず、創傷が連続した上皮で覆われた ら、その創傷は治癒したとみなした。 ＫＧＦ−２は、２種類のＫＧＦ−２用量(５０μＬの賦形剤中、一つは１日あ たり創傷あたり４μｇを８日間、もう一つは１日あたり創傷あたり４０μｇを８ 日間)を使って投与した。賦形剤対照群には、５０μＬの賦形剤を与えた。 第８日にナトリウムペントバルビタール(３００mg／kg)の腹腔内注射により動 物を安楽死させた。次いで、組織学的検査と免疫組織化学的検査のために、創傷 と周囲の皮膚を採取した。組織標本は、さらなる処理のため、生検スポンジ(bio psy sponge)間の組織カセット中の１０％中性緩衝ホルマリンに入れた。 実験計画 それぞれ１０匹の動物(５匹は糖尿病で、５匹は非糖尿病対照)からなる３群： １）賦形剤プラシーボ対照群、２）ＫＧＦ−２４μｇ／日群、および３）ＫＧＦ −２ ４０μｇ／日群を評価した。この試験は次のように計画した。創傷の面積と閉鎖の計測 創傷の閉鎖は、その面積を垂直および水平軸方向に計測し、創傷の総平方面積 を求めることによって分析した。次いで、最初(第０日)と処置後(第８日)の創 傷面積の差を定めることによって収縮を見積もった。第１日での創傷面積は６４ mM²で、これは真皮穿孔具のサイズに相当する。計算は次式を使って行なった。 ［第８日の開口面積］−［第１日の開口面積］／［第１日の開口面積］ 組織学 標本を１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋ブロックを創傷表面 に対して垂直に薄片化(５μｍ)し、ライヘルト−ユングミクロトームを使って切 断した。二等分した創傷の横断面に対して常用のヘマトキシリン・エオジン(Ｈ −Ｅ)染色を施した。創傷の組織学的検査を用いて、治癒過程と修復された皮膚 の形態的外観がＫＧＦ−２を用いた処置によって変化したかどうかを評価した。 この評価には、細胞集積、炎症性細胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮化および表 皮成熟の存在の確認を含めた(Greenhalgh，D．G．ら，Am．J．Pathol．１３６： １２３５（１９９０）)(表１)。盲検観察者が較正済のレンズマイクロメーター を使用した。 免疫組織化学 再上皮化 ＡＢＣ Elite検出システムを用いて、組織切片をポリクローナルウサギ抗ヒト ケラチン抗体で免疫組織化学的に染色した。ヒトの皮膚を陽性組織対照として使 用し、非免疫IgGを陰性対照として使用した。ケラチノサイトの増殖は、創傷の 再上皮化の程度を較正済のレンズマイクロメーターを使って評価することにより 測定した。細胞増殖マーカー ＡＢＣ Elite検出システムを使用し、抗ＰＣＮＡ抗体(１：５０)を用いること により、皮膚標本中の増殖細胞核抗原／サイクリン(ＰＣＮＡ)を明らかにした。 ヒト結腸癌を陽性組織対照とし、ヒト脳組織を陰性組織対照として使用した。各 標本には、一次抗体を省略し、非免疫マウスIgGに置換した切片を含めた。これ らの切片の格付けは、増殖の程度に基き０−８の尺度で行なった(尺度が低い ほど増殖がわずかで、高いほど強い増殖を表わす)。 統計分析 独立t検定を使って実験データを分析した。０.０５未満のp値を有意とみなし た。データは、平均±ＳＥＭとして表す。 結果 創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２の効果 糖尿病マウスは、ヘテロ接合性の正常マウスと比較して、治癒障害を示した。 一部位あたり４μｇのＫＧＦ−２用量で糖尿病動物と非糖尿病動物に最大反応が もたらされたようである(第５、６図)。これらの結果は、緩衝液対照群と比較し て、統計的に有意だった(p＝０.００２およびp＜０.０００１)。ＫＧＦ−２によ る処置は、４μｇ／日を与えた群で６０.６％、４０μｇ／日群で３４.５％の最 終平均閉鎖率をもたらした。緩衝液対照群の創傷は、第８日までに３.８％の閉 鎖率しか示さなかった。ＫＧＦ−２で処置したdb+／db+マウスから創傷形成後の 第２−５日と第８日に繰返して得た創傷の計測値により、緩衝液対照群と比較し て、創傷形成後第３日までに総創傷面積(mM²)の有意な改善が立証された。この 改善は持続し、実験の終了時までに統計的に有意な結果が観察された(第７図)。 ＫＧＦ−２を与えたdb／+m群の動物も繰返し行なった計測で緩衝液対照群より大 きな創傷面積の減少を示した(第８図)。これらの結果から、ＫＧＦ−２で処置し た動物の方が創傷閉鎖率が高いことが確認された。 組織学的スコアに対するＫＧＦ−２の効果 第８日に行なった糖尿病(db+／db+)モデルにおけるＫＧＦ−２の病理組織的評 価により、緩衝液対照と比較して、創傷スコアの統計学的に有意な改善(p＜０. ０００１)が示された。４μｇおよび４０μｇのＫＧＦ−２用量の両者に観察さ れた薬理作用には互いに有意差がなかった。緩衝液対照群が示す細胞集積はごく わずかで、肉芽組織または上皮移動を伴わなかったが、４μｇおよび４０μｇの ＫＧＦ−２投与量(それぞれp＜０.０００１およびｐ＝０.０６)は、創傷を覆う 上皮、新 血管新生、肉芽組織形成および線維芽細胞とコラーゲンの沈着を示した(第９図) 。 皮膚創傷の病理組織学的評価は、ヘマトキシリン・エオジン染色試料に対して 行なった。採点基準には、１−１２の尺度を含めた。ここにスコア１は、細胞集 積がごくわずかで肉芽形成をほとんど伴わないか全く伴わないことを表わし、ス コア１２は、線維芽細胞、コラーゲン沈着および創傷を覆う新しい上皮の豊富な 存在を表わす(表１)。 表１ 組織学切片の採点 両投与量のＫＧＦ−２を投与した後の非糖尿病同腹仔の評価は、評価したどの 測定についても、緩衝液対照群と比較して有意な活性を示さなかった(第１０図) 。緩衝液対照群は、未熟な肉芽組織、炎症性細胞および毛細管を示した。平均ス コアは糖尿病群より高く、このことから糖尿病(db+／db+)マウスにおける治癒障 害が示された。 再上皮化に対するＫＧＦ−２の効果 サイトケラチン免疫染色法を使って再上皮化の程度を測定した。スコアは、０ (閉鎖なし)から８(完全な閉鎖)までの尺度で、閉鎖の程度に基いて与えた。４μ ｇ／日投与群では、緩衝液対照群と比較して、再上皮化スコアに統計的に有意な 改善があった(p＜０.００１)(第１１図)。この群では、創傷を覆う新たに形成し た表皮に局在したケラチノサイトが観察された。ＫＧＦ−２の両投与量は、様々 な段階の有糸分裂像をも示した。両投与量のＫＧＦ−２で非糖尿病群を評価 したところ、やはり再上皮化ランクが有意に改善された(それぞれp=０.００６お よび０.０１)(第１２図)。 細胞増殖に対するＫＧＦ−２の効果 増殖細胞核抗原免疫染色により、４μｇ群と４０μｇ群の両方に有意な増殖が 示された(第１３図)。非糖尿病群の結果も同様で、両投与量のＫＧＦ−２を与え た群はどちらも、緩衝液対照群より高い有意な得点を示した(第１４図)。表皮増 殖は特に、表皮の基底層で観察された。また真皮、とりわけ毛包に高密度のＰＣ ＮＡ標識細胞が観察された。 結論 これらの結果は、ＫＧＦ−２が初代表皮ケラチノサイトの増殖を特異的に刺激 することを立証している。またこれらの実験は、局所的に適用された組換えヒト ＫＧＦ−２が糖尿病マウスにおける全層切除真皮創傷の治癒速度を著しく加速す ることを立証している。組織学的評価は、ＫＧＦ−２が表皮肥厚を伴うケラチノ サイト増殖を誘導することを示している。この増殖は表皮の基底層に局在するこ とが、増殖細胞核抗原(ＰＣＮＡ)によって立証された。真皮のレベルでコラーゲ ン沈着、線維芽細胞増殖および新血管新生により、正常な皮膚構造が再建された 。 ＰＣＮＡ標識細胞が少ない緩衝液群とは対照的に、ＫＧＦ−２処置動物におけ るＰＣＮＡ標識細胞の密度が高いことは、真皮-表皮レベルでのケラチノサイト 、線維芽細胞および毛包の刺激を示している。この実験では、ＫＧＦ−２による 治癒過程の強化が一貫して観察された。この効果は、評価したパラメーター(再 上皮化率および創傷閉鎖率)で統計的に有意だった。重要なことに、ＰＣＮＡ標 識ケラチノサイトは、主として表皮の下層−基底層に観察された。真皮は、線維 芽細胞、コラーゲンおよび肉芽組織を伴う正常化された組織を示した。 非糖尿病動物で観察された活性は、第８日の時点で、また毎日行なった計測に よればこの実験の経過中、ＫＧＦ−２が創傷閉鎖率に有意な薬理学的応答を得た ことを示している。病理組織学的評価には、緩衝液対照と比較して有意差がなか ったが、ケラチノサイト増殖とＰＣＮＡスコアから有意な効果が立証された。 要約すると、これらの結果から、ＫＧＦ−２がdb+／db+マウスモデルを使った 障害を持つおよび正常な切除創傷モデルのどちらでも有意な活性を示すこと、ま たそれゆえに手術創、糖尿病性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、熱傷およびその他の皮 膚状態を含む創傷の治療に有用であるといえることが立証された。 実施例８ ステロイド障害ラットモデルにおけるＫＧＦ−２が媒介する創傷治癒 ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々の試験管内および生体内系で詳細に 報告されている(Anti−Inf1amMatory Steroid Action：Basic and Clinical Asp ectsの２８０−３０２頁，Wahl，S．M．著，Glucocorticoids and Wound healin g（１９８９）；Wahl，S．M．ら，J．Immunol．１１５：４７６−４８１（１９ ７５）；Werb，Z．ら，J．Exp．Med．１４７：１６８４−１６９４（１９７８） )。グルココルチコイドは、血管新生を阻害し、血管透過性(Ebert，R．H．ら，A n．Intern．Med．３７:７０１−７０５（１９５２）)、線維芽細胞増殖およびコ ラーゲン合成(Beck，L．S．ら，Growth Factors．５：２９５−３０４（１９９ １）；Haynes，B．F．ら，J．Clin．Invest．６１：７０３−７９７（１９７８ ）)を低下させ、循環単球の一時的低下をもたらす(Haynes，B．F．ら，J．Clin ．Invest．６１：７０３−７９７（１９７８）；AntiinflamMatory Steroid Act ion：Basic and Clinical Aspects，Academic Press，New York)の２８０−３０ ２頁，Wahl，S．M．著，Glucocorticoids and wound healing（１９８９）)こと によって創傷治癒を遅らせる。ステロイド剤の全身投与による創傷治癒の障害は 、ラットで十分に確証された現象である(Beck，L．S．ら，GrQwth Factors．５ ：２９５−３０４（１９９１）；Haynes，B．F．ら，J．Clin．Invest．６１： ７０３−７８７（１９７８）；AntiinflamMatory Steroid Action：Basic and C linical Aspects，Academic Press，New York)の２８０−３０２頁，Wahl，S．M ．著，Glucocorticoids and wound healing（１９８９）；Pierce，G．F．ら,Pr oc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ．８６：２２２９−２２３３（１９８９）)。 ＫＧＦ−２が治癒過程を加速することを立証するため、メチルプレドニゾロン の全身投与によって治癒機能に障害を受けたラットにおける全層切除皮膚創傷に 対するＫＧＦ−２の複数回局所適用の効果を評価した。試験管内試験により、Ｋ ＧＦ−２は、初代ヒト表皮ケラチノサイトの増殖を特異的に刺激することが立証 されている。この実施例は、局所的に適用された組換えヒトＫＧＦ−２がラット の全層切除皮膚創傷の治癒速度を加速することを、較正済ジェームソンキャリパ ーによる創傷間隙の計測と組織形態測定および免疫組織化学によって立証するも のである。組織学的評価により、ＫＧＦ−２が再上皮化を加速し、続いて創傷修 復を加速することが立証される。 動物 この実施例では、体重２５０−３００gの若い成体の雄のスプレーグ・ドーリ ーラット(Charles River Laboratories)を使用した。これらの動物は８週齢で購 入し、試験の開始時点で９週齢だった。創傷形成時にメチルプレドニゾロンを全 身投与(筋肉内に１７mg／kg／ラット)することにより、ラットの治癒反応を障害 した。動物は個別に飼育し、水と食物を無制限に摂取させた。すべての操作を無 菌技術を使って行なった。この試験は、Human Genome Sciences，Inc．の社内動 物実験委員会(Institutional Animal Care and Use ComMittee)の規則と指針お よび動物実験ガイドライン(Guidelines for the Care and Use of Laboratory A nimals)に従って行なった。 ＫＧＦ−２ 組換えヒトＫＧＦ−２は、大腸菌発現ベクター系(pＱＥ−９；Qiagen)の１つp ＱＥ６０−Cys３７から過剰発現させ、精製した。この構築物から発現されるタ ンパク質は、３７番目のシステインから２０８番目のセリンまでよりなるＫＧＦ −２で、そのタンパク質のＮ末端に結合した６×(His)標識を持つ(第１５図)（ 配列番号２９−３０）。純度９５％を超える組換え物質を含有する画分を実験に 使用した。ＫＧＦ−２は、１×ＰＢＳを含む賦形剤中に調剤した。原液の最終濃 度は、２０μｇ／mLおよび８０μｇ／mLとした。希釈液は、同じ賦形剤を 使って原液から調製した。 ＫＧＦ−２Δ２８は、大腸菌発現系から過剰発現させ、精製した。純度９５％ を超える組換え物質を含む画分を実験に使用した。ＫＧＦ−２は、１×ＰＢＳを 含む賦形剤中に調剤した。原液の最終濃度は、２０μｇ／mLおよび８０μｇ／mL とした。希釈液は、同じ賦形剤を使って原液から調製した。 手術創形成 創傷形成法は、上記実施例７に従った。創傷形成の日に動物をケタミン(５０m g／kg)とキシラジン(５mg／kg)の筋肉内注射によって麻酔した。その動物の背中 を剃毛し、皮膚を７０％エタノール溶液とヨウ素液で洗浄した。創傷形成に先立 って手術領域を滅菌ガーゼで乾燥させた。次いで、キーズ組織穿孔具を使って８ mMの全層創傷を形成させた。実験期間中は、創傷を開放状態にしておいた。試験 物質の適用は、創傷形成の日に開始し、メチルプレドニゾロンの投与に続いて７ 日間連続して局所的に行なった。処置に先立ち、創傷を滅菌食塩水とガーゼスポ ンジを使って穏やかに洗浄した。 創傷形成の日と処置の終了時に創傷を目視検査し、一定の距離から写真撮影し た。創傷の閉鎖は、第１−５日の毎日と第８日に行なった計測によって決定し、 図面した。創傷は、較正済ジェームソンキャリパーを使って水平および垂直方向 に計測した。肉芽組織がもはや視認できず、創傷が連続した上皮で覆われたら、 その創傷は治癒したとみなした。 用量反応測定は、２種類のＫＧＦ−２用量(５０μＬの賦形剤中、一つは１日 あたり創傷あたり１μｇ、もう一つは１日あたり創傷あたり４μｇを５日間)を 使って行なった。賦形剤対照群には、５０μＬの１×ＰＢＳを与えた。 第８日にナトリウムペントバルビタール(３００mg／kg)の腹腔内注射により動 物を安楽死させた。次いで、組織学的検査のために、創傷と周囲の皮膚を採取し た。組織標本は、さらなる処理のため、生検スポンジ間の組織カセット中の１０ ％中性緩衝ホルマリンに入れた。 実験計画 それぞれ１０匹の動物(５匹はメチルプレドニゾロンを投与、５匹はグルココ ルチコイドの投与なし)からなる４群：１）無処置群、２）賦形剤プラシーボ対 照群、３）ＫＧＦ−２ １μｇ／日群および４）ＫＧＦ−２ ４μｇ／日群を評価 した。この試験は次のように計画した。 創傷の面積と閉鎖の測定 創傷の閉鎖は、その面積を垂直および水平軸方向に計測し、創傷の総面積を求 めることによって分析した。次いで、最初(第０日)と処置後(第８日)の創傷面積 の差を定めることによって閉鎖を見積もった。第１日での創傷面積は６４mM²で 、これは真皮穿孔具のサイズに相当する。計算は次式を使って行なった。 ［第８日の開口面積］−［第１日の開口面積］／［第１日の開口面積］ 組織学 標本を１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋ブロックを創傷表面 に対して垂直に薄片化(５μｍ)し、オリンパスミクロトームを使って切断した。 二等分した創傷の横断面に対して常用のヘマトキシリン・エオジン(Ｈ−Ｅ)染色 を施した。創傷の組織学的検査により、治癒過程と修復された皮膚の形態的外観 がＫＧＦ−２を用いた処置によって改善されたかどうかを評価することができた 。創傷間隙の間隔は、盲検観察者が較正済のレンズマイクロメーターを使って決 定 した。 統計分析 独立t検定を使って実験データを分析した。０.０５未満のp値を有意とみなし た。データは、平均±ＳＥＭとして表した。 結果 メチルプレドニゾロンを投与した無処置対照群とメチルプレドニゾロンを投与 しない無処置対照群の創傷閉鎖を比較すると、メチルプレドニゾロンで処置され たラットは、正常なラットと比較して、創傷形成後８日の時点で有意な創傷治癒 障害を示すことがわかる。総創傷面積は、メチルプレドニゾロン注射群では５８ .４mM²、グルココルチコイド非投与群では２２.４mM²だった(第１６図)。 創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２の効果 創傷形成時にラットにメチルプレドニゾロンを全身投与すると、正常ラットの 創傷閉鎖が遅延した(p＝０.００２)。第８日の実験終了時に行なったメチルプレ ドニゾロン障害群の創傷閉鎖測定から、ＫＧＦ−２群の創傷閉鎖は、無処置群と 比較して統計的に有意に大きい(１μｇ群はp＝０.００２；４μｇ群はp＝０.０ ０５)ことが明らかになった(第１６図)。創傷閉鎖率は、１μｇ−ＫＧＦ−２投 与群で６０.２％(p＝０.００２)、４μｇ-ＫＧＦ−２投与群で７３％(p＝０.０ ００８)だった。これに対し、無処置群では１２.５％、賦形剤プラシーボ群では ２８.６％だった(第１７図)。 第１日から第８日までのグルココルチコイド群における創傷閉鎖の経過分析に より、処置群では、どちらのＫＧＦ−２投与量でも創傷形成後の第３日から第８ 日まで創傷サイズの有意な減少が示される(第１８図)。 これらの結果は、４μｇのＫＧＦ−２で処置した群では、無処置群と比較して 創傷閉鎖が統計的に有意(p＝０.０５)に加速されたことを示している(第１９Ａ 図)。正常な動物においてタンパク質またはその他化合物の創傷治癒加速力を評 価することは(回復が迅速なために)困難であるが、それでもなお、ＫＧＦ−２は 、 このモデルで創傷治癒を加速することが示された。 ＫＧＦ−２で処置した創傷の病理組織学的評価 創傷間隙の組織形態測定は、ＫＧＦ−２処置群の創傷間隔の減少を示した。無 処置群で観察された創傷間隙が５３３６ミクロンであったのに対し、１μｇのＫ ＧＦ−２で処置した群では２９７２ミクロンに減少し、４μｇのＫＧＦ−２で処 置した群(p＝０.０４)では創傷間隙が３０８５ミクロンに減少していた(第２０ 図)。 創傷治癒に関するＫＧＦ−２Δ２８の効果 メチルプレドニゾロン障害ラットモデルの創傷治癒に関するＫＧＦ−２Δ２８ とＰＤＧＦ−ＢＢの評価も検討した。この実験は、ＫＧＦ−２Δ２８タンパク質 がHis標識を持たない点と創傷治癒を第２、４、６、８、および１０日に測定し た点以外は、上記ＫＧＦ−２タンパク質の場合と同様に行なった。これらタンパ ク質用の緩衝賦形剤は、全長のＫＧＦ−２の"Ｅ２"調製品を除くいずれについて も４０mM NaOAcおよび１５０mM NaCl(ｐＨ 6.5)とした。"Ｅ２"ＫＧＦ−２調製 品用の緩衝賦形剤は、２０mM NaOAcおよび４００mM NaCl(ｐＨ ６.４)とした。 第１９Ｂ図に示す結果は、ＫＧＦ−２Δ２８が無処置群と比較して創傷閉鎖を 統計的に有意に加速し、創傷治癒に対するメチルプレドニゾロンの作用をくつが えしたことを立証している。 結論 この実施例は、ＫＧＦ−２が創傷治癒に対するメチルプレドニゾロンの作用を くつがえしたことを証明している。増殖因子類の外因的適用は、創傷に炎症性細 胞を引き寄せることにより肉芽組織形成を加速しうる。類似の活性は、毎日の測 定からＫＧＦ−２が第５日の時点で創傷閉鎖率に有意な薬理学的応答を得たこと を示すメチルプレドニゾロン非投与動物でも観察された。ラットにおけるグルコ コルチコイド障害創傷治癒モデルは、創傷治癒領域におけるＫＧＦ−２とその他 の化合物の効力を測定するのに適した再現性あるモデルであることがわかった。 要約すると、これらの結果は、ＫＧＦ−２がグルココルチコイド障害切除創傷 モデルと正常切除創傷モデルの両方で有意な活性を示すことを証明している。従 って、ＫＧＦ−２は、手術創、糖尿病性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、熱傷およびそ の他の異常な創傷治癒状態(例えば、尿毒症、栄養不良、ビタミン欠乏症、ステ ロイド剤や抗腫瘍剤での全身処置など)を含む創傷治癒の刺激に臨床的に有用で あるといえる。 実施例９ ＫＧＦ−２mＲＮＡ発現の組織分布 上記Sambrookらの著書などに記載の方法を使ってＫＧＦ−２タンパク質をコー ドする遺伝子のヒト組織における発現レベルを調べるために、ノーザンブロット 分析を行なう。本発明のＫＧＦ−２の全オープンリーディングフレーム（配列番 号１）に相当するプローブをＰＣＲで得て、rediprime^TMＤＮＡラベリングシス テム(Amersham Life Science)を製造者の指示に従って使用することにより、そ のプローブを³²Ｐで標識した。標識した後、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００^TM カラム(Clontech Laboratories，Inc．)を製造者の実験計画案(プロトコル)番号 ＰＴ１２００−１に従って使用することにより、プローブを精製した。次いで、 精製した標識プローブを使って、種々のヒト組織をＫＧＦ−２をコードする遺伝 子の発現について調べた。 種々のヒト組織(Ｈ)またはヒト免疫系組織(ＩＭ)に由来するポリＡＲＮＡを含 むマルチプル・ティシュ・ノーザン(Multiple Tissue Northern；ＭＴＮ)ブロッ トをClontechから入手し、ExpressHyb^TMハイブリダイゼーション溶液(Clontech) を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って使用することにより、標識 プローブで調べた。ハイブリダイゼーションと洗浄の後、ブロットをフィルムに 載せて−７０℃で終夜露出し、標準的な手法でフィルムを現像した。 ほとんどのヒト組織に約４.２kbの多量のmＲＮＡ種が観察された。ＫＧＦ−２ mＲＮＡは、心臓、膵臓、胎盤および卵巣に比較的豊富だった。約５．２kbの微 量なmＲＮＡ種も遍在することがわかった。この５．２kb mＲＮＡ種の正体は不 明だ った。この５.２kb転写物は、択一的にスプライシングされた形態のＫＧＦ−２ か、ＫＧＦファミリーの第３の要素をコードする可能性がある。ＫＧＦ−２ cＤ ＮＡは４.１bであり、これは４.２kbのＲＮＡのサイズと合致する。 実施例１０ ケラチノサイト増殖アッセイ 皮膚ケラチノサイトは、皮膚の表皮中の細胞である。皮膚におけるケラチノサ イトの増殖と展開は、創傷治癒の重要な過程である。従って、ケラチノサイトの 増殖アッセイは、タンパク質のケラチノサイト増殖刺激活性(従って、創傷治癒 刺激活性)の貴重な指標である。 しかしケラチノサイトは、試験管内で生育することが難しい。ケラチノサイト 細胞系はわずかしか存在しない。これらの細胞系は、細胞的遺伝的に異なる欠陥 を持っている。生育に重要な増殖因子レセプターの喪失や生育に重要な増殖因子 の欠乏などといった細胞的欠陥によるこのアッセイの複雑化を避けるため、この アッセイには、初代皮膚ケラチノサイトを選択する。これらの初代ケラチノサイ トは、Clonetics，Inc．（San Diego，ＣＡ）から得る。アラマーブルーによるケラチノサイト増殖アッセイ アラマーブルー(alamar Blue)は、培養培地に加えるとミトコンドリアによっ て代謝される生細胞青色色素である。次いで、この色素は、組織培養上清中で赤 色に変わる。この赤色色素の量は、５７０nMと６００nMの光学密度の差を読み取 ることによって直接定量できる。この示数は、細胞活性と細胞数を反映する。 正常な初代皮膚ケラチノサイト(ＣＣ−０２５５，ＮＨＥＫ−Neoプール)は、C loneticsから購入する。これらの細胞は、継代数２である。ケラチノサイトを完 全ケラチノサイト生育培地(ＣＣ−３００１，ＫＧＭ；Clonetics，Inc．)中で８ ０％コンフルエントに達するまで生育する。これらの細胞を製造者の仕様書に従 ってトリプシン処理する。簡単に述べると、細胞をハンクス平衡塩類溶液で２回 洗浄した。２−３mlのトリプシンを室温で約３−５分間細胞に加えた。トリプシ ン中和液を加え、細胞を集めた。細胞を室温にて６００×ｇで５分間遠 心し、予め温めておいた培地を使って新しいフラスコに１平方センチメートルあ たり３,０００細胞の密度で播種する。 増殖アッセイには、Corningの平底９６ウェルプレートの最も外側の列を除く 各ウェルに１,０００−２,０００個のケラチノサイトを播種する。外側のウェル を滅菌水２００μｌで満たす。これはウェルの温度と湿度の変動を最小限に保つ のを助ける。細胞を５％ＣＯ₂と共に３７℃で終夜生育する。細胞をケラチノサ イト基礎培地(ＣＣ−３１０１，ＫＢＭ；Clonetics，Inc．)で２回洗浄し、１０ ０μｌのＫＢＭを各ウェルに加える。２４時間培養する。増殖因子類をＫＢＭ中 に段階希釈法で希釈し、各ウェルに１００μｌずつ加える。ＫＧＭを陽性対照と して使用し、ＫＢＭを陰性対照として使用する。各濃度点につき６つのウェルを 使用する。２〜３日間培養する。培養終了時に細胞をＫＢＭで１回洗浄し、使用 前に培地に混合した１０％ｖ／ｖアラマーブルーを含むＫＢＭ １００μｌを加 える。培地の色がＫＧＭ陽性対照で赤色に変化しはじめるまで６〜１６時間培養 する。プレートリーダーにプレートを直接置いて、Ｏ.Ｄ．５７０nM−Ｏ.Ｄ．６ ００nMを測定する。 結果ＫＧＦ−２によるケラチノサイト増殖の刺激 ＫＧＦ−２(すなわち上記実施例７および８に記述したようにアミノ酸Cys３７ から始まるもの)とＮ末端欠失突然変異体ＫＧＦ−２Δ３３およびＫＧＦ−２Δ ２８が表皮ケラチノサイト増殖を刺激する活性を持つことを立証するために、正 常初代ヒト表皮ケラチノサイトを大腸菌が発現した精製ＫＧＦ−２タンパク質（ バッチ番号Ｅ３）(配列番号２)、ＫＧＦ−２Δ３３(バッチ番号Ｅ１)およびＫＧ Ｆ−２Δ２８(バッチ番号Ｅ２)と共に培養した。ＫＧＦ−２タンパク質は、ＦＧ Ｆ７／ＫＧＦ−１と同等な約５ng／mlのＥＣ５０で表皮ケラチノサイトの増殖を 刺激した(第２１Ａ図)。これに対し、ＦＧＦ−１やＦＧＦ−２などの他のＦＧＦ 類は、初代ケラチノサイトの増殖を刺激しなかった。ＫＧＦ−２Δ３３に関する ＥＣ５０は０.２ng／mlで、ＫＧＦ−２Δ２８のＥＣ５０は２ng／mlだった(第２ １ＢおよびＣ図を参照)。このようにＫＧＦ−２は、初代表皮ケラチノサイト の増殖を刺激する点で、ＦＧＦ７／ＫＧＦと同じぐらい強力だと思われた。しか しＫＧＦ−２Δ３３は、ケラチノサイト増殖を刺激する点で、上記実施例７およ び８に記載の"ys(３７)"ＧＦ−２やＫＧＦ−２Δ２８よりもさらに強力である。 創傷組織の瘢痕化は、真皮線維芽細胞の過剰増殖を伴う。ＫＧＦ−２の刺激作 用が線維芽細胞ではなくケラチノサイトに特異的であるかどうかを決定するため に、マウスＢＡＬＢ.c.３Ｔ３線維芽細胞とヒト肺線維芽細胞を試験した。増殖 アッセイでは、どちらのタイプの線維芽細胞もＫＧＦ−２に反応しなかった。従 って、ＫＧＦ−２は、表皮ケラチノサイトに特異的で、線維芽細胞などの間葉細 胞には特異的でない分裂促進物質であると思われた。このことから、ＫＧＦ−２ が創傷組織の瘢痕化を引き起こす可能性は低いことが示唆された。 実施例１１ Ａ．特定のＦＧＦレセプターを遺伝子導入した細胞に対するＫＧＦ−２の分裂促 進作用 どのＦＧＦレセプターアイソフォームがＫＧＦ−２の増殖作用を媒介するのか を決定するため、特定のＦＧＦレセプターアイソフォームを発現する細胞に対す るＫＧＦ−２の作用を、Santos-OcAmpoら，Ｊ．Biol．Chem２７１：１７２６− １７３１（１９９６）に記載の方法に従って試験した。ＦＧＦ７／ＫＧＦはＦＧ ＦＲ２iiib型に結合し、これを特異的に活性化することによって表皮細胞の有糸 分裂誘発を誘導することが知られていた(Mikiら，Science ２５１：７２−７５ （１９９１）)。そこで有糸分裂誘発アッセイにおけるＫＧＦ−２の増殖作用を 、次に挙げるＦＧＦレセプターアイソフォームの一つを発現する細胞を使って調 べた：ＦＧＦＲ１iiib、ＦＧＦＲ２iiib、ＦＧＦＲ３iiib、およびＦＧＦＲ４。ＦＧＦレセプターを発現する細胞の有糸分裂誘発アッセイ 特定のＦＧＦレセプターを発現するBaF３細胞のチミジン取り込み実験をSanto s-OcAmpoら，J．Biol．Chem．２７１：１７２６−１７３１（１９９ ６）に記述されているように行なった。簡単に述べると、特定のＦＧＦレセプタ ーを発現するBaF３細胞を、ダルベッコ改良イーグル培地、１０％ウシ新生仔血 清、L−グルタミンで洗浄し、それに再懸濁した。２μｇ／mlヘパリンを含む培 地が入った９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに約２２,５００個の細胞を 播種した。各ウェルが総体積２００μｌになるよう、各ウェルに試験試薬類を加 えた。細胞を３７℃で２日間培養した。次いで、各ウェルに１μＣｉの³Ｈ-チミ ジンを５０μｌの体積で加えた。４−５時間後に細胞をガラス繊維紙を通す濾過 によって収集した。取り込まれた³Ｈ−チミジンをWallacのベータプレートシン チレーションカウンターでカウントした。 結果 その結果から、³Ｈ−チミジン取り込みが示すように、ＫＧＦ−２タンパク質( 第１図（配列番号２）のThr(３６)−Ser(２０８)にＮ末端Metが付加したもの)は 、ＫＧＦレセプターＦＧＦＲ２iiibアイソフォームを発現するBaF３細胞の増殖 を強く刺激することが明らかになった(第２２Ａ図)。興味深いことに、ＦＧＦＲ １iiibアイソフォームを発現するBaF３細胞の増殖に対してＫＧＦ−２のわずか な刺激作用が観察された。ＫＧＦ−２は、ＦＧＦＲ３iiib型またはＦＧＦＲ４型 のレセプターを発現する細胞に対して何の作用も示さなかった。 ＦＧＦ７／ＫＧＦは、ＫＧＦレセプタ−ＦＧＦＲ２iiibアイソフォームを発現 する細胞の増殖を刺激したが、ＦＧＦＲ１iiibアイソフォームを発現する細胞の 増殖は刺激しなかった。ＫＧＦ−２とＦＧＦ７／ＫＧＦの相違は興味深いものだ った。対照実験では、aＦＧＦは、そのレセプターＦＧＦＲ１iiibおよびiiicを 刺激し、bＦＧＦは、そのレセプターＦＧＦＲ２iiicを刺激した。このようにこ れらの結果から、ＫＧＦ−２は、ＦＧＦＲ２iiibアイソフォームに結合して有糸 分裂誘発を刺激することが示唆された。ＦＧＦ７／ＫＧＦとは対照的に、ＫＧＦ −２は、ＦＧＦＲ１iiibアイソフォームをも結合し有糸分裂誘発を刺激する。 Ｂ．特定のＦＧＦレセプターを遺伝子導入した細胞に対するＫＧＦ−２Δ３３の 分裂促進作用 上に示したように、ＦＧＦ類またはＫＧＦ−１とＫＧＦ−２は共に、ＦＧＦ２ iiibレセプター(ＦＧＦＲ２iiib)に結合し、これを活性化する。有糸分裂誘発ア ッセイにおけるＫＧＦ−２Δ３３の増殖作用を、次に挙げるＦＧＦレセプターア イソフォームの一つを発現する細胞を使って調べた：ＦＧＦＲ２iiibまたはＦＧ ＦＲ２iiic(2iiicレセプターを遺伝子導入した細胞は、陰性対照として含める) 。 これらの実験は、この実施例の上記A項と同様に行なった。簡単に述べると、 １０％親ウシ仔ウシ血清(ＢＣＳ−胎仔血清でないもの)、ＷＥＨＩ３細胞(５％ ＢＣＳを含むＲＰＭＩ中で生育)の培養から得た１０％調整培地、５０nM β-メ ルカプトエタノール、Ｌ−Glu(１００×液で２％)およびpen／strep(１００×液 で１％)を含むＲＰＭＩ中でBaF３細胞を生育した。 アッセイのため、１０％ＢＣＳと１μｇ／mlヘパリンを含むＲＰＭＩ培地中で BaF３細胞を２回洗浄した。１０％ＢＣＳと１μｇ／mlヘパリンを含むＲＰＭＩ 培地１５０μｌが入った９６ウェルプレートにBaF３細胞(２２,０００個／ウェ ル)を播種した。酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＫＧＦ-1(ＨＧ１５４００)または ＫＧＦ−２タンパク質(ＨＧ０３４００、０３４０１、０３４１０、または０３ ４１１)を約０nMから１０nMまでの濃度で添加した。それらの細胞を２００μｌ の最終体積中３７℃で４８時間培養した。すべてのアッセイを３つずつ行なった 。トリチウム化チミジン(０.５μＣｉ)を３７℃で４時間各ウェルに加え、次い で、ガラス繊維フィルターを通す濾過によって細胞を収集した。次いで、取り込 まれた放射活性の総量を液体シンチレーションカウントによって決定した。次に 挙げる陽性対照を使用した：ＦＧＦＲ２iiic細胞には、塩基性ＦＧＦと酸性ＦＧ Ｆ；ＦＧＦＲ２iiib細胞には、酸性ＦＧＦとＫＧＦ-1。次に挙げる陰性対照を使 用した：基礎培地(１０％ＢＣＳと１μｇ／mlヘパリンを含むＲＰＭＩ培地)。 結果 その結果から、³Ｈ−チミジン取り込みによって示されるように、ＫＧＦ−２( Ｎ末端にMetが付加されているThr(３６)−Ser(２０８))、ＫＧＦ−２Δ３３ およびＫＧＦ−２Δ２８タンパク質は、ＫＧＦレセプターＦＧＦＲ２iiibアイソ フォームを発現するBaF３細胞の増殖を強く刺激することが明らかになった(第２ ２Ａ−Ｃ図)。ＫＧＦ−２タンパク質は、ＦＧＦＲ２iiic型のレセプターを発現 する細胞には何の作用も示さなかった。これらの結果から、ＫＧＦ−２タンパク 質がＦＧＦＲ２iiibアイソフォームに結合して有糸分裂誘発を刺激することが示 唆された。またＫＧＦ−２Δ３３は、ＫＧＦ−２(Thr(３６)−Ser(２０８))以上 にBaF３細胞の増殖を刺激することができたようである。 実施例１２ Ａ．大腸菌に最適化した全長のＫＧＦ−２の構築 大腸菌発現系での全長のＫＧＦ−２の発現レベルを高めるために、遺伝子のア ミノ末端部分のコドンを使用頻度の高い大腸菌コドンに最適化した。最適化され たＫＧＦ−２の領域を合成するため、６種類の一連のオリゴヌクレオチド（番号 １−６；配列は後述）を合成した。これらの一部重複オリゴを使って次の条件で ７ラウンドのＰＣＲ反応を行なった： 変性 ９５度 ２０秒 アニーリング ５８度 ２０秒 伸長反応 ７２度 ６０秒 第二ＰＣＲ反応には第−ＰＣＲ反応液１μｌを使用し、３'プライマーをＫＧ Ｆ−２合成プライマー６に、５'プライマーをＫＧＦ−２合成５'BamHＩにして、 上記と同じ条件で２５サイクルに設定した。この最終反応によって生成した産物 をAvaIIとBamHＩで制限消化した。実施例１のＫＧＦ−２構築物をAvaIIとHindII Iで制限消化し、その断片を単離した。これら２つの断片をBamHＩとHindIIIで制 限消化したpQE−９に三断片連結法によりクローニングした。 最適化された合成ＫＧＦ−２ １／２０８の構築に使用したプライマーは次の 通りである： ＫＧＦ−２合成プライマー１： ＫＧＦ−２合成プライマー２： ＫＧＦ−２合成プライマー３： ＫＧＦ−２合成プライマー４： ＫＧＦ−２合成プライマー５：ＫＧＦ−２合成プライマー６： ＫＧＦ−２合成５'BamHI 得られたクローンを第２３図に示す（配列番号３８および３９）。 Ｂ．大腸菌に最適化した成熟ＫＧＦ−２の構築 大腸菌発現系での成熟型ＫＧＦ−２の発現レベルをさらに高めるために、遺伝 子のアミノ末端部分のコドンを使用頻度が高い大腸菌コドンに最適化した。成熟 型ＫＧＦ-1と一致するように、スレオニン３６から始まる先端切断型のＫＧＦ− ２を構築した。実施例１２Ａで得た大腸菌合成ＫＧＦ−２をテンプレートとし、 ５'プライマーにはBspHＩ５’ＫＧＦ−２（配列は後述）を、３'プライマーには HindIII３’ＫＧＦ−２（配列は後述）を使用してＰＣＲ反応を行なった。増幅 は、上記実施例１２Ａに記述したような標準的条件を使って２５サイクル行なっ た。得られた生成物をBspHＩとHindIIで制限消化し、NcoＩとHindIIIで消化した 大腸菌発現ベクターpQE６０にクローニングした。 BspHＩ ５’ＫＧＦ−２プライマー： HindIII ３’ＫＧＦ−２プライマー： 得られたクローンを第２４図（配列番号４２および４３）に示す。 Ｃ．もう一つの大腸菌最適化成熟ＫＧＦ−２の構築 大腸菌発現系での成熟型ＫＧＦ−２の発現レベルをさらに高めるために、上記 大腸菌最適化遺伝子のアミノ末端部分にある53アミノ酸のコドンを使用頻度が高 い別の大腸菌コドンに変えた。最適化されたＫＧＦ−２の領域を合成するため、 ６種類の一連のオリゴヌクレオチド（番号１８０６２、１８０６１、１８０５８ 、１８０６４、１８０５９、および１８０６３；配列は後述）を合成した。これ らの一部重複オリゴを使って次の条件で７ラウンドのＰＣＲ反応を行なった： 変性 ９５度 ２０秒 アニーリング ５８度 ２０秒 伸長反応 ７２度 ６０秒 ７ラウンドの合成に続いて、その領域に対する５'プライマー１８１６９とそ の全領域に対する３'プライマー１８０６０を、上記６種類のオリゴヌクレオチ ドによる初反応から得た１マイクロリットルを含むＰＣＲ反応に加えた。この産 物は次の条件を使って３０ラウンド増幅した： 変性 ９５度 ２０秒 アニーリング ５５度 ２０秒 伸長反応 ７２度 ６０秒 第二ＰＣＲ反応は、遺伝子の３'領域を、プライマー１８０６６と１８０６５ を使って上と同じ条件下に２５ラウンド増幅するように設定した。得られた生成 物をアガロースゲルで分離した。生成物を含むゲル切片を１０mMトリス、1mMＥ ＤＴＡ(pH７.５)に希釈した。希釈した各ゲル切片から得たそれぞれ１マイクロ リットルを使用し、５'プライマーにはプライマー１８１６９を、３'プライマー にはプライマー１８０６５を使ってさらなるＰＣＲ反応を行なった。この産 物は、上と同じ条件を使って２５サイクル増幅した。この最終反応によって生成 した産物をEcoRＩとHindIIIで制限消化し、やはりEcoRＩとHindIIIで切断したp ＱＥ６０にクローニングした(pＱＥ６)。 ５'合成プライマーの配列：１８１６９ ＫＧＦ２５’EcoRＩ／ＲＢＳ ： １８０６２ ＫＧＦ２合成新Ｒ１センス： １８０６１ ＫＧＦ２合成Ｒ２センス： １８０５８ ＫＧＦ２合成Ｒ３センス： １８０６６ ＫＧＦ２ ２０bp AvaIIセンス： １８０６４ ＫＧＦ２合成Ｆ１アンチセンス： １８０５９ ＫＧＦ２合成Ｆ２アンチセンス： １８０６３ ＫＧＦ２合成Ｆ３アンチセンス： １８０６０ ＫＧＦ２ AvaIIアンチセンス： １８０６５ ＫＧＦ ２HindIII ３’ストップ： 合成ＫＧＦ−２遺伝子の配列とそれに対応するアミノ酸を第２４Ｂ図（配列番 号５４および５５）に示す。 実施例１３ ＫＧＦ−２欠失突然変異体の構築 実施例１２Ａで得た最適化したＫＧＦ−２構築物をテンプレートとして、ＫＧ Ｆ−２遺伝子の５'末端と３'末端から欠失突然変異体を構築した。欠失部位は、 大腸菌での発現に悪影響をあたえないと思われる遺伝子の領域に基いて選択した 。５'欠失体については、後述のプライマーを５'プライマーとして使用した。こ れらのプライマーは、表記の制限部位と開始メチオニンをコードするＡＴＧとを 含有する。３'プライマーには、ＫＧＦ−２(ＦＧＦ−１２)２０８アミノ酸３’ ＨindIIIプライマーを使用した。実施例１２に示したような標準的条件を用いて 、２５ラウンドのＰＣＲ増幅を行なった。ＫＧＦ−２ ３６aa／２０８aa欠失突 然変異体用の産物は、５'部位についてはBspHＩで、３'部位についてはHindIII で制限消化し、BspHＩとHindIIIで消化しておいたpＱＥ６０にクローニングした 。その他の産物はすべて、５'制限酵素としてのNcoＩと、３'部位についてはHin dIIIで制限消化し、NcoＩとHindIIIで消化しておいたpＱＥ６０にクローニング した。ＫＧＦ−２(ＦＧＦ−１２)については、５'プライマーとしてのＦＧＦ− １２ ３６aa／２０８aaと共に、３６aa／１５３aaおよび１２８aa ３’HindIII を３'プライマーとして使用した。ＦＧＦ−１２ ６２aa／１５３aaについては 、５'プライマーとしてのＦＧＦ−１２６２aa／２０８aaと共に、１２８aa３’H indIIIを３'プライマーとして使用した。得られたクローンの名称は、その欠失 によって得られたポリペプチドの最初と最後のアミノ酸を示している。例えばＫ ＧＦ−２３６aa／１５３aaは、その欠失突然変異体の最初のアミノ酸がＫＧＦ− ２のアミノ酸３６であり、最後のアミノ酸がアミノ酸１５３であることを示して いる。また第２５−３３図に示すように、各突然変異体は、そのＮ末 端にMetが付加されている。 欠失プライマーの配列：ＦＧＦ１２ ３６aa／２０８aa ： ＦＧＦ１２ ６２aa／２０８aa： ＦＧＦ１２ ７７aa／２０８aa： ＦＧＦ１２ ９３aa／２０８aa： ＦＧＦ１２ １０４aa／２０８aa： ＦＧＦ１２ １２３aa／２０８aa： ＦＧＦ１２ １３８aa／２０８aa： ＦＧＦ１２ ３’HindIII：（上記欠失クローンのすべてに使用） ＦＧＦ１２ ３６aa／１５３aa： ５'BspHＩ（上記の通り） ＦＧＦ１２ ６３aa／１５３aa： ５’NcoＩおよび３’HindIII、上記の通り。 得られた欠失突然変異体の配列を第２５−３３図［配列番号６５−８２］に記 載する。 実施例１４ ＫＧＦ−２のシステイン突然変異体の構築 Ｃ−３７突然変異プライマー５４５７ ５’BspHIと５２５８ １７３aa ３’ HindIIIの構築により、実施例１２Ａで得たＫＧＦ−２(ＦＧＦ−１２)テンプレ ートを増幅した。プライマー５４５７ ５’BspHＩは、システイン３７をセリン に変える。増幅は、上記実施例１２Ａに概説した標準的条件を使って２５サイク ル行なった。得られた産物をBspHＩとHindIIIで制限消化し、BspHＩとHindIIIで 消化した大腸菌発現ベクターpＱＥ６０にクローニングした(第３４図)［配列番 号８３］。 システイン１０６をセリンに突然変異させるため、このシステインのオリゴヌ クレオチド部位特異的突然変異誘発用に２つのＰＣＲ反応を設定した。一つの反 応では、５４５３ BspHＩを５'プライマーとして使用し、５４５５をその反応の ３'プライマーとして使用した。第二の反応では、５４５６を５'プライマーとし て使用し、５２５８ HindIIIを３'プライマーとして使用した。これらの反応は 、実施例１２に記述したような標準的条件下に２５ラウンド増幅した。これらＰ ＣＲ反応のそれぞれから得た1μｌをテンプレートとし、５'プライマーとして５ ４５３ BspHＩを、３'プライマーとして５２５８ HindIIIを使用して次の反応 を行なった。実施例１２に記述したような標準的条件を使って２５ラウンドの増 幅を行なった。得られた産物をBspHＩとHindIIIで制限消化し、NcoＩとHindIII で制限消化した大腸菌発現ベクターpＱＥ６０にクローニングした。 Ｃ−３７／Ｃ−１０６突然変異体を作成するには、２つのＰＣＲ反応が必要だ った。システイン３７からセリンへの置換を含むこの突然変異体の５'領域を作 成するには、プライマー５４５７ BspH1と５４５５を使用し、システイン１０６ からセリンへの置換を含むこの突然変異体の３'領域を作成するには、プライマ ー５４５６と５２５８ HindIIIを使用した。第二の反応では、５４５７ BspHＩ プライマーを５'プライマーとして使用し、５２５８ HindIIIプライマーを３'プ ライマーとして使用することにより、各初反応から得た1μｌを合わせてテンプ レートとして、Ｃ−３７／Ｃ−１０６突然変異体を作成した。このＰＣＲ産物を BspHＩとHindIIIで制限消化し、NcoＩとHindIIIで制限消化しておいたpＱＥ６０ にクローニングした。得られたクローンを第３５図（配列番号８４）に示す。 システイン突然変異体プライマーの配列： 実施例１５ ＫＧＦ(ＦＧＦ−１２)の生産と精製 実施例１２Ｂに記載の最適化された成熟タンパク質(すなわちＫＧＦ−２のア ミノ酸Ｔ３６からＳ２０８まで)をコードするＤＮＡ配列をプラスミドpＱＥ−９ (Qiagen)にクローニングした。１００μｇ／mlアンピシリンと２５μｇ／mlカナ マイシンを含むＬＢ中３７℃で大腸菌(Ｍ１５／rep４；Qiagen)を定常期まで終 夜生育した。この培地を、１００μｇ／mlアンピシリンと２５μｇ／mlカナマイ シンを含む新しいＬＢ培地の接種に、１：５０の希釈率で使用した。その細胞を Ｏ.Ｄ.₅₉₅が０.７になるまで３７℃で生育し、最終濃度１mMのイソプロピル−１ −チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)の添加によって誘導した。３− ４時間後、細胞を遠心分離によって収集し、６０mM NaPO₄と３６０mM NaClを含 む緩衝液に緩衝液５体積部：細胞ペースト１体積部の割合で再懸濁した。Mautin −Gaulinホモジナイザーで破砕した後、NaOHの添加によってその抽出物をpH８. ０に調節し、遠心分離によって清浄化した。 清浄化した可溶性抽出物をPoros ＨＳ−５０カラム(２.０×１０.０cm；ＰerS eptive Biosystems，Inc．)にのせ、結合したタンパク質を０.５Ｍ、１.０Ｍ、 および１.５ＭのNaClを含む５０mM NaPO₄(pH８.０)で段階的に溶出した。ＫＧＦ −２は、１.５Ｍ塩画分に溶出した。次いで、これを５０mMNaPO₄(pH６.５)で５ 倍に希釈して、最終塩濃度を３００mMにした。次いで、このＫＧＦ−２含有画分 をPoros ＨＱ−２０カラム(２.０×７.０cm；Ｐ erSeptive Biosystems，Inc．)に通し、続いてPoros ＣＭ−２０カラム(２.０× ９.０cm；PerSeptive Biosystems，Inc．)に通して、そこに結合させた。約５０ ０mM−約７５０mM NaClで溶出したＫＧＦ−２(ＦＧＦ−１２)含有画分を集め、 再びＣＭ−２０カラムにかけることによって濃縮した。最後にそのタンパク質を ４０mM NaOAc(pH６.５)／１５０mM NaClのゲルろ過カラム(Ｓ−７５；Pharmacia )で分離した(バッチＥ−５)。これとは別に、ゲルろ過カラムをリン酸緩衝食塩 水(ＰＢＳ)でも行なった(バッチＥ−４)。ＫＧＦ−２含有画分を集め、タンパク 質濃度をBio-Radプロテインアッセイで測定した。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥで純度＞９０％と判断された。最後にエンドトキシンレベルをリムルスアメ ボサイトライゼートアッセイ(カブトガニ遊走細胞分解産物試験；Cape Cod Asso ciates)によって測定したところ、内毒素レベルは≦１Eu／mgであることがわか った。この方法で調製したタンパク質は、ＦＧＦファミリー構成要素の特徴であ るヘパリン結合能を有した。 実施例１６ Ａ．Ｎ末端欠失突然変異体ＫＧＦ−２Δ３３の構築 大腸菌でのＫＧＦ２の発現レベルを高めるため、また大腸菌が発現したＫＧＦ ２の溶解性と安定性を強化するために、プレプロセシングされた(pre−processe d)ＫＧＦ２の最初の６８アミノ酸を欠く欠失変異種ＫＧＦ−２Δ３３(ＫＧＦ− ２ aa６９−２０８)を作成した。この欠失変異種を作成する理論的根拠は、次の 観察結果に基いている。第一に、成熟ＫＧＦ２(ＫＧＦ−２ aa３６−２０８)は 、奇数個(３個)のシステイン残基を含有し、これらは分子内ジスルフィド橋形成 による凝集につながりうる。ＫＧＦΔ３３欠失変異種は２つのシステイン残基し か含まず、これにより分子内ジスルフィド橋形成とそれに続く凝集の可能性が減 少する。凝集の減少は、活性なＫＧＦ２タンパク質の収率の増大につながるはず である。第二に、ＫＧＦΔ３３欠失変異種は、ＫＧＦ−１には存在せず活性にと っては重要でないと思われるが大腸菌における当該タンパク質の発現を妨げるで あろうボリセリン区間を欠く。従って、ポリセリン区間の除去は、活性なＫＧＦ −２タンパク質の発現レベルを高めるだろう。第三に、大腸菌でＫＧ ＦΔ３３を発現させると、ＫＧＦ−２の残基６８と残基６９の間は初めから切断 されていることになる。従って、ＫＧＦ２Δ３３は、大腸菌中で効率よくプロセ シングされ、大腸菌中で安定だろうと予想される。 pＱＥ６中のＫＧＦ２Δ３３の構築 ポリメラーゼ連鎖反応による増幅とＫＧＦ−２Δ３３の大腸菌タンパク質発現 ベクターpＱＥ６へのサブクローニングを可能にするため、ＫＧＦ２の所望の領 域に相補的な次の配列を持つ２種類のオリゴヌクレオチドプライマー(５９５２ と１９１３８)を合成した。 Ｎ末端プライマー(５９５２)にはAflIII制限部位を組み込み、Ｃ末端プライマ ー(１９１３８)にはHindIII制限部位を組込んだ。プライマー５９５２は、クロ ーニングした断片の大腸菌での翻訳が可能なようにＫＧＦ２コード領域に隣接し かつ同じ読み枠でＡＴＧ配列をも含有する。一方、プライマー１９１３８は、Ｋ ＧＦ２コード領域に隣接しかつ読み枠が一致した２つの停止コドン(大腸菌で優 先的に使用されるもの)を含み、これによって大腸菌での正しい翻訳の終結が保 証される。 ポリメラーゼ連鎖反応は、成熟ＫＧＦ−２(aa３６−２０８)のヌクレオチド配 列(実施例１２Ｃで構築したもの)をテンプレートとし、当業者によく知られてい る標準的な条件を用いて行った。得られたアンプリコンをAflIIIとHindIIIで制 限消化し、NcoＩ／HindIIIで消化したpＱＥ６タンパク質発現ベクターにサブク ローニングした。 pＨＥ１中のＫＧＦ２Δ３３の構築 ポリメラーゼ連鎖反応による増幅とＫＧＦ２Δ３３の大腸菌発現ベクターpＨ Ｅ１へのサブクローニングを可能にするため、ＫＧＦ２の所望の領域に対応する 次の塩基配列を持つ２種類のオリゴヌクレオチドプライマー(６１５３と６１５ ０)を合成した。 Ｎ末端プライマー(６１５３)にはNdeＩ制限部位を組み込み、Ｃ末端プライマ ー(６１５０)にはAsp７１８制限部位を組込んだ。プライマー６１５３は、クロ ーニングした断片の大腸菌での翻訳が可能なように、ＫＧＦ２コード領域に隣接 しかつ同じ読み枠でＡＴＧ配列をも含有する。一方、プライマー６１５０は、Ｋ ＧＦ２コード領域に隣接しかつ同じ読み枠で2つの停止コドン(大腸菌で優先的に 使用されるもの)を含み、これにより大腸菌での正しい翻訳の終結が保証される 。 ポリメラーゼ連鎖反応は、成熟ＫＧＦ−２(aa３６−２０８)のヌクレオチド配 列(実施例１２Ｃで構築したもの)をテンプレートとし、当業者によく知られてい る標準的条件を用いて行なった。得られたアンプリコンをNdeＩとAsp７１８で制 限消化し、NdeＩ／Asp７１８で消化したpＨＥ１タンパク質発現ベクターにサブ クローニングした。 ＫＧＦ２Δ３３のヌクレオチド配列 ＫＧＦΔ３３のアミノ酸配列： Ｂ．最適化されたＫＧＦ−２Δ３３の構築 大腸菌でのＫＧＦ２Δ３３の発現レベルを高めるために、全遺伝子のコドンを 大腸菌で最も使用頻度が高いものと合致するように最適化した。ＫＧＦ２Δ３３ の作成に使用したテンプレートは、Ｎ末端領域のコドンが最適化されているので 、Ｃ末端アミノ酸(８４−２０８)を最適化する必要があった。 まずアミノ酸１７２−２０８のコドンを最適化してＫＧＦ２Δ３３(s１７２− ２０８)を作成した。これは、オーバーラッピングPＣR法によって達成した。オ リゴヌクレオチドＰＭ０７とＰＭ０８(アミノ酸１７２−２０８に対応)を混合し 、それらを７０℃に加熱することによって両者をアニーリングし、それらを３７ ℃に冷ました。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチドをテンプレートとして 、プライマーＰＭ０９とＰＭ１０による標準的ＰＣＲ反応を行なった。ＫＧＦ２ Δ３３をテンプレートとし当業者によく知られている標準的条件に従って行なっ た別個のＰＣＲ反応では、オリゴヌクレオチドＰＭ０５(これは、ＫＧＦ２のコ ード領域内にあるPstＩ部位と一部重複する)とＰＭ１１を使って、アミノ酸８４ −１７２に対応するＫＧＦ２の領域を増幅した。第三のＰＣＲ反応では、第一Ｐ ＣＲ反応の産物(コドンが最適化されたアミノ酸１７２−２０８に相当する)と第 二ＰＣＲ反応の産物(コドンが最適化されていないアミノ酸８４−１７２に相当 する)を混合し、それらをテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＰＭ０５と ＰＭ１０による標準的ＰＣＲ反応を行なった。得られたアンプリコンをPstＩ／H indIIIで消化し、PstＩ／HindIIIで消化したpＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３にサブクロ ーニングすることにより、対応する非コドン最適化領域を効果的に置換し、pＱ Ｅ６ＫＧＦ２Δ３３(s１７2−２０８)を得た。 ＫＧＦ２のコドン最適化を完了するため、アミノ酸８４−１７２に対応するＫ ＧＦ２の領域についてコドンが最適化された合成遺伝子を、重複オリゴヌクレオ チド群を使用して作成した。まず、4種類のオリゴヌクレオチド(ＰＭ３１、ＰＭ ３２、ＰＭ３３、およびＰＭ３４)を組み合せて、次の７サイクルのＰＣＲを行 なった：９４℃、３０秒；４６.５℃、３０秒；７２℃、３０秒。 次いで、プライマーＰＭ３５とＰＭ３６による第二ＰＣＲ反応を、１μｌの第 一ＰＣＲ反応液をテンプレートとして使用して標準的手法に従って行なった。次 いで、得られたコドン最適化遺伝子断片をPstＩ／SalIで消化し、PstＩ／SalIで 消化したpＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３(s１７２−２０８)にサブクローニングすること により、完全に最適化されたＫＧＦ２コード領域pＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３sを作成 した。 これに代わる大腸菌タンパク質発現ベクターを作成するため、pＱＥ６ＫＧＦ ２Δ３３sに対してプライマーＰＭ１０２とＰＭ１３０を使用することにより、 ＫＧＦ２Δ３３sをＰＣＲ増幅した。得られたアンプリコンをNdeＩとEcoRVで消 化し、NdeＩとAsp７１８で消化しておいたpＨＥ１発現ベクター(平滑末端化した もの)にサブクローニングすることにより、pＨＥ１Δ３３sを作成した。 コドン最適化ＫＧＦ２Δ３３sの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列は次 の通りである。 ＫＧＦ２Δ３３(s１７２−２０８)のヌクレオチド配列： ＫＧＦ２Δ３３(s１７２−２０８)のアミノ酸配列Ｃ．Ｎ末端欠失突然変異体ＫＧＦ−２Δ４の構築 大腸菌でのＫＧＦ２の発現レベルを高めるため、また大腸菌が発現したＫＧＦ ２の安定性と溶解性を強化するために、プレプロセシングされたＫＧＦ２の最初 の３８アミノ酸(３７番目のシステインを含む)を欠く欠失変異種ＫＧＦ２Δ４( アミノ酸３９−２０８)を構築した。得られたＫＧＦ２欠失分子は偶数個のシス テインを含むので、分子内ジスルフィド橋形成が引き起こす凝集による問題は減 少し、活性なタンパク質の発現レベルが高まることになるはずである。 ポリメラーゼ反応による増幅とＫＧＦ２Δ４の大腸菌タンパク質発現ベクター pＱＥ６へのサブクローニングを可能にするため、次の塩基配列を持つ２種類の オリゴヌクレオチドプライマー(ＰＭ６１と１９１３８)を合成した。 Ｎ末端プライマー(ＰＭ６１)にはNcoＩ制限部位を組み込み、Ｃ末端プライマ ー(１９１３８)にはHindIII制限部位を組込んだ。ＰＭ６１は、クローニングし た断片が大腸菌で翻訳されうるように、ＫＧＦ２コード領域に隣接しかつ読み枠 が一致したＡＴＧ配列をも含有する。一方、１９１３８は、ＫＧＦ２コード領域 に隣接しかつ読み枠が一致した停止コドン(大腸菌で優先的に使用されるもの)を 含み、これは大腸菌での正しい翻訳の終結を保証する。 ポリメラーゼ連鎖反応は、全長のＫＧＦ２(aa３６−２０８)(実施例１２Ｃで 構築したもの)をテンプレートとし、当業者によく知られている標準的条件を用 いて行なっつた。得られたアンプリコンをNcoＩとHindIIIで消化し、NcoＩ／Hin dIIIで消化したpＱＥ６タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。 ＫＧＦ２Δ４のヌクレオチド配列：ＫＧＦ２Δ４のアミノ酸配列： 実施例１７ 正常ラットにおける創傷治癒のＫＧＦ−２Δ３３による刺激 ＫＧＦ−２Δ３３が治癒過程を加速することを立証するため、次のモデルを用 いて切除創傷の創傷治癒を調べた。 キーズ皮膚穿孔具を使ってスプレーグ・ドーリーラット(ｎ＝５)の背中に６mM の切除創傷を作る。その創傷を開放状態にしておき、様々な濃度のＫＧＦ−２Δ ３３(４０mM NaOAcと１５０mM NaClのpH６.５緩衝液中)と緩衝液(４ ０mM NaOAcおよび１５０mM NaCl，pH６.５)で、創傷形成の日から始めて４日間 処置する。較正済ジェームソンキャリパーを用いて創傷を毎日計測する。創傷の サイズは、平方ミリメートルで表わす。最終日に創傷を計測し、さらに分析する ため、それを採取した。統計分析は、独立t検定を使って行なった(平均±ＳＥＭ )。評価パラメーターには、創傷閉鎖率、組織学的スコア(１−３わずかな細胞集 積、肉芽形成なし；４−６未熟な肉芽形成、炎症性細胞、毛細管；７−９肉芽組 織、細胞、線維芽細胞、新しい上皮；１０−１２線維芽細胞、コラーゲン、上皮 を伴う成熟した皮膚)、再上皮化および免疫組織化学を含める。 創傷形成の３日後に、ＫＧＦ−２Δ３３による処置は、緩衝液対照の３８.９m M²と比較して、創傷サイズの減少(４μｇで３０.４mM²、p＝０.００６；１μｇ で３３.６mM²、p＝０.０００７)を示した。創傷形成後４日に、ＫＧＦ−２Δ３ ３による処置は、緩衝液対照の３３.８mM²と比較して、創傷サイズの減少(０.１ μｇで２７.２mM²、p＝０.０２；０.４μgで２７.９mM²、p＝０.０４)を示した 。創傷形成後５日に、ＫＧＦ−２Δ３３による処置は、緩衝液対照の２５.１mＭ² と比較して、創傷サイズの減少(４μｇで１８.１M²、p＝０.０２)を示した。第 ３６図を参照。 第５日に創傷を採取した後、さらなるパラメーターを評価した。ＫＧＦ−２Δ ３３は、緩衝液対照６０.２％と比較して、４μgで創傷閉鎖率の増加(７１.２％ 、p＝０.０２)を示した。ＫＧＦ−２Δ３３の投与は、緩衝液対照の６.４と比較 して、１μｇと４μｇで組織学的スコアの改善(１μｇで８.４、p＝０.００５； ４μｇで８.５、p＝０.０４)をももたらす。再上皮化も、緩衝液対照の９２３μ ｍと比較して、１μｇと４μｇのＫＧＦ−２Δ３３で改善された(１μｇで１３ ８９μｍ、p=０.００７；４μｇで１２２０μm、p＝０.０２)。第３７図を参照 。 この試験は、ＫＧＦ−２Δ３３で毎日処置することにより、全創傷面積の減少 が示すように、正常動物における創傷治癒速度が加速されることを立証している 。また、創傷標本の組織学的評価と再上皮化の評価も、ＫＧＦ−２Δ３３がこの 正常ラットモデルにおける治癒速度を改善することを示している。 実施例１８ 正常ラットにおける引張り強さと表皮厚に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 ＫＧＦ−２Δ３３が創傷の引張り強さと表皮厚を増大させることを立証するた め、次の実験を行なった。 ２.４cmの全層正中線切開創傷を雄のスプレーグ・ドーリーラット(ｎ＝８また は９)の背中に作る。皮膚切開は、等間隔の３つの皮膚ステープルで閉じる。緩 衝液(４０mM NaOAcおよび１５０mM NaCl，pH６.５)またはＫＧＦ−２Δ３３(４ ０mM NaOAcおよび１５０mM NaClのpH６.５緩衝液中)を創傷形成時に局所的に適 用した。幅０.５cmの４本の創傷片を第５日に摘出する。それらの標本を、Instr on^TM皮膚張力計による破壊強さの試験、ヒドロキシプロリン測定および病理組織 学的評価に使用する。破壊強さは、破断前に各創傷が堪えた最大の力と定義した 。統計分析は、独立t検定を用いて行なった(平均±ＳＥ)。 切開皮膚ラットモデルにおいて、局所適用されたＫＧＦ−２Δ３３は、創傷形 成後の単回の切開内適用の結果として、統計的に有意な破壊強さ、引張り強さお よび上皮厚の増大を示した。ある試験では、１、４、および１０μｇのＫＧＦ− ２で処置した創傷の破壊強さが緩衝液対照と比較して有意に高かった(１μｇで １０７.３ｇ、p＝０.０００６；４μｇで１２６.４ｇ、p＜０.０００１；１０μ gで１２３.８ｇ、p＜０.０００１)。第３８図を参照。 表皮厚は、マッソン三重染色切片で光学顕微鏡下に評価した。ＫＧＦ−２Δ３ ３で処置した創傷は、緩衝液対照が５４.８ミクロンであったのに対して、増加 した表皮肥厚(１μｇで６６.５１ミクロン；４μｇで６６.５１ミクロン、p＝０ .０１；１０μｇで５９.６ミクロン)を示した。第３９図を参照。 これらの試験は、ＫＧＦ−２の単回切開内適用が、切開創傷の破壊強さと表皮 厚の増大を特徴とする創傷治癒過程を強化および加速することを立証している。 実施例１９ 正常ラット皮膚に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 ＫＧＦ−２Δ３３がその皮内注射後に正常なラット皮膚に与える作用を決定す るため、次の実験を行なった。 第０日に、雄の成体ＳＤラット(ｎ＝３)にプラシーボか、５０μｌ中１μｇお よび４μｇ濃度のＫＧＦ−２Δ３３(４０mM NaOAcと１５０nM NaClのpH６.５緩 衝液中)を６回皮内注射した。２４時間および４８時間の時点で犠牲にする２時 間前に、５−２’−ブロモ-デオキシウリジン(BrdU)(腹腔内１００mg／kg)を動 物に注射した。表皮厚を顆粒層から基底層の底面まで測定した。注射部位に沿っ て約２０回の測定を行い、平均厚を見積もった。測定は、マッソン三重染色切片 で光学顕微鏡下に較正済マイクロメーターを使って行なった。BrdU採点は、盲検 観察者２人が光学顕微鏡下に次の採点法を用いて行なった：０−３ BrdU標識細 胞なし〜ごくわずか；４−６中等度の標識；７−１０強い標識細胞。注射の２４ 時間後と４８時間後に動物を犠牲にした。統計分析は、独立t検定を使って行な った。(平均±ＳＥ)。 ＫＧＦ−２Δ３３で処置した皮膚は、緩衝液対照が２７.１ミクロンだったの に対して、２４時間で増大した表皮肥厚を示した(１μｇで３２.２ミクロン、p ＜０.００１；４μｇで３５.４ミクロン、p＜０.０００１)。４８時間では、緩 衝液対照の２７.８ミクロンと比較して、ＫＧＦ−２Δ３３で処置した皮膚は、 増大した表皮肥厚(１μｇで３４.０ミクロン、p＝０.０００３；４μｇで４２. ４ミクロン、p＜０.０００１)を示した。第４０図を参照。またＫＧＦ−２Δ３ ３で処置した皮膚は、４８時間で、緩衝液対照の３.３３と比較して増大したBrd U免疫染色を示した(１μｇで４.７３、p＝０.０７；４μｇで６.８５、p＜０.０ ００１)。第４１図を参照。 これらの試験は、ＫＧＦ−２の皮内注射が、表皮肥厚を強化し加速することを 立証している。従って、ＫＧＦ−２は、しわの予防または緩和、老化した肌の改 善、瘢痕化の軽減、または美容外科からの治癒の改善に応用されるだろう。また ＫＧＦ−２は、化学療法やその他の薬剤に反応しておこる腸炎、口腔粘膜炎（口 内炎)を防止もしくは軽減するために予防的に使用することもできる。 実施例２０ ＰＡＦ誘導性足浮腫に対するＫＧＦ−２の抗炎症作用 ＫＧＦ−２の抗炎症作用を立証するため、ＰＡＦ誘導性足浮腫炎症モデルを用 いて次の実験を行なった。 ルイスラット(１９０〜２１０ｇ)４匹の群に、２.５nMolのＰＡＦと１２５μ ｇのCkb-１０(Ｂ５)、２４μｇのＬＰＳもしくは７３μｇのＫＧＦ−２(Ｎ末端M etを持つ第１図（配列番号２）のThr(３６)−Ser(２０８))とを含む(またはタン パク質なしの)溶液１２０μｌを右後足の足蹠に皮下注射した。左後足には同量 の緩衝液を投与し、並行対照として使用した。足体積をＰＡＦ注射の直前、３０ 分後および９０分後にプレチスモグラフシステムを使って定量した。足体積変化 率(％)を計算した。 実験番号１および２における試験試薬 第４２図に示すように、ＰＡＦのみを注射した右後足は、予想通り注射後０. ５時間で足体積に有意な増加をもたらした(実験番号１または２でそれぞれ７５ または１００％)が、緩衝液を投与した左後足もしくはＬＰＳまたはＳＥＢのみ を与えた右後足は、浮腫の症状をほとんど示さなかった(非開示データ)。しかし 、ＫＧＦ−２をＰＡＦと共に局所投与すると、ＰＡＦのみで攻撃した足と比較し て足体積にかなりの減少(実験番号１または２でそれぞれ２５または５０％)が起 る。Ckb−１０(別のタンパク質)、ＬＰＳまたはＳＥＢ(これら２つは炎症メディ エーター)と共にＰＡＦを投与した動物には、足浮腫の軽減は観察されなかった 。これらの結果から、ＫＧＦ−２の抗炎症作用が特異的であり、このタンパク質 の何らかの非特異的性質によるのではないことが示唆される。 ラットにおけるＰＡＦ誘導性足浮腫に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 ＫＧＦ−２Δ３３を使用して、ケラチノサイト増殖の刺激に関するその試験管 内生物活性と、創傷治癒に対するその生体内作用とを確認するために、上述の実 験に行なうことにより、さらにＫＧＦ−２Δ３３をラットのＰＡＦ誘導性足浮腫 モデルで評価した。ルイスラット(１９０〜２１０ｇ)４匹の群に、２.５nMolの ＰＡＦと２１０μｇのＫＧＦ−２Δ３３またはアルブミンとを含む溶液１２０μ ｌを右後足の足蹠に皮下注射した。左後足には、同量の緩衝液、アルブミン、ま たはＫＧＦ−２Δ３３のみを投与し、並行対照として使用した。ＰＡＦ注射後様 々な間隔でプレチスモグラフシステムを使って足体積を定量した。足体積の変化 率(％)を計算した。 第４３図に示すように、ＰＡＦとアルブミンを注射した右後足は、予想通り、 注射後０.５時間で足体積の有意な増加(７５％)をもたらしたが、緩衝液、アル ブミンまたはＫＧＦ−２Δ３３のみを投与した左後足は、浮腫の症状をほとんど 示さなかった。しかしＫＧＦ−２Δ３３をＰＡＦと共に局所投与すると、ＰＡＦ とアルブミンとで攻撃した足と比較して足体積にかなりの減少(平均２０％)が４ 時間で終了した全実験期間にわたって観察された。これらの結果から、ＫＧＦ− ２Δ３３の抗炎症性が確認される。 試験試薬 従って、ＫＧＦ−２は、炎症をその疾患の重要な病因とする急性および慢性の 状態、例えば乾癬、湿疹、皮膚炎および／または関節炎など(ただしこれらに限 らない)の治療に役立つ。 実施例２１ 端々結腸吻合ラットモデルに対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 この実施例では、ＫＧＦ−２Δ３３がウィスターラットまたはスプレーグ・ド ーリーラットの腸または結腸吻合モデルにおける腸管修復速度を上昇させること を示す。 実験的に吻合術を施したラットの使用は、よく特徴づけられた適切な再現性あ る手術創治癒のモデルである。このモデルは、結腸および小腸での手術創治癒の 質や速度に対する長期ステロイド治療の影響や種々の化学療法の影響を調べるた めに拡大することもできる(MastboomW．J．B．ら，Br．J．Surg．７８：５４− ５６（１９９１）；Salm R．ら，J．Surg．Oncol．４７：５−１１（１９９１） ；Weiber S．ら，Eur．Surg．Res．２６：１７３−１７８（１９９４）)。吻合 部の治癒は、身体の他の部位での創傷治癒に似ている。治癒の初期相は、急性炎 症とそれに続く線維芽細胞増殖およびコラーゲンの合成を特徴とする。コラーゲ ンは徐々に形作られ、新しいコラーゲンが合成されるにつれて、創傷は強化され る(Koruda M．J．およびRolandelli，R．H．J．Surg．Res．４８：５０４−５１ ５（１９９０）)。吻合部漏洩などのほとんどの術後合併症は、手術後最初の数 日間−すなわち結腸の強度が主として創縁が縫合糸を保持する能力によって確保 されている期間−に起る。胃腸路の縫合糸保持力は、術後最初の数日間は８０％ も減少すると報告されている(Hogstrom HおよびHaglundU．Acta Chir Scand１５ １：５３３−５３５（１９８５）；Jonsson K．ら，Am．J．Surg．１４：８００ −８０３（１９８３）)。 雄の成体ＳＤラット(ｎ＝５)を、ケタミン(５０mg／kg)とキシラジン(５mg／k g)を組み合せて筋肉内投与することにより麻酔した。その腹腔を長さ４cmの正中 線切開で開いた。腹膜反転部に対し近位３cmの位置で辺縁の血管を残して左結腸 の幅１cmの切片を切除した。８−１０の断続的５−０Vicryl内反縫合で単層端々 吻合術を行なうことにより、腸の連続性を回復した。次いで、その吻合部を緩衝 液または１μｇおよび４μｇのＫＧＦ−２Δ３３で注射器により局所的に処置し た。切開創を筋肉層については３−０続絹縫合糸で、皮膚については外科用ステ ープルで閉じた。その後、緩衝液またはＫＧＦ−２Δ３３(皮下に１および ５mg／kg)からなる処置を毎日施した。手術の日とその後の毎日に体重を測定し た。最後の処置(第５日)から２４時間後に動物を安楽死させた。動物を麻酔して バリウム注腸を施し、一定の距離からＸ線撮影した。盲検観察者２人による結腸 内投与後の放射線分析により、ＫＧＦ−２Δ３３処置群は、１）手術部位でのバ リウム漏洩速度の減少、２）手術部位での狭窄度の低下、および３）外科部位よ り遠位に存在する糞粒の増加を示すことが明らかになった。 結腸吻合 放射線分析 実施例２２ ＫＧＦ−２のカルボキシ末端突然変異体の構築 ＫＧＦ−２のカルボキシル末端を高度に荷電させる。それら荷電残基の密度は 、タンパク質の安定性に影響を及ぼし、その結果、その溶解性に影響しうる。溶 液状態でタンパク質を安定化しうる突然変異タンパク質を作成するため、その遺 伝子のこの領域に一連の突然変異を導入した。 点突然変異体１９４Ｒ／Ｅ、１９４Ｒ／Ｑ、１９１Ｋ／Ｅ、１９１Ｋ／Ｑ、１ ８８Ｒ／Ｅ、１８８Ｒ／Ｑを作成するため、５９５２ＫＧＦΔ３３ ５’AflIII ５'プライマーと、ＫＧＦ−２に関して適当な点変異を含む表記の３'プライマー とを使用し、ＫＧＦ−２Δ３３をテンプレートとして、当業者によく知られてい る標準的条件でＰＣＲ反応を行なった。得られた生成物をAflIIIとHindIIIで制 限消化し、NcoＩとHindIIIで制限消化した大腸菌発現ベクターpＱＥ６０にクロ ーニングした。 ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｅ構築： 次のプライマーを使用した： ５９５２ＫＧＦΔ３３ ５’Afl III： ＫＧＦ２ ３'HindＩＩＩ １９４aa Ｒ→Ｅ： ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｅヌクレオチド配列： ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｅアミノ酸配列： ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｑ構築： 次のプライマーを使用した： ５９５２ＫＧＦΔ３３ ５’Afl III： ＫＧＦ２ ３'HindIII １９４aa Ｒ→Ｑ： ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｑヌクレオチド配列：ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｑアミノ酸配列： ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｅ構築： 次のプライマーを使用した： ５９５２ＫＧＦΔ３３ ５’Afl III： ＫＧＦ２ ３'HindIII １９１aa Ｋ→Ｅ： ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｅヌクレオチド配列：ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｅアミノ酸配列： ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｑ構築： 次のプライマーを使用した： ５９５２ＫＧＦΔ３３ ５’Afl III： ＫＧＦ２ ３'HindIII １９１aa Ｋ→Ｑ： ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｑヌクレオチド配列：ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｑアミノ酸配列： ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｅ構築： 次のプライマーを使用した： ５９５２ＫＧＦΔ３３ ５’Afl III： ＫＧＦ２ ３'HindIII １８８aa Ｒ→Ｅ： ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｅヌクレオチド配列：ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｅアミノ酸配列： ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｑ構築： 次のプライマーを使用した： ５９５２ＫＧＦΔ３３ ５’Afl III： ＫＧＦ２ ３'HindIII １８８aa Ｒ→Ｑ： ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｑヌクレオチド配列：ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｑアミノ酸配列： ＫＧＦ２Δ３３，１８３Ｋ／Ｅ構築： 突然変異１８３／Ｅについては、このリジンのオリゴヌクレオチド部位特異的 突然変異誘発を行なうために２つのＰＣＲ反応を設定した。一つの反応では、５ ９５２ＫＧＦΔ３３ ５’AflIIIを５'プライマーとして使用し、ＫＧＦ２ １ ８3aaＫ→Ｅアンチセンスを３'プライマーとして反応に使用した。第二の反応で は、ＫＧＦ２ ５’１８３aaＫ→Ｅセンスを５’プライマーとして使用し、ＫＧ Ｆ２ ３’HindIII ＴＡＡストップを３'プライマーとして使用した。これらの 反応には、ＫＧＦ−２Δ３３をテンプレートとして使用した。これらの増幅反応 は、当業者によく知られている標準的条件下で行なった。次の反応では、これら ＰＣＲ反応で得た各１plをテンプレートとし、５'プライマーとして５４５３ Bs pHIを、３'プライマーとして５２５８ HindIIIを使用した。増幅は、当業者によ く知られている標準的条件を用いて行なった。得られた生成物をAfl IIIとHindI IIで制限消化し、NcoIとHindIIIで制限消化した大腸菌発現ベクターpＱＥ６０に クローニングした。 次のプライマーを使用した： ５９５２ＫＧＦΔ３３ ５’Afl III： ＫＧＦ２ ５’１８３aa Ｋ→Ｅセンス： ＫＧＦ２ １８３aa Ｋ→Ｅアンチセンス： ＫＧＦ２ ３’HindIII ＴＡＡストップ： ＫＧＦ２Δ３３，１８３Ｋ／Ｅヌクレオチド配列： ＫＧＦ２Δ３３，１８３Ｋ／Ｅアミノ酸配列： 実施例２３ ＢＡＬＢ/cマウスの全身照射後の生存に対するＫＧＦ−２の作用 電離放射線は、肺癌、乳癌、リンパ腫、骨盤腫瘍を含む多くの悪性腫瘍の治療 に広く使用されている(Ward，W．F．ら，CRC Handbook of Animal Models of Pu lmonary Disease，CRC Press，１６５−１９５（１９８９）)。 しかし放射線が誘発する損傷(肺、腸など)が放射線療法の強度と成功を制限して いる(Morgan，G．W．ら，Int．J．Radiat．Oncol．Biol．Phys．3１：３６１（ １９９５）)。胃腸粘膜は、速い細胞周期を持ち、細胞障害因子に対する感受性 がとりわけ高い(Potten，C．S．ら，Cytotoxic Insult to Tissue，Churchill L ivingstone，１０５−１５２頁（１９８３）)。腸放射線損傷の症状発現には、 急性直腸炎、腸線維症、狭窄症または瘻孔形成などが含まれる(Anseline，D．F ．ら，Ann．Surg．１９４：７１６−７２４（１９８１）)。腫瘍の放射線感受性 を変えずに正常な構造を放射線から保護する処置は、これらの障害の管理に有益 だろう。照射面積とは無関係に、放射線量は、正常組織の放射線感受性によって 制限される。全身照射または部分照射後の合併症には、肺炎、線維症、冑腸損傷 および骨髄障害が含まれる。 ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２を含む数種類のサイトカインは、Ｔ ＢＩ後の放射線防護作用が証明されている(Neta，R．ら，J．Exp．Med．１７３ ：１１７７（１９９１）)。ＩＬ−１１は、照射と化学療法の併用後(Du，Ｘ．Ｘ ．ら，Blood ８３：３３（１９９４）)および放射線誘発性胸部損傷後(Redlich ，C．A．ら，The Journal of Immunology １５７：１７０５−１７１０（１９９ ６）)の小腸粘膜細胞を保護することが示されている。 動物 すべての実験は、ＢＡＬＢ/cマウスを用いて行なった。動物は６週齢で購入し 、試験の開始時に７週齢だった。すべての操作を無菌技術を使って行なった。こ の試験は、実験計画を検閲して認可したHuman Genome Sciences，Inc．の社内動 物実験委員会による指針に従って行われた。 ＫＧＦ−２ このタンパク質は、ＫＧＦ−２Δ３３と名づけた１４１アミノ酸のヒトタンパ ク質からなる。このタンパク質は、成熟タンパク質の最初の３３アミノ末端残基 を欠く、ＫＧＦ−２の先端切断型アイソフォームである。このタンパク質をコー ドする遺伝子は、大腸菌発現ベクターにクローニングされている。純度９５％を 超える組換え物質を含む画分を実験に使用した。ＫＧＦ−２は、４０ｍＭ酢酸ナ トリウム＋１５０ｍＭ NaCl(ｐＨ ６.５)を含む賦形剤中に調剤した。希釈液は 、その原液から同じ賦形剤を使って調製した。 全身照射と実験計画 ６８ Mark I Shepherdセシウム照射装置を用いて、マウスに５１９ラド(５.１ ９Ｇｙ)を照射した。ＫＧＦ−２Δ３３を、照射２日前から始めて照射後７日間 、毎日皮下投与した。全てのマウスについて毎日体重を測定した。マウス群は、 次に挙げる３種類の処置のうちの１つに無作為に割り当てた:全身照射(ＴＢＩ) ＋緩衝液、ＴＢＩ＋ＫＧＦ−２Δ３３(皮下１mg／kg)、ＴＢＩ＋ＫＧＦ−２Δ３ ３(皮下５mg／kg)。２回の独立した実験を行なった。 結果 照射した動物を使って２回の試験を行なった。第１の試験では、動物に５１９ ラド(５.１９Ｇｙ)を照射した。照射前の２日間と照射後毎日７日間にわたって 、緩衝液または１mg／kgおよび５mg／kgのＫＧＦ−２Δ３３で動物を処置した。 全身照射後２５日の時点で、緩衝液群では５匹中１匹が生き残った。これに対し ＫＧＦ−２処置群では、１mg／kgで５匹中５匹が、５mg／kgで５匹中４匹が生き 残った(第４４図)。 また、ＫＧＦ−２処置動物は、ＴＢＩ後２０日で０.９％および５.３％の体重 増加を示した。これに対し、緩衝液処置群は、第２０日で４.２％の体重減少を 示した。正常な非照射同年齢対照動物は、同じ期間内に６.７％の体重増加を示 した(第４５図)。 第二の試験でも動物に５１９ラド(５.１９Ｇｙ)を照射した。照射前の２日間 と照射後の毎日７日間にわたって、動物に緩衝液または１mg／kgおよび５mg／kg のＫＧＦ−２Δ３３を皮下投与した。全身照射後１５日の時点で、緩衝液群のす べての動物が死亡していた。ＫＧＦ−２は、１mg／kgで３０％の生存率、５mg／ kgで６０％の生存率を示した。ＴＢＩ後２５日の時点で、１mg／kg群は２０％の 生存率、５mg／kg群は５０％の生存率を示した(第４６図)。 結論 要約するとこれらの結果は、ＫＧＦ−２がＴＢＩ後の保護作用を持つことを示 している。ＫＧＦ−２がＴＢＩを受けた動物の生存率を向上させるうることは、 これが放射線誘発性損傷にも有用であり、悪性腫瘍の治療における照射の治療可 能比を増大させるのにも有用であることを示唆している。 実施例２４ マウスの皮膚炎症のＴＰＡモデルにおけるＫＧＦ−２の評価 ＫＧＦ−２が接触皮膚炎の進行を減衰することを立証するため、マウスのテト ラデカノイルホルボールアセテート(ＴＰＡ)誘発性皮膚炎症モデルを使用した。 実験的に皮膚炎を起こした雌のＢＡＬＢ／cマウスと雄のSwiss Websterマウスの 使用は、よく特徴づけれた適切な再現性ある接触皮膚炎のモデルである。これら の系統のマウスは、ＴＰＡの局所適用後に、局所的血流動態、血管透過性および 白血球の局所的移動からなる持続性の炎症反応を起すことが示されており、それ らの病的変化は、ヒトの皮膚炎と類似している(Raoら，１９９３，Inflammation １７(６)：７２３；Raoら，１９９４，Ｊ．Kipid Mediators Cell Signalling １０：２１３)。 マウス群にＴＰＡ(４μｇ／耳)をアセトン溶液(２００μｇ／ml)として耳の内 表面と外表面に１０μｌずつ局所適用した６０分後に、賦形剤またはＫＧＦ−２ を腹腔内、皮下または静脈内投与する。対照群には、アセトン２０μｌを局所適 用する。ＴＰＡ適用の４時間後に耳の厚さを測定し、組織学的検査のために耳を 切除する。ＴＰＡに反応した血管透過性を測定するため、ＴＰＡ局所適用後の選 択した時点でエバンスブルー(３００mg／kg)を尾静脈からマウスに静脈内注射し 、その１５分後にマウスを犠牲にする。耳を切除した後、ジメチルホルムアミド 中に抽出し、遠心分離する。５９０ｎＭの吸光度値を分光光度法で測定する。 実施例２５ 創傷治癒におけるＫＧＦ−２Δ３３の作用 初代ヒト表皮ケラチノサイトと、ＦＧＦＲアイソフォーム２iiibを遺伝子導入 したマウスプロ−Ｂ BaF３細胞をＫＧＦ−２が刺激できることを示す初期の試 験管内データに基き、皮膚におけるＫＧＦ−２Δ３３の生物学的作用を調べた。 最初の実験は、皮内投与後のＫＧＦ−２Δ３３の生物学的作用を決定するために 行なった。皮内試験に続いて、ＫＧＦ−２Δ３３を種々の創傷治癒モデル(全層 パンチ生検創傷と切開創傷を含む)で調査することにより、創傷治癒剤としての 潜在能力を決定した。 創傷治癒のグルココルチコイド障害ラットモデルにおけるＫＧＦ−２Δ３３の作 用 創傷治癒障害は、糖尿病などの様々な病的状態に伴う重要な臨床課題であり、 ステロイド剤や代謝拮抗物質の全身投与の合併症である。全身グルココルチコイ ドによる治療は、ヒトおよび組織修復の動物モデルにおいて創傷治癒を損なうこ とが知られている。グルココルチコイド投与に続いて、循環単球レベルの低下と プロコラーゲン合成の阻害が観察されている。従って、治癒の炎症相とマトリッ クス合成は、組織修復の複雑な過程に関わる重要な因子である。この試験では、 ＫＧＦ−２の複数回局所投与の効果を、メチルブレドニゾロンの全身投与によっ て治癒機能が損なわれているラットの全層切除皮膚創傷で評価した。 スプレーグドーリーラット(ｎ＝５／処置群)の背中に８ｍＭの創傷を負わせ、 治癒を損なうためにメチルプレドニゾロン(筋肉内１７mg／kg)を与えた。創傷を 体積５０μｌの緩衝液または投与量０.１、０.５、および１.５μｇのＫＧＦ− ２で毎日局所的に処置した。第２、４、６、および８日に較正済ジェームソンキ ャリパーを用いて創傷を計測した。第６日(非開示データ)と第８日(第４７図)に 、ＫＧＦ−２処置群は、緩衝液対照と比較して創傷の閉鎖に関して統計的に有意 な縮小を示した。 糖尿病マウスモデルにおける創傷治癒に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 ６週齢で体重３０−３５ｇの遺伝性糖尿病ホモ接合性の雌の(db＋／db＋)マウ ス(ｎ＝６)の背中に６ｍＭ生検穿孔具で全層創傷を負わせた。その創傷を開放状 態にしておき、毎日プラシーボまたは０.１、０.５、および１.５μｇのＫＧＦ − ２で処置した。創傷の閉鎖は、ジャームソンキャリパーを用いて測定した。第１ ０日に動物を安楽死させ、組織学的検査のために創傷を採取した。 ＫＧＦ−２は、プラシーボまたは無処置群と比較して、０.１μｇで創傷閉鎖 率に有意な改善を示した(p＝０.０２)。ＫＧＦ−２の投与は、プラシーボまたは 無処置群と比較して０.１μｇ(p＝０.０３)で、また無処置群と比較して１.５μ ｇ(p＝０.０５)で、組織学的スコアにも改善をもたらした。 結論 上記の結果から、ＫＧＦ−２は、グルココルチコイド投与や糖尿病などの障害 状態に有意な活性を示す。従って、ＫＧＦ−２は、手術後、糖尿病または循環不 全(静脈不全や静脈性潰瘍など)を持つ患者の慢性潰瘍、熱傷、その他の異常な創 傷治癒状態(例えば尿毒症、栄養不良、ビタミン欠乏症およびステロイドや抗腫 瘍剤による全身治療など)の治癒を刺激するのに臨床的に有用であるといえる。 実施例２６ 口腔粘膜に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 臨床的に使用される細胞障害剤は、口腔粘膜などのいくつかの部位で正常な上 皮の増殖を阻害するという残念な作用を持ち、粘膜障壁に生命を脅かす障害をも たらす。我々は、この臨床領域におけるＫＧＦ−２の効力を調べるための試験を 行なった。そのデータは、粘膜炎のモデルにおけるＫＧＦ−２の治療効果を裏付 けるものである。 ハムスター口腔粘膜に対するＫＧＦ−２の作用 ＫＧＦ−２が正常な口腔粘膜上皮の増殖を誘導しうるかどうかを決定しようと した。口腔粘膜でのＫＧＦ−２の作用を雄のゴールデンシリアンハムスターで評 価した。ハムスターの頬嚢を緩衝液またはＫＧＦ−２Δ３３(０．1、１、および １０μｇ／頬)(麻酔したハムスターの頬に頬あたり１００μｌの体積で局所的に 適用)で毎日処置した。この化合物は、頬と最低６０秒間接触した後、嘆下され た。７日間の処置後、上述のように動物にBrdUを注射し、犠牲にした。増殖細胞 を 抗BrdU抗体で標識した。第４８図は、動物を１μｇおよび１０μｇのＫＧＦ−２ Δ３３で処置すると(緩衝液処置と比較して)BrdU標識(細胞増殖)が有意に増大し たことを示している。 ＫＧＦ−２による局所処置は、正常な粘膜上皮細胞の増殖を誘導した。これら の結果から、ＫＧＦ−２は、化学療法剤(またはその他の毒物療法)、放射線療法 または化学療法と放射線療法の併用によって起る口腔粘膜炎の予防に臨床的に有 用であるといえる。またＫＧＦ−２は、毒物(化学療法)または放射線療法の結果 としての口腔粘膜への傷害の重篤度を軽減する点で、治療剤としても有用である 。 実施例２７ ラットにおける虚血性創傷治癒に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 この実施例に記載する実験の目的は、虚血性創傷治癒モデルを用いた創傷治癒 におけるＫＧＦ−２の効力を決定することにあった。 局部的な皮膚の血液供給を、一つの有茎全層ランダム筋皮弁(３×４cm)の挙上 によって部分的に妨害した。その筋皮弁を構成する皮膚局所に全層創傷を負わせ た。この試験には、６０匹の成体スプレーグ・ドーリーラットを使用し、それら をＫＧＦ−２Δ３３群とプラシーボ群に無作為に分割した(５匹／群／時点)。創 傷形成後第１、３、５、７、１０、および１５日に、それぞれ創傷を採取した。 創傷の破壊強さは、創傷形成後１０日と１５日に至るまでの早い時点では、Ｋ ＧＦ−２処置群と緩衝液処置群の間で有意差を示さなかった。 結果は、ＫＧＦ−２が創傷形成の１０日後に虚血性創傷修復における創傷の破 壊強さを有意に改善したことを示した。またこれらの結果は、正常な創傷治癒の 試験で過去に得たデータと比較して、虚血がどちらの群の治癒過程をも遅延させ ることを示唆している。 この筋皮弁モデルは、静脈還流による虚血状況下のデータと情報を提供する。 これらの結果は、ＫＧＦ−２が静脈還流の障害および／または静脈不全によって 起る慢性静脈性脚潰瘍の治療に使用しうることを示唆している。 実施例２８ ラットにおける結腸吻合部の治癒に関するＫＧＦ−２の評価 この実験の結果は、ＫＧＦ−２Δ３３がウィスターラットまたはスプレーグ・ ドーリーラットの腸もしくは結腸吻合モデルにおいて腸管修復の速度を高めるこ とを立証する。またこのモデルは、ＫＧＦ−２とそのアイソフォームが胃腸壁ま たは結腸壁の縫合結合力を増大させることを立証するためにも使用できる。 実験的吻合術を施したラットの使用は、よく特徴づけられた適切な再現性ある 手術創治癒のモデルである。このモデルは、結腸および小腸の手術創治癒の質と 速度に対する長期ステロイド治療の影響や種々の化学療法の影響を調べるために 拡張することもできる(Mastboom，W．J．B．ら，Br．J．Surg．７８：５４−５ ６（１９９１）；Salm，R．ら，J．Surg．Oncol．４７：５−１１（１９９１） ；Weiber，S．ら，Eur．Surg．Res．２６：１７３−１７８（１９９４）)。吻合 部の治癒は、身体の他の部位における創傷治癒と似ている。治癒の初期相は、急 性炎症とそれに続く線維芽細胞増殖およびコラーゲンの合成を特徴とする。コラ ーゲンは徐々に形作られ、新しいコラーゲンが合成されるにつれて、創傷は強化 される(Koruda M．J．およびRolandelli，R．H．，J．Surg．Res．４８：５０４ −５１５（１９９０）)。吻合部漏洩などのほとんどの術後合併症は、手術後最 初の数日間−すなわち結腸の強度が主として創縁が縫合糸を保持する能力によっ て確保されている期間−に起る。胃腸路の縫合糸保持力は、術後最初の数日間は ８０％も減少すると報告されている(Hogstrom H．およびHaglund U.，Acta Chir Scand １５１：５３３−５３５（１９８５）；Jonsson K．ら，Am J．Surg．１ ４：８００−８０３（１９８３）)。 ケタミン(５０mg／kg)とキシラジン(５mg／kg)を組み合せて筋肉内投与するこ とにより、ラットを麻酔した。皮膚消毒中、手術中および手術後は、動物を加熱 パッドの上に保った。腹腔を長さ４cmの正中線切開で開いた。腹膜反転部に対し 近位3cmの位置で辺縁の血管を残して左結腸の幅１cmの切片を切除した。８−１ ０の断続的５−０プロピレン内反縫合で単層端々吻合術を行なうことにより、腸 の連続性を回復した。切開創を筋肉層については３−０連続絹縫合糸で、皮膚に ついては外科用ステープルで閉じた。各動物について毎日、個々の体重、体温お よ び食物消費パターンからなる臨床評価を行なった。 ＫＧＦ−２Δ３３処置とプラシーボ処置は、術後直ちに、皮下、局所、腹腔内 、筋肉内、胃内、または結腸内に毎日施し、その後、犠牲にする日（第７日）ま で続けた。無処置対照群、プラシーボ群およびＫＧＦ−２Δ３３群を設けた。安 楽死の２時間前に、動物の腹腔内に１００mg／kg BrdUを注射した。最後の処置( 第５日)の２４時間後に動物を安楽死させた。正中線切開を前腹壁に施し、吻合 部を含む長さ１cmの結腸切片を摘出した。手術部位の第三の切片を総コレステロ ール分析のために採取した。 一連の２つの実験では、雄の成体ＳＤラット(ｎ＝５)を麻酔し、８−１０の断 続的６−０プロレン内反縫合で遠位結腸の単層端々吻合術を施した。次いで、吻 合部位を緩衝液または濃度１μｇおよび４μｇのＫＧＦ−２Δ３３で注射器によ り局所的に処置した。その後、緩衝液または濃度１mg／kgもしくは５mg／kgのＫ ＧＦ−２Δ３３の腹腔内投与により動物を毎日処置した。第５日に動物を安楽死 させ、結腸を摘出し、液体窒素で急速冷凍し、凍結乾燥して、コラーゲン測定に かけた。コラーゲン濃度は、μｇコラーゲン／mg乾燥重量組織として表わす。統 計分析は、独立t検定を使って行なった。平均±ＳＥ。第５日に、ラットを麻酔 し、バリウム注腸を施した後、放射線像分析を行なった。２回の実験で得た端々 左結腸吻合のバリウム注腸放射線評価は、１mg／kgおよび５mg／kgのＫＧＦ−２ で処置された動物について腹腔漏洩の一貫した低下を示した。このデータを下記 の表に示す。また張力計を用いて手術部位の破壊強さも調べた。ＫＧＦ−２Δ３ ３群と緩衝液群の間に有意差は観察されなかった。第４９図に示すように、緩衝 液対照に対して、手術部位でのコラーゲン含量の有意な増加が、１mg／kgＫＧＦ −２Δ３３(p＝０.０２)と５mg／kg(p＝０.００４)の両方で明らかになった。 表 結腸吻合 放射線分析 ^*吻合部狭窄採点法：０−狭窄なし；１−５−極微〜激しい狭窄。 雄の成体ＳＤラット(ｎ＝５)を、ケラチン(５０mg／kg)とキシラジン(５mg／kg) を組み合せて筋肉内投与することにより麻酔した。その腹腔を長さ４cmの正中線 切開で開いた。腹膜反転部に対し近位３cmの位置で辺縁の血管を残して左結腸の 幅１cmの切片を切除した。８−１０の断続的５−０プロレン内反縫合で単層端々 吻合術を行なうことにより、腸の連続性を回復した。次いで、その吻合部を緩衝 液または１μｇおよび４μｇのＫＧＦ−２で注射器により局所的に処置した。切 開創を筋肉層については３−０連続絹縫合糸で、皮膚については外科用ステープ ルで閉じた。その後、緩衝液またはＫＧＦ−２Δ３３(皮下に１および５mg／kg) からなる処置を毎日施した。手術の日とその後の毎日に体重を測定した。最後の 処置(第５日)から２４時間後に動物を安楽死させた。動物を麻酔してバリウム注 腸を施し、一定の距離からX線撮影した。次いで、吻合部を摘出して病理組織学 的分析と生体力学的分析を行なった。 実施例２９ 炎症性腸疾患のモデルにおけるＫＧＦ−２の評価 ＫＧＦ−２は、試験管内でケラチノサイトの増殖を誘導し、種々の生体内創傷 治癒モデルで活性なタンパク質である。この試験の目的は、飲用水中のデキス トラン硫酸ナトリウムへの無制限の曝露によって誘発したネズミ結腸炎のモデル でＫＧＦ−２が有効かどうかを決定することにあった。 ６〜８週齢の雌のスイスウェブスターマウス(２０−２５ｇ；Charles River， Raleigh，NC)を、硫酸ナトリウムの４％溶液(ＤＳＳ，分子量３６，０００−４ ４,０００，American International Chemistry，Natick，MA)を１週間無制限に 与えることによって誘発した炎症性腸疾患のモデルに使用した。ＫＧＦ−２は毎 日非経口投与によって与えた(ｎ＝１０)。効力の決定には、次の３つのパラメー ターを使用した：１）糞便の評価に基く臨床スコア、２）結腸の評価に基く組織 学的スコア、および３）体重変化。臨床スコアは、合計して４を上限とする２つ の部分からなる。糞便軟度は、０＝固い、１=ゆるい、２=下痢と採点した。糞便 中の血液も０〜２の尺度で、０＝血液なし、１＝潜血、２=著しい直腸出血と評 価した。３を超える平均群スコアは、ほぼ確実な致死性と、治療可能な段階を超 えて進行した疾患を示した。臨床スコアは、第０、４、５、６、および７日に採 点した。組織学的スコアを得るため、上行、横行および下行結腸のスライドを炎 症スコア(０−３）と陰窩スコア(０−４)に基く盲検法で評価した。体重は、毎 日測定した。データを平均±ＳＥＭとして表した。独立スチューデントt検定を 使って、疾患対照と比較した有意差を決定した(^*p＜０.０５；^**p＜０.０１；^{** *} p＜０.００１)。 ＤＳＳ処置マウスに投与量１、５、または１０mg／kgのＫＧＦ−２Δ３３を毎 日７日間腹腔内(ＩＰ)注射した場合、ＫＧＦ−２は、臨床スコアをそれぞれ２８ 、３８、および５０％有意に低下させた。組織学的評価は、臨床スコアの用量依 存的抑制とよく類似し、１、５、および１０mg／kgの投与量で組織学的スコアを 有意に２６、４８、および５１％低下させた。ＫＧＦ−２は、ＤＳＳ誘発性結腸 炎に伴う体重減少も有意に抑制した。 第二の試験では、ＩＰまたは皮下(ＳＣ)に毎日投与した場合のＫＧＦ−２Δ３ ３(１０mg／kg)の相対効力を比較した。第７日の実験終了時点までに、ＫＧＦ− ２をＩＰ注射した動物は臨床スコアに有意な３４％の減少を示し、一方、ＫＧＦ −２のＳＣ注射は有意な４６％の減少をもたらした。ＳＣ投与は、ＤＳＳ対照に 対して体重減少をも有意に抑制した。臨床スコアと体重の測定から、ＫＧＦ−２ のＳＣ投与は、少なくともＩＰ投与と同等に有効である。 本発明を上述の説明と実施例に具体的に記載した以外の方法で実施できること は明らかだろう。 前述に照せば本発明の多くの変更態様が可能であり、従って、添付の請求の範 囲の範囲内で、本発明を上述した以外の方法で実施できる。 ここに引用したすべての刊行物(特許、特許出願、雑誌記事、実験マニュアル 、書籍その他の文書を含む)の全内容は、参考文献として本明細書の一部を構成 する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/04 Ａ６１Ｐ 7/00 7/00 9/10 9/10 11/00 11/00 13/02 13/02 15/00 15/00 17/02 17/02 17/06 17/06 29/00 29/00 31/00 31/00 31/10 31/10 37/00 37/00 43/00 43/00 Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒメネス，パブロ アメリカ合衆国21043メリーランド州エリ コット・シティ、カレッジ・アベニュー 3843番 (72)発明者 ランピー，マーク・エイ アメリカ合衆国20879メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ワイルド・アップル・サー クル 10224番 (72)発明者 メンドリック，ドナ アメリカ合衆国21771メリーランド州マウ ント・エアリー、リッジ・ロード29112番 (72)発明者 チャン，ジュン アメリカ合衆国20817メリーランド州ベセ ズダ、クレストベリー・プレイス10100番 (72)発明者 ニー，チーアン アメリカ合衆国20853メリーランド州ロッ クビル、マナーフィールド・ロード5502番 (72)発明者 ムーア，ポール・エイ アメリカ合衆国20874メリーランド州ジャ ーマンタウン、レザーバーク・ドライブ 19005番 (72)発明者 コールマン，ティモシー・エイ アメリカ合衆国20879メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ボックスベリー・テラス 7512番 (72)発明者 ジェンツ，レイナー・エル アメリカ合衆国20850メリーランド州ロッ クビル、マウント・プロスペクト・ドライ ブ3608番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ケラチノサイト増殖因子−２(ＫＧＦ−２)のＮ末端欠失変異体であっ て、該変異体は、第１図の、少なくとも最初の３８のＮ末端アミノ酸残基を欠失 するが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基を欠失であることを除けば、第 １図のアミノ酸配列を含む変異体； （ｂ）ケラチノサイト増殖因子−２(ＫＧＦ−２)のＣ末端欠失変異体であって、 該変異体は、第１図の、少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基(Ser(２０８))を 欠失するが、最後の５５以下のＣ−末端アミノ酸残基の欠失であることを除けば 第１図のアミノ酸配列を含み、該ＫＧＦ−２ Ｃ末端欠失変異体のＮ末端アミノ 酸残基は、第１図のアミノ酸残基１(Met)、３６(Thr)、または３７(Cys)である 変異体； （ｃ）ケラチノサイト増殖因子−２(ＫＧＦ−２)のＮ末端およびＣ末端欠失変異 体であって、該変異体は、第１図の、少なくとも最初の３８のＮ末端アミノ酸残 基を欠失するが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失であり、第１図 の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基(Ser(２０８))を欠失するが、最後の５ ５以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失であることを除けば、第１図のアミノ酸配列 を含む変異体； （ｄ）（ａ）のＫＧＦ−２欠失変異体のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一で あるアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｅ）（ｄ）のＫＧＦ−２欠失変異体のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一で あるアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｆ）（ｃ）のＫＧＦ−２欠失変異体のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一で あるアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｇ）少なくとも１つのアミノ酸置換を除けば、（ａ）のＫＧＦ−２欠失変異体 のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｈ）少なくとも１つのアミノ酸置換を除けば、（ｂ）のＫＧＦ−２欠失変異体 のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｉ）少なくとも１つのアミノ酸置換を除けば、（ｃ）のＫＧＦ−２欠失変異体 のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド； よりなる群から選択される単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリ ペプチドはケラチノサイトの増殖を刺激するポリペプチド。 ２．ポリペプチドが（ａ）である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。 ３．変異体が、少なくとも最初の４６のＮ末端アミノ酸残基を欠失するが、最初 の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失である、請求項２に記載の単離された ポリペプチド。 ４．変異体が、少なくとも最初の６２のＮ末端アミノ酸残基を欠失するが、最初 の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有する、請求項３に記載の単離され たポリペプチド。 ５．変異体が、少なくとも最初の６８のＮ末端アミノ酸残基を欠失するが、最初 の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有する請求項４に記載の単離された ポリペプチド。 ６．変異体が、少なくとも最初の７６のＮ末端アミノ酸残基を欠失するが、最初 の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有する、請求項５に記載の単離され たポリペプチド。 ７．変異体が、少なくとも最初の９２のＮ末端アミノ酸残基を欠失するが、最初 の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有する、請求項６に記載の単離され たポリペプチド。 ８．変異体が、少なくとも最初の１０３のＮ末端アミノ酸残基を欠失するが、最 初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有する、請求項７に記載の単離さ れたポリペプチド。 ９．変異体が、少なくとも最初の１２２のＮ末端アミノ酸残基を欠失するが、最 初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有する、請求項８に記載の単離さ れたポリペプチド。 １０．変異体が、最初の１３７のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有する請求項９に 記載の単離されたポリペプチド。 １１．変異体が、Ala(３９)−Ser(２０８)；Pro(４７)−Ser(２０８）；Ala(６ ３)−Ser(２０８)；Ser(６９)−Ser(２０８)；Val(７７)−Ser(２０ ８)；Glu(９３)−Ser(２０８)；Glu(１０４)−Ser(２０８)；Val(１２３)Ser(２ ０８)；Gly(１３８)−Ser(２０８)よりなる群から選択される第１図に示すアミ ノ酸配列を有する、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。 １２．変異体が、野性型のＫＧＦ−２に比べて高められたケラチノサイト増殖刺 激活性を有する、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。 １３．ポリペプチドが（ｄ）である、請求項１に記載の単離されたボリペプチド 。 １４．アミノ酸配列が（ａ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端欠失変異体のアミノ酸配列と 少なくとも９７％同一である、請求項１３に記載の単離されたポリペプチド。 １５．アミノ酸配列が（ａ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端欠失変異体のアミノ酸配列と 少なくとも９９％同一である、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。 １６．アミノ酸配列が（ａ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端欠失変異体のアミノ酸配列と 同一である、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド。 １７．ポリペプチドが（ｇ）である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。 １８．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Arg(１９４)Glu、Arg(１９４)Gln、Ly s(１９１)Glu、Lys(１９１)Gln、Arg(１８８)Glu、Arg(１８８)Gln、およびLys( １８３)Gluよりなる群から選択される請求項１７に記載の単離されたポリペプチ ド。 １９．ポリペプチドが（ｄ）である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド 。 ２０．変異体が少なくとも最後の１０、２０、３０、４０または５０のＣ末端ア ミノ酸の欠失を有するが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸の欠失を有する請求 項１９に記載の単離されたポリペプチド。 ２１．変異体が最後の５５のＣ末端アミノ酸の欠失を有する請求項２０に記載の 単離されたポリペプチド。 ２２．変異体が、Met(１)−Lys(１５３)、Thr(３６)−Lys(１５３)、およびCys( ３７)−Lys(１５３)よりなる群から選択される第１図に示すアミノ酸配列を有す る、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。 ２３．ポリペプチドが（ｅ）である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。 ２４．アミノ酸配列が、（ｂ）のＫＧＦ−２ Ｃ末端欠失変異体のアミノ酸配列 と少なくとも９７％同一である、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。 ２５．アミノ酸配列が、（ｂ）のＫＧＦ−２ Ｃ末端欠失変異体のアミノ酸配列 と少なくとも９９％同一である、請求項２４に記載の単離されたポリペプチド。 ２６．アミノ酸配列が、（ｂ）のＫＧＦ−２ Ｃ末端欠失変異体のアミノ酸配列 と同一である、請求項２５に記載の単離されたポリペプチド。 ２７．ポリペプチドが（ｈ）である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。 ２８．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Cys(３７)SerおよびCys(１０６)Serよ りなる群から選択される、請求項２７に記載の単離されたポリペプチド。 ２９．ポリペプチドが（Ｃ）である請求項１に記載の単離されたポリペプチド。 ３０．変異体が、第１図の少なくとも最初の４６、６２、６８、７６、９２、１ ０３、または１２２のＮ末端アミノ酸の欠失を有するが、最初の１３７以下のＮ 末端アミノ酸の欠失を有し、第１図の少なくとも最後の１０、２０、３０、４０ 、または５０のＣ末端アミノ酸の欠失を有するが、最後の５５以下のＣ末端アミ ノ酸の欠失を有する、請求項２９に記載の単離されたポリペプチド。 ３１．変異体が、Ala(３９)−His(２００)、Met(４４)−Arg(１９３)、Ala(６３ )−Lys(１５３)、およびSer(６９)−Lys(１５３)よりなる群から選択される第１ 図に示すアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の単離されたポリペプチド。 ３２．ポリペプチドが（ｆ）である請求項１に記載の単離されたボリペプチド。 ３３．アミノ酸配列が、（ｃ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体の アミノ酸配列と少なくとも９７％同一である、請求項３２に記載の単離されたポ リペプチド。 ３４．アミノ酸配列が、（ｃ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体の アミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、請求項３３に記載の単離されたポ リペプチド。 ３５．アミノ酸配列が、（ｃ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体の アミノ酸配列と同一である、請求項３４に記載の単離されたポリペプチド。 ３６．ポリペプチドが（ｉ）である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド 。 ３７．変異体のアミノ酸配列が、Ｎ末端に付加されたアミノ酸Metを含む請求項 １に記載の単離されたポリペプチド。 ３８．融合タンパク質の部分である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド 。 ３９．ポリペプチドがマーカー配列に融合している請求項３８に記載の単離され たポリペプチド。 ４０．マーカー配列がヘキサヒスチジンタグまたは赤血球凝集素タグより選択さ れる、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。 ４１．組換え宿主細胞中で製造され、またはその中に含まれる、請求項１に記載 の単離されたポリペプチド。 ４２．宿主細胞が哺乳動物である請求項４１に記載の単離されたポリペプチド。 ４３．（ａ）ケラチノサイト増殖因子−２(ＫＧＦ−２)のＮ末端欠失変異体であ って、該変異体は第１図のアミノ酸配列Ser(６９)−Ser(２０８)より本質的にな る変異体； （ｂ）（ａ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端欠失変異体のアミノ酸配列と少なくとも９５ ％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｃ）少なくとも１のアミノ酸置換を除いては、（ａ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端欠 失変異体のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド； よりなる群から選択される単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリ ペプチドはケラチノサイトの増殖を刺激する単離されたポリペプチド。 ４４．ポリペプチドが（ａ）である請求項４３に記載の単離されたポリペプチド 。 ４５．変異体が、野性型のＫＧＦ−２と比較して高められたケラチノサイト増殖 刺激活性を有する、請求項４４に記載の単離されたポリペプチド。 ４６．ポリペプチドが（ｂ）である、請求項４３に記載の単離されたポリペプチ ド。 ４７．アミノ酸配列が、（ａ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端欠失変異体のアミノ酸配列 と少なくとも９７％同一である請求項４６に記載の単離されたポリペプチド。 ４８．アミノ酸配列が、（ａ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端欠失変異体のアミノ酸配列 と少なくとも９９％同一である請求項４７に記載の単離されたポリペプチド。 ４９．アミノ酸配列が、（ａ）のＫＧＦ−２ Ｎ末端欠失変異体のアミノ酸配列 と同一である請求項４８に記載の単離されたポリペプチド。 ５０．ポリペプチドが（ｃ）である、請求項４３に記載のポリペプチド。 ５１．少なくとも１つのアミノ酸置換が変異体の安定性を増加させる、請求項５ ０に記載の単離されたポリペプチド。 ５２．少なくとも１つのアミノ酸置換を、Arg(１９４)Glu、Arg(１９４)Gln、Ly s(１９１)Glu、Lys(１９１)Gln、Arg(１８８)Glu、Arg(１８８)Gln、およびLys( １８３)Gluよりなる群から選択する、請求項５１に記載の単離されたポリペプチ ド。 ５３．ポリペプチドがＮ末端に付加されたアミノ酸Metを含む、請求項４３に記 載の単離されたポリペプチド。 ５４．融合タンパク質の部分である請求項４３に記載の単離されたポリペプチド 。 ５５．ポリペプチドがマーカー配列に融合している、請求項５４に記載の単離さ れたポリペプチド。 ５６．マーカー配列を、ヘキサヒスチジンタグまたは赤血球凝集素タクから選択 する請求項５５に記載の単離されたポリペプチド。 ５７．組換え宿主細胞中で製造され、またはその中に含まれる請求項４３に記載 の単離されたポリペプチド。 ５８．宿主細胞が哺乳動物である請求項５７に記載の単離されたポリペプチド。 ５９．ケラチノサイト増殖因子−２(ＫＧＦ−２)の親水性領域を含む単離された ポリペプチドであって、該ペプチドは長さが１５０アミノ酸以下であり、Gly(４ １)−Asn(７１)、Lys(９１)−Ser(１０９)、Asn(１３５)−Tyr(１６４)、および Asn(１８１)−Ala(１９９)よりなる群から選択する第１図に示すアミノ酸配列を 含む単離されたポリペプチド。 ６０．長さが１００アミノ酸以下である請求項５９に記載のポリペプチド。 ６１．長さが５０アミノ酸以下である、請求項６０に記載のポリペプチド。 ６２．医薬的に受容し得る担体または賦形剤と共にある請求項１に記載の単離さ れたポリペプチド。 ６３．医薬的に受容し得る担体または賦形剤と共にある請求項４３に記載の単離 されたポリペプチド。 ６４．医薬的に受容し得る担体または賦形剤と共にある請求項５９に記載の単離 されたポリペプチド。 ６５．請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド 。 ６６．請求項４３に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチ ド。 ６７．請求項５９に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチ ド。 ６８．E．coli中での発現のために最適化されている請求項６５に記載の単離さ れたポリヌクレオチド。 ６９．第２３図のヌクレオチド配列を有する請求項６８に記載に単離されたポリ ヌクレオチド。 ７０．第２４Ａ図のヌクレオチド配列を有する請求項６８に記載の単離されたポ リヌクレオチド。 ７１．第２４Ｂ図のヌクレオチド配列を有する請求項６８に記載の単離されたポ リヌクレオチド。 ７２．E．coli中での発現のために最適化されている請求項６６に記載の単離さ れたポリヌクレオチド。 ７３．本願明細書第１２２頁７〜１７行に示すヌクレオチド配列を有する、請求 項７２に記載の単離されたポリヌクレオチド。 ７４．請求項６５、６６または６７に記載の核酸分子をベクター中に挿入するこ とを含む組換えベクターの製造方法。 ７５．請求項７４に記載の方法により製造した組換えベクター。 ７６．請求項７５に記載の組換えベクターを宿主細胞中に導入することを含む組 換え宿主細胞の製造方法。 ７７．請求項７６に記載の方法により製造した組換え宿主細胞。 ７８．ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを宿主 細胞に導入し； 該宿主細胞を培養し；そして 該ポリペプチドを回収する； ことを含む方法により製造した、請求項１、４３、または５９に記載の単離され たポリペプチド。 ７９．請求項７７に記載の組換え宿主細胞をベクターが発現する条件下に培養し ； 該ポリペプチドを回収する； ことを含むポリペプチドの製造方法。 ８０．細胞を有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドと接触させるこ とを含むケラチノサイトの成長または増殖を刺激する方法。 ８１．ポリペプチドを個体に投与する請求項８０に記載の方法。 ８２．皺または老化した皮膚の外観を防止または改良すること、皮膚の強度を改 良すること、表皮の厚化を促進すること、瘢痕を減少させること、または整容手 術後の治癒を改善することから選択される目的で、ポリペプチドを投与する請求 項８１に記載の方法。 ８３．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドを個体に投与すること を含む創傷治癒を促進する方法。 ８４．個体が創傷治癒が損なわれている請求項８３に記載の方法。 ８５．創傷治癒が損なわれるのが、糖尿病、虚血性遮断もしくは損傷、ステロイ ド、非ステロイド化合物、尿毒症、栄養不良、ビタミン欠除、肥満、感染、免疫 抑制、放射線療法、または化学療法により起される請求項８４に記載に方法。 ８６．創傷が、外科手術創傷、切除創傷、真皮および表皮の損傷を含む深い創傷 、眼の組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、肘 潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性のうっ血潰瘍、または火傷から選択される、請求項８ ３に記載の方法。 ８７．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドをその必要のある個体 に投与することを含む、結腸または胃腸(ＧＩ)の外科手術により生じる創傷を処 置する方法。 ８８．該外科手術が吻合である請求項８７に記載の方法。 ８９．個体が創傷治癒が損なわれている請求項８７に記載の方法。 ９０．創傷治癒が損なわれるのが、糖尿病、虚血性遮断もしくは損傷、ステロイ ド、非ステロイド化合物、尿毒症、栄養不良、ビタミン欠除、肥満、感染、免疫 抑制、放射線療法、または化学療法により起される請求項８９に記載の方法。 ９１．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドをその必要のある個体 に投与することを含む、粘膜炎を治療または予防する方法。 ９２．粘膜炎が、口、食道、胃、腸、結腸、直腸、または肛門の粘膜炎から選択 される、請求項９１に記載の方法。 ９３．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドをその必要のある個体 に投与することを含む、炎症性の腸の病気を処置する方法。 ９４．該病気が潰瘍性の大腸炎またはクローン病から選択される請求項９３に記 載の方法。 ９５．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドをその必要のある個体 に投与することを含む炎症を減少させる方法。 ９６．炎症が、乾癬、湿疹、皮膚炎、または関節炎から選択される病気または状 態に関連する請求項９５に記載の方法。 ９７．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドをその必要のある個体 に投与することを含む、毛髪生長を促進する方法。 ９８．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドをその必要のある個体 に投与することを含む、放射線に暴露された組織を処置し、または放射線に暴露 されるべき組織を保護する方法。 ９９．ポリペプチドを、個体の悪性疾患を治療するのに用いる放射線量を増加さ せることを可能にするために投与する請求項９８に記載の方法。 １００．ポリペプチドを、口の損傷、胃腸の損傷、粘膜炎、間質性線維症、直腸 炎、肺線維症、肺炎、胸膜退縮、造血性症候群、または骨髄毒性より選択される 放射線による誘起される状態を処置するために投与する、請求項９８に記載の方 法。 １０１．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドをその必要のある個 体に投与することを含む尿路上皮の治癒を促進する方法。 １０２．有効量の請求項１または４３に記載のポリペプチドをその必要のある個 体に投与することを含む女性の生殖管における組織生長または修復を促進する方 法。