ES2348130T3

ES2348130T3 - Procedimiento, chip, dispositivo y sistema de extracción de materiales biológicos.

Info

Publication number: ES2348130T3
Application number: ES05706794T
Authority: ES
Inventors: Gert Bolander Jensen; Lars Thomsen; Oene Robert Veltman
Original assignee: Delta Dansk Elektronik Lys og Akustik
Current assignee: Delta Dansk Elektronik Lys og Akustik
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2010-11-30
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: IL177694A0; US20080108119A1; EP1730276A1; DE602005021327D1; US7985540B2; WO2005083078A1; EP1730276B1; JP2007527237A; JP4796045B2; CA2557486A1; EP1730276B8; DK1730276T3; ATE468395T1; CN100535112C; CN1965081A

Abstract

Procedimiento para la extracción de material biológico de una espora bacteriana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar una cámara de muestra y un primer y un segundo electrodo, estando el primer y el segundo electrodo y la cámara de muestra situados de tal modo que al menos una parte de la cámara de muestra está entre el primer y el segundo electrodo, b) proporcionar una muestra líquida en la cámara de muestra, comprendiendo dicha muestra líquida una espora bacteriana, c) exponer dicha muestra líquida a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, siendo proporcionado dicho campo eléctrico alterno por el primer y segundo electrodo y teniendo una amplitud suficiente como para extraer material biológico de la espora bacteriana, y d) realizar un análisis en una parte de la muestra líquida expuesta, dicha parte comprendiendo material biológico extraído de la espora bacteriana.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001]La presente invención está relacionada con un método para la extracción de material biológico de células biológicas. La invención implica la exposición de las partículas biológicas a un campo eléctrico alterno en una cámara de muestra y puede implicar también análisis posteriores del material biológico después de la extracción.

ANTECEDENTES [0002]En respuesta a las amenazas de bioterrorismo se ha hecho cada vez más importante realizar una detección rápida y precisa de agentes de guerra biológica. La bacteria Bacillus anthracis es un miembro del grupo formador de endosporas de Bacillus cereus. Bacillus anthracis es un agente de guerra biológica altamente letal que es fácil de obtener, almacenar y aplicar como un arma biológica. Para realizar una detección fiable de Bacillus anthracis debe analizarse el ADN, puesto que las diferencias fenotípicas entre los miembros del grupo de Bacillus cereus en algunas ocasiones son menores del 1%. [0003]Por ejemplo, Bacillus cereus difiere sólo de Bacillus anthracis en que el segundo contiene dos plásmidos adicionales llamados pXO1 y pOX2. Las cepas no virulentas de Bacillus anthracis que carecen de pXO1 y pXO2 son virtualmente indistinguibles de Bacillus cereus. En teoría, la transferencia de los plásmidos pXO1 y pXO2 a miembros del grupo de Bacillus cereus transformará estas bacterias en Bacillus anthracis funcionales. Por esta razón, el análisis de ADN y la discriminación de los plásmidos pXO1 y pXO2 por medio de hibridación de ADN, secuenciación o PCR es el único método válido para determinar si el organismo detectado es Bacillus anthracis. [0004]Debido a su capacidad para resistir en ambientes adversos, la liberación y extracción de ADN de una endospora es una tarea difícil. El procedimiento normal usado en la detección de Bacillus anthracis es germinar las esporas en un sustrato de cultivo, recoger las bacterias y posteriormente extraer el ADN de las bacterias vegetativas, un procedimiento que puede llevar desde muchas horas a un día (Levi et al 2003). Otros métodos incluyen técnicas elaboradas como ruptura mecánica, ciclos de congelación/descongelación o tratamiento químico (Johns et al 1994). Sin embargo, la cubierta y la corteza de la espora son estructuras bioquímicas desarrolladas para una hibernación prolongada que puede durar miles de años. Un ejemplo famoso es una bacteria revivida a partir de una endospora que se encontró en el intestino de una abeja embebida en ámbar

5 (Cano & Borucki 1995). Además, la ruptura mecánica (golpeo con perlas) da como resultado una mala calidad del ADN liberado (Levi et al 2003). Usando la tecnología actual, es posible liberar el ADN en un periodo de 5-10 minutos a partir de las endosporas mediante la combinación de tratamientos físicos, mecánicos y químicos, pero incluso cinco minutos para la extracción de ADN

10 se considera un tiempo largo cuando la aplicación es un control de ataques de bioterrorismo llevados a cabo mediante aerosoles. El uso de procedimientos multietapa elaborados no es óptimo en la situación de tensión que es un posible ataque con ántrax. Por esta razón existe la necesidad de una tecnología que permita una extracción rápida (en

15 segundos) del ADN en un solo paso sin intervención directa, a partir de endosporas de bacterias Gram positivas. [0005]Las bacterias Gram positivas del género Bacillus y Clostridia son capaces de experimentar un proceso al final de la fase de crecimiento exponencial llamado esporulación. Durante la esporulación, las bacterias

20 forman una espora resistente capaz de persistir en ambientes adversos. La espora es una estructura latente con sólo unas pocas enzimas metabólicas activas que inducen la germinación cuando la espora se expone a nutrientes. La espora es muy diferente en su composición bioquímica como se representa en la Tabla 1.

25 Tabla 1. Diferencias en la composición bioquímica existente entre las esporas y las células vegetativas de especies de Bacillus.

Niveles de moléculas (mol/g [peso seco])

Molécula pequeña: Espora de Bacillus Célula vegetativa de Bacillus

NADH: <0,002 1,95

NAD: 0,11 0,35

NADPH: <0,001 0,52

NADP: <0,018 0,44

ATP: <0,005 3,6

ADP: 0,2 1

AMP: 1,2-1,3 1

3PGA: 5-18 <0,2

DPA: 410-470 <0,1

Ca2+: 380-916

Mg2+: 86-120

Mn2+: 27-56

H+: 6,3-6,5 7,5-8,2

[0006]Las estructuras bioquímicas y el estado fisiológico latente hace a la endospora una entidad extremadamente resistente al calor, estrés mecánico y estrés químico, lo cual plantea un problema particular en términos de la

5 rapidez en la preparación de la muestra y en la extracción de ADN de agentes de guerra biológica para conseguir una rápida identificación. Las esporas pueden resistir, por ejemplo, un hervido prolongado sin romperse. El destino final medioambiental de la espora no se conoce en detalle. Las esporas pueden sobrevivir “indefinidamente” en ambientes secos y

10 protegidos. Excavaciones en el Parque Nacional Kruger en Sudáfrica revelaron esporas de B. anthracis de más de 200 años de edad (como se dató mediante el método de carbono 14) que aún eran capaces de germinar en el laboratorio. [0007]Los métodos más sensibles de detección de bacterias y virus se

15 basan en conseguir acceso a los componentes intracelulares de los organismos, tales como su material genético. [0008]El documento US 2003/0.146.100 describe la separación dielectroforética de células de la sangre seguida de lisis electrónica en células aisladas y digestión, realizada en una microplaca con un conjunto de

20 electrodos es una cámara de flujo. La electroforesis se realizó con un campo sinusoidal de 10 kHz y la lisis se realizó con una serie de 400 pulsos de 500 V y 50 s de duración o 40 pulsos de 200 V y 10 s de duración (onda cuadrada). [0009]El documento US 2002/0115201 describe lisis celular usando

25 microondas en el intervalo de 2,45-310 GHz, liberando de este modo ADN de células en suspensión líquida. Se describe adicionalmente una cámara con electrodos externos planos paralelos para la aplicación de microondas, teniendo la cámara canales de flujo para proporcionar la muestra a la cámara.

30 [0010]El documento US 4.970.154 describe un método para insertar genes ajenos en células usando radiofrecuencia de pulsos. Describe adicionalmente la electroporación y fusión de células suspendidas en una solución en una cámara usando campos eléctricos oscilantes de radiofrecuencia de pulsos entre electrodos en la cámara. La frecuencia varía desde 60 Hz a 10 MHz, con intensidades de campo de 100-400 V/cm. [0011]El documento WO99/57314A describe el aislamiento de ácido nucleico mediante el uso de campos eléctricos por medio de un portador de muestras en forma de microplaca (ejemplo 5). [0012]El documento WO2004/013329 describe un método de extracción de ADN para extraer ADN a partir de una muestra que incluye un material que contiene ADN (típicamente células bacterianas), comprendiendo el método las etapas de proporcionar una microplaca de extracción de ADN que incluye un canal principal; suministrar flujos paralelos primero y segundo a través del canal principal, siendo el primer flujo de una muestra que incluye material que contiene ADN y el segundo flujo de un medio de separación; aplicar un campo de electroporación al primer flujo de muestra que incluye un material que contiene ADN de modo que se efectúe la electroporación del material que contiene ADN; y aplicar un campo de electroseparación a lo largo del canal principal de modo que se efectúe electroseparación de ADN del material que contiene ADN sometido a electroporación en el primer flujo hacia el segundo flujo paralelo. [0013]El documento WO97/08293A describe un método para la liberación de material intracelular desde células, que comprende: la aplicación de cómo máximo 50 V a una suspensión que contiene las células. También se reivindica un método para producir ácido nucleico monocatenario que comprende la liberación de ácido nucleico bicatenario a partir de células como se ha descrito anteriormente usando un electrodo y la desnaturalización del ácido nucleico mediante la aplicación de un voltaje a la suspensión con el electrodo para convertir el ácido nucleico bicatenario en ácido nucleico monocatenario. [0014]El documento WO99/28742A describe un método en el que se rompen células biológicas para extraer los contenidos celulares para su análisis mediante su sometimiento a un campo eléctrico. Las células se ponen en contacto con una sustancia para estimular la ruptura celular, antes de o mientras el campo eléctrico afecta a las células. [0015]El documento US5891694 describe un método para la recuperación de ácido nucleico que comprende: la aplicación de una corriente eléctrica a una solución que contiene un microbio y se recuperan ácidos nucleicos y preferiblemente proteínas de la solución. E. coli se cultivó y diluyó mediante suero salino fisiológico. Se sumergió una membrana de hilo hueco recubierta de metal en la solución y se aplicó una corriente pulsátil de 200 mA a la membrana. [0016]El documento WO00/26405A describe un método para lisar una célula, para exponer el material nuclear. Dicho método comprende: crear una descarga ionizante; proporcionar una superficie en la que célula se dispondrá antes o después de que la célula se lise; y someter a la célula a la descarga ionizante que provoca que la membrana celular de la célula se rompa de modo que se exponga el material nuclear.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0017]Un objeto de la presente invención está relacionado con la provisión de métodos para extraer, es decir, para conseguir acceso al material biológico de células biológicas. Con respecto a un objeto de la presente invención, la expresión “célula biológica” indica una espora bacteriana. [0018]Otro objeto de la presente invención está relacionado con la provisión de métodos para la extracción de material biológico de células biológicas a un porcentaje de liberación alto, es decir, el material biológico se extrae o libera a partir de un alto porcentaje de células biológicas. [0019]Otro objeto de la presente invención está relacionado con la provisión de métodos para la extracción de material biológico de células biológicas sin dañar el material biológico. [0020]Otro objeto más de la presente invención está relacionado con la provisión de métodos que permiten fácilmente el análisis adicional de material biológico extraído. [0021]Otro objeto más de la presente invención está relacionado con la provisión de métodos en los que la extracción de material biológico y el análisis posterior del material biológico se realizan en la misma estructura y preferiblemente en la misma cámara. [0022]Otros objetos de la invención se pondrán de manifiesto al leer la descripción y los ejemplos. [0023]Un aspecto de la presente invención está relacionado con un método para la extracción de material biológico de una célula biológica, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar una cámara de muestra y un primer y segundo electrodos, estando el primer y el segundo electrodos y la cámara de muestra situados de tal manera que al menos una parte de la cámara de muestra está entre el primer y segundo electrodo, b) proporcionar una muestra líquida en la cámara de muestra, comprendiendo dicha muestra líquida una célula biológica, c) exponer dicha muestra líquida a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, proporcionándose dicho campo eléctrico alterno mediante el primer y el segundo electrodo y teniendo una amplitud suficiente para que se extraiga el material biológico de la célula biológica. [0024]En una realización preferida de la invención, el método comprende adicionalmente una etapa (d) de realizar un análisis en una parte de la muestra líquida expuesta, comprendiendo dicha parte material biológico extraído de la célula biológica. El análisis puede comprender, por ejemplo, un análisis genético o un análisis de proteínas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS [0025]A continuación se describirán algunas realizaciones de la presente invención con referencia a las figuras, en las que la Figura 1 muestra el efecto de la duración de exposición al campo eléctrico alterno sobre el porcentaje de liberación de ADN/ARN (medido mediante PCR en tiempo real y fluorescencia), la Figura 2 muestra el efecto de la exposición prolongada al campo eléctrico alterno sobre el porcentaje de liberación de ADN/ARN (medido mediante PCR en tiempo real y fluorescencia), la Figura 3 muestra que los tiempos de exposición más largos no tienen un efecto adverso sobre la calidad del ADN diana, la Figura 4 muestra el efecto de la frecuencia del campo eléctrico alterno sobre el porcentaje de liberación de ADN/ARN (medido mediante PCR en tiempo real y fluorescencia), la Figura 5 muestra el efecto de la amplitud del campo eléctrico alterno sobre el porcentaje de liberación de ADN/ARN (medido mediante PCR en tiempo real y fluorescencia), y la Figura 6 muestra la sección transversal de dos realizaciones de una microplaca.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN [0026]Un aspecto de la presente invención está relacionado con un método para extraer material biológico de una célula biológica, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar una cámara de muestra y un primer y segundo electrodos, estando el primer y segundo electrodos y la cámara de muestra situados de tal modo que al menos una parte de la cámara de muestra está entre el primer y el segundo electrodos, b) proporcionar una muestra líquida a la cámara de muestra, comprendiendo dicha muestra líquida una célula biológica, c) exponer dicha muestra líquida a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, proporcionándose dicho campo eléctrico alterno mediante el primer y el segundo electrodos y teniendo una amplitud suficiente para extraer material biológico de la célula biológica. [0027]En una realización preferida de la invención, el método comprende adicionalmente una etapa (d) de realizar un análisis en una parte de la muestra líquida expuesta, comprendiendo dicha parte material biológico extraído de la célula biológica. El análisis puede comprender, por ejemplo, un análisis genético o un análisis de proteínas. [0028]El análisis genético puede comprender, por ejemplo, procedimientos tales como la incubación con enzimas de restricción, amplificación de ácidos nucleicos tal como el proceso de PCR, electroforesis y detección tal como, por ejemplo, detección de fluorescencia o detección electroquímica. El proceso de PCR y la detección pueden realizarse, por ejemplo, de acuerdo con los métodos y usando los kits descritos en la solicitud PCT en trámite junto con la presente “Method, kit and system for enhanced nested PCR” (Método, kit y sistema para PCR anidada mejorada) que tiene el número de publicación WO 2005 08 3114. [0029]En una realización preferida de la invención, la parte de la muestra líquida expuesta en la que se realiza un análisis genético adicional comprende al menos un 20% de la muestra líquida de la cámara de muestra, tal como al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97,5, 99, 99,5 ó 99,9% de la muestra líquida en la cámara de muestra, tal como al menos aproximadamente el 100% de la muestra líquida en la cámara de muestra. [0030]De acuerdo con la presente invención, los términos “extracción” y “extraer” se refieren a liberar el material biológico de dichas una o más células biológicas, es decir, por ejemplo, hacer que el material biológico esté disponible para un análisis adicional en la muestra líquida. Los términos “extracción” y “extraer” también se refieren, por ejemplo, a abrir y/o romper la pared celular o barrera celular de la célula biológica lo suficiente como para permitir que el material biológico escape al líquido circundante. Después de que se haya extraído el material biológico, éste aún puede localizarse cerca de la célula biológica o puede transportarse a otra localización, por ejemplo, mediante fuerzas electroforéticas. El material biológico puede, por ejemplo, adsorberse en un electrodo después del transporte electroforético. [0031]En el presente contexto, la expresión “célula biológica” se refiere a una partícula que comprende una espora bacteriana. [0032]En una realización preferida de la invención, la célula biológica es un microorganismo transportado por el aire. [0033]Por ejemplo, la espora bacteriana puede estar formada por una bacteria seleccionada del género Bacillus y/o del género Clostridium. [0034]En una realización preferida de la invención, la espora bacteriana es una espora formada por Bacillus anthracis. La célula biológica puede comprender, por ejemplo, una espora bacteriana formada por Bacillus anthracis. Además, la célula bacteriana puede consistir esencialmente en una o más esporas bacterianas formadas por Bacillus anthracis. [0035]Además, la célula biológica puede ser una bacteria vegetativa o una espora. [0036]El material biológico extraído de la célula biológica típicamente comprende un componente seleccionado del grupo que consiste en un orgánulo celular, un material genético y una proteína. [0037]El material genético puede comprender, por ejemplo, ADN cromosómico y/o ADN plasmídico y/o cualquier tipo de ARN. [0038]La proteína puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en enzimas, proteínas estructurales, proteínas de transporte, canales iónicos, toxinas, hormonas y receptores. [0039]Preferiblemente, el material biológico comprende ADN y/o ARN. [0040]De acuerdo con la presente invención, la expresión “muestra líquida” se refiere a una sustancia líquida, una solución o suspensión, que puede comprender o no uno o más compuestos de interés. La muestra líquida puede ser, por ejemplo, una muestra biológica o una muestra no biológica. [0041]Una muestra biológica puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en frotis dérmico, líquido cefalorraquídeo, sangre, esputo, lavado bronco-alveolar, aspirados bronquiales, tejido pulmonar y orina.

[0042]Las muestras no biológicas pueden ser, por ejemplo, una suspensión líquida que comprende polvos, partículas de muestras de aire y partículas de muestras de tierra e hisopos de superficies. [0043]Pueden cultivarse muestras biológicas o no biológicas. Después, el cultivo puede evaluarse con respecto a la presencia de, por ejemplo, un microorganismo, tal como B. anthracis, usando los métodos, kits, microplacas, dispositivos y sistemas de la invención. [0044]Adicionalmente, la muestra líquida puede comprender uno o más reactivos requeridos para realizar una amplificación de ácido nucleico. [0045]La muestra líquida puede comprender uno o más reactivos seleccionados del grupo que consiste en un cebador, un ácido nucleico, un desoxinucleótido trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico. [0046]La muestra líquida puede comprender adicionalmente aditivos tales como 2-mercaptoetanol, por ejemplo a una concentración de 10 mM, BSA a una concentración de, por ejemplo, 1 mg/ml y/o un detergente a una concentración de, por ejemplo, 0,5% a 6% (p/v). El detergente puede seleccionarse del grupo que consiste en Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Tween20, Tween80 y detergentes no iónicos similares. [0047]En el presente contexto, la expresión “ácido nucleico”, “secuencia de ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” debería interpretarse en sentido amplio y puede ser, por ejemplo, un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. Esta expresión incluye moléculas compuestas de nucleobases, azúcares y enlaces covalentes internucleósido (troncales) de origen natural así como moléculas que tienen nucleobases, azúcares y enlaces covalentes internucleósido (troncales) de origen no natural que actúan de forma similar o combinaciones de los mismos. Dichos ácidos nucleicos modificados o sustituidos pueden preferirse ante formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, mayor afinidad por la molécula diana de ácido nucleico y mayor estabilidad en presencia de nucleasas y otras enzimas y se describen en el presente contexto mediante las expresiones “análogos de ácidos nucleicos” o “miméticos de ácidos nucleicos”. Son ejemplos preferidos de miméticos de ácidos nucleicos moléculas que comprenden ácido péptido nucleico (APN), Ácido Nucleico Cerrado (LNA), xilo-LNA, fosforotioato, 2’-metoxi-, 2’-metoxietoxi, morfolino y fosforamidato o derivados de ácidos nucleicos funcionalmente similares.

[0048]La expresión “polimerasa de ácido nucleico” se refiere a una enzima polimerasa de ADN dependiente de ADN o ARN que es preferiblemente termoestable, es decir, la enzima cataliza la formación de los productos de extensión de cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos que constituyen el molde bicatenario. Generalmente, la síntesis se inicia en el extremo 3’ de cada cebador y transcurre en dirección 5’ a 3’ a lo largo de la cadena molde. Se han aislado polimerasas termoestables de cepas termófilas o extremadamente termófilas tales como Thermus flavus, T. ruber,

T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. No obstante, también pueden emplearse polimerasas que no son termoestables en la amplificación de ácidos nucleicos siempre que se abastezca de enzima. [0049]La muestra líquida puede comprender adicionalmente una sonda de ácido oligonucleico degradable mediante exonucleasa 5’-3’, dando como resultado la degradación de dicho ácido nucleico la liberación de un componente activo redox. [0050]El componente activo redox puede ser, por ejemplo, un metaloceno tal como, por ejemplo, ferroceno. [0051]En una realización de la invención, el primer y el segundo electrodos están separados por una distancia que es como máximo 20 mm, preferiblemente como máximo 20 mm, tal como, como máximo 15 mm, 10 mm, 9 mm, 8 mm, 7 mm, 6 mm, 5 mm o como máximo 4 mm, siendo más preferiblemente como máximo 3 mm e incluso más preferiblemente como máximo 0,5 mm tal como, como máximo 0,3 mm, 0,2 mm, 0,1 mm, tal como, como máximo 0,05 mm. [0052]Por ejemplo el primer y el segundo electrodos pueden estar separados por una distancia en el intervalo de 0,05-20 mm, tal como en el intervalo de 0,05-0,1, 0,1-0,2, 0,2-0,3, 0,3-0,4, 0,4-0,5, 0,5-1, 1-2, 2-5, 5-10 o 10-15 mm, tal como en el intervalo de 15 a 20 mm. [0053]Típicamente, el primer y el segundo electrodos están separados por una distancia, que es de al 0,02 mm tal como al menos 0,03 mm o 0,05 mm. [0054]Normalmente, al menos una parte de la muestra líquida en la cámara de muestra se sitúa entre el primer y el segundo electrodos. Por ejemplo, al menos el 40% del volumen de la muestra líquida se sitúa entre el primer y el segundo electrodos, tal como al menos el 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97,5, 99, 99,5 ó 99,9% del volumen de la muestra líquida se sitúa entre el primer y el segundo electrodos, tal como al menos el 100% del volumen de la muestra líquida se sitúa entre el primer y el segundo electrodos. [0055]Preferiblemente, la célula biológica se coloca entre el primer y el segundo electrodos durante la etapa (c). La célula biológica puede incluso estar unida al primer o al segundo electrodo al menos inicialmente la etapa

(c) y posiblemente también durante la etapa (c). [0056]La expresión “y/o” usada en el contexto “X y/o Y” debería interpretarse como “X” o “Y” o “X e Y”. [0057]La microplaca de la presente descripción comprende una cámara de muestra que comprende una primera abertura. [0058]La primera abertura puede usarse para introducir la muestra en la cámara de muestra. La primera abertura puede estar en conexión fluida con una muestra, por ejemplo, el aire circundante. Como alternativa, la primera abertura está conectada a una o más válvulas, pudiendo abrirse dicha válvula o dichas válvulas para poner en conexión fluida la cámara de muestra con la muestra. [0059]En una realización importante de la invención, la cámara de muestra, por ejemplo la cámara de muestra de la microplaca, comprende una segunda abertura. La segunda abertura puede usarse, por ejemplo, para facilitar la introducción de una nueva muestra en la cámara de muestra permitiendo que salga el aire o la muestra de la cámara de muestra. La segunda abertura también puede usarse para introducir un primer reactivo líquido en la cámara de muestra. Como alternativa, el primer reactivo líquido puede entrar en la cámara de muestra mediante la primera abertura. [0060]La cámara de muestra, por ejemplo la cámara de muestra de la microplaca, es típicamente una cámara de muestra a microescala. En una realización de la invención, el volumen de la cámara de muestra es como máximo de 500 l, tal como, como máximo 400 l, 300 l, 200 l, 100 l, 50 l, 25 l, 15 l, 10 l, 5 l, 4 l, 3 l o como máximo 2 l, tal como, como máximo 1 l. Por ejemplo, el volumen de la cámara de muestra puede ser como máximo de 500 nl, tal como, como máximo 400 nl, 300 nl, 200 nl, 100 nl, 50 nl, 25 nl, 15 nl, 10 nl, 5 nl, 4 nl, 3 nl o como máximo 2 nl, tal como, como máximo 1 nl.

[0061]Típicamente, el volumen de la cámara de muestra es de al menos 10 nl. En una realización preferida de la invención, el volumen de la cámara de muestra está en el intervalo de 1 l-50 l, tal como 5 l-30 l. [0062]En una realización de la descripción, la distancia más pequeña entre un par de paredes opuestas es como máximo de 20 mm, tal como, como máximo 15 mm, 10 mm, 8 mm, 6 mm, 4 mm, 3 mm o 2 mm, tal como, como máximo 1 mm. Por ejemplo, la menor distancia entre un par de paredes opuestas es como máximo de 800 m, tal como, como máximo 600 m, 500 m, 400 m, 300 m, 200 m, 100 m, 50 m, 25 m, 15 m, 10 m, 5 m, 4 m, 3 m o como máximo 2 m, tal como, como máximo 1 m. [0063]Típicamente la distancia más pequeña entre un par de paredes opuestas es de al menos 5 m. En una realización preferida de la invención, la distancia más pequeña entre un par de paredes opuestas está en el intervalo de 50 m-500 m, tal como 100 m-400 m y 150 m-350 m. [0064]En una realización de la descripción, la longitud de la cámara de muestra, por ejemplo, la cámara de muestra de la microplaca, está en el intervalo de 1 mm-50 mm, tal como en el intervalo de 1 mm-10 mm, 10 mm20 mm, 20 mm-30 mm, 30 mm-40 mm o 40 mm-50 mm. En una realización preferida, la longitud de la cámara de muestra está en el intervalo de 2 mm-8 mm, tal como 3 mm-7 mm o 4 mm-6 mm. Por ejemplo, la longitud de la cámara de muestra puede ser de aproximadamente 4,5 mm. [0065]En una realización de la descripción, la anchura de la cámara de muestra, por ejemplo la cámara de muestra de la microplaca, está en el intervalo de 0,2 mm-10 mm, tal como en el intervalo de 0,2 mm-1 mm, 1 mm- 3 mm, 3 mm-5 mm, 5 mm-7 mm o 7 mm-10 mm. En una realización preferida, la anchura de la cámara de muestra está en el intervalo de 0,2 mm-2 mm, tal como 0,5 mm-1,5 mm y 0,75 mm-1,25 mm. Por ejemplo, la anchura de la cámara de muestra puede ser de aproximadamente 1 mm. [0066]En una realización de la descripción, la altura de la cámara de muestra, por ejemplo, la cámara de muestra de la microplaca, está en el intervalo de 50 m -2 mm, tal como en el intervalo de 100 m-1 mm, 200 m-900 m, 300 m-800 m, 500 m-700 m. En una realización preferida, la altura de la cámara de muestra está en el intervalo de 100 m-400 m, tal como 200 m-300 m. [0067]En una realización de la descripción, la longitud de la cámara de muestra, por ejemplo la cámara de muestra de la microplaca, es de aproximadamente 4,5 mm, la anchura de la cámara de muestra es de aproximadamente 1 mm y la altura de la cámara de muestra es de aproximadamente 300 m. [0068]En una realización de la presente descripción, la microplaca comprende adicionalmente un primer y un segundo electrodos. [0069]El primer y/o el segundo electrodos pueden tener diferentes tamaños

o dimensiones. Por ejemplo, el primer y/o segundo electrodos pueden tener una forma sustancial elegida del grupo que consiste en una lámina, una placa, un disco, un cable, un bastón; o cualquier combinación de las mismas. [0070]En una realización preferida de la presente descripción, el primer y segundo electrodos pueden ser, por ejemplo, electrodos de tipo lámina. [0071]En una realización preferida de la presente descripción, el primer electrodo y el segundo electrodo se encuentran uno frente al otro. Por ejemplo, pueden situarse en lados opuestos de la cámara de muestra. [0072]El primer electrodo y/o el segundo electrodo pueden situarse, por ejemplo, dentro de la cámara de muestra, sueltos en la cámara de muestra o unidos a una o más de las paredes de la cámara de muestra. [0073]El primer y/o el segundo electrodo o electrodos pueden incluirse en la pared o paredes de la cámara de muestra. Por ejemplo, el primer y el segundo electrodo o electrodos pueden incluirse en las paredes de la cámara de muestra. Como alternativa, el primer y/o el segundo electrodo o electrodos pueden situarse en la superficie o superficies exteriores de la microplaca. [0074]Preferiblemente, el primer electrodo y el segundo electrodo se sitúan en lados opuestos de la cámara de muestra. [0075]La diferencia de potencial entre el primer y el segundo electrodos puede estar en un intervalo que hace que se capturen partículas de tamaños uniformes o distintos en una superficie o se giren en una dirección dada que puede acomodar una selección o captura de las partículas de interés. [0076]Un electrodo, por ejemplo el primer electrodo y/o el segundo electrodo, puede formarse de varios materiales diferentes. Típicamente, los electrodos se forman de metales o aleaciones. El primer y el segundo electrodos pueden comprender, por ejemplo, un metal seleccionado del grupo que consiste en plata, oro, platino, cobre, carbono, hierro, grafito, cromo, níquel, cobalto, titanio, mercurio o una aleación de los mismos. [0077]También se concibe que un electrodo puede comprender un líquido conductor e incluso esencialmente consistir en un líquido conductor. El líquido conductor puede ser, por ejemplo, mercurio. [0078]La dimensión y/o estructura de los electrodos típicamente dependen de la dimensión y/o estructura de la cámara de muestra. La longitud y anchura de los electrodos son del mismo orden de magnitud que la longitud y anchura de la cámara de muestra. [0079]Los electrodos pueden formarse con tan poco como un recubrimiento de unas pocas capas de átomos de material conductor. [0080]En una realización de la invención, un electrodo, por ejemplo el primer y/o el segundo electrodos, tiene un grosor en el intervalo de 0,001 m-2000 m, tal como 0,001 m-1 m, 1 m-20 m, 20 m-200 m y 200 m-2000 m. En una realización de la invención, la cámara de muestra de la microplaca comprende adicionalmente un conjunto de electrodos de detección, por ejemplo, dos o tres electrodos de detección, para la detección de la presencia o ausencia de un componente activo redox, que por ejemplo puede liberarse a partir de una sonda. Los dos electrodos de detección pueden servir como electrodo de trabajo y electrodo auxiliar, respectivamente. Este conjunto de electrodos de detección puede comprender adicionalmente un electrodo de referencia. Típicamente, los electrodos de detección están formados de metales o aleaciones. Los electrodos pueden comprender, por ejemplo, un material seleccionado del grupo que consiste en carbono, plata, oro o platino. Después de la detección, los electrodos pueden sufrir formación de película sobre la superficie del electrodo. Para permitir una detección adicional de la sonda digerida, pueden colocarse conjuntos adicionales de electrodos de detección dentro de la cámara de muestra de la microplaca. [0081]En una realización de la invención, el primer y segundo electrodos pueden ser el conjunto de electrodos de detección. [0082]En una realización preferida de esta descripción, la microplaca comprende adicionalmente un elemento sensible a la temperatura que, por ejemplo, puede ser un resistor basado en metal sensible a la temperatura (un termistor) con un coeficiente de temperatura positivo (PTC) es decir, el termistor muestra una resistencia eléctrica creciente con aumentos de la temperatura ambiental y una resistencia eléctrica decreciente con una temperatura decreciente. [0083]El termistor puede, por ejemplo, seleccionarse del grupo de materiales que comprende cobre, níquel, hierro, aluminio, platino o aleaciones de los mismos. [0084]El termistor puede tener diferentes formas o dimensiones. Por ejemplo, el termistor puede tener una forma sustancial seleccionada del grupo de una lámina, una placa, un disco, un cable o un bastón. [0085]El termistor puede ser, por ejemplo, un electrodo en forma de cable. [0086]El electrodo de calentamiento puede tener diferentes formas o dimensiones. Por ejemplo, el electrodo de calentamiento puede tener una forma sustancial seleccionada del grupo de una lámina, una placa, un disco, un cable o un bastón. [0087]En una realización preferida de la presente invención, el electrodo de calentamiento puede ser, por ejemplo, un electrodo de tipo lámina. En una realización preferida de la presente invención, el electrodo de calentamiento puede situarse para permitir el calentamiento desde al menos un lado de la cámara de reacción. [0088]En otra realización más, uno o más electrodos de calentamiento suplementarios pueden situarse en los lados opuestos de la cámara de reacción. [0089]El electrodo de calentamiento está hecho de material eléctricamente conductor, preferiblemente seleccionado del grupo de níquel-cromo (NiCr), hierro-cromo-aluminio (FeCrAl), hierro-níquel-cromo (FeNiCr) u otras aleaciones de elementos de calentamiento. [0090]En una realización preferida de la descripción, la microplaca comprende una o más placas de contacto conductoras en contacto eléctrico con los electrodos de la microplaca. La microplaca puede comprender una placa de contacto conductora en contacto eléctrico con el primer electrodo. La microplaca puede comprender una placa de contacto conductora en contacto eléctrico con el segundo electrodo. La microplaca puede comprender dos placas de contacto conductoras en contacto eléctrico cada una con su extremo del electrodo de calentamiento. La microplaca puede comprender dos o tres placas de contacto conductoras en contacto eléctrico cada una con su electrodo del conjunto de electrodos de detección. [0091]En la Figura 1, se ilustran dos realizaciones de microplacas ejemplares. En la Figura 1 A), la microplaca (1) comprende la cámara de muestra (2) y un primer electrodo (3) y segundo electrodo (4). El primer electrodo (3) se une a la parte superior (5) de la microplaca y el segundo electrodo (4) se une a la parte inferior (6) de la microplaca. Tanto el primer como el segundo electrodos están cubiertos por una capa eléctricamente aislante (7) para prevenir una electrólisis no buscada del contenido líquido de la cámara de muestra (2). Un electrodo de calentamiento se incluye en la capa de aislamiento sobre el segundo electrodo. La cámara de muestra se forma mediante una parte espaciadora (9), que se intercala entre la primera parte (5) y la segunda parte (6) de la microplaca (1). El conjunto de electrodos de detección y el elemento sensible a la temperatura no se muestran en la Figura 1. [0092]La microplaca puede comprender una amplia serie de materiales diferentes. Puede comprender, por ejemplo, polímeros orgánicos tales como plásticos, metales y semiconductores tales como silicona, vidrios y cerámicas, y similares. [0093]Con respecto a la Figura 1, la primera y segunda partes podrían comprender, por ejemplo, materiales tales como plásticos, semiconductores tales como silicio, vidrios o cerámicas. El primer y segundo electrodos podrían comprender, por ejemplo, un metal tal como oro o cobre. La capa de aislamiento podría ser, por ejemplo, una película de SiO2 o poliimida. El electrodo de calentamiento podría ser, por ejemplo, un electrodo de NiCr y la capa espaciadora podría ser, por ejemplo, una colada de elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS). [0094]En la Figura 1 B) el primer y segundo electrodos no están comprendidos por la microplaca, pero pueden estar comprendidos, por ejemplo, por un dispositivo para hacer funcionar la microplaca. [0095]La microplaca puede comprender solamente una cámara de muestra única o puede comprender múltiples cámaras de muestra. [0096]Una microplaca típicamente tiene un grosor en el intervalo de 0,5 mm50 mm y preferiblemente en el intervalo de 2 mm-8 mm. [0097]Una microplaca típicamente tiene una longitud o diámetro en el intervalo de 10 mm-500 mm, preferiblemente en el intervalo de 40 mm-200 mm. [0098]Una microplaca típicamente tiene una anchura en el intervalo de 5 mm-200 mm, preferiblemente en el intervalo de 20 mm-100 mm. [0099]En la etapa c) la muestra líquida se expone a un campo eléctrico alterno, que proporcionan el primer y el segundo electrodos. Es importante que el campo eléctrico alterno tenga una amplitud suficiente y se aplique durante una duración suficiente de tiempo para extraer el material biológico de la célula biológica. [0100]De acuerdo con la presente invención, la expresión “campo eléctrico alterno” se refiere a campos eléctricos que cambian a lo largo del tiempo. El campo eléctrico alterno puede ser, por ejemplo, el campo eléctrico que se produce al cambiar periódicamente la polaridad de dos electrodos entre positivo/negativo y negativo/positivo, por ejemplo mediante la conexión de una fuente CA a los electrodos. El campo eléctrico alterno puede comprender, por ejemplo, o ser un campo de CA. El campo eléctrico alterno puede comprender, por ejemplo, uno o más pulsos de CC. [0101]Es importante que el campo eléctrico alterno tenga una amplitud suficiente y se aplique durante un periodo suficiente de tiempo para extraer el material biológico. También puede ser importante que el campo eléctrico alterno tenga adicionalmente una frecuencia suficiente para extraer el material biológico. [0102]En una realización preferida de la invención, la frecuencia del campo eléctrico alterno es de al menos 5 kHz, siendo preferiblemente de al menos 20 kHz y más preferiblemente de al menos 50 kHz. [0103]En otra realización preferida de la invención, la frecuencia del campo eléctrico alterno es de al menos 100 kHz, siendo preferiblemente de al menos 250 kHz y más preferiblemente de al menos 500 kHz. [0104]Por ejemplo, la frecuencia del campo eléctrico alterno puede ser de al menos 5 kHz, tal como al menos 10, 20, 50, 100, 200, 300 ó 400 kHz, tal como al menos 500 kHz. Se conciben incluso frecuencias más altas tales como 1000 kHz, 2000 kHz o 5000 kHz. [0105]Preferiblemente, la frecuencia del campo eléctrico alterno es, como máximo, de 750 kHz, tal como, como máximo, de 500 kHz. [0106]Así pues, la frecuencia del campo eléctrico alterno puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 5-750 kHz, tal como en el intervalo de 5-10, 1020, 20-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500 kHz, tal como en el intervalo de 500-750 kHz. [0107]En una realización preferida, el campo eléctrico alterno se proporciona mediante la modulación de la polaridad de los dos electrodos. [0108]El campo eléctrico alterno puede tener una forma sustancial seleccionada del grupo que consiste en: rectangular, sinusoidal, en diente de sierra, triangular asimétrica, triangular simétrica; o cualquier combinación de las mismas. [0109]Además, el campo eléctrico alterno, en el dominio de frecuencia, puede comprender al menos un primer y un segundo componentes de frecuencia. [0110]La amplitud del campo eléctrico alterno, es decir, la máxima diferencia de potencial entre el primer y el segundo electrodos, es típicamente como máximo de 30 V, tal como, como máximo 25, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 ó 2 V, tal como, como máximo 1 V. [0111]La amplitud del campo eléctrico alterno, es decir, la máxima diferencia de potencial entre el primer y el segundo electrodos, puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 1-100 V, tal como en el intervalo de 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-8, 8-10, 10-15, 15-20 o 20-30 V, tal como en el intervalo de 30100 V. Preferiblemente, la máxima diferencia de potencial entre el primer y el segundo electrodos está en el intervalo de 5-50 V tal como 10-25 V. [0112]Una medida útil de rendimiento de la extracción de material biológico es el porcentaje de liberación de ADN/ARN. El “porcentaje de liberación de ADN/ARN” es el porcentaje de células biológicas en la cámara de muestra que liberan su ADN cromosómico y/o ARN cromosómico debido a la exposición en la etapa c) al campo eléctrico alterno. El porcentaje de liberación de ADN/ARN se determina de acuerdo con el método normalizado descrito en el Ejemplo 5. [0113]La extracción y, por lo tanto, el porcentaje de liberación de ADN/ARN de las células biológicas en la cámara de muestra o en una microplaca que comprende la cámara de muestra es fuertemente dependiente del diseño y de la distancia entre el primer y el segundo electrodos, la estructura y materiales de la cámara de muestra y los potenciales aplicados al primer y al segundo electrodos. [0114]En una realización altamente preferida de la invención, el primer potencial del primer electrodo y el segundo potencial del segundo electrodo y, por lo tanto, el campo eléctrico alterno entre el primer y el segundo electrodos, se modulan de modo que se produzca un porcentaje de liberación de ADN/ARN de al menos el 30%, tal como un porcentaje de liberación de ADN/ARN de al menos el 40%, preferiblemente de al menos el 50% y más preferiblemente de al menos el 60%, tal como de al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, 99,5% o 99,9% tal como aproximadamente del 100%.

[0115]En otra realización preferida de la invención, el primer potencial del primer electrodo y el segundo potencial del segundo electrodo y, por lo tanto, el campo eléctrico alterno entre el primer y el segundo electrodos se modulan de modo que se produzca un porcentaje de liberación de ADN/ARN de al menos el 30% de las esporas bacterianas en la cámara de muestra, tal como un porcentaje de liberación de ADN/ARN de al menos el 40%, preferiblemente de al menos el 50% y más preferiblemente de al menos el 60% de las esporas bacterianas en la cámara de muestra, tal como de al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, 99,5% o 99,9%, tal como de aproximadamente el 100% de las esporas bacterianas en la cámara de muestra. [0116]En una realización de la invención, el tiempo durante el que la muestra líquida se expone al campo eléctrico alterno es de, como máximo, 3600 segundos, tal como, como máximo 3000, 2000, 1000, 500, 250, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4 ó 3 segundos, tal como, como máximo 1 segundo. [0117]Por ejemplo, el tiempo durante el que la muestra líquida se expone al campo eléctrico alterno está en el intervalo de 0,01-3.600 segundos, tal como en el intervalo de 0,1-1, 1-5, 5-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-250, 250500, 500-1000 ó 1000-2000 segundos, tal como en el intervalo de 2000-3600 segundos. En una realización preferida de la invención, el tiempo durante el que la muestra líquida se expone al campo eléctrico alterno está en el intervalo de 5-100 segundos, tal como 6-90 segundos, 7-80 segundos, 8-70 segundos, 9-60 y 10-50 segundos. [0118]En una realización preferida de la invención, la muestra líquida se expone al campo eléctrico alterno durante como máximo 250 segundos, preferiblemente durante como máximo 100 segundos, tal como, como máximo, durante 30 segundos. [0119]Otro aspecto de la descripción está relacionado con una microplaca para la extracción de material biológico a partir de una célula biológica, comprendiendo la microplaca una cámara de muestra que comprende:

-: una cámara de muestra que comprende una primera abertura en conexión fluida con el aire circundante y una segunda abertura para formar una conexión fluida con un dispositivo, y

-: un primer y segundo electrodos situados en lados opuestos de la cámara de muestra. [0120]En una realización preferida de la descripción, la cámara de muestra

de la microplaca comprende adicionalmente una muestra líquida que comprende una célula biológica. [0121]La microplaca puede comprender adicionalmente un campo eléctrico alterno entre y proporcionado por el primer y el segundo electrodos, teniendo dicho campo eléctrico alterno una suficiente amplitud como para extraer el material biológico de la célula biológica. [0122]En una realización de la invención, el primer y segundo electrodos de la microplaca se sitúan entre la primera y la segunda aberturas de la cámara de muestra. [0123]La célula biológica se localiza preferiblemente entre el primer y el segundo electrodos de la microplaca. [0124]Debería observarse que las realizaciones y características descritas en el contexto de un aspecto de la presente invención también son aplicables a los otros aspectos de la invención. [0125]Otro aspecto de la descripción está relacionado con un dispositivo para la extracción de material biológico de una célula biológica, comprendiendo el dispositivo:

-: un sitio de microplaca en el que se debe localizar la microplaca para asociarse funcionalmente con el dispositivo,

-una interfaz eléctrica entre el dispositivo y la microplaca para aplicar un campo eléctrico alterno entre los electrodos de la cámara de muestra, y

-: una unidad coprogramable que comprende un software que logra que el dispositivo realice una o más acciones seleccionadas del grupo que consiste en:

-: comprobar si la microplaca está asociada funcionalmente con el dispositivo,

-: proporcionar una muestra líquida en la cámara de muestra, comprendiendo dicha muestra líquida una célula biológica,

-: exponer dicha muestra líquida a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, estando proporcionado dicho campo eléctrico alterno mediante el primer y el segundo electrodos y teniendo una amplitud suficiente como para extraer el material biológico de la célula biológica, y

-: realizar un análisis en una parte de la muestra líquida expuesta comprendiendo dicha parte material biológico extraído de la célula biológica. [0126]En el presente contexto, la expresión “asociado funcionalmente” se refiere a que la microplaca se asocia con el dispositivo, de modo que el dispositivo puede realizar una o más acciones que afectan a la microplaca.

[0127]En una realización de la descripción, la microplaca se asocia funcionalmente con el dispositivo cuando el dispositivo puede afectar al campo eléctrico del contenido de la cámara de muestra. [0128]En una realización de la descripción, la microplaca se asocia funcionalmente con el dispositivo cuando el dispositivo puede controlar el potencial de al menos un electrodo de la microplaca. Por ejemplo, el dispositivo puede estar asociado funcionalmente con la microplaca cuando el dispositivo puede controlar el potencial del primer electrodo y/o el segundo electrodo de la microplaca. [0129]Estar asociado funcionalmente puede incluir adicionalmente que la cámara de muestra de la microplaca esté en comunicación fluida con un medio de control de flujo. [0130]En una realización de la descripción, el dispositivo comprende un conjunto de electrodos de recogida y cuando la microplaca está asociada funcionalmente un campo eléctrico entre el conjunto de electrodos de recogida ayuda a recoger las células biológicas de la muestra gaseosa en la cámara de muestra. En esta realización, la microplaca no necesita comprender el conjunto de electrodos de recogida. [0131]El dispositivo también puede comprender una primera cámara de reactivo para recibir y/o mantener un primer reactivo líquido. Típicamente, la primera cámara de reactivo tiene al menos una abertura, que está en conexión fluida con la cámara de muestra cuando la microplaca está asociada funcionalmente con el dispositivo. Como alternativa, dicha al menos una abertura de la primera cámara de reactivo se pone en conexión fluida con la cámara de muestra, por ejemplo, mediante el uso del medio para controlar el flujo. La primera cámara de reactivo también puede cerrarse mediante una barrera extraíble durante el almacenamiento, retirándose dicha barrera reversible o irreversiblemente cuando se usa el dispositivo. [0132]El dispositivo puede comprender adicionalmente una fuente de energía eléctrica para abastecer de energía, por ejemplo, al medio de generación de flujo y/o la unidad programable, el primer y segundo electrodos. [0133]En una realización de la presente descripción, la microplaca está asociada funcionalmente al dispositivo mediante el sitio de microplaca. El sitio de microplaca puede comprender, por ejemplo, una interfaz plástica que sirve como material de conexión y como juntas que aseguran uniones estrechas entre los orificios de la microplaca y los orificios del dispositivo eliminan las fugas de aire y líquido. El sitio de microplaca puede comprender, por ejemplo, una superficie y/o base para recibir la microplaca. Típicamente, el sitio de microplaca comprende al menos una placa de contacto conductora. Preferiblemente, el sitio de microplaca comprende al menos una placa de contacto conductora para proporcionar contacto eléctrico con el primer electrodo de la microplaca y una placa de contacto conductora para proporcionar contacto eléctrico con el segundo electrodo de la microplaca. [0134]La unidad programable contiene instrucciones, preferiblemente leíbles por un ordenador por ejemplo software, adaptadas para facilitar el control, la supervisión y/o manipulación del dispositivo antes de la operación, durante la operación y/o después de la operación. [0135]La unidad programable preferiblemente comprende al menos un ordenador que tiene uno o más programas informáticos almacenados dentro de medios de almacenamiento de datos asociados con el mismo, adaptándose el sistema informático para controlar el dispositivo. La unidad programable puede, en el contexto de la presente invención, seleccionarse del grupo no exhaustivo de: un ordenador de propósito general, un ordenador personal (PC), una unidad de control lógico programable (PLC), una unidad de control lógico programable de software (soft-PLC), una unidad de control lógico programable de hardware (hard-PLC), un ordenador personal industrial o un microprocesador dedicado. [0136]La presente invención también está relacionada con la adaptación de un producto de programa informático para permitir a un sistema informático que comprende al menos un ordenador que tiene medios de almacenamiento de datos asociados con el mismo controlar, supervisar y/o manipular el dispositivo antes de la operación, durante la operación y/o después de la operación. La presente invención también está relacionada con un medio leíble por un ordenador que tiene almacenado en él un conjunto de rutinas para permitir a un sistema informático que comprende al menos un ordenador que tiene medios de almacenamiento de datos asociados con el mismo controlar, supervisar y/o manipular el dispositivo antes de la operación, durante la operación y/o después de la operación. [0137]La unidad programable para controlar, supervisar y/o manipular el dispositivo antes de la operación, durante la operación y/o después de la operación preferiblemente está adaptado para operar en condiciones adversas, tales como clima ártico, clima tropical y ambiente de combate, en particular zonas de combate que se han sometido a armamento atómico, biológico y/o químico (armamento ABC). Preferiblemente, la unidad programable cumple las especificaciones militares relevantes para dichas unidades. [0138]En una realización de la descripción, la unidad programable que comprende el software adicionalmente logra que el dispositivo compruebe si la microplaca está asociada funcionalmente con el dispositivo. [0139]La unidad programable que comprende el software puede adicionalmente lograr que el dispositivo realice una o más acciones, tal como por ejemplo 2 ó 3 acciones, seleccionadas del grupo que consiste en

-: proporcionar una muestra líquida en una cámara de muestra,

-: exponer la muestra líquida a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, teniendo dicho campo eléctrico alterno una amplitud suficiente como para extraer material biológico de una célula biológica,

-: realizar un análisis en el material biológico de la muestra líquida expuesta. [0140]La unidad programable que comprende el software puede, por ejemplo, lograr que el dispositivo proporcione una muestra gaseosa en la cámara de muestra mediante la operación de un medio de generación de flujo para proporcionar una muestra gaseosa. [0141]La unidad programable que comprende el software puede, por ejemplo, lograr que el dispositivo aplique un primer potencial al primer electrodo y un segundo potencial al segundo electrodo. [0142]La unidad programable que comprende el software puede, por ejemplo, lograr que el dispositivo exponga la mezcla de reacción a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra mediante la modulación de los potenciales de al menos 2 electrodos, por ejemplo el primer y el segundo electrodos como se han descrito en la presente memoria u otro grupo de electrodos dedicados al campo eléctrico alterno. [0143]La unidad programable que comprende el software puede, por ejemplo, lograr que el dispositivo realice una amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana mediante la operación de un electrodo de calentamiento como se ha descrito en la presente memoria. [0144]La unidad programable que comprende el software puede, por

ejemplo, lograr que el dispositivo mida la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana amplificada y/o medir productos resultantes de la amplificación de la secuencia del ácido nucleico diana mediante la operación de los electrodos de detección en relación con voltimetría de pulso diferencial. [0145]En una realización preferida de la descripción, el dispositivo comprende adicionalmente una interfaz eléctrica entre el dispositivo y la microplaca para aplicar un campo electrostático entre el primero y los electrodos de la cámara de muestra. [0146]El dispositivo puede medir adicionalmente una señal de referencia, es decir una señal de una muestra que comprende una muestra sin una célula biológica o comprende una cantidad bien definida de una célula biológica dada. La señal de referencia puede, por ejemplo, recuperarse de otra cámara remota a la cámara de muestra, por ejemplo, una cámara localizada en otra posición de la microplaca o una cámara localizada en otra microplaca. [0147]El dispositivo puede comprender adicionalmente una fuente de energía interna. [0148]La fuente de energía interna puede comprender, por ejemplo, una batería. La cantidad de energía a utilizar durante una reacción de PCR puede estimarse como la cantidad de calor requerido para calentar un volumen de agua equivalente al de la muestra fluida entre las temperaturas mínima y máxima del ciclo de PCR. Esta diferencia de temperatura es de aproximadamente 50 K y por lo tanto el calor a transferir por ciclo es de aproximadamente 6 Julios para un volumen de muestra de 30 l. Llevando a cabo por ejemplo 60 ciclos, el consumo de energía total para una reacción de PCR suma 60*6=360 Julios. Usando un tiempo de aumento de temperatura comparable a los termocicladores comerciales (es decir 2ºC por segundo) la energía requerida es de 360*2/50=14,4 W. [0149]El voltaje de la batería se considera que es el voltaje nominal de la batería, por ejemplo 1,2 V por célula para baterías de níquel-cadmio (NiCd) y níquel-hidruro metálico (NiMH) y 3,6 V por célula para la mayoría de las baterías de ión litio (Li-ión). La capacidad de carga de la batería se da típicamente en términos de miliAmperios por hora (mAh) y se denomina índice C. Por ejemplo, una corriente de carga de 1 C para una batería con un índice C de 1200 miliAmperios hora es 1200 mA. Una batería puede considerarse ideal (es decir, con una capacidad energética constante) cuando se drena con una corriente de carga por debajo de 0,1 C (Linden, D. 1984. Handbook of Batteries and Fuel Cells. Nueva York: McGraw-Hill). Por lo tanto, cuando se suministra una potencia de salida de 14,4 W usando, por ejemplo, una batería que suministra 10,8 V, el índice C de esta batería debería estar en el intervalo de 14,4/(10,8*0,1)=13300 mAh para evitar el consumo de energía máximo que reduciría dramáticamente la capacidad energética. [0150]Para permitir este consumo de energía y suministro de potencia, y para asegurar adicionalmente una verdadera transportabilidad, se prefieren baterías recargables. En una realización preferida de la presente invención, las baterías recargables se seleccionan del grupo que consiste en baterías basadas en Níquel e Hidruro Metálico (NiMH) y baterías basadas en ión de Litio (Li-ión). [0151]Además, la fuente de energía interna puede comprender un generador, por ejemplo un generador portátil. Un generador de energía portátil puede utilizarse como una fuente de energía externa. El generador de energía portátil puede recargarse a partir de, o consistir simplemente en, un módulo solar, un cargador de batería (por ejemplo cargador de batería CA o de coche), un generador de combustión de combustible o similar. [0152]Como alternativa, puede proporcionarse energía de una fuente de energía externa al dispositivo, por ejemplo suplementarse con una batería de reserva. [0153]En una realización de la invención, el dispositivo comprende adicionalmente un medio de generación de flujo, por ejemplo, para proporcionar una muestra gaseosa en la cámara de muestra de la microplaca y estar en conexión fluida con la segunda abertura de la cámara de muestra cuando la microplaca se inserta en el dispositivo. [0154]La generación de flujo puede comprender una bomba tal como una bomba de pistón, una bomba de membrana o una bomba de desplazamiento positivo. [0155]En una realización de la presente invención, la bomba es capaz de suministrar un flujo de aire apropiado a través de la microplaca durante la toma de muestras (en el intervalo de 10 ml/min a 500 ml/min) se selecciona. Preferiblemente, la bomba debería seleccionarse para cumplir uno o más de los siguientes criterios: tamaño pequeño, peso ligero, flujo libre de pulsaciones, flujo reversible del medio mediante un cambio de la polaridad del motor, volumen de flujo ajustable mediante control del voltaje. En una realización de la invención, el medio de generación de flujo puede comprender un dispensador de chorro de tinta para crear pequeñas gotas de reactivo o un dispositivo de microsuministro similar. [0156]En una realización de la presente invención, la muestra gaseosa puede proporcionarse mediante un flujo pasivo a través de la microplaca. Esto requerirá una diferencia de velocidad entre la microplaca y el aire circundante del que se tomarán las muestras. Por ejemplo, la microplaca puede moverse a través del aire, por ejemplo, montada en un aeroplano de tal modo que la primera abertura esté en conexión fluida con el aire circundante, óptimamente en oposición a la dirección de vuelo. Como alternativa, se producen las condiciones si el aire se mueve alrededor de la microplaca sin velocidad comparada con el aire, por ejemplo montada en un conducto de ventilación. [0157]En una realización de la descripción, el dispositivo comprende adicionalmente un medio para controlar, por ejemplo, un flujo a través de la cámara de muestra. [0158]El flujo puede ser, por ejemplo, un flujo líquido y/o un flujo gaseoso. [0159]El medio para controlar un flujo típicamente comprende una o más válvulas. Las válvulas pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en una válvula de retención, una válvula de doble asiento, una válvula de multiposición y una válvula de constricción. [0160]La válvula puede ser, por ejemplo, una válvula microfabricada y en una realización la válvula está integrada en la microplaca. [0161]En una realización de la presente descripción, el primer líquido reactivo puede suministrarse usando la tecnología de microsuministro de chorro de tinta. Un cartucho de chorro de tinta que contiene uno o más compartimentos que comprenden el primer reactivo líquido o componentes separados del primer reactivo líquido se monta de tal manera que permita el microsuministro de líquidos en la cámara de reacción. [0162]En otra realización más de la presente descripción, el primer reactivo líquido o componentes separados del mismo se encapsulan dentro de una envoltura sellada que se compone de un polímero plástico. La envoltura del polímero plástico está equipada con un electrodo de calentamiento incorporado, lo que permite la fusión del polímero plástico mediante la aplicación de una corriente eléctrica apropiada y la liberación posterior del líquido encapsulado a la microplaca. En otra realización más, la liberación del líquido de la envoltura de polímero plástico sellada puede lograrse mediante la ruptura mecánica o física de la envoltura, por ejemplo mediante la perforación de la envoltura con un objeto afilado. [0163]En una realización de esta descripción, el dispositivo puede equiparse con una visualización que permita una lectura visual de los resultados. La visualización puede estar en el formato de una fuente de emisión de luz (un LED, una bombilla o similar), una pantalla, una lectura digital o cualesquiera combinaciones de lo mencionado. En otra realización más de la invención, la lectura puede comunicarse en forma de señales auditivas. [0164]En una realización preferida de esta descripción, el dispositivo comprende un componente que permite una comunicación inalámbrica. Son ejemplos de comunicación inalámbrica LAN inalámbrica móvil 802.11, celular, Bluetooth, GPS, y banda ultraancha. La comunicación puede ser unidireccional, por ejemplo transporte de datos desde el dispositivo o transporte de datos al dispositivo o la comunicación puede ser la combinación, es decir bidireccional. La comunicación establecida puede expandirse adicionalmente a comunicación entre dispositivos, es decir, el establecimiento de una red ad hoc que permite a un dispositivo desencadenar la iniciación de la toma de muestras de otro dispositivo facilitando así el control de, por ejemplo, la progresión de una nube de aerosol. [0165]En una realización preferida de la descripción, el dispositivo es un dispositivo de peso bajo y/o portátil. [0166]En una realización de la presente invención, el dispositivo pesa como máximo 10 kg, tal como, como máximo 8 kg, 6 kg, 4 kg, 3 kg o 2 kg, tal como, como máximo 1 kg. Puede preferirse incluso que el dispositivo pese como máximo 800 g tal como, como máximo 600 g, 500 g, 400 g, 300 g, 200 g, 150 g, 100 g, 80 g, 60 g, 50 g, 40 g, 30 g, 20 g, 10 g o 5 g, tal como, como máximo 1 g. [0167]Típicamente, el dispositivo tiene un peso total en el intervalo de 20 g-1 kg, tal como 20 g- 50 g, 50 g-100 g, 100 g-250 g, 250 g-500 g o 500 g-100 g. [0168]Otro aspecto de la descripción está relacionado con un sistema para extraer material biológico de una célula biológica, comprendiendo dicho sistema una microplaca como se define en la presente memoria asociada funcionalmente con un dispositivo como se define en la presente memoria. [0169]En una realización de la presente descripción, la microplaca y el dispositivo del sistema están integrados y no se pretende que estén separados físicamente entre sí. En una realización de la invención, la microplaca y el dispositivo del sistema están integrados de modo que no pueden estar físicamente separados entre sí sin dañar la microplaca o el dispositivo. [0170]En una realización importante de la presente descripción, el sistema es un sistema desechable, por ejemplo que se pretende que se use solamente una vez. [0171]En otra realización importante, la microplaca del sistema es desechable pero se pretende que el dispositivo se reutilice. [0172]Un aspecto especial de la presente invención está relacionada con un método y una microestructura que facilitan el método para la extracción de ADN de las endosporas de bacterias del grupo Bacillus. [0173]Un propósito de la presente invención es realizar una extracción rápida de ADN a partir de endosporas altamente resistentes a tensión mecánica, química y calor de bacterias Gram positivas, incluyendo Bacillus anthracis, para permitir la detección rápida de ADN. [0174]Este propósito se obtiene mediante un método y una estructura que comprende el uso combinado de un campo eléctrico por pulsos inducido sobre las esporas, dicho uso consiste en una estructura fluida que contiene una solución de esporas incluidas entre o adyacentes a un campo eléctrico que puede variarse en frecuencia y amplitud y aplicarse durante un tiempo variable y un conjunto de ajustes paramétricos óptimos para dicho uso. [0175]La presente invención describe un método que permite la aplicación de un campo eléctrico por pulsos a través de una solución que contiene esporas. Como resultado de dicho método se libera ADN durante un periodo de 5 segundos después del inicio de dicho método. [0176]En una realización especial, esta invención proporciona un método para la extracción rápida de ADN a partir de esporas utilizando una configuración de dos electrodos con una solución intercalada que contiene esporas. Los electrodos se conectan a una fuente de voltaje y un generador de frecuencia que permite que un campo eléctrico por pulsos se induzca en la solución. [0177]En otra realización especial, la invención utiliza un dispositivo microfluídico que realiza las mismas funciones que se han descrito anteriormente y podría ser una parte integrada de un sistema de preparación de muestras para la extracción rápida de ADN. [0178]En otro aspecto especial más de la invención, la calidad del ADN liberado como consecuencia de la aplicación de dicho método no se ve afectada según se mide mediante PCR realizada posteriormente o la inspección visual de la calidad del ADN (después de electroforesis en gel de agarosa y tinción). [0179]El problema con respecto a la cantidad de potencial aplicado que de hecho aparece a través de la solución es particularmente importante en microestructuras que usan una configuración de dos electrodos para aplicar un voltaje de electroporación para la solución de células o esporas. Debido a esto, la disminución de voltaje en la interfaz electrodo-solución es significativa en comparación con el voltaje aplicado. Para los expertos en la materia, se conoce bien que la solución usada en el experimento pone límites al gradiente de potencial a lo largo del tiempo. Por ejemplo, un voltaje aplicado pequeño (< 2 V) da como resultado un gradiente de potencial muy pequeño a través de los electrodos, incluso a tiempos de pulso largos (> 100 s) generando un gradiente en forma de pico. La magnitud máxima del voltaje aplicado en la solución puede calcularse mediante la superposición de las funciones exponenciales para el tiempo de subida del instrumento y tiempo de carga. Por ejemplo, un tiempo de subida del instrumento de 8 s y un tiempo de carga en el intervalo de 20-40 s da un máximo de 15-18% de la amplitud aplicada. El máximo se alcanza aproximadamente 10-15 s después de la aplicación del pulso. Después de 50-75 s, la caída de potencial es efectivamente cero porque todo el voltaje aplicado aparece en la interfaz electrodo-solución. A voltajes más altos, las impedancias interfaciales se vuelven insignificantes y la corriente que pasa entre los electrodos se limita por la conductancia de la solución. [0180]La resistencia de una solución de KCl 100 mM para distancias mayores de 10 m generalmente se encuentra en el intervalo de 30  3 k. [0181]La cubierta de la espora consiste en proteínas que dan protección mecánica a la estructura de la espora completa. Bacillus cereus tiene una cubierta de espora que consiste en una proteína mientras que Bacillus subtilis tiene más de 20 proteínas identificadas en la cubierta. Adicionalmente la cubierta es un tamiz molecular funcional que protege el interior de la espora contra todas las moléculas excepto las más pequeñas, aunque la cubierta de la espora se ha asociado con resistencia a halógenos tales como cloruro y yoduro. La cubierta también participa en la germinación; se ha demostrado que las esporas con mutaciones en la cubierta de espora también son las más defectuosas con respecto a la germinación. [0182]En la célula vegetativa de la especie de Bacillus, el peptidoglicano de la pared celular se compone de disacáridos repetidos de Nacetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM) en enlaces -1,4. Las cadenas peptídicas (inicialmente ácido L-alanina-D-glutamato-mesodiaminopimélico [Dpm]-D-alanina-D-alanina) se unen a los restos de NAM; aproximadamente el 35% de todos los PG en células vegetativas participan en reticulación. Al contrario que los PG de células vegetativas, que pueden mostrar variaciones significativas entre diferentes especies de Bacillus, las características básicas de la estructura de los PG corticales son similares en todas las especies. La estructura de los PG corticales difiere en dos sentidos principales de la de los PG de células vegetativas.

1.: Aproximadamente el 50% de los restos de NAM en la corteza están presentes como ácido murámico-rho-lactama (MAL) con la mayor parte de los restos de MAL espaciados en cada segunda posición de ácido murámico en la cadena de glicano.

2.: Aproximadamente el 25% de los restos de NAM portan solamente una Lalanina única y puesto que los restos de MAL no portan una cadena lateral peptídica, solamente un cuarto de los restos de Dpm están disponibles para participar en la formación de retículas en la corteza de la espora en comparación con la célula en crecimiento. Como consecuencia, los PG de la espora están mucho menos reticulados que en la célula vegetativa. Sin embargo, la disposición molecular exacta de la corteza de la espora no se conoce. Se ha demostrado que la corteza de la espora está implicada en el hinchamiento y encogimiento osmótico de la espora. [0183]Como consecuencia del potencial eléctrico alterno y aplicado, puede producirse alteración química de las bases nucleotídicas del ADN debido a reacciones de oxidación o reducción en los electrodos. Esto posiblemente puede dar como resultado un mal reconocimiento de nucleótidos por la ADN polimerasa termoestable durante la amplificación de ADN posterior, produciendo tasas de amplificación reducidas o incorporación errónea de nucleótidos.

[0184]Así pues, un aspecto especial de la presente invención está relacionado con un método para hacer a los componentes intracelulares accesibles desde las esporas mediante la aplicación de un campo electrolizante alterno de alta frecuencia. [0185]En una realización especial de la invención, el método puede estar dirigido, por ejemplo, a la extracción de ADN y/o purificación de ADN. [0186]En una realización especial de la invención, el método también puede estar dirigido para su uso en detección de ADN, por ejemplo en el contexto de análisis de diagnóstico. [0187]En una realización especial de la invención, el método puede estar dirigido, por ejemplo, para su uso en PCR, tal como su uso en dispositivos de PCR integrados. [0188]En una realización especial de la invención, el método puede estar dirigido, por ejemplo, para su uso en dispositivos de PCR móviles, o en detección de agentes de guerra biológica. [0189]En una realización especial de la invención, el método puede estar dirigido, por ejemplo, a esporas bacterianas. [0190]En una realización especial de la invención, el método descrito en la presente memoria está dirigido a esporas de bacterias Gram positivas. [0191]En una realización especial de la invención, el método descrito en la presente memoria está dirigido a esporas del género Bacillus y Clostridia. [0192]En una realización especial de la invención, el método descrito en el presente memoria está dirigido a esporas del grupo de Bacillus cereus. [0193]En una realización especial de la invención, el método descrito en la presente memoria está dirigido a esporas de la especie Bacillus anthracis. [0194]En una realización especial de la invención, el método descrito en la presente memoria está dirigido a la detección de células procariotas. [0195]En una realización especial de la invención, los métodos descritos en la presente memoria, en los que el objetivo es liberar ADN de células bacterianas. [0196]En una realización especial de la invención, el método de la presente memoria está dirigido a células bacterianas resistentes a calor. [0197]En una realización especial de la invención, el método descrito en la presente memoria está dirigido a bacterias termófilas y extremadamente termófilas. [0198]En una realización especial de la invención, los métodos están dirigidos a la detección de bacterias resistentes al calor mediante PCR. [0199]En una realización especial de la invención, el método descrito en la presente memoria está dirigido a la detección de bacterias resistentes a lisis por calor. [0200]En una realización especial de la invención, el método descrito en la presente memoria está dirigido al uso con Micobacterias. [0201]En una realización especial de la invención, los métodos descritos en la presente memoria están dirigidos al uso con células eucariotas. [0202]En una realización especial de la invención, el método descrito en la presente memoria está dirigido al uso con células de mamífero. [0203]En una realización especial de la invención, el método es para uso con células humanas, células fúngicas, células vegetales o con virus. [0204]En una realización especial de la invención, los métodos son para uso en un diseño capilar en el que la suspensión de células o esporas está contenida entre 2 ó más superficies de electrodos. [0205]En una realización especial de la invención, la lisis se induce mediante la aplicación de campos alternos de alta frecuencia. [0206]En una realización especial de la invención, la frecuencia aplicada del campo alterno de alta frecuencia está entre 8000 y 200.000 Hz. [0207]En una realización especial de la invención, al campo alterno se le aplican secuencias de pulsos entre 1 y 60 s. [0208]En una realización especial de la invención, el método incluyó la aplicación de descansos cortos entre los pulsos. [0209]En una realización especial de la invención, las tensiones aplicadas estaban entre 6 y 40 V. [0210]En una realización especial de la invención, el método se realiza en las células o esporas suspendidas en agua desmineralizada. [0211]En una realización especial de la invención, las células o esporas se suspenden en una formulación de tampón de PCR. [0212]En una realización especial de la invención, los métodos son para uso en combinación con un dispositivo de captura. [0213]En una realización especial de la invención, el método es para uso en combinación con un dispositivo de captura de esporas. [0214]En una realización especial de la invención, el método es para uso en combinación con un dispositivo de captura de células. [0215]En una realización especial de la invención, el método debe usarse en

combinación con un dispositivo de captura electrostática.

[0216]En una realización especial de la invención, el dispositivo de captura electrostática es una parte de un diseño integrado de captura de esporas y lisis. [0217]En una realización preferida de la invención, el método, microplaca, dispositivo y sistema no son para electroporación y/o fusión de células biológicas. [0218]Debería tenerse en cuenta que, de acuerdo con la presente invención, las realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los otros aspectos de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Calidad de ADN después de la aplicación de un potencial eléctrico alterno. [0219]El análisis de PCR en tiempo real se realizó en un motor de ADN Opticon (MJ Research) usando el sistema de Mezcla Maestra de PCR universal TaqMan (Applied Biosystems), que es una solución integrada que contiene tampón, dNTP y Taq polimerasa. Los dos cebadores 269-1623espaciador1 5'-TAT GAG CTA CAC TGT TAT CTA GTT TTC AAA GAA-3' (SEC ID Nº 1) y 270-16-23espaciador2 5'-TTT CCG TGT TTC GTT TTG TTC AG-3' (SEC ID Nº 2) se añadieron a una concentración final de 900 nM y una sonda fluorescente TAQMAN (FAM-ACT TCT CTC ATA TAT AAA TGTMGB-NFQ) (SEC ID Nº 3) a 100 nM, todos dirigidos a la amplificación del espaciador intergenético de los genes de ARNt 16S y 23S de Bacillus thuringiensis. La PCR convencional usó un volumen de muestra de 15 l y se inició la PCR mediante incubación durante 15 minutos a 95ºC para activar la Taq polimerasa. Posteriormente se aplicaron 40 ciclos de una reacción de PCR en dos etapas que eran una etapa de fusión de 15 s a 94ºC y una etapa de hibridación y extensión combinadas de 60 s a 60ºC. Al final de cada ciclo se midió la fluorescencia en línea para analizar la formación de producto de PCR. [0220]El ADN cromosómico de 2 ml (aproximadamente 109 células/ml) de un cultivo de una noche de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki se aisló usando el método de Boe et al. (Boe et al. 1989). El ADN purificado se disolvió en 75 l de tampón TE, lo que significa que una dilución de 10-6

debería contener ADN de aproximadamente 27 células/l.

Se usaron 4 l de una dilución de 10-6 de la solución de ADN cromosómico (equivalente a ~100 copias genómicas) para analizar el posible efecto perjudicial de campos eléctricos de alta frecuencia en muestras de ADN diluidas. La PCR convencional de detección se realizó para examinar la influencia del campo o campos eléctricos aplicados. En detalle, 20 l de una dilución 10-6 de ADN cromosómico de Bacillus thuringiensis se sometieron a un campo de electrolisis de alta frecuencia de 10 V, 100 kHz a 5, 10, 20 ó 30

s. Posteriormente, 4 l (el equivalente a 100 copias del cromosoma) del ADN tratado se sometieron a análisis de PCR en tiempo real. Todas las muestras sometidas a las condiciones de electrolisis se detectaron después de 34 ciclos de PCR, lo que quiere decir que no se observó pérdida de sensibilidad de la detección. El hecho de que todas las muestras de ADN tratadas de manera diferente se detectaran en el mismo punto CT indica que la reducción u oxidación química de bases nucleotídicas tiene un efecto menor en la sensibilidad de la PCR de detección (véase la Figura 1). Sin embargo, el aumento de la duración del procedimiento de electrolisis aún más, (30, 90 ó 180 s) muestra que el tiempo de electrolisis sí tiene un efecto cuando se aplican procedimientos prolongados (véase la Figura 2). La electrolisis durante más de 30 s presumiblemente da como resultado la liberación y sobresaturación del ADN diana, proporcionando posteriormente una pobre detección de PCR como se midió mediante PCR cuantitativa. Ejemplo 2 Lisis de esporas después de la aplicación de un potencial eléctrico alterno como se midió mediante PCR cuantitativa. [0221]Cien mg de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki de Biobit que contenían 3,2 x 109 esporas/g (Valent BioSciences Corp, Libertyville, Estados Unidos) se resuspendieron en 1 ml de agua desmineralizada y se centrifugaron durante 90 s a 12000 rpm. Este procedimiento se repitió 4 veces. Se descartó el sobrenadante. La solución final contenía aproximadamente 3,2 x 108 esporas. Esta solución se diluyó hasta una concentración final de 3,2 x 105 esporas/ml y posteriormente se usó para electrolisis y PCR. [0222]Manteniendo la frecuencia y el voltaje constantes (100 kHz y 10 V respectivamente), la duración del procedimiento de electrolisis se examinó usando variaciones de tiempo de exposición que variaban entre 5 y 30 segundos. Como resulta evidente a partir de la Figura 3, no existe un efecto notable en el valor CT, lo que demuestra que la lisis de las esporas es virtualmente independiente del tiempo. Sin embargo, el aumento adicional de la duración del procedimiento de electrolisis (30, 90 y 180 segundos, respectivamente) muestra que el tiempo de electrolisis sí tiene un efecto cuando se aplican procedimientos prolongados (véase la Figura 4). La electrolisis durante más de 30 s presumiblemente da como resultado la liberación y sobresaturación del ADN diana, dando posteriormente una detección por PCR pobre.

Ejemplo 3 Los efectos de diversas frecuencias (10-100 kHz) en la eficacia de la electrolisis de las esporas. [0223]Cien mg de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki de Biobit que contenían 3,2 x 109 esporas/g (Valent BioSciences Corp, Libertyville, Estados Unidos) se resuspendieron en 1 ml de agua desmineralizada y se centrifugaron durante 90 s a 12000 rpm. Este procedimiento se repitió 4 veces. Se descartó el sobrenadante. La solución final contiene aproximadamente 3,2 x 108 esporas. Esta solución se diluyó hasta una concentración final de 3,2 x 105 esporas/ml y se usó posteriormente para electrolisis y PCR. [0224]El voltaje y el tiempo se mantuvieron constantes (a 10 V y 30 s, respectivamente). La Figura 4 muestra los resultados de este experimento y, como resulta aparente, la alta frecuencia de 100 kHz mostró una disminución de CT (ciclo umbral), demostrando así la liberación de ADN amplificable de las esporas. La disminución de la frecuencia a 50 kHz o 10 kHz no dio lugar a ninguna mejora en los valores de CT (es decir, una disminución de CT en comparación con los controles no tratados).

Ejemplo 4 Determinación del voltaje eficaz mínimo para electrolisis de esporas. [0225]Manteniendo la frecuencia y el tiempo constantes (100 kHz y 30 s, respectivamente), se examinó el voltaje del procedimiento de electrolisis usando variaciones del voltaje de exposición que variaban entre 3 y 10 V (3, 5, 7 y 10 V, respectivamente). Como resulta evidente a partir de la Figura 5, está claro que existe un valor VT de voltaje umbral para ruptura de membrana/espora. Así pues, el voltaje aplicado es un parámetro crítico altamente dependiente de la resistencia de electrodos interfacial, por ejemplo un voltaje pequeño aplicado (< 2 V) da un gradiente de potencial muy pequeño a través de los electrodos incluso a largos tiempos de pulso (> 100 s); se crea un gradiente en forma de pico. [0226]La magnitud máxima del voltaje aplicado en solución puede calcularse mediante la superposición de funciones exponenciales para el tiempo de subida del instrumento y el tiempo de carga. Por ejemplo, un tiempo de subida del instrumento de 8 s y un tiempo de carga en el intervalo de 20 a 40 s da un máximo de 15-18% de la amplitud aplicada. El máximo se alcanza aproximadamente 10-15 s después de la aplicación del pulso. Después de 50-75 s, la caída de potencial es efectivamente cero debido a que todo el voltaje aplicado aparece en la interfaz electrodo-solución. A voltajes más altos, las impedancias interfaciales se vuelven insignificantes y la corriente que pasa entre los electrodos se limita por la conductancia de la solución.

Ejemplo 5 Determinación de porcentaje de liberación de ADN/ARN. [0227]Cien mg de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki de Biobit que contenían aproximadamente 109 UFC/g (Valent BioSciences Corp, Libertyville, Estados Unidos) se resuspendieron en 1 ml de agua desmineralizada y posteriormente se pasteurizaron a 70ºC durante 5 min, posteriormente la solución se centrifuga (5000 x g, 5 min). Se descarta el sobrenadante. Este procedimiento (tindalización) se repite 2 veces más. La solución final de 1 ml contiene aproximadamente 108 esporas. [0228]Esta solución se diluye hasta una concentración final de 105 esporas/ml, constituyéndose así la solución madre. [0229]La cámara de muestra se llena con una muestra de solución madre y la muestra se expone a un campo eléctrico alterno que tiene una frecuencia, amplitud y duración seleccionadas. [0230]Para determinar el porcentaje de liberación de ADN/ARN de las células biológicas de la muestra, tanto la muestra expuesta como un control que contiene solución madre se tratan con el fluorocromo 4',6-diamidino-2fenilindol (DAPITM). DAPI se usa ampliamente como una tinción de ADN que forma un complejo fluorescente cuando se une a secuencias ricas en A-T en el surco menor de ADNbc. La solución de tinción es una solución acuosa que contiene 2,0 g/ml de DAPI. Adicionalmente, DAPI tiene permeabilidad celular limitada y es por lo tanto óptimo para mostrar liberación celular del material genético. [0231]La cámara de muestra se eluye con un volumen de solución de tinción cuyo volumen es 3 veces el volumen de la cámara de muestra. Se permite la incubación del eluyente de la cámara de muestra a temperatura ambiente durante 5 min. [0232]Un volumen de control comparable al volumen de la muestra expuesta se tiñe separadamente durante 5 min con un volumen de solución de tinción que es aproximadamente 3 veces el volumen del control. [0233]Después se examina un volumen apropiado del control y un volumen apropiado de la muestra expuesta en microscopía de contraste de fases y microscopía de fluorescencia (que incluye un filtro DAPI). Para la muestra tanto de control como expuesta, el número de esporas se cuenta mediante microscopía de contraste de fases y el número de esporas que muestran una liberación de moléculas de ADN cromosómico (visibles como puntos azules) se cuenta mediante microscopía de fluorescencia. El porcentaje de liberación de ADN/ARN se determina después como

dS

100%

SS en la que ds es el número contado de puntos de ADN azules y Ss es el número total de esporas. [0234]El porcentaje de liberación de ADN/ARN de fondo también puede determinarse para el control y si muestra una liberación de fondo de más del 5%, se sugiere que la determinación se considere no válida y que se repita en una nueva solución madre de células biológicas.

BIBLIOGRAFÍA

[0235]

Levi et al.: Levi, K., Higham, J.L., Coates,D., & Hamlyn,P.F. (2003)

Molecular detection of anthrax spores on animal fibres.

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Replication origins of single-stranded-DNA plasmid pUB110.

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Johns et al.: Johns, M., L. Harrington, R. W. Titball, y D. L. Leslie. (1994). Improved methods for detection of Bacillus anthracis spores by polymerase chain reaction. Lett. Appl. Microbiol. 18:236238.

5: Linden, D. Linden, David. (1984). Handbook of Batteries and Fuel Cells. Nueva York: McGraw-Hill.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

imagen1

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

imagen2

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento para la extracción de material biológico de una espora bacteriana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar una cámara de muestra y un primer y un segundo electrodo, estando el primer y el segundo electrodo y la cámara de muestra situados de tal modo que al menos una parte de la cámara de muestra está entre el primer y el segundo electrodo, b) proporcionar una muestra líquida en la cámara de muestra, comprendiendo dicha muestra líquida una espora bacteriana, c) exponer dicha muestra líquida a un campo eléctrico alterno en dicha cámara de muestra, siendo proporcionado dicho campo eléctrico alterno por el primer y segundo electrodo y teniendo una amplitud suficiente como para extraer material biológico de la espora bacteriana, y d) realizar un análisis en una parte de la muestra líquida expuesta, dicha parte comprendiendo material biológico extraído de la espora bacteriana.
2.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la espora bacteriana se selecciona del género Bacillus y/o del género Clostridium.
3.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la espora bacteriana es del grupo Bacillus.
4.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la espora bacteriana es Bacillus anthracis.
5.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primero y segundo electrodos están separados por una distancia que es como máximo de 20 mm.
6.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la espora bacteriana está unida a y/o localizada entre el primer y el segundo electrodo.
7.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la frecuencia del campo eléctrico alterno es de al

menos 5 kHz.
8.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la frecuencia del campo eléctrico alterno es de al menos 100 kHz.
9.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo eléctrico alterno se crea mediante la modulación de la polaridad del primer y del segundo electrodo.
10.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo eléctrico alterno tiene una forma seleccionada del grupo que consiste en: rectangular, sinusoide, diente de sierra, triangular asimétrica, triangular simétrica; o cualquier combinación de las mismas.
11.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el campo eléctrico alterno, en el dominio de frecuencia, comprende al menos un primer y un segundo componente de frecuencia.
12.

Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material biológico comprende un componente seleccionado del grupo que consiste en un orgánulo celular, un material genético y una proteína.
13.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el material genético comprende ADN cromosómico y/o ADN plasmídico y/o cualquier tipo de ARN.
14.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en enzimas, proteínas estructurales, proteínas de transporte, canales iónicos, toxinas, hormonas y receptores.