ES2330393T3

ES2330393T3 - Caracterizacion de ehrlichia granulocitica y metodos de uso.

Info

Publication number: ES2330393T3
Application number: ES98919870T
Authority: ES
Inventors: Cheryl A. Murphy; James Storey; Gerald A. Beltz; Richard T. Coughlin
Original assignee: Antigenics LLC
Current assignee: Agenus Inc
Priority date: 1997-04-25
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2018-04-24
Also published as: WO1998049313A3; DE69841037D1; EP0915980B1; US8461323B2; EP0915980A2; EP2060631A3; CA2258277A1; EP2311957A1; EP2060631A2; US7863434B2; AU7256398A; US20120178102A1; CA2258277C; ATE438657T1; WO1998049313A2; US8435495B2; US8093008B2; US6204252B1; US20110045605A1; US20100088774A1

Abstract

Un polipéptido purificado, que comprende una primera secuencia de aminoácidos que al menos tiene una identidad del 60% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

Description

Caracterización de Ehrlichia granulocítica y métodos de uso.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a proteínas de Ehrlichia granulocítica (GE). En particular, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican a las proteínas S2 de GE; a polipéptidos y proteínas S2 de GE purificadas; a moléculas de ácidos nucleicos recombinantes; a células que contienen las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes; a anticuerpos que tienen afinidad de enlace específicamente con polipéptidos y proteínas S2 de GE; a hibridomas que contienen los anticuerpos; a sondas de ácidos nucleicos para la detección de ácidos nucleicos que codifican a las proteínas S2 de GE; a un método para detectar en una muestra ácidos nucleicos que codifican a los polipéptidos o proteínas S2 de GE; a kits que contienen sondas o anticuerpos de ácidos nucleicos; a bioensayos que usan la secuencia de ácido nucleico, las proteínas o los anticuerpos de esta invención para diagnosticar, evaluar o pronosticar a un mamífero aquejado de erliquiosis; a usos terapéuticos, específicamente vacunas que comprenden polipéptidos o proteínas S2 de GE; y a métodos para prevenir la erliquiosis en un animal.

Técnica relacionada

La erliquiosis granulocítica es una infección aguda potencialmente fatal transmitida por las garrapatas. El agente causante, Ehrlichia granulocítica (GE), ha sido identificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores universales de RNA eubacteriano ribosómico 16S (rRNA) para amplificar el DNA de sangre de pacientes infectados (Chen et al., J. Clin. Micro. 32:589-595 (1994)). La comparación de la secuencia del gen rRNA 16S de GE con otras secuencias conocidas de rDNA 16S reveló una equivalencia casi idéntica con los genes 16S de Ehrlichia phagocytophila y Ehrlichia equi (Chen et al., 1994). Otros dos grupos de especies Ehrlichia también han sido clasificados según sus secuencias del gen rRNA 16S, los grupos de Ehrlichia canis y Ehrlichia sennetsu. Las especies E. canis y E. sennetsu infectan predominantemente fagocitos mononucleares (Dumler et al., N. Eng. J. Med. 325:1109-1110 (1991)), mientras que los miembros del grupo de Ehrlichia phagocytophila incluyendo GE son trópicos para los granulocitos (Ristic et al., en Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, Kreig et al., eds., (1984), pp. 704-709). La casi identidad de las secuencias de los genes rRNA 16S y el hecho de compartir una significativa antigenicidad mediante los ensayos IFA y de manchas Western (Dumler et al., J. Clin. Micro. 53:1098-1103 (1995)) indican que E. phagocytophila, E. equi y GE están estrechamente relacionadas.

La clasificación completa de las especies de E. phagocytophila incluyendo las relaciones antigénicas entre los aislados individuales ha estado impedida por la incapacidad de cultivar estos organismos en un cultivo celular. Se ha mostrado que GE puede cultivarse con éxito en células HL60, una línea celular de leucemia promielocítica de ser humano (Coughlin et al., WO 96/39484; Goodman et al., N. Eng. J. Med. 334:209-215 (1996)).

En el documento WO 98/42740 se describen polipéptidos que al menos contienen una porción antigénica de un antígeno Ehrlichia y secuencias de DNA que codifican a tales polipéptidos para usar en el diagnóstico y tratamiento de la infección por Ehrlichia.

La presente invención describe un gen específico de GE que codifica la proteína S2 que puede usarse como reactivo de diagnóstico y en vacunas.

Sumario de la invención

Según el primer aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido purificado que comprende una primera secuencia de aminoácidos que al menos tiene una identidad del 60% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, la primera secuencia de aminoácidos puede tener al menos una identidad del 70% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4, o al menos una identidad del 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

En otras realizaciones, la primera secuencia de aminoácidos puede comprender la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4. En esta realización, la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4 puede estar codificada por el clon polinucleótido contenido en el nº de depósito ATCC 97844.

En otra realización alternativa, la primera secuencia de aminoácidos puede comprender un epítope inmunógeno o antigénico de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

En otras realizaciones, la primera secuencia de aminoácidos puede comprender los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o los aminoácidos 411-432 de SEQ ID NO:4, o los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4.

Según el segundo aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido purificado que comprende una primera secuencia de aminoácidos que al menos tiene una identidad del 60% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4.

Según el tercer aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido purificado que comprende una primera secuencia de aminoácidos que al menos tiene una identidad del 60% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4.

En las realizaciones de los aspectos segundo y tercero de la invención, la primera secuencia de aminoácidos puede tener al menos una identidad del 70% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, o al menos una identidad del 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

Según el cuarto aspecto de la invención, se proporciona una molécula aislada de un ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención.

Según el quinto aspecto de la invención, se proporciona una molécula aislada de un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia de nucleótidos complementaria con la primera secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico del cuarto aspecto de la invención.

Según el sexto aspecto de la invención, se proporciona una molécula aislada de un ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido S2 que tiene la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4. En una realización de este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4 puede estar codificada por el clon polinucleótido contenido en el nº de depósito ATCC 97844.

Según el séptimo aspecto de la invención, se proporciona una molécula aislada de un ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos que al menos tiene una identidad del 90% con la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó con los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3, o al menos una identidad del 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó con los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

En otra realización de este aspecto, la primera secuencia de nucleótidos puede comprender la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

Según el octavo aspecto de la invención, se proporciona un vector aislado que comprende la molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos cuarto, quinto, sexto y séptimo de la invención.

Según el noveno aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped transformada con el vector del octavo aspecto.

Según el décimo aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende:

(a): un vehículo; y

(b): (i) {}\hskip0,3cm el polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención; o

(ii): un segundo polipéptido que consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4;

(iii): la molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos cuarto, quinto, sexto y séptimo de la invención, o

(iv): una segunda molécula aislada de un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que codifica a dicho polipéptido.

Según el onceavo aspecto de la invención, se proporciona la composición del décimo aspecto de la invención para usar en la producción de una respuesta inmune que reconozca a Ehrlichia granulocítica en un huésped o para prevenir o inhibir la erliquiosis en un animal.

Según el decimosegundo aspecto de la invención, se proporciona una vacuna para usar en provocar en un animal una respuesta inmune beneficiosa a Ehrlichia granulocítica, comprendiendo dicha vacuna:

(a): un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable; y

(ii): un segundo polipéptido que consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4;

Según el decimotercero aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar en una muestra un polipéptido de Ehrlichia granulocítica, comprendiendo dicho método:

(a): poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se enlace específicamente con la primera secuencia de aminoácidos del polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención o con uno de sus fragmentos que comprenda un epítope inmunógeno o antigénico de dicha primera secuencia de aminoácidos del polipéptido, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos; y

(b): detectar la presencia del polipéptido de Ehrlichia granulocítica enlazado a dicho anticuerpo.

Según el decimocuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar en una muestra un anticuerpo del polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención, comprendiendo dicho método:

(a): poner en contacto la muestra con el polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención o con un segundo polipéptido, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos, en el que dicho segundo polipéptido consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4; y

(b): detectar la presencia del anticuerpo enlazado a dicho polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención, o a dicho segundo polipéptido.

Según el decimoquinto aspecto de la invención, se proporciona un kit de diagnóstico que comprende:

(a): un primer medio recipiente que contiene un anticuerpo que se enlace específicamente con la primera secuencia de aminoácidos del polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención o con uno de sus fragmentos que comprenda un epítope inmunógeno o antigénico de dicha primera secuencia de aminoácidos del polipéptido; y

(b): un segundo medio recipiente que contiene un conjugado que comprende un socio de enlace de dicho anticuerpo y un marcador.

Según el decimosexto aspecto de la invención, se proporciona un kit de diagnóstico que comprende:

(a): un primer medio recipiente que contiene el polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención o uno de sus fragmentos que comprenda un epítope inmunógeno o antigénico de dicha primera secuencia de aminoácidos del polipéptido; y

(b): un segundo medio recipiente que contiene un conjugado que comprende un socio de enlace de dicho polipéptido o fragmento y un marcador.

Según el decimoséptimo aspecto de la invención, se proporciona el uso de:

(a): el polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención; o

(b): un segundo polipéptido que consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4; o

(c): la molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos cuarto, quinto, sexto y séptimo de la invención, o

(d): una segunda molécula aislada de un ácido nucleico que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que codifica a dicho segundo polipéptido,

junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la preparación de una vacuna para provocar en un animal una respuesta inmune beneficiosa a Ehrlichia granulocítica.

Según el decimoctavo aspecto de la invención, se proporciona el uso de la composición del décimo aspecto de la invención en la preparación de una vacuna para provocar en un animal una respuesta inmune beneficiosa a Ehrlichia granulocítica.

Según el decimonoveno aspecto de la invención, se proporciona un método para diagnosticar o detectar una infección por Ehrlichia granulocítica en un animal, que comprende:

(a): poner en contacto una muestra biológica del animal con el polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención o con un segundo polipéptido que consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4; y

(b): detectar la presencia del anticuerpo enlazado a dicho polipéptido de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo y tercero de la invención, o a dicho segundo polipéptido,

en el que la presencia del anticuerpo significa que el animal está infectado por Ehrlichia granulocítica.

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Definiciones

En la descripción que sigue se utilizan extensamente varios términos usados en la tecnología del DNA recombinante (rDNA). Con el fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, incluyendo el alcance a dar a tales términos, se dan las siguientes definiciones.

Molécula de ácido nucleico aislada. Una "molécula de ácido nucleico aislada", como en general se entiende y se usa en la presente memoria, se refiere a un polímero de nucleótidos, e incluye pero no debe limitarse a, DNA y RNA.

DNA recombinante. Cualquier molécula de DNA formada uniendo segmentos de DNA de diferentes fuentes y producida usando la tecnología del DNA recombinante (es decir, la ingeniería genética molecular).

Segmento de DNA. Un segmento de DNA, como en general se entiende y se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende un tramo lineal de nucleótidos en el que los nucleótidos están presentes en una secuencia que puede codificar, por medio del código genético, a una molécula que comprende una secuencia lineal de residuos aminoácidos que se denomina proteína, un fragmento de proteína o un polipéptido.

Gen. Una secuencia de DNA relacionada con una única proteína o cadena de polipéptido, y cuando se usa en la presente memoria incluye los extremos 5' y 3' sin traducir. El polipéptido puede ser codificado por una secuencia se longitud completa o por una porción de la secuencia codificante, en tanto y cuanto se retenga la actividad funcional de la proteína.

DNA complementario (cDNA). Moléculas de ácido nucleico recombinante sintetizadas por transcripción inversa de RNA mensajero ("mRNA").

Gen estructural. Una secuencia de DNA que es transcrita en mRNA que a continuación es traducido en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Marco abierto de lectura (abreviado en las figuras como "orf"). La propiedad de algunas secuencias de un ácido nucleico de codificar más de un péptido dentro de la misma secuencia, lo cual es posible porque estas secuencias contienen una serie de tripletes que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación que interrumpa los marcos de lectura relevantes.

Endonucleasa de restricción. Una endonucleasa de restricción (también enzima de restricción) es una enzima que tiene la capacidad de reconocer una secuencia específica de bases (usualmente de una longitud de 4, 5 ó 6 pares de bases) en una molécula de DNA, y escindir la molécula de DNA en cada lugar en el que aparezca esta secuencia. Por ejemplo, EcoRI reconoce la secuencia de bases GAATTC/CTTAAG.

Fragmento de restricción. Las moléculas de DNA producidas por digestión con una endonucleasa de restricción se denominan fragmentos de restricción. Cualquier genoma dado puede ser digerido por una endonucleasa de restricción particular en una serie discreta de fragmentos de restricción.

Electroforesis en gel de agarosa. Para determinar la longitud de los fragmentos de restricción se requiere un método analítico para fraccionar moléculas de DNA de doble hebra sobre la base del tamaño. La técnica más comúnmente usada (aunque no sólo la única) para conseguir tal fraccionamiento es la electroforesis en gel de agarosa. El principio de este método es que las moléculas de DNA migran a través del gel como si fuera un tamiz que retarda el movimiento de las moléculas más grandes en mayor extensión y el movimiento de las moléculas más pequeñas en menor extensión. Adviértase que cuanto más pequeño es el fragmento de DNA, mayor es la movilidad en la electroforesis en gel de agarosa.

Los fragmentos de DNA fraccionados por electroforesis en gel de agarosa pueden visualizarse directamente mediante un procedimiento de tinción si el número de fragmentos incluidos en el modelo es pequeño. Los fragmentos de DNA de los genomas pueden visualizarse con éxito. Sin embargo, la mayor parte de los genomas, incluyendo el genoma de ser humano, contienen demasiadas secuencias de DNA para producir un modelo simple de fragmentos de restricción. Por ejemplo, el genoma de ser humano es escindido por digestión por EcoRI en aproximadamente 1.000.000 de fragmentos diferentes de DNA. Con el fin de visualizar una pequeña subserie de estos fragmentos puede aplicarse una metodología denominada el procedimiento de hibridación Southern.

Procedimiento de transferencia Southern. El fin del procedimiento de transferencia Southern (también denominado procedimiento de las manchas) es transferir físicamente DNA fraccionado por electroforesis en gel de agarosa sobre un papel de filtro de nitrocelulosa u otra superficie o método apropiado, a la vez que se retienen las posiciones relativas de los fragmentos de DNA que proceden del procedimiento de fraccionamiento. La metodología usada para conseguir la transferencia desde el gel de agarosa a la nitrocelulosa implica extraer el DNA del gel en el papel de nitrocelulosa por acción capilar o transferencia electrofonética.

Hibridación de ácidos nucleicos. La hibridación de ácidos nucleicos depende del principio de que dos moléculas de ácido nucleico de una única hebra que tienen secuencias de bases complementarias volverán a formar la estructura de doble hebra termodinámicamente favorecida si se mezclan en condiciones apropiadas. La estructura de doble hebra se formará entre dos ácidos nucleicos complementarios de una única hebra incluso si una está inmovilizada sobre un filtro de nitrocelulosa como mediante los procedimientos Southern de transferencia e hibridación. En el procedimiento de hibridación Southern se produce la última situación. Como se advirtió previamente, el DNA del individuo a ensayar se digiere con una endonucleasa de restricción, se fracciona mediante electroforesis en gel de agarosa, se convierte en la forma de hebra única y se transfiere a un papel de nitrocelulosa, tornándolo disponible para el reapareamiento con la sonda de hibridación. Ejemplos de condiciones de hibridación pueden encontrarse en Aussubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY (1989). Como ejemplo, se incuba un filtro de nitrocelulosa durante toda la noche a 68ºC con una sonda marcada en una disolución que contiene formamida al 50%, alta concentración salina (5X SSC [20X: NaCl 3M/citrato trisódico 0,3M] ó 5X SSPE [20X: NaCl 3,6M/NaH_{2}PO_{4} 0,2M/EDTA 0,02M, pH 7,7]), 5X disolución de Denhardt, SDS al 1% y 100 \mug/mL de DNA desnaturalizado de esperma de salmón. Esto es seguido por varios lavados en 0,2X SSC/SDS al 0,1% a una temperatura seleccionada basada en la severidad deseada: temperatura ambiente (baja severidad), 42ºC (moderada severidad) ó 68ºC (alta severidad). La temperatura seleccionada se determina sobre la base de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de DNA.

Sonda de hibridación. Para visualizar una secuencia de DNA particular en el procedimiento Southern de hibridación, se hace reaccionar una molécula de DNA marcada o una sonda de hibridación marcada con el DNA fraccionado enlazado al filtro de nitrocelulosa. Las áreas del filtro que portan secuencias de DNA complementarias con la sonda de DNA marcada se marcan por sí mismas como consecuencia de la reacción de reapareamiento. Se visualizan las áreas del filtro que exhiben tal marcaje. La sonda de hibridación se produce en general por clonación molecular de una secuencia específica de DNA.

Oligonucleótido u oligómero. Una molécula compuesta de dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más que tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, los cuales a su vez dependerán de la función última o del uso del oligonucleótido. Un oligonucleótido puede derivarse sintéticamente o por clona-
ción.

Amplificación de secuencias. Un método para generar grandes cantidades de una secuencia diana. En general, se aparean uno o más cebadores de amplificación a una secuencia de un ácido nucleico. Las secuencias que se encuentran adyacentes a o entre los cebadores se amplifican usando enzimas apropiadas.

Cebador de amplificación. Un oligonucleótido que es capaz de aparearse adyacente a una secuencia diana y servir como un punto de iniciación de la síntesis de DNA cuando se coloca en condiciones en las que se inicia la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico.

Vector. Un DNA de plásmido o fago u otra secuencia de DNA en la cual puede insertarse DNA para ser clonado. El vector puede replicarse autónomamente en una célula huésped, y puede además caracterizarse por uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de las endonucleasas en los cuales pueden cortarse tales secuencias de DNA de una manera determinable y en los cuales puede insertarse DNA. Además, el vector puede contener un marcador adecuado para usar en la identificación de células transformadas con el vector. Por ejemplo, los marcadores son resistentes a la tetraciclina o a la ampicilina. Las palabras "vehículo de clonación" son algunas veces usadas por "vector".

Expresión. La expresión es el proceso mediante el cual un gen estructural produce un polipéptido. Implica la transcripción del gen en mRNA, y la traducción de tal mRNA en polipéptido(s).

Vector de expresión. Un vector o vehículo similar a un vector de clonación pero que es capaz de expresar un gen que ha sido clonado en él después de la transformación en un huésped. El gen clonado se coloca usualmente bajo el control de (es decir, operablemente unido a) ciertas secuencias de control tales como las secuencias promotoras.

Las secuencias que controlan la expresión variarán dependiendo de si el vector está diseñado para expresar el gen operablemente unido en un huésped procariota o eucariota y pueden contener adicionalmente elementos transcripcionales tales como elementos potenciadores, secuencias de terminación, elementos con especificidad por tejidos y/o sitios de inicio y terminación de la traducción.

Derivado funcional. Un "derivado funcional" de una secuencia, de proteína o de ácido nucleico, es una molécula que posee una actividad biológica (funcional o estructural) que es sustancialmente similar a una actividad biológica de una secuencia de proteína o de ácido nucleico. Un derivado funcional de una proteína puede contener modificaciones posteriores a la traducción tales como un carbohidrato unido covalentemente, dependiendo de la necesidad de tales modificaciones para la eficacia de una función específica. Se pretende que la expresión "derivado funcional" incluya los "fragmentos", "segmentos", "variantes", "análogos", o "derivados químicos" de una molécula.

Cuando se usa en la presente memoria, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que normalmente no son parte de la molécula. Tales restos pueden alternativamente disminuir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, y efectos semejantes. Los restos capaces de mediar tales efectos se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Los procedimientos para acoplar tales restos a una molécula son bien conocidos en la técnica.

Variante. Una "variante" de una proteína o de un ácido nucleico se refiere a una molécula sustancialmente similar en estructura y actividad biológica a la proteína o al ácido nucleico. Así, siempre que dos moléculas posean una actividad común y puedan sustituirse una por otra se consideran variantes ya que el término se usa en la presente memoria incluso si la composición o la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una de las moléculas no es idéntica a la encontrada en la otra, o si la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos no es idéntica.

Alelo. Un "alelo" es una forma alternativa de un gen que ocupa un lugar dado en el cromosoma.

Mutación. Una "mutación" es cualquier cambio detectable en el material genético que puede transmitirse a las células hija y posiblemente incluso a las generaciones futuras dando lugar a células mutantes o a mutantes individuales. Si los descendientes de una célula mutante dan sólo lugar a células somáticas en organismos multicelulares surge un punto o área mutante. Las mutaciones en la línea germinal de organismos que se reproducen sexualmente pueden ser transmitidas por los gametos a la siguiente generación dando lugar a un individuo con la nueva condición mutante tanto en sus células somáticas como germinales. Una mutación puede ser cualquier (o una combinación de) cambio no natural detectable que afecte a la constitución química o física, mutabilidad, replicación, función fenotípica o recombinación de uno o más desoxirribonucleótidos; los nucleótidos pueden añadirse, suprimirse, sustituirse, invertirse o transponerse a nuevas posiciones con o sin inversión. Las mutaciones pueden ocurrir espontáneamente y pueden inducirse experimentalmente mediante la aplicación de mutágenos. De una mutación resulta una variación mutante de una molécula de ácido nucleico. Un polipéptido mutante puede proceder de una molécula mutante de un ácido nucleico.

Especie. Una "especie" es un grupo de poblaciones naturales que se cruzan real o potencialmente. Una variación en la especie dentro de una molécula de ácido nucleico o de una proteína es un cambio en el ácido nucleico o en la secuencia de aminoácidos que se produce entre especies y puede determinarse secuenciando el DNA de la molécula en cuestión.

Purificado(a). Una proteína "purificada" o un ácido nucleico purificado son una proteína o un ácido nucleico que han sido separados de un componente celular. Las proteínas "purificadas" o los ácidos nucleicos han sido
purificadas(os) hasta un grado de pureza no encontrado en la naturaleza.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1. Mapa de enzimas de restricción de clones del grupo I. La línea superior representa un mapa compuesto de todos los clones del grupo I y contiene los sitios de reconocimiento de enzimas seleccionadas. Debajo de este mapa se lista individualmente cada clon del grupo I y la longitud relativa del inserto de DNA se indica mediante la línea siguiente al nombre del clon. Se muestra un mapa más detallado de S22 con el marco abierto de lectura indicado mediante el recuadro negro.

Figura 2. Mapa de enzimas de restricción de clones del grupo II. Los clones individuales del grupo II se representan como se describe en la leyenda de la figura 1. S2 es el clon representativo de este grupo y el marco abierto de lectura se indica mediante el recuadro negro.

Figura 3. Mapa de enzimas de restricción de clones del grupo III. Los clones individuales del grupo III se representan como se describe en la leyenda de la figura 1. S7 es el clon representativo de este grupo y el marco abierto de lectura se indica mediante el recuadro negro.

Figura 4. Secuencia del DNA de S22 (SEQ ID NO:1). Se muestra la secuencia completa de DNA del inserto S22 en Lambda Zap II. En el margen izquierdo se indica el número de nucleótido.

Figura 5. La figura 5A muestra la secuencia de aminoácidos de S22 (SEQ ID NO:2). Se muestra la secuencia de aminoácidos traducida para el marco abierto de lectura de S22 que comienza en el nucleótido 500 y finaliza con el codón de parada en el nucleótido 2359 (véase la figura 4). La figura 5B también muestra la secuencia del ácido nucleico del gen de la proteína de 130 kDa (SEQ ID NO:1). Los números de los nucleótidos se indican a la izquierda. El codón de inicio ATG y el codón de parada TAA se muestran en negrita. La secuencia de aminoácidos traducida del marco abierto de lectura se exhibe debajo de la secuencia de DNA usando el código de aminoácidos de letra única (SEQ ID NO:2). Se subraya un posible sitio de enlace a los ribosomas.

Figura 6. En la figura 6A se muestra la secuencia completa del DNA del inserto S2 (SEQ ID NO:3) en Lambda Zap II y se continúa en la figura 6B. En el margen izquierdo se indica el número de nucleótido.

Figura 7. La figura 7A muestra la secuencia de aminoácidos de S2 (SEQ ID NO:4) para el marco abierto de lectura que comienza en el nucleótido 1576 y finaliza con el codón de parada en el nucleótido 3801 (véase la figura 6). La figura 7B también muestra la secuencia de ácido nucleico del gen de la proteína de 160 kDa (SEQ ID NO:3). Los números de los nucleótidos se indican a la izquierda. El codón de inicio ATG y el codón de parada TAA se muestran en negrita. La secuencia de aminoácidos traducida para el marco abierto de lectura se exhibe debajo de la secuencia del DNA usando el código de aminoácido de letra única (SEQ ID NO:4). Las secuencias reguladoras aguas arriba están subrayadas: -35, -10 y sitios de enlace a los ribosomas.

Figura 8. Secuencia del DNA de S7 (SEQ ID NO:5). En la figura 8A se muestra la secuencia completa del DNA del inserto S7 en Lambda Zap II y se continúa en la figura 8B. En el margen izquierdo se indica el número de nucleótido.

Figura 9. La figura 9A muestra la secuencia de aminoácidos de S7 (SEQ ID NO:6) para el marco abierto de lectura que comienza en el nucleótido 233 y finaliza con el codón de parada en el nucleótido 1969 (véase la figura 8). La figura 9B también muestra la secuencia de ácido nucleico del gen de la proteína de 160 kDa (SEQ ID NO:5). Los números de los nucleótidos se indican a la izquierda. El codón de inicio ATG y el codón de parada TAA se muestran en negrita. La secuencia de aminoácidos traducida para el marco abierto de lectura se exhibe debajo de la secuencia del DNA usando el código de aminoácido de letra única (SEQ ID NO:6). Se subraya un posible sitio de enlace a los ribosomas.

Figura 10. Secuencia del DNA de S23 (SEQ ID NO:7). En la figura 10A se muestra la secuencia completa del DNA del inserto S23 en Lambda Zap II y se continúa en la figura 10B. En el margen izquierdo se indica el número de nucleótido.

Figura 11. Secuencia de aminoácidos de S23 (SEQ ID NO:8) para el marco abierto de lectura que comienza en el nucleótido 254 y finaliza en el nucleótido 1708 (véase la figura 10). En los nucleótidos 2656-2997 (hebra complementaria) y en los 3904-4248 se encuentran dos marcos abiertos de lectura más pequeños (véase la figura 10).

Figura 12. Diagrama esquemático de las proteínas S22 y S23. Los recuadros representan regiones repetidas de aminoácidos. Recuadros más claros: repeticiones de 28 aminoácidos. Recuadros más oscuros: repeticiones de 59 aminoácidos. Nota: las repeticiones de 28 aminoácidos también están contenidas dentro de las regiones repetidas de 59 aminoácidos. Se indica el tamaño aproximado y la localización de la supresión S22 que da lugar a S23.

Figura 13. Diagramas esquemáticos de las proteínas S2 (arriba) y S7 (abajo). Las regiones repetidas se indican mediante los recuadros.

Figura 14. Diagrama esquemático de la proteína de GE de 160 kDa. Las regiones repetidas se indican mediante los recuadros. Las secuencias de repeticiones anquirina propuestas, numeradas 1-8 (SEQ ID NOS:9-16) están alineadas usando la secuencia consenso (SEQ ID NO:17) en la parte superior (6): h, hidrófobo; t, semejante a una vuelta o polar; S/T, serina o treonina; mayúsculas, aminoácidos conservados.

Figura 15. Alineamientos de secuencias de aminoácidos de regiones seleccionadas de proteínas de GE de 130 kDa y E. chaffeensis de 120 kDa (A) (SEQ ID NO:18) y de proteínas de GE de 100 kDa (SEQ ID NO:19) y E. chaffeensis de 120 kDa (A) (SEQ ID NO:20) (B). Cada proteína se muestra como una secuencia de aminoácidos lineal y los aminoácidos se numeran en cientos. Las regiones en los recuadros de la secuencia lineal representan aminoácidos repetidos. A) Alineamientos de aminoácidos de una secuencia que aparece 4 veces en la proteína (45) de E. chaffeensis (línea superior del alineamiento), A-1) y 8 veces en la proteína de GE de 130 kDa (a-1 a a-4). La secuencia a-1 se repite 3 veces, las secuencias relacionadas a-2 y a-3 se repiten dos veces cada una y la secuencia relacionada a-4 se encuentra una vez. La posición de estas secuencias en las proteínas se indica por las líneas pequeñas en negrita. B) Alineamientos de dos restos de secuencias diferentes que aparecen en la proteína de 120 kDa (B-1 a B-3 y C-1) de E. chaffeensis y en la proteína de 100 KDa de GE (b-1 y c-1). Los recuadros en negrita y con líneas cruzadas indican la posición de estas secuencias en las proteínas. Los aminoácidos idénticos están rodeados por recuadros y los aminoácidos conservados están en letras mayúsculas.

Figura 16. Análisis de manchas Western de: A) USG3 purificada disgregada en SDS (calle GE). B) Se hicieron crecer clones individuales recombinantes de GE 100 kDa (S7), GE 160 kDa (S2), GE 130 kDa (S22), y un testigo negativo (NEG, ningún inserto) y se incubaron con IPTG para inducir la expresión de las proteínas según Materials and Métodos. Muestras de cada una se sometieron a electroforesis en geles SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa para el análisis de manchas Western. Las manchas se hicieron reaccionar con sondas de sueros de perros convalecientes. Los marcadores de pesos moleculares (en kilodaltons) se muestran a la izquierda de cada
figura.

Figura 17. Análisis de manchas Western de las proteínas S2, S7, S22 y S23. Se hicieron crecer clones individuales recombinantes de S2, S7, S22, S23 y un testigo negativo y se indujeron con IPTG para que expresaran las proteínas. Muestras de cada una se sometieron a electroforesis en un gel SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa para el análisis de manchas Western. Como testigo positivo se usó GE disgregada con SDS. La mancha se hizo reaccionar con sondas de sueros de perros convalecientes y las muestras se indican en la parte superior del gel. Los marcadores de pesos moleculares (en kilodaltons) se muestran a la izquierda de cada figura.

Figura 18. Análisis de manchas Western de proteínas de GE. Se usaron tres muestras diferentes de suero de ser humano como sondas para reaccionar con manchas Western que contenían USG3 disgregada con SDS (calles GE), GE160, GE100 y GE130. Como testigo negativo (NEG) se usó un clon de una biblioteca pBluescript que no contenía ningún inserto. El origen de los sueros se indica en la parte inferior de cada panel (WI, Wisconsin; NY, Nueva York). Los marcadores de pesos moleculares (en kilodaltons) se muestran a la izquierda de cada panel.

Figura 19. Análisis por PCR de los grupos I, II y III. Se realizaron reacciones PCR y los productos se analizaron usando geles Nusieve al 4%. Las secuencias de los cebadores se listan en la tabla 5. A) Para amplificar una región de 159 bp de DNA de S22 se usaron cebadores S22 usando como plantillas: DNA de plásmido de S22 (calle 4), DNA de plásmido de S23 (calle 8), DNA de células HL60 (calles 2 y 6) y DNA de GE (calles 3 y 7). B) Para amplificar una región de 395 bp de DNA de S2 se usaron cebadores S2 usando como plantillas: DNA de plásmido de S2 (calles 4 y 5), DNA de células HL60 (calle 2) y DNA de GE (calle 3). C) Para amplificar una región de 643 bp de DNA de S7 se usaron cebadores S7 usando como plantillas: DNA de plásmido de S7 (calle 3), DNA de células HL60 (calle 4) y DNA de GE (calle 2). Los marcadores DNA de pesos moleculares (50 - 1000 bp, FMC) están presentes en la calle 1 de cada figura.

Figura 20. Análisis por PCR de genes de GE. Se realizaron reacciones PCR como se describe en Materiales y Métodos y los productos se analizaron usando geles Nusieve al 4%. Para amplificar una región de 395 bp de DNA de S2 se usaron cebadores S2 usando como plantillas: DNA de células HL60 (calle 2), DNA de plásmido de S2 (calle 3) y DNA de células USG3 (calle 4). Para amplificar una región de 643 bp de DNA de S7 se usaron cebadores S7 usando como plantillas: DNA de células HL60 (calle 5), DNA de plásmido de S7 (calle 6), y DNA de células USG3 (calle 7). Para amplificar una región de 159 bp de DNA de S22 se usaron cebadores S22 usando como plantillas: DNA de células HL60 (calle 8), DNA de plásmido de S22 (calle 9) y DNA de células USG3 (calle 10). Los marcadores DNA de pesos moleculares (50 - 1000 bp, FMC, Rockland, ME) están presentes en la calle 1.

Figura 21. Se muestra la secuencia de aminoácidos de C6.1 (SEQ ID NO:21) que comienza en el nucleótido 312 y finaliza en el nucleótido 1532 (véase la figura 23).

Figura 22. Se muestra la secuencia de aminoácidos de C6.2 (SEQ ID NO:22) que engloba los nucleótidos 1542-2336 (véase la figura 23).

Figura 23. Secuencia de DNA de C6 (SEQ ID NO:23). SE muestra la secuencia completa del DNA de doble hebra del inserto C6 en Lambda Zap II.

Figura 24. Análisis de manchas Western de tres clones. Se hicieron crecer clones individuales recombinantes de C1, C6 y C7 y fueron inducidos con IPTG para que expresaran las proteínas según Materiales y Métodos. Muestras de cada uno se sometieron a electroforesis en geles SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa para el análisis de manchas Western. Como testigo positivo se usó GE disgregada con SDS. La mancha se hizo reaccionar con sondas de sueros "C" de ratones vacunados. Las muestras se indican en la parte superior del gel. Los marcadores de pesos moleculares (en kilodaltons) se muestran a la izquierda de cada figura.

Figura 25. Análisis por PCR de genes de C6. Se realizaron reacciones PCR y los productos se analizaron usando geles Nusieve al 4%. Para amplificar una región de 500 bp de DNA de C6 se usaron cebadores C6.1 (del primer marco abierto de lectura, calles 2, 3, 4) usando como plantillas: DNA de plásmido de C6 (calle 4), DNA de células HL60 (calle 2), y DNA de GE (calle 3). Para amplificar una región de 300 bp de DNA de C6 se usaron cebadores C6.2 (del segundo marco abierto de lectura, calles 5, 6, 7) usando como plantillas: DNA de plásmido de C6 (calle 7), DNA de células HL60 (calle 5), y DNA de GE (calle 6). Ambas series de cebadores también se usaron juntos en la misma reacción PCR usando como plantilla DNA de plásmido de C6 (calle 8). Los marcadores DNA de pesos moleculares (50 - 1000 bp, FMC) están presentes en la calle 1.

Figura 26. Alineamiento con ClustalW de aminoácidos codificados por el producto PCR de 550 bp (SEQ ID NO:24) y la proteína MSP-2 de A. marginale (número de acceso al GenBank U07862) SEQ ID NO:25). Los aminoácidos idénticos están encerrados en los recuadros. Los aminoácidos que representan cambios conservadores en los codones se muestran en letras mayúsculas.

Figura 27. Análisis de manchas Western de proteínas de GE. Se analizaron por SDS-PAGE muestras que contenían antígeno USG3 purificado (valles GE), proteínas de células HL60 no infectadas (HL60), un clon de biblioteca pBluescript sin ningún inserto (NEG), E46, E8 ó E33 y se transfirieron a manchas en papel de nitrocelulosa. Las manchas se hicieron reaccionar con sondas de sueros de perro (izquierda) o de cabra (derecha). Los marcadores de tamaños moleculares se indican a la izquierda de cada mancha. Las posiciones de las proteínas expresadas se indican por flechas en el lado derecho de cada mancha. La doble flecha a la izquierda indica las proteínas que fueron cortadas para la secuenciación de péptidos.

Figura 28. Diagrama esquemático de insertos pBluescript E8, E33 y E46. Cada hebra del inserto de DNA se muestra como una línea: +) hebra positiva de DNA; -) hebra negativa de DNA. Las regiones en los recuadros indican marcos abiertos de lectura relacionados. Se indican la posición y la orientación (flechas) del promotor lacZ.

Figura 29. Secuencia del gen GE E8 msp2 (SEQ ID NO:26). Los números de los nucleótidos se indican a la izquierda. El codón de inicio ATG y el codón de parada TAA se muestran en negrita. La secuencia de aminoácidos traducida para el marco abierto de lectura se representa debajo de la secuencia de DNA usando el código de aminoácidos de letra única (SEQ ID NO:27). También se subraya un posible sitio de enlace a los ribosomas aguas arriba del codón ATG.

Figura 30. Secuencia completa de E46. El número de nucleótido se indica encima de las secuencias. Se muestra la secuencia completa de DNA del inserto E46 en Lambda Zap II (SEQ ID NO:28). Las secuencias de aminoácidos traducidas para el marco abierto de lectura se representan debajo de las secuencias de DNA. Se muestra la secuencia de aminoácidos de E46#1 que comienza en el nucleótido 305 y finaliza en el nucleótido 1282 (SEQ ID NO:29). Se muestra la secuencia de aminoácidos de E46#2 que comienza en el nucleótido 1346 y finaliza en el nucleótido 2437 (SEQ ID NO:30).

Figura 31. Alineamiento con ClustalW de secuencias de proteínas MSP-2 de GE y MSP-2 de A. marginale (U07862) (SEQ ID NOS:27, 29-31). Los aminoácidos idénticos están encerrados en los recuadros. Los aminoácidos que representan cambios conservadores en los codones se muestran en letras mayúsculas. El símbolo - - - denota un hueco usado para conseguir un alineamiento óptimo entre las secuencias.

Figura 32. Análisis de manchas Southern de DNA genómico de células USG3. Se digirió DNA genómico de células USG3 o HL60 con los enzimas de restricción indicados encima de las calles y se sometió a análisis de manchas Southern. Como testigo positivo se usó DNA de plásmido de E8 digerido con EcoRI para la hibridación con la sonda y como testigo negativo se usó DNA de timo de ternero (CT). Las manchas se hibridaron con sonda A (extremo 5' de msp-2A de E8) o sonda B (extremo 3' de msp-2A de E8) marcadas con digoxigenina.

Figura 33. Análisis de manchas Western de cultivos bacterianos E33 que expresaban las proteínas MSP-2A y MSP-2B hechas reaccionar con sondas de sueros de pacientes HGE. Se analizaron mediante SDS-PAGE los cultivos bacterianos de MSP-2A (parte superior) y MSP-2B (parte inferior) de E33 y las proteínas se transfirieron a manchas en papel de nitrocelulosa. Las manchas se cortaron en tiras y se hicieron reaccionar con sondas de sueros de los pacientes nºs 1-14 como se indica encima de las calles. Estos números corresponden a los números de paciente mostrados en la tabla 7. Como testigos positivo y negativo también se usaron sueros de perros y cabras inmunes (+) y preinmunes (-). Los marcadores de tamaños moleculares se indican en el lado izquierdo de cada mancha. Las flechas muestran las posiciones de las proteínas MSP-2.

Figura 34. Se listan las secuencias de aminoácidos de la proteína de 64 kDa que degeneran en secuencias de cebadores derivadas de los mismos (SEQ ID NOS:32-33) para SEQ ID NOS:34 y 35 (péptidos 24 y 24, respectivamente). Se subrayan los aminoácidos a partir de los cuales se generan las secuencias de cebadores. Se listan otros dos péptidos: péptido nº 23 (SEQ ID NO:36) y péptido nº 26 (SEQ ID NO:37). Las posiciones sin determinar de las secuencias de péptidos se designan con un asterisco (*).

Figura 35. Mapa lineal de S11 de la biblioteca nBluescript. Los recuadros en cada extremo representan secuencias de vectores y la línea sólida del centro denota el inserto. Las secuencias promotoras T3 y T7 están posicionadas como se indica y el gen S11 se muestra como una línea en negrita.

Figura 36. Secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de S11/GE 59 kDa (SEQ ID NOS:38-39). Los codones de inicio y parada están en negrita. Los péptidos secuenciados están subrayados en la figura 36.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Se describe la secuenciación y el análisis de proteínas de nueve clones recombinantes (S2, S7, S22, S23, C6, S11, E8, E46#1 y E46#2) identificadas por exploración inmunológica de una biblioteca genómica de GE. Dos de estos clones, S22 y S23, codifican proteínas idénticas que difieren sólo por la pérdida de una región repetida en S23. Un clon, C6, contiene dos marcos abiertos de lectura que codifican los polipéptidos C6.1, C6.2. Los clones E8, E46#1 y E46#2 contienen regiones con terminaciones amino y carboxi conservadas. Sobre la base del análisis PCR de DNA de GE y DNA de células HL60 se ha probado que estos aislados de DNA genómico son específicos de GE.

De los cientos de placas de fagos que salieron positivos usando sueros de perros convalecientes o de ratones vacunados, la inmensa mayoría se identificaron como del grupo I (por ejemplo, S22 ó S23), del grupo II (por ejemplo, S2) o del grupo III (por ejemplo, S7). Los genes descritos en la presente memoria codifican más probablemente antígenos GE inmunodominantes que también pueden estar presentes en más de una copia en el genoma de GE. Se ha mostrado que otros antígenos rickettsiales inmunodominantes son importantes reactivos de diagnóstico y dianas de vacunas que incluyen los polipéptidos de la membrana externa de Anaplasma marginale (Tenele et al., Infect. Immun. 59:3199-3204 (1991)), proteínas inmunógenas de Cowdria rumantiun (Mahan et al., Microbiology 140:2135-2142 (1994); van Vliet et al., Infect. Immun. 62:1451-1456 (1994)), la proteína inmunodominante de 120 kDa de E. chaffeensis (Yu et al., J. Clin. Micro. 34:2853-2855 (1996)), el antígeno proteína superficial inmunodominante de Rickettsia prowazekii (Dasch et al., en Microbiology, D. Schlessinger (ed.), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1984), pp. 251-256), y dos proteínas superficiales de Rickettsia prowazekii (Anacker et al., Infect. Immun. 55:825-827 (1987); Summer et al., Vaccine 13:29-35 (1995)). Muchas de estas proteínas contienen regiones muy repetidas similares a las encontradas para las proteínas de GE. Se ha mostrado que los dominios repetitivos de proteínas funcionan en el enlace a los ligandos (Wren, Mol:Microbiol. 5:797-803 (1991)) y pueden funcionar para facilitar la absorción rickettsial por las membranas de las células huésped.

Con el fin de aportar claridad a la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones:

\quad: Moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos S2;

\quad: Polipéptidos S2 producidos por técnicas recombinantes;

\quad: Sonda de ácido nucleico para la detección específica de S2;

\quad: Un método para detectar la presencia de S2 en una muestra;

\quad: Un kit para detectar la presencia de S2 en una muestra;

\quad: Constructos de DNA que comprenden una molécula de ácido nucleico S2 y células que contienen estos constructos;

\quad: Un anticuerpo que tiene afinidad enlazante a un polipéptido S2 y un hibridoma que contiene el anticuerpo;

\quad: Un método para detectar un anticuerpo o polipéptido S2 en una muestra;

\quad: Un kit de diagnóstico que comprende anticuerpo o proteína S2;

\quad: Exploración de diagnóstico; y

\quad: Vacunas.

I. Moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos S2

En una realización, la presente invención se refiere a moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de un polinucleótido al menos 90% idéntica (más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica) a una secuencia seleccionada de:

(a): una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido S2 que comprende la secuencia de aminoácidos completa en SEQ ID NO:4;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido S2, que comprende la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon polinucleótido contenido en el nº de depósito ATCC 97844; y

(c): una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) o (b).

Los ácidos nucleicos S2 se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE.UU., el 31 de diciembre de 1996 como nº de depósito ATCC 97844.

En una realización preferida, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de S2 de GE con una identidad o similitud mayor que 90% (preferiblemente mayor que 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%) con la secuencia de nucleótidos presente en SEQ ID NO:3, respectivamente. En otra realización preferida, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de S2 presente en SEQ ID NO:3. En otra realización, la molécula aislada de ácido nucleico codifica a la secuencia de aminoácidos S2 presente en SEQ ID NO:4.

También están incluidos dentro del alcance de esta invención los equivalentes funcionales de las moléculas aisladas de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria y sus derivados. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos representadas en SEQ ID NO:3 pueden alterarse por sustituciones, adiciones o supresiones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las secuencias que codifican los nucleótidos, en la práctica de la presente invención pueden usarse otras secuencias de DNA que codifiquen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO:4. Éstas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos que comprenden todo o porciones del ácido nucleico S2 representado en SEQ ID NO:3, las cuales son alteradas mediante la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo aminoácido funcionalmente equivalente dentro de la secuencia.

Además, la secuencia de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que proceda de la adición, supresión o sustitución de al menos un nucleótido en el extremo 5' y/o 3' de la fórmula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO:3 o de uno de sus derivados. A este respecto, puede usarse cualquier nucleótido o polinucleótido, siempre que su adición, supresión o sustitución no altere sustancialmente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 que está codificada por la secuencia de nucleótidos. Por otra parte, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede, cuando sea necesario, tener sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción añadidos a su extremo 5' y/o 3'. Por lo tanto, todas las variaciones de la secuencia de nucleótidos del gen S2 y sus fragmentos permitidos por el código genético están incluidas en esta invención.

Además, es posible suprimir codones o sustituir uno o más codones por codones diferentes de los codones degenerados para producir un polipéptido estructuralmente modificado, pero uno que tenga sustancialmente la misma utilidad o actividad del polipéptido producido por la molécula de ácido nucleico sin modificar. Como se reconoce en la técnica, los dos polipéptidos son funcionalmente equivalentes, como lo son las dos moléculas de ácido nucleico que ocasionan su producción, incluso aunque las diferencias entre las moléculas de ácido nucleico no estén relacionadas con la degeneración del código genético.

A. Aislamiento del ácido nucleico

En un aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a S2. En particular, la molécula de ácido nucleico puede aislarse de una muestra biológica (preferiblemente de origen mamífero o de garrapatas) que contenga RNA o DNA de GE.

La molécula de ácido nucleico puede aislarse de una muestra biológica que contenga RNA de GE usando las técnicas de clonación de cDNA e hibridación sustractiva. La molécula de ácido nucleico puede aislarse de una biblioteca de cDNA usando una sonda homóloga.

La molécula de ácido nucleico puede aislarse de una muestra biológica que contenga DNA genómico o de una biblioteca genómica. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, organismos completos, órganos, tejidos, sangre y células. El método de obtener la muestra biológica variará dependiendo de la naturaleza de la muestra.

Un experto en la técnica se dará cuenta de que los genomas pueden estar sometidos a ligeras variaciones alélicas entre individuos. Por lo tanto, también se pretende que la molécula aislada de ácido nucleico incluya variaciones alélicas en tanto y cuanto la secuencia sea un derivado funcional de la secuencia que codifica S2. Cuando un alelo S2 no codifica la secuencia idéntica a la encontrada en SEQ ID NO:3 puede aislarse e identificarse como S2 usando las mismas técnicas usadas en la presente memoria, y especialmente técnicas PCR, para amplificar el gen apropiado con cebadores basados en las secuencias descritas en la presente memoria.

Un experto en la técnica se dará cuenta de que organismos diferentes de GE también contendrán genes S2. Se pretende que la invención incluya, pero no se limite a, moléculas de ácidos nucleicos S2 aisladas de los organismos anteriormente descritos. Asimismo, los organismos eucariotas (por ejemplo, mamíferos, aves, peces y seres humanos) pueden contener genes S2.

B. Síntesis de ácido nucleico

Las moléculas aisladas de ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen las sintetizadas químicamente. Por ejemplo, puede diseñarse una molécula de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos que codifica el producto de expresión del gen S2 y, si es necesario, dividirse en fragmentos apropiados más pequeños. Luego, puede sintetizarse un oligómero que corresponda a la molécula de ácido nucleico, o a cada uno de los fragmentos divididos. Tales oligonucleótidos sintéticos pueden prepararse, por ejemplo, por el método del triéster de Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 705:3185-3191 (1981) o usando un sintetizador automático de DNA.

Un oligonucleótido puede derivarse sintéticamente o por clonación. Si es necesario, los extremos 5' de los oligómeros pueden fosforilarse usando la polinucleótido quinasa T4. La quinasación de hebras individuales antes del apareamiento o para marcarlas puede conseguirse usando un exceso de la enzima. Si la quinasación es para marcar la sonda, el ATP puede contener radioisótopos de alta actividad específica. Luego, el oligómero de DNA puede someterse a apareamiento y ligado con la ligasa T4 o enzimas semejantes.

II. Polipéptidos S2 producidos por técnicas recombinantes

En otra realización, la presente invención se refiere a un polipéptido purificado (preferiblemente, sustancialmente puro) que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a S2 en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos puesta de manifiesto en SEQ ID NO:4, o al menos una identidad del 60% o al menos una similitud del 70% con la misma (preferiblemente, una identidad de al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% o una similitud de al menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, con la misma) o al menos 6 aminoácidos contiguos con la misma (preferiblemente, al menos 10, 15, 20, 25 ó 59 aminoácidos contiguos con la misma).

En una realización preferida, la invención se refiere a epítopes de S2. El epítope de estos polipéptidos es un epítope inmunógeno o antigénico. Un epítope inmunógeno es la parte de la proteína que provoca una respuesta a los anticuerpos cuando la proteína completa es el inmunógeno. Un epítope antigénico es un fragmento de la proteína que puede provocar una respuesta a los anticuerpos. Los métodos de seleccionar fragmentos epítopes antigénicos son bien conocidos en la técnica (Sutcliffe et al., Science 219:660-666 (1983)). Los péptidos y polipéptidos de la invención que portan epítopes antigénicos son útiles para elevar una respuesta inmune que reconozca específicamente a los polipéptidos.

Los péptidos y polipéptidos de la invención que portan epítopes antigénicos comprenden al menos 7 aminoácidos (preferiblemente, 9, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos) de las proteínas de la invención. Ejemplos no limitantes de polipéptidos o péptidos antigénicos incluyen los listados más adelante en la tabla 1.

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TABLA 1 Epítopes antigénicos de S2

1

Pueden prepararse variantes de la secuencia de aminoácidos por mutaciones en el DNA. Tales variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de, o inserciones o sustituciones de, residuos dentro de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:4. También puede hacerse cualquier combinación de supresiones, inserciones y sustituciones para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea la actividad deseada.

Cuando el sitio para introducir una secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar la realización de una mutación en un sitio dado, puede llevarse a cabo una mutagénesis al azar en el codón o región diana y explorarse las variantes de S2 expresadas para la combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en un DNA que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis de sitio específico.

La preparación de una variante de S2 según con lo dicho en la presente invención se consigue preferiblemente por mutagénesis de sitio específico de un DNA que codifica una variante preparada antes o una versión no variante de la proteína. La mutagénesis de sitio específico permite la producción de variantes de S2 por medio del uso de secuencias específicas de oligonucleótidos que codifican a la secuencia de DNA de la mutación deseada. En general, la técnica de la mutagénesis de sitio específico es bien conocida en la técnica, como se ejemplifica mediante publicaciones tales como Adelman et al., DNA 2:183 (1983) y Aussubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", J. Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1996.

Como se apreciará, la técnica de mutagénesis de sitio específico puede emplear un vector fago que existe tanto en forma de hebra individual como de doble hebra. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis de sitio específico incluyen vectores tales como, por ejemplo, el fago M13 que es descrito por Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombination DNA, A. Walton (ed.), Elsevier, Amsterdam (1981). Estos fagos están disponibles comercialmente fácilmente y en general su uso es bien conocido por los expertos en la técnica. Alternativamente, para obtener DNA de una única hebra pueden emplearse vectores basados en plásmidos que contienen un origen de replicación tipo fago de una única hebra (Vieira et al., Meth. Enzymol. 153:3 (1987)).

En general, la mutagénesis dirigida al sitio según lo dicho en la presente memoria se realiza obteniendo en primer lugar un vector de una única hebra que incluye dentro de su secuencia una secuencia de DNA que codifica a la proteína relevante. Se prepara un cebador oligonucleótido que porta la secuencia mutada deseada, en general sintéticamente, por ejemplo mediante el método de Crea et al., Proc. Nad. Acad. Sci. (USA) 75:5765 (1978). A continuación, el cebador se aparea con el vector que contiene la secuencia de la proteína de una única hebra y se somete a enzimas que polimerizan el DNA, tales como el fragmento de Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la hebra que porta la mutación. Así, una secuencia mutada y la segunda hebra portan la mutación deseada. El vector heterodúplex se usa a continuación para transformar células apropiadas y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que portan la disposición de la secuencia mutada.

Después de que tal clon se haya seleccionado, la región mutada de la proteína puede separarse y colocarse en un vector apropiado para la producción de proteínas, en general un vector de expresión del tipo que puede emplearse para la transformación de un huésped apropiado.

En general, las supresiones en la secuencia de aminoácidos varían de aproximadamente 1 a 30 residuos, más preferiblemente 1 a 10 residuos, y típicamente son contiguas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los grupos amino y/o carboxilo terminales que van desde un residuo a polipéptidos de longitud esencialmente no restringida, así como inserciones intra-secuencia de residuos aminoácidos individuales o múltiples. Las inserciones intra-secuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia S2 completa) pueden variar en general de aproximadamente 1 a 10 residuos, más preferiblemente 1 a 5.

El tercer grupo de variantes son aquellas en las que al menos se ha eliminado al menos un residuo aminoácido en la molécula S2, y preferiblemente sólo uno, y en su lugar se ha insertado un residuo diferente. Preferiblemente, cuando se desea modular finamente las características de S2, tales sustituciones se realizan según la siguiente tabla 2.

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TABLA 2

2

Se hacen cambios sustanciales en la identidad funcional o inmunológica seleccionando sustituciones que sean menos conservadoras que las de la tabla 2, es decir, seleccionando residuos que difieran más significativamente en su efecto de mantener: (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que son en general esperadas son aquellas en las que: (a) la glicina y/o la prolina son reemplazados por otro aminoácido o se suprimen o se insertan; (b) un residuo hidrófobo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo es sustituido por un residuo hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, o viceversa; un residuo de cisteína sustituye a cualquier otro residuo, o viceversa; (d) un residuo que tiene una carga electronegativa, por ejemplo glutamilo o aspartilo, es sustituido por un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo o histidilo, o viceversa; o (e) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, reemplaza a uno que no tiene tal cadena lateral, por ejemplo glicina, o viceversa.

No es de esperar que algunas supresiones e inserciones y sustituciones produzcan cambios radicales en las características de S2. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción antes de hacer eso, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado por ensayos exploratorios rutinarios. Por ejemplo, una variante típica se hace por mutagénesis de sitio específico del ácido nucleico natural que codifica a S2, expresión del ácido nucleico variante en un cultivo de células recombinantes, y, opcionalmente, purificación del cultivo celular, por ejemplo, por adsorción de inmunoafinidad en una columna (para adsorber la variante enlazándola a al menos un epítope inmune recombinante. La actividad del lisado celular o de la molécula S2 purificada se explora entonces en un ensayo de exploración adecuado para la característica deseada. Por ejemplo, mediante un inmunoensayo de tipo competitivo se mide un cambio en el carácter inmunológico de la molécula S2, tal como la afinidad por un anticuerpo dado. Los cambios en la inmunomodulación se miden mediante el ensayo apropiado. Se ensayan las modificaciones de propiedades de las proteínas tales como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobia, la susceptibilidad a la degradación proteolítica o la tendencia a agregarse con vehículos o en multímeros, mediante métodos bien conocidos por un experto normal.

Para obtener el péptido de la presente invención puede usarse una variedad de metodologías conocidas. En una realización, el péptido se purifica de tejidos o células que producen el péptido de manera natural. Alternativamente, pueden usarse fragmentos aislados del ácido nucleico anteriormente descritos para expresar la proteína S2 en cualquier organismo. Las muestras de la presente invención incluyen células, extractos de proteínas o extractos de membranas de células o fluidos biológicos. La muestra variará sobre la base del formato de ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos usados como muestra.

Como fuente para el péptido de la invención puede usarse cualquier organismo procariota (preferiblemente, una Ehrlichia granulocítica), en tanto y cuanto el organismo fuente contenga de manera natural tal péptido. Como organismo fuente también puede usarse un organismo eucariota infectado con Ehrlichia granulocítica. Cuando se usa en la presente memoria, "organismo fuente" se refiere al organismo original a partir del cual se deriva la secuencia de aminoácidos de la subunidad;

\hbox{independientemente del organismo la subunidad se expresa
en él  y finalmente se aísla de él.}

Un experto en la técnica puede seguir fácilmente métodos para aislar proteínas con el fin de obtener el péptido exento de contaminantes naturales. Éstos incluyen, pero no se limitan a, inmunocromatografía, cromatografía de exclusión molecular, HPLC, cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de inmuno-afinidad.

III. Sonda de ácido nucleico para la detección específica de S2

En otra realización, la presente invención se refiere a una sonda de ácido nucleico para la detección específica de la presencia del ácido nucleico S2 en una muestra que comprende las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente descritas, o al menos uno de sus fragmentos, que se enlaza en condiciones severas al ácido nucleico S2.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a una sonda aislada de ácido nucleico que consiste en 10 a 1000 nucleótidos (preferiblemente, 10 a 500, 10 a 100, 10 a 50, 10 a 35, 20 a 1000, 20 a 500, 20 a 100, 20 a 50 ó 20 a 35) que preferencialmente se hibrida con RNA o DNA de Ehrlichia granulocítica pero no con RNA o DNA de organismos tipo Ehrlichia no granulocítica (por ejemplo, seres humanos), en la que dicha sonda de ácido nucleico es o es complementaria de una secuencia de nucleótidos que consiste en al menos 10 nucleótidos consecutivos (preferiblemente, 15, 20, 25 ó 30) de la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de un polinucleótido al menos 90% idéntica a una secuencia seleccionada de:

(a): una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido S2 que comprende la secuencia de aminoácidos completa en SEQ ID NO:4, respectivamente;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido S2, que comprende la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon polinucleótido contenido en el nº de depósito ATCC 97844, respectivamente;

(c): una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) o (b); y

(d): una secuencia de nucleótidos como se describió previamente antes.

Más adelante, en la tabla 3, se ponen de manifiesto ejemplos de sondas específicas de ácidos nucleicos que pueden usarse en la presente invención.

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TABLA 3 Sondas de ácidos nucleicos

3

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La sonda de ácido nucleico puede usarse para sondear una biblioteca cromosómica o de cDNA apropiada mediante métodos usuales de hibridación para obtener otra molécula de ácido nucleico de la presente invención. Puede prepararse una biblioteca cromosómica o de cDNA a partir de células apropiadas según métodos reconocidos en la técnica (consúltese, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, editado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

En una alternativa, con el fin de obtener sondas de ácidos nucleicos que tengan secuencias de nucleótidos que correspondan a las porciones amino-terminal y carboxi-terminal de la secuencia de aminoácidos S2 (véase la tabla 3) se lleva a cabo una síntesis química. Así, las sondas de ácidos nucleicos sintetizadas pueden usarse como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada según técnicas de PCR reconocidas, esencialmente según PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, editado por Michael et al., Academic Press, 1990, utilizando la biblioteca cromosómica, de cDNA o de líneas celulares apropiada, para obtener el fragmento de la presente
invención.

Un experto en la técnica puede diseñar fácilmente tales sondas sobre la base de la secuencia descrita en la presente memoria usando métodos de alineamiento y de análisis de secuencias por computadora conocidos en la técnica (consúltese, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, editado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Las sondas de hibridación de la presente invención pueden marcarse mediante técnicas estándar de marcaje tales como radiomarcaje, marcaje enzimático, marcaje fluorescente, marcaje con biotina-avidina, quimioluminiscencia, y semejantes. Después de la hibridación, las sondas pueden visualizarse usando métodos conocidos.

Las sondas de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen RNA así como sondas de DNA, generándose tales sondas usando técnicas conocidas en la técnica.

En una realización del método anteriormente descrito, se inmoviliza una sonda de ácidos nucleicos sobre un soporte sólido. Ejemplos de tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, plásticos tales como policarbonatos, hidratos de carbono complejos tales como agarosa y sefarosa y resinas acrílicas, tales como poliacrilamida y bolas de látex. Las técnicas para acoplar sondas de ácidos nucleicos a tales soportes sólidos son bien conocidas en la técnica.

Las muestras de ensayo adecuadas para métodos con sondas de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen, por ejemplo, células o extractos de ácidos nucleicos de células, o fluidos biológicos. La muestra usada en los métodos anteriormente descritos variará sobre la base del formato de ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos a ensayar. Los métodos para preparar extractos de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y pueden adaptase fácilmente con el fin de obtener una muestra que sea compatible con el método utilizado.

IV. Un método para detectar la presencia de S2 en una muestra

En otra realización, la presente invención se refiere a un método para detectar en una muestra la presencia de ácido nucleico S2, que comprende: a) poner en contacto la muestra con la sonda de ácidos nucleicos anteriormente descrita en condiciones específicas de hibridación tales que se produzca la hibridación, y b) detectar la presencia de la sonda enlazada a la molécula de ácido nucleico.

Alternativamente, en otra realización preferida, el método para detectar la presencia de ácido nucleico S2 en una muestra puede comprender: a) amplificar el ácido nucleico en la muestra con la sonda de ácidos nucleicos, en el que la amplificación usa técnicas de PCR, y b) detectar la presencia de moléculas del ácido nucleico amplificado. Un experto en la técnica seleccionaría la sonda de ácidos nucleicos según técnicas conocidas en la técnica que se describieron anteriormente. Las muestras a ensayar incluyen, pero no se limitan a, muestras de RNA de tejido de ser
humano.

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V. Un kit para detectar la presencia de S2 en una muestra

En otra realización, la presente invención se refiere a un kit para detectar en una muestra la presencia de ácido nucleico S2, que comprende al menos un medio recipiente que tiene dispuesto en el mismo la sonda de ácidos nucleicos anteriormente descrita. En una realización preferida, el kit comprende además otros recipientes que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos para lavar y reactivos capaces de detectar la presencia de la sonda de ácidos nucleicos enlazada. Ejemplos de reactivos de detección incluyen, pero no se limitan a, sondas radiomarcadas, sondas marcadas enzimáticamente (peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina) y sondas marcadas por afinidad (biotina, avidina o estreptavidina).

En detalle, un kit compartimentalizado incluye cualquier kit en el están contenidos reactivos en recipientes separados. Tales recipientes incluyen pequeños recipientes de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o papel. Tales recipientes permiten la transferencia eficiente de reactivos de un compartimento a otro tal que las muestras y los reactivos no experimenten contaminación cruzada y los agentes o las disoluciones de cada recipiente pueden añadirse de una manera cuantitativa de un compartimento a otro. Tales recipientes incluirán un recipiente que aceptará la muestra a ensayar, un recipiente que contiene la sonda o los cebadores usados en el ensayo, recipientes que contienen los reactivos para lavar (tales como una disolución salina tamponada con fosfatos, tampones tris y semejantes) y recipientes que contienen los reactivos usados para detectar la sonda hibridada, el anticuerpo enlazado, el producto amplificado, o semejantes.

Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que las sondas de ácidos nucleicos descritas en la presente invención pueden incorporarse fácilmente a uno de los formatos de kits establecidos que son bien conocidos en la técnica.

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VI. Constructos de DNA que comprenden una molécula de ácido nucleico S2 y células que contienen estos constructos

En otra realización, la presente invención se refiere a una molécula de DNA recombinante que comprende un promotor 5' a 3' efectivo para iniciar la transcripción en una célula huésped y las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente descritas. En otra realización, la presente invención se refiere a una molécula de DNA recombinante que comprende un vector y una molécula de ácido nucleico anteriormente descrita.

En otra realización, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una región de control transcripcional en una célula, una secuencia complementaria a una secuencia de RNA que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido anteriormente descrito y una región de terminación transcripcional funcional en la célula.

Preferiblemente, las moléculas anteriormente descritas son moléculas aisladas y/o moléculas de DNA purificadas.

En otra realización, la presente invención se refiere a una célula o a un organismo no humano que contiene una molécula de ácido nucleico anteriormente descrita.

En otra realización, el péptido se purifica de las células que han sido alteradas para expresar al péptido.

Cuando se usa en la presente memoria, se dice que una célula "ha sido alterada para expresar un péptido deseado" cuando se hace que la célula, por medio de manipulación genética, produzca una proteína que normalmente no produce o que la célula normalmente produce en bajas concentraciones. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente procedimientos para introducir y expresar secuencias genómicas, de cDNA o sintéticas en células eucariotas o procariotas.

Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como DNA, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información transcripcional y de traducción reguladora y tales secuencias están "operablemente conectadas" a las secuencias de nucleótidos que codifican al polipéptido. Una conexión operable es una conexión en la que las secuencias de DNA reguladoras y la secuencia de DNA que se busca que se exprese están conectadas de tal forma que permitan la expresión de la secuencia del gen. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia del gen puede variar de organismo a organismo, pero en general incluirá una región promotora la cual, en los procariotas, contiene tanto el promotor (el cual dirige la iniciación de la transcripción del RNA) así como las secuencias de DNA que, cuando se transcriben en RNA, transmitirán las señales para la iniciación de la síntesis. Normalmente, tales regiones incluirán aquellas secuencias 5' no codificantes implicadas en la iniciación de la transcripción y de la traducción, tal como el recuadro TATA, secuencia rematada, secuencia CAAT y semejantes.

Si se desea, la región 3' no codificante a la secuencia codificante S2 puede obtenerse mediante los métodos anteriormente descritos. Esta región puede ser retenida por sus secuencias reguladoras de la terminación transcripcional, tales como terminación y poliadenilación. Así, reteniendo la región 3' naturalmente contigua a la secuencia de DNA que codifica un gen S2 puede proporcionarse las señales de terminación transcripcional. Cuando las señales de terminación transcripcional no son satisfactoriamente funcionales en la célula huésped de expresión, entonces puede estar sustituida una región funcional 3' en la célula huésped. Se dice que dos secuencias de DNA (tales como una secuencia de una región promotora y una secuencia codificante de S2) están operablemente conectadas si la naturaleza de la conexión entre las dos secuencias de DNA: (1) no da lugar a la introducción de una mutación del marco de lectura, (2) no interfiere con la capacidad de la secuencia de la región promotora para dirigir la transcripción de una secuencia codificante de S2, o (3) no interfiere con la capacidad de la secuencia codificante de S2 de ser transcrita por la secuencia de la región promotora. Así, una región promotora estaría operablemente conectada con una secuencia de DNA si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de DNA.

La presente invención engloba la expresión de la secuencia codificante de S2 (o de uno de sus derivados funcionales) en células procariotas o eucariotas. En general, los huéspedes procariotas son los más eficientes y convenientes para la producción de proteínas recombinantes y, por lo tanto, son preferidos para la expresión de la secuencia codificante de S2.

Los procariotas están más frecuentemente representados por varias cepas de E. coli. Sin embargo, también pueden usarse otras cepas microbianas, incluyendo otras cepas bacterianas. En sistemas procariotas pueden usarse vectores basados en plásmidos que contengan sitios de replicación y secuencias de control derivadas de una especie compatible con el huésped. Ejemplos de vectores basados en plásmidos adecuados incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 y semejantes; de vectores adecuados basados en fagos o bacteriófagos incluyen \lambdagt10, \lambdagtll y semejantes; y de vectores adecuados basados en virus incluyen pMAM-neo, pKRC y semejantes. Preferiblemente, el vector seleccionado de la presente invención tiene la capacidad de replicarse en la célula huésped seleccionada.

Los huéspedes procariotas reconocidos incluyen bacterias tales como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, y semejantes. Sin embargo, en tales condiciones, el péptido no estará glicosilado. El huésped procariota tiene que ser compatible con las secuencias del replicón y de control en el plásmido de expresión.

Para expresar S2 en una célula procariota, es necesario conectar operablemente la secuencia codificante de S2 con un promotor procariota funcional. Tales promotores pueden ser constitutivos o, más preferiblemente, regulables (es decir, inducibles o depresibles). Ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla de la secuencia del gen de \beta-lactamasa de pBR322, y el promotor CAT de la secuencia del gen de la cloranfenicol acetil transferasa de pBR325, y semejantes. Ejemplos de promotores procariotas inducibles incluyen los principles promotores de las hélices derecha e izquierda del bacteriófago \lambda (P_{L} y P_{R}), los promotores trp, recA, lacZ, lacI y gal de E. coli, los promotores de \alpha-amilasa (Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162:176-182 (1985)) y \varsigma-28-específicos de B. subtilis (Gilman et al., Gene sequence 32:11-20 (1984)), los promotores de los bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, en: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)), y los promotores de Streptomyces (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203:468-478 (1986)). Los promotores procariotas son revisados por Glick (J. Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987)); Cenatiempo (Biochimie 68:505-516 (1986)); y Gottesman (Ann. Rev. Genet. 8:415-442 (1984)).

La expresión apropiada en una célula procariota también requiere la presencia de un sitio de enlace a los ribosomas aguas arriba de la secuencia del gen que codifica la secuencia. Tales sitios de enlace a los ribosomas son descritos, por ejemplo, por Gold et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404 (1981)).

La selección de las secuencias de control, los vectores de expresión, los métodos de transformación y semejantes, depende del tipo de célula huésped usada para expresar el gen. Cuando se usan en la presente memoria, "célula", "línea celular" y "cultivo celular" pueden usarse intercambiablemente y todas dichas designaciones incluyen la progenie. Así, las palabras "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula primaria objeto y los cultivos derivados de la misma, sin consideración al número de transferencias. Se ha de entender que no toda la progenie puede ser precisamente idéntica en el contenido de DNA, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Sin embargo, como se define, la progenie mutante tiene la misma funcionalidad que la de la célula original transformada. Las células huésped que pueden usarse en los sistemas de expresión de la presente invención no están estrictamente limitadas, siempre que sean adecuadas para usar en la expresión del péptido S2 de interés. Los huéspedes adecuados incluyen células eucariotas.

Los huéspedes eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, levaduras, hongos, células de insectos y células de mamíferos in vivo o en un cultivo tisular. Las células de mamíferos preferidas incluyen células HeLa, células de mamíferos origen fibroblastos tales como VERO o CHO-K1, o células de mamíferos de origen linfoide y sus derivados.

Además, las células de plantas también están disponibles como huéspedes, y están disponibles secuencias de control compatibles con las células de plantas, tales como los virus 35S y 19S del mosaico de la coliflor, y el promotor de la nopalina sintasa y las secuencias que transmiten las señales de la poliadenilación.

Otro huésped preferido es una célula de insecto, por ejemplo Drosophila larvae. Usando como huéspedes células de insectos puede usarse el promotor de la enzima alcohol deshidrogenasa de Drosophila (Rubin, Science 240:1453-1459 (1988)). Alternativamente, pueden modificarse por ingeniería genética vectores basados en baculovirus para que expresen grandes cantidades de S2 en células de insectos (Jansy, Science 238:1653 (1987); Miller et al., en: Genetic Engineering (1986), Setlow, J.K. et al., eds., Plenum, vol. 8, pp. 277-297).

Las células de huéspedes diferentes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesado y modificación durante y después de la traducción (por ejemplo, glicosilación, escisión) de proteínas. Pueden escogerse líneas de células apropiadas para asegurar la modificación y el procesado deseados de la proteína extraña expresada.

Puede usarse cualquiera de una serie de sistemas de expresión de secuencias de genes en levaduras, los cuales incorporan elementos promotores y de terminación de las secuencias de genes activamente expresadas que codifican enzimas glicolíticos. Estas enzimas se producen en grandes cantidades cuando se hacen crecer levaduras en medios ricos en glucosa. Las secuencias conocidas de genes glicolíticos también pueden proporcionar señales de control transcripcional muy eficientes.

Las levaduras proporcionan ventajas sustanciales porque también pueden llevar a cabo modificaciones de péptidos después de la traducción. Existen varias estrategias basadas en la tecnología de DNA recombinante que utilizan secuencias de promotores fuertes y un alto número de copias de plásmidos que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en levaduras. Las levaduras reconocen secuencias líderes en productos de secuencias de genes clonados de mamíferos y secretan péptidos que portan secuencias líderes (es decir, pre-péptidos). Para un huésped mamífero están disponibles varios sistemas vectores posibles para la expresión de S2.

Dependiendo de la naturaleza del huésped pueden emplearse una amplia variedad de secuencias reguladoras transcripcionales y transnacionales. Las señales reguladoras transcripcionales y durante la traducción pueden derivarse de fuentes víricas, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de los simios o semejantes, cuando las señales reguladoras están asociadas con una secuencia particular de un gen que tiene un alto grado de expresión. Alternativamente, pueden emplearse los promotores de productos de expresión en mamíferos, tales como actina, colágeno, miosina y semejantes. Pueden seleccionarse señales transcripcionales reguladoras de la iniciación que permitan la represión o la activación, de modo que pueda modularse la expresión de las secuencias del gen. Son de interés las señales reguladoras que son sensibles a la temperatura de modo que variando la temperatura pueda reprimirse o iniciarse la expresión, o que son objeto de regulación química (tal como por metabolitos).

Como se trató anteriormente, la expresión de S2 en huéspedes eucariotas requiere el uso de regiones reguladoras eucariotas. En general, tales regiones incluirán una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de RNA. Los promotores eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, el promotor de la secuencia del gen metalotioneína I en ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); el promotor TK del virus del herpes (Mcknight, Cell 37:355-365 (1982)); el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., Nature (London) 290:304-310 (1981)); el promotor de la secuencia del gen gal4 en levadura (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975 (1982); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955 (1984)) y el promotor del gen inmediato-temprano de CMV (Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:659-663 (1984).

Como es ampliamente conocido, la traducción de mRNA eucariota se inicia en el codón que codifica la primera metionina. Por esta razón, es preferible asegurar que la conexión entre un promotor eucariota y una secuencia codificante de S2 no contenga ningún codón intermedio que sea capaz de codificar una metionina (es decir, AUG). La presencia de tales codones da lugar a la formación de una proteína de fusión (si el codón AUG está en el mismo marco de lectura que la secuencia codificante de S2) o a una mutación del marco (si el codón AUG no está en el mismo marco de lectura que la secuencia codificante de S2).

Una molécula de ácido nucleico S2 y un promotor operablemente conectado pueden introducirse en una célula receptora procariota o eucariota como una molécula de DNA (o RNA) no replicante que puede ser una molécula lineal, o, más preferiblemente, una molécula circular cerrada covalente. Puesto que tales moléculas son incapaces de replicación autónoma, la expresión del gen puede ocurrir a través de la expresión transitoria de la secuencia introducida. Alternativamente, la expresión permanente puede ocurrir a través de la integración de la secuencia de DNA introducida en el cromosoma del huésped.

En una realización, se emplea un vector que es capaz de integrar las secuencias deseadas del gen en el cromosoma de la célula huésped. Pueden seleccionarse células que han integrado establemente el DNA introducido en sus cromosomas introduciendo también uno o más marcadores que permitan la selección de células huésped que contengan el vector de expresión. El marcador puede proporcionar prototrofia a un huésped autotrófico, resistencia a los biocidas, por ejemplo, antibióticos o metales pesados, tales como el cobre, o semejantes. La secuencia seleccionable marcadora del gen puede estar directamente conectada a las secuencias de DNA del gen a expresar, o introducida en la misma célula por co-transfección. Para la síntesis óptima de mRNA de cadena única enlazante de proteínas también pueden necesitarse elementos adicionales. Estos elementos pueden incluir señales de empalme así como promotores de transcripción, secuencias potenciadoras de señales y señales de terminación. Los vectores de expresión de cDNA que incorporan tales elementos incluyen los descritos por Okayama, Molec. Cell. Biol. 3:280 (1983).

En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico introducida se incorporará a un vector basado en plásmidos o en virus capaz de replicación autónoma en el huésped receptor. Para este fin puede emplearse cualquiera de una amplia variedad de vectores. Los factores de importancia para seleccionar un vector particular basado en plásmidos o en virus incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector pueden reconocerse y seleccionarse de aquellas células receptoras que no contengan el vector; el número de copias del vector que se desea en un huésped particular; y si es deseable ser capaces de "transportar" el vector entre células huésped de diferentes especies. Los vectores procariotas deseables incluyen plásmidos tales como los que son capaces de replicación en E. coli (tales como, por ejemplo, pBR322, COPEI, pSC101, pACYC 184, \piVX. Tales plásmidos son, por ejemplo, descritos por Sambrook (consúltese Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, editado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Los plásmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127 y semejantes. Tales plásmidos son descritos por Gryczan (en: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982), pp. 307-329. Los plásmidos de Streptomyces adecuados incluyen pIJ101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183 (1987)), y bacteriófagos de Streptomyces tales como \varphiC31 (Chater et al., en: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungría (1986), pp. 45-54). Los plásmidos de Pseudomonas son revisados por John et al. (Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986)), e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978)).

Los plásmidos eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, BPV, vaccinia, SV40, círculo de 2 micrómetros y semejantes o sus derivados. Tales plásmidos son bien conocidos en la técnica (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19:265-214 (1982); Broach, en: The Molecular Biology of Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp- 445-470 (1981); Broach, Cell 28:203-204 (1982); Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980); Maniatis, en: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608 (1980)).

Una vez que el vector o la molécula de ácido nucleico que contiene el o los constructos ha sido preparada para la expresión, el o los constructos de DNA pueden introducirse en una célula huésped apropiada por cualquiera de una variedad de medios adecuados, es decir, transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, tecnología del cañón de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, y semejantes. Después de la introducción del vector se hacen crecer las células receptoras en un medio selectivo, el cual se selecciona para el crecimiento de células que contengan el vector. La expresión de la o las moléculas del gen clonado da lugar a la producción de S2. Esto puede ocurrir en las células transformadas como tales, o seguir a la inducción de estas células para diferenciar (por ejemplo, mediante la administración de bromodesoxiuracilo a células de neuroblastoma o semejantes).

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VII. Un anticuerpo que tiene afinidad enlazante a un polipéptido S2 y un hibridoma que contiene el anticuerpo

En otra realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad enlazante específicamente a un polipéptido S2 como se describió anteriormente o específicamente a uno de sus fragmentos que se enlaza a un polipéptido S2. Un anticuerpo se enlaza específicamente a un polipéptido S2 o a uno de sus fragmentos enlazantes si no se enlaza a polipéptidos que no sean S2. Los que se enlazan selectivamente a S2 serían seleccionados para usar en métodos que podrían incluir, pero que no deben limitarse a, el análisis de la expresión alterada de S2 en tejidos que contienen S2.

Las proteínas S2 de la presente invención pueden usarse en una variedad de procedimientos y métodos, tales como para la generación de anticuerpos, para usar en la identificación de composiciones farmacéuticas y para estudiar la interacción DNA/proteínas.

Las proteínas S2 de la presente invención pueden usarse para producir anticuerpos o hibridomas. Un experto en la técnica reconocerá que si se desea un anticuerpo, tal péptido se generaría como se describe en la presente memoria y se usaría como un inmunógeno.

Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos de estos anticuerpos. La invención además incluye anticuerpos de una única cadena. Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: el fragmento F(ab')_{2}; los fragmentos Fab', los fragmentos Fab y los fragmentos Fv.

De especial interés para la presente invención son los anticuerpos de proteínas S2 que se producen en seres humanos, o son "humanizados" (es decir, no inmunógenos en un ser humano) por técnicas recombinantes u otras tecnologías. Los anticuerpos humanizados pueden producirse, por ejemplo, reemplazando una porción inmunógena de un anticuerpo por una porción correspondiente no inmunógena (es decir, anticuerpos quimera) (Robinson et al., solicitud PCT nº PCT/US86/02269); Akira et al., patente europea nº 184.187; Taniguchi, patente europea nº 171.496; Morrison et al., patente europea nº 173.494; Neuberger et al., solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly et al., patente europea nº 125.023; Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); Liu et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Liu et al., J. Immunol. 139:3521-3526 (1987); Sun et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Nishimura et al., Cane. Res. 47:999-1005 (1987); Word et al., Nature 314:446-449 (1985)); Shaw et al., J. Nad. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988). Revisiones generales de anticuerpos quimera "humanizados" son dadas por Morrison (Science, 229:1202-1207 (1985)) y por Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)). Alternativamente, pueden producirse anticuerpos "humanizados" adecuados por sustitución CDR o CEA (Jones et al., Nature 321:552-525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239:1534 (1988); Beidler et al., J. Immunol. 747:4053-4060 (1988)).

En otra realización, la presente invención se refiere a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anteriormente descrito. Un hibridoma es una línea celular inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo monoclonal específico.

En general, las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales e hibridomas son bien conocidas en la técnica (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holanda (1984); St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:1-21
(1980)).

Cualquier animal (ratón, conejo y semejantes) que se sepa produce anticuerpos puede ser inmunizado con el polipéptido seleccionado. Los métodos de inmunización son bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen inyección subcutánea o interperitoneal del polipéptido. Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad de polipéptido usada para la inmunización variará sobre la base del animal que es inmunizado, la antigenicidad del polipéptido y el sitio de inyección.

El polipéptido puede modificarse o administrarse en un compuesto auxiliar con el fin de aumentar la antigenicidad del péptido. Los métodos para aumentar la antigenicidad de un polipéptido son bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen condensar el antígeno con una proteína heteróloga (tal como globulina o \beta-galactosidasa) o por medio de la inclusión de un compuesto auxiliar durante la inmunización.

Para anticuerpos monoclonales, se separan células del bazo de los animales inmunizados, se fusionan con células de mieloma y se permite que se tornen en células hibridoma que producen anticuerpos monoclonales.

Para identificar la célula hibridoma que produce un anticuerpo de las características deseadas puede usarse uno cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Éstos incluyen exploración de los hibridomas con un ensayo ELISA, análisis de manchas Western o radioinmunoensayo (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175:109-124 (1988)).

Los hibridomas que secretan los anticuerpos deseados se clonan y la clase y subclase se determina usando procedimientos conocidos en la técnica (Campbell, Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, véase anteriormente (1984)).

Para anticuerpos monoclonales, se aíslan antisueros que contienen anticuerpos del animal inmunizado y se exploran respecto a la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada usando uno de los procedimientos anteriormente descritos.

En otra realización de la presente invención, los anticuerpos anteriormente descritos se marcan detectablemente. Los anticuerpos pueden marcarse detectablemente por medio del uso de radioisótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina, avidina y semejantes), marcadores enzimáticos (tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y semejantes), marcadores fluorescentes (tales como FITC o rodamina y semejantes), átomos paramagnéticos y semejantes. Los procedimientos para conseguir tal marcaje son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, (Sternberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval et al., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)). Los anticuerpos marcados de la presente invención pueden usarse para ensayos in vitro, in vivo e in situ para identificar células o tejidos que expresen un péptido específico.

En otra realización de la presente invención, los anticuerpos anteriormente descritos se inmovilizan sobre un soporte sólido. Ejemplos de tales soportes sólidos incluyen plásticos tales como policarbonatos, hidratos de carbono complejos tales como agarosa y sefarosa, resinas acrílicas tales como poliacrilamida y bolas de látex. Las técnicas para condensar anticuerpos a tales soportes sólidos son bien conocidas en la técnica (Weir et al., "Handbook of Experimental Immunology", 4ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra, capítulo 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 academic Press, N.Y. (1974)). Los anticuerpos inmovilizados de la presente invención pueden usarse para ensayos in vitro, in vivo e in situ así como en inmunocromatografía.

Además, un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los procedimientos, así como las técnicas, métodos y kits actualmente disponibles descritos anteriormente con respecto a los anticuerpos, para generar péptidos capaces de enlazarse a una secuencia peptídica específica con el fin de generar péptidos anti-péptidos racionalmente diseñados. Véase, por ejemplo, Hurby et al., "Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", en Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, pp. 289-307 (1992), y Kaspczak et al., Biochemistry 28:9230-8
(1989).

Pueden generarse péptidos anti-péptidos de una de dos maneras. Primera, los péptidos anti-péptidos pueden generarse reemplazando los residuos aminoácidos básicos encontrados en la secuencia peptídica S2 por residuos ácidos, mientras que se mantienen los grupos hidrófobos y polares no cargados. Por ejemplo, los residuos de lisina, arginina y/o histidina son reemplazados por ácido aspártico o ácido glutámico y los residuos de ácido glutámico son reemplazados por lisina, arginina o histidina.

VIII. Un método para detectar un anticuerpo o polipéptido S2 en una muestra

En otra realización, la presente invención se refiere a un método para detectar en una muestra un polipéptido S2 que incluye la secuencia consenso correspondiente a las regiones amino y/o carboxi terminales compartidas por los polipéptidos E8, E46#1 y E46#2, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo (o proteína) anteriormente descrito en condiciones tales que se formen inmunocomplejos, y b) detectar la presencia del anticuerpo enlazado al polipéptido. En detalle, los métodos comprenden incubar una muestra de ensayo con uno o más de los anticuerpos de la presente invención y ensayar si el anticuerpo se enlaza a la muestra de ensayo. Concentraciones de péptidos S2 alteradas en una muestra comparadas con las concentraciones normales pueden indicar una enfermedad específica.

En otra realización, la presente invención se refiere a un método para detectar en una muestra un anticuerpo S2, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un polipéptido S2 anteriormente descrito en condiciones tales que se formen inmunocomplejos, y b) detectar la presencia de la proteína enlazada al anticuerpo o del anticuerpo enlazado a la proteína. En detalle, los métodos comprenden incubar una muestra de ensayo con una o más de las proteínas de la presente invención y ensayar si el anticuerpo se enlaza a la muestra de ensayo. La presencia de anticuerpos de S2 puede indicar exposición a GE, la necesidad potencial de terapia del individuo afectado, o contaminación de una muestra biológica con GE.

Las condiciones para incubar un anticuerpo con una muestra de ensayo varían. Las condiciones de incubación dependen del formato empleado en el ensayo, de los métodos de detección empleados y del tipo y la naturaleza del anticuerpo usado en el ensayo. Un experto en la técnica reconocerá que puede adaptase fácilmente uno cualquiera de los formatos de ensayos inmunológicos normalmente disponibles (tales como radioinmunoensayos, ensayos con inmunoadsorbentes conectados a enzimas, difusión basada en gel de Ouchterlony o ensayos de inmunofluorescencia en cohete) para emplear los anticuerpos de la presente invención. Ejemplos de tales ensayos pueden encontrarse en Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holanda (1986); Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL vol. 1 (1982), vol. 2 (1983), vol. 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publications, Amsterdam, Holanda (1985).

Las muestras de ensayos para ensayos inmunológicos de la presente invención incluyen células, extractos de proteínas o de membranas de células o fluidos biológicos tales como sangre, suero, plasma u orina. La muestra de ensayo usada en el método anteriormente descrito variará sobre la base del formato de ensayo, la naturaleza del método de detección y de los tejidos, las células o los extractos usados como la muestra a ensayar. Los métodos para preparar extractos de proteínas o de membranas de células son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse fácilmente con el fin de obtener una muestra que sea capaz con el sistema utilizado.

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IX. Un kit de diagnóstico que comprende anticuerpo o proteína S2

En otra realización de la presente invención, se proporciona un kit que contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de detección previamente descritos.

El kit puede comprender: i) un primer medio recipiente que contiene un anticuerpo anteriormente descrito; y ii) un segundo medio recipiente que contiene un conjugado que comprende un socio de enlace del anticuerpo y un marca-
dor.

El kit puede comprender: i) un primer medio recipiente que contiene una proteína anteriormente descrita y, preferiblemente, ii) un segundo medio recipiente que contiene un conjugado que comprende un socio de enlace de la proteína y un marcador. Más específicamente, un kit de diagnóstico comprende un péptido S2 para detectar anticuerpos en el suero de animales o seres humanos potencialmente infectados.

En otra realización preferida, el kit comprende además uno o más recipientes que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos para lavar y reactivos capaces de detectar la presencia de anticuerpos enlazados. Ejemplos de reactivos de detección incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos secundarios marcados, o en una alternativa, si el anticuerpo primario está marcado, los reactivos cromóforos, enzimáticos o anticuerpos que sean capaces de reaccionar con el anticuerpo marcado. El kit compartimentalizado puede ser como se describió anteriormente para los kits de sondas de ácidos nucleicos.

Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que los anticuerpos descritos en la presente invención pueden incorporarse fácilmente a uno de los formatos de kits establecidos que son bien conocidos en la técnica.

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X. Exploración de diagnóstico

Se ha de entender que aunque la siguiente discusión se dirige específicamente a pacientes humanos, las enseñanzas también son aplicables a cualquier animal que pueda ser infectado con GE.

Los métodos de diagnóstico y de exploración de la invención son especialmente útiles para un paciente del que se sospecha está en riesgo de desarrollar erliquiosis.

Según la invención, ahora es posible una exploración pre y postsintomática de un individuo que necesite tal exploración usando DNA que codifica la proteína S2 o uno de sus fragmentos de la invención. El método de exploración de la invención permite un diagnóstico presintomático de la presencia de proteína o DNA S2 en individuos, y por tanto una opinión relacionada con la probabilidad de que tal individuo desarrolle o haya desarrollado erliquiosis. Para maximizar la intervención oportunamente apropiada se desea un diagnóstico temprano.

En una realización preferida del método de exploración, se extraería una muestra de tejido de un individuo, y se exploraría respecto a: (1) la presencia de la secuencia codificante de DNA de S2; (2) la presencia de mRNA de S2; (3) la presencia de proteína S2; y/o (4) la presencia de anticuerpos de la proteína S2.

Un método preferido de detectar la presencia de proteína S2 y/o la presencia de anticuerpos de la proteína S2 comprende: a) poner en contacto la muestra con un polipéptido o anticuerpo de un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos de S2 o de uno de sus fragmentos en condiciones tales que se formen inmunocomplejos; y b) detectar la presencia del anticuerpo y el polipéptido inmunocomplejados.

Los individuos no infectados con GE no tienen DNA, mRNA o proteína S2 de GE.

Los métodos de exploración y diagnóstico de la invención no requieren que se use para la sonda la secuencia codificante completa de S2. Más bien, sólo es necesario usar un fragmento o longitud de ácido nucleico que sea suficiente para detectar la presencia del ácido nucleico de S2 en una preparación de DNA de un individuo.

El análisis de ácidos nucleicos específicos de GE puede ser por técnicas PCR o por técnicas de hibridación (consúltese, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2ª edición, editado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Eremeeva et al., J. Clin. Microbiol. 32:803-810 (1994) que describe la diferenciación entre especies de Rickettsia del grupo de las fiebres moteadas por análisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción de DNA amplificado por PCR). Las sondas de ácidos nucleicos usadas para analizar el DNA genómico de GE vía análisis PCR han sido descritas en Chen et al., J. Clin. Microbiol. 32:589-595 (1994).

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XI. Vacunas

En otra realización, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende una proteína S2 de GE o uno de sus fragmentos (preferiblemente, un fragmento inmunológicamente activo) junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que la proteína está presente en una cantidad efectiva para provocar en un animal una respuesta inmune a GE beneficiosa. La proteína S2 puede obtenerse como se describió anteriormente y usando métodos bien conocidos en la técnica. Un fragmento inmunológicamente activo comprende una porción de la proteína que porta un epítope.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a una composición que comprende una proteína S2 de GE o uno de sus fragmentos (preferiblemente, un epítope antigénico del fragmento inmunológicamente reactivo, en la tabla 1 se listan ejemplos) y un vehículo.

En otra realización, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende un ácido nucleico S2 (preferiblemente, DNA) de GE o uno de sus fragmentos (preferiblemente, un fragmento que codifica una proteína o un péptido inmunológicamente activos) junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que el ácido nucleico está presente en una cantidad efectiva para provocar en un animal una respuesta inmune a GE beneficiosa. El ácido nucleico S2 puede obtenerse como se describió anteriormente y usando métodos bien conocidos en la técnica. Un fragmento inmunológicamente activo comprende una porción del ácido nucleico que porta un
epítope.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a una composición que comprende un ácido nucleico (preferiblemente, DNA) S2 de GE o uno de sus fragmentos (preferiblemente, que codifica una proteína o un epítope antigénico del fragmento inmunológicamente reactivo) y un vehículo.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método para producir una respuesta inmune que reconozca GE en un huésped, que comprende administrar al huésped la composición anteriormente descrita.

En una realización preferida, el animal a proteger se selecciona de seres humanos, caballos, ciervos, ganado, cerdos, ovejas, perros y pollos. En una realización más preferida, el animal es un ser humano o un perro.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método para prevenir la erliquiosis en un animal, que comprende administrar al animal la vacuna anteriormente descrita, en el que la vacuna se administra en una cantidad efectiva para prevenir o inhibir la erliquiosis. La vacuna de la invención se usa en una cantidad efectiva dependiendo de la ruta de administración. Aunque las rutas de administración preferidas son la intranasal, subcutánea o intramuscular, la vacuna de la presente invención también puede administrarse por una ruta oral, intraperitoneal o intravenosa. Un experto en la técnica apreciará que las cantidades a administrar en cualquier protocolo de tratamiento particular pueden determinarse fácilmente sin experimentación innecesaria. Las cantidades adecuadas están dentro del intervalo de 2 \mug de la proteína S2 por kg de peso corporal a 100 \mug por kg de peso corporal (preferiblemente, 2 \mug a 50 \mug, 2 \mug a 25 \mug, 5 \mug a 50 \mug ó 5 \mug a 10 \mug).

Ejemplos de formulaciones de vacuna que incluyen las cantidades de antígenos, la ruta de administración y la adición de compuestos auxiliares pueden encontrarse en Kensil, Therapeutic Drug Carrier Systems 13:1-55 (1996), Livingston et al., Vaccine 12:1215 (1994), y Powell et al., AIDS RES, Human Retroviruses 10:5105 (1994).

La vacuna de la presente invención puede emplearse en formas tales como cápsulas, disoluciones, suspensiones o elixires líquidos para la administración oral, o formas líquidas estériles tales como disoluciones o suspensiones. Preferiblemente, se usa cualquier vehículo inerte, tal como una disolución salina, disolución salina tamponada con fosfatos, o cualquier vehículo en el que la vacuna tenga propiedades de solubilidad adecuadas. Las vacunas pueden estar en forma de preparaciones de una única dosis o en frascos de múltiples dosis que pueden usarse para programas de vacunación masiva. Para métodos de preparación y uso de vacunas se hace referencia a Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Easton, PA, Osol (ed.) (1980); y a New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (eds.), University Park Press, Baltimore, MD (1978).

Las vacunas de la presente invención pueden además comprender compuestos auxiliares que potencien la producción de anticuerpos y de células inmunes. Tales compuestos auxiliares incluyen, pero no se limitan a, varias formulaciones oleosas tales como la preparación auxiliar completa de Freund, el dipéptido conocido como MDP, saponinas (por ejemplo, QS-21, patente de EE.UU. nº 5.047.540), hidróxido de aluminio o citoquinas linfáticas. La preparación auxiliar de Freund es una emulsión de un aceite mineral y agua que se mezcla con la sustancia inmunógena. Aunque la preparación auxiliar de Freund es poderosa, usualmente no se administra a seres humanos. En su lugar, para la administración a un ser humano puede usarse el compuesto auxiliar alumbre (hidróxido de aluminio). La vacuna puede adsorberse sobre el hidróxido de aluminio desde el que se libera lentamente después de la inyección. La vacuna también puede encapsularse dentro de los liposomas según Fullerton, patente de EE.UU.
4.235.877.

La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplos

Los siguientes protocolos A-G y los detalles experimentales se relacionan en los ejemplos no limitantes, ejemplos 1-16.

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Protocolo A

Cultivo de GE en células HL60

La línea USG3 de células HL60 infectadas con GE se obtuvo co-cultivando células HL60 (ATCC CCL 240) con células sanguíneas de perros enfrentadas a garrapatas Ixodes scapularis recogidas en el campo. Después de que fuese apreciable la degeneración de la morfología celular, las células infectadas se pasaron sobre células HL60 recientes no infectadas para mantener el cultivo. Se hizo crecer USG3 en RPMI 1640 que contenía suero de bovino fetal al 10-20% inactivado térmicamente, 1-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM y se repartió en células HL60 recientes dos o tres veces por semana. Este procedimiento también es bosquejado por Coughlin et al., solicitud PCT nº PCT/US96/10117 y también ha sido demostrado por Goodman et al., N. Eng. J. Med. 334:209-215 (1996).

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Protocolo B

Aislamiento de DNA

Se centrifugaron a 840 x g durante 15 min a 4ºC cultivos de USG3 con una lisis celular del 80% (monitorizada microscópicamente), para separar los desechos de células HL60 huésped. El sobrenadante se filtró a través de una membrana de policarbonato de 5 \mum Poretics (Livermore, CA), de 47 mm de diámetro, seguida por un filtro Poretics de 3 \mum a presión negativa. El filtrado de USG3 se centrifugó a 9460 x g en una centrífuga Sorvall durante 30 min a 4ºC. Tras la centrifugación, el pelet de GE se resuspendió en 5 mL de Tris 25 mM, pH 8,0, MgCl 10 mM, NaCl 0,9%. Se añadió DNasa I (Life Technologies, Gaithersburg, MD) hasta una concentración final de 9 \mug por mL y la disolución se incubó durante 15 min a 37ºC. Tras la incubación, la DNasa se inactivó mediante la adición de 0,5 mL de EDTA 0,5 M y la GE se peletizó a 14.000 x g en una centrífuga Sorvall durante 30 min a
4ºC.

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Protocolo C

Construcción de una biblioteca genómica de GE

Se aisló DNA genómico de GE purificada usando el kit de DNA genómico QIAamp (Qiagen, Chatsworth, CA) para la preparación de bibliotecas (Stratagene, La Jolla, CA). El DNA se cizalló mecánicamente para dar un intervalo de pesos moleculares de 4-10 kb y se ligó a conectores EcoRI. Los fragmentos conectados se ligaron al sitio EcoRI de Lambda Zap II y la biblioteca se amplificó en la cepa XL1-Blue MFR' de E. coli hasta un título de 10^{10} Pfu/mL.

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Protocolo D

Preparación de los sueros de exploración

Suero de perro: garrapatas adultas Ixodes scapularis recogidas en regiones del este de los Estados Unidos que tenían una alta incidencia de la enfermedad de Lyme de ser humano fueron aplicadas a perros como se ha descrito (Coughlin et al., J. Infect. Dis. 171:1049-1052 (1995)). Los sueros de los perros se ensayaron respecto a su inmunorreactividad a E. equi mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Los sueros positivos de perros infectados se juntaron y se usaron para la inmunoexploración de la biblioteca genómica de GE.

Suero de ratón: se separaron por SDS-PAGE las proteínas contenidas en GE completa disgregada con SDS y cuarenta y seis bandas individuales se cortaron de cada uno de los dos geles, acrilamida al 10% y al 15%. Cada fragmento de gel se amasó, se añadió a un tampón y compuesto auxiliar Ribi y se usó para inmunizar dos ratones. Los sueros con patrones similares de inmunorreactividad frente al antígeno GE, como se determinó por ensayo de manchas Western, se juntaron en 4 grupos: A, B, C y D.

Sueros de cabra: para inmunizar cabras se usaron mezclas de 100 \mug de antígeno USG3 purificado inactivado térmicamente. Las cabras recibieron tres dosis subcutáneas de antígeno a intervalos bisemanales. El suero se recogió dos semanas después de la tercera inmunización y se usó para inmunoexplorar la biblioteca genómica de GE.

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Protocolo E

Exploración de la biblioteca genómica de GE

Se diluyeron bacteriófagos y se extendieron con células XL1-Blue MRF' sobre platos de agar NZY. Se prepararon platos dando aproximadamente 50.000 placas por plato. A los fagos se les indujo a expresar la proteína clonada con IPTG 10 mM (Sigma, St. Louis, Missouri) y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Para la inmunoexploración, los filtros fueron bloqueados en TBS (Tris HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 0,5M) que contenía cetiléter polioxietilenado 20 (Brij 58) al 0,1% y se incubaron con sueros de perro juntados, sueros de ratón juntados o sueros de cabra juntados. Los filtros se lavaron y a continuación se hicieron reaccionar con anticuerpos anti-perro conjugados con HRP o anticuerpos anti-cabra conjugados con HRP. Los filtros se lavaron otra vez y se revelaron con 4-cloronaftol (Bio-Rad).

Las placas positivas se aislaron, se volvieron a extender en platos y se volvieron a explorar dos veces para conseguir pureza. Mediante un sistema de rescate de plásmidos (Stratagene, La Jolla, CA) se obtuvo DNA de plásmido que contenía los clones recombinantes putativos.

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Protocolo F

Análisis de DNA

Análisis con enzimas de restricción: se siguieron técnicas estándar según los protocolos de Sambrook et al., Molecular Cloning (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989)).

Secuenciación de DNA y análisis por secuenciación: la secuenciación del DNA de clones recombinantes se realizó usando el método del cebador caminante y un secuenciador de DNA ABI 373A (ACGT, Northbrook, IL; Lark Technologies, Houston, TX; y Sequegen, Shrewsbury, MA) Las secuencias se analizaron usando el programa de análisis de secuencias MacVector (Oxford Molecular Group) versión 6.0. Para buscar secuencias homólogas de ácidos nucleicos y proteínas se usó el algoritmo BLAST D, versión 1.4, disponible en el servidor del National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Amplificación por PCR de las secuencias diana: se diseñaron juegos de oligonucleótidos cebadores de DNA sobre la base de la información de la secuenciación de cada clon individual. Los cebadores para PCR fueron sintetizados por Life Technologies (Gaithersburg, MD). Las plantillas para PCR fueron DNA de plásmido purificado, DNA genómico purificado de células HL60 o de GE, o lisados de fagos. Todas las reacciones se realizaron usando un ciclador térmico Gene Amp 9600 (Perkin-Elmer, CT), reactivos GenAmp de Perkin-Elmer y anticuerpos TaqStart (clontech, CA). El programa de ciclado consistió en 30 ciclos, cada uno de 30 s a 94ºC, 30 s de 48ºC a 55ºC y 1 min a 72ºC, y un ciclo adicional de 10 min a 72ºC. Los productos de PCR se analizaron en geles de Nusive:agarosa 3:1 al 4% (FMC Bioproducts, Rockland, ME).

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Protocolo G

Aislamiento y análisis de proteínas

Cultivos de clones individuales que se habían mantenido toda la noche se diluyeron 1:25 en caldo TP (por litro: 20 g de bactotriptona, 2 g de Na_{2}HPO_{4}, 1 g de KH2PO4, 8 g de NaCl, 15 g de extracto de levadura) y se hicieron crecer a 37ºC hasta que se alcanzó una DO_{600} (densidad óptica) de 0,5 a 1. Se cosechó una parte alícuota de 1,5 mL. Se añadió IPTG hasta una concentración de 5 mM y se continuó el crecimiento durante 3 horas a 37ºC. Se leyó la DO_{600} y cada cultivo fue peletizado. Los pelets se resuspendieron en 5X tampón de Laemmli (glicerol 12%, Tris-HCl 0,2M, pH 6,8, SDS 5%, \beta-mercaptoetanol 5%) a razón de 200 \muL por unidad de DO. En una alternativa, las preparaciones de proteínas GE cosechadas se peletizaron y resuspendieron en SDS 0,4%, Tris 12,5 mM, pH 6,8, y se calentaron a 90-100ºC durante 20 min. Para la lisis de las células, se añadieron 50 \muL por 5 mg de GE de un cóctel que consistía en RNasa (33 \mug/mL) y aprotinina (0,2 mg/mL) y 9 \muL de DNasa (0,17 mg/mL). Se añadieron veinte \muL de cóctel inhibidor de las proteasas de Boehringer/Mannheim 25 X (nº de catálogo 1697498) por cada 0,5 mL de suspensión de células y se añadieron 2 \muL de una disolución PMSF (1M en DMSO) justo antes de la disgregación de las células. Las células se disgregaron en intervalos de 30 segundos durante un total de 3 min en un disgregador de células Mini-Beadbeater tipo BX-4 (BioSpec), agitado a temperatura ambiente durante 30 min y se centrifugaron a 15.000 x g durante 10 min. El pelet se suspendió en tampón de Laemmli y se ajustó a una concentración de 1,4 mg de SDS/mg de proteína. Se hirvieron las muestras y 10 \muL de cada una se sometieron a electroforesis en geles SDS-PAGE.

Para el análisis de manchas Western, los geles se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, los filtros se bloquearon en TBS/Brij 58 y las manchas se sondearon con antisueros. A continuación, las manchas se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Después de una etapa final de lavado, las manchas se revelaron con 4-cloronaftol (Bio-Rad, Hercules, CA) o se detectaron usando quimioluminiscencia potenciada (Pierce, Rockford, IL).

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Ejemplo 1

Amplificación por PCR y clonación de rDNA 16S de GE

Se cultivó GE en células HL60 como se describió en el protocolo A (véase anteriormente). Se prepararon extractos celulares mediante protocolos de lisis como se describió anteriormente. Los cebadores para PCR (específicos del DNA ribosómico 16S del genogrupo que comprende E. equi, E. phagocytophila, y el agente HGE usado para amplificar el DNA a partir de extractos celulares) se modificaron como sigue para que incluyeran sitios de reconocimiento de enzimas de restricción:

Cebador directo, 5'-CTGCAGGTTTGATCCTGG-3'(sitio PstI) (SEQ ID NO: 40);

Cebador inverso, 5'-GGATCCTACCTTGTTACGACTT-3' (sitio BamHI) (SEQ ID NO: 41).

Estos cebadores (0,5 \muM) se añadieron a una mezcla de reacción que contenía tampón II PCR 1X (Perkin-Elmer Corp), MgCl_{2} 1,5 mM (Perkin-Elmer Corp), dATP, dGTP, dCTP y dTTP, cada uno 200 \muM, 2,5 U de DNA polimerasa de Amplitaq y 20 \muL de DNA de USG3. La amplificación se realizó como se describió en el protocolo F. El fragmento de 1500 bp amplificado se digirió con PstI y BamHI y se ligó a pUC19 linealizado con las mismas enzimas. El clon resultante, pUCHGE16S, se secuenció.

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Ejemplo 2

Aislamiento de clones usando sueros caninos

Se realizó un análisis de manchas Western del plásmido recombinante individual como se describió en el protocolo G usando sueros caninos preparados como se describió en el protocolo D o se preparó una dilución 1:1000 de sueros de ser humano a partir de dos sueros de pacientes en fase convaleciente (nºs 2 y 3, Nueva York, amablemente proporcionados por el Dr. Aguero-Rosenfeld) y de un individuo de Wisconsisn que formó parte de un estudio de seroprevalencia (nº 1, amablemente proporcionado por el Dr. Bakken). Las manchas se lavaron y se incubaron con IgG anti-perro de cabra marcada con biotina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) seguido por estreptavidina marcada con peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) o IgG anti-humano conjugada con HRP (BioRad, Hercules, CA). Después de varios lavados adicionales, las manchas de sueros de perro se revelaron con 4-cloronaftol (Bio-Rad, Hercules, CA). Se identificaron por encima de 1000 clones positivos. Trescientos de estos clones (tanto de inmunorreactividad fuerte (S) como débil (W)) se purificaron adicionalmente mediante una exploración secundaria de la biblioteca. De este grupo, se purificaron 48 clones como placas individuales mediante una tercera inmunoexploración. Los plásmidos se rescataron según el protocolo de Stratagene y el DNA se purificó usando kits Qiagen de purificación de plásmidos. De los cuarenta y ocho clones originales, no se fue capaz de analizar siete debido a la falta de suficiente DNA. Se realizaron varias digestiones de restricción sobre cada clon para evaluar su grado de parentesco. Se realizaron digestiones simples con enzimas con EcoRI, HindIII, BamHI, HincII, XbaI, PstI y Alw26I y en algunos casos se hicieron varias digestiones dobles. Sobre la base de estas digestiones se generaron mapas de restricción y la mayoría de los clones pudieron colocarse en uno de tres grupos - grupos designados I, II y III. Las figuras 1-3 muestran las estructuras de los tres grupos basadas en el análisis con enzimas de restricción. Otros cinco clones habían perdido el inserto durante el rescate del plásmido y no fueron clasificados en ningún grupo.

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Ejemplo 3

Caracterización de clones S2, S7, S22 y S23 representativos

Se escogió un clon representativo de cada uno de los tres grupos (véase el ejemplo 2, anteriormente) para su posterior caracterización.

Estos clones, S2, S7 y S22 se secuenciaron según el protocolo F. También se secuenció S3 ya que no parecía que cayera en uno de estos grupos. La secuencia completa de ácido nucleico de cada uno de estos clones se muestra como sigue: figura 4, grupo I (S22); figura 6, grupo II (S2); figura 8, grupo III (S7); figura 10 (S23). El análisis de secuencias (MacVector, Oxford Molecular Group) mostró que cada clon contenía un único gran marco abierto de lectura codificado por la hebra positiva del inserto y parecía que cada uno era un gen completo. Las secuencias de aminoácidos codificadas por cada clon se muestran en la figura 5 (S22), figura 7 (S2), figura 9 (S7) y figura 11 (S23). También hay dos pequeños marcos abiertos de lectura adicionales en el inserto de DNA de S23, uno en la hebra negativa y el otro en la hebra positiva. Una comparación de las secuencias de DNA de los 4 clones reveló que S23 es un clon del grupo I que ha perdido un tramo de nucleótidos en S22 que contenía dos sitios EcoRI. A las secuencias de nucleótidos de los genes descritos en la presente memoria se les ha asignado los siguientes números de acceso en el GenBank: GE ank (GE 160), AF020521; GE rea (GE 130), AF020522; GE gra (GE 100), AF020523. Un análisis adicional de las secuencias de los cuatro genes mostró que todos ellos contenían regiones de aminoácidos repetidos.

La figura 12 representa un diagrama esquemático de las proteínas S22 y S23 y de las regiones repetidas dentro de esas proteínas. Similarmente, la figura 13 muestra las regiones repetidas de las proteínas S2 y S7 en un diagrama esquemático. El análisis de las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por los tres clones de los genes S22, S2 y S7, mostró que todas contenían regiones de aminoácidos repetidos. Una versión esquemática de estas estructuras repetidas se muestra en las figuras 14 y 15. La proteína S2 codificada (160 kDa) tiene tres grupos de repeticiones. La primera serie consiste en varias unidades repetidas de 33 aminoácidos, la segunda consiste en varias unidades repetidas de 27 aminoácidos y la tercera consiste en varias unidades repetidas de 11 aminoácidos. Las repeticiones de anquirina fueron reveladas mediante una búsqueda de homologías de proteínas en la base de datos BLAST. Las repeticiones de anquirina ocurren en al menos cuatro copias consecutivas y están presentes en levaduras, plantas, bacterias y mamíferos. La figura 14 muestra un alineamiento múltiple de las repeticiones de anquirina en la proteína codificada por S2 (160 kDa) debajo de una secuencia consenso derivada del análisis de varios cientos de restos similares semejantes a la anquirina. La secuencia de ocho repeticiones se ase a la de consenso sólo a través de la primera mitad de la unidad repetida y puede no representar una repetición completa semejante a la anquirina.

La proteína (130 kDa) codificada por S22 tiene una unidad repetida de 26 a 34 aminoácidos la cual ocurre ocho veces en la mitad carboxi terminal de la proteína (véase la figura 15). La secuencia varía algo de repetición a repetición. Una búsqueda de homologías en la base de datos con el algoritmo NCBI BLAST reveló que la proteína codificada por S22 tiene una homología limitada con la proteína de 120 kDa de E. chaffeensis. En la figura 15A se muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de un resto común a ambas proteínas. Este resto está representado por una línea en negrita y ocurre cuatro veces de una manera idéntica en la proteína de E. chaffeensis (designada A-1) y ocho veces con cuatro variaciones en la proteína de 130 kDa (a-1, a-2, a-3 y a-4).

La proteína (100 kDa) codificada por S7 tiene tres grandes unidades repetidas, las cuales difieren algo en la longitud (véase la figura 15). Una búsqueda en la base de datos reveló que es similar a la proteína de 120 kDa de E. chaffeensis, la cual contiene cuatro unidades repetidas de 80 aminoácidos cada una. Ambas proteínas contienen grandes cantidades de ácido glutámico: 18% en la proteína de 100 kDa y 17% en la proteína de 120 kDa. Cuando las dos secuencias de proteínas se alinean, la mayor parte de la homología ocurre en las regiones repetidas. La figura 15B muestra alineamientos de dos grupos homólogos de restos de aminoácidos de las dos proteínas (designados B/b y C/c) encontrados con el algoritmo BLAST. No son los únicos alineamientos posibles de las dos proteínas pero proporcionan un ejemplo de sus similitudes. Las localizaciones de las secuencias homólogas están indicadas por líneas en negrita o cruzadas encima (proteína de 100 kDa codificada por S7) o debajo (proteína de 120 kDa de E. chaffeensis) de las respectivas proteínas. La secuencia B representada por la línea en negrita varía ligeramente en la proteína de
E. chaffeensis (mostrada como B-1, B-2 y B-3) y ocurre un total de cinco veces. La equivalente b-1 a la proteína codificada por S7 es invariante y ocurre tres veces. La secuencia representada por las líneas cruzadas ocurre cuatro veces en la proteína de 120 kDa de E. chaffeensis (C-1) y dos veces en S7 (C-1).

Muestras de clones recombinantes fueron inducidas a expresar la proteína codificada y se prepararon extractos bacterianos para SDS-PAGE como se bosqueja en el protocolo G. La figura 16 muestra una mancha Western que contiene muestras de S2, S7, S22, y la figura 17 muestra una mancha Western que también contiene una muestra de S23. Como testigo positivo se usó GE completa disgregada con SDS y como testigo negativo se hizo correr un clon que no expresaba proteína. Mediante sueros de perros se detectaron proteínas inmunorreactivas para los 4 clones. Las mismas proteínas también se detectaron cuando las manchas se sondearon con sueros obtenidos de un paciente humano con GE, como es evidente en la figura 18. Las manchas se sondearon con antisueros de ser humano. Los pesos moleculares calculados, basados en las secuencias de aminoácidos de estas proteínas, son significativamente menores que los pesos moleculares aparentes por SDS-PAGE. En la tabla 4 se comparan los pesos moleculares calculados (basados en la secuencia de aminoácidos) y aparentes (basados en la movilidad en SDS-PAGE) de cada proteína codificada por los marcos abiertos de lectura de los clones listados. Este fenómeno ha sido observado en otras proteínas (véase Barbet et al., Infect. Immun. 59:971-976 (1991); Hollingshead et al., J. Biol. Chem. 261:1677-1686 (1986); Yu et al., Gene 184:149-154 (1997)).

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TABLA 4

4

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Ejemplo 4

Verificación por análisis PCR de que los clones S2, S7, S22 y S23 son derivados de GE

Se diseñaron series de cebadores para PCR sobre la base de las secuencias de cada uno de los tres clones de GE y son como se describe en la tabla 5. Las secuencias de cada serie de cebadores, indicadas en la tabla 5, se usaron para amplificar regiones de los clones listados (SEQ ID NOS: 47-52). Cada secuencia oligonucleótida se muestra en la orientación 5' a 3'. Cada reacción de 50 \muL contenía 0,5 \muM de cada cebador, 1X Supermix PCR (Life Technologies, Gaithersburg, MD), y 100 ng de DNA de USG3, 100 ng de DNA de HL60 ó 200 ng de DNA de plásmido. La amplificación por PCR se realizó como se describe en el protocolo F.

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TABLA 5

5

Estos experimentos establecieron que los genes secuenciados fueron derivados de DNA de GE y no de DNA de HL60, y permitió la eliminación de clones duplicados antes del rescate del plásmido y del aislamiento del DNA usándolos en PCR de lisados de fagos. Se usaron pares de cebadores específicos de S22/S23, S2 y S7 en reacciones PCR separadas para amplificar tres plantillas diferentes: DNA de GE, DNA de HL60, o DNA de plásmido purificado de cada clon.

Las figuras 19 y 20 muestran los resultados obtenidos para los cebadores de S22, S23, S2 y S7 usando las condiciones de PCR perfiladas anteriormente. Los tres clones fueron específicos de GE y no estaban presentes en DNA de HL60. En cada caso, el tamaño del producto de PCR usando DNA genómico como plantilla fue el mismo que el generado por DNA de plásmido purificado.

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Ejemplo 5

Caracterización adicional de clones de GE aislados

Los mismos pares de bases (véase anteriormente) también se usaron para confirmar o establecer la identidad de cada cepa de fago purificada de todos los 48 clones derivados de la exploración de la biblioteca con los sueros de perro. Cada aislado, con una excepción (W20), fue un clon del grupo I, II o III, como es evidente en la tabla 6 de más adelante. Los clones se aislaron por inmunoexploración con sueros de perros convalecientes. Cada clon se clasifica como un clon del grupo I, II o III sobre la base de PCR con cebadores específicos para secuencias de DNA de los grupos I, II o III. El clon W20 fue el único clon diferente de los otros 3 grupos.

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TABLA 6

6

7

Ejemplo 6

Aislamiento de clones usando sueros murinos

Para explorar la biblioteca de DNA genómico de GE se usaron cuatro conjuntos de sueros (designados A, B, C y D) obtenidos de ratones inmunizados con muestras de proteína G separadas en bandas en un gel (protocolo D). Se purificaron en placa veintiséis clones y se usaron para un análisis posterior. Éstos se designaron A1, A2, A8, A11, A14, A16; B1, B3, B6, B8, B9, B12; C1, C3, C5, C6, C7, C10, C11; D1, D2, D7, D8, D9, D11 Y D14. Se rescató DNA de plásmido de cada clon y se realizaron análisis de restricción. Varios clones (A14, B12, C3, C5, D1, D2, D9 y D11) no tuvieron ningún inserto. De los clones restantes, nueve pudieron colocarse en uno de los dos grupos debido a similitudes en sus patrones de enzimas de restricción. El primer grupo incluía todos los clones C y el segundo consistía en todos los clones D más B3. Algunos de los otros clones no fueron agrupados en esta etapa debido a la falta de suficiente DNA.

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Ejemplo 7

Caracterización del clon representativo C6

Se seleccionó un clon (C6) representativo del grupo C para secuenciar el DNA. El inserto de 2,7 kb contenía dos marcos abiertos de lectura (designados C6.1, C6.2, y cuyas secuencias de aminoácidos se dan en las figuras 21 y 22, respectivamente) sobre la hebra positiva, los cuales estaban separados por 9 nucleótidos (figura 23). Una búsqueda de las bases de datos de proteínas/nucleótidos reveló que la primera secuencia de aminoácidos (C6.1) tiene una homología significativa con dihidrolipoamida succiniltransferasa, una enzima implicada en la descarboxilación oxidativa de piruvato 2-oxoglutarato (Spencer et al., Eur. J. Biochem. 141:361-374 (1984)). La segunda secuencia de aminoácidos (C6.2) es homóloga a una metionina aminopeptidasa encontrada en varios tipos de especies bacterianas.

Los clones C1, C6 Y C7 fueron inducidos a que expresaran la proteína codificada y se prepararon extractos bacterianos para SDS-PAGE. La figura 24 muestra una mancha Western de estas muestras sometidas a electroforesis a continuación de GE completa disgregada con SDS. Para sondear la mancha se usó el suero de ratón inmune designado "C". Los tres clones recombinantes expresaron una proteína del mismo peso molecular, aproximadamente 50 kDa. Los pesos moleculares calculados de C6.1, C6.2 son de 44 kDa y 29 kDa, respectivamente. Así, sobre la base del tamaño, C6.1 es más probablemente que sea la proteína recombinante expresada detectada por inmunoexploración.

La secuenciación del DNA también reveló que el grupo de clones que consistía en todos los clones D y el clon B3 contenían un marco abierto de lectura para una proteína con homología con la proteína hsp70 de choque térmico.

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Sobre la base de las secuencias de DNA de cada clon se diseñaron cebadores para PCR para amplificar regiones específicas de cada marco abierto de lectura contenido en C6. Los cebadores usados fueron como sigue:

Cebador directo para C6.1: 5'-CAGGCAGTGAGCACTCAAAAACC-3'(SEQ ID NO:48);

Cebador inverso para C6.1: 5'-GCGACTCCAATGTTACAATAGTCCC-3'(SEQ ID NO:49);

Cebador directo para C6.2: 5'-TGTGATCCTCGATGGTTGGC-3'(SEQ ID NO:50);

Cebador inverso para C6.2: 5'-CCCTCCTGAATCGTAACATCATCC-3'(SEQ ID NO:51).

La figura 25 muestra los resultados obtenidos con cada par de cebadores usando como plantillas en una reacción PCR DNA de GE, DNA de HL60 o el DNA de plásmido de C6. Ambas series de cebadores amplificaron una región del tamaño esperado usando plantillas de GE o de plásmido pero no la plantilla de HL60. Así, ambos genes C6 son específicos de GE.

Los cebadores C6 también se usaron para amplificar lisados de fagos de cada uno de los otros veinticinco clones aislados usando sueros de ratones inmunes. Además de todos los clones C, también fueron encontrados los genes C6.1 y C6.2 en A1, A11, A14 y A16.

Los siguientes ejemplos (ejemplos 8-15) están todos relacionados con la caracterización de la proteína inmunorreactiva de GE en el intervalo de masas moleculares de 42-45 kDa.

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Ejemplo 8

SDS-PAGE y secuenciación de péptidos de proteínas inmunorreactivas

Para caracterizar las proteínas de GE en el intervalo de 42 a 45 kDa, se añadieron 50 \muL de un cóctel que consistía en RNasa (33 \mug/mL) y aprotinina (0,2 mg/mL) y 9 \muL de DNasa (0,17 mg/mL) por cada 5 mg de pelet de USG3 en MgCl_{2} 2 mM, Tris-HCl 50 mM, tampón pH 7,5. Se añadieron veinte \muL de cóctel inhibidor de proteasas 25 X de Boehringer/Mannheim por cada 0,5 mL de suspensión de células y se añadieron 2 \muL de una disolución PMSF (1M en DMSO) justo antes de la disgregación de USG3. Las células se disgregaron en intervalos de 30 segundos durante un total de 3 min, en un disgregador de células Mini-Beadbeater tipo BX-4 (BioSpec), agitado a temperatura ambiente durante 30 min y se centrifugaron a 15.000 x g durante 10 min. El pelet se suspendió en tampón para muestras Laemmli y se ajustó a una concentración de 1,4 mg de SDS por mg de proteína, y se calentó a 90-100ºC durante 5 min. La concentración de proteínas se determinó por ensayo BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). La electroforesis se realizó en un gel de SDS-PAGE al 15% y las proteínas se transfirieron sobre una membrana de PVDF de 0,2 \mum. La mitad de la mancha se sondeó con sueros (6) de perro anti-GE y la otra mitad se tiñó con colorante Ponceau S. Se cortaron dos bandas de proteínas que igualaron la masa molecular de las dos bandas más inmunorreactivas en la mancha Western (43 y 45 kDa). Una porción de cada banda se usó para la secuenciación directa por el extremo N-terminal. El material restante se digirió in situ con tripsina y los péptidos individuales se separaron por RP-HPLC en una columna ZORBAX C18 (1 mm x 150 mm). Los péptidos se analizaron y se exploraron por espectrometría de masas MALDI-TOF. La secuenciación de los péptidos se realizó por degradación Edman (Harvard Microchemistry, Cambridge, MA). Se obtuvieron para cada proteína un péptido N-terminal y dos péptidos internos (tabla 7).

TABLA 7 Secuencias de péptidos de proteínas de GE transferidas a papel de nitrocelulosa

8

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Los resultados muestran que los péptidos amino-terminales de las dos proteínas son idénticos. Una búsqueda de homologías en la base de datos BLAST mostró que dos de los péptidos internos de la proteína de 43 kDa fueron homólogos a las proteínas MSP-2 de Anaplasma marginale, un hemoparásito rickettsial del ganado (Palmer et al., Infect. Immun. 62:3808-3816 (1994)) que está filogenéticamente estrechamente relacionado con GE (Dumler et al., J. Clin. Microbiol. 33:1098-1103) (1995).

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Ejemplo 9

Amplificación por PCR de DNA genómico de USG3

Para obtener información adicional de las secuencias de estas proteínas, se sintetizaron conjuntos degenerados de oligonucleótidos sobre la base de la traducción inversa de las secuencias de péptidos y se usaron para amplificar DNA de USG3. También se sintetizó el complemento inverso de cada oligonucleótido con la excepción de uno que correspondía al péptido amino-terminal. Se realizaron amplificaciones por PCR usando una serie de cebadores directos y una de inversos usando DNA genómico de USG3 como plantilla y una temperatura de apareamiento de 55ºC. Los pares de cebadores no dieron ningún producto PCR o dieron una única banda. El par de cebadores que dio lugar a la generación del producto más largo, 550 bp, consistía en el cebador directo 5'-ACNGGNGGNGCWGGNTAYTTY-3' (péptido amino-terminal HDDVSALETGGAGYF) y el cebador inverso 5'-CCNCCRTCNGTRTARTCNGC-3' (péptido SGDNGSLADYTDGGASQTNK). Este DNA se secuenció y se encontró que contenía un marco abierto de lectura con homología con la proteína MSP-2 de A. marginale (figura 26). También estaban contenidos dentro de esta secuencia otros dos péptidos, uno de la proteína de 45 kDa y otro de la proteína de 43 kDa. La similitud en la secuencia de las proteínas entre las dos proteínas inmunorreactivas de 43 y 45 kDa puede indicar que son versiones procesadas o diferencialmente modificadas de la misma proteína o pueden representar proteínas expresadas por dos miembros diferentes de una familia de genes.

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Ejemplo 10

Aislamiento de clones usando sueros de cabra

Se obtuvo un suero de cabra contra proteínas del agente HGE inmunizando animales 3 veces con antígeno USG3 purificado. El análisis de manchas Western mostró que muchas proteínas de varias masas moleculares fueron reconocidas por este suero incluyendo las proteínas de 43 y 45 kDa (figura 27, calles GE). Se exploró la biblioteca de expresión genómica de USG3 (preparada como se describió en el protocolo C) con suero de cabra inmune y se identificaron varias placas inmunorreactivas para un análisis adicional. Para eliminar clones previamente aislados usando sueros de perros inmunes se exploraron sobrenadantes de fagos de las placas por PCR usando cebadores basados en las secuencias de los clones previamente identificados. Los bacteriófagos fueron extendidos en platos con XL1-Blue MRF' y fueron inducidos con IPTG 10 mM (Sigma St. Louis, MO) para que expresaran proteínas. Las proteínas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa y los filtros se lavaron con TBS (Tris HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 0,5M). Los filtros lavados se bloquearon en TBS que contenía cetil éter polioxietileno 20 (Brij 58) al 0,1% y se incubaron con una dilución 1:1000 de suero de cabra con un título reducido (dilución 1:2000) de anticuerpos Ig de conejo anti-cabra conjugados con HRP, se volvieron a lavar y se revelaron con 4-cloronaftol. Las placas positivas se aislaron, se volvieron a extender en platos y se exploraron otra vez. El DNA de plásmido que contenía los clones recombinantes putativos se obtuvo por rescate de plásmidos (Stratagene, La Jolla, CA). Se rescataron plásmidos de la biblioteca pBluescript de los clones restantes y se evaluaron respecto a su grado de parentesco mediante análisis con enzimas de restricción. Dos clones, E8 y E33, parecían contener el mismo inserto en orientación opuesta desde el promotor lacZ. Otros dos clones, E46 y E80, compartían en común fragmentos de enzimas de restricción pero E46 contenía un inserto más grande que E80.

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Ejemplo 11

Secuenciación de DNA y análisis de secuencias

Se secuenciaron tres clones, E8, E33 y E46 mediante el método del cebador caminante. Ambas hebras de cada inserto se secuenciaron como se describió en el protocolo F. Las secuencias de los tres clones compartían una considerable homología. El clon E8 contenía una versión mayor del inserto E33 pero en orientación opuesta con respecto al promotor lacZ (figura 28). Ambos clones contenían el mismo marco abierto de lectura pero E33 había perdido 420 nucleótidos desde el extremo 5' del gen. La secuencia de aminoácidos deducida del marco abierto de lectura de E33 estaba encuadrada con la secuencia de aminoácidos parcial de la \beta-galactosidasa codificada por el vector (datos no mostrados). En la figura 29 se muestran las secuencias de nucleótidos y las deducidas de aminoácidos del inserto E8 (que no contenía el gen entero) de la biblioteca pBluescript. La masa molecular predicha de la proteína codificada por este gen fue 45,9 kDa. Las secuencias de nucleótidos y las deducidas de aminoácidos del clon E46 se muestran en la figura 30. El inserto E46 contenía un marco abierto de lectura parcial y dos completos todos los cuales compartían una considerable homología con la proteína codificada por el gen E8. La figura 28 muestra cómo las secuencias de DNA (hebras + y -) y las secuencias deducidas de aminoácidos de E46 se comparan con las de E8 y E33. Las regiones de los recuadros representan los marcos abiertos de lectura y las áreas sombreadas indican secuencias homólogas. Como se muestra en la figura 31, los tres genes completos mostraron un patrón similar para las proteínas codificadas: un dominio variable flanqueado por regiones conservadas que tiene una secuencia amino-terminal de consenso como se pone de manifiesto en SEQ ID NOS: 41-43, y/o uno carboxi terminal que tiene una secuencia consenso como se pone de manifiesto en SEQ ID NOS: 41-43 (véase la figura 31). La longitud de las regiones conservadas varía entre las proteínas codificadas, estando presentes en la proteína E8 las regiones conservadas amino y carboxi terminal más largas. Mediante análisis por PCR usando los cebadores descritos en la presente memoria se confirmó que las secuencias presentes en los plásmidos E8, E33 y E48 de la biblioteca pBluescript derivaban de DNA genómico de USG3 y no de DNA de HL60. Cuando las secuencias de los tres genes de longitud completa aisladas por clonación de la biblioteca de expresión se compararon con la secuencia del producto de PCR derivado del análisis de péptidos, se encontró que el fragmento de PCR estaba contenido dentro de la secuencia de E8, bp 232 a 760 (figura 29). De hecho, el péptido amino-terminal y todos los cuatro péptidos internos secuenciados a partir de las proteínas de 43 kDa y 45 kDa podrían encontrarse dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína E8. Los péptidos secuenciados se subrayan en la figura 20. Se encontró que el péptido amino-terminal (HDDVSALE...) comienza en el aminoácido 27 y esto puede indicar que los primeros 26 aminoácidos son parte de un péptido señal el cual se escinde para producir la proteína madura. Puesto que el producto de PCR tenía homología tanto de nucleótidos como de aminoácidos con la familia de genes msp2 de A. marginale, se realizó una búsqueda de homologías en la biblioteca BLAST para evaluar también el grado de parentesco de los productos de los genes E8 y E46 con esta familia. Se observaron fuertes equivalencias para todas las proteínas de GE descritas en la presente memoria con las proteínas MSP-2 de A. marginale. En la figura 31 se muestra un alineamiento con ClustalW de las proteínas de GE (designadas GE MSP-2A (E8), MSP-2B (E46#1) y MSP-2C (E46#2)) con una de las proteínas MSP-2 de A. marginale (número de acceso al GenBank U07862). La homología de las proteínas MSP2 de GE con MSP-2 de A. marginale ocurrió principalmente en las regiones conservadas mostradas en la figura 28. La identidad de aminoácidos varió de 40 a 50% entre las proteínas de las dos especies y la similitud de aminoácidos fue próxima a 60%. Las proteínas MSP2 de A. marginale contienen péptidos señal (datos no mostrados) y los datos que indican que GE MSP-2A tiene un péptido señal son consistentes con la homología observada entre proteínas MSP2 de las dos especies. A las secuencias de nucleótidos de los genes descritos en la presente memoria se les ha asignado los siguientes números de acceso al GenBank: GE msp2A (E8):AF029322; GE msp2B (E46#1) y GE msp2C (E46#2):AF029323.

Los tres clones E8, E33 y E46 parecían así ser parte de una familia de multigenes que codifican proteínas que contienen regiones amino- y carboxi-terminales muy homólogas relacionadas con las proteínas MSP-2 de A. marginale. Además de los tres genes de longitud completa y de uno truncado semejantes a msp-2 presentados en la presente memoria, probablemente hay otros presentes en el genoma de GE. Estudios de hibridación (véase más adelante) usando sondas del extremo 5' ó 3' del gen E8 msp2 identificaron múltiples copias de genes homólogos a msp2 en el genoma de USG3.

La secuenciación de varios otros clones de la biblioteca de GE ha revelado tramos cortos (100 a 300 nucleótidos) de DNA homólogos a msp2. Se ha informado de varias proteínas MSP-2 diferentes de A. marginale que varían en tamaño de 33 a 41 kDa y > 1% de su genoma puede consistir en msp2. La función de las proteínas MSP-2 de GE es desconocida. Zhi et al., véase anteriormente, demostraron que los antígenos están presentes en fracciones de la membrana externa de ehrlichiae granulocítica purificada. Así, pueden jugar un papel en la interacción entre el patógeno y la célula huésped. En A. marginale, la expresión de variantes de MSP-2 antigénicamente únicas por organismos individuales durante la rickettsemia aguda en ganado sugiere que las copias múltiples del gen msp-2 pueden proporcionar un mecanismo para la evasión de la respuesta inmune beneficiosa dirigida contra estos antígenos. Esto puede explicar la observación de que la proteína MSP-2A de GE está presente en USG3 purificada pero que las proteínas MSP-2B y MSP-2C no.

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Ejemplo 12

Análisis de manchas Southern

Para determinar si estaban presentes en el genoma copias adicionales de msp-2, se aisló DNA genómico de USG3 y se digirió con enzimas de restricción. Se prepararon sondas marcadas con digoxigenina por PCR usando el kit PCR Dig Probe Synthesis (Boehringer Mannheim). Para generar un producto de 240 bp (sonda A) se usaron dos series de cebadores desde el extremo 5' del gen E8:

(cebador directo: 5'-CATGCTTGTAGCTATG-3' (SEQ ID NO:52;

cebador inverso: 5'-GCAAACTGAACAATATC-3' (SEQ ID NO:53)) y un producto de 238 bp (SONDA b) desde el extremo 3' del gen E8;

(cebador directo: 5'-GACCTAGTACAGGAGC-3' (SEQ ID NO:54);

cebador INVERSO: 5'-CTATAAGCAAGCTTAG-3' (SEQ ID NO:55) incluyendo la secuencia consenso correspondiente a las regiones amino- y/o carboxi-terminales compartidas por E8, E46#1 y el polipéptido E46#2). Se preparó DNA genómico a partir de células USG3 o HL60 como se describió anteriormente y se digirieron partes alícuotas de 1 \mug de DNA con SphI, NdeI, SacI o SspI (New England Biolabs, Beverly, MA). Estas endonucleasas de restricción no cortan dentro de la secuencia de msp2A de E8. Como testigo se digirió idénticamente DNA de timo de ternero. Se digirió con EcoRI DNA de plásmido recombinante de E8 de la biblioteca Bluescript y se usó como testigo positivo para la hibridación con sondas. Los fragmentos digeridos se separaron por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1%. Se realizó un análisis de manchas Southern en condiciones de prehibridación y de hibridación de 65ºC en Dig Easy Hyb (Boehringer/Mannheim) y la hibridación se realizó durante toda la noche. Se realizaron dos lavados de las membranas en 2X SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 5 min cada uno seguido por dos lavados en 0,SX SSC/SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 min cada uno. La sonda enlazada se detectó por quimioluminiscencia usando anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con alcalina fosfatasa (Boehringer/Mannheim). La figura 32 muestra que, usando ambas sondas, estaban presentes múltiples bandas sobre las manchas Southern, lo que indica la presencia de múltiples copias de msp-2. El número exacto de genes no puede determinarse ya que las diferencias en las secuencias pueden generar sitios adicionales para enzimas de restricción en algunas de las copias de msp-2, dando lugar a más que una banda a partir de una única copia. También, en un fragmento único de restricción podía estar presente más que un gen msp-2, un caso que no ocurre con los genes msp-2B y
msp-2C.

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Ejemplo 13

Análisis de manchas Western de proteínas codificadas por clones de GE

Se analizaron por SDS-PAGE y manchas Western lisados bacterianos de clones E8, E33 y E46 de la biblioteca genómica. Cultivos que contenían plásmidos recombinantes individuales fueron inducidos con IPTG 5 mM a que expresaran proteínas. Las células bacterianas se peletizaron por centrifugación y se resuspendieron en 5X tampón de Laemmli (glicerol al 12%, Tris-HCl 0,2M, pH 6,8, SDS al 5%, \beta-mercaptoetanol al 5%) a razón de 200 \muL por unidad de DO de cultivo. Se hirvieron muestras y 10 \muL de cada una se analizaron en geles NuPage (Novex, San Diego, CA). Las proteínas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, los filtros se bloquearon en TBS/Brij 58 y las manchas se sondearon con una dilución 1:500 de sueros juntados de perros que estaban infectados con GE por exposición a garrapatas, una dilución 1:500 del suero de cabra descrito anteriormente, o una dilución 1:1000 de suero de ser humano. También se usaron sueros de perros y cabras preinmunes en una dilución 1:500. Las manchas se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP (Bio-Rad, Hercules, CA). Después de varios lavados adicionales, las manchas se revelaron usando el kit de quimioluminiscencia Super Signal Chemiluminescence de Pierce (Rockford, IL). La figura 27 muestra que mediante los sueros de perro y de cabra se detectaron específicamente una proteína de aproximadamente 37 kDa del clon E46 y una proteína de 45 kDa del clon E48 (indicadas por flechas en el lado derecho de cada mancha). La reactividad de los sueros difirió algo en que los sueros de perros reaccionaron mucho mejor con la proteína E46 que los sueros de cabra y los sueros de cabra tuvieron mejor reactividad con la proteína E8. Se desconoce si la proteína E46 de 37 kDa está codificada por el primero o por el segundo gen E46 y tampoco está clara la razón para la expresión de dos proteínas E33 inmunorreactivas de tamaño estrechamente parecido. Los sueros preinmunes no detectaron estas proteínas y se observó expresión en ausencia de inducción con IPTG. La masa molecular de las proteínas es consistente con la capacidad codificante de los genes msp-2 encontrados en los clones de la biblioteca. El testigo negativo (calle NEG) fue un clon de la biblioteca pBluescript sin un inserto. La figura 27 también muestra un par de proteínas de E46 y E8 de masa molecular más pequeña que reaccionan específicamente con el suero de cabra. No se sabe si son productos de ruptura de las proteínas MSP-2 de longitud completa o si son producidas por iniciación interna dentro de genes msp-2.

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Ejemplo 14

Amplificación por PCR de clones aislados

Se diseñaron cebadores de PCR basados en las secuencias de cada clon de GE y son como sigue:

E8 (directo 5'-GCGTCACAGACGAATAAGACGG-3' (SEQ ID NO:56); Inverso 5'-AGCGGAGATTACAGGA
GAGAGCTG-3' (SEQ ID NO:57);

E46.1 (directo 5'-TGTTGAATACGGGGAAAGGGAC-3' (SEQ ID NO:58); Inverso 5'-AGCGGAGATTTCAG
GAGAGAGCTG-3' (SEQ ID NO:59);

E46.2 (directo 5'-TGGTTTGGATTACAGTCCAGCG-3' (SEQ ID NO:60); Inverso 5'-ACCTGCCCAGTTTCAC
TTACATTC-3' (SEQ ID NO:61)).

Cada reacción de 50 \muL contenía 0,5 \muM de cada cebador, 1X Supermix PCR (Life Technologies, Gaithersburg, MD), y 100 ng de DNA de USG3, 100 ng de DNA de HL60 ó 200 ng de DNA de plásmido. La amplificación por PCR se realizó usando las siguientes condiciones: 94ºC durante 30 s, 61ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min. Después de 30 ciclos se hizo una única extensión de 10 min a 72ºC. Los productos de PCR se analizaron en geles de Nusieve:agarosa 3:1 al 4% (FMC Bioproducts, Rockland, ME).

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Ejemplo 15

Reconocimiento de MSP-2A y MSP-2B mediante sueros de ser humano GE-positivos

Se realizó la amplificación por PCR del primer gen en el clon E46 de la biblioteca pBluescript para generar un inserto para subclonar en E. coli. Se diseñaron series de cebadores para que contuvieran sitios de restricción para la clonación, un codón de terminación de la traducción y una secuencia de seis residuos de histidina para la purificación de las proteínas expresadas (directo 5'-CCGGCATATGCTTGTAGCTATGGAAGGC-3' (SEQ ID NO:62); inverso 5'-CCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAAGCAAACCTAACACCAAATTCCCC-3' (SEQ ID NO:63)).

Los 100 \muL de reacción contenían 500 ng de cada cebador, 500 ng de plantilla E46 y 1X PCR Supermix (Life Technologies, Gaithersburg, MD). La amplificación se realizó usando las siguientes condiciones: 94ºC durante 30 s, 58ºC durante 30 s, 72ºC durante 1 min. Después de 37 ciclos se realizó una única extensión durante 10 min a 72ºC. Tras el análisis en un gel de agarosa TBE al 1%, el producto se purificó usando un kit de extracción en gel QIAEX II (QIAGEN Inc, Chatsworth, CA) y se digirió con enzimas de restricción NdeI y XhoI (New England Biolabs, Beverly, MA) usando las condiciones recomendadas por el fabricante. El fragmento de 1004 bp fue ligado a pXA digerido con NdeI y XhoI y transformado en la cepa MZ-1(19) de E. coli. El vector de expresión pXA es un vector basado en pBR322 que contiene el promotor pL del bacteriófago lambda, un sitio de enlace a los ribosomas, el codón de iniciación ATG y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Se indujo MSP-2B recombinante haciendo crecer el clon transformado en MZ-1 hasta una A_{550} = 1,0 a 30ºC y a continuación desplazando la temperatura a 38ºC durante 2 h adicionales. Se peletizaron por centrifugación partes alícuotas (1,5 mL) de células pre-inducidas e inducidas y se resuspendieron en tampón de Laemmli SX.

Las regiones codificantes de MSP-2A y MSP-2B se volvieron a clonar usando un sistema de expresión de E. coli térmicamente inducible como se perfiló anteriormente. La expresión de la proteína MSP2A usando este sistema permaneció baja. Sin embargo, la proteína recombinante MSP-2B fue expresada y pudo detectarse tanto con sueros de perro como de cabra GE-positivos (figura 32). La proteína recombinante MSP-2B y la proteína MSP-2A de E33 se ensayaron a continuación respecto a la reactividad con muestras de sueros de ser humano que previamente habían mostrado ser positivos respecto a Ehrlichia granulocítica mediante ensayo de inmunofluorescencia (IFA). La tabla 8 muestra los perfiles de los pacientes y los resultados de diagnóstico de laboratorio de catorce individuos. A diez de estos individuos se les diagnosticó clínicamente con HGE (nºs 1-9, 13), tres de ellos participaron en un estudio de seroprevalencia (nºs 10-12), y uno fue un testigo positivo (nº 14). Como testigos positivos y negativos en las manchas Western también se usaron sueros de perros y cabras inmunes y preinmunes. La figura 33 muestra la reactividad de cada muestra de suero de ser humano con MSP-2A (parte superior) y MSP-2B (parte inferior). Todas las muestras de ser humano con títulos IFA de 512 ó más (nºs 7, 9, 10, 11, 13) se hicieron reaccionar con las proteínas MSP-2 al igual que los sueros de perros y cabras. El suero nº 8 de ser humano también reaccionó débilmente con ambas proteínas. Además, todos estos mismos sueros reaccionaron con GE purificada en manchas Western (datos no mostrados). El suero nº 12 de ser humano reaccionó con una proteína de E. coli que migra entre las dos proteínas MSP-2 de E33. Esta reactividad se vio con todos los clones de la biblioteca que se ensayaron, incluyendo los que no expresan ninguna proteína relacionada con GE (datos no mostrados). A partir de estos datos parece que para el diagnóstico de HGE el ensayo IFA es más sensible que el de la mancha Western.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8 Perfiles de pacientes con HGE y resultados de los ensayos de diagnóstico de laboratorio

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Ejemplo 16

Caracterización del clon representativo S11

Se obtuvieron preparaciones de proteínas de GE purificadas como se describió en el protocolo G. Se hicieron correr partes alícuotas por cuatro calles para permitir la tinción de tres calles con colorante Ponceau S (0,1% en ácido acético 1 N) y una calle con tinción de azul de Coomassie. También se hicieron correr por dos calles marcadores de pesos moleculares. La electroforesis se realizó en un gel preparativo SDS-PAGE al 10% y las proteínas se transfirieron sobre una membrana de PVDF de 0,2 \mum. Las bandas de Ponceau S con los mismos pesos moleculares que las bandas teñidas con azul de Coomassie (un total de cinco) se separaron por corte para secuenciarlas. Se obtuvo la secuencia N-terminal para una de las cinco bandas. Las proteínas en las otras cuatro bandas se digirieron in situ con tripsina para la secuenciación de péptidos internos. Los péptidos se separaron por RP-HPLC en una columna ZORBAX C18 (1mm x 150 mm). Los candidatos potenciales para la secuenciación se exploraron respecto al peso molecular por espectrometría MALDI-TOF en un equipo Finnigan Lasermet 2000 (Hemel, UK). La secuenciación de las proteínas se realizó por degradación de Edman.

Cuatro de las cinco bandas del gel contenían proteínas de suero (probablemente del suero de bovino fetal usado para cultivar las células) o proteínas de choque térmico. La otra banda parecía contener una única proteína. Se obtuvieron cuatro secuencias de péptidos internos de esta banda del gel, que representaban una proteína de aproximadamente 64 kDa, que no equivalían a ninguna secuencia de proteína en la base de datos. Las secuencias de estos péptidos se muestran en la figura 34 (SEQ ID NOS:34-37). Sobre la base de estas secuencias se diseñaron oligonucleótidos degenerados de DNA para cada péptido (tanto con orientación directa/complemento como inversa/complemento) y se usaron en todas las combinaciones posibles para PCR usando DNA de GE como plantilla. Una combinación, cebadores 5F (SEQ ID NO:32) y 6R (SEQ ID NO:33) (mostrada en la figura 34) produjo un fragmento PCR de 450 pares de bases. El DNA se clonó en pCR Script SK(+) y el inserto se secuenció. Cuando el DNA del inserto se tradujo, se encontraron ambos péptidos (nºs 24 y 25) (SEQ ID NOS:34-35) en la secuencia, uno en cada extremo, como se esperaba.

Para obtener un clon que contenía el gen entero representado por el fragmento de PCR, se diseñaron dos cebadores basados en la secuencia de DNA del fragmento de PCR. Estos cebadores se usaron en reacciones PCR para explorar sub-bibliotecas de la biblioteca genómica de GE.

Cebador directo (250F2): 5'-CCCCGGGCTTTACAGT-3' (SEQ ID NO:64)

Cebador INVERSO (250R2): 5'-CCAGCAAGCGATAACC-3' (SEQ ID NO:65).

Las sub-bibliotecas se generaron mediante la exploración inicial de la biblioteca genómica con sueros de perros convalecientes.

Cuando se encontró una cepa de fago positiva mediante exploración por PCR, el lisado se diluyó dos veces en serie y se volvió a extender en platos con la cepa bacteriana XL1-Blue MRF' para obtener placas aisladas. Se recogieron cuarenta y ocho de estas placas y los lisados se exploraron por PCR con cebadores 250F2 y 250R2. Se obtuvo un clon positivo que se designó S11. El DNA del plásmido se rescató y se realizó un análisis con enzimas de restricción para determinar el tamaño del DNA del inserto y la localización aproximada del gen dentro del inserto. Los resultados indicaron que el tamaño del inserto fue de aproximadamente 8 kb y que el gen de interés estaba localizado en el extremo T7 del inserto relativo al vector pBluescript (figura 35). Se secuenció una porción de 2 kb del inserto S11 y se encontró que contenía un marco abierto de lectura de 545 aminoácidos. La secuencia completa se muestra en la figura 36 (SEQ ID NO:39).

Cuando la secuencia de aminoácidos de S11 (SEQ ID NO:39) se comparó con las secuencias de los péptidos obtenidos de la banda cortada del gel que representaba un proteína de 64 kDA, se encontraron las cuatro secuencias de péptidos. Éstas se muestran subrayadas en la figura 36. La única diferencia entre la secuencia de ácido nucleico y las secuencias de péptidos fue la presencia de fenilalanina (F) en lugar de ácido aspártico (D) en la posición 4 del péptido nº 26 (SEQ ID NO:37). La razón de esta diferencia es desconocida. El peso molecular calculado de la proteína codificada por el gen S11 fue 58,5 kDa. Una búsqueda en las bases de datos de ácidos nucleicos y de proteínas no reveló ninguna homología significativa entre ella y otras proteínas de la base de datos. Sin embargo, había algunas similitudes menores con las proteínas de la superficie externa de algunas especies bacterianas.

Claims

1. Un polipéptido purificado, que comprende una primera secuencia de aminoácidos que al menos tiene una identidad del 60% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

2. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 70% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

3. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

4. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 90% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

5. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 95% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

6. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 96% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

7. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 97% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

8. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 98% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

9. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 99% con la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

10. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

11. El polipéptido purificado según la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4 es codificada por el clon polinucleótido contenido en el nº de depósito ATCC 97844.

12. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende un epítope inmunógeno o antigénico de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

13. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4.

14. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 411-432 de SEQ ID NO:4.

15. El polipéptido purificado según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4.

16. Un polipéptido purificado, que comprende una primera secuencia de aminoácidos que al menos tiene una identidad del 60% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4.

17. Un polipéptido purificado, que comprende una primera secuencia de aminoácidos que al menos tiene una identidad del 60% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, en el que la primera secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4.

18. El polipéptido purificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 70% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

19. El polipéptido purificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

20. El polipéptido purificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

21. El polipéptido purificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

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22. El polipéptido purificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 96% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

23. El polipéptido purificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 97% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

24. El polipéptido purificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 98% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

25. El polipéptido purificado según la reivindicación 16 ó 17, en el que la primera secuencia de aminoácidos al menos tiene una identidad del 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

26. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25.

27. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una segunda secuencia de nucleótidos complementaria con la primera secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 26.

28. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido S2 que tiene la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4.

29. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 28, en la que la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:4 es codificada por el clon polinucleótido contenido en el nº de depósito ATCC 97844.

30. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una primera secuencia de nucleótidos que al menos tiene una identidad del 90% con la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó con los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

31. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 30, en la que la primera secuencia de nucleótidos al menos tiene una identidad del 95% con la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó con los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

32. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 30, en la que la primera secuencia de nucleótidos al menos tiene una identidad del 96% con la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó con los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

33. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 30, en la que la primera secuencia de nucleótidos al menos tiene una identidad del 97% con la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó con los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

34. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 30, en la que la primera secuencia de nucleótidos al menos tiene una identidad del 98% con la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó con los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

35. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 30, en la que la primera secuencia de nucleótidos al menos tiene una identidad del 99% con la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó con los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

36. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 30, en la que la primera secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:3 ó los nucleótidos 1576-3801 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

37. Un vector aislado, que comprende la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 26-36.

38. Una célula huésped, transformada con el vector según la reivindicación 37.

39. Una composición que comprende:

(a): un vehículo; y

(b): (i) {}\hskip0,3cm el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25; o

(ii): un segundo polipéptido que consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4;

(iii): la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 26-36; o

(iv): una segunda molécula aislada de ácido nucleico que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que codifica a dicho segundo polipéptido.

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40. La composición según la reivindicación 39, para usar en la producción de una respuesta inmune que reconozca Ehrlichia granulocítica en un huésped o para prevenir o inhibir la erliquiosis en un animal.

41. Una vacuna para usar en provocar en un animal una respuesta inmune beneficiosa a Ehrlichia granulocítica, comprendiendo dicha vacuna:

(a): un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable; y

(ii): un segundo polipéptido que consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4;

(iii): la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 26-36, o

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42. Un método para detectar en una muestra un polipéptido de Ehrlichia granulocítica, comprendiendo dicho método:

(a): poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se enlace específicamente con la primera secuencia de aminoácidos del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, o con uno de sus fragmentos que comprenda un epítope inmunógeno o antigénico de dicha primera secuencia de aminoácidos del polipéptido, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos; y

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43. Un método para detectar en una muestra un anticuerpo del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, comprendiendo dicho método:

(a): poner en contacto la muestra con el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, o con un segundo polipéptido, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos, en el que dicho segundo polipéptido consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4; y

(b): detectar la presencia del anticuerpo enlazado a dicho polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, o a dicho segundo polipéptido.

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44. Un kit de diagnóstico, que comprende:

(a): un primer medio recipiente que contiene un anticuerpo que se enlace específicamente con la primera secuencia de aminoácidos del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 o con uno de sus fragmentos que comprenda un epítope inmunógeno o antigénico de dicha primera secuencia de aminoácidos del polipéptido; y

45. Un kit de diagnóstico, que comprende:

(a): un primer medio recipiente que contiene el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 o uno de sus fragmentos que comprenda un epítope inmunógeno o antigénico de dicha primera secuencia de aminoácidos del polipéptido; y

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46. Uso de:

(a): el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25; o

(b): un segundo polipéptido que consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4; o

(c): la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 26-36, o

(d): una segunda molécula aislada de ácido nucleico que comprende una segunda secuencia de nucleótidos que codifica a dicho segundo polipéptido,

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47. Uso de la composición según la reivindicación 39, en la preparación de una vacuna para provocar en un animal una respuesta inmune beneficiosa a Ehrlichia granulocítica.

48. Un método para diagnosticar o detectar una infección por Ehrlichia granulocítica en un animal, que comprende:

(a): poner en contacto una muestra biológica del animal con el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25 o con un segundo polipéptido que consiste en

(1): los aminoácidos 181-190 de SEQ ID NO:4, o

(2): los aminoácidos 636-650 de SEQ ID NO:4; y

(b): detectar la presencia de anticuerpo enlazado a dicho polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, o a dicho segundo polipéptido,