ES2330347T3 - Metodo, chip, dispositivo y sistema integrado para la deteccion de particulas biologicas. - Google Patents
Metodo, chip, dispositivo y sistema integrado para la deteccion de particulas biologicas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2330347T3 ES2330347T3 ES05706792T ES05706792T ES2330347T3 ES 2330347 T3 ES2330347 T3 ES 2330347T3 ES 05706792 T ES05706792 T ES 05706792T ES 05706792 T ES05706792 T ES 05706792T ES 2330347 T3 ES2330347 T3 ES 2330347T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sample
- nucleic acid
- electrodes
- amplification
- biological
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 100
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 43
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 83
- 230000005684 electric field Effects 0.000 claims abstract description 63
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 39
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 209
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 24
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 23
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 18
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 8
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 6
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 28
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000000463 material Substances 0.000 description 27
- 239000003570 air Substances 0.000 description 26
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 25
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 22
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 18
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 17
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 16
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 16
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 14
- VNNRSPGTAMTISX-UHFFFAOYSA-N chromium nickel Chemical group [Cr].[Ni] VNNRSPGTAMTISX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 11
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000010408 film Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 7
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 7
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 6
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 4
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 4
- -1 dirt Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000005686 electrostatic field Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 229910001416 lithium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000000623 plasma-assisted chemical vapour deposition Methods 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 4
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 3
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 3
- 238000005367 electrostatic precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 3
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 3
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N Lithium ion Chemical compound [Li+] HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- UMIVXZPTRXBADB-UHFFFAOYSA-N benzocyclobutene Chemical compound C1=CC=C2CCC2=C1 UMIVXZPTRXBADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000010292 electrical insulation Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052987 metal hydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001465 metallisation Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 2
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000264368 Coptotermes lacteus Species 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 102100037091 Exonuclease V Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 101000881977 Homo sapiens Exonuclease V Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000203367 Methanothermus fervidus Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 206010037688 Q fever Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 241000042515 Tetraselmis rubens Species 0.000 description 1
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 1
- 241000191098 Thermoflexibacter ruber Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical compound OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007591 Tilia tomentosa Species 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000001085 Trapa natans Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 201000006824 bubonic plague Diseases 0.000 description 1
- OJIJEKBXJYRIBZ-UHFFFAOYSA-N cadmium nickel Chemical compound [Ni].[Cd] OJIJEKBXJYRIBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- BIJOYKCOMBZXAE-UHFFFAOYSA-N chromium iron nickel Chemical compound [Cr].[Fe].[Ni] BIJOYKCOMBZXAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003989 dielectric material Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 238000010892 electric spark Methods 0.000 description 1
- 238000009760 electrical discharge machining Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- ZNKMCMOJCDFGFT-UHFFFAOYSA-N gold titanium Chemical compound [Ti].[Au] ZNKMCMOJCDFGFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000083 pulse voltammetry Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000029054 response to nutrient Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000005236 sound signal Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000000992 sputter etching Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001258 titanium gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/02—Devices for withdrawing samples
- G01N2001/021—Correlating sampling sites with geographical information, e.g. GPS
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Procedimiento para detectar una partícula biológica en una muestra gaseosa, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar una cámara de muestra y un primer y segundo electrodos, estando el primer y el segundo electrodos y la cámara de muestra situados de modo que al menos una parte de la cámara de muestra esté entre el primer y el segundo electrodos, siendo la distancia entre el primer y el segundo electrodos de 20 mm como máximo, b) proporcionar una muestra gaseosa en la cámara de muestra, c) aplicar un primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al segundo electrodo, produciéndose por lo tanto una diferencia de potencial y un campo eléctrico entre el primer y el segundo electrodos para contribuir a la recogida electrostática en la cámara de muestra de una partícula biológica de la muestra gaseosa, d) poner en contacto la partícula biológica recogida con un primer reactivo líquido, obteniendo de este modo una mezcla de reacción, e) exponer dicha mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, teniendo dicho campo eléctrico alterno una amplitud suficiente para permitir la extracción de material biológico de la partícula biológica, f) realizar la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana, y g) medir la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o de los productos resultantes de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y, opcionalmente, inferir que la partícula biológica se ha detectado en la muestra si al menos está presente una copia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o si está presente al menos un producto resultante de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana.
Description
Método, chip, dispositivo y sistema integrado
para la detección de partículas biológicas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de partículas biológicas. El
procedimiento de la invención comprende típicamente recoger las
partículas biológicas a partir de una muestra gaseosa, poner en
contacto las partículas biológicas con un primer reactivo líquido,
extraer el material biológico de las partículas biológicas
recogidas y analizar el material biológico para determinar la
presencia de una secuencia de ácido nucleico diana.
Para facilitar una detección rápida de patógenos
de transmisión área capaces de causar epidemias naturales o
deliberadas es importante recoger partículas que contengan o
consistan en dichos patógenos para facilitar una detección rápida.
Las enfermedades que se propagan a través del aire representan un
grave riesgo para la salud de los seres humanos. De acuerdo con la
Organización Mundial de la Salud (OMS) hasta 1000 millones de
personas pueden infectarse con tuberculosis entre 2002 y 2020, de
las que aproximadamente 150 millones enfermarán y 36 millones de
personas morirán de la enfermedad. La primera nueva enfermedad de
transmisión aérea comunicable del siglo 21 es el Síndrome
Respiratorio Agudo Grave (SARS) que tiene el potencial de generar
infecciones de rápida propagación. Pueden temerse paralelismos con
la propagación de la peste ("la Muerte Negra") en la Edad
Media en Europa, cuando aproximadamente 25 millones de personas
murieron en el periodo de 1347 a 1352. La forma más mortal de la
peste es por inhalación de aerosoles infecciosos, donde una cantidad
tan pequeña como 1-10 células de Yersinia
pestis son suficientes para causar enfermedad. Los aerosoles
pueden surgir por la respiración de seres humanos infectados o, lo
que es más amenazador, por liberaciones deliberadas de Y.
pestis por bioterroristas.
Los agentes de guerra biológica (BW) de interés
crítico son esporas bacterianas, tales como Bacillus
anthracis (ántrax), Clostridium tetani (tétanos) y
Clostridium botulinum (botulismo). Las esporas, producidas
por ciertos tipos de bacterias Gram-positivas en
respuesta a privación de nutrientes, no están en desarrollo, son
termorresistentes, están deshidratadas y son resistentes a extremos
de temperatura, pH, desecación, radiación y agentes químicos. Esta
estabilidad las hace una herramienta atractiva para su uso en armas
BW.
Otros microorganismos que podrían usarse para
generar epidemias deliberadas comprenden microorganismos que
causan, por ejemplo, viruela, ébola, encefalitis y fiebre Q. También
se temen los productos de recombinación de origen natural de la
influenza de transmisión aérea con la mortífera gripe aviar. Estos
virus recombinados tienen el potencial de causar pandemias
facilitadas por un desplazamiento aéreo de dimensiones no observadas
hasta ahora.
El documento US 5.674.742 describe un
instrumento microfabricado integrado para manipulación, reacción y
detección de muestras de microlitros a picolitros. El instrumento es
adecuado para reacciones bioquímicas, particularmente reacciones
basadas en ADN tales como la reacción en cadena de la polimerasa,
que requieren termociclado, ya que el tamaño intrínsecamente
pequeño del instrumento facilita tiempos de ciclos rápidos. La
naturaleza integrada del instrumento proporciona un procesamiento
preciso sin contaminación. El instrumento puede incluir depósitos
de reactivo, agitadores y mezcladores, calentadores, bombas y
detectores ópticos o electromecánicos. Pueden usarse dispositivos
ultrasónicos de onda Lamb como detectores, bombas y agitadores.
El documento US 6.586.253 describe un
procedimiento para la detección de contenido celular que contiene
las etapas de introducir una célula en un canal en una microplaca;
lisar la célula para liberar el contenido celular en el canal;
desplazar el contenido de la célula hacia una zona de detección; y
detectar el contenido celular en la zona de detección. Además se
describe un aparato para la detección de contenido celular,
comprendiendo el aparato: una microplaca; un canal de movilización
de células formado en la microplaca, teniendo el canal de
movilización de células un extremo de introducción de células y un
extremo de detección; un movilizador de células conectado
operativamente con el extremo de introducción de células para
desplazar las células desde el extremo de introducción de células
hasta el extremo de detección; medios para lisar células en el canal
de movilización de células en una zona de lisis, localizándose la
zona de lisis entre el extremo de introducción de células y el
extremo de detección; y un detector, colocado adyacente al extremo
de detector, dispuesto para detectar el contenido celular que
aparezca en el extremo de detector que se ha desplazado desde la
zona de lisis hasta el extremo de detector por el movilizador de
células.
El documento US 6.673.621 describe un
dispositivo adecuado para marcar una muestra recogida, que comprende
medios de recogida para recoger la muestra y al menos un marcador
detectable que está asociado con al menos una porción del medio de
recogida, donde el al menos un marcador detectable puede entrar en
contacto con la muestra tras la recogida de la muestra para marcar
la muestra recogida tras el contacto de la muestra con al menos una
porción del medio de recogida que tiene el al menos un marcador
detectable asociado con el mismo, y donde el al menos un marcador
detectable es distinto de un componente que está presente en la
muestra antes de la recogida y es inerte a cualquier componente
presente en la muestra antes de la recogida. Describe además kits
que contienen el dispositivo, procedimientos para marcar muestras
usando el dispositivo y procedimientos para determinar la
integridad de una muestra marcada, y también se proporciona el uso
de los marcadores para el ensayo de laboratorios y/o personal de
laboratorio para fines de certificación, ensayo de competencia o
acreditación.
El documento WO00/26405 describe un aparato y un
procedimiento para lisar una célula o una espora para exponer el
material nuclear contenido en el interior de una membrana
superficial de la célula o la espora. El procedimiento incluye la
etapa de generar una descarga ionizante. Se proporciona una
superficie en la que se coloca una célula que se va a lisar o que
se ha lisado. La célula o la espora se exponen después a la descarga
ionizante durante al menos un intervalo de tiempo predefinido, de
modo que la descarga ionizante rompe la membrana superficial de la
célula o la espora, exponiendo el material nuclear del interior de
la célula o la espora.
El documento US 6.511.831 describe un
procedimiento para el aislamiento y purificación de ácidos nucleicos
a partir de una muestra, en particular un material biótico o
abiótico. El procedimiento contiene las etapas de aislar ácidos
nucleicos a partir de una muestra seleccionada del grupo que
consiste en células procariotas, células eucariotas, virus,
orgánulos celulares, núcleos celulares y liposomas, que comprenden
disociar la muestra por aplicación a la misma de al menos un campo
eléctrico, para liberar los ácidos nucleicos de la muestra, poner
los ácidos nucleicos liberados en contacto con un material capaz de
unirse a ácidos nucleicos en condiciones de unión; y separar los
ácidos nucleicos unidos del resto de la muestra.
Un objeto de la presente invención se refiere al
suministro de un procedimiento para realizar una detección rápida
de partículas biológicas.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a un suministro de un procedimiento para realizar una detección
sensible de partículas biológicas.
Otro objeto más de la presente invención se
refiere a un suministro de un procedimiento adecuado para realizar
una detección descentralizada y preferiblemente totalmente
automatizada de partículas biológicas.
Otro objeto más de la presente invención se
refiere al suministro de un procedimiento para realizar la
detección de partículas biológicas con una manipulación de muestra
manual mínima.
Otro objeto más de la presente invención se
refiere al suministro de un procedimiento para realizar la
detección de partículas biológicas, usando el procedimiento un
mínimo de energía para la detección.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
se refiere al suministro de la recogida directa de partículas
biológicas a partir de muestras gaseosas tales como muestras de
aire.
Otro objeto de la presente invención se refiere
al suministro de procedimientos para sobreconcentrar partículas
biológicas a partir de una muestra gaseosa de gran tamaño en un
volumen mucho menor, es decir, aumentar la concentración de las
partículas biológicas.
Otro objeto más de la presente invención se
refiere al suministro de procedimientos en los que se realiza la
recogida y sobreconcentración de las partículas biológicas en la
misma estructura y preferiblemente también en la misma etapa.
Otro objeto más de la presente invención se
refiere al suministro de procedimientos que permiten fácilmente un
análisis adicional de partículas biológicas recogidas.
Un objeto adicional de la presente invención se
refiere al suministro de procedimientos que permiten fácilmente un
análisis adicional de partículas biológicas recogidas.
Además, un objeto de la invención se refiere a
un suministro de procedimientos que recojan partículas biológicas
con una alta eficacia de captura.
Otros objetos de la invención serán evidentes
cuando se lea la descripción y los ejemplos.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un procedimiento para detectar una partícula biológica a partir de
una muestra gaseosa, comprendiendo el procedimiento las etapas
de:
- a)
- proporcionar una cámara de muestra y un primer y segundo electrodos, estando el primer y el segundo electrodo y la cámara de muestra situados de tal modo que al menos una parte de la cámara de muestra esté entre el primer y el segundo electrodo, siendo la distancia entre el primer y el segundo electrodo como máximo de 20 mm,
- b)
- proporcionar una muestra gaseosa en la cámara de muestra,
- c)
- aplicar un primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al segundo electrodo, produciéndose por lo tanto una diferencia de potencial y un campo eléctrico entre el primer y segundo electrodos para contribuir a la recogida electrostática en la cámara de muestra de una partícula biológica a partir de la muestra gaseosa,
- d)
- poner en contacto la partícula biológica recogida con un primer reactivo líquido, obteniéndose de este modo una mezcla de reacción,
- e)
- exponer dicha mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, teniendo dicho campo eléctrico alterno una amplitud suficiente para extraer material biológico de la partícula biológica,
- f)
- realizar la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana, y
- g)
- medir la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o de los productos resultantes de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y, opcionalmente, inferir que la partícula biológica se ha detectado en la muestra si al menos está presente una copia de secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o si está presente al menos un producto resultante de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana.
Se describe una microplaca para detectar una
partícula biológica a partir de una muestra gaseosa, comprendiendo
la microplaca
- -
- una cámara de muestra, por ejemplo, que comprende una primera abertura en conexión fluida con el aire circundante y
- -
- una segunda abertura para formar una conexión fluida con un dispositivo, comprendiendo la cámara de muestra una muestra gaseosa.
Se describe un dispositivo para detectar una
partícula biológica a partir de una muestra gaseosa, comprendiendo
el dispositivo:
- -
- un sitio de microplaca donde se va a localizar una microplaca para asociarse funcionalmente con el dispositivo,
- -
- una interfaz eléctrica entre el dispositivo y la microplaca para aplicar un campo eléctrico alterno entre los electrodos de la cámara de muestra y
- -
- una unidad programable que comprende un programa informático que logra que el dispositivo realice una o más acciones seleccionadas del grupo que consiste en:
- -
- proporcionar una muestra gaseosa en la cámara de muestra,
- -
- aplicar un primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al segundo electrodo, produciéndose por lo tanto una diferencia de potencial y un campo eléctrico entre el primer y segundo electrodos, para contribuir a la recogida electrostática en la cámara de muestra de una partícula biológica presente en la muestra gaseosa,
- -
- poner en contacto la partícula biológica recogida con un primer reactivo líquido,
- -
- exponer una mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, teniendo dicho campo eléctrico alterno una amplitud suficiente para extraer material biológico de la partícula biológica,
- -
- realizar la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana,
medir la presencia de la secuencia de ácido
nucleico diana amplificada y/o medir los productos resultantes de
la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana.
Se describe un sistema para detectar una
partícula biológica a partir de una muestra gaseosa, comprendiendo
el sistema una microplaca como se define en este documento
funcionalmente asociada con un dispositivo como se define en este
documento.
En lo siguiente se describirán algunas
realizaciones de la presente invención con respecto a las figuras,
en las que
La Figura 1 ilustra la sección transversal de
dos realizaciones ejemplares de la microplaca,
La Figura 2 muestra el sustrato de silicio del
Ejemplo 1,
La Figura 3 muestra la Capa de aislamiento
térmico del Ejemplo 1,
La Figura 4 muestra la Capa calentadora del
Ejemplo 1,
La Figura 5 muestra la Capa de contacto 1 del
Ejemplo 1,
La Figura 6 muestra la Capa de aislamiento
eléctrico 1 del Ejemplo 1,
La Figura 7 muestra la Capa de platino 1 del
Ejemplo 1,
La Figura 8 muestra la Capa de contacto 2 del
Ejemplo 1,
La Figura 9 muestra la Capa de aislamiento
eléctrico 2 del Ejemplo 1,
La Figura 10 muestra la Planarización 1 del
Ejemplo 1,
La Figura 11 muestra el Espaciador del Ejemplo
1,
La Figura 12 muestra la Tapa del Ejemplo 1,
y
La Figura 13 muestra la microplaca final del
Ejemplo 1.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un procedimiento para detectar una partícula biológica a partir de
una muestra gaseosa, comprendiendo el procedimiento las etapas
de:
- a)
- proporcionar una cámara de muestra y un primer y un segundo electrodos, estando el primer y el segundo electrodos y la cámara de muestra situados de modo que al menos una parte de la cámara de muestra esté entre el primer y el segundo electrodos, siendo la distancia entre el primer y el segundo electrodos, como máximo, de 20 mm,
- b)
- proporcionar una muestra gaseosa en la cámara de muestra,
- c)
- aplicar un primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al segundo electrodo, produciéndose una diferencia de potencial y un campo eléctrico entre el primer y el segundo electrodos para contribuir a la recogida electrostática en la cámara de muestra de una partícula biológica a partir de la muestra gaseosa,
- d)
- poner en contacto la partícula biológica recogida con un primer reactivo líquido, obteniéndose de este modo una mezcla de reacción,
- e)
- exponer dicha mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, teniendo dicho campo eléctrico alterno una amplitud suficiente para extraer material biológico de la partícula biológica,
- f)
- realizar la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana, y
- g)
- medir la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o productos resultantes de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana e inferir opcionalmente que la partícula biológica se ha detectado en la muestra si está presente al menos una copia de secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o si está presente al menos un producto resultante de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "partícula biológica" se refiere a una partícula que
comprende, por ejemplo, un microorganismo y/o un virus y/o un
fragmento del mismo.
El término "y/o" usado en el contexto de
"X y/o Y" debe interpretarse como "X" o "Y", o "X e
Y".
El microorganismo, por ejemplo, puede
seleccionarse del grupo que consiste en un microorganismo
arqueobacteriano, un microorganismo eubacteriano o un
microorganismo eucariota.
Por ejemplo, el microorganismo puede
seleccionarse del grupo que consiste en una bacteria, una espora
bacteriana, un virus, un hongo y una espora fúngica.
En una realización preferida de la invención, el
microorganismo es un microorganismo de transmisión aérea.
La partícula biológica también puede comprender
una espora vegetal o un fragmento de la misma.
En una realización preferida de la invención, el
microorganismo es una espora bacteriana.
Por ejemplo, la espora bacteriana puede formarse
por una bacteria seleccionada del género Bacillus y/o del género
Clostridium.
En una realización preferida de la invención, la
espora bacteriana es una espora formada por Bacillus
anthracis. La partícula biológica puede comprender, por ejemplo,
una espora bacteriana formada por Bacillus anthracis.
Además, la partícula biológica puede consistir esencialmente en una
o más esporas bacterianas formadas por Bacillus
anthracis.
La expresión "muestra gaseosa" se refiere a
una muestra que comprende uno o más gases y posiblemente también
partículas biológicas. La muestra gaseosa puede ser, por ejemplo,
una muestra de aire, tal como muestras de aire ambientales, una
muestra de aire resultante de una succión al vacío de materiales en
polvo tales como tierra, arena, polvo o polvo no identificado. La
muestra gaseosa a examinar puede tener su origen en una persona que
exhala una muestra respiratoria que contiene o es susceptible de
contener microorganismos.
De acuerdo con la presente invención, las
expresiones "cámara de muestra", "recipiente" y "cámara
de reacción" se usan indistintamente.
En una realización preferida de la invención, la
cámara de muestra está compuesta por una microplaca, es decir, un
cartucho o una biomicroplaca. La cámara de muestra puede estar
compuesta, por ejemplo, por una microplaca como se define en este
documento.
En una realización preferida, el primer y
segundo electrodos están situados en lados opuestos de la cámara de
muestra.
En una realización de la invención, el primer
y/o el segundo electrodos tienen una forma sustancial seleccionada
del grupo que consiste en una lámina, una placa, un disco, un
alambre, una varilla o cualquier combinación de los mismos. En la
presente invención se prefiere que al menos un electrodo tenga una
forma de lámina y se prefiere aún más que tanto el primer como el
segundo electrodos tengan formas de láminas.
En una realización de la invención, el primer y
el segundo electrodos están separados por una distancia que es,
como máximo, de 20 mm, que preferiblemente es como máximo de 20 mm,
tal como de 15 mm, 10 mm, 9 mm, 8 mm, 7 mm, 6 mm o 5 mm como máximo
o de 4 mm como máximo, siendo la distancia más preferiblemente como
máximo de 3 mm, y aún más preferiblemente como máximo de 0,5 mm,
tal como de 0,3 mm, 0,2 mm o 0,1 mm como máximo, tal como de 0,05
mm como máximo.
Por ejemplo, el primer y el segundo electrodos
pueden estar separados por una distancia en intervalo de
0,05-20 mm, tal como en el intervalo de
0,05-0,1, 0,1-0,2,
0,2-0,3, 0,3-0,4,
0,4-0,5, 0,5-1, 1-2,
2-5, 5-10, o 10-15
mm, tal como en el intervalo de 15-20 mm.
Típicamente, el primer y segundo electrodos
pueden estar separados por una distancia que es de al menos 0,02
mm, tal como de al menos 0,03 mm o 0,05 mm.
En la etapa c), se recogen una o más partículas
biológicas a partir de la muestra gaseosa. La recogida de
partículas biológicas puede realizarse de acuerdo con el
procedimiento y usando la microplaca, dispositivo y sistema
descritos en la solicitud PCT en trámite junto con la presente
"Method, chip, device and system for collection of biological
particles" (Procedimiento, microplaca, dispositivo y sistema para
recoger partículas biológicas).
En una realización de la invención, las
partículas biológicas se recogen a partir de la muestra gaseosa
mientras que la muestra gaseosa está fluyendo a través de la cámara
de muestra. En otra realización, las partículas biológicas se
recogen a partir de la muestra gaseosa mientras que la muestra
gaseosa se hace recircular a través de la cámara de muestra, es
decir, la muestra gaseosa pasa a través de la cámara de muestra más
de una vez, para aumentar la eficacia de captura. Por ejemplo,
cuando se recircula, la muestra gaseosa puede fluir a través de la
cámara de muestra al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10
veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 75 veces,
tal como al menos 100 veces. La muestra gaseosa puede fluir, por
ejemplo, a través de la muestra un número de veces en el intervalo
de 2-200, tal como 2-50 veces,
50-100 veces o 100-200 veces.
En una realización de la invención, la muestra
gaseosa se proporciona en la cámara de muestra por medio de un
flujo de gas. Durante la recogida de partículas biológicas, el flujo
de gas tiene típicamente una velocidad de flujo que varía
preferiblemente de aproximadamente 5-1000
ml/minuto.
En una realización de la invención, el flujo de
gas se ha interrumpido antes de que se recojan las partículas
biológicas a partir de la muestra de gas.
Normalmente, al menos una parte de la muestra
gaseosa en la cámara de muestra se sitúa o fluye entre el primer y
el segundo electrodos. Por ejemplo, al menos el 40% del volumen de
la muestra gaseosa se sitúa o fluye entre el primer y segundo
electrodos, tal como al menos el 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97,5, 99,
99,5 ó 99,9% del volumen de la muestra gaseosa se sitúa o fluye
entre el primer y el segundo electrodos, tal como al menos el 100%
del volumen de la muestra gaseosa se sitúa o fluye entre el primer y
el segundo electrodos.
En una realización más de la invención, el campo
eléctrico del primer y segundo electrodos se selecciona para dar
una eficacia de captura de al menos el 50% para partículas
biológicas que tienen una longitud eficaz en el intervalo de
1-10 micrómetros.
La magnitud del campo eléctrico puede
seleccionarse del grupo de: 50 V/mm, 100 V/mm, 200 V/mm, 300 V/mm,
400 V/mm, 500 V/mm, 600 V/mm, 700 V/mm, 800 V/mm, 900 V/mm, 1000
V/mm, 1100 V/mm, 1200 V/mm, 1300 V/mm, 1400 V/mm, 1500 V/mm, 1600
V/mm, 1700 V/mm, 1800 V/mm, 1900 V/mm, 2000 V/mm.
Por ejemplo, la magnitud del campo eléctrico
puede estar en el intervalo de 50-2000 V/mm, tal
como en el intervalo de 50-100,
100-200, 200-300,
300-400, 400-500,
500-750, 750-1000,
1000-1200 V/mm, 1200-1500 V/mm, tal
como en el intervalo de 1500-2000 V/mm.
En una realización preferida de la invención, el
primer y el segundo electrodos están cargados respectivamente
negativa y positivamente o viceversa. Por ejemplo, si la diferencia
de potencial entre los dos electrodos es de 400 V, el electrodo
cargado negativamente puede tener un potencial de -200 V con
respecto a tierra y el electrodo cargado positivamente puede tener
un potencial de 200 V con respecto a tierra.
En una realización altamente preferida de la
invención, el primer potencial del primer electrodo y el segundo
potencial del segundo electrodo, y por lo tanto el campo eléctrico
entre el primer y el segundo electrodos, se seleccionan para dar
una eficacia de captura de al menos el 50% para partículas
biológicas que tiene una longitud eficaz en el intervalo de
1-10 micrómetros, tal como una eficacia de captura
de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 80% y más
preferiblemente de al menos el 90%, tal como de al menos el 95%,
97,5%, 99, 99,5 ó 99,9%, tal como aproximadamente del 100%.
Preferiblemente, la eficacia de captura se
determina de acuerdo con el procedimiento estandarizado del Ejemplo
2.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "longitud eficaz" de una partícula es el diámetro
aerodinámico de la partícula, por ejemplo, medido por dispersión de
luz láser (O'Brien et al 1986). El diámetro aerodinámico de
una partícula, d_{pa}, puede estimarse mediante la fórmula
d_{pa} =
d_{ps} \cdot \sqrt{\rho
_{o}}
donde d_{ps} es el diámetro de
Stoke en \mum y \rho_{p} es la densidad de partículas en
g/cm^{3}.
En una realización preferida de la invención,
las partículas biológicas recogidas de la cámara de muestra entran
en contacto con un primer reactivo líquido. Puede preferirse que las
partículas biológicas entren en contacto mientras aún están
localizadas entre el primer y el segundo electrodos.
En la etapa d), la partícula biológica recogida
se pone en contacto con un primer reactivo líquido y la mezcla
resultante se denomina la mezcla de reacción.
El primer reactivo líquido comprende uno o más
reactivos necesarios para realizar una amplificación de ácido
nucleico.
El primer reactivo líquido puede comprender uno
o más reactivos seleccionados del grupo que consiste en un cebador,
un ácido nucleico, un nucleótido trifosfato y una polimerasa de
ácido nucleico.
El primer reactivo líquido puede comprender
además aditivos tales como 2-mercaptoetanol, por
ejemplo, en una concentración de 10 mM, BSA, por ejemplo, en una
concentración de 1 mg/ml y/o un detergente, por ejemplo, en una
concentración del 0,5% al 6% (p/v). El detergente puede
seleccionarse del grupo que consiste en Triton
X-100, Triton X-114,
NP-40, Tween20, Tween80 y detergentes no iónicos
similares.
En el presente contexto, la expresión "ácido
nucleico", "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de
ácido nucleico" debe interpretarse ampliamente y, por ejemplo,
puede ser un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o
ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. Esta
expresión incluye moléculas compuestas por nucleobases de origen
natural, azúcares y enlaces internucleosídicos (estructurales)
covalentes, así como moléculas que tienen nucleobases no naturales,
azúcares y enlaces internucleosídicos (estructurales) covalentes
que funcionan de forma similar o combinaciones de los mismos. Dichos
ácidos nucleicos modificados o sustituidos pueden preferirse sobre
las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por
ejemplo, una mayor afinidad por la molécula diana de ácido nucleico
y mayor estabilidad en presencia de nucleasas y otras enzimas, y se
describen en el presente contexto mediante las expresiones
"análogos de ácidos nucleicos" o "miméticos de ácidos
nucleicos". Son ejemplos preferidos de miméticos de ácidos
nucleicos moléculas que comprenden ácido peptidonucleico (PNA),
ácido nucleico bloqueado (LNA), xilo-LNA-,
fosforotioato-, 2'-metoxi-,
2'-metoxietoxi-, morfolino- y fosforamidato- o
derivados de ácidos nucleicos funcionalmente similares.
La expresión "polimerasa de ácido nucleico"
se refiere a una enzima ADN polimerasa dependiente de ADN o ARN que
preferiblemente es termoestable, es decir, la enzima cataliza la
formación de productos de la extensión de cebadores complementarios
a un molde y no se desnaturaliza de forma irreversible cuando se
somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para
lograr la desnaturalización de ácidos nucleicos de molde
bicatenarios. Generalmente, la síntesis se inicia en el extremo 3'
de cada cebador y avanza en la dirección 5' a 3' a lo largo de la
cadena molde. Se han aislado polimerasas termoestables a partir de
cepas termófilas o extremadamente termófilas tales como Thermus
flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T.
rubens, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus, Bacillus
stearothermophilus y Methanothermus fervidus. No
obstante, también pueden emplearse polimerasas que no sean
termoestables en la amplificación de ácidos nucleicos siempre que
se reponga la enzima.
El primer reactivo líquido puede comprender
además una oligosonda de ácido nucleico degradable por exonucleasa
5'-3', dando como resultado la degradación de dicha
sonda de ácido nucleico la liberación de un componente redox
activo.
El componente redox activo puede ser, por
ejemplo, un metaloceno, tal como, por ejemplo, ferroceno.
En la etapa e), la mezcla de reacción se expone
a un campo eléctrico alterno. El campo eléctrico alterno puede
proporcionarse por el primer y segundo electrodos que proporcionan
el campo eléctrico para la recogida o pueden proporcionarse por
otro conjunto de electrodos.
La extracción del material biológico puede
realizarse de acuerdo con el procedimiento y usando la microplaca,
dispositivo y sistema descritos en la solicitud PCT en trámite junto
con la presente "Method, chip, device and system for extracción
of biological material" (Procedimiento, microplaca, dispositivo y
sistema para la extracción de material biológico).
En una realización preferida de la invención, la
parte de la mezcla de reacción expuesta sobre la que se realiza un
análisis genético adicional constituye al menos el 20% de la mezcla
de reacción en la cámara de muestra, tal como al menos el 30, 40,
50, 60, 70, 80, 90, 95, 97,5, 99, 99,5, ó 99,9% de la mezcla de
reacción en la cámara de muestra, tal como al menos aproximadamente
el 100% de la mezcla de reacción en la cámara de muestra.
De acuerdo con la presente invención, los
términos "extracción" y "extraer" se refieren a liberar
material biológico de dicha una o más células biológicas, es decir,
por ejemplo, hacer que esté disponible para un análisis adicional
en la mezcla de reacción. Los términos "extracción" y
"extraer" también se refieren, por ejemplo, a abrir o romper
la pared celular o barrera celular de la partícula biológica.
El material biológico extraído a partir de la
partícula biológica comprenderá típicamente un componente
seleccionado del grupo que consiste en un orgánulo celular, un
material genético y una proteína.
El material genético puede comprender, por
ejemplo, ADN cromosómico y/o ADN plasmídico y/o cualquier tipo de
ARN.
La proteína puede seleccionarse, por ejemplo,
del grupo que consiste en enzimas, proteínas estructurales,
proteínas de transporte, canales iónicos, toxinas, hormonas y
receptores.
Preferiblemente, el material biológico comprende
ADN y/o ARN.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "campo eléctrico alterno" se refiere a campos
eléctricos que cambian con el tiempo. El campo eléctrico alterno
puede ser, por ejemplo, el campo eléctrico que se produce por un
cambio periódico de la polaridad de dos electrodos entre
positivo/negativo y negativo/positivo, es decir, por conexión de
una fuente de CA a los electrodos. El campo eléctrico alterno puede
comprender o ser, por ejemplo, un campo de CA. El campo eléctrico
alterno puede comprender, por ejemplo, uno o más pulsos de CC.
Es importante que el campo eléctrico alterno
tenga una amplitud suficiente y se aplique durante un tiempo
suficiente para extraer el material biológico. También puede ser
importante que el campo eléctrico alterno tenga además una
frecuencia suficiente para extraer el material biológico.
En una realización preferida de la invención, la
frecuencia del campo eléctrico alterno es de al menos 5 kHz, siendo
preferiblemente de al menos 20 kHz y, siendo más preferiblemente de
al menos 50 kHz.
En otra realización preferida de la invención,
la frecuencia del campo eléctrico alterno es de al menos 100 kHz,
siendo preferiblemente de al menos 250 kHz y siendo más
preferiblemente de al menos 500 kHz.
Por ejemplo, la frecuencia del campo eléctrico
alterno puede ser de al menos 5 kHz, tal como de al menos 10, 20,
50, 100, 200, 300 ó 400 kHz, tal como de al menos 500 kHz. Se prevén
frecuencias incluso mayores tales como de 1000 kHz, 2000 kHz o 5000
kHz.
Preferiblemente, la frecuencia del campo
eléctrico alterno es como máximo de 750 kHz, tal como de 500 kHz
como máximo.
Por lo tanto, la frecuencia del campo eléctrico
alterno puede estar, por ejemplo, en el intervalo de
5-750 kHz, tal como en el intervalo de
5-10, 10-20, 20-50,
50-100, 100-200,
200-300, 300-400 ó
400-500 kHz, tal como en el intervalo de
500-750 kHz. Preferiblemente, la frecuencia del
campo eléctrico alterno puede estar, por ejemplo, en el intervalo
de 60-750 kHz, tal como 70-750 kHz,
80-750 kHz, 90-750 kHz o
100-750 kHz.
La amplitud del campo eléctrico alterno, es
decir, la diferencia de potencial máxima entre el primer y el
segundo electrodos es típicamente, como máximo, de 30 V, tal como de
25, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 ó 2 V como máximo, tal como de 1 V
como máximo.
La amplitud del campo eléctrico alterno, es
decir, la diferencia de potencial máxima entre el primer y el
segundo electrodos, puede estar, por ejemplo, en el intervalo de
1-30 V, tal como en el intervalo de
1-2, 2-3, 3-4,
4-5, 5-6, 6-8,
8-10, 10-15, 15-20 ó
20-25 V, tal como en el intervalo de
25-30 V.
Una medida interesante de la extracción de
material biológico es el porcentaje de liberación de ADN/ARN. El
"porcentaje de liberación de ADN/ARN" es el porcentaje de
células biológicas en la cámara de muestra que liberan su ADN y/o
ARN debido a la exposición en la etapa c) al campo eléctrico
alterno. El porcentaje de liberación de ADN/ARN se determina de
acuerdo con el procedimiento estandarizado descrito en el Ejemplo
3.
La extracción, y por lo tanto el porcentaje de
liberación de ADN/ARN de células biológicas en la cámara de muestra
o en una microplaca que comprende la cámara de muestra, depende
enormemente del diseño de y de la distancia entre el primer y el
segundo electrodos, la estructura y materiales de la cámara de
muestra y los potenciales aplicados al primer y segundo
electrodos.
En una realización altamente preferida de la
invención, el primer potencial del primer electrodo y el segundo
potencial del segundo electrodo, y por lo tanto el campo eléctrico
alterno entre el primer y el segundo electrodos, se modulan para
dar un porcentaje de liberación de ADN/ARN de al menos el 30%, tal
como un porcentaje de liberación de ADN/ARN de al menos el 40%,
preferiblemente de al menos el 50%, y más preferiblemente de al
menos el 60%, tal como de al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99,
99,5 ó 99,9%, tal como de aproximadamente el 100%.
En otra realización preferida de la invención,
el primer potencial del primer electrodo y el segundo potencial del
segundo electrodo, y por lo tanto el campo eléctrico alterno entre
el primer y el segundo electrodos, se modulan para dar un
porcentaje de liberación de ADN/ARN de al menos el 30% de las
esporas bacterianas en la cámara de muestra, tal como un porcentaje
de liberación de ADN/ARN de al menos el 40%, preferiblemente de al
menos el 50% y, más preferiblemente, de al menos el 60% de las
esporas bacterianas en la cámara de muestra, tal como de al menos
el 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99, 99,5 ó 99,9%, tal como de
aproximadamente el 100% de las esporas bacterianas en la cámara de
muestra.
En una realización preferida, el campo eléctrico
alterno se proporciona por modulación de la polaridad de los dos
electrodos.
El campo eléctrico alterno puede tener una forma
sustancial seleccionada del grupo que consiste en: rectangular,
sinusoidal, diente de sierra, triangular asimétrica, triangular
simétrica; o cualquier combinación de las mismas.
Además, el campo eléctrico alterno, en el
dominio de frecuencia, puede comprender al menos un primer y un
segundo componentes de frecuencia.
En una realización de la invención, la mezcla de
reacción se expone al campo eléctrico alterno durante 3600 segundos
como máximo, tal como durante 3000, 2000, 1000, 500, 250, 100, 50,
40, 30, 20, 10, 5, 4 ó 3 segundos como máximo, tal como durante 1
segundo como máximo.
Por ejemplo, la mezcla de reacción puede
exponerse al campo eléctrico alterno en el intervalo de
0,01-3600 segundos, tal como en el intervalo de
0,1-1, 1-5, 5-10,
10-25, 25-50,
50-100, 100-250,
250-500, 500-1000 ó
1000-2000 segundos, tal como en el intervalo de
2000-3600 segundos.
En una realización preferida de la invención, la
mezcla de reacción se expone al campo eléctrico alterno durante 250
segundos como máximo, preferiblemente durante 100 segundos como
máximo, tal como durante 30 segundos como máximo.
La etapa f) comprende realizar una amplificación
de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana.
Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico diana se selecciona
para que sea específica para la partícula biológica.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "secuencia de ácido nucleico diana" (TNAS) se refiere
a una secuencia de ácido nucleico de especial interés, por ejemplo,
para fines analíticos o de diagnóstico. La TNAS puede ser, por
ejemplo, un gen o un fragmento de un gen.
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "amplificación de ácido nucleico" se refiere a un
proceso en el que un molde, por ejemplo un fragmento del ácido
nucleico que comprende la TNAS, se copia en varias copias.
En una realización preferida de la invención, la
amplificación de ácido nucleico de la etapa f) se realiza usando
una técnica de amplificación seleccionada del grupo que consiste en
técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA), amplificación
por círculo rodante mediada por ligación (L-RCA) y
sus combinaciones/modificaciones. Estos procedimientos, así como la
PCR, son bien conocidos por el especialista en la técnica y se
describen, por ejemplo, en Sambrook et al.
Preferiblemente, la amplificación de ácido
nucleico de la etapa f) es PCR. La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es una de las técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos más usada comúnmente. Las Patentes de Estados Unidos Nº
4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188 describen realizaciones
de la técnica de PCR. LA PCR emplea típicamente dos cebadores
oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico
seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Un cebador puede purificarse
a partir de un producto de digestión de restricción por
procedimientos convencionales o puede producirse sintéticamente.
Preferiblemente, el cebador es monocatenario para una eficacia
máxima de amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. Los
cebadores bicatenarios primero se desnaturalizan, es decir, se
tratan para separar las cadenas. Un procedimiento de
desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios es por
calentamiento.
Después de desnaturalizar por calor el ácido
nucleico bicatenario, la mezcla de reacción se deja enfriar a una
temperatura que promueva la hibridación de cada cebador a la
secuencia de ácido nucleico que comprende la TNAS. La temperatura
para la hibridación es habitualmente de aproximadamente 35ºC a
aproximadamente 65ºC. El tiempo de hibridación es típicamente de
aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 1 min. Después, la
mezcla de reacción se ajusta a una temperatura a la que se promueva
u optimice la actividad de la polimerasa, es decir, una temperatura
suficiente para que se produzca la extensión a partir del cebador
hibridado para generar productos complementarios al ácido nucleico
molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un
producto de extensión a partir de cada cebador que se hibride con un
molde de ácido nucleico pero no debe ser tan alta como para
desnaturalizar un producto de extensión a partir de su molde
complementario (por ejemplo, la temperatura para la extensión varía
generalmente de aproximadamente 40ºC a 80ºC). El tiempo de extensión
es normalmente de aproximadamente 5 segundos (ajustes en
laboratorio en microplaca) a aproximadamente 5 minutos.
De acuerdo con la presente invención, el término
"cebador" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es
capaz de hibridar, por ejemplo, con la TNAS, con una secuencia de
ácido nucleico próxima a la secuencia diana o con una secuencia de
ácido nucleico que solape con la TNAS. Como alternativa, un cebador
puede ser capaz de hibridar con la secuencia complementaria de la
TNAS, con la secuencia complementaria de una secuencia de ácido
nucleico próxima a la TNSA o con la secuencia complementaria de una
secuencia de ácido nucleico que solape con la
TNAS.
TNAS.
Los cebadores comprenden típicamente
oligonucleótidos, es decir, moléculas de ácido nucleico que
comprenden en el intervalo de 5-30 nucleótidos, tal
como en el intervalo de 5-10 nucleótidos,
10-15 nucleótidos, 15-20
nucleótidos, 20-25 nucleótidos y
25-30 nucleótidos. También se prevé que pueden
usarse moléculas de ácido nucleico de mayor longitud como
cebadores. Por lo tanto, un cebador puede comprender una molécula de
ácido nucleico que comprenda en el intervalo de
30-50 nucleótidos, tal como en el intervalo de
30-35 nucleótidos, 35-40
nucleótidos, 40-45 nucleótidos y
45-50 nucleótidos.
Por ejemplo, un cebador puede consistir
esencialmente en un oligonucleótido, es decir, moléculas de ácido
nucleico que consisten esencialmente en el intervalo de
5-30 nucleótidos, tal como en el intervalo de
5-10 nucleótidos, 10-15 nucleótidos,
15-20 nucleótidos, 20-25 nucleótidos
y 25-30 nucleótidos. Además, un cebador puede ser
una molécula de ácido nucleico que consista esencialmente en el
intervalo de 30-50 nucleótidos, tal como en el
intervalo de 30-35 nucleótidos,
35-40 nucleótidos, 40-45 nucleótidos
y 45-50 nucleótidos.
Se prefiere especialmente que la amplificación
de ácido nucleico de la etapa f) sea una PCR anidada. La PCR
anidada usa al menos dos pares de cebadores, es decir, un par de
cebadores externos y un par de cebadores internos. En un par de
cebadores, un cebador, el cebador con sentido, se diseña típicamente
para ser capaz de hibridar con la cadena de ácido nucleico que
comprende la cadena de TNAS. El otro cebador, el cebador
antisentido, se diseña típicamente para ser capaz de hibridar con
la cadena de ácido nucleico complementaria de la cadena de ácido
nucleico que comprende la cadena de TNAS. En primer lugar se realiza
un proceso de PCR que implica al par externo de cebadores,
enriqueciendo de este modo la mezcla de reacción con moléculas de
ácido nucleico que comprenden la TNAS o fragmentos de la misma y
reduciendo la interferencia de otras secuencias de ácido nucleico
de la mezcla de reacción. A continuación se realiza un proceso de
PCR que implica al par interno de cebadores, amplificando por lo
tanto específicamente la TNAS un fragmento de la misma.
Se prefiere aún más realizar una PCR anidada en
un formato de un solo tubo, es decir, una PCR anidada en la que
tanto el par de cebadores externos como el par de cebadores internos
estén presentes en la mezcla de reacción al mismo tiempo. Una
ventaja principal del uso de PCR anidada en un solo tubo en el
contexto de sistemas de detección automatizados y, por ejemplo,
basados en microplacas, es que la complejidad de la manipulación de
líquido se reduce espectacularmente en comparación con una PCR
anidada convencional en la que los pares de cebadores externo e
interno tienen que añadirse en la mezcla de reacción de forma
secuencial.
Típicamente, la temperatura de fusión (Tm) del
par de cebadores externos es al menos 2ºC superior a la Tm del par
de cebadores internos. Esta diferencia en la Tm hace posible
realizar el proceso de PCR exclusivamente con el par de cebadores
externos manteniendo la temperatura de hibridación por encima de la
Tm del par de cebadores internos. El proceso de PCR que implica el
par de cebadores internos se inicia por reducción de la temperatura
de hibridación por debajo de la Tm del par de cebadores
internos.
\newpage
Por ejemplo, puede realizarse una PCR anidada en
un solo tubo, por ejemplo, mediante el procedimiento que comprende
las etapas de:
- i)
- ciclar, al menos dos veces, la temperatura de la mezcla de reacción entre una primera temperatura de desnaturalización, una primera temperatura de hibridación y una primera temperatura de extensión, siendo la primera temperatura de hibridación similar a o inferior a la menor Tm del par de cebadores externos y superior a la mayor Tm del par de cebadores internos y
- ii)
- ciclar, al menos dos veces, la temperatura de la mezcla de reacción entre una segunda temperatura de desnaturalización, una segunda temperatura de hibridación y una segunda temperatura de extensión, siendo la segunda temperatura de hibridación similar a o inferior a la menor Tm del par de cebadores inter-nos.
El proceso de PCR anidada en un solo tubo y la
detección pueden realizarse, por ejemplo, de acuerdo con los
procedimientos y usando los kits que se describen en la solicitud
PCT en trámite junto con la presente "Method, kit and system for
enhanced Nested PCR" (Procedimiento, kit y sistema para una PCR
anidada mejorada).
La etapa g) implica medir la presencia de la
secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o productos
resultantes de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico
diana y, opcionalmente, inferir que la partícula biológica se ha
detectado en la muestra si está presente al menos una copia de
secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o está presente al
menos un producto resultante de la amplificación de la secuencia de
ácido nucleico diana.
En una realización preferida de la invención, la
medición de la etapa g) comprende una medición electroquímica, tal
como, por ejemplo, una medición amperométrica o una medición
voltamétrica.
En una realización especialmente preferida de la
invención, la medición voltamétrica se realiza usando voltimetría
pulsada diferencial u otro medio de resta de la señal de referencia
para aumentar la relación entre la señal y las interferencias.
Preferiblemente, la medición voltamétrica se
realiza usando electrodos de detección situados en la cámara de
muestra. La señal de referencia puede recuperarse, por ejemplo, de
otra cámara lejana a la cámara de muestreo.
La detección voltamétrica se realiza
preferiblemente por medio de una sonda oligonucleotídica degradable
por exonucleasa 5'-3', dando como resultado la
degradación de dicha sonda de ácido nucleico la liberación de un
componente detectable tal como un componente redox activo.
El componente redox activo puede ser, por
ejemplo, un metaloceno tal como, por ejemplo, ferroceno, que puede
medirse con alta sensibilidad y especificidad en un programa de
detección voltamétrica. Preferiblemente, el componente redox activo
es un grupo metalocenilo. Más preferiblemente es un grupo
ferrocenilo. Un componente redox activo representativo para la
sonda es ferrocenilo y metalocenilo, más ventajosamente carboxamidas
de ferroceno o metaloceno N-sustituidas. El anillo
de ferroceno o metaloceno, que constituye el resto marcador, puede
no estar sustituido. En la técnica se conocen los componentes redox
activos anteriores, así como componentes redox activos útiles
adicionales y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 03/074
731 y EP 1 481 083.
En solución, la sonda digerida acumulada puede
distinguirse de la sonda no digerida debido a su diferente
actividad redox; por lo tanto, el procedimiento incluye además la
detección de la presencia o ausencia de un pico de voltaje
específico de sonda que usa un sistema de detección basado en el
análisis voltamétrico de la actividad redox.
En una realización más preferida de la
invención, la medición de la etapa g) comprende una medición óptica
tal como, por ejemplo, una medición de fluorescencia o una medición
de quimioluminiscencia. El uso de medición óptica puede requerir
que la cámara de muestra, por ejemplo, la cámara de muestra de la
microplaca, comprenda una ventana que es transparente para las
longitudes de onda pertinentes.
Existen varias técnicas de fluorescencia bien
descritas diferentes. Por ejemplo, la medición de fluorescencia
puede emplear la denominada TaqMan® que, por ejemplo, se describe en
la Patente de Estados Unidos 5.723.591.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un procedimiento de detección de partículas biológicas, por
ejemplo, excluyendo esporas, comprendiendo el procedimiento la etapa
a), b), c), d), f), g) como se describe en este documento y una
etapa sustituta e1) que sustituye a la etapa e). La etapa sustituta
e1) comprende extraer material biológico a partir de las partículas
biológicas por tratamiento térmico de la mezcla de reacción a una
temperatura en el intervalo de 80ºC-105ºC, tal como
90ºC-100ºC. La duración del tratamiento térmico
está típicamente en el intervalo de 5 segundos - 3 horas, tal como 5
minutos - 60 minutos.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para extraer material biológico a partir de
partículas biológicas, comprendiendo el procedimiento las etapas
anteriores a), b), c), d), e) y f) como se han descrito en este
documento.
\newpage
A continuación se describe una microplaca para
detectar una partícula biológica en una muestra gaseosa,
comprendiendo la microplaca
- -
- una cámara de muestra, por ejemplo, que comprende una primera abertura en conexión fluida con el aire circundante y
- -
- una segunda abertura para formar una conexión fluida con un dispositivo, comprendiendo la cámara de muestra una muestra gaseosa.
La cámara de muestra, por ejemplo, la cámara de
muestra de la microplaca es típicamente una cámara de muestra a
escala microscópica. El volumen de la cámara de muestra es de 500
\mul como máximo, tal como de 400 \mul, 300 \mul, 200 \mul,
100 \mul, 50 \mul, 25 \mul, 15 \mul, 10 \mul, 5 \mul, 4
\mul o 3 \mul como máximo, o de 2 \mul como máximo, tal como
de 1 \mul como máximo. Por ejemplo, el volumen de la cámara de
muestra puede ser de 500 nl como máximo, tal como de 400 nl, 300 nl,
200 nl, 100 nl, 50 nl, 25 nl, 15 nl, 10 nl, 5 nl, 4 nl o 3 nl como
máximo o de 2 nl como máximo, tal como de 1 nl como máximo.
Típicamente, el volumen de la cámara de muestra
es de al menos 10 nl. En una realización preferida, el volumen de
la cámara de muestra está en el intervalo de 1
\mul-50 \mul, tal como 5
\mul-30 \mul.
La menor distancia entre un par de paredes
opuestas es de 20 mm como máximo, tal como de 15 mm, 10 mm, 8 mm, 6
mm, 4 mm, 3 mm o 2 mm como máximo, tal como de 1 mm como máximo. Por
ejemplo, la menor distancia entre un par de paredes opuestas es de
800 \mum como máximo, tal como de 600 \mum, 500 \mum, 400
\mum, 300 \mum, 200 \mum, 100 \mum, 50 \mum, 25 \mum,
15 \mum, 10 \mum, 5 \mum, 4 \mum o 3 \mum como máximo o
de 2 \mum como máximo, tal como de 1 \mum como máximo.
Típicamente, la menor distancia entre un par de
paredes opuestas es de al menos 5 \mum. En una realización
preferida, la menor distancia entre un par de paredes opuestas está
en el intervalo de 50 \mum-500 \mum, tal como
100 \mum-400 \mum y 150
\mum-350 \mum.
La longitud de la cámara de muestra, por
ejemplo, la cámara de muestra de la microplaca, está en el
intervalo de 1 mm-50 mm, tal como en el intervalo de
1 mm-10 mm, 10 mm- 20 mm, 20 mm-30
mm, 30 mm-40 mm, o 40 mm-50 mm. En
una realización preferida, la longitud de la cámara de muestra está
en el intervalo de 2 mm-8 mm, tal como 3
mm-7 mm o 4 mm-6 mm. Por ejemplo, la
longitud de la cámara de muestra puede ser de aproximadamente 4,5
mm.
En una realización, la anchura de la cámara de
muestra, por ejemplo, la cámara de muestra de la microplaca, está
en el intervalo de 0,2 mm-10 mm, tal como en el
intervalo de 0,2 mm-1 mm, 1 mm-3 mm,
3 mm-5 mm, 5 mm-7 mm o 7
mm-10 mm. En una realización preferida, la anchura
de la cámara de muestra está en el intervalo de 0,2
mm-2 mm, tal como 0,5 mm-1.5 mm y
0,75 mm-1,25 mm. Por ejemplo, la anchura de la
cámara de muestra puede ser de aproximadamente 1 mm.
En una realización, la altura de la cámara de
muestra, por ejemplo, la cámara de muestra de la microplaca está en
el intervalo de 50 \mum-2 mm, tal como en el
intervalo de 100 \mum-1 mm, 200
\mum-900 \mum, 300 \mum-800
\mum o 500 \mum-700 \mum. En una realización
preferida, la altura de la cámara de muestra está en el intervalo
de 100 \mum-400 \mum, tal como 200
\mum-300 \mum.
En una realización, la longitud de la cámara de
muestra, por ejemplo, la cámara de muestra de la microplaca, es de
aproximadamente 4,5 mm, la anchura de la cámara de muestra es de
aproximadamente 1 mm y la altura de la cámara de muestra es de
aproximadamente 300 \mum.
En una realización, la microplaca comprende
además un primer y un segundo electrodos.
El primer y/o el segundo electrodos pueden tener
formas o dimensiones diferentes. Por ejemplo, el primer y/o el
segundo electrodos pueden tener una forma sustancial seleccionada
del grupo de una lámina, una placa, un disco, un alambre, una
varilla; o cualquier combinación de las mismas.
En una realización preferida, el primer y el
segundo electrodos pueden ser electrodos de tipo lámina.
Una realización preferida, el primer electrodo y
el segundo electrodo están enfrentados entre sí. Por ejemplo,
pueden situarse en lados opuestos de la cámara de muestra.
El primer electrodo y/o el segundo electrodo
pueden situarse, por ejemplo, en el interior de la cámara de
muestra, estando libres en la cámara de muestra o unidos a una o más
de las paredes de la cámara de muestra.
El primer y/o el segundo electrodos pueden estar
embebidos en la pared o paredes de la cámara de muestra. Por
ejemplo, el primer y el segundo electrodos pueden estar embebidos en
las paredes de la cámara de muestra. Como alternativa, el primer
y/o el segundo electrodos pueden estar situados en la superficie o
superficies externas de la microplaca.
Preferiblemente, el primer electrodo y el
segundo electrodo se sitúan en lados opuestos de la cámara de
muestra.
Un electrodo, por ejemplo, el primer electrodo
y/o el segundo electrodo pueden formarse de varios materiales
diferentes. Típicamente, los electrodos están formados por metales o
aleaciones. El primer y el segundo electrodos pueden comprender,
por ejemplo, un metal seleccionado del grupo que consiste en plata,
oro, platino, cobre, carbono, hierro, grafito, cromo, níquel,
cobalto, titanio, mercurio o una aleación de los mismos.
También se prevé que un electrodo puede
comprender un líquido conductor e incluso consistir esencialmente
en un líquido conductor. El líquido conductor puede ser, por
ejemplo, mercurio.
La dimensión y/o estructura de los electrodos
depende típicamente de la dimensión y/o estructura de la cámara de
muestra. La longitud y anchura de los electrodos son del mismo orden
de magnitud que la longitud y anchura de la cámara de muestra.
Los electrodos pueden estar formados por tan
sólo un recubrimiento de unas pocas capas de átomos de material
conductor.
En una realización de la invención, un
electrodo, por ejemplo, el primer y/o el segundo electrodo, tiene
un espesor en el intervalo de 0,001 \mum-2000
\mum, tal como 0,001 \mum-1 \mum, 1
\mum-20 \mum, 20 \mum-200
\mum y 200 \mum-2000 \mum.
En una realización, la cámara de muestra de la
microplaca comprende además un conjunto de electrodos de detección,
por ejemplo, dos o tres electrodos de detección, para la detección
de la presencia o ausencia de un componente redox activo que, por
ejemplo, puede liberarse a partir de una sonda. Dos electrodos de
detección pueden servir como electrodo de trabajo y
contraelectrodo, respectivamente. El conjunto de electrodos de
detección puede comprender además un electrodo de referencia.
Típicamente, los electrodos de detección están formados en metales
o aleaciones. Los electrodos pueden comprender, por ejemplo, un
material seleccionado del grupo que consiste en carbono, plata, oro
o platino. Después de la detección, los electrodos pueden
experimentar formación de películas en la superficie del electrodo.
Para permitir una detección adicional de sonda digerida, pueden
disponerse conjuntos de electrodos de detección adicionales en el
interior de la cámara de muestra de la microplaca.
En una realización, el primer y el segundo
electrodos pueden ser el conjunto de electrodos de detección.
En una realización preferida, la microplaca
comprende además un elemento de detección de temperatura que podría
ser, por ejemplo, un resistor basado en un metal termosensible (un
termistor) con un coeficiente de temperatura positivo (PTC), es
decir, el termistor presenta una resistencia eléctrica creciente con
aumentos en la temperatura ambiental y una resistencia eléctrica
decreciente con disminución de la temperatura.
El termistor puede seleccionarse, por ejemplo,
del grupo de materiales que comprende cobre, níquel, hierro,
aluminio, platino o aleaciones de los mismos.
El termistor puede tener formas o dimensiones
diferentes. Por ejemplo, el termistor puede tener una forma
sustancial seleccionada del grupo de una lámina, una placa, un
disco, un alambre o una varilla.
El termistor puede ser, por ejemplo, un
electrodo en forma de alambre.
El electrodo de calentamiento puede tener formas
o dimensiones diferentes. Por ejemplo, el electrodo de
calentamiento puede tener una forma sustancial seleccionada del
grupo de una lámina, una placa, un disco, un alambre o una
varilla.
En una realización preferida, el electrodo de
calentamiento puede ser, por ejemplo, un electrodo de tipo lámina.
En una realización preferida, el electrodo de calentamiento puede
situarse de manera que permite el calentamiento desde al menos un
lado de la cámara de reacción.
En otra realización más, uno o más electrodos de
calentamiento complementarios pueden situarse en los lados opuestos
de la cámara de reacción.
El electrodo de calentamiento está hecho de un
material eléctricamente conductor, preferiblemente seleccionado del
grupo de níquel-cromo (NiCr),
hierro-cromo-aluminio (FeCrAl),
hierro-níquel-cromo (FeNiCr) u otras
aleaciones de elementos de calentamiento.
En una realización preferida, la microplaca
comprende una o más almohadillas de contacto conductoras en
contacto eléctrico con los electrodos de la microplaca. La
microplaca puede comprender una almohadilla de contacto conductora
en contacto eléctrico con el primer electrodo. La microplaca puede
comprender una almohadilla de contacto conductora en contacto
eléctrico con el segundo electrodo. La microplaca puede comprender
dos almohadillas de contacto conductoras en contacto eléctrico con
cada uno de los extremos del electrodo de calentamiento. La
microplaca puede comprender dos o tres almohadillas de contacto
conductoras en contacto eléctrico con cada uno de los electrodos
del conjunto de electrodos de detección.
En la Figura 1 se ilustran dos realizaciones
ejemplares de microplaca. En la Figura 1 A) la microplaca (1)
comprende la cámara de muestra (2) y un primer electrodo (3) y un
segundo electrodo (4). El primer electrodo (3) está unido a la
parte superior (5) de la microplaca y el segundo electrodo (4) está
unido a la parte inferior (6) de la microplaca. Tanto el primer
como el segundo electrodos están cubiertos por una capa
eléctricamente aislante (7) para evitar una electrolisis no deseada
del contenido líquido de la cámara de muestra (2). Un electrodo de
calentamiento está embebido en la capa aislante en la parte superior
del segundo electrodo. La cámara de muestra está formada por una
parte separadora (9), que está intercalada entre la primera parte
(5) y la segunda parte (6) de la microplaca (1). El conjunto de
electrodos de detección y el elemento de detección de la
temperatura no se muestra en la Figura 1.
La microplaca puede comprender una amplia serie
de materiales diferentes. Puede comprender, por ejemplo, polímeros
orgánicos tales como plásticos, metales y semiconductores tales como
silicio, vidrios y materiales cerámicos, y similares.
Con respecto a la Figura 1, la primera y segunda
partes podrían comprender, por ejemplo, materiales tales como
plásticos, semiconductores tales como silicio, vidrios o materiales
cerámicos. El primer y segundo electrodos podrían comprender, por
ejemplo, un metal tal como oro o cobre. La capa aislante podría ser,
por ejemplo, una película de SiO_{2} o poliimida. El electrodo de
calentamiento podría ser, por ejemplo, un electrodo de NiCr y la
capa separadora podría ser, por ejemplo, un elastómero de
polidimetilsiloxano (PDMS) moldeado.
En la Figura 1 B), el primer y segundo
electrodos no están comprendidos en la microplaca pero pueden estar
comprendidos, por ejemplo, en un dispositivo para hacer funcionar la
microplaca.
Típicamente, una microplaca tiene un espesor en
el intervalo de 0,5 mm-50 mm y, preferiblemente, en
el intervalo de 2 mm-8 mm.
Típicamente, una microplaca tiene una longitud o
diámetro en el intervalo de 10 mm-500 mm,
preferiblemente en el intervalo de 40 mm-200
mm.
Típicamente, una microplaca tiene una anchura en
el intervalo de 5 mm-200 mm, preferiblemente en el
intervalo de 20 mm-100 mm.
La microplaca puede comprender sólo una única
cámara de muestra o puede comprender múltiples cámaras de
muestra.
Se describe un dispositivo para detectar una
partícula biológica en una muestra gaseosa, comprendiendo el
dispositivo:
- -
- un sitio de microplaca en el que se va a localizar una microplaca para asociarse funcionalmente con el dispositivo,
- -
- una interfaz eléctrica entre el dispositivo y la microplaca para aplicar un campo eléctrico alterno entre los electrodos de la cámara de muestra y
- -
- una unidad programable que comprende un programa informático que hace que el dispositivo realice una o más acciones seleccionadas del grupo que consiste en:
- -
- proporcionar una muestra gaseosa en la cámara de muestra,
- -
- aplicar un primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al segundo electrodo, produciéndose por lo tanto una diferencia de potencial y un campo eléctrico entre el primer y segundo electrodos para contribuir a la recogida electrostática en la cámara de muestra de una partícula biológica presente en la muestra gaseosa,
- -
- poner en contacto la partícula biológica recogida con un primer reactivo líquido,
- -
- exponer una mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, teniendo dicho campo eléctrico alterno una amplitud suficiente para extraer el material biológico de la partícula biológica,
- -
- realizar la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana,
medir la presencia de la secuencia de ácido
nucleico diana amplificada y/o medir los productos resultantes de
la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana.
La expresión "asociado funcionalmente" se
refiere a que la microplaca está asociada con el dispositivo de
modo que el dispositivo puede realizar una o más acciones que
afectan a la microplaca.
\newpage
En una realización, la microplaca está
funcionalmente asociada con el dispositivo cuando el dispositivo
puede afectar al campo eléctrico del contenido de la cámara de
muestra.
En una realización, la microplaca está
funcionalmente asociada con el dispositivo cuando el dispositivo
puede controlar el potencial de al menos un electrodo de la
microplaca. Por ejemplo, el dispositivo puede estar asociado
funcionalmente con la microplaca cuando el dispositivo puede
controlar el potencial del primer electrodo y/o el segundo
electrodo de la microplaca.
Estar funcionalmente asociado puede incluir
además que la cámara de muestra de la microplaca esté en
comunicación fluida con un medio de control de flujo.
En una realización, el dispositivo comprende el
primer y segundo electrodos y cuando la microplaca está asociada
funcionalmente el campo eléctrico entre el primer y segundo
electrodos contribuye a recoger las partículas biológicas de la
muestra gaseosa en la cámara de muestra. En esta realización, la
microplaca no necesita comprender el primer y el segundo
electrodos.
El dispositivo también puede comprender una
primera cámara de reactivo para recibir y/o contener un primer
reactivo líquido. Típicamente, la primera cámara de reactivo tiene
al menos una abertura, que está en conexión fluida con la cámara de
muestra cuando la microplaca está asociada funcionalmente con el
dispositivo. Como alternativa, la al menos una abertura de la
primera cámara de reactivo se pone en conexión fluida con la cámara
de muestra, por ejemplo, usando el medio para controlar un flujo. La
primera cámara de reactivo también puede cerrarse mediante una
barrera desmontable durante el almacenamiento, retirándose dicha
barrera de forma reversible o irreversible cuando se usa el
dispositivo.
El dispositivo puede comprender además una
fuente de energía eléctrica para suministrar energía, por ejemplo,
al medio generador de flujo y/o a la unidad programable, el primer y
segundo electrodos.
En una realización, la microplaca está asociada
funcionalmente con el dispositivo mediante el sitio de microplaca.
El sitio de microplaca puede comprender, por ejemplo, una interfaz
de plástico que sirve como material de conexión y como juntas que
aseguren uniones estrechas entre los puertos de microplaca y los
puertos de dispositivo, eliminando fugas de aire y líquido. El
sitio de microplaca puede comprender, por ejemplo, una superficie
y/o un soporte para recibir la microplaca. Típicamente, el sitio de
microplaca comprende al menos una almohadilla de contacto
conductora. Preferiblemente, el sitio de microplaca comprende al
menos una almohadilla de contacto conductora para proporcionar
contacto eléctrico con el primer electrodo de la microplaca y una
almohadilla de contacto conductora para proporcionar contacto
eléctrico con el segundo electrodo de la microplaca. La unidad
programable contiene instrucciones, preferiblemente legibles por
ordenador, por ejemplo un programa informático, adaptadas para
facilitar el control, la supervisión y/o la manipulación del
dispositivo antes del funcionamiento, durante el funcionamiento y/o
después del funcionamiento.
La unidad programable comprende preferiblemente
al menos un ordenador que tiene uno o más programas de ordenador
almacenados en el interior del medio de almacenamiento de datos
asociado con el mismo, estando el sistema de ordenador adaptado
para controlar el dispositivo. La unidad programable puede
seleccionarse en el contexto de la presente invención a partir del
grupo no exhaustivo de: un ordenador universal, un ordenador
personal (PC), una unidad de control lógico programable (PLC), una
unidad de control lógico programable implementada por software
(soft-PLC), una unidad de control lógico programable
implementada por hardware (hard-PLC), un ordenador
personal industrial o un microprocesador especializado.
También se describe un producto de programa
informático que se adapta para permitir un sistema informático que
comprende al menos un ordenador que tiene un medio de almacenamiento
de datos asociado con el mismo para controlar, supervisar y/o
manipular el dispositivo antes del funcionamiento, durante el
funcionamiento y/o después del funcionamiento. También se describe
un medio legible por ordenador que tiene almacenado en el mismo un
conjunto de rutinas para permitir a un sistema informático que
comprende al menos un ordenador que tiene un medio de
almacenamiento de datos asociado con el mismo controlar, supervisar
y/o manipular el dispositivo antes del funcionamiento, durante el
funcionamiento y/o después del funcionamiento.
La unidad programable para controlar, supervisar
y/o manipular el dispositivo antes del funcionamiento, durante el
funcionamiento y/o después del funcionamiento preferiblemente está
adaptada para el funcionamiento en condiciones rigurosas tales como
clima ártico, clima tropical y entorno de combate, en particular en
zonas de combate que se hayan sometido a guerra atómica, biológica
y/o química (guerra ABC). Preferiblemente, la unidad programable
cumple con las especificaciones militares pertinentes para dichas
unidades.
En una realización, la unidad programable que
comprende el programa informático hace además que el dispositivo
compruebe si la microplaca está asociada funcionalmente con el
dispositivo.
La unidad programable que comprende el programa
informático puede hacer además que el dispositivo realice una o más
acciones, tales como, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 6 acciones
seleccionadas del grupo que consiste en:
- -
- proporcionar una muestra gaseosa en la cámara de muestra,
- -
- aplicar un primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al segundo electrodo, produciéndose por lo tanto una diferencia de potencial y un campo eléctrico entre el primer y el segundo electrodos, para contribuir a la recogida electrostática en la cámara de muestra de una partícula biológica presente en la muestra gaseosa,
- -
- poner en contacto la partícula biológica recogida con un primer reactivo líquido,
- -
- exponer una mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, teniendo dicho campo eléctrico alterno una amplitud suficiente para permitir la extracción de material biológico,
- -
- realizar la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana
- -
- medir la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o medir productos resultantes de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana.
La unidad programable que comprende el programa
informático puede hacer, por ejemplo, que el dispositivo
proporcione una muestra gaseosa en la cámara de muestra por
funcionamiento de un medio generador de flujo para proporcionar una
muestra gaseosa.
La unidad programable que comprende el programa
informático puede hacer, por ejemplo, que el dispositivo aplique un
primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al
segundo electrodo.
La unidad programable que comprende el programa
informático puede hacer, por ejemplo, que el dispositivo ponga en
contacto la partícula biológica recogida con un primer reactivo
líquido por funcionamiento de un medio generador de flujo para
proporcionar un reactivo líquido y/o funcionamiento del medio para
controlar un flujo.
La unidad programable que comprende el programa
informático puede hacer, por ejemplo, que el dispositivo exponga la
mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de
muestra por medio de la modulación de los potenciales de al menos
dos electrodos, por ejemplo, el primer y el segundo electrodos como
se describe en este documento u otro conjunto de electrodos
dedicados al campo eléctrico alterno.
La unidad programable que comprende el programa
informático puede hacer, por ejemplo, que el dispositivo realice
una amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido
nucleico diana por funcionamiento de un electrodo de calentamiento
como se describe en este documento.
La unidad programable que comprende el programa
informático puede hacer, por ejemplo, que el dispositivo mida la
presencia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o
mida los productos resultantes de la amplificación de la secuencia
de ácido nucleico diana por funcionamiento de los electrodos de
detección relacionados con una voltametría de pulso
diferencial.
Preferiblemente, el dispositivo comprende además
una interfaz eléctrica entre el dispositivo y la microplaca para
aplicar un campo electrostático entre el primer y el segundo
electrodos de la cámara de muestra.
El dispositivo puede medir además una señal de
referencia, es decir, una señal de una muestra que comprende una
muestra sin una partícula biológica o comprende una cantidad bien
definida de una partícula biológica dada. La señal de referencia
puede recuperarse, por ejemplo, de otra cámara lejana a la cámara de
muestreo, por ejemplo, una cámara localizada en otra posición de la
microplaca o una cámara localizada en otra microplaca.
El dispositivo puede comprender además una
fuente de energía interna.
La fuente de energía interna puede comprender,
por ejemplo, una pila. La cantidad de energía a utilizar durante
una reacción de PCR puede estimarse como la cantidad de calor
necesario para calentar un volumen de agua equivalente al de la
muestra líquida entre las temperaturas mínima y máxima del ciclo de
PCR. Esta diferencia de temperatura es de aproximadamente 50 K y,
por lo tanto, el calor a transferir por ciclo es de aproximadamente
6 Julios para un volumen de muestra de 30 \mul. El procesamiento,
por ejemplo, de 60 ciclos, el consumo de energía total para una
reacción de PCR asciende a 60*6=360 Julios. Usando un tiempo de
aumento progresivo de la temperatura comparable a los
termocicladores comerciales (es decir 2ºC por segundo) la energía
necesaria es de 360*2/50 = 14,4 W.
El voltaje de la pila se considera el voltaje
nominal de la pila, por ejemplo, 1,2V por celda para pilas de
níquel-cadmio (NiCd) y
níquel-hidruro metálico (NiMH) y 3,6V por celda para
la mayoría de pilas de ion-litio
(Li-ion). La capacidad de carga de la pila se
proporciona típicamente en términos de miliAmp-horas
(mAh) y se denomina la clasificación tipo C de la pila. Por
ejemplo, una corriente de carga de 1C para una pila con una
clasificación tipo C de 1200 mA-horas es de 1200 mA.
Una pila puede considerarse ideal (es decir, con una capacidad de
energía constante) cuando se agota con una corriente de carga por
debajo de 0,1 C (Linden, D. 1984. Handbook of Batteries and Fuel
Cells. Nueva York: McGraw-Hill). Por lo tanto,
cuando se suministra una salida de energía de 14,4 W usando, por
ejemplo, una pila que suministra 10,8V, la clasificación tipo C de
esta pila debe estar en el intervalo de 14,4/(10,8*0,1) = 13300 mAh
para evitar un consumo de energía máximo que reducirá
espectacularmente la capacidad de energía.
Para permitir este consumo de energía y este
suministro de energía, y para asegurar adicionalmente una
portabilidad verdadera, se prefieren pilas recargables. En una
realización preferida de la presente invención se seleccionan pilas
recargables del grupo que consiste en pilas basadas en
Níquel-Hidruro Metálico (NiMH) y pilas basadas en
ion-Litio (Li-ion).
Además, la fuente de energía interna puede
comprender un generador, por ejemplo, un generador portátil. Puede
utilizarse un generador de energía portátil como fuente de energía
externa. El generador de energía portátil puede recargarse a partir
de, o simplemente consistir en un módulo solar, un cargador de pilas
(por ejemplo, cargador de pila de CA o de batería de coche), un
generador de combustión de combustible o similar.
Como alternativa, al dispositivo se le puede
proporcionar energía a partir de una fuente de energía externa, por
ejemplo, complementado con un dispositivo de reserva de pila.
En una realización, el dispositivo comprende
además un medio generador de flujo, por ejemplo, para proporcionar
una muestra gaseosa en la cámara de muestra de la microplaca y estar
en conexión fluida con la segunda abertura de la cámara de muestra
cuando la microplaca se inserta en el dispositivo.
El generador de flujo puede comprender una
bomba, tal como una bomba de pistón, una bomba de membrana o una
bomba de desplazamiento positivo.
En una realización, se selecciona una bomba
capaz de suministrar un flujo de aire apropiado a través de la
microplaca durante el muestreo (en el intervalo de 10 ml/min a 500
ml/min). Preferiblemente, la bomba debe seleccionarse de manera que
cumpla uno o más de los siguientes criterios: pequeño tamaño, peso
ligero, flujo sin pulsaciones, flujo reversible del medio por
cambio de la polaridad del motor o volumen de flujo ajustable por
control del voltaje. En una realización de la invención, el medio
generador de flujo puede comprender un dispensador de chorro para
generar pequeñas gotas de reactivo o un dispositivo de
microdispensación similar.
En una realización, la muestra gaseosa puede
proporcionarse mediante un flujo pasivo a través de la microplaca.
Esto exigirá una diferencia de velocidad entre la microplaca y el
aire circundante a muestrear. Las condiciones para que esto suceda
se cumplen si la microplaca se desplaza a través del aire, por
ejemplo, montada en un avión de tal modo que la primera abertura
esté en conexión fluida con el aire circundante, de forma óptima
opuesta a la dirección de vuelo. Como alternativa, las condiciones
se dan si el aire se está moviendo alrededor de la microplaca que
no tiene velocidad en comparación con el aire, por ejemplo, montada
en un conducto de ventilación de aire.
En una realización, el dispositivo comprende
además un medio para controlar, por ejemplo, un flujo a través de
la cámara de muestra.
El flujo puede ser, por ejemplo, un flujo
líquido y/o un flujo de gas.
Los medios para controlar un flujo comprenden
típicamente una o más válvulas. Las válvulas pueden seleccionarse,
por ejemplo, del grupo que consiste en una válvula de retención, una
válvula de dos vías, una válvula multiposición y una válvula de
constricción.
La válvula puede ser, por ejemplo, una válvula
microfabricada y, en una realización, la válvula está integrada en
la microplaca.
En una realización, el primer reactivo líquido
puede suministrarse usando la tecnología de microdispensación de
chorro. Un cartucho de chorro que contiene uno o más compartimentos
que comprenden el primer reactivo líquido o componentes separados
del primer reactivo líquido se monta de tal modo que permite la
microdispensación de líquidos en la cámara de reacción.
En otra realización más, el primer reactivo
líquido o componentes separados del mismo se encapsulan en el
interior de una envuelta sellada que está compuesta por un polímero
de plástico. La envuelta de polímero de plástico está equipada con
un electrodo de calentamiento incorporado, permitiendo la fusión del
polímero de plástico mediante la aplicación de una corriente
eléctrica apropiada y la posterior liberación del líquido
encapsulado en la microplaca. En otra realización más, la liberación
de líquido a partir de la envuelta polimérica de plástico sellada
puede conseguirse por ruptura mecánica o física de la envuelta, por
ejemplo, por perforación de la envuelta con un objeto afilado.
En una realización, el dispositivo puede
equiparse con un dispositivo de visualización que permita una
lectura visual de los resultados. El dispositivo puede estar en
formato de una fuente emisora de luz (un LED, una bombilla o
similar), una pantalla, una lectura digital o cualquier combinación
de las mencionadas anteriormente. En otra realización más, la
lectura puede comunicarse en forma de señales de audio.
En una realización preferida, el dispositivo
comprende un componente que permite una comunicación sin cable. Son
ejemplos de comunicación sin cable 802.11 Mobile Wireless LAN,
celular, Bluetooth®, GPS, y Banda Ultra Ancha. La comunicación
puede ser de sentido único, por ejemplo, transporte de datos desde
el dispositivo o transporte de datos hasta el dispositivo, o la
comunicación puede ser la combinación, es decir, de doble sentido.
La comunicación establecida puede ampliarse adicionalmente a
comunicación interdispositivo, es decir, el establecimiento de una
red ad-hoc que permita a un dispositivo desencadenar
el inicio del muestreo de otro dispositivo facilitando de este modo
la supervisión, por ejemplo, de la progresión de una nube de
aerosol.
En una realización preferida, el dispositivo es
un dispositivo de bajo peso y/o portátil.
En una realización, el dispositivo pesa 10 kg
como máximo, tal como 8 kg, 6 kg, 4 kg, 3 kg o 2 kg como máximo,
tal como 1 kg como máximo. Puede incluso preferirse que el
dispositivo pese 800 g como máximo, tal como 600 g, 500 g, 400 g,
300 g, 200 g, 150 g, 100 g, 80 g, 60 g, 50 g, 40 g, 30 g, 20 g, 10 g
o 5 g como máximo, tal como 1 g como máximo.
Típicamente, el dispositivo tiene un peso total
en el intervalo de 20 g-1 kg, tal como de 20
g-50 g, 50 g-100 g, 100
g-250 g, 250 g-500 g o 500
g-1000 g.
Se describe un sistema para detectar una
partícula biológica en una muestra gaseosa, comprendiendo el
sistema una microplaca como se define en este documento asociada
funcionalmente con un dispositivo como se define en este
documento.
En una realización, la microplaca y el
dispositivo del sistema están integrados y se supone que no deben
separarse físicamente entre sí. En una realización de la invención,
la microplaca y el dispositivo del sistema están integrados de modo
que no pueden separarse físicamente el uno del otro sin dañar la
microplaca o el dispositivo.
En una realización importante, el sistema es un
sistema desechable, por ejemplo, destinado a usarse sólo una
vez.
En otra realización importante, la microplaca
del sistema es desechable pero se supone que el dispositivo debe
reutilizarse.
Un aspecto especial se refiere a un dispositivo
que tiene como objetivo supervisar enfermedades infecciosas de
transmisión aérea y está optimizado para supervisar bajas
concentraciones de aerosol, con implicaciones directas para
vigilancia de epidemias. El dispositivo consiste en tres tecnologías
integradas alojadas en el mismo recipiente (volumen que varía de 10
nl a 10 ml) que permiten el muestreo de bioaerosoles y la
preparación de muestras para extracción de material genético con
amplificación posterior de ADN o ADNc. El recipiente se suministra
mediante una entrada y salida común para aire y líquido.
Inicialmente, el aire pasa a través del recipiente en una corriente
que se origina por sobrepresión en la entrada o vacío en la salida.
El recipiente está equipado con electrodos que facilitan la
precipitación electrostática. Los electrodos típicamente están
formados como dos láminas opuestas entre las que pasa el aire. Sin
embargo pueden usarse otras configuraciones, por ejemplo, un solo
electrodo de lámina combinado con un solo o un conjunto de
electrodos puntuales para dirigir las partículas muestreadas a un
punto dado en el recipiente. El campo eléctrico entre los electrodos
medido en la distancia más corta está por debajo de 1000 V/mm para
prevenir la formación de chispas eléctricas. Las biopartículas que
llevan una carga natural se capturan en el campo electrostático, su
desplazamiento a través del recipiente se interrumpe y se dirigen
hacia los electrodos donde precipitan. El mecanismo de captura es
eficaz y se consigue fácilmente una eficacia de captura del 80% o
mayor. El tiempo para la precipitación electrostática se ajusta
fácilmente mediante un equipo externo que controla el voltaje sobre
los electrodos de superficie. La precipitación se detiene cuando se
apaga el voltaje. Una vez que se ha procesado un volumen deseado de
aire a través del recipiente, el bombeo de aire puede interrumpirse
y el recipiente puede cargarse con un líquido que contenga los
reactivos para amplificación de ADN/ADNc.
Las biopartículas recogidas y concentradas
pueden exponerse ahora para la preparación de muestra. Se ha
demostrado que endosporas de bacterias
Gram-positivas, que se sabe que son extremadamente
resistentes a la degradación mecánica, química y térmica, liberan
ADN cromosómico y plasmídico cuando se exponen a un campo eléctrico
oscilante a través del recipiente. La liberación de ADN se produce
en unos pocos segundos si la frecuencia es superior a 10 kHz y se
consigue una liberación máxima alrededor de 100 kHz. El efecto del
campo oscilante es la destrucción de la integridad de las esporas
por rotura directa de la membrana, formación de poros en la pared
de la endospora o hinchamiento osmótico súbito debido a degradación
bioquímica de la espora con activación concomitante de cationes
divalentes tamponados de otro modo como Mg^{2+} o Ca^{2+}. La
pared de la endospora de las bacterias
Gram-positivas es la estructura de inclusión más
estable encontrada en bacterias, virus y hongos, protegiendo al
organismo y permitiendo que resida latente en condiciones rigurosas
extremas durante décadas. Por lo tanto, la tecnología de preparación
de muestras que utiliza un campo eléctrico oscilante es eficaz en
la liberación de material genético a partir de células bacterianas y
esporas. El campo oscilante puede inducirse mediante los mismos
electrodos usados para precipitación electrostática.
Después de la preparación de la muestra
eléctrica inicial, la muestra se expone a ciclos de calentamiento y
refrigeración calentando rápidamente la muestra a una temperatura de
desnaturalización y refrigerándola posteriormente. La temperatura
de ciclado media la degradación adicional de células, esporas y
especialmente virus que no se ven afectados por el campo eléctrico
oscilante y libera material genético. Los virus son generalmente
material genético embebido en estructuras proteicas que se
desnaturalizan rápidamente a mayores temperaturas. Las oscilaciones
rápidas de temperatura (velocidades de calentamiento >
40ºC/segundo y velocidades de refrigeración > 15ºC/segundo) se
facilitan al diseñar el recipiente para un intercambio óptimo de
calor. El diseño térmico se basa en la relación entre las
constantes de tiempo térmico total de los materiales en comparación
con la constante de tiempo térmico del agua en el recipiente. La
capacidad térmica total de los materiales circundantes del
recipiente y el acoplamiento de estos materiales entre sí y con un
recipiente térmico montado externamente son factores importantes
para permitir las oscilaciones rápidas de temperatura. El calor se
suministra a través de una película fina conductora de, por ejemplo,
Au o Pt tanto en la parte superior como en la parte inferior del
recipiente y es importante que el líquido forme una lámina plana
entre los calentadores para conseguir un rápido calentamiento y
refrigeración.
La película fina se calienta por paso de
corriente a través del material conductor. La temperatura se
controla por supervisión de un dispositivo termodetector de puente
de Wheatstone de cuatro cables que permite que se ajuste la
temperatura en el interior del recipiente con una exactitud de \pm
0,1ºC. Las oscilaciones de la temperatura facilitan adicionalmente
la amplificación de ADN o ADNc si están presentes las condiciones
bioquímicas apropiadas dentro del recipiente.
El dispositivo representa una combinación única
y novedosa de metodologías que permiten un muestreo, una
preparación de muestra y una amplificación de molécula sencilla de
ADN o ADNc rápidos e integrados en un dispositivo.
El término "fluido", como se usa en este
documento, se refiere a cualquier fluido, incluyendo aire, un gas o
un líquido incluyendo agua y una solución acuosa.
Un aspecto especial se refiere a un dispositivo
a escala microscópica para recoger partículas biológicas, extraer
material genético y realizar reacciones bioquímicas dependientes de
la temperatura que comprende;
- una cámara de reacción que tiene una abertura de entrada que proporciona una capacidad de flujo de gas entre el aire a muestrear y la cámara de reacción, y una abertura de salida que proporciona una capacidad de flujo de gas entre la cámara de reacción y el exterior de la cámara de reacción, estando la entrada o salida conectadas a un medio productor de flujo de aire para extraer la muestra gaseosa a través de la cámara de reacción desde la abertura de entrada hasta la abertura de salida; teniendo dicha cámara de reacción una capacidad para introducir disolventes definidos bioquímicamente en la cámara, una capacidad para retirar los productos de la reacción bioquímica dependiente de la temperatura de la cámara y una capacidad para un control muy rápido y exacto de la temperatura de la cámara de reacción, y un componente de recogida y electrolización dispuesto en el interior de la cámara de reacción entre la abertura de entrada y la abertura de salida, consistiendo dicho componente de recogida y electrolización en dos o más electrodos situados en paralelo y que tienen las superficies o al menos una parte de las superficies recubiertas con o constituidas por un material capaz de conducir una corriente eléctrica.
En una realización especial, los electrodos
paralelos permiten la generación de un campo eléctrico en un ángulo
o perpendicular al flujo de aire que pasa a través del dispositivo,
facilitando que las partículas presentes en el aire muestreado se
carguen electrostáticamente y por lo tanto se capturen adhiriéndose
al electrodo cargado positivamente o negativamente.
En una realización especial, los electrodos
aplican un campo electrolizante alterno de alta frecuencia a dichas
partículas biológicas capturadas después de la introducción de
dichos disolventes definidos bioquímicamente.
En una realización especial, los disolventes
comprenden reactivos que permiten realizar una reacción en cadena
de la polimerasa o PCR.
En una realización especial, los disolventes
comprenden reactivos que permiten realizar una reacción en cadena
de la ligasa o LCR.
En una realización especial, los disolventes
comprenden reactivos que permiten realizar una amplificación basada
en la transcripción.
En una realización especial, los disolventes
comprenden reactivos que permiten realizar una amplificación basada
en restricción.
En una realización especial, la cámara de
reacción está adaptada para contener en el intervalo de
aproximadamente 0,1 \mul a 500 \mul de fluido.
En una realización especial, la cámara de
reacción está adaptada para contener en el intervalo de
aproximadamente 1,0 \mul a 5 \mul de fluido.
En una realización especial, la cámara de
reacción tiene aproximadamente las dimensiones de 4,5 mm x 1 mm x
300 \mum o es proporcionalmente menor.
En una realización especial, el dispositivo es
reutilizable y se fabrica a partir del grupo de materiales que
consisten en polímeros, sílice, vidrio, metales y materiales
cerámicos.
En una realización especial, el dispositivo es
desechable y se fabrica a partir del grupo de materiales que
consisten en polímeros, sílice, vidrio, metales y materiales
cerámicos.
En una realización especial, los electrodos
comprenden al menos un electrodo de placa para conducir una
corriente eléctrica generando de este modo un campo
electrostático.
En una realización especial, el electrodo
comprende al menos un electrodo lineal para conducir una corriente
eléctrica generando de este modo un campo electrostático.
En una realización especial, la distancia entre
los electrodos en un ángulo o perpendicular al flujo de aire a
través del dispositivo es de entre 0,01 mm y 4 mm. En una
realización especial de la invención, el campo electrostático
aplicado entre los electrodos está comprendido entre 100 V/mm y 1600
V/mm.
En una realización especial, el procedimiento
comprende además realizar una lisis celular inducida por la
aplicación de campos eléctricos alternos de alta frecuencia.
En una realización especial, la corriente
alterna se aplica a frecuencias comprendidas entre 8000 y 200.000
Hz.
En una realización especial, las secuencias de
pulsos aplicados están comprendidas entre 1 segundo y 60
segundos.
En una realización especial, el dispositivo
comprende además un medio de transmisión para notificar los
resultados de dicha reacción bioquímica.
En una realización especial, el medio de
transmisión es mediante conexión por cable, mediante enlace de
radio, mediante transmisión por infrarrojo, mediante transmisión por
microondas, mediante teléfono móvil, mediante módulo GSM o mediante
red informática.
Otro aspecto especial se refiere a un sistema de
supervisión microbiana que comprende dispositivos como se describe
en este documento, en los que dicho sistema de supervisión
microbiana comprende una red de dispositivos separados.
En una realización especial, la red de
supervisión es una red integrada.
En una realización especial, la localización de
un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo en la red, se determina
por medio de un sistema de posicionamiento global.
En una realización especial de la invención, los
procedimientos constituyen un ensayo de detección o
diagnóstico.
En una realización especial, de la invención, el
ensayo de detección comprende un temporizador variable o
programable que determina la frecuencia de ensayos de detección.
Debe señalarse que, de acuerdo con la presente
invención, las realizaciones y características descritas en el
contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se
aplican a los otros aspectos de la invención.
El diseño incorpora un recipiente o cámara de
reacción que tiene dimensiones que son (o que se varían a escala
proporcionalmente a) 4,5 mm x 1 mm x 300 \mum. La estructura de
dispositivo propuesta sigue los esquemas esenciales del diseño de
concepto descrito.
Una base de sustrato de silicio se recubre con
una capa resistiva térmicamente para definir las propiedades
térmicas del dispositivo. Posteriormente, se deposita y se realiza
un patrón en una capa calentadora resistiva con baja resistencia,
pistas de salida y almohadillas de contacto. El calentador tiene un
patrón uniforme para calentar la base del canal. A continuación se
deposita una capa dieléctrica para aislar el calentador de las
capas posteriores. Después se deposita una película de platino y se
crea un patrón para proporcionar detectores de temperatura y
electrodos. Los detectores de temperatura se aíslan después
selectivamente de la muestra. La fabricación de oblea de silicio se
completa por el procesamiento de cualquiera de las capas que son
necesarias para la unión y sellado en la formación de canal/unión de
tapa.
La tapa está hecha de vidrio para proporcionar
un aislamiento térmico intrínseco. se deposita una película de
electrodo de platino y se crea un patrón. Si es necesario puede
aislarse o puede tener detectores de temperatura estampados en la
misma. Las etapas de estampado son esencialmente un subconjunto de
las usadas en la fabricación de oblea de silicio. Después se forman
en la tapa puertos de acceso de fluido, son posibles una variedad de
procesos pero podría realizarse esencialmente por fabricación a
máquina convencional. Los componentes de la superficie de contacto
de fluido tales como los ajustes Luer se unen a estos puertos en una
fase conveniente en el proceso de montaje.
\newpage
El canal se define por grabado en la placa antes
de la formación del electrodo de platino. Esto se puede conseguir
fácilmente sólo si los electrodos en la tapa son de una geometría
relativamente basta que permite la fabricación trivial de patrones.
Como alternativa, la etapa continúa siendo un componente plano y el
canal se forma en una capa "separadora" de 300 \mum de
espesor que se une tanto a la base de silicio como a la tapa de
vidrio.
En esta subsección se define la secuencia de
capas usadas para construir el dispositivo. Se describe el papel o
papeles funcionales de la capa en el dispositivo y se proporcionan
varias alternativas de cómo obtener el dispositivo y la lista de
ventajas/desventajas de las selecciones.
Etapa 1, véase la Figura
2
Sustrato de silicio. Ésta es una oblea de
silicio del orden de 500 \mum de espesor. Es preferible una oblea
pulida de doble cara ya que facilita el contacto térmico con la cara
posterior de la cámara de reacción. Si puede conseguirse un
aislamiento térmico lateral mediante un proceso de RIE profunda de
superficie posterior, entonces el espesor de la oblea debería
especificarse de una forma razonablemente precisa o debería variarse
la profundidad del grabado para compensar las variaciones de
espesor de la oblea. Dichas obleas se pueden adquirir fácilmente en
un amplio número de fuentes.
Etapa 2, véase la Figura 3
Capa de aislamiento térmico. Esta capa se
deposita sobre la superficie superior del silicio para controlar la
velocidad de pérdida de calor hacia el disipador térmico y por lo
tanto la energía necesaria tanto para mantener la temperatura como
para calentar la muestra. Para los tiempos de ciclo de PCR y niveles
de energía necesarios será necesaria una capa de poliimida del
orden de 20 \mum de espesor. Están disponibles para el uso
diversas clases de poliimida, siendo el BCB (benzociclobuteno) un
material dieléctrico polimérico alternativo.
Etapa 3, véase la Figura 4
Capa calentadora. Esta capa está formada por un
material convenientemente resistivo. En la energía máxima de modelo
térmico, se indica una disipación en el calentador del orden de 4 W.
La resistencia que requiere depende del voltaje y corriente de
excitación deseados. Se consideran razonables corrientes del orden
de 100 mA a 1 A, variando los voltajes de forma correspondiente de
40 V a 4 V. La resistencia requerida está entonces en el intervalo
de 400 \Omega hasta 4 \Omega. La geometría del resistor térmico
puede seguir convenientemente de forma estrecha la de la cámara de
reacción, que es una simple placa rectangular que cubre la base
completa. Por lo tanto, el resistor es de aproximadamente 4,5
cuadrados de longitud indicando una resistividad de película en el
intervalo aproximado de 1-100 \Omega/m. Esta
resistividad puede conseguirse fácilmente con un proceso de
película fina. Puede depositarse un resistor de NiCr por metalizado
por bombardeo o evaporación y puede crearse un diseño por grabado
en húmedo. Se pueden adquirir fácilmente procesos de resistor de
NiCr que cumplen los requisitos.
Etapa 4, véase la Figura 5
Capa de contacto 1. Esta capa se deposita
inmediatamente después de la deposición del NiCr y sirve para
definir los contactos con el resistor de NiCr. Típicamente, esta
capa será una capa fina de oro. Se define mediante grabado en
húmedo. De forma manifiesta, el patrón es tal que siempre hay NiCr
debajo del oro, pero puede no haber oro sobre el NiCr. La secuencia
típica es una máscara fotolitográfica para definir una seudocapa de
"oro o NiCr", grabar el oro y después el NiCr, volver a cubrir
para definir la capa de "oro" y volver a grabar el oro.
(Parece que esencialmente no se produce ningún ataque sobre la
película de NiCr por agentes de grabado de oro basados en yodo). Se
pueden adquirir fácilmente procesos adecuados.
Etapa 5, véase la Figura 6
Aislamiento eléctrico 1. Esta capa sirve para
aislar eléctricamente la capa calentadora de las capas conductoras
posteriores. El material más probable para usar es un óxido de
PECVD. Las vías/aberturas de contacto necesarias pueden estamparse
creando un patrón en el óxido usando un proceso de grabado por iones
reactivos convencional. Se pueden adquirir fácilmente tanto el
PECVD como los procesos de RIE.
Etapa 6, véase la Figura 7
Platino 1. Esta capa sirve para formar las dos
estructuras serpenteantes usadas como detectores de temperatura y
para formar electrodos usados en los procesos de captura de esporas
y de detección de ADN. Se prevé que la película se estampe por
fotolitografía por levantamiento de resina
(lift-off) y se deposite por deposición de haz de
electrones. En su lugar, es posible usar deposición por metalizado
por bombardeo y retrograbado por metalizado por bombardeo o grabado
por iones reactivos. Sin embargo, probablemente la vía de
levantamiento de la resina será la que se pueda adquirir más
fácilmente.
Etapa 7, véase la Figura 8
Contacto 2. Puede ser necesario un segundo
material de capa de contacto para facilitar la unión de cables a
las películas de platino.
Etapa 8, véase la Figura 9
Aislamiento eléctrico 2. Esta capa sirve para
aislar los detectores de temperatura de la muestra. Se prevé un
óxido de PECVD depositado y estampado esencialmente como en la etapa
5.
Etapa 9, véase la Figura 10
Planarización 1. Si la unión de la tapa requiere
una superficie especialmente plana entonces puede ser necesario
depositar una capa global que pueda pulirse hasta un alto grado de
llanura, antes de retirarla de todas partes excepto de la región de
unión de la tapa. Dichos procesos de planarización son cada vez más
comunes y son los más eficaces. Por ejemplo, el cristal líquido en
la industria de pantallas de silicio usa procesos de este tipo para
permitir que se formen superficies de espejo de calidad óptica sobre
una topografía de circuito integrado densa.
Etapa 10, véase la Figura 11 y la Figura 12
Para la finalización en esta fase se muestra un
separador de "marco de imagen" y la tapa del dispositivo. Se
analizan a continuación. Se asume que la etapa tiene una capa de
platino global o una capa de titanio-oro. El corte
de muesca fuera en la pared lateral del marco es para permitir que
se ponga en contacto la película de platino en la tapa con el
sustrato de silicio principal. Esto se consigue usando un material
conductor inyectado, tal como un epoxi cargado.
El dispositivo final se muestra en la Figura
13.
Se prefiere una cubierta de vidrio puesto que
ofrece una barrera térmica eficaz en un material demostrado. Se
introduce una ligera complejidad por la necesidad de definir una
estructura de platino en esta tapa, y por los puertos de fluido,
pero esto no está fuera de lo normal.
Una decisión de diseño clave es si se incluye
algún detector de temperatura y calentamiento en la cubierta. Si se
incluyen entonces el flujo de proceso es más complicado.
Podría producirse una cubierta sencilla que
tenga sólo un electrodo de platino expuesto usado para captura de
esporas mediante metalizado por bombardeo simple o evaporación de
haces de electrones de platino sobre el sustrato de vidrio
completo. Si se incorporan calentadores y detectores de temperatura
entonces se usaría un flujo de proceso seleccionado de las etapas
3-9 del proceso de silicio de base. Puede haber
ligeras variaciones en los detalles de las etapas del flujo para
adaptarse al vidrio en oposición al sustrato de silicio.
Una vez que se fabrican las películas finas, los
puertos de fluido se fabricarían a máquina a través del vidrio.
Están disponibles diversos medios para esto, por ejemplo, usando una
máquina de micropulido con un eje de alta velocidad. Otras vías
incluyen erosión por chispas, pulido ultrasónico y limpieza mediante
aspersión de arena.
El canal se forma usando una capa separadora
unida tanto al silicio como al vidrio. Son posibles muchas vías
para formar y unir esta capa. Las vías preferidas son películas
adhesivas y PDMS activado o simplemente fijado. Las alternativas
para la formación de canales son las siguientes:
Al nivel más simple posible puede ser posible
definir el canal mediante troquel o láser, por corte en una
película adhesiva de 300 \mum de espesor. Dichos adhesivos se usan
ampliamente en el mercado público de dispositivos de ensayo
médicos. Sin embargo, puede haber preocupaciones sobre la fiabilidad
a largo plazo para la solicitud actual. El uso de cinta adhesiva
sería posible si el dispositivo se usara como desechable.
En este proceso se moldea una junta en goma de
silicona. Dichas piezas moldeadas se producen fácilmente en
cantidades moderadas, produciéndose de forma económica prototipos.
El proceso de moldeo permite la retención de detalles muy finos. El
proceso de unión de goma de silicona a vidrio por activación con
plasma de oxígeno de la silicona está bien establecido en muchos
grupos. Forma fácilmente uniones duraderas que tienen alta
resistencia de unión: típicamente el material de goma de silicona
falla por rotura, antes de que falle la unión al vidrio. Puesto que
la fabricación de silicio finaliza con una capa de óxido de PECVD,
puede usarse una junta de PDMS para unir los dos componentes y
formar el precinto.
Si el envase y el dispositivo se diseñan juntos
entonces puede resultar atractivo usar un precinto fijado. Lo más
probable es que éste sea de PDMS. Esto podría ser un corte por láser
o troquel a partir de una lámina moldeada con precisión hasta un
espesor marginalmente en exceso de los 300 \mum deseados. Se
usarían separadores de precisión en el ensamblaje para limitar la
compresión del precinto y por lo tanto limitar la excursión lateral
en la compresión.
Es posible la unión por fusión de componentes de
vidrio siempre que ambas superficies sean muy planas y estén
limpias. La salvedad principal de esta vía es que las temperaturas
necesarias pueden resultar ser demasiado elevadas para permitir el
uso de cualquier material polimérico en el dispositivo.
Una posibilidad interesante es formar un marco
que defina los canales en vidrio fino o quizás definir el canal por
grabado en la tapa. Después se deposita una metalización de película
fina y se crea un patrón para definir el área de sellado y se
electrodeposita una capa de indio. Esta capa es del orden de 25
\mum de espesor, depositándose una capa similar sobre la región
de sellado de los otros componentes. Para ensamblar los
componentes, el indio se limpia para eliminar el óxido superficial,
típicamente con HCl diluido, y después se aclara con disolventes.
Después se ponen en contacto las dos superficies de indio limpias e
inmediatamente se sueldan en frío entre sí.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspenden cien mg de Biobit Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki que contienen
aproximadamente 10^{9} esporas/g (Valent BioSciences Corp,
Libertyville, Estados Unidos) en 1 ml de agua desmineralizada y se
centrifugan durante 90 s a 12000 rpm. Se desecha el sobrenadante.
Este procedimiento se repite cuatro veces. Antes de la última
resuspensión, se retira una muestra para la determinación del número
de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. El tubo se deja
para desecación, por ejemplo, al vacío hasta que se seque.
Se siembran diluciones seriadas en placas de
agar-LB (sustrato de Luria Bertani; 10,0 g de
triptona, 5,0 g de extracto de levadura, 10,0 g de NaCl, 15,0 g de
agar resuspendido en 1,0 litros de H2O - pH = 7,0, esterilizado en
autoclave), se incuban a 30ºC durante una noche y se inspeccionan
para determinar las colonias a simple vista. El número de UFC
permite la determinación de esporas en el polvo.
Las esporas de Bacillus thuringiensis
lavadas y secadas se formulan en aerosol en una cámara de aerosol
apropiada dando como resultado una concentración de esporas
aproximada de 10^{4}-10^{5} esporas por litro.
La microplaca/cámara de muestreo para la que se va a determinar la
eficacia de captura está conectada al dispositivo, estando por lo
tanto asociada funcionalmente. Entonces, la microplaca/cámara de
muestreo se conecta a la cámara de aerosol y se aspira el aerosol a
través de la cámara de muestra de la microplaca con un flujo de gas
de aproximadamente 50 ml/minuto. Un contador de partículas (por
ejemplo, analizador modelo 3321 de TSI Inc., 500 Cardigan Road,
Shoreview, MN 55126-3996, Estados Unidos) se conecta
a la salida de la microplaca y cuenta el número de esporas en el
intervalo de tamaños de 1-10 \mum que abandonan la
microplaca.
Primero se mide el número de esporas en 25 ml de
aerosol por aspiración del aerosol mientras se ajustan los
potenciales del primer y segundo electrodos a tierra. El número de
esporas medido se usa como el valor de control, N_{c}.
Después, se aplican los potenciales
seleccionados al primer y al segundo electrodo, se aspiran otros 25
ml de aerosol a través de la microplaca y se mide el número de
esporas que salen de la microplaca durante la aspiración. Este
valor se denomina N_{s}.
La eficacia de captura de la microplaca/cámara
de muestreo a los potenciales seleccionados se calcula como
(N_{c}-N_{s})/N_{c}*100%.
\newpage
Se resuspenden cien mg de Biobit Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki que contiene aproximadamente
10^{9} UFC/g (Valent BioSciences Corp, Libertyville, USA) en 1 ml
de agua desmineralizada y posteriormente se pasteurizan a 70ºC
durante 5 minutos, y posteriormente la solución se centrifuga (5000
x g, 5 minutos). Se desecha el sobrenadante. Este procedimiento
(Tindalización) se repite dos veces más. La solución final de 1 ml
contiene aproximadamente 10^{8} esporas.
Esta solución se diluye hasta una concentración
final de 10^{5} esporas/ml, constituyendo de esta manera la
solución madre.
La cámara de muestra se llena con una muestra de
solución madre y la muestra se expone a un campo eléctrico alterno
que tiene una frecuencia, amplitud y duración seleccionadas.
Para determinar el porcentaje de liberación de
ADN/ARN de las células biológicas de la muestra, tanto la muestra
expuesta como un control que contiene solución madre se tratan con
el fluorocromo
4',6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI). DAPI se usa ampliamente como un tinte de ADN que forma un
complejo fluorescente cuando se une a secuencias ricas en
A-T en el surco menor del ADNbc. La solución de
tinción es una solución acuosa que contiene DAPI a 2,0
\mug/ml.
La cámara de muestra se eluye con un volumen de
solución de tinción cuyo volumen es tres veces el volumen de la
cámara de muestra. El eluyente de la cámara de muestra se deja
incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Un volumen de control comparable al volumen de
la muestra expuesta se tiñe por separado durante 5 minutos con un
volumen de solución de tinción que es aproximadamente tres veces el
volumen de control.
Después se visualizan un volumen apropiado del
control y un volumen apropiado de la muestra expuesta en
microscopia de contraste de fases y microscopia de fluorescencia
(suministrada con un filtro DAPI). Tanto para el control como para
la muestra expuesta, el número de esporas se cuenta mediante
microscopía de contraste de fase y el número de esporas que
presentan una liberación de moléculas de ADN cromosómico (visibles
como manchas azules) se cuenta mediante microscopia de
fluorescencia. Después se determina el porcentaje de liberación de
ADN/ARN como
\frac{d_{s}}{s_{s}} \cdot
100%
donde d_{s} es el número contado
de manchas de ADN azules y s_{s} es el número total de
esporas.
También puede determinarse el porcentaje de
liberación de ADN/ARN de fondo para el control y si muestra una
liberación de fondo de más del 5%, se sugiere que la determinación
se considere inválida y que se repita en una nueva solución madre
de células biológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Patente de Estados Unidos 5.723.591
Documento WO 03/074,731
Documento EP 1 481 083
O'Brien et al O'Brien D,
Baron P, Willeke K. (1986) Size and
concentration measurement of an industrial aerosol. Am Ind Hyg
Assoc J. 47:386-92
Linden, D. Linden, David.
(1984). Handbook of Batteries and Fuel Cells. New
York: McGraw-Hill
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
- \bullet US 5674742 A
- \bullet US 4683195 A
- \bullet US 6586253 B
- \bullet US 4800159 A
- \bullet US 6673621 B
- \bullet US 4965188 A
- \bullet WO 0026405 A
- \bullet WO 03074731 A
- \bullet US 6511831 B
- \bullet EP 1481083 A
\bulletO'Brien D; Baron P;
Willeke K. Size and concentration measurement of an
industrial aerosol. Am Ind Hyg Assoc J., 1986, vol.
47, 386-92 [0277]
Claims (12)
1. Procedimiento para detectar una partícula
biológica en una muestra gaseosa, comprendiendo el procedimiento
las etapas de:
- a)
- proporcionar una cámara de muestra y un primer y segundo electrodos, estando el primer y el segundo electrodos y la cámara de muestra situados de modo que al menos una parte de la cámara de muestra esté entre el primer y el segundo electrodos, siendo la distancia entre el primer y el segundo electrodos de 20 mm como máximo,
- b)
- proporcionar una muestra gaseosa en la cámara de muestra,
- c)
- aplicar un primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al segundo electrodo, produciéndose por lo tanto una diferencia de potencial y un campo eléctrico entre el primer y el segundo electrodos para contribuir a la recogida electrostática en la cámara de muestra de una partícula biológica de la muestra gaseosa,
- d)
- poner en contacto la partícula biológica recogida con un primer reactivo líquido, obteniendo de este modo una mezcla de reacción,
- e)
- exponer dicha mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, teniendo dicho campo eléctrico alterno una amplitud suficiente para permitir la extracción de material biológico de la partícula biológica,
- f)
- realizar la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana, y
- g)
- medir la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o de los productos resultantes de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y, opcionalmente, inferir que la partícula biológica se ha detectado en la muestra si al menos está presente una copia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o si está presente al menos un producto resultante de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el primer y el segundo electrodos se
sitúan en lados opuestos de la cámara de muestra.
3. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que primer reactivo líquido
comprende uno o más reactivos necesarios para realizar una
amplificación de ácido nucleico.
4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que el primer reactivo
líquido comprende uno o más reactivos seleccionados del grupo que
consiste en un cebador, un nucleótido trifosfato y una
polimerasa.
5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-4, en el que el primer
reactivo líquido comprende además una oligosonda de ácido nucleico
degradable por exonucleasa 5'-3', dando como
resultado la degradación de dicha sonda de ácido nucleico la
liberación de un componente redox activo.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que el componente redox activo es un
metaloceno tal como, por ejemplo, ferroceno.
7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la amplificación de
ácido nucleico de la etapa f) se realiza usando una técnica de
amplificación seleccionada del grupo que consiste en técnicas de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por
desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por círculo rodante
mediada por ligación (L-RCA) y sus
combinaciones/modificaciones.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que la amplificación de ácido nucleico de la
etapa f) es PCR.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la amplificación de ácido nucleico de la
etapa f) es PCR anidada, preferiblemente PCR anidada en un solo
tubo.
10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en el que la medición de la etapa
g) comprende una medición voltamétrica.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que la medición voltamétrica se realiza
usando voltametría pulsátil diferencial u otro medio de resta de
señal de referencia para aumentar la relación entre la señal y las
interferencias.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 u 11, en el que la medición voltamétrica se
realiza usando electrodos de detección situados en la cámara de
muestra.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK200400303 | 2004-02-26 | ||
| DKPA200400303 | 2004-02-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2330347T3 true ES2330347T3 (es) | 2009-12-09 |
Family
ID=34895919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05706792T Expired - Lifetime ES2330347T3 (es) | 2004-02-26 | 2005-02-25 | Metodo, chip, dispositivo y sistema integrado para la deteccion de particulas biologicas. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7892794B2 (es) |
| EP (1) | EP1730518B1 (es) |
| JP (1) | JP4750781B2 (es) |
| CN (1) | CN1947011B (es) |
| AT (1) | ATE436015T1 (es) |
| CA (1) | CA2557485A1 (es) |
| DE (1) | DE602005015299D1 (es) |
| DK (1) | DK1730518T3 (es) |
| ES (1) | ES2330347T3 (es) |
| IL (1) | IL177693A0 (es) |
| PL (1) | PL1730518T3 (es) |
| WO (1) | WO2005083426A2 (es) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005083391A1 (en) * | 2004-02-26 | 2005-09-09 | Thomsen Bioscience A/S | Method, chip, device and system for collection of biological particles |
| US8298389B2 (en) * | 2005-09-12 | 2012-10-30 | Abbott Diabetes Care Inc. | In vitro analyte sensor, and methods |
| DE102005062174C5 (de) * | 2005-12-23 | 2010-05-06 | INSTITUT FüR MIKROTECHNIK MAINZ GMBH | Meßchip |
| JP4908182B2 (ja) * | 2006-12-22 | 2012-04-04 | 栄研化学株式会社 | 核酸増幅の有無の判定方法、標的核酸の検出方法及びそれらに用いられる装置 |
| WO2008156135A1 (ja) * | 2007-06-20 | 2008-12-24 | Toyohashi University Of Technology | 核酸を有する微粒子の計測方法および装置 |
| JP5518093B2 (ja) * | 2009-10-13 | 2014-06-11 | 株式会社日立製作所 | イオン検出装置 |
| EE201000013A (et) * | 2010-01-29 | 2011-10-17 | Selfdiagnostics O� | Meetod ja kiirtesti seade sihtmrk-molekuli proovimaterjalist detekteerimiseks |
| WO2011125600A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-13 | パナソニック電工 株式会社 | 細胞活性化方法および細胞活性化装置 |
| GB201009998D0 (en) * | 2010-06-15 | 2010-07-21 | Bg Res | Cell disruption |
| US9618431B2 (en) * | 2010-11-30 | 2017-04-11 | Inspirotec, Inc. | Electrokinetic device for capturing assayable agents in a dielectric fluid |
| JP5829556B2 (ja) * | 2012-03-15 | 2015-12-09 | 日本特殊陶業株式会社 | 微粒子検知システム |
| JP2016168018A (ja) * | 2015-03-13 | 2016-09-23 | セイコーエプソン株式会社 | 核酸増幅反応装置及び核酸増幅方法 |
| EP3364186B1 (en) * | 2015-10-14 | 2020-04-08 | Alps Alpine Co., Ltd. | Flow path structure and device for measuring measurement object liquid |
| US10857536B2 (en) | 2016-01-08 | 2020-12-08 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Polymerase chain reaction device |
| CN106442243B (zh) * | 2016-09-27 | 2019-03-05 | 东南大学 | 一种用于检测粉尘浓度的装置及方法 |
| JP6917540B2 (ja) * | 2016-10-21 | 2021-08-11 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | コカインアプタマーおよびそれを用いてコカインを検出する方法 |
| PH12022552675A1 (en) | 2020-03-31 | 2024-05-06 | Force Tech | Method and quality system for determining a quality parameter of an agricultural group |
| CA3215011A1 (en) | 2021-04-30 | 2022-11-03 | Sarah PLACELLA | Device for collecting material from air |
| EP4426495A4 (en) * | 2021-11-01 | 2025-10-29 | Novel Microdevices Inc | APPARATUS FOR CONTROLLING DOSING PROCESSES IN A RESPONSE SAMPLE DEVICE AND ITS METHOD OF USE |
| TWI821853B (zh) * | 2022-01-05 | 2023-11-11 | 財團法人工業技術研究院 | 微機電感測裝置及其感測模組 |
| JP7489153B1 (ja) | 2024-01-05 | 2024-05-23 | 株式会社ファーストスクリーニング | エアロゾルの含有成分の測定方法、測定装置、反応液およびその混合キット |
Family Cites Families (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US342548A (en) * | 1886-05-25 | Alfred osten walker | ||
| US895729A (en) * | 1907-07-09 | 1908-08-11 | Int Precipitation Co | Art of separating suspended particles from gaseous bodies. |
| US1250088A (en) * | 1914-04-18 | 1917-12-11 | Int Precipitation Co | Process and apparatus for separation of suspended particles from gases. |
| US1204907A (en) * | 1915-06-17 | 1916-11-14 | Int Precipitation Co | Means for producing discharge of electricity into gases. |
| US1605648A (en) * | 1921-03-07 | 1926-11-02 | Milton W Cooke | Art of separating suspended matter from gases |
| US1931436A (en) * | 1930-11-03 | 1933-10-17 | Int Precipitation Co | Electrical precipitating apparatus |
| US2085349A (en) * | 1935-02-28 | 1937-06-29 | Research Corp | Electrical precipitation |
| US2129783A (en) * | 1935-10-15 | 1938-09-13 | Westinghouse Electric & Mfg Co | Electrical precipitator for atmospheric dust |
| US2142129A (en) * | 1936-04-22 | 1939-01-03 | Int Precipitation Co | Apparatus for electrical precipitation |
| US2297601A (en) * | 1940-09-03 | 1942-09-29 | American Air Filter Co | Electric gas cleaner |
| US2847082A (en) * | 1955-11-03 | 1958-08-12 | Westinghouse Electric Corp | Electrostatic precipitators |
| US3910779A (en) * | 1973-07-23 | 1975-10-07 | Gaylord W Penney | Electrostatic dust filter |
| US3999964A (en) * | 1975-03-28 | 1976-12-28 | Carrier Corporation | Electrostatic air cleaning apparatus |
| DE2756164C2 (de) | 1977-12-16 | 1982-11-25 | Claus H. Dr. 6800 Mannheim Beck | Vorrichtung zur Bestimmung der Anzahl der Partikel in Luft |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4800159A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| US4970154A (en) * | 1987-10-09 | 1990-11-13 | Baylor College Of Medicine | Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency |
| EP0386086B1 (en) | 1987-10-09 | 1996-05-29 | Baylor College Of Medicine | Method for cell poration and cell fusion using radiofrequency electrical pulses |
| US5639423A (en) * | 1992-08-31 | 1997-06-17 | The Regents Of The University Of Calfornia | Microfabricated reactor |
| US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US6071394A (en) | 1996-09-06 | 2000-06-06 | Nanogen, Inc. | Channel-less separation of bioparticles on a bioelectronic chip by dielectrophoresis |
| JP3154294B2 (ja) * | 1995-05-19 | 2001-04-09 | 株式会社ニックス | 核酸回収方法および核酸回収装置 |
| EP0846161B1 (en) | 1995-08-25 | 2005-08-17 | Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) | Release of intracellular material |
| US6673621B1 (en) * | 1996-10-04 | 2004-01-06 | Intronn Llc | Sample collection devices and methods using markers and the use of such markers as controls in sample validation, laboratory evaluation and/or accreditation |
| FR2764385B1 (fr) * | 1997-06-06 | 1999-07-16 | Commissariat Energie Atomique | Microsysteme d'analyse de liquides a cuvette integree |
| JPH1189567A (ja) | 1997-09-24 | 1999-04-06 | Nikko Kogyo Kk | 微生物を殺菌するシステム、及び遺伝子回収システム |
| DE19752961C1 (de) | 1997-11-28 | 1999-07-15 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren und Vorrichtung zum Aufschluß biologischer Zellen zur Extraktion und Analyse der Zellinhalte |
| CA2230653A1 (en) | 1998-02-27 | 1999-08-27 | The Governors Of The University Of Alberta | Microchip based enzymatic analysis |
| WO1999057314A1 (de) | 1998-05-04 | 1999-11-11 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Elektrische, integrierte nucleinsäureisolierung, -reinigung und -detektion |
| US5989824A (en) * | 1998-11-04 | 1999-11-23 | Mesosystems Technology, Inc. | Apparatus and method for lysing bacterial spores to facilitate their identification |
| US6729196B2 (en) * | 1999-03-10 | 2004-05-04 | Mesosystems Technology, Inc. | Biological individual sampler |
| US6221136B1 (en) * | 1998-11-25 | 2001-04-24 | Msp Corporation | Compact electrostatic precipitator for droplet aerosol collection |
| FI105259B (fi) * | 1999-03-02 | 2000-07-14 | Flaekt Ab | Sähkösuodatin |
| US6623945B1 (en) | 1999-09-16 | 2003-09-23 | Motorola, Inc. | System and method for microwave cell lysing of small samples |
| US6514721B2 (en) | 2001-07-03 | 2003-02-04 | Biochem Technologies, Inc. | Air sampler for pathogens and psychrometrics |
| US6686207B2 (en) | 2001-10-12 | 2004-02-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Manipulating micron scale items |
| US6807874B2 (en) * | 2002-01-21 | 2004-10-26 | Shimadzu Corporation | Collecting apparatus of floating dusts in atmosphere |
| JP3758577B2 (ja) * | 2002-01-22 | 2006-03-22 | 株式会社島津製作所 | 大気中の浮遊粒子状物質の捕集装置および捕集した浮遊粒子状物質の測定方法 |
| US6887362B2 (en) * | 2002-02-06 | 2005-05-03 | Nanogen, Inc. | Dielectrophoretic separation and immunoassay methods on active electronic matrix devices |
| GB0205455D0 (en) | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| EP1546367A4 (en) | 2002-07-24 | 2006-08-16 | Univ Texas | INFLUENCE AND DETECTION OF MICROBES WITH MEMBRANE PROCESSES |
| GB0218009D0 (en) | 2002-08-02 | 2002-09-11 | Imp College Innovations Ltd | DNA extraction microchip, system and method |
| US6623544B1 (en) * | 2002-10-31 | 2003-09-23 | Kamaljit S. Kaura | Air purification system and method of operation |
| CN1460855A (zh) * | 2003-06-13 | 2003-12-10 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种微流体生物传感器芯片装置及应用 |
-
2005
- 2005-02-25 CN CN2005800061502A patent/CN1947011B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-02-25 JP JP2007500052A patent/JP4750781B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-02-25 ES ES05706792T patent/ES2330347T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2005-02-25 DE DE602005015299T patent/DE602005015299D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2005-02-25 AT AT05706792T patent/ATE436015T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-02-25 WO PCT/DK2005/000130 patent/WO2005083426A2/en not_active Ceased
- 2005-02-25 PL PL05706792T patent/PL1730518T3/pl unknown
- 2005-02-25 EP EP05706792A patent/EP1730518B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2005-02-25 US US10/590,632 patent/US7892794B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-02-25 DK DK05706792T patent/DK1730518T3/da active
- 2005-02-25 CA CA002557485A patent/CA2557485A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-08-24 IL IL177693A patent/IL177693A0/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL1730518T3 (pl) | 2010-05-31 |
| JP2007523652A (ja) | 2007-08-23 |
| EP1730518B1 (en) | 2009-07-08 |
| CN1947011A (zh) | 2007-04-11 |
| WO2005083426A3 (en) | 2005-10-13 |
| US7892794B2 (en) | 2011-02-22 |
| DK1730518T3 (da) | 2009-11-16 |
| JP4750781B2 (ja) | 2011-08-17 |
| CA2557485A1 (en) | 2005-09-09 |
| EP1730518A2 (en) | 2006-12-13 |
| WO2005083426A2 (en) | 2005-09-09 |
| IL177693A0 (en) | 2006-12-31 |
| DE602005015299D1 (de) | 2009-08-20 |
| US20080220414A1 (en) | 2008-09-11 |
| CN1947011B (zh) | 2011-06-01 |
| ATE436015T1 (de) | 2009-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2330347T3 (es) | Metodo, chip, dispositivo y sistema integrado para la deteccion de particulas biologicas. | |
| ES2348951T3 (es) | Procedimiento, chip y sistema para la recogida de particulas biologicas. | |
| Qiu et al. | On-site airborne pathogen detection for infection risk mitigation | |
| ES2856074T3 (es) | Preparación de muestras de ácido nucleico | |
| ES2624685T3 (es) | Detección microbiana rápida y prueba de susceptibilidad antimicrobiana | |
| US20150140611A1 (en) | Portable Preparation, Analysis, and Detection Apparatus for Nucleic Acid Processing | |
| US7592139B2 (en) | High temperature flow-through device for rapid solubilization and analysis | |
| US20080003689A1 (en) | Systems and methods for sample modification using fluidic chambers | |
| ES2348130T3 (es) | Procedimiento, chip, dispositivo y sistema de extracción de materiales biológicos. | |
| WO2021243080A1 (en) | Magnetofluidic cartridges, devices and related methods of sample analysis | |
| Feng et al. | On-site monitoring of airborne pathogens: recent advances in bioaerosol collection and rapid detection | |
| 丁震昊 | DNA detection methods based on microbeads dielectrophoresis | |
| Crowther | Higher Order Electrokinetic Effects for Applied Biological Analytics | |
| IH8PECXED | NATO ADVANCED RESEARCH WORKSHOP |