ES2330406T3 - Citocinas de mamifero; reactivos relacionados. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado o recombinante que codifica un polipéptido que comprende el polipéptido maduro de: a) la SEC ID Nº: 2; b) la SEC ID Nº: 4; c) la SEC ID Nº: 8; o d) la SEC ID Nº: 10.
Description
Citocinas de mamífero; reactivos
relacionados.
Esta presentación reclama prioridad a las
solicitudes de patente de Estados Unidos en trámite junto con la
presente de cesión común USSN 09/364.674, presentada el 30 de julio
de 1999; y USSN 09/369.634, presentada el 6 de agosto de 1999.
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La presente invención se refiere a composiciones
relacionadas con proteínas, las cuales funcionan para controlar la
biología y fisiología de células de mamíferos, por ejemplo, células
del sistema inmune de un mamífero. En particular, proporciona genes
purificados, proteínas, anticuerpos y reactivos relacionados útiles,
por ejemplo, para regular la activación, desarrollo, diferenciación
y función de varios tipos de células, incluyendo células
hematopoyéticas.
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La tecnología de ADN recombinante se refiere en
general a la técnica de integrar información genética de una fuente
de donador en vectores para procesamiento subsecuente, tal como a
través de introducción a un huésped, por lo que la información
genética transferida se copia y/o expresa en el nuevo ambiente.
Comúnmente la información genética existe en la forma de ADN
complementario (ADNc) derivado de ARN mensajero (ARNm) que codifica
para un producto de proteína deseada. El portador frecuentemente es
un plásmido que tiene la capacidad de incorporar un ADNc para
replicación posterior en un huésped y, en algunos casos, en realidad
para controlar la expresión del ADNc y de esta manera dirigir la
síntesis del producto codificado en el huésped.
Durante algún tiempo, se ha sabido que la
respuesta inmune de mamíferos se basa en una serie de interacciones
celulares complejas, denominadas la "red inmune". La
investigación reciente ha proporcionado nuevas percepciones en el
funcionamiento interno de esta red. Aunque permanece evidente que
mucha de la respuesta, en realidad, tiene que ver con las
interacciones de tipo red de linfocitos, macrófagos, granulocitos y
otras células, los inmunólogos ahora generalmente sostienen la
opinión de que las proteínas solubles, conocidas como linfocinas,
citocinas o monocinas, juegan un papel importante en el control de
estas interacciones celulares. De esta manera, existe un
considerable interés en el aislamiento, caracterización y mecanismos
de acción de factores moduladores de célula, cuyo entendimiento
conducirá a avances importantes en el diagnóstico y terapia de
numerosas anomalías médicas, por ejemplo, trastornos del sistema
inmune. Algunos de estos factores son factores de crecimiento
hematopoyético y/o factores de diferenciación, por ejemplo, factor
de células madre (SCF) o IL-11. Ver, por ejemplo,
Mire-Sluis y Thorpe (ed. 1988) Cytokines Academic
Press, San Diego; Thomson (ed. 1998) The Cytokine Handbook (3a.
ed.). Academic Press, San Diego; Metcalf y Nicola (1995) The
Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University
Press; y Aggarwal y Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell.
Las linfocinas aparentemente median las
actividades celulares en una variedad de formas. Han mostrado apoyar
la proliferación, el crecimiento y la diferenciación de células
madre hematopoyéticas pluripotenciales en vastos números de
progenitores comprendiendo diversos linajes celulares que forman un
sistema inmune complejo. Las interacciones apropiadas y
equilibradas entre los componentes celulares son necesarias para una
respuesta inmune saludable. Los diferentes linajes celulares por lo
general responden en una forma diferente cuando se administran
linfocinas junto con otros agentes.
Los linajes celulares especialmente importantes
para la respuesta inmune incluyen dos clases de linfocitos: células
B, las cuales producen y secretan inmunoglobulinas (proteínas con la
capacidad de reconocer y unirse a la materia extraña para efectuar
su remoción), y células T de varios subconjuntos que secretan
linfocinas e inducen o suprimen las células B y varias otras
células (incluyendo otras células T) que forman la red inmune.
Estos linfocitos interactúan con muchos otros tipos de célula.
Otro linaje celular importante es la célula
cebada (que no se ha identificado positivamente en todas las
especies de mamíferos), que es una célula de tejido conectivo que
contiene gránulos localizada cerca de los capilares por todo el
cuerpo. Estas células se encuentran especialmente en altas
concentraciones en los pulmones, la piel, y tractos
gastrointestinal y genitourinario. La células cebadas juegan un
papel importante en trastornos relacionados con alergias,
particularmente anafilaxis como sigue: cuando los antígenos
seleccionados se entrecruzan con una clase de inmunoglobulinas
unidas a receptores sobre la superficie de la célula cebada, la
célula cebada se desgranula y libera mediadores, por ejemplo,
histamina, serotonina, heparina y prostaglandinas, las cuales
ocasionan reacciones alérgicas, por ejemplo, anafilaxis.
La búsqueda para entender mejor y tratar varios
trastornos inmunes se ha visto obstaculizada por la incapacidad
general para mantener células del sistema inmune in vitro.
Los inmunólogos han descubierto que el cultivo de estas células
puede lograrse a través del uso de sobrenadantes de células T u
otros sobrenadantes de células, los cuales contienen varios
factores de crecimiento, incluyendo muchas de las linfocinas.
A partir de lo anterior, es evidente que el
descubrimiento y desarrollo de nuevas linfocinas, por ejemplo,
relacionadas con IL-11, puede contribuir a nuevas
terapias para una amplia variedad de condiciones degenerativas o
anormales, las cuales directa o indirectamente involucran al sistema
inmune y/o células hematopoyéticas. En particular, el
descubrimiento y el desarrollo de linfocinas, que mejoran o
potencian actividades benéficas de linfocinas conocidas, podría ser
altamente ventajoso. La presente invención proporciona nuevas
composiciones de interleucina y compuestos relacionados, y métodos
para su uso.
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La presente invención está dirigida a mamíferos,
por ejemplo, roedores, caninos, felinos, primates, interleucina
enumerada DNAX 80, o IL-D80 y sus actividades
biológicas. Incluye ácidos nucleicos que codifica para los mismos
polipéptidos y métodos para su producción y uso. Los ácidos
nucleicos de la invención se caracterizan, en parte, por su
homología a la secuencias de ADN complementario (ADNc) aquí
descritas, y/o a través de ensayos funcionales para actividades de
tipo de factor de crecimiento o de citocina, por ejemplo,
IL-11 (ver Thomson (1998) The Cytokine Handbook 3a.
ed., Academic Press, San Diego), aplicados a los polipéptidos, los
cuales típicamente están codificados por estos ácidos nucleicos. Se
proporcionan métodos para modular o intervenir en el control de
fisiología dependiente de un factor de crecimiento o de una
respuesta inmune.
La presente invención se basa en, en parte, el
descubrimiento de nuevas secuencias de citocina que exhiben una
similitud de secuencia y estructural significativa con
IL-11. En particular, proporciona secuencias de
primate, por ejemplo ser humano, y de roedor (por ejemplo de ratón).
Los equivalentes funcionales que exhiben una homología secuencia
importante estarán disponibles a partir de otros mamíferos, por
ejemplo, vacas, caballos y ratas, ratones y especies que no son
mamíferos.
En varias realizaciones de proteínas, la
invención proporciona: un polipéptido substancialmente puro o
aislado que comprende el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2, 4,
8, ó 10. También se describe en la presente memoria un polipéptido
de IL-D80 substancialmente puro o recombinante que
exhibe una identidad sobre una longitud de por lo menos
aproximadamente 12 aminoácidos con la SEC ID Nº: 2, 4, 8, ó 10. El
polipéptido de la invención puede ser: una IL-D80
de secuencia natural de la SEC ID Nº: 2, 4, 8, ó 10; o una proteína
de fusión que comprende la secuencia de IL-D80 de
SEC ID Nº: 2, 4, 7, ó 10. También se describen en la presente
memoria segmentos de identidad de por lo menos aproximadamente 14,
17, ó 19 aminoácidos. En otras realizaciones de la invención, la
IL-D80 comprende una secuencia madura que comprende
la secuencia de la Tabla 1; o exhibe un patrón de modificación
posterior a la traducción distinto de la IL-D80
natural. Esta invención se refiere a un polipéptido de un animal de
sangre caliente seleccionado de un mamífero, incluyendo un primate.
También se describe en la presente memoria una
IL-D80 que comprende por lo menos un segmento de
polipéptido de la SEC ID Nº: 2, 4, 8 ó 10; exhibe una pluralidad de
fragmentos de residuos aminoácidos; es una variante alélica natural
de IL-D80; tiene una longitud de por lo menos
aproximadamente 30 aminoácidos; exhibe por lo menos dos epítopos no
solapantes, los cuales son específicos para una
IL-D80 de primate; exhibe una identidad de secuencia
sobre una longitud de por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos
con la IL-D80 de primate. En algunas realizaciones
de la invención el polipéptido está es glicosilado; tiene un peso
molecular de por lo menos 10 kD con glicosilación natural; es un
polipéptido sintético; está unido a un substrato sólido; está
conjugado con otra porción química. También se describe en la
presente memoria una IL-D80 con una substitución de
cinco veces o menor a partir de la secuencia natural; o que es una
variante de eliminación o inserción de una secuencia natural. Las
realizaciones preferidas de la invención incluyen una composición
que comprende: un polipéptido de IL-D80 estéril; o
el polipéptido de IL-D80 y un vehículo, en donde el
vehículo es: un compuesto acuoso incluyendo agua, solución salina
y/o regulador de pH; y/o se formula para administración oral,
rectal, nasal, tópica o parenteral. En realizaciones de proteína de
fusión, la proteína puede tener: una secuencia de polipéptido maduro
de la Tabla 1; una etiqueta de detección o purificación, incluyendo
una secuencia de FLAG, His6 o Ig; y/o una secuencia de otra citocina
o quimiocina, incluyendo una
IL-11.
IL-11.
Las realizaciones de kit incluyen aquellas con
un polipéptido IL-D80, y: un compartimento que
comprende el polipéptido; y/o instrucciones para el uso o desecho
de reactivos en el kit.
La presente invención también proporciona un
anticuerpo o fragmento de unión del mismo como se define en las
reivindicaciones adjuntas.
También se describen en la presente memoria
compuestos de unión, en los que el compuesto puede tener un sitio
de unión de antígeno de un anticuerpo, el cual se une
específicamente a un polipéptido IL-D80 natural, en
donde: la IL-D80 es una proteína de primate. El
anticuerpo o fragmento de unión de la invención puede: ser un
fragmento Fv, Fab o Fab2; conjugarse a otra porción química;
desarrollarse contra una secuencia de péptido de una porción de
polipéptido madura de la Tabla 1; desarrollarse contra una
IL-D80 madura; desarrollarse contra una
IL-D80 de primate purificada; inmunoseleccionarse;
ser un anticuerpo policlonal; unirse a una IL-D80
desnaturalizada; exhibir un valor de Kd de por lo menos 30 \muM;
unirse un substrato sólido incluyendo una perla o membrana de
plástico, estar en una composición estéril; o estar aceptablemente
marcado, incluyendo una etiqueta radioactiva o fluorescente. Los
kits que contienen compuestos de unión incluyen aquellos con: un
compartimento que incluye el compuesto de unión; y/o instrucciones
para el uso o desecho de reactivos en el kit. Por lo general, el
kit es capaz de hacer un análisis cualitativo o cuantitativo. Las
composiciones preferidas comprenderán: un compuesto de unión
estéril; o el compuesto de unión y un vehículo, en donde el
vehículo es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina,
y/o regulador de pH; y/o se formulan para administración oral,
rectal, nasal, tópica o parenteral.
Las realizaciones de ácido nucleico incluyen una
ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido
IL-D80 que comprende el polipéptido maduro de la SEC
ID Nº: 2, 4, 8 ó 10 o una proteína de fusión. La
IL-D80 puede ser de un primate; como también se
describe en la presente memoria, el ácido nucleico puede codificar
una secuencia de péptido antigénico de la Tabla 1; codificar una
pluralidad de secuencias de péptido antigénico de la Tabla 1;
exhibir una identidad con un ADNc natural que codifica el segmento.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede: ser un vector de
expresión; comprender además un origen de replicación; ser de una
fuente natural; comprender una etiqueta detectable; comprender una
secuencia de nucleótidos sintética; ser menor que 6 kb,
preferiblemente menor que 3 kb; ser de un primate, incluyendo un ser
humano; comprender una secuencia de codificación de longitud
completa natural; ser una sonda de hibridación para un gen que
codifica la IL-D80. También se describe en la
presente memoria un cebador de PCR, producto de PCR o cebador de
mutagénesis. La invención también proporciona, una célula, tejido,
u órgano aislado que comprende dicho ácido nucleico recombinante, y
preferiblemente la célula será: una célula procariótica; una célula
eucariótica; una célula bacteriana; una célula de levadura; una
célula de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una
célula de primate; o una célula
humana.
humana.
Las realizaciones de kit incluyen aquellas con
aquellos nucleicos y: un compartimento comprendiendo el ácido
nucleico; un compartimento que incluye además la proteína o
polipéptido IL-D80; y/o instrucciones para el uso o
desecho de los reactivos en el kit. Típicamente, el kit es capaz de
hacer un análisis cualitativo o cuantita-
tivo.
tivo.
También se describe en la presente memoria un
ácido nucleico que: hibridiza bajo condiciones de lavado de 30ºC y
menos de 2M de sal o de 45ºC y/o 500 mM de sal, o 55ºC y/o 150 mM de
sal, con la SEC ID Nº: 1, 3, 7 ó 9; o exhibe una identidad sobre
una extensión de por lo menos aproximadamente 30, 55 ó 75
nucleótidos, con una IL-D80 de primate.
La invención abarca método para modular la
fisiología o el desarrollo de una célula o células de cultivos de
tejido, que comprende poner en contacto la célula con un agonista o
antagonista de una IL-D80 de primate. El método
puede ser cuando: el contacto es en combinación con un agonista o
antagonista de IL-11; o el contacto es con un
antagonista incluyendo una composición de unión que comprende un
sitio de unión de anticuerpo que se une específicamente a una
IL-D80.
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La presente invención proporciona secuencias de
aminoácidos y secuencias de ADN que codifican varias proteínas de
mamífero, las cuales son citocinas, por ejemplo, las cuales son
moléculas secretadas que pueden mediar una señal entre células
inmunes u otra células. Ver, por ejemplo, Paul (1997) Fundamental
Immunology (3a. edición) Raven Press, N.Y. Las citocinas de
longitud completa, y fragmentos o antagonistas, serán útiles en la
modulación fisiológica de células que expresan un receptor.
Probablemente, la IL-D80 tenga tanto efectos
estimulantes como inhibidores sobre las células hematopoyéticas,
incluyendo, por ejemplo, células linfoides tales como células T,
células B, células asesinas naturales (NK), macrófagos, células
dendríticas, progenitores hematopoyéticos, etc.. Las proteínas
también serán útiles como antígenos, por ejemplo, inmunógenos, para
desarrollar anticuerpos contra varios epítopos sobre la proteína,
tanto epítopos lineales como conformacionales.
Un ADNc que codifica IL-D80 se
identificó a partir de varias secuencias de primate, por ejemplo, de
ser humano, de BAC del cromosoma 16. Ver, por ejemplo,
CIT987SK-A-575C2 y
CIT987SK-A-761H5. La molécula se
designó como huIL-D80. Se identificó y se describió
una EST humana, la EST AI085007 humana. También se identificó y se
describió una EST AA266872 de ratón.
El gen de primate, por ejemplo, de ser humano,
codificará una pequeña proteína de tipo citocina soluble, de
aproximadamente 216 aminoácidos (para la SEC ID Nº: 2) o
aproximadamente 243 aminoácidos (para la SEC ID Nº: 8). Ver la
Tabla 1 y SEC. ID. Nº: 1, 2, 7 y 8. La IL-D80 exhibe
motivos estructurales características de un miembro de las
citocinas de cadena larga. Comparar, por ejemplo, las secuencias de
IL-D80 e IL-11, disponibles de
GenBank. También ver secuencias de roedor y Tabla 2 ó 3.
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Los límites de exón probablemente corresponden a
aproximadamente 219/220; 393/394; 492/493; y 551/552. Los segmentos
de codificación que corresponden a aquellos límites son de
particular interés. La secuencia de aminoácidos traducida 193 a 918
es la SEC ID NO: 2.
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Sitio de escisión de señal pronosticado entre...
VWG y FPR...; los límites de la hélice A entre aproximadamente...
GRP y QLS... a entre aproximadamente... RKL y LSE...; los límites de
la hélice B entre aproximadamente... QLP y DVS... a entre
aproximadamente... TLQ y PFH...; los límites de la hélice C entre
aproximadamente... GLG y TQG... a entre aproximadamente... VLA y
AGF...; y los límites de la hélice D entre aproximadamente... STY y
RLL... a entre aproximadamente... HSV y WPL... Los solicitantes
intentan descartar emparejamientos de secuencia con residuos
altamente repetidos por ejemplo, las repeticiones L y E
(13-20, 220-223, y
163-175), y los segmentos de codificación
correspondientes.
\newpage
Ácido nucleico (SEC ID NO: 7) que codifica una
variante de IL-D80 a partir de un primate, por
ejemplo, un ser humano (observar que la secuencia de no
codificación es igual a aquella en SEC ID Nº: 1 pero se ha dejado
aquí para aclaración).
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La secuencia de aminoácidos traducida en la SEC
ID Nº: 8:
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Sitio de escisión de señal pronosticado entre...
VWG y FPR...; los límites de la hélice A entre aproximadamente...
GRP y QLS... a entre aproximadamente... RKL y LSE...; los límites de
la hélice B entre aproximadamente...QLP y DVS... a entre
aproximadamente... TLQ y PFH...; los límites de la hélice C entre
aproximadamente... GLG y TQG... a entre aproximadamente... VLA y
AGF...; y los límites de la hélice D entre aproximadamente... STY y
RLL... a entre aproximadamente... HSV y WPL... Los solicitantes
intentan descartar emparejamientos de secuencia con residuos
altamente repetidos por ejemplo, las repeticiones L y E
(13-20, 220-223, y
163-175), y los segmentos de codificación
correspondientes.
Comparación de las SEC ID Nº: 2 y 8:
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Ácido nucleico (SEC ID Nº: 3) que codifica
IL-D80 de un roedor, por ejemplo, ratón.
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Límites de exón de aproximadamente 198/199;
360/361; 459/460; y 618/619. Son particularmente interesantes
segmentos de codificación correspondientes a esos límites. La
secuencia de aminoácidos traducida de 199 a 891 es la SEC ID Nº:
4.
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Sitio de escisión de señal pronosticado entre...
VWG y FPR...; los límites de la hélice A entre aproximadamente...
GRP y QLS... a entre aproximadamente... RKL y LSE...; los límites de
la hélice B entre aproximadamente...QLP y DVS... a entre
aproximadamente... TLQ y PFH...; los límites de la hélice C entre
aproximadamente... GLG y TQG... a entre aproximadamente... VLA y
AGF...; y los límites de la hélice D entre aproximadamente... STY y
RLL... a entre aproximadamente... HSV y WPL... Los solicitantes
intentan descartar emparejamientos de secuencia con residuos
altamente repetidos por ejemplo, las repeticiones L y E
(13-20, 220-223, y
163-175), y los segmentos de codificación
correspondientes.
IL-D80 de roedor variante, por
ejemplo, ratón (SEC ID Nº:9).
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Traducción de 1-702;
IL-D80 de roedor, por ejemplo, ratón (SEC ID Nº:
10)
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Comparación de las SEC ID Nº: 4 y 10:
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La comparación de las secuencias también
proporcionará un árbol evolutivo. Este puede generarse, por ejemplo,
utilizando el programa TreeView en combinación con el programa de
software de análisis ClutalX. Ver, Thompson y otros, Nuc. Acids
Res. 25:4876-4882; y TreeView, Page, IBLS,
Universidad de Glasgow, correo electrónico rpage@bio.gla.ac.uk;
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk.rod.treeview.html.
Como antes, la comparación de las secuencias
también proporcionará un árbol evolutivo. Este puede generarse, por
ejemplo, utilizando el programa TreeView en combinación con el
programa de software de análisis ClustalX. Ver, Thompson, y otros,
Nuc. Acids Res. 25: 4876-4882; y TreeView, Page,
IBLS, Universidad de Glasgow, correo electrónico
rpage@bio.gla.ac.uk;
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk.rod.treeview.html.
La homología estructural de
IL-D80 con proteínas de citocinas relacionadas
sugiere una función relacionada de esta molécula. La
IL-D80 es una citocina de cadena larga exhibe una
similitud de secuencia con IL-11.
Muchos aspectos de la biología de
IL-11 son bien reconocidos. Ver, por ejemplo, Sonis
y otros (1999) Leukimia 13:831-834; Jacques y
otros, (1998) Res. Immunol. 149: 737-740; Trepicchi,
y otros, (1998) Ann N.Y. Acad. Sci. 856: 12-21;
Jacobson (1998) in Thomson The Cytokine Handbook, Academic Press;
Maslak y otros, (1998) Semin. Hematol. 35: 253-60;
Leng y otros (1997) Int. J. Biochem. Cell. Biol. 29:1059 -1062; Du y
otros (1997) Blood 89: 3897-3908; Goldman (1995)
Stem Cells 13: 462-471; y Du y otros (1995) Curr.
Opin. Hematol. 2: 182-188. La biología de la
IL-D80 se espera que sea similar, por ejemplo,
algunas de las actividades biológicas se pueden solapar.
Los agonistas, o los antagonistas, de
IL-D80 también pueden actuar como antagonistas
funcionales o del receptor, por ejemplo, los cuales bloquean la
unión de IL-11 a sus receptores respectivos, o
median las acciones opuestas. De esta manera, la
IL-D80 o sus antagonistas, pueden ser útiles en el
tratamiento de condiciones médicas anormales, incluyendo trastornos
inmunes, por ejemplo, deficiencias inmunes de células T, inflamación
crónica o rechazo de tejido, o en condiciones cardiovasculares o
neurofisiológicas. Por lo general se utilizarán composiciones que
combinen la IL-D80 y reactivos relacionados con
IL-11.
Los antígenos naturales son capaces de mediar
varias respuestas bioquímicas que conducen a respuestas biológicas
o fisiológicas en células objetivo. La realización preferida
caracterizada en la presente es de ser humano, pero existen otros
homólogos de primate u otras especies por naturaleza. Las secuencias
adicionales para proteínas en otras especies de mamíferos, por
ejemplo, primates, caninos, felinos y roedores, también deberían
estar disponibles, particularmente las especies animales
domésticas. Ver más adelante. Las descripciones que siguen están
dirigidas, para propósitos ilustrativos, a una
IL-D80 humana, pero asimismo son aplicables a
realizaciones relacionadas de otras especies.
En varias realizaciones se muestra una secuencia
de aminoácidos de IL-D80 de primate, por ejemplo, de
ser humano, por ejemplo las SEC ID Nº: 2, 4, 8, o 10. Otros ácidos
técnicos de existencia natural que codifican la proteína, pueden
aislarse a través de procedimientos estándares utilizando la
secuencia provista, por ejemplo, técnicas de PCR o a través de
hibridación. Estas secuencias de aminoácidos, proporcionadas de
amino a carboxi, son importantes para proporcionar información de
secuencia para la citocina permitiendo distinguir el antígeno
proteico de otras proteínas e ilustrando numerosas variantes. Sin
embargo, las secuencias peptídicas permiten la preparación de
péptidos para generar anticuerpos para reconocer tales segmentos, y
las secuencias de nucleótidos permiten la preparación de sondas
oligonucleotídicas, siendo ambas estrategias para la detección o
aislamiento, por ejemplo, clonación de genes que codifican tales
secuencias.
Como se utiliza en la presente, el término
"IL-D80 soluble humana" debe abarcar, cuando se
utilizan en el contexto de una proteína, una proteína que tenga una
secuencia de aminoácidos que corresponda a un polipéptido soluble
mostrado en la SEC ID Nº: 2 u 8, o sus fragmentos importantes.
También se describen en la presente memoria una pluralidad de
distintos segmentos por ejemplo, no solapantes, de la longitud
especificada. Típicamente, la pluralidad será por lo menos 2, muy
usualmente por lo menos 3, y preferiblemente 5, 7 o aún más. Aunque
se proporcionan la longitud mínima, pueden ser apropiadas longitudes
más largas y de varios tamaños, por ejemplo, una de una longitud de
7 y dos de una longitud de 12.
Los componentes unión, por ejemplo, los
anticuerpos, típicamente se unen a una IL-D80 con
una alta afinidad, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 100
nM, usualmente mejor que aproximadamente 30 nM, preferiblemente
mejor que aproximadamente 10 nM, y muy preferiblemente mejor que
aproximadamente 3 nM. Las proteínas homólogas se encontrarán en
especies de mamíferos distintas al ser humano, por ejemplo, otros
primates, ungulados o roedores. Las especies que no son de
mamíferos también deberían poseer genes y proteínas estructural o
funcionalmente relacionados, por ejemplo, aves o anfibios.
También se describen en la presente memoria
polipéptidos que incluyen un fragmento o segmento importante, y
abarcan una extensión de residuos aminoacídicos de por lo menos
aproximadamente ocho aminoácidos, en general por lo menos
aproximadamente doce aminoácidos, típicamente por lo menos
aproximadamente 16 aminoácidos, de preferencia por lo menos
aproximadamente veinte aminoácidos y con realizaciones
particularmente preferidas, por lo menos aproximadamente 30 o más
aminoácidos, por ejemplo, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 100, etcétera.
Dichos fragmentos pueden tener extremos que comiencen y/o finalicen
prácticamente en todas las posiciones, por ejemplo, que comiencen
en los residuos 1, 2, 3, etc. y terminen en, por ejemplo, 150, 149,
148, etcétera, en todas las combinaciones prácticas. Los péptidos
particularmente de interés tienen extremos que corresponden a
límites de dominio estructural, por ejemplo, hélices, A, B, C y/o
D. Ver Tablas 1, 2 y 3.
El término "composición de unión" se
refiere a moléculas que se unen con un carácter específico a
IL-D80, por ejemplo, en una interacción de
anticuerpos-antígenos. El carácter específico puede
ser más o menos inclusivo, por ejemplo, específico a una
realización particular, o grupos de realizaciones relacionadas, por
ejemplo, primates, roedores, etcétera. También incluye compuestos,
por ejemplo, proteínas que específicamente se asocian con
IL-D80, incluyendo una interacción de
proteína-proteína fisiológicamente importante,
natural, ya sea, covalente o no covalente. La molécula puede ser un
polímero, o reactivo químico. Un análogo funcional puede ser una
proteína con modificaciones estructurales o puede ser una molécula
que tenga una forma molecular que interactúe con los determinantes
de unión apropiados. Los compuestos pueden servir como agonistas o
antagonistas de una interacción de unión a receptor, ver, por
ejemplo, Goodman, y otros (eds.) Goodman & Gilma's: The
Pharmacological Bases of Therapeutics (edición actual) Pergamon
Press.
Substancialmente puro por ejemplo, en un
contexto de proteína, típicamente significa que la proteína está
libre de otras proteínas de contaminación, ácidos nucleicos, u otros
ingredientes biológicos derivados del organismo de fuente original.
La pureza puede analizarse a través de métodos estándares,
típicamente en peso, y ordinariamente será por lo menos
aproximadamente 40% pura, en general por lo menos aproximadamente
50% pura, por lo general por lo menos aproximadamente 60% pura,
típicamente por lo menos aproximadamente 80% pura, de preferencia
por lo menos aproximadamente 90% pura y en realizaciones muy
preferidas, por lo menos 95% pura. Por lo general se pueden agregar
vehículos o excipientes.
La solubilidad de un polipéptido un fragmento
depende del ambiente y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a
la solubilidad del polipéptido, incluyendo temperatura, ambiente de
electrolito, tamaño y características moleculares del polipéptido y
naturaleza del disolvente. Típicamente, la temperatura a la cual el
polipéptido se utiliza varía de aproximadamente 4ºC a
aproximadamente 65ºC. Usualmente, la temperatura en uso es mayor
que aproximadamente 18ºC. Para propósitos de diagnóstico, la
temperatura usualmente será de aproximadamente temperatura ambiente
o más caliente, pero menos que la temperatura de desnaturalización
de los componentes en el ensayo. Para propósitos terapéuticos, la
temperatura usualmente será la temperatura del cuerpo, típicamente
alrededor de 37ºC para seres humanos ratones, aunque bajo ciertas
situaciones, la temperatura puede aumentarse o disminuirse in
situ o in vitro.
El tamaño y estructura del polipéptido
generalmente debe estar en un estado substancialmente estable, y
usualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede
asociarse con otros polipéptido sin una estructura cuaternaria, por
ejemplo, para conferir solubilidad o asociarse con lípidos o
detergentes.
El disolvente y los electrolitos usualmente
serán un regulador de pH biológicamente compatible, de un tipo
utilizado para la conservación de actividades biológicas, y
usualmente se aproximará a un disolvente acuoso fisiológico.
Usualmente, el disolvente tendrá un pH neutro, típicamente dentro de
aproximadamente 5 y 10, y de preferencia alrededor de 7.5. En
algunas ocasiones, se agregarán uno o más detergentes, típicamente,
uno no desnaturalizante moderado, por ejemplo CHS (hemisuccinato de
colesterilo) o CHAPS (sulfonato de
3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano),
o una concentración lo suficientemente baja para evitar la
interrupción importante de las propiedades estructurales o
fisiológicas de la proteína. En otros casos, se puede utilizar
detergente duro para efectuar una desnaturalización importante.
También se describen en la presente memoria
proteínas o péptidos que tienen una identidad de secuencia de
aminoácidos substancial con la secuencia de aminoácidos del antígeno
IL-D80. Las variantes incluyen variantes de
especies, polifórmicas o alérgicas.
La homología de secuencia de aminoácido, o
identidad de secuencia, se determina optimizando coincidencias de
residuos, si es necesario, introduciendo huecos según sea necesario.
Ver también Needleham y otros (1979) J. Mol. Biol. 48:
43-453; Sankiff y otros (1983) Capítulo Uno en Time
Warps, String Edits, y Macremolecules: The Theory and Practice of
Sequence Comparison, Addison-Wesley. Reading, MA; y
paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y la
Universidad de Wisconsin Genetics Computer Group, Madison WI. La
identidad de secuencia cambia cuando se consideran las
substituciones conservadoras como coincidencias. Las substituciones
conservadoras típicamente substituciones dentro de los siguientes
grupos: glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina; ácido
aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina;
lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. La conservación puede
aplicarse a características biológicas, características funcionales
o características estructurales. Las secuencias de aminoácidos
homólogas típicamente están destinadas a incluir variaciones
polimórficas o alélicas e interespecie naturales de una secuencia de
proteína. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán una
identidad de 25-100% (si pueden introducirse
huecos), una identidad de 50-100% (si se incluyen
substituciones conservadoras), con la secuencia de aminoácidos de
IL-D80. Las mediciones de identidad serán por lo
menos aproximadamente de 65%, en general por lo menos alrededor de
40%, por lo regular por lo menos aproximadamente de 50%,
típicamente por lo menos alrededor de 60%, usualmente por lo menos
alrededor de 70%, de preferencia por lo menos alrededor de 80%, y
muy preferiblemente por lo menos alrededor de 90%.
El ADN de IL-D80 aislado puede
modificarse fácilmente a través de substituciones de nucleótidos,
eliminaciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e
inversiones de extensiones cortas de nucleótidos. Estas
modificaciones dan como resultado nuevas secuencias de ADN que
codifican estos antígenos, sus derivados o proteínas que tienen una
actividad fisiológica, inmunogénica, antigénica u otra actividad
funcional similar. Esta secuencias modificadas pueden usarse para
producir antígenos mutantes o para mejorar la expresión. La
expresión mejorada puede implicar la amplificación de genes,
transcripción aumentada, traducción aumentada y otros mecanismos.
"IL-D80 mutante" abarca un polipéptido que de
otro modo se incluye en la definición de identidad de secuencia de
la IL-D80, como se estableció anteriormente, pero
teniendo una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de
IL-D80 como normalmente se encuentra por
naturaleza, ya sea a través de eliminación, substitución o
inserción. Esto generalmente incluye proteínas que tienen una
identidad significativa con una proteína que tienen una secuencia
de SEC ID Nº: 2, 4, 8 o 10, y que comparten varias actividades
biológicas, por ejemplo, antigénicas o inmunogénicas, con aquella
secuencias, y pueden contener la mayor parte de las secuencias
descritas de longitud completa naturales. Las secuencias de
longitud completa típicamente serán preferidas, aunque también serán
útiles versiones truncadas, asimismo, son típicamente muy deseados
genes o proteínas encontrados en fuentes naturales. Los conceptos
similares se aplican a diferentes proteínas de
IL-D80, particularmente aquellas que se encuentran
en varios animales de sangre caliente, por ejemplo, mamíferos y
aves. Estas descripciones generalmente abarcan muchas proteínas de
IL-D80, no se limitan a realizaciones de primate
particulares específicamente descritas.
La mutagénesis de IL-D80 también
puede realizarse haciendo inserciones o eliminaciones de
aminoácidos. Se pueden generar substituciones, eliminaciones,
inserciones o cualquier combinación para llegar a una construcción
final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o
carboxi-terminales. Se puede realizar la mutagénesis
aleatoria en un codón objetivo y los mutantes expresados después
pueden clasificarse para la actividad deseada. Los métodos para
hacer mutaciones de substitución en sitios predeterminados en el ADN
que tengan una secuencia conocida son bien conocidos en el campo,
por ejemplo, a través de mutagénesis con cebador M13 o técnicas de
reacción en cadena de polimerasa (PCR). Ver, por ejemplo, Sambrook y
otros (1989); Ausubel, y otros (1987 y Suplementos); y Kunkel y
otros (1987) Methods in Ezymol. 154:367-382. La
descripción incluye substituciones preferiblemente conservadoras,
por ejemplo de una vez, de dos veces, tres veces, cinco veces, siete
veces, etc., a niveles de nucleótido o aminoácido. Preferiblemente,
las substituciones estarán lejos de las cisteínas conservadas, y
por lo general estarán en las regiones lejos de los dominios
estructurales helicoidales. Tales variantes pueden ser útiles para
producir anticuerpos específicos y, por lo general compartirán
muchas o todas las propiedades biológicas.
La presente invención también proporciona
proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión
heterólogas utilizando segmentos de estas proteínas. Una proteína
de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que de
forma natural normalmente no están fusionados de la mimas forma. Un
concepto similar se aplica a secuencias de ácido nucleico
heterólogas.
Además, se pueden hacer nuevas construcciones
combinando dominios funcionales similares de otras proteínas. Por
ejemplo, la unión a objetivo u otros segmentos puede
"cambiarse" entre nuevos polipéptidos o fragmentos de fusión
diferentes. Cunningham y otros, (1989) Science 243:
1330-1336; y O'Dowd y otros (1988) J. Biol. Chem.
263: 151985-15992.
El método de fosforamidita descrito por Beaucage
y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862,
producirá fragmentos de ADN sintéticos adecuados. Por lo general se
obtendrá un fragmento de cadena doble sintetizando la cadena
complementaria e hibridando las cadenas entre sí bajo condiciones
apropiadas o agregando la cadena complementaria utilizando
polimerasa de ADN con la secuencia cebadora apropiada, por ejemplo,
técnicas de PCR.
El análisis estructural puede aplicarse a este
gen, en comparación con la familia de citocinas
IL-11. La alineación de las secuencias de
IL-D80 humana con otros miembros de la familia de
IL-11 debería permitir la definición de
características estructurales. En particular, se pueden determinar
residuos de lámina \beta y hélice \alpha utilizando, por
ejemplo, el programa RASMOL, ver, Bazan y otros (1996) Nature 379:
591; Lodi y otros (1994) Science; 263: 1762-1766;
Sayle y Milner-White (1995) TIBS 20:
374-376; y Gronenberg y otros, (1991) Protein
Engineering 4:263-269. Los residuos preferidos para
substituciones incluyen los residuos expuestos en superficie, los
cuales se pronostica que interactúan con el receptor. Otros residuos
que deben conservar la función serán substituciones conservadoras,
particularmente en la posición lejos de los residuos expuestos en
la superficie.
El bloqueo de la respuesta fisiológica a
IL-D80 puede resultar de la inhibición competitiva
de la unión del ligando a su receptor.
Los ensayos in vitro descritos en la
presente invención por lo general utilizarán proteína aislada,
fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión a receptor de
estas proteínas, o fragmentos unidos a substratos de fase sólida.
Estos ensayos también permitirán la determinación de diagnóstico de
los efectos de mutaciones y modificaciones de segmentos de unión o
mutaciones y modificaciones de citocinas, por ejemplo, análogos de
IL-D80.
También se describe en la presente memoria el
uso de ensayos de clasificación de fármacos competitivos, por
ejemplo, cuando anticuerpos de neutralización para la citocina, o
fragmentos de unión de receptor compiten con un compuesto de
prueba.
Los "derivados" de antígenos de
IL-D80 incluyen mutantes de la secuencia de
aminoácidos de formas de existencia natural, variantes de
glicosilación y conjugados covalentes o agregados con otras
porciones químicas. Los derivados covalentes pueden prepararse a
través de enlace de funcionalidades a grupos que se encuentran en
las cadenas laterales de aminoácidos de IL-D80 o en
los terminales N o C, por ejemplo, a través de medios estándares.
Ver, por ejemplo, Lundblad y Noyes (1988) Chemical Reagents for
Protein Modification, vols. 1-2, CRC Press, Inc.,
Boca Raton, FL; Hugli (ed. 1989) Techniques in Protein Chemistry,
Academia Press, San Diego, CA; y Wong (1991) Chemistry of Protein
Conjugation and Cross Linkinkg, CRC Press, Boca Raton, FL.
En particular, se incluyen alteraciones de
glicosilación, por ejemplo, hechas modificando los patrones de
glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento,
o en pasos de procesamiento adicionales. Ver, por ejemplo, Elbein
(1987) Ann. Rev. Biochem. 56:497-534. También se
abarcan versiones de los péptidos con la misma secuencia de
aminoácidos primaria, los cuales tienen otras modificaciones
menores, incluyendo residuos aminoacídicos fosforilados, por
ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina.
También se proporcionan polipéptidos de fusión
entre IL-D80 y otras proteínas homólogas o
heterólogas. Muchos receptores de citocina u otras proteínas de
superficie son multiméricos, por ejemplo, entidades homodiméricas,
y una construcción de repetición puede tener varias ventajas,
incluyendo susceptibilidad disminuida a la escisión proteolítica.
Ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido indicador, por
ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por
ejemplo, un segmento de unión de receptor, de manera que la
presencia o localización del ligando fusionado puede determinarse
fácilmente. Ver, por ejemplo, Dull y otros, patente de Estados
Unidos Nº 4.859.609. Otros patrones de fusión de genes incluyen
\beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A,
\beta-lactamasa, \alpha-amilasa,
alcohol deshidrogenasa, factor coincidente alfa de levadura, y
etiquetas de detección o purificación tales como una secuencia de
FLAG de la secuencia His6. Ver, por ejemplo, Godowski y otros
(1988) Science 241:812-816.
Los péptidos de fusión típicamente se harán a
través de métodos de ácido nucleico recombinante o a través de
métodos de polipéptido sintético. Las técnicas para manipulación y
expresión de ácido nucleico se describen generalmente en, por
ejemplo, Sambrook y otros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2a. edición), vols. 1-3, Cold Spring Harbor
Laboratory; y Ausubel y otros, (eds. 1993) Current Protocols in
Molecular Biology, Greene y Wiley, NY: Las técnicas para las
síntesis de polipéptidos se describen en, por ejemplo, Merrifield
(1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield
(1986) Science 232:341-347; Atherton y otros, (1989)
Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press,
Oxford; y Grant (1992), IRL Press, Oxford; y Grant (1992) Synthetic
Peptides: A User Guide, W.H. Freeman, NY. Los métodos de
replegamiento pueden ser aplicables a proteínas sintéticas.
Esta invención también contempla el uso de
derivados de proteínas de IL-D80 distintas a las
variaciones en la secuencia de aminoácidos o glicosilación. Tales
derivados pueden involucrar asociación covalente o de agregación
con porciones químicas o portadores de proteína. Los derivados
covalentes o de agregación serán útiles como inmunógenos, como
reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación tales como
la purificación de afinidad de compañeros de unión, por ejemplo,
otros antígenos. Una IL-D80 puede inmovilizarse
uniéndose en forma covalente a un soporte sólido, tal como
SEPHAROSE activada con bromuro de cianógeno, a través de métodos que
son bien conocidos en la técnica, o adsorbidos sobre superficies de
poliolefina, con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído, para
utilizarse en el ensayo o purificación de anticuerpos
anti-IL-D80 o una composición de
unión alternativa. Las proteínas de IL-D80, también
pueden marcarse con un grupo detectable, por ejemplo, para
utilizarse en ensayos de diagnóstico. La purificación de
IL-D80 puede efectuarse a través de un anticuerpo
inmovilizado o compañero de unión complementario, por ejemplo, una
porción de unión de un receptor.
Una IL-D80 solubilizada o
fragmento de esta invención se puede utilizar como un inmunógeno
para la producción de antisueros o anticuerpos específicos para la
unión. El antígeno purificado puede usarse para clasificar
anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de antígeno,
abarcando fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos naturales,
por ejemplo, Fab, Fab', F(ab)_{2}, etc. También se
pueden utilizar antígenos de IL-D80 purificados
como un reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a
la presencia de niveles elevados de la citocina, los cuales pueden
ser el diagnóstico de una condición fisiológica, o enfermedad
anormal o específica. Esta invención contempla anticuerpos que
surgen contra secuencias de aminoácidos codificadas por la secuencia
de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1, 3, 7 ó 9, o fragmentos
de proteínas que las contienen. En particular, esta invención,
contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión a, o surgen
contra dominios específicos, por ejemplo, las hélices A, B, C, o
D.
También se describe en la presente memoria el
aislamiento de variantes de especies estrechamente relacionadas
adicionales. El análisis de transferencia de Southern y Northern
establecerá que existen entidades genéticas similares en otros
mamíferos. Es probable que las IL-D80 estén
ampliamente dispersadas en variantes de especies, por ejemplo,
roedores, lagomorfos, carnívoros, artiodáctilos, perisodáctilos, y
primates.
La invención también proporciona medios para
aislar un grupo de antígenos relacionados que presentan tanto
puntos distintos como similitudes en estructura, expresión y
función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de
las moléculas se acelerará enormemente a través del aislamiento y
caracterización de distintas especies adicionales o variantes
polimórficas de las mismas. En particular, la presente invención
proporciona sondas útiles para identificar entidades genéticas
homólogas adicionales en diferentes especies.
Los genes aislados permitirán la transformación
de células que carecen de la expresión de una
IL-D80, por ejemplo, ya sea tipos o células de
especies que carecen de proteínas correspondientes y exhiben una
actividad de fondo negativa. Esto debería permitir el análisis de
la función de IL-D80 en comparación con células de
control no transformadas.
La disección de elementos estructurales críticos
que efectúan las varias funciones fisiológicas mediadas a través de
estos antígenos es posible utilizando técnicas estándares de
biología molecular moderna, particularmente para comparar miembros
de la clase relacionada. Ver, por ejemplo, la técnica de mutagénesis
de exploración homóloga descrita por Cunningham, y otros (1989)
Science 243:1339-1336; y aspectos utilizados por
O'Dowd, y otros (1988) J. Biol. Chem.
263:15985-15992; y Lechleiter y otros, (1990) EMBO
J. 9:4381-4390.
Las funciones intracelulares probablemente
podrían involucrar la señalización de receptor. Sin embargo, la
internalización de proteína puede ocurrir bajo ciertas
circunstancias, y puede ocurrir la interacción entre componentes
intracelulares y citocinas. Los segmentos específicos de interacción
de IL-D80 con componentes de interacción pueden
identificarse a través de mutagénesis o medios bioquímicos directos,
por ejemplo, métodos de entrecruzamiento o afinidad. El análisis
estructural a través de métodos cristalográficos u otros métodos
físicos también será aplicable. La investigación adicional del
mecanismo de la transducción de señal incluirá el estudio de
componentes asociados que pueden aislarse a través de métodos de
afinidad o a través de medios genéticos, por ejemplo, análisis de
complementación de los mutantes.
Se seguirá otro estudio de la expresión y
control de IL-D80. Los elementos de control
asociados con los antígenos deben exhibir una expresión
fisiológica, de desarrollo, especifica de tejido u otros patrones de
expresión diferenciales. Las regiones genéticas cadena arriba o
cadena abajo, por ejemplo elementos de control, son de interés.
Los estudios estructurales de los antígenos de
IL-D80 conducirán al diseño de nuevos antígenos,
particularmente análogos que exhiben propiedades agonistas o
antagonistas en la molécula. Esto puede combinarse con métodos de
clasificación previamente descritos para aislar antígenos que
exhiben espectros deseados de actividades.
Se pueden desarrollar anticuerpos contra varios
epítopos de las proteínas de IL-D80, incluyendo
variantes de especies, polimórficas o alélicas y fragmentos de las
mismas, tanto en formas de existencia natural como en sus formas
recombinantes. Además, se pueden desarrollar anticuerpos contra
IL-D80 en cualquiera de sus formas activas o en sus
formas inactivas, incluyendo versiones nativas o desnaturalizadas.
También se contemplan anticuerpos
anti-idiotípicos.
Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de
unión y versiones de cadena individual, contra fragmentos
predeterminados de los antígenos pueden desarrollarse a través de
inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con
proteínas inmunogénicas. Los anticuerpos monoclonales se preparan a
partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos
anticuerpos pueden clasificarse para unirse a IL-D80
normales o defectuosas, o clasificarse para actividad agonística o
antagonística, por ejemplo, mediada a través de un receptor. Los
anticuerpos pueden ser agonísticos o antagonísticos, por ejemplo,
bloqueando estéricamente la unión a un receptor. Estos anticuerpos
monoclonales usualmente se unirán con por lo menos una K_{D} de
aproximadamente 1 mM, más usualmente por lo menos aproximadamente
300 \muM, típicamente por lo menos aproximadamente 100 \muM, muy
típicamente por lo menos aproximadamente 30 \muM, de preferencia
por lo menos aproximadamente 10 \muM, y muy preferiblemente por
lo menos aproximadamente 3 \muM o mejor.
Una proteína de IL-D80 que
específicamente se une a o que es específicamente inmunorreactiva
con un anticuerpo generado contra un inmunógeno definido, tal como
un inmunógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 2, 4, 8 ó 10, típicamente se determina en un inmunoensayo. El
inmunoensayo típicamente utiliza un anticuerpo policlonal, el cual
fue desarrollado, por ejemplo, para un polipéptido de SEC ID Nº: 2,
4, 8, o 10. Este antisuero se seleccionó teniendo una baja
reactividad cruzada contra otra IL-11, por ejemplo,
IL-11 humana o de roedor, preferiblemente de la
misma especie, y cualquier reactividad cruzada de este tipo se
elimina a través de inmunoabsorción antes de utilizarse en el
inmunoensayo.
Con el fin de producir antisueros para
utilizarse en un inmunoensayo, la proteína de SEC ID Nº: 2, 4, 8, o
10, o una combinación de las mismas se aísla como se describe aquí.
Por ejemplo, se puede producir una proteína recombinante en una
línea de célula de mamífero. Un huésped apropiado, por ejemplo, una
cepa endogámica de ratones tales como Balb/c, se inmuniza con la
proteína seleccionada, típicamente utilizando un adyuvante estándar,
tal como un adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de
ratón estándar (ver, Harlow y Lane, supra).
Alternativamente, un derivado de péptido sintético de la secuencias
descritas aquí, y conjugado a una proteína portadora, puede usarse
como un inmunógeno. Los sueros policlonales se recogen y se titulan
contra la proteína inmunógena en un inmunoensayo, por ejemplo, un
inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un
soporte sólido. Los antisueros policlonales con una titulación de
10^{4} se seleccionan y se prueban para determinar su reactividad
cruzada contra otros miembros de la familia IL-11,
por ejemplo, IL-11 de roedor, utilizando un
inmunoensayo de unión competitivo tal como aquel descrito por Harlow
y Lane, supra, en las páginas 570-573.
Preferiblemente, por lo menos un miembro de la familia
IL-11 distinto se utiliza en esta determinación
junto con, por ejemplo, la IL-11 de primate. Los
miembros de la familia de IL-11 pueden producirse
como proteínas recombinantes y aislarse utilizando biología
molecular estándar y técnicas de química de proteína como se
describe aquí.
Se pueden utilizar inmunoensayos en el formato
de unión competitiva para las determinaciones de reactividad
cruzada. Por ejemplo, la proteína de SEC ID Nº: 2 u 8 puede
inmovilizarse a un soporte sólido. Las proteínas agregadas al
ensayo compiten con la unión de los antisueros para el antígeno
inmovilizado. La habilidad de las proteínas anteriores para
competir con la unión de los antisueros para la proteína
inmovilizada se compara con la proteína de SEC ID Nº: 2 o 8. Se
calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas
anteriores, utilizando cálculos estándares. Aquellos antisueros con
menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas
listadas anteriormente se seleccionan y combinan. Los anticuerpos
que presentan reacción cruzada se eliminan después de los
antisueros combinados a través de inmunoabsorción con las proteínas
listadas anteriormente.
Después, los antisueros inmunoabsorbidos y
combinados se utilizan en un inmunoensayo de unión competitivo como
se describió anteriormente para comparar una segunda proteína con la
proteína inmunógena (por ejemplo, la proteína similar a
IL-11 de SEC ID Nº:2, 4, 8, o 10). Con el fin de
hacer esta comparación, las proteínas son cada una analizadas a una
amplia escala de concentraciones y se determina la cantidad de cada
proteína requerida para inhibir un 50% de la unión del antisuero a
la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína
requerida es menor que el doble de la cantidad de la proteína de la
proteína o proteínas seleccionadas que se requieren, entonces se
dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo
generado para el inmunógeno.
Los anticuerpos de esta invención también pueden
ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de
captura o no neutralizantes, pueden clasificarse por su habilidad
para unirse los antígenos sin inhibir la unión a un receptor. Como
anticuerpos neutralizantes, pueden ser útiles en ensayos de unión
competitiva. También será útil para detectar o cuantificar la
proteína IL-D80 o sus receptores. Ver, por ejemplo
Chan (ed. 1987) Immunology: A Practical Guide, Academic Press,
Orlando, FL; Price y Newman (eds. 1991) Principles and Practice of
Immunoassay, Stockton Press, N.Y; y Ngo (ed. 1988) Nonisotopic
Immunoassay, Plenum Press, N.Y. Las absorciones, eliminaciones
cruzadas u otros medios proporcionarán preparaciones de selectividad
definida, por ejemplo, caracteres específicos de especie únicos o
compartidos. Esta puede ser la base para pruebas que identificarán
varios grupos antígenos.
Además, los anticuerpos, incluyendo fragmentos
de unión a antígeno, de esta invención pueden ser potentes
antagonistas que se unen al antígeno e inhiben la unión funcional,
por ejemplo, a un receptor que puede producir una respuesta
biológica. También pueden ser útiles como anticuerpos no
neutralizantes y pueden acoplarse a toxinas o radionúclidos, de
manera que cuando el anticuerpo se une al antígeno, se destruye una
célula que lo expresa, por ejemplo, en su superficie. Además, estos
anticuerpos pueden conjugarse a fármacos u otros agentes
terapéuticos, ya sea directa o indirectamente a través de un
enlazador, y pueden efectuar el direccionamiento de fármacos.
Los fragmentos de antígeno se pueden unir a
otros materiales, en particular polipéptidos, como los polipéptidos
fusionados o covalentemente unidos que se usarán como inmunógenos.
Un antígeno y sus fragmentos pueden fusionarse o unirse
covalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como hemocianina
de lapa californiana, albúmina de suero de bovino, toxoide de
tétanos, etc. Ver, por ejemplo, Microbiology, Hoeber Medical
Division, Harper y Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of
Serological Reactions, Dover Publications, Nueva York; Williams y
otros, (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, vol. 1,
Academic Press, Nueva York; y Harlow y Lane (1988) Antibodies: A
Laboratory Manual, CSH Press, N.Y., para descripciones de métodos
para preparar antisueros policlonales.
En algunos casos, es deseable preparar
anticuerpos monoclonales a partir de varios huéspedes de mamífero,
tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc.. La
descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos
monoclonales puede encontrarse en, por ejemplo, Suites y otros
(eds.) Basic and Clinical Immunology (4a. ed.), Lange Medical
Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas aquí; Harlow y
Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding
(1986) Monoclonal Antibodies; y particularmente por Kokler y
Milstein (1975) en Nature 256:495-497, la cual
discute un método para generar anticuerpos monoclonales.
Otras técnicas adecuadas involucran la
exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos
antigénicos o alternativamente a selección de colecciones de
anticuerpos en fagos o vectores similares. Ver, Huse y otros (1989)
"Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin
Receptoire in Phage Lambda", Science
246:1275-1281; y Ward y otros, (1989) Nature
341: 544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la
presente invención pueden usarse con o sin modificación, incluyendo
anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los
polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniendo, ya sea covalente o
no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal
detectable. Una amplia variedad de marcadores y técnicas de
conjugación se conocen y se describen extensamente tanto en la
bibliografía científica, como en la bibliografía de patentes. Los
marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, substratos,
co-factores, inhibidores, porciones fluorescentes,
porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares.
Las patentes que enseñan el uso de tales marcadores incluyen las
patentes de Estados Unidos Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350;
3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. También, se pueden
producir inmunoglobulinas recombinantes, ver Cabilly, patente de
Estados Unidos Nº 4,816,567; Moore, patente de Estados Unidos Nº
4,642,334; y Queen y otros, (1989) Proc Nat'l. Acad. Sci. USA,
86:10029-10033.
Los anticuerpos de esta invención también pueden
usarse para cromatografía de afinidad en el aislamiento de la
proteína. Se pueden preparar columnas en donde los anticuerpos se
unen a un soporte sólido. Ver, por ejemplo, Wilchek y otros (1984)
Meth. Enzymol. 104: 3-55. La inversa puede usarse
para purificar anticuerpos.
Los anticuerpos desarrollados contra cada
IL-D80 serán también útiles para generar anticuerpos
anti-idiotípicos. Esto será útil para detectar o
diagnosticar varias condiciones inmunológicas relacionadas con
expresión de los antígenos respectivos.
Las secuencias peptídicas descritas y los
reactivos relacionados son útiles para detectar, aislar o
identificar un clon de ADN que codifica IL-D80, por
ejemplo, de una fuente natural. Típicamente, será útil aislar un gen
de un mamífero, y se aplicarán procedimientos similares para aislar
genes de otras especies, por ejemplo, animales de sangre caliente
tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el
aislamiento de IL-D80 a partir de la misma, por
ejemplo, valientes polimórficas, u otras especies. Un número de
diferentes aspectos estarán disponibles para aislar exitosamente un
clon de ácido nucleico adecuado.
La proteína purificada o los péptidos definidos
son útiles para generar anticuerpos a través de métodos estándares,
como se describió anteriormente. Se pueden presentar péptidos
sintéticos o proteína purificada a un sistema inmune para generar
anticuerpos monoclonales o policlonales. Ver, por ejemplo, Coligan
(1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Halorw y
Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press.
Por ejemplo, la composición de unión específica
puede utilizarse para clasificar una colección de expresión hecha a
partir de una línea de célula que expresa una
IL-D80. La clasificación de expresión intracelular
puede realizarse a través de varios procedimientos de tinción o de
inmunofluorescencia. Las composiciones de unión podrían utilizarse
para purificar por afinidad o clasificar células que expresan una
proteína de fusión de superficie.
Los segmentos de péptidos también pueden usarse
para pronosticar oligonucleótidos apropiados para clasificar una
colección. El código genético puede usarse para seleccionar
oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para la
clasificación. Ver, por ejemplo, SEC ID Nº: 1, 3, 7 ó 9. En
combinación con técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR),
los oligonucleótidos sintéticos serán útiles para seleccionar clones
correctos de una colección. También se utilizarán secuencias
complementarias como sondas, cebadores o estructuras de cadena
antisentido. Varios fragmentos deberían ser particularmente útiles,
por ejemplo, acoplados con un vector anclado o técnicas de PCR
complementarias de poli-A o con ADN complementario
de otros péptidos.
Esta invención contempla el uso de ADN aislado o
fragmentos para codificar un polipéptido IL-D80
correspondiente, antigénico o biológicamente activo; careciendo
particularmente de la porción que codifica la porción no traducida
5' de la secuencia descrita. Además, en la presente memoria se
describe ADN aislado o recombinante que codifica una proteína
biológicamente activa o polipéptido y que es capaz de hibridizar
bajo condiciones apropiadas con las secuencias de ADN descritas en
la presente. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo
puede ser un antígeno intacto, o fragmento, y tener una secuencia
de aminoácidos descrita en por ejemplo, SEC ID Nº: 2, 4, 8, o 10,
particularmente un polipéptido secretado maduro. Además, también se
describe en la presente memoria el uso de ADN aislado o
recombinante, o fragmentos del mismo, los cuales codifican proteínas
que exhiben una alta identidad con una IL-D80
secretada. El ADN aislado puede tener las secuencias reguladoras
respectivas en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores,
potenciadores, señales de adición poli-A y otros.
Alternativamente, la expresión puede efectuarse uniendo
operativamente un segmento de codificación a un promotor heterólogo,
por ejemplo, insertando un promotor cadena arriba de un gen
endógeno.
Un ácido nucleico "aislado" es un ácido
nucleico, por ejemplo, un ARN, ADN, un polímero mixto, el cual está
sustancialmente separado de los otros componentes que acompañan por
naturaleza a una secuencia nativa, por ejemplo, ribosomas,
polimerasas y/o secuencias genómicas de flanqueo de las especies de
origen. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que se ha
retirado de su ambiente de existencia natural, e incluye aislados
de ADN recombinantes o clonados y análogos químicamente sintetizados
o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos.
Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la
molécula. En general, el ácido nucleico estará en un vector o
fragmento menor que aproximadamente 50 kb, usualmente menor que
aproximadamente 30 kb, típicamente menor que aproximadamente 10 kb,
y de preferencia menor que aproximadamente
6 kb.
6 kb.
Un ácido nucleico aislado generalmente será una
composición homogénea de moléculas, pero, en algunas realizaciones,
contendrá una heterogeneidad menor. Esta heterogeneidad típicamente
se encuentra en los extremos del polímero o porciones no críticas
para la función o actividad biológica deseada.
Un ácido nucleico "recombinante" se define
ya sea por su método de producción o su estructura. En referencia a
su método de producción, por ejemplo, un producto hecho a través un
procedimiento, siendo el procedimiento el uso de técnicas de ácido
nucleico recombinante, por ejemplo, involucrando la intervención de
seres humanos en la secuencia de nucleótidos, típicamente selección
o producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico hecho
generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos
que no están naturalmente contiguos entre sí, pero excluyen
productos de la naturaleza, por ejemplo, mutantes de existencia
natural. De esta manera, por ejemplo, se abarcan productos hechos
transformando células con cualquier vector no de existencia natural,
ya que son ácidos nucleicos que comprenden una secuencia derivada
utilizando cualquier proceso de oligonucleótidos sintéticos. Por lo
general esto se realiza para reemplazar un codón con un codón
redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido
conservador, mientras se introduce o elimina típicamente un sitio de
reconocimiento de
secuencia.
secuencia.
Alternativamente, se realiza la unión de los
segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas entre sí para
generar una entidad genética individual, que comprende la
combinación deseada de funciones que no se encuentran en las formas
naturales comúnmente disponibles. Los sitios de reconocimiento de
enzima de restricción en general son el objetivo de tales
manipulaciones artificiales, pero otros objetivos específicos de
sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de ADN,
secuencias de regulación, secuencias de control, u otras
características útiles pueden incorporarse por diseño. Un concepto
similar está destinado a un polipéptido recombinante, por ejemplo,
polipéptido de fusión. Específicamente, se incluyen ácidos nucleicos
sintéticos que a través de la redundancia del código genético,
codifican polipéptidos similares a fragmentos de estos antígenos y
fusiones de secuencias de varias especies diferentes o variantes
polimórficas.
Un "fragmento" significativo en un contexto
de ácido nucleico es un segmento contiguo de por lo menos
aproximadamente 17 nucleótidos, en general alrededor de por lo
menos 22 nucleótidos, ordinariamente por lo menos alrededor de 29
nucleótidos, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 35
nucleótidos, típicamente por lo menos aproximadamente 41
nucleótidos, usualmente por lo menos alrededor de 47 nucleótidos,
preferiblemente por lo menos alrededor de aproximadamente 55
nucleótidos, y en realizaciones particularmente preferidas será de
por lo menos aproximadamente 60, o más nucleótidos, por ejemplo,
67, 73, 81, 89, 95, etc.
Un ADN que codifica para una proteína
IL-D80 será particularmente útil para identificar
genes, ARNm y especies de ADNc que codifican para proteínas
relacionadas o similares, así como ADN y que codifican proteínas
homólogas de diferentes especies. Habrá homólogos en otras
especies, incluyendo primates, roedores, caninos, felinos, aves y
peces. Varias proteínas IL-D80 deberían ser
homólogas. Sin embargo, incluso proteínas que tienen una relación
de evolución distante al antígeno pueden aislarse fácilmente bajo
condiciones apropiadas utilizando estas secuencias si son
suficientemente homólogas. Las proteínas de IL-D80
de primates son de interés particular.
Los clones recombinantes derivados de la
secuencias genómicas, por ejemplo, conteniendo intrones, serán
útiles para estudios transgénicos, incluyendo, por ejemplo, células
y organismos transgénicos, y para terapia de genes. Ver, por
ejemplo, Goodnow (1992) "Transgenic Animals" en Roitt (ed.)
Encyclopedia of Immunology, Academia Press, San Diego, pp.
1502-1504; Travis (1992) Science
256:1392-1394; Kuhn y otros (1991) Science
254:707-710, Capecchi (1989) Science 244:1288;
Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A
Practical Approach, IRL Press, Oxford; Rosenberg (1992) J. Clinical
Oncology 10:180-199: y Cournoyer y Caskey (1993)
Ann. Rev. Immunol. 11:297-329. Alternativamente, la
expresión puede efectuarse uniendo operativamente un segmento de
codificación a un promotor heterólogo, por ejemplo, insertando un
promotor cadena arriba de un gen endógeno. Ver, por ejemplo, Treco
y otros, WO 96/29411 o USSN 08/406,030.
La homología substancial, por ejemplo, la
identidad, en el contexto de comparación de secuencia de ácido
nucleico representa cualquiera de los segmentos, o sus cadenas
complementarias, cuando se comparan, son idénticas cuando se
alinean óptimamente con inserciones o eliminaciones de nucleótidos
apropiadas, en por lo menos un 50% de los nucleótidos, en general
por lo menos alrededor de 58%, ordinariamente por lo menos alrededor
de 65%, por lo general por lo menos aproximadamente 71%,
típicamente por lo menos aproximadamente 77%, usualmente alrededor
de 85%, de preferencia por lo menos aproximadamente 95% a 98% o más,
tan altos como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos.
Alternativamente, existe una homología substancial cuando los
segmentos hibriden bajo condiciones de hibridación selectivas, con
una cadena, o su complemento, típicamente utilizando una secuencia
de IL-D80, por ejemplo, SEC ID Nº: 1, 3, 7, o 9.
Típicamente, la hibridación selectiva ocurrirá cuando exista por lo
menos un 55% de identidad sobre una extensión de por lo menos
aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente por lo menos
alrededor de 75% sobre una extensión de aproximadamente 25
nucleótidos, y muy preferiblemente alrededor de 90% sobre
aproximadamente 20 nucleótidos. Ver, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res.
12:203-213. La longitud de la comparación de
identidad, según descrita, puede ser sobre extensiones más largas, y
en ciertas realizaciones será sobre una extensión de por lo menos
aproximadamente 17 nucleótidos, usualmente por lo menos alrededor
de 28 nucleótidos, típicamente por lo menos alrededor de 40
nucleótidos y de preferencia por lo menos aproximadamente 75 a 100
o más nucleótidos.
Las condiciones severas, con referencia a la
homología con respecto a la hibridación, serán condiciones
combinadas severas de sal, temperatura, disolventes orgánicos y
otros parámetros, típicamente aquellos controlados en reacciones de
hibridación. Las condiciones severas de temperatura usualmente
incluirán temperaturas en un exceso de aproximadamente 30ºC,
usualmente en un exceso de aproximadamente 37ºC, típicamente en un
exceso de aproximadamente 55ºC, 60ºC o 65ºC, y preferiblemente en
un exceso de aproximadamente 70ºC. Las condiciones de sal severas
ordinariamente serán menores de aproximadamente 1000 mM, usualmente
menor que aproximadamente 400 mM, típicamente menor que
aproximadamente 250 mM, de preferencia menor que aproximadamente 150
mM, incluyendo aproximadamente 100, 50 o aún 20 mM. Sin embargo, la
combinación de parámetros es mucho más importante que la medición
de cualquier parámetro individual. Ver, por ejemplo, Wetmur y
Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370. La
hibridación bajo condiciones severas debe proporcionar un fondo de
por lo menos del doble sobre el fondo, preferiblemente por lo menos
3-5 o más.
Para comparación de secuencia, típicamente una
secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se
comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de
comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia
se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas
subsecuentes, si es necesario, y se designan parámetros de programa
de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia
entonces calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la
secuencia(s) de prueba, con relación a la secuencia de
referencia, basándose en los parámetros designados.
La alineación óptica de secuencias para
comparación puede realizarse, por ejemplo, a través del algoritmo
de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math.
2:482, a través del algoritmo de alineación de homología de
Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, a través de la
búsqueda de un método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc.
Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, a través de aplicaciones
computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en
el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group,
575 Science Dr., Madison, WI), o a través de inspección visual (ver
generalmente Ausubel y otros, supra).
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP.
PILEUP crea una alineación secuencia múltiple a partir de un grupo
de secuencias relacionadas utilizando alineaciones progresivas en
pares, para mostrar una relación y un porcentaje de identidad de
secuencia. También se representa un árbol o dendrograma mostrando
las relaciones agrupadas utilizadas para crear la alineación. El
algoritmo PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación
progresiva de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol.
35:351-360. El método utilizado es similar al método
descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS
5:151-153. El programa puede alinear hasta 300
secuencias cada una con la longitud máxima de 5000 nucleótidos o
aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con
alineación por pares de las dos secuencias más similares,
produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Éste grupo
después se alinea con la siguiente secuencia más relacionada o
agrupación de secuencias alineadas. Dos grupos de secuencia se
alinean a través de una extensión simple de la alineación en pares
de dos secuencias individuales. La alineación final se logra a
través de una serie de alineaciones progresivas en pares. El
programa se opera designando secuencias específicas y sus
coordenadas de aminoácido o nucleótido para regiones de comparación
de secuencia y designando los parámetros de programa. Por ejemplo,
la secuencia de referencia puede compararse con otras secuencia de
prueba para determinar la relación de porcentaje de identidad de
secuencia utilizando los siguientes parámetros: peso de hueco por
defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10), y
huecos de extremos ponderados.
Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para
determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de
secuencia es el algoritmo BLAST, el cual se describe por Altschul y
otros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El software
para realizar análisis de BLAST está públicamente disponible a
través del National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero
identificar pares de secuencia de alta puntuación (HSP)
identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de
petición, ya sea coincidiendo o mediante la satisfacción de alguna
puntuación T de umbral valorado en forma positiva, cuando se alinea
con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de
datos. T se denomina como el umbral de puntuación de palabra más
cercana (Atschul y otros, supra). Esta palabra circundante
inicial actúa como semillas para iniciar búsquedas para encontrar
HSP más grandes que las contengan. Los éxitos de palabra después se
extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la
medida en que pueda aumentarse la puntuación de alineación
acumulativa. La extensión de los éxitos de palabra en cada dirección
se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa
disminuye en la cantidad de X desde su valor logrado máximo; la
puntuación acumulativa va de 0 o más abajo, debido a la acumulación
de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se
alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del
algoritmo BLAST, W, T y X, determinan la sensibilidad y velocidad
de alineación. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud
palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver, Henikoff y
Henikoff (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:10915) alineaciones
(B) de 50, valores esperados (E) de 10, M=5, N=4 y comparación de
ambas cadenas.
Además de calcular el porcentaje de identidad de
secuencia el algoritmo BLAST también realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo,
Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA
90:5873-5787). Una medida de similitud provista por
el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña
(P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por
la que puede ocurrir una coincidencia entre dos secuencias de
nucleótidos o de aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, se
considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de
referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación
del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es
menor que aproximadamente 0,1, preferiblemente menor que
aproximadamente 0,01 y muy preferiblemente menor que aproximadamente
0,001.
Una indicación adicional de que dos secuencias
de ácido nucleico de polipéptidos son substancialmente idénticas,
es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es
inmunológicamente reactivo en forma cruzada con el polipéptido
codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más
adelante. De esta manera, un polipéptido es típicamente
substancialmente idéntico a un segundo polipéptido por ejemplo,
cuando los dos péptidos difieren solamente por substituciones
conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido
nucleico son substancialmente idénticas, es que las dos moléculas
hibridan entre sí bajo condiciones severas, como se describe más
adelante.
La IL-D80 de otras especies de
mamíferos puede clonarse y aislarse a través de hibridación de
especie cruzada de especies estrechamente relacionadas. La
homología puede ser relativamente baja entre especies distantemente
relacionadas y de esta manera es aconsejable la hibridación de
especies relativamente estrechamente relacionadas.
Alternativamente, la preparación de una preparación de un anticuerpo
que exhibe un carácter específico de especies menor, puede ser útil
en aspectos de clonación de expresión.
Se puede obtener el ADN que codifica la
IL-D80 o sus fragmentos a través de síntesis
química, clasificando colecciones de ADNc, o clasificando
colecciones genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de
líneas de célula o muestras de tejido. Ver, por ejemplo, Okayama y
Berg (1982) Mol. Cel. Biol. 2:161-170; Gubler y
Hoffman (1983) Gene 25:263-269; y Glover (ed. 1984)
DNA Cloning; A Practical Approach, IRL Press, Oxford.
Alternativamente, las secuencias proporcionadas aquí proporcionan
cebadores de PCR útiles o permiten la preparación sintética u otro
tipo de de genes adecuados que codifican una IL-D80;
incluyendo realizaciones de existencia natural.
Este ADN puede expresarse en una amplia variedad
de células huésped para la síntesis de una IL-D80 de
longitud completa o fragmentos que pueden, a su vez, por ejemplo
utilizarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales;
para estudios unión; para la construcción y expresión de moléculas
modificadas; y para estudios de estructura/función. Existe la
necesidad de una proteína chaperona para una secreción eficiente, o
pueden ser necesarios pasos adicionales para recuperar proteína del
compartimento intracelular.
Los vectores, como se utilizan en la presente,
comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN
integrables, y otros vehículos que permiten la integración de
fragmentos de ADN en el genoma del huésped. Ver, por ejemplo,
Pouwels y otros (1985 y suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory
Manual, Elsevier, N.Y.; y Rodríguez y otros, (eds. 1988) Vector: A
Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth,
Boston,
MA.
MA.
Para los propósitos de esta invención, las
secuencias de ADN están unidas operativamente cuando están
funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN para una
pre-secuencia o líder de secreción está
operativamente unido a un polipéptido si se expresa como una
pre-proteína o participa en la dirección del
polipéptido hacia la membrana de la célula o en la secreción del
polipéptido. Un promotor está operativamente unido a una secuencia
de codificación si controla la transcripción del polipéptido; un
sitio de unión a ribosoma está operativamente unido a una secuencia
de codificación si está colocado para permitir la traducción.
Usualmente, operativamente unido significa contiguo y en marco de
lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos tales como genes
represores no están unidos en forma contigua pero siguen estando
unidos a las secuencias de operador que su vez controlan la
expresión. Ver, por ejemplo, Rodríguez y otros, Capítulo 10, pp.
205-236; Balbas y Bolivar (1990) Methods in
Enzymology 185:14-37; y Ausebel, y otros (1993)
Current Protocols in Molecular Biology, Greene y Wiley, NY.
Los ejemplos representativos de vectores de
expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, ver Okayama y otros
(1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMClneo
Poly-A, ver Thomas, y otros (1987) Cell
51:503-512; y un vector de baculovirus tal como pAC
373 o pAC 610. Ver, por ejemplo, Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol.,
42:177-
199.
199.
Por lo general se deseará expresar un
polipéptido IL-D80 en un sistema que proporcione un
patrón de glicosilación específico o definido. Ver, por ejemplo,
Luckow y Summers (1988) Bio/Technolgy 6:47-55; y
Kaufman (1990) Meth. Enzymol. 185:487-511.
La IL-D80, o un fragmento de la
misma, puede diseñarse por ingeniería para unirse por fosfatidil
inositol (PI) a una membrana de célula, pero puede eliminarse de
las membranas a través del tratamiento con una enzima de escisión
de fosfatidil inositol, por ejemplo, fosfatidil inositol
fosfolipasa-C. Esto libera el antígeno en forma
biológicamente activa y permite la purificación mediante
procedimientos estándares de química de proteínas. Ver, por
ejemplo, Low (1989) Biochim. Biophys, Acta
988:427-454; Tse, y otros, (1985) Science
230:1003-1008; y Brunner y otros (1991) J. Cell.
Biol. 114:1275-1283.
Ahora que la IL-D80 ha sido
caracterizada, se pueden preparar fragmentos o derivados de la misma
a través de procedimientos convencionales para sintetizar péptidos.
Estos incluyen procedimientos tales como aquellos descritos por
Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce
Chemical Co., Rockford, IL; Bodanzky y Bodanzky (1984) The Practice
of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; y
Villafranca (ed. 1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic
Press, San Diego, CA.
La presente invención proporciona reactivos que
encontrarán uso en aplicaciones diagnósticas como se describe aquí
en cualquier parte, por ejemplo, en condiciones medianas por
IL-D80, o más adelante en la descripción de kits de
diagnóstico. El gen puede ser útil en ciencias forenses, por
ejemplo, para distinguir un roedor de un ser humano, o como
marcador para distinguir entre diferentes células que exhiben
diferentes patrones de expresión o modificación diferencial.
Esta invención también proporciona reactivos con
un potencial comercial y/o terapéutico importante. La
IL-D80 (de existencia natural o recombinante), sus
fragmentos, y anticuerpos para la misma, junto con compuestos
identificados como que tienen una afinidad de unión a
IL-D80, deberían ser útiles como reactivos para
enseñar técnicas de biología molecular, inmunología o fisiología.
Se pueden preparar kits apropiados con los reactivos, por ejemplo,
en ejercicios de laboratorio de prácticas en la producción o el uso
de proteínas, anticuerpos, métodos de clonación, histología,
etc.
Los reactivos también serán útiles en el
tratamiento de condiciones asociadas con una fisiología o desarrollo
anormal, incluyendo condiciones inflamatorias. Pueden ser útiles
pruebas in vitro para determinar la presencia o ausencia de
componentes de interacción, los cuales pueden correlacionarse con
éxito de estrategias de tratamiento particulares. En particular, la
modulación de fisiología de varios, por ejemplo, células
hematopoyéticas o linfoides, se logrará a través de métodos
apropiados para el tratamiento utilizando las composiciones
proporcionadas aquí. Ver, por ejemplo, Thomson (ed. 1998) The
Cytokine Handbook (3a. ed.) Academia Press, San Diego; Metcalf
y Incola (1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factor
Cambridge University Press; y Aggarwal y Gutterman (1991) Human
Cytokines Blackwell Pub.
Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado
con una expresión anormal o señalización anormal a través de una
IL-D80, debería ser probablemente un objetivo para
un agonista o antagonista. La nueva citocina debería jugar un papel
importante en la regulación o desarrollo de células hematopoyéticas,
por ejemplo, células linfoides, las cuales afectan a respuestas
inmunológicas, por ejemplo, inflamación y/o trastornos autoinmunes.
Alternativamente se puede afectar la fisiología o desarrollo
vascular, o efectos neuronales.
En particular, la citocinas debería mediar, en
varios contextos, la síntesis de citocinas por la células,
proliferación, etcétera. Los antagonistas de IL-D80,
tales como variantes de muteína de una forma de existencia natural
de IL-D80 o anticuerpos de bloqueo, pueden
proporcionar una forma selectiva y poderosa para bloquear
respuestas inmunes, por ejemplo, en situaciones como respuestas
inflamatorias o autoinmunes. Ver también, Samter y otros (eds.)
Immunological Diseases vol. 1 y 2, Little, Brown and Co.
Se conocen varias condiciones anormales en
diferentes tipos de célula, las cuales producirán
IL-D80, por ejemplo, según se evalúa a través de la
expresión de ARNm mediante análisis de transferencia de Northern,
Ver, Berkow (Northern, Ver, Berkow (ed.) The Merck Manual of
Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn y
otros, Harrison's Principles of Internal Medicine,
McGraw-Hill, N.Y.M; y Watherall y otros, (eds.)
Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford.
Muchas otras condiciones o enfermedades médicas involucran la
activación a través de macrófagos o monocitos, y muchas de estas
serán sensibles al tratamiento por un agonista o antagonista
proporcionado aquí. Ver, por ejemplo, Sites y Terr (eds.; 1991)
Basic and Clinical Immunology, Appleton y Lange, Norwalk,
Connecticut; y Samter, y otros (eds.) Immunological Diseases Little,
Brown and Co. Estos problemas deberían ser susceptibles a la
prevención o tratamiento utilizando composiciones
proporcionadas
aquí.
aquí.
La IL-D80, antagonistas,
anticuerpos, etcétera, pueden purificarse y después administrarse a
un paciente, veterinario o ser humano. Estos reactivos pueden
combinarse para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes
adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes
farmacéuticamente aceptables, convencionales, por ejemplo,
adyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizadores, excipientes o
conservadores fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden
esterilizarse por filtración y colocarse en formas de dosificación
como por liofilización en frascos de dosificación o almacenarse en
preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también
contempla el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión,
incluyendo formas que no son de unión del complemento.
La clasificación de fármacos utilizando
IL-D80 o sus fragmentos, puede realizarse para
identificar compuestos que tengan afinidad de unión u otros efectos
biológicos importantes sobre las funciones de
IL-D80, incluyendo el aislamiento de componentes
asociados. Después, se pueden utilizar ensayos biológicos
subsecuentes para determinar si los compuestos tienen una actividad
estimulante intrínseca y, por lo tanto, es un bloqueante o
antagonista ya que bloquea la actividad de la citocina. Asimismo, un
compuesto que tiene una actividad estimulante intrínseca puede
activar la trayectoria de señal y de esta manera es un agonista en
el sentido de que estimula la actividad de IL-D80.
También se describe en la presente memoria el uso terapéutico de
anticuerpos del bloqueo para IL-D80 como
antagonistas y de anticuerpos estimulantes como agonistas. Este
aspecto debería ser particularmente útil con otras variantes de
especies de IL-D80.
Las cantidades de reactivos necesarias para una
terapia eficaz dependerán de muchos factores, incluyendo los medios
de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del
paciente, y otros medicamentos administrados. De esta manera, las
dosificaciones de tratamiento deben titularse para optimizar la
seguridad y eficacia. Típicamente, las dosificaciones utilizadas
in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades
útiles para administración in situ de estos reactivos. La
prueba en animales de dosis efectivas para el tratamiento de
trastornos particulares proporcionará una indicación predictiva
adicional de la dosificación para ser humano. Se describen varias
consideraciones, por ejemplo, por Gilman y otros, (eds.) Goodman y
Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, última
edición, Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences,
última edición, Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos para
la administración se discuten ahí y más adelante, por ejemplo, para
administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular,
difusión transdérmica y otros. Los vehículos farmacéuticamente
aceptables incluirán agua, solución salina, reguladores de pH y
otros compuestos descritos, por ejemplo en, Merck Index, Merck
& Co., Rahway, New Jersey. Las escalas de dosificación
generalmente se puede esperar que estén en cantidades más bajas que
concentraciones de 1 mM, típicamente en concentraciones menores que
aproximadamente 10 \muM, usualmente menos de aproximadamente 100
mM, preferiblemente menos de aproximadamente 10 pM (picomolares), y
muy preferiblemente menos de aproximadamente 1 fM (fentomolar), con
un vehículo apropiado. Por lo general se utilizarán formulaciones de
lenta liberación, o una aparato de lenta liberación para la
administración continua o a largo plazo. Ver, por ejemplo Langer
(1990) Science 249:1527-1533.
La IL-D80, fragmentos de la
misma y anticuerpos para la misma o sus fragmentos, antagonistas y
agonistas, pueden administrarse directamente al huésped que se
tratará o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser
deseable conjugarlos a proteínas portadoras tales como ovoalbúmina o
albúmina de suero antes de su administración. Las formulaciones
terapéuticas pueden administrarse en muchas formulaciones de
dosificación convencionales. Aunque es posible que el ingrediente
activo se administre solo, se prefiere presentarlo como una
formulación farmacéutica. Las formulaciones típicamente comprenden
por lo menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente,
junto con uno o más vehículos aceptables de los mismos. Cada
vehículo debería ser tanto farmacéutica como fisiológicamente
aceptable en el sentido de ser compatible con otros ingredientes y
no peligroso para el paciente. Las formulaciones incluyen aquellas
adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica o
parenteral (incluyendo inyecciones subcutánea, intramuscular,
intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse
convenientemente en una forma de dosificación unitaria y se pueden
preparar a través de cualquier método bien conocido en la técnica
de la farmacia. Ver, por ejemplo, Gilman y otros (eds. 1990)
Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics,
8ava. Edición, Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical
Sciences, 17ava. Edición (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.;
Avis, y otros, (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral
Medications, Dekker, Nueva York; Lieberman y otros, (eds. 1990)
Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, Nueva York; y
Lieberman, y otros, (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms:
Disperse Systems, Dekker, Nueva York. La terapia descrita en la
presente memoria puede combinarse con, o utilizarse junto con otros
agentes, por ejemplo, otras citocinas, incluyendo
IL-11, o sus antagonistas.
Las formas tanto de existencia natural como
recombinantes de las IL-D80 de esta invención son
particularmente útiles en kits y métodos de ensayo que son capaces
de clasificar compuestos para actividad de unión a las proteínas.
Se han desarrollado varios métodos de automatización de ensayos en
los últimos años con el fin de permitir la clasificación de cientos
de miles de compuestos en un corto período. Ver, por ejemplo, Fodor
y otros (1991) Science 251:767-773, la cual describe
medios para probar la afinidad de unión de una pluralidad de
polímeros definidos sintetizados sobre un substrato sólido. El
desarrollo de ensayos adecuados puede facilitarse enormemente por
la disponibilidad de grandes cantidades de IL-D80
purificada, soluble, según se proporciona por esta invención.
Se pueden utilizar otros métodos para determinar
los residuos críticos en interacciones de receptor de
IL-D80-IL-D80. El
análisis mutacional puede realizarse, por ejemplo, ver Somoza, y
otros (1993) J. Explot. Med. 178:549-558, para
determinar residuos específicos críticos en la interacción y/o
señalización. PHD (Rost y Sander (1994) Proteins
19:55-72) y DSC (King y Sternberg (1996) Protein
Sci. 5:2298-2310) pueden proporcionar predicciones
de estructura secundaria de \alpha-hélice (H),
cadena \beta (E) o enrollamiento (L). Las hélices A y D son muy
importantes en la interacción de receptor, siendo la hélice D la
región más importante. Los límites para las varias hélices se
indicaron anteriormente. Dichos residuos expuestos afectarían a la
unión de receptor, mientras que los residuos embebidos afectarían a
la estructura general.
Por ejemplo, los antagonistas pueden encontrarse
normalmente una vez que el antígeno ha sido estructuralmente
definido, por ejemplo, a través de datos de estructura terciara. La
prueba de análogos de interacción potenciales ahora es posible
después del desarrollo de métodos de ensayo altamente automáticos
utilizando una IL-D80 purificada. En particular, se
descubrirán nuevos agonistas y antagonistas utilizando técnicas de
clasificación descritas aquí. De importancia particular son los
compuestos que se encuentra que tienen una afinidad de unión
combinada para un espectro de moléculas de IL-D80,
por ejemplo, compuestos que pueden servir como antagonistas para
variantes de especies de IL-D80.
Un método para la clasificación de fármacos
utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas, las cuales
están establemente transformadas con moléculas de ADN recombinante
que expresan una IL-D80. Se pueden aislar células
que expresan una IL-D80 en aislamiento de otras
moléculas. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, pueden
usarse para ensayos de unión de compañero de unión estándares. Ver,
también, Parce y otros (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
87:4007-4011, las cuales describen métodos sensibles
para detectar respuestas celulares.
Otra técnica para la clasificación de fármacos
involucra un aspecto que proporciona una clasificación de alta
producción para compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada
a una IL-D80 y se describe con detalle por Geysen,
solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre
de 1984. En primer lugar, se sintetizan grandes números de
diferentes compuestos de prueba de péptidos pequeños sobre un
substrato sólido, por ejemplo, horquillas de plástico o alguna otra
superficie apropiada, ver Fodor, y otros (1991). Después, todas las
horquillas se hacen reaccionar con IL-D80
solubilizada no purificada o solubilizada purificada y se lavan. El
siguiente paso involucra detectar IL-D80 unida.
El diseño de fármacos racional también se puede
basar en estudios estructurales de las formas moleculares de
IL-D80 y otros efectores o análogos. Los efectores
pueden ser otras proteínas que median otras funciones en respuesta
a la unión, u otras proteínas que normalmente interactúan con
IL-D80, por ejemplo, un receptor. Un medio para
determinar qué sitios interactúan con otras proteínas específicas,
es una determinación de estructura física, por ejemplo, técnicas de
cristalografía de rayos X, o RMN bidimensional. Estas proporcionarán
una guía de qué residuos aminoacídicos forman regiones de contacto
moleculares, según se modelan, por ejemplo, contra otros modelos de
citocina-receptor. Para una descripción detallada de
la determinación estructural de proteína, ver, por ejemplo,
Blundell y Jonson (1976) Protein Crystallography, Academia Press,
Nueva York.
Esta invención también contempla el uso de
proteínas IL-D80 sus fragmentos, péptidos y sus
productos de fusión en una variedad de kits de diagnóstico y
métodos como se definen en las reivindicaciones adjuntas para
detectar la presencia de otra IL-D80 o compañero de
unión. Típicamente, el kit tendrá un compartimento que contenga un
péptido IL-D80 definido o un segmento de gen o un
reactivo que reconozca uno o el otro, por ejemplo, los fragmentos o
anticuerpos de IL-D80.
Un kit para determinar la afinidad de unión de
un compuesto de prueba a una IL-D80 típicamente
comprendería un compuesto de prueba; un compuesto marcado, por
ejemplo, un compañero de unión o anticuerpo que tenga una afinidad
de unión conocida para IL-D80; una fuente de
IL-D80 (de existencia natural o recombinante), y
medios para separar compuesto marcado unido de libre, tal como una
fase sólida para inmovilizar la molécula. Una vez que los
compuestos se clasifican, aquellos que tienen afinidad de unión
adecuada al antígeno pueden evaluarse en ensayos biológicos
adecuados, como es bien conocido en la técnica, para determinar si
actúan como agonistas o antagonistas para la trayectoria de
señalización de IL-D80. La disponibilidad de
polipéptidos IL-D80 recombinantes también
proporciona estándares bien definidos para calibrar tales
ensayos.
Un kit preferido para determinar la
concentración de, por ejemplo, una IL-D80 en una
muestra, típicamente comprendería un compuesto marcado, por
ejemplo, un compañero de unión o anticuerpo, que tenga una afinidad
de unión conocida por el antígeno, una fuente de citocina (de
existencia natural o recombinante) y medios para separar el
compuesto marcado unido del libre, por ejemplo, una fase sólida para
inmovilizar la IL-D80. Normalmente se
proporcionarán compartimentos que contengan reactivos e
instrucciones.
Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión
a antígeno, específicos para IL-D80 o fragmentos son
útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de
niveles elevados de IL-D80 y/o sus fragmentos.
Dichos ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas,
células fijas, inmunofluorescencia, cultivos de células, fluidos
del cuerpo y además pueden involucrar la detección de antígenos
relacionados con el antígeno en el suero, o similares. Los ensayos
de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin un paso de separación
entre el reactivo libre y el complejo de
antígeno-compañero de unión) o heterogéneos (con un
paso de separación). Existen varios ensayos comerciales, tales como
radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA), inmunoensayo de enzima (EIA), técnica de inmunoensayo de
enzima multiplicada (EMIT), inmunoensayo fluorescente de substrato
marcado (SLFIA) y similares. Ver, por ejemplo, Van Vunakis, y otros
(1980) Method Enzymol, 70:;1-525; Harlow y Lane
(1980) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; y Coligan y
otros (eds. 1993) Current Protocols in Immunology, Greene y Wiley,
N.Y.
Los anticuerpos anti-idiotípicos
pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de
anticuerpos contra una IL-D80 como puede ser el
diagnóstico de varios estados anormales. Por ejemplo, la
sobreproducción de IL-D80 puede dar como resultado
la producción de varias reacciones inmunológicas que pueden ser el
diagnóstico de estados fisiológicos anormales, particularmente en
condiciones de células proliferativas tales como cáncer, o
activación o diferenciación anormal. Además, el patrón de
distribución disponible proporciona información de que la citocina
se expresa en islotes pancreáticos, sugiriendo la posibilidad de que
la citocina puede estar involucrada en la función de ese órgano,
por ejemplo, en una condición médica pertinente a diabetes.
Frecuentemente, los reactivos para ensayos de
diagnóstico se suministran en kits, para optimizar la sensibilidad
del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza
del ensayo, el protocolo, y el marcador, ya esté el anticuerpo o
compañero de unión marcado o no marcado, se proporciona
IL-D80 marcado. Esto usualmente va junto con otros
aditivos, tales como reguladores de pH, estabilizadores, materiales
necesarios para la producción de señales tales como substratos para
enzimas y similares. Preferiblemente, el kit también contendrá
instrucciones para uso apropiado y desecho de los contenidos después
del uso. Típicamente, el kit tiene compartimentos para cada
reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proporcionan como un
polvo seco liofilizado, donde los reactivos pueden reconstituirse
en un medio acuoso proporcionando concentraciones apropiadas de
reactivos para realizar el
ensayo.
ensayo.
Muchos de los constituyentes antes mencionados
de la clasificación de fármacos y los ensayos de diagnóstico pueden
utilizarse sin modificación o pueden modificarse en una variedad de
formas. Por ejemplo, el marcaje puede lograrse uniendo covalente o
no covalentemente una porción que directa o indirectamente
proporciona un señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, el
compañero de unión, el compuesto de prueba, IL-D80,
o anticuerpos para la misma pueden marcarse ya sea directa o
indirectamente. Las posibilidades para un marcaje directo incluyen
grupos marcadores: radiomarcadores tales como ^{125}I, enzimas
(patente de Estados Unidos Nº 3,645,090) tales como peroxidasa y
fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de Estados
Unidos Nº 3.940.475) capaces de verificar el cambio en la
intensidad de fluorescencia, desplazamiento de longitud de onda o
polarización de fluorescencia. Las posibilidades para un marcaje
indirecto incluyen biotinilación de un constituyente seguido por la
unión a avidina acoplada con uno de los grupos marcadores
anteriores.
También existen numerosos métodos para separar
la IL-D80 unida de la libre o alternativamente el
compuesto de prueba unido del libre. La IL-D80
puede inmovilizarse sobre varias matrices seguido por lavado. Las
matrices adecuadas incluyen plástico tal como una placa de ELISA,
filtros y perlas. Ver, por ejemplo, Coligan, y otros (eds. 1993)
Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Capítulo 2, Greene y Wiley,
N.Y. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin
limitación, el método de partícula magnetizable de anticuerpo de
fluoresceína descrito por Rattle, y otros (1984) Clin. Chem.
30:1457-1461, y la separación doble de partícula
magnética de anticuerpo como se describe en la patente de Estados
Unidos Nº 4.659.478.
Se han descrito extensamente en la bibliografía
métodos para unir proteínas o sus fragmentos a los diversos
marcadores, y no requieren de discusión detallada aquí. Muchas de
las técnicas involucran el uso de grupos carboxilo activados ya sea
a través del uso de carbodiimida o ésteres activos para formar
enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante la reacción
de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo,
o una olefina activada tal como maleimida, para formación de
enlaces, o similares. Las proteínas de fusión también encontrarán
uso en estas aplicaciones.
Otro aspecto de diagnóstico de esta invención
involucra el uso de secuencias de oligonucleótido o polinucléotido
tomadas de la secuencia de una IL-D80. Estas
secuencias pueden usarse como sondas para detectar niveles del
mensaje de IL-D80 en muestras de pacientes con
sospecha de tener una condición anormal, por ejemplo, inflamatoria
o autoinmune. Ya que la citocina puede ser un marcador o mediador
para la activación, esta puede ser útil para determinar los números
de células activadas para determinar, por ejemplo, cuando se puede
solicitar una terapia adicional, por ejemplo, de una forma
preventiva antes de que los efectos se presenten y progresen a
importantes. La preparación de secuencias de nucleótidos tanto de
ARN como de ADN, el marcaje de las secuencias y el tamaño preferido
de las secuencias ha recibido una amplia descripción y discusión en
la bibliografía. Ver, por ejemplo, Langer-Safer, y
otros (1982), Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79:4381-4385;
Caskey (1987) Science 236:962-967; y Wilchek y
otros (1988) Anal. Biochem 171:1-32.
También se contemplan kits de diagnóstico que
también prueban la expresión cualitativa o cuantitativa de otras
moléculas. La diagnosis o prognosis puede depender de la combinación
de múltiples indicaciones utilizadas como marcadores. De esta
manera, los kits pueden probar las combinaciones de marcadores. Ver,
por ejemplo, Viallet, y otros (1989) Progress in Growth Factor Res.
1:89-91. Se pueden utilizar otros kits para evaluar
otros subgrupos de células.
Habiendo aislado un ligando de una interacción
de ligando-receptor específica, existe un método
para aislar el receptor. Ver, por ejemplo, Gearing y otros, (1989)
EMBO J. 8:3667-3676. Por ejemplo, se pueden
determinar medios para marcar la citocina IL-D80
sin interferir con la unión a su receptor. Por ejemplo, se puede
fusionar un marcador de afinidad ya sea al terminal amino o
carboxilo del ligando. Dicho marcador puede ser una etiqueta de
epítopo FLAG, o por ejemplo, un dominio Ig o Fc. Se puede clasificar
una colección de expresión por la unión específica de la citocina,
por ejemplo, a través de clasificación de células u otra
clasificación para detectar subpoblaciones que expresan dicho
componente de unión. Ver, por ejemplo, Ho, y otros (1993) Proc.
Nat'l. Acad. Sci. USA 90:11267-11271; y Liu, y otros
(1994) J. Immunol. 152:1821-29. Alternativamente, se
puede utilizar un método de selección. Ver, por ejemplo, Seed y
Aruffo (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA,
84:3365-3669.
Se pueden aplicar técnicas de entrecruzamiento
de proteína con marcador, para aislar compañeros de unión de la
citocina IL-D80. Esto podría permitir la
identificación de proteínas que específicamente interactúan con la
citocina, por ejemplo, en una forma de tipo
ligando-receptor. Es una predicción que la
IL-D80 se unirá a la subunidad alfa de
IL-11R, o una subunidad de receptor estrechamente
homóloga. La subunidad beta del receptor probablemente va a ser
gp130, posiblemente con la implicación del receptor LIF como un
componente de receptor adicional.
Se realizarán experimentos anteriores, según se
pronosticó, para determinar si los componentes de receptor de
IL-11 conocidos están involucrados en respuestas
para IL-D80. También es bastante posible que estos
complejos de receptor funcionales puedan compartir muchos o todos
los componentes con un complejo de receptor de
IL-D80, ya sea una subunidad de receptor específica
o una subunidad de receptor accesoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Muchos de los métodos estándares que se
presentan a continuación se describen o hacen referencia a, por
ejemplo, Maniatis, y otros (1982) Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press,
N.Y.; Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(2a. ed.) Vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausebel, y
otros Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausebel
y otros (1987 y suplementos), Current Protocols in Molecular
Biology Wiley/Greene, NY; Innis, y otros (eds. 1990) PCR Protocols:
A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY. Los métodos
para la purificación de proteína incluyen métodos tales como
precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de columna,
electroforesis, centrifugación, cristalización, y otros. Ver, por
ejemplo, Ausebel y otros (1987 y suplementos periódicos); Deutscher
(1990) "Guide to Protein Purification", Methods and Enzymology
vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; Coligan, y otros (1995 y
suplementos) Current Protocols in Protein Science John Wiley and
Sons, Nueva York, NY; P. Matsudaira (ed. 1993) A Practical Guide to
Protein and Peptide Purification for Microsequencing Academia Press,
San Diego, CA; y bibliografía del fabricante sobre el uso de
productos de purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia,
Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La
combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a
segmentos apropiados (etiquetas de epítopo) por ejemplo, a una
secuencia de FLAG o un equivalente que puede fusionarse, por
ejemplo, a través de una secuencia removible de proteasa. Ver, por
ejemplo, Hochuli (1989) Chemishce Industrie
12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of
Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow
(ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods
12:87-98, Plenum Press, NY; y Crowe y otros (1992)
OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification
System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.
Las técnicas inmunológicas estándares se
describen, por ejemplo, en Hertzenberg, y otros (1996) Weir's
Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4,
Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology,
Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology vols. 70, 73, 74, 84,.
92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, y 163. Los ensayos de
citocina se describen, por ejemplo, en Thomson (ed. 1998) The
Cytokine Handbook (3a. ed.) Academic Press, San Diego;
Mire-Sluis y Torpe (1998) (3a. ed.) Academic Press,
San Diego; Mire-Sluis y Torpe (1998) Cytokines
Academic Press, San Diego; Metcalf y Nicola (1995) The Hematopoietic
Colony Stimulating Factors Cambridge University Press, y Aggarwal y
Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.
Los ensayos para actividades biológicas
vasculares son bien conocidos en la técnica. Cubrirán actividades
angiogénicas y angioestáticas en tumores, u otros tejidos, por
ejemplo, proliferación de músculo liso arterial (ver, por ejemplo,
Koyoma y otros (1996) Cell 87:1069-1078), adhesión
de monocito al epitelio vascular (ver, McEvoy, y otros (1997) J.
Exp. Med. 185:2069-2077), etc. También ver Ross
(1993) Nature 362:801-809; Rekhter y Gordon (1995)
Am. J. Pathol. 147:668-677; Thyberg y otros (1990)
Atherosclerosis 10:966-990; y Gumbiner (1996) Cell
84:345-
357.
357.
Los ensayos para actividades biológicas de
célula neural se describen en, por ejemplo, Wouterlood (ed. 1995)
Neuroscience Protocols módulos 10, Elsevier; Methods in
Neurosciences, Academic Press; y Neuromethods, Humana Press,
Totowa, NJ. La metodología de sistemas de desarrollo se describe,
por ejemplo, en Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and
Developmental Biology, CRC Press; y Chrispeels (ed.) Molecular
Techniques and Approaches in Developmental Biology,
Intescience.
Los análisis de FACS se describen en Melamed, y
otros (1990) Floy Cytometry and Sorting Wiley-Liss,
Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry,
Liss, Nueva York, NY; y Robinson y otros, (1993) Handbook of Flow
Cytometry Methods, Wiley-Liss, Nueva York, NY.
Las secuencias de genes de primate, por ejemplo,
ser humano, se proporcionan en la Tabla 1. Estas secuencias se
derivan de una base de datos de secuencia. Estas secuencias permiten
la preparación de cebadores de PCR, o sondas, para determinar la
distribución celular del gen. Estas secuencias permiten el
aislamiento de ADN genómico que codifica el mensaje.
Al utilizar la sonda o cebadores de PCR, se
sondan varios tejidos o tipos de célula para determinar la
distribución celular. Los productos de PCR se clonan utilizando,
por ejemplo, un kit de clonación TA (Invitrogen). Los plásmidos de
ADNc resultantes se secuencian a partir de ambos extremos en un
secuenciador automático (Applied
Biosystems).
Biosystems).
Se prepararon una sonda o cebadores apropiados
específicos para ADNc que codifica IL-D80 de
primate. Típicamente, la sonda está marcada, por ejemplo, por
cebado aleatorio.
Análisis de Southern: Se digirió ADN (5 \mug)
a partir de una colección de ADNc amplificado primaria, con enzimas
de restricción apropiadas para liberar los insertos, operando en gel
de agarosa al 1% y se transfirieron a una membrana de nylon
(Schleicher y Schuell, Keene, NH).
Las muestras para el asilamiento de ARNm humano
pueden incluir: células mononucleares de sangre periférica
(monocitos, células T, células NK, granulocitos, células B), en
reposo (T100); células mononucleares de sangre periférica,
activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 12 horas de
combinación (T101); célula T, clon THO Mot 72, en reposo (T102);
célula T clon TH0 Mot 72, activado con anti-CD28 y
anti-CD3 durante 3, 6, 12 horas de combinación
(T103); célula T, clon TH0 Mot 72, anérgica tratada con péptido
especifico durante 2, 7, 12 horas en combinación (T104); célula T,
clon TH1, HY06, en reposo (T107); célula T, clon TH1 HY06, activado
con anti-CD28 y anti-CD3 durante,
3, 6, 12 horas en combinación (T108); célula T, clon TH1 HY06,
anérgico tratado con péptido específico durante 2, 6, 12 horas en
combinación (T109); célula T, clon TH2, HY935 en reposo (T110);
célula T, TH2, clon HY9035, activado con anti-CD28
y anti-CD3 durante 2, 7, 12 horas en combinación
(T111); líneas de tumor de célula T Jurkat y Hut 78, en reposo
(T117); clones de célula T, combinados AD130.2, Tc783.12, Tc783.13,
Tc783.58, Tc782.69, en reposo (T118); clones de célula T \gammad
aleatorios de célula T en reposo (T119); clon de célula T de CD28;
esplenocitos en reposo (B100); esplenocitos, activados con
anti-CD40 e IL-4 (B101); líneas de
EBV de célula B combinadas con WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3,
HSY, en reposo (B102); línea de célula B JY, activada con PMA y
ionomicina durante 1, 6 horas en combinación (B103); clones de NK20
combinados, en reposo (K100); clones de NK20 combinados, activados
con PMA y inonomicina durante 6 horas (k101); clon NKL derivado de
sangre periférica de un paciente con leucemia LGL,
IL-2 tratada (K106); línea de precursor
hematopoyético TF1, activada con PMA y ionomicina durante 1, 6
horas combinada (C100); línea premonocítica U937, en reposo (M100);
línea premonocítica U937, activada con PMA y ionomicina durante 1, 6
horas en combinación (M101); monocitos elutriados, activados con
LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante
1, 2, 6, 12, 24 horas en combinación (M102); monocitos elutriados,
activados con LPS, IFN\gamma, IL-10 durante 1, 2,
6, 12, 24 horas en combinación (M103); monocitos elutriados,
activados con LPS, IFN\gamma,
anti-IL-10 durante 4, 16 horas en
combinación (M106); monocitos elutriados, activados con LPS,
IFN\gamma, IL-10 durante 4, 6, 12, 24 horas en
combinación (M107); monocitos elutriados, activados con LPS,
durante 1, hora (M108); monocitos elutriados, activados con LPS
durante 6 horas (M109); DC 70% CD1a+, de CD34+
GM-CSF, TNF\alpha 12 días, en reposo (D101); DC
70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días,
activados con PMA y ionomicina durante una hora (D102); DC 70%
CD1a+, de CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días,
activados con PMA y ionomicina durante una 6 horas (D103); DC 95%
CD1a+, de CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días
clasificados por FACS, activados con PMA y ionomicina durante una 1,
6 horas en combinación (D104); DC 95% CD14+, ex CD34+
GM-CSF, TNF\alpha 12 días clasificados por FACS,
activados con PMA y ionomicina durante una 1, 6 horas en
combinación (D105); DC CD1a+, de CD86+ de GM-CSF,
TNF\alpha 12 días clasificados por FACS, activados con PMA y
ionomicina durante una 1, 6 horas en combinación (D106); DC de
monocitos GM-CSF, IL-4, 5 días, en
reposo (D107); DC de monocitos GM-CSF,
IL-4, 5 días, en reposo (D108); DC de monocitos
GM-CSF, IL-4, 5 días, activado con
LPS durante 4, 16 horas en combinación (D109); DC de monocitos
GM-CSF, IL-4, 5 días, TNF\alpha
activado, monocito durante 4, 16 horas en combinación (D110);
células epiteliales, no estimuladas; células epiteliales, activadas
con IL-1\beta; línea de sarcoma de fibroblasto de
pulmón MRC5, activada con PMA y ionomicina durante 1, 6 horas en
combinación (C101); línea de célula de carcinoma epitelial de riñón
CHA, activado con PMA y ionomicina durante 1, 6 horas en combinación
(C102).
Se identificó un homólogo de roedor, por
ejemplo, un ratón, y sus distribuciones se evaluaron de forma
similar. Las muestras para aislamiento de ARNm de ratón pueden
incluir: línea de célula L fibroblástica de ratón en reposo (C200);
células transfectadas con Braf:ER (fusión de Braf al receptor de
estrógeno), control (C201); células T naturales de Mel14+ de bazo,
en reposo (T209); células T naturales Mel14+ de bazo, estimuladas
con IFN\gamma, IL-12, y anti IL-4
para polarizar a células TH1, expuestas a IFN\gamma durante 6, 12,
24 horas en combinación (T210); células T naturales de Mel14 de
bazo estimuladas con IL-4 y
anti-IFN\gamma para polarizar a células th2,
expuestas a IL-4 y IFN\gamma durante 6, 13, 24
horas, en combinación (T211); células T, polarizadas con TH1 (Mel14
brillante, células CD4+ de bazo polarizadas durante 7 días con
IFN-\gamma y anti IL-4;T200);
células T, TH2 polarizadas (Mel14 brillante, células CD4+ de bazo,
polarizadas durante 7 días con IL-4 y
anti-IFN-\gamma;T201); células T,
altamente polarizadas 3 veces con TH1 a partir de Babl/transgénico
(ver, Openshaw, y otros. (1995) J. Exp. Med.
182:1357-1367; activado con anti-CD3
durante 2, 6, 24 horas en combinación T202); células T, altamente
polarizadas 3 veces con TH2 de Balb/c transgénico durante 2, 6, 24
horas en combinación (T203); células T, altamente polarizadas 3
veces con TH1 de C57 bl/6 transgénico (activado con
anti-CD3 durante 2, 6, 24 horas en combinación;
T212); células T, altamente polarizadas 3 veces con TH2 de C57 bl/6
transgénico (activado con anti-CD3 durante 2, 6, 24
horas en combinación; T213); células, altamente polarizadas con TH1
(células T de CD4+ naturales de Blab/c transgénico polarizadas 3
veces con IFN\gamma, IL-12 y
anti-IL4; estimuladas con IGIF,
IL-12, y anti IL-4 durante 6, 12, 24
horas, en combinación), células pre-T CD44- CD25+,
clasificadas de timo (T204); clon de célula T, TH1, D1.1, en reposo
durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno
(T205); célula T TH1 clon D1.1, 10\mug/ml de ConA estimulado
durante 15 horas (T206); clon de célula T de TH2, CD35 en reposo
durante 3 semanas después de última estimulación con antígeno
(T207); clon de célula T TH2, CD35, 10 \mug/ml de ConA estimulada
durante 15 horas (T208); línea de célula B no estimulada CH12
(B201); línea de célula de leucemia de célula B madura no estimulada
A20 (B200); células B grandes no estimuladas de bazo (B202);
células B de bazo total, activadas con LPS (B203); células
dendríticas ricas en metrizamida de bazo, en reposo (D200); células
dendríticas de médula ósea, en reposo (D201); células dendrítica
derivadas de médula ósea no estimuladas carentes de anti B220, anti
CD3 y anti-Clase II, cultivadas en
GM-CSF y IL-4 (D202); células
dendríticas derivadas de médula ósea, carentes de anti B220, anti
CD3, y anti-Clase II, cultivadas en
GM-CSF y IL-4, estimuladas con
anti-CD40 durante 1, 5 días, en combinación (D203);
línea de célula de monocito RAW 264.7 activada con LPS durante 4
horas (M200); macrófagos de médula ósea derivados con GM y CSF
(M201); macrófagos de médula ósea derivados con
GM-CSF, estimulados con LPS, IFN\gamma, y
IL-10 durante 24 horas (M205); macrófagos de médula
ósea derivados con GM-CSF, estimulados con LPS,
IFN\gamma, y anti IL-10 durante 24 horas (M206);
macrófagos peritoneales (M207); línea de célula de macrófago J774,
en reposo (M202); línea de célula de macrófago J774 + LPS +
anti-IL-10 a 0.5, 1, 3, 6, 12 horas
en combinación (M203); línea de célula de macrófago J774 + LPS +
IL-10 a 0.5, 1, 3, 5, 12, horas en combinación
(M204); líneas de células cebadas no estimuladas
MC-9 y MCP-12 (M208); línea de
célula endotelial inmortalizada derivada de células endoteliales
microvasculares de cerebro, no estimulada (E200); línea de célula
endotelial inmortalizada derivada de células endoteliales
microvasculares de cerebro, estimulada durante la noche con
TNF\alpha (E201); línea de célula endotelial inmortalizada
derivada de células endoteliales microvasculares de cerebro,
estimulada durante la noche con TNF\alpha (E202); línea de célula
endotelial inmortalizada derivada de células endoteliales
microvasculares de cerebro, estimulada durante la noche con
TNF\alpha y IL-10 (E203); aorta total de ratón wt
C57 bl/6; aorta total de ratón ApoE KO de 5 meses (X207); aorta
total de ratón ApoE KO de 12 meses (X207); timo wt (O214); timo
total rag-1 (0208); riñón total,
rag-1 (0209); riñón total, ratón NZ B/W; y corazón
total, rag-1 (0202). Se detectó una alta señal en
la línea de célula de monocito RAW 264.7 activada con LPS durante 4
horas (M200); células T, altamente polarizadas 3 veces con TH1 de
C57 bl/6 transgénico (activado con anti-CD3 durante
2, 6, 24 horas en combinación; T212); y células T, altamente
polarizadas con TH1 (células T CD4+ naturales de Balb/C,
transgénico, polarizadas 3 veces con IFN\gamma,
IL-12 y ant-IL-4;
estimuladas con IGIF, IL-12, y
anti-IL-4 durante 6, 12, 24 horas,
en combinación).
Se utilizó un ADNc aislado que codifica la
IL-D80. El mapeo de cromosoma es una técnica
estándar. Ver, por ejemplo, BIOS Laboratorios (New Haven, CT) y
métodos para utilizar un panel híbrido de células somáticas de
ratón con PCR.
Se clasificaron múltiples líneas de células
transfectadas para una que exprese la citocina a un nivel alto
comparado con otras células. Varias líneas de células se
clasificaron y seleccionaron por sus propiedades favorables en el
manejo. Se puede aislar IL-D80 natural de fuentes
naturales, a través de la expresión de una célula transformada
utilizando un vector de expresión apropiado. La purificación de la
proteína expresada se logra a través de procedimientos estándares,
o se puede combinar con medios diseñados por ingeniería para la
purificación efectiva a alta eficiencia a partir de lisados de
células o sobrenadantes. Se pueden utilizar segmentos FLAG o
His_{6} para cada uno de estos aspectos de purificación.
Alternativamente, se puede utilizar la cromatografía de afinidad
con anticuerpos específicos, como se ve más adelante.
Se produce proteína en sistemas de expresión de
E. coli, célula de insecto o de mamífero, según se desee. Se
preparó una construcción de IL-D80 con una extensión
de etiqueta de epítopo, por ejemplo, FLAG. La construcción se
expresó en forma pasajera en células 293 y se purificó a partir de
sobrenadante utilizando técnicas de columna de inmunoafinidad de
etiqueta. Se obtuvo como resultado una proteína altamente
purificada.
El ADNc de IL-D80, u otra
secuencia homóloga de especie, se pueden utilizar como una sonda de
hibridación para clasificar una colección a partir de una fuente
deseada, por ejemplo, una colección de ADNc de células de primate.
Se pueden clasificar muchas especies diferentes tanto para
rigurosidad necesaria para una fácil hibridación, como para la
presencia utilizando una sonda. Se utilizarán condiciones de
hibridación apropiadas para seleccionar los clones que exhiben
carácter específico de hibridación cruzada.
La clasificación a través de hibridación
utilizando sondas degeneradas basadas en la secuencia del péptido
también permitirán el aislamiento de clones apropiados.
Alternativamente, el uso de cebadores apropiados para la
clasificación por PCR producirá un enriquecimiento de clones de
ácidos nucleicos apropiados.
Métodos similares son aplicables para aislar
variantes de especie, polimórficas o alélicas. Las variantes de
especie se aíslan utilizando técnicas de hibridación de especie
cruzada basándose en el aislamiento de un aislado o fragmento de
longitud completa de una especie como una sonda.
Alternativamente, los anticuerpos que surgen
contra IL-D80 humana se usarán para clasificar
células que expresen proteína de reactividad cruzada a partir de
una colección apropiada, por ejemplo, de ADNc. La proteína
purificada o péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos
a través de métodos estándares, como se describió anteriormente.
Los péptidos sintéticos o proteínas purificadas se presentan a un
sistema inmune para generar anticuerpos monoclonales o
policlonales. Ver, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in
Immunology Wiley/Greene; y Harlow y lane (1989) Antibodies: A
Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Los anticuerpos
resultantes se usan para la clasificación, purificación o
diagnóstico, como se describió.
Se presentan péptidos sintéticos o proteína
purificada a un sistema inmune para generar anticuerpos monoclonales
o policlonales. Ver, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols
in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989) Antibodies; A
Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Se puede preparar suero
policlonal o hibridomas. En situaciones apropiadas, el reactivo de
unión se marca como se describió anteriormente, por ejemplo, con
fluorescencia o de otra manera, o se inmoviliza a un sustrato para
métodos de selección. Las técnicas de inmunoselección, de
absorciones y técnicas relacionadas están disponibles para preparar
reactivos selectivos, por ejemplo, exhibiendo el espectro deseado
de selectividad para unión.
Se probaron las actividades biológicas de
IL-D80, basándose, en parte, en la homología de
secuencia y estructural entre IL-D80 y
IL-11. Inicialmente, se examinaron ensayos que
muestran actividades biológicas de IL-11. Ver, por
ejemplo, Jacobsen (1998) en Thomson The Cytokine Handbook Academic
Press.
Se evaluó el efecto sobre la proliferación o
diferenciación de varios tipos de célula con varias concentraciones
de citocina. Se realizó un análisis de respuesta a la dosis, en
ciertos casos en combinación con otras citocinas, por ejemplo,
aquellas que sinergizan con la citocina relacionada
IL-11. Estas incluyen, por ejemplo,
IL-1, IL-4, IL-6,
IL-12, LIF, G-CSF,
M-CSF, GM-CSF, IL-3,
TPO, ligando de kit o ligando Flt.
En particular, IL-11 exhibe
actividades sinergísticas sobre células madre. La
IL-D80 se ensayará en células de sangre de cordón
para ver si tiene efecto sobre la proliferación o diferenciación de
células progenitoras tempranas derivadas de las mismas. De
preferencia, la células son células precursoras tempranas por
ejemplo, células madre, que se originan de, por ejemplo, sangre del
cordón, médula ósea, timo, bazo, o células progenitoras CD34+. La
citocinas se ensayarán para efectos sobre precursores mieloides y/o
eritoides incluyendo precursores de célula B.
Se aislaron PBMC de capa
leuco-plaquetarias de donadores sanos normales a
través de centrifugación en ficoll-hypaque como se
describió (Boyum, y otros). Las PBMC se cultivaron en 200 \mul del
medio Yssel (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) conteniendo uno por
ciento de suero AB humano en placas de 96 cavidades (Falcon
Becton-Dickinson, NJ) en ausencia o presencia de
IL-D80, sola son combinación con otras citocinas.
Las células se cultivaron sólo en medio o en combinación con 100
U/ml de IL-2 (R&D Systems) durante 120 horas. Se
agregó 3H-timidina (0.1 mCi) durante las últimas 6
horas de cultivo y la incorporación de 3H-timidina
se determinó a través de recuento de escintilación líquida.
Las proteínas nativas, recombinantes y de fusión
se ensayarían para actividad agonista y antagonista en muchos otros
sistemas de ensayos biológicos, por ejemplo en células T, células B,
NK, macrófagos, células dendríticas, progenitores hemotopoyéticos,
etc.
La IL-D80 se evaluó para
actividad agonista o antagonista en células transfectadas que
expresan el receptor de IL-11 y controles.
La IL-D80 se evaluó para
efectos, sola o en combinación con otras citocinas, en activación de
macrófago/célula dendrítica y ensayos de presentación de antígeno,
producción de citocina de célula T y proliferación en respuesta a
antígeno o estímulo alogénico. Ver, por ejemplo, de Waal y otros,
(1991) J. Exp. Med. 174:1209-1220; de Waal Malefyt
y otros, (1991) J. Exp. Med 174:915-924; Fiorentino,
y otros (1991) J. Immunol. 147: 3815-3822;
Fiorentino y otros (1991) J. Immunol. 146:
3444-3451; y Groux y otros (1996) J. Exp. Med.
184:19-29.
La IL-D80 también se evaluó para
efectos sobre la estimulación de células NK. Los ensayos se pueden
basar en, por ejemplo, Hsu, y otros, (1992) Internat. Immunol.
4:563-569; y Schwartz, y otros (1994) J. Immunother.
16:95-104. Se aplicaron otros ensayos para evaluar
los efectos sobre células T citotóxicas y células LAK. Ver, por
ejemplo, Namien Y Mire-Sluis (1998).
Se analizó los efectos de crecimiento y
diferenciación de células B, por ejemplo, a través de la metodología
descrita en, por ejemplo, Defrance, y otros (1992) J. Exp. Med,
175:671-682; Rousset, y otros (1992) Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA 889:1890-1893; incluyendo ensayos de
factor de cambio IgG2 e IgA2. Observar que, a diferencia de los
sobrenadantes COS7, los sobrenadantes de NIH3T3 y COP aparentemente
no interfieren con ensayos de células B humanas.
Se purificaron monocitos a través de selección
negativa a partir de células mononucleares de sangre periférica de
donadores sanos normales. En resumen, se incubaron 3 x 10^{8}
células mononucleares en banda de ficoll sobre hielo con un cóctel
de anticuerpos monoclonales (Becton-Dickinson;
Mountain View, CA) que consistía en, por ejemplo, 200 \mul de
\alphaCD2 (Leu-5A), 200 \mul de \alphaCD3
(Leu-4), 100 \mul de \alphaCD8 (Leu 2a), 100
\mul de \alphaCD19 (Leu12), 100 \mul de \alphaCD20
(Leu-16),, 100 \mul de \alphaCD56
(Leu-19), 100 \mul de \alphaCD67 (IOM 67;
Immunotech, Westbrook, ME) y anticuerpo
anti-glicoforina (10F7MN, ATCC, Rockville, MD). Las
células unidas al anticuerpo se lavaron y después se incubaron con
perlas magnéticas acopladas a IgG de antirratón de cabra (Dynal,
Oslo, Noruega) a una relación de perla a célula de 20:1. Las
células unidas al anticuerpo se separaron de los monocitos a través
de la aplicación de un campo magnético. Posteriormente, se
cultivaron los monocitos humanos en el medio de Yssel (Gemini
Bioproducts, Calabasas, CA) contiendo 1% de suero AB humano en
ausencia o presencia de IL-D80, sola o en
combinación con otras citocinas.
Se pueden realizar análisis para la expresión de
moléculas de superficie de célula a través de inmunofluorescencia
directa. Por ejemplo, se incubaron 2 x 10^{5} monocitos
purificados en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS)
conteniendo uno por ciento de suero humano sobre hielo durante 20
minutos. Las células se sedimentaron a 200 x g. Las células se
volvieron a suspender en 20 ml de PE o mAb marcado con FITC. Después
de una incubación adicional de 20 minutos sobre hielo, las células
se lavaron en PBS conteniendo uno por ciento de suero humano
seguido por los dos lavados en PBS solo. Las células se fijaron en
PBS conteniendo 1% de paraformaldehído y se analizaron en un
citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson; Mountain View, CA).
Los mAb ilustrativos utilizados son, por ejemplo: CD11b
(anti-macl), CD11c (anti-gp150/95),
CD14 (Leu-M3), CD54 (Leu 54), CD80
(anti-BB1/B7), HLA-DR (L243) de
Becton-Dickinson y CD86 (FUN 1; Pharmingen), CD64
(32.2; Medarex), CD40 (mAb89; Schering-Plouge
Francia).
Se aislaron monocitos humanos como se describió
y se cultivaron en el medio de Yssel (Gemini Bioproducts,
Calabasas, CA) conteniendo 1% de suero AB humano en ausencia o
presencia de IL-D80 (dilución de 1/100 de material
expresado en baculovirus). Además, los monocitos se estimularon con
LPS (E. Coli 0127:B8 Difco) en ausencia o presencia de
IL-D80 y la concentración de citocinas
(IL-1\beta, IL-6, TNF\alpha,
GM-CSF, y IL-10) en el sobrenadante
del cultivo de células se determinó a través de ELISA.
Para tinción intracitoplásmica para citocinas,
se cultivaron monocitos (1 millón/ml) en el medio de Yssel, en
ausencia o presencia de IL-D80 y LPS (E.
coli, 0127:B8 Difco) y 10 mg/ml de Brefeldin A (Epicentro
technologies Madison WI) durante 12 horas. Las células se lavaron
en PBS y se incubaron en una solución de formaldehído al 2%/PBS
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las
células se lavaron, se volvieron a suspender en regulador de pH de
permeabilización (0.5% saponina (Sigma) en PBS/BSA (0.5%)/Azida (1
mM) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las
células (2 x 10^{5}) se centrifugaron y se volvieron a suspender
en 20 ml de mAb anti-citocina directamente
conjugados diluidos a 1:10 en regulador de pH de permeabilización
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los siguientes
anticuerpos pueden utilizarse:
Il-1\alpha-PE
(364-3B3-14);
IL-5-PE (MQ2-13A5);
TNF\alpha-PE (MAb11);
GM-CSF-PE
(BVD2-21C11); y
Il-12-PE (C11.5.14; pharmingen san
Diego, CA). Posteriormente, las células se lavaron dos veces en el
regulador de pH de permeabilización y una vez en PBS/BSA/Azida y se
analizaron en un citómetro de flujo FASCcan (Becton Dickinson;
Mountain View, CA).
Se ensayarán ensayos adicionales en las áreas de
remodelación de huesos, condriocitos, neuronas, adipocitos,
epitelio gastrointestinal o epitelio bronquial.
Se pueden generar ratones transgénicos a través
de métodos estándares. Tales animales son útiles para determinar
los efectos de eliminación del gen, en tejidos específicos o
completamente en todo el organismo. Esto puede proporcionar nuevas
percepciones interesantes en el desarrollo del animal o tejidos
particulares en varias etapas. Además, se puede evaluar el efecto
sobre varias respuestas a la tensión biológica. Ver, por ejemplo,
Hogan, y otros (1995) Manipulatin the Mouse Embryo: A Laboratory
Manual, (2a. ed). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
<110> Schering Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Citocinas de Mamífero; Reactivos
Relacionados
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DX01040K1 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/364.674
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-07-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/369.643
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-08-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate: supuesto Homo
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate: supuesto Homo
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1098
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> roedor: supuesto Mus
musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1098)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n puede ser a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> roedor: supuesto Mus
musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> primate: supuesto Homo
sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip0,8cm
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<211> 199
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<212> PRT
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<213> roedor: supuesto Mus
musculus
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<400> 6
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 732
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate: supuesto Homo
sapiens
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<400> 7
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\hskip0,8cm
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<210> 8
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<211> 243
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate: supuesto Homo
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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\hskip0,8cm
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<210> 9
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<211> 991
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<212> ADN
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<213> roedor: supuesto Mus
musculus
\newpage
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<400> 9
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\hskip0,8cm
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<210> 10
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<211> 234
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<212> PRT
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<213> roedor: supuesto Mus
musculus
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<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (57)
1. Un polinucleótido aislado o recombinante que
codifica un polipéptido que comprende el polipéptido maduro
de:
de:
- a)
- la SEC ID Nº: 2;
- b)
- la SEC ID Nº: 4;
- c)
- la SEC ID Nº: 8; o
- d)
- la SEC ID Nº: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un polinucleótido aislado o recombinante que
codifica un polipéptido que comprende el polipéptido maduro de la
SEC ID Nº: 2.
3. Un polinucleótido aislado o recombinante que
codifica un polipéptido que comprende el polipéptido maduro de la
SEC ID Nº: 8.
4. Un vector de expresión que comprende el
polinucleótido de la reivindicación 1.
5. Una célula huésped aislada que comprende el
vector de expresión de la reivindicación 4.
6. Un método para preparar un polipéptido que
comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 5 en
condiciones en las que se exprese el polinucleótido.
7. Un método para detectar un polinucleótido de
la reivindicación en una muestra que comprende poner en contacto la
muestra con un sonda en condiciones de hibridación severas.
8. Un kit para detectar un polinucleótido de la
reivindicación 1 que comprende un compartimento que contienen una
sonda que hibrida en condiciones de hibridación severas de al menos
65ºC y menos de aproximadamente 150 mM de sal con al menos 17
nucleótidos contiguos de un polinucleótido de la reivindicación 1
para formar un dúplex.
9. El kit de la reivindicación 8, en el que
dicha sonda es una sonda marcada de forma detectable.
10. Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo
que:
- 1)
- se une específicamente al polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2;
- 2)
- se une específicamente al polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 4;
- 3)
- se une específicamente al polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 8;
- 4)
- se une específicamente al polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo
que se une específicamente al polipéptido maduro de la SEC ID Nº:
2.
12. Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo
que se une específicamente al polipéptido maduro de la SEC ID Nº:
8.
13. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que es un anticuerpo monoclonal.
14. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que es un fragmento Fv.
15. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que es un fragmento Fab.
16. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que es un fragmento
F(ab)2.
17. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que es un anticuerpo policlonal.
18. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que está marcado de forma detectable.
19. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que es estéril.
20. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que está en una composición de pH
regulado.
21. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10, que estimula la actividad del polipéptido
maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
22. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que inhibe la unión a receptor del
polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
23. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 1 mM con el
polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
24. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 100 \muM
con el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
25. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 30 \muM
con el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
26. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 10 \muM
con el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
27. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 3 \muM
con el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
28. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 100 nM con
el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
29. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 30 nM con
el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
30. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 10 nM con
el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
31. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo
de la reivindicación 10 que presenta una Kd de al menos 3 nM con el
polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2 u 8.
32. Un método para usar el anticuerpo o
fragmento de unión del mismo de la reivindicación 10, que comprende
poner en contacto dicho anticuerpo o fragmento de unión del mismo
con una muestra biológica que comprende un antígeno, donde dicho
contacto da como resultado la formación de un complejo
antígeno:anticuerpo.
33. El método de la reivindicación 32, en el que
dicha muestra biológica es de un ser humano.
34. Un kit de detección que comprende dicho
anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la reivindicación 10
y:
- a)
- material de instrucciones para el uso de dicho anticuerpo o fragmento de unión del mismo.
- b)
- un compartimento que proporcione la segregación de dicho anticuerpo o fragmento de unión del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
35. Un polipéptido sustancialmente puro o
aislado que comprende:
- a)
- el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2;
- b)
- el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 4;
- c)
- el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 8; o
- d)
- el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 10.
\vskip1.000000\baselineskip
36. Un polipéptido sustancialmente puro o
aislado que comprende el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 2.
37. Un polipéptido sustancialmente puro o
aislado que comprende el polipéptido maduro de la SEC ID Nº: 8.
38. El polipéptido de la reivindicación 35, que
es un polipéptido soluble.
39. El polipéptido de la reivindicación 35, que
está marcado de forma detectable.
40. El polipéptido de la reivindicación 35, que
está en una composición estéril.
41. El polipéptido de la reivindicación 35, que
está en una composición de pH regulado.
42. El polipéptido de la reivindicación 35, que
se une a un receptor de superficie celular.
43. El polipéptido de la reivindicación 35, que
se produce de forma recombinante.
44. Una formulación farmacéutica que comprende
el polipéptido de la reivindicación 36 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
45. Una formulación farmacéutica que comprende
el polipéptido de la reivindicación 37 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
46. La composición farmacéutica de la
reivindicación 44 que está liofilizada.
47. La composición farmacéutica de la
reivindicación 45 que está liofilizada.
48. La composición farmacéutica de la
reivindicación 44 en la que el vehículo comprende agua.
49. La composición farmacéutica de la
reivindicación 45 en la que el vehículo comprende agua.
50. La composición farmacéutica de la
reivindicación 44 en la que el vehículo comprende solución
salina.
51. La composición farmacéutica de la
reivindicación 45 en la que el vehículo comprende solución
salina.
52. La composición farmacéutica de la
reivindicación 44 en la que el vehículo comprende regulador de
pH.
53. La composición farmacéutica de la
reivindicación 45 en la que el vehículo comprende regulador de
pH.
54. La composición farmacéutica de la
reivindicación 44 que es una formulación oral, rectal, nasal, tópica
o parenteral.
55. La composición farmacéutica de la
reivindicación 54 que es una formulación parenteral.
56. La composición farmacéutica de la
reivindicación 45 que es una formulación oral, rectal, nasal, tópica
o parenteral.
57. La composición farmacéutica de la
reivindicación 56 que es una formulación parenteral.
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