ES2330692T3

ES2330692T3 - Uso de toxina botulinica para aliviar dolor testicular.

Info

Publication number: ES2330692T3
Application number: ES07811857T
Authority: ES
Inventors: Gregory F. Brooks
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2006-05-02
Filing date: 2007-04-26
Publication date: 2009-12-14
Anticipated expiration: 2027-04-26
Also published as: ATE444076T1; US20070259000A1; US7811586B2; DE602007002625D1; EP2012811A1; WO2007143294A1; EP2012811B1

Abstract

Una toxina botulínica para uso en un método para aliviar un dolor testicular, comprendiendo el método la etapa de administrar localmente la toxina botulínica a por lo menos un sitio anatómico seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) un testículo; y (b) un tejido asociado con el testículo; aliviando así el dolor testicular.

Description

Uso de toxina botulínica para aliviar dolor testicular.

Antecedentes

La presente invención se refiere a una toxina botulínica para uso en un método para aliviar un dolor testicular, en particular un método para tratar un dolor testicular crónico.

Un dolor testicular (orquialgia) puede ser una dolencia de duración breve o una dolencia de larga duración. Cuando un dolor testicular dura tres meses o más, se denomina dolor testicular crónico.

Un dolor testicular puede interferir de modo importante con las actividades cotidianas del paciente. Por desgracia, el dolor testicular crónico parece un problema creciente entre la población masculina (Granitsiotis y col., European Urology (2004) 45:430-436). Por otra parte, el tratamiento del paciente con dolor testicular crónico es a menudo difícil y ocupa una cantidad considerable del tiempo de la mayoría de los urólogos.

El dolor testicular crónico puede asociarse con (por ejemplo, estar causado por) diferentes etiologías como traumatismo, infección, hidrocele, varicocele, tumor testicular, vasectomía. Casi el 25% de estos casos son de origen desconocido. Convencionalmente, el método para aliviar un dolor testicular crónico es no quirúrgico, lo que incluye la administración de antibióticos, analgésicos, medicaciones antiinflamatorias y bloqueos regionales de nervios. Sin embargo, estos tratamientos no quirúrgicos pueden no aliviar adecuadamente el dolor. Cuando el tratamiento convencional fracasa, el siguiente curso de terapia no está claro. Los médicos han intentado métodos radicales, por ejemplo, orquiectomía inguinal, para aliviar el dolor. Sin embargo, estos métodos radicales tienen un éxito limitado. Por ejemplo, se ha comunicado que hasta el 80% de los pacientes que se han sometido a una orquiectomía inguinal no experimentan un alivio adecuado del dolor después de la operación.

Genitales masculinos

Los genitales masculinos incluyen los testículos, los conductos deferentes, las vesículas seminales, los conductos eyaculadores, el pene y estructuras accesorias.

Los testículos son dos órganos glandulares, que secretan el semen. Están suspendidos en el escroto por los cordones espermáticos (fig. 1 y 2). Las cubiertas de los testículos son la piel, la túnica dartos, la fascia intercrural, el escroto, el cremáster, la fascia infundibuliforme, la tunica vaginalis y la fascia intercrural.

El escroto es una bolsa cutánea que contiene los testículos y partes de los cordones espermáticos. Está dividido en su superficie en dos partes laterales por una cresta o rafe, que continúa hacia delante hasta la superficie inferior del pene, y hacia atrás, a lo largo de la línea media del perineo hasta el ano. De estas dos partes laterales, la izquierda cuelga más abajo que la derecha, en correspondencia con la mayor longitud del cordón espermático izquierdo. El escroto consiste en dos capas, el integumento y la túnica dartos. El integumento es muy fino, de un color parduzco, y generalmente está envuelto en pliegues o arrugas. Está provisto de folículos sebáceos, cuya secreción tiene un olor peculiar, y está erizado de pelos crespos finamente dispersos, cuyas raíces se ven a través de la piel. La túnica dartos (tunica dartos) es una fina capa de fibras musculares no rayadas, continuas, alrededor de la base del escroto, con las capas de la fascia superficial de la ingle y el perineo; proyecta hacia dentro un tabique, que divide la bolsa escrotal en dos cavidades para los testículos, y se extiende entre el rafe y la superficie inferior del pene, hasta su raíz.

La Fascia Intercrural (fascia intercolumnar o fascia espermática externa) es una fina membrana, prolongada hacia abajo alrededor de la superficie del cordón y el testículo (véase página 411). Está separada de la túnica dartos por tejido areolar poco firme.

El Cremáster consiste en haces dispersos de fibras musculares conectadas conjuntamente en una cubierta continua por tejido areolar intermedio.

La Fascia Infundibuliforme (tunica vaginalis communis [testis et funiculi spermatici]) es una fina capa, que reviste el cordón de manera poco firme; es una continuación hacia abajo de la fascia transversal.

Los nervios son las ramas ilioinguinal y lumboinguinal del plexo lumbar, las dos ramas perineales superficiales del nervio pudendo interno y la rama pudenda del nervio cutáneo femoral posterior.

El cordón espermático (funiculus spermaticus) (fig. 2) se extiende desde el anillo inguinal abdominal, en el que convergen las estructuras de las que está compuesto, a la parte posterior del testículo. En la pared abdominal el cordón pasa en oblicuo a lo largo del conducto inguinal, tendiéndose al principio bajo el obliquus internus, y sobre la fascia transversal; pero más cerca del pubis, descansa en los ligamentos inguinal y lacunar, que tienen la aponeurosis del obliquus externus enfrente, y el falce inguinal detrás. A continuación se escapa en el anillo subcutáneo, y desciende casi verticalmente al escroto. El cordón izquierdo es bastante más largo que el derecho, y en consecuencia el testículo izquierdo cuelga algo más bajo que su compañero.

El cordón espermático está compuesto por arterias, venas, nódulos linfáticos, nervios y el conducto excretor del testículo. Estas estructuras están conectadas conjuntamente por tejido areolar, y revestidas por las capas arrastradas por el testículo en su descenso.

Los nervios son el plexo espermático del simpático, unidos por filamentos del plexo pélvico que acompañan a la arteria del conducto deferente.

Los testículos están suspendidos en el escroto por los cordones espermáticos, con el testículo izquierdo colgando un poco más bajo que su compañero. Las dimensiones medias del testículo son de 4 a 5 cm de longitud, 2,5 cm de anchura y 3 cm de diámetro antero-posterior; su peso varía de 10,5 a 14 g. Cada testículo es de una forma oval comprimida lateralmente, y que tiene una posición oblicua en el escroto; la extremidad superior se dirige hacia delante y un poco en lateral; la inferior, hacia atrás y un poco medial; el borde convexo anterior mira adelante y hacia abajo, el borde posterior o recto, al que está unido el cordón, hacia atrás y hacia arriba.

El borde anterior y las superficies laterales, así como las dos extremidades del órgano, son convexos, libres, lisos y van revestidos por la capa visceral de la tunica vaginalis. El borde posterior, al que está unido el cordón, tiene sólo un revestimiento parcial de esa membrana. Tendido sobre el borde lateral de este borde posterior hay un cuerpo largo, estrecho y aplanado, denominado epidídimo.

El epidídimo consiste en una parte central o cuerpo; una extremidad superior agrandada, la cabeza (globus major); y una extremidad inferior en punta, la cola (globus minor), que continúa con el conducto deferente, el conducto del testículo (fig. 3). La cabeza está conectada íntimamente con el extremo superior del testículo por medio de los conductillos eferentes de la glándula; la cola está conectada con el extremo inferior por tejido celular, y un reflejo de la tunica vaginalis. La superficie lateral, la cabeza y la cola del epidídimo están libres y cubiertas por la membrana serosa; el cuerpo está también revestido completamente por ella, salvo a lo largo de su borde posterior; mientras, entre el cuerpo y el testículo hay una bolsa, denominada seno del epidídimo (fosa digital). El epidídimo está conectado a la parte posterior del testículo por un pliegue de la membrana serosa.

En la extremidad superior del testículo, justo debajo de la cabeza del epidídimo, hay un diminuto cuerpo oval sésil, el apéndice del testículo (hidátide de Morgagni); es el vestigio del extremo superior del conducto de Müller. En la cabeza del epidídimo hay un segundo apéndice pequeño y pedunculado (a veces duplicado); se denomina apéndice del epidídimo (hidátide pedunculada), y habitualmente se contempla como un conducto eferente desprendido.

El testículo está revestido por tres túnicas: la tunica vaginalis, la tunica albuginea y la tunica vasculosa. La Tunica Vaginalis (tunica vaginalis propria testis) es la cubierta serosa del testículo. Es una bolsa de membrana serosa, derivada del saco vaginal del peritoneo, que en el feto precedió al descenso del testículo desde el abdomen al escroto. Después de este descenso, esa parte de la bolsa que se extiende desde el anillo inguinal abdominal a cerca de la parte superior de la glándula se oblitera; la parte inferior permanece en un saco cerrado, que reviste la superficie del testículo, y se refleja en la superficie interna del escroto; de ahí que pueda describirse como consistente en una lámina visceral y una parietal.

La lámina visceral (lamina visceralis) cubre la mayor parte del testículo y el epidídimo, conectando el segundo al testículo por medio de un pliegue diferenciado. Desde el borde posterior de la glándula se refleja en la superficie interna del escroto.

La lámina parietal (lamina parietalis) es bastante más extensa que la visceral, extendiéndose hacia arriba durante una cierta distancia enfrente y en el lado medial del cordón, y llegando debajo del testículo. La superficie interna de la tunica vaginalis es lisa, y está cubierta por una capa de células endoteliales. El intervalo entre las láminas visceral y parietal constituye la cavidad de la tunica vaginalis.

La Tunica Albuginea es la cubierta fibrosa del testículo. Es una membrana densa, de un color blanco azulado, compuesta por haces de tejido fibroso blanco que se entrelazan en todas direcciones. Está cubierta por la tunica vaginalis, excepto en los puntos de unión del epidídimo al testículo, y a lo largo de su borde posterior, en el que los vasos espermáticos entran en la glándula. Se aplica a la tunica vasculosa sobre la sustancia glandular del testículo, y, en su borde posterior, se refleja en el interior de la glándula, formando un tabique vertical incompleto, denominado mediastino testicular (corpus Highmori).

El mediastino testicular se extiende desde la extremidad superior a cerca de la inferior de la glándula, y es más ancho arriba que abajo. Desde su parte anterior y los laterales se emiten numerosos tabiques imperfectos (trabéculas), que irradian hacia la superficie del órgano, y están unidos a la tunica albuginea. Dividen el interior del órgano en una serie de espacios incompletos que tienen forma un tanto de cono, siendo anchos en sus bases en la superficie de la glándula, y estrechándose cuando convergen en el mediastino. El mediastino da sostén a los vasos y el conducto del testículo en su paso a y desde la sustancia de la glándula.

Toxina botulínica

El género Clostridium tiene más de ciento veintisiete especies, agrupadas de acuerdo con su morfología y funciones. La bacteria anaerobia gram-positiva Clostridium botulinum produce una potente toxina polipeptídica clostridial, la toxina botulínica, que causa una enfermedad neuroparalizante en seres humanos y animales referida como botulismo. Las esporas de Clostridium botulinum se encuentran en el suelo y pueden crecer en recipientes de alimentos inadecuadamente esterilizados y sellados de envasadoras domésticas, que son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo aparecen normalmente de 18 a 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede pasar aparentemente sin atenuar a través de la mucosa del tracto digestivo y atacar a las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de intoxicación con toxina botulínica pueden progresar desde dificultad para caminar, deglutir y hablar a parálisis de los músculos respiratorios y muerte.

La toxina botulínica de tipo A es el agente biológico natural más letal conocido por el hombre. Aproximadamente 50 picogramos de una toxina botulínica de tipo A disponible comercialmente (complejo de toxina clostridial purificada)^{1} es una DL_{50} en ratones (es decir, 1 unidad). Una unidad de BOTOX® contiene aproximadamente 50 picogramos (aproximadamente 56 attomoles) de complejo de toxina botulínica de tipo A. De modo interesante, sobre una base molar, la toxina botulínica de tipo A es aproximadamente 1.800 millones de veces más letal que la difteria, aproximadamente 600 millones de veces más letal que el cianuro de sodio, aproximadamente 30 millones de veces más letal que la toxina de la cobra y aproximadamente 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B. R. Singh y col., Plenum Press, Nueva York (1996) (donde la DL_{50} nominal de toxina botulínica de tipo A de 0,3 ng igual a 1 U se corrige por el hecho de que aproximadamente 0,05 ng de BOTOX® es igual a 1 unidad). Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la DL_{50} en inyección intraperitoneal en ratones hembra Swiss Webster que pesan de 18 a 20 gramos cada uno.

Se han caracterizado siete toxinas clostridiales botulínicas inmunológicamente distintas, siendo respectivamente los serotipos de toxinas clostridiales botulínicas A, B, C_{1}, D, E, F y G cada uno de los cuales se distingue por neutralización con anticuerpos específicos del tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en las especies animales a las que afectan y en la gravedad y duración de la parálisis que evocan. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo A es 500 veces más potente, según se mide por la velocidad de parálisis producida en la rata, que es toxina botulínica de tipo B. Adicionalmente, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo B es no tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg que es aproximadamente 12 veces la DL_{50} del primate para toxina botulínica de tipo A. Moyer E y col., Botulinum Toxin Type B: Experimental and Clinical Experience, siendo el capítulo 6, páginas 71-85 de "Therapy With Botulinum Toxina", editado por Jankovic, J. y col. (1994), Marcel Dekker, Inc. La toxina botulínica se une aparentemente con alta afinidad a neuronas motoras colinérgicas, se transloca en la neurona y bloquea la liberación de acetilcolina.

Con independencia del serotipo, el mecanismo molecular de intoxicación por toxinas parece ser similar y afectar a por lo menos tres etapas o fases. En la primera etapa del método, la toxina se une a la membrana presináptica de la neurona objeto a través de una interacción específica entre la cadena pesada, la cadena H y un receptor superficial de células; se cree que el receptor es diferente para cada tipo de toxina botulínica y para la toxina tetánica. El segmento terminal de carboxilo de la cadena, H_{C}, parece ser importante para la fijación de la toxina a la superficie de la célula.

En la segunda etapa, la toxina cruza la membrana plasmática de la célula intoxicada. La toxina primero es absorbida por la célula a través de endocitosis mediada por receptores, y se forma un endosoma que contiene la toxina. A continuación, la toxina escapa del endosoma al citoplasma de la célula. Se cree que esta etapa está mediada por el segmento terminal amino de la cadena H, H_{N}, que activa un cambio conformacional de la toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5,5 o inferior. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protones que disminuye el pH intraendosómico. El desplazamiento conformacional expone residuos hidrófobos en la toxina, que permite que la toxina se integre en la membrana endosómica. La toxina (o como mínimo la cadena ligera) se transloca entonces a través de la membrana endosómica en el citoplasma.

La última etapa del mecanismo de actividad de la toxina botulínica parece implicar la reducción del enlace de disulfuro que se une a la cadena pesada, cadena H, y a la cadena ligera, cadena L. La actividad tóxica conjunta de las toxinas botulínica y tetánica está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopeptidasa de zinc (Zn++) que segmenta selectivamente proteínas esenciales para reconocimiento y acoplamiento de vesículas que contienen neurotransmisores con la superficie citoplásmica de la membrana plasmática, y la fusión de las vesículas con la membrana plasmática. La toxina clostridial tetánica, toxina botulínica de tipos B, D, F y G, causa degradación de sinaptobrevina (también denominada proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP)), una proteína de membrana sinaptosómica. La mayoría de las VAMP presentes en la superficie citoplásmica de la vesícula sináptica es eliminada como consecuencia de cualquiera de los episodios de segmentación. La toxina botulínica de serotipo A y E escinde SNAP-25. En un principio se pensaba que la toxina botulínica de serotipo C_{1} segmentaba la sintaxina, pero se encontró que segmenta la sintaxina y SNAP-25. Cada una de las toxinas botulínicas segmenta específicamente un enlace diferente, excepto la toxina botulínica de tipo B (y la toxina tetánica), que segmentan el mismo enlace.

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Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas inhiben aparentemente la liberación de la acetilcolina de neurotransmisores en la unión neuromuscular, lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o segmentando estas proteínas en diferentes sitios. Por ejemplo, las botulínicas de tipos A y E segmentan la proteína sinaptosómica asociada de 25 kiloDalton (kD) (SNAP-25), pero se dirigen a diferentes secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína. Las toxinas botulínicas de tipos B, D, F y G actúan sobre la proteína asociada a vesículas (VAMP, también denominada sinaptobrevina), con cada serotipo segmentando la proteína en un sitio diferente. Finalmente, se ha demostrado que la toxina botulínica de tipo C_{1} segmenta la sintaxina y SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar a la potencia y/o duración de acción relativas de los diversos serotipos de toxina botulínica. Aparentemente, puede encontrarse un sustrato para una toxina botulínica en una diversidad de tipos de células diferentes. Véase, por ejemplo, Gonelle-Gispert, C., y col., SNAP-25a and -25b isoforms are both expressed in insulin-secreting cells and can function in insulin secretion, Biochem J. 1; 339 (pt 1):159-65:1999, y Boyd R. S. y col., The effect of botulinum Clostridial toxin-B on insulin release from a \exists-cell line, y Boyd R. S. y col., The insulin secreting \exists-cell line, HIT-15, contains SNAP-25 which is a target for botulinum Clostridial toxin-A, ambos publicados en Mov Disord, 10(3):376:1995 (las células B de islotes pancreáticos contienen por lo menos SNAP-25 y sinaptobrevina).

El peso molecular de la molécula de proteínas de toxina botulínica, para los siete serotipos conocidos de toxina botulínica, es aproximadamente de 150 kD. De modo interesante, las toxinas botulínicas son liberadas por la bacteria clostridial como complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina botulínica de 150 kD junto con proteínas asociadas que no son toxinas. Así, el complejo de toxina botulínica de tipo A puede ser producido por bacteria clostridial como formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. La toxina botulínica de tipos B y C_{1} es producida aparentemente sólo como complejo de 700 kD o 500 kD. La toxina botulínica de tipo D es producida como complejos de 300 kD y 500 kD. Finalmente, la toxina botulínica de tipos E y F es producida sólo como complejos de aproximadamente 300 kD. Se cree que los complejos (es decir, peso molecular mayor que 150 kD aproximadamente) contienen una proteína de hematoglutinina no toxina y una proteína sin hemaglutinina no tóxica y no toxina. Estas dos proteínas no toxinas (que junto con la molécula de toxina botulínica comprenden el complejo de toxina clostridial relevante) pueden actuar para proporcionar estabilidad frente a desnaturalización para la molécula de toxina botulínica y protección frente a ácidos digestivos cuando se ingiere la toxina. Adicionalmente, es posible que los complejos de toxina botulínica más grandes (de peso molecular mayor que 150 kD aproximadamente) puedan derivar en un ritmo más lento de difusión de la toxina botulínica alejándose de un sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulínica.

Todos los serotipos de toxinas botulínicas están formados por bacterias Clostridium botulinum como proteínas de cadena única inactiva que deben ser segmentadas o cortadas por proteasas para volverse neuroactivas. Las cepas bacterianas que hacen que los serotipos de toxinas botulínicas A y G posean proteasas endógenas y los serotipos A y G puedan, por tanto, ser recuperados a partir de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. En contraste, los serotipos de toxinas botulínicas C_{1}, D y E son sintetizados por cepas no proteolíticas y, por tanto, se inactivan normalmente cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F son producidos por cepas proteolíticas y no proteolíticas y, por tanto, pueden recuperarse en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de toxina botulínica de tipo B sólo segmentan una parte de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas cortadas con respecto a las no cortadas depende de la duración de la incubación y de la temperatura del cultivo. Por tanto, es probable que un cierto porcentaje de cualquier preparación, por ejemplo, de la toxina botulínica de tipo B esté inactivo, lo que explica posiblemente la menor potencia de la toxina botulínica de tipo B en comparación con la toxina botulínica de tipo A. La presencia de moléculas de toxina botulínica inactiva en una preparación clínica contribuirá a la carga global de proteínas de la preparación, que se ha vinculado con el aumento de la antigenicidad, sin contribuir a su eficacia clínica.

Las toxinas botulínicas y los complejos de toxinas pueden obtenerse, por ejemplo, de List Biological Laboratories, Inc., Campbell, Calif.; Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, R.U.; Wako (Osaka, Japón), así como de Sigma Chemicals de St Louis, Mo. Las toxinas botulínicas disponibles comercialmente que contienen composiciones farmacéuticas incluyen BOTOX® (complejo de toxina clostridial de toxina botulínica de tipo A con albúmina de suero humano y cloruro de sodio) disponible en Allergan, Inc., de Irvine, Calif. en viales de 100 unidades como un polvo liofilizado que se reconstituirá con cloruro de sodio al 0,9% antes de su uso), Dysport® (complejo de hemaglutinina de toxina Clostridium botulinum de tipo A con albúmina de suero humano y lactosa en la formulación), disponible en Ipsen Limited, Berkshire, R.U. como un polvo que se reconstituirá con cloruro de sodio al 0,9% antes de su uso) y MyoBoc^{TM} (una solución inyectable que comprende toxina botulínica de tipo B, albúmina de suero humano, succinato de sodio y cloruro de sodio a un pH de aproximadamente 5,6, disponible en Elan Corporation, Dublín, Irlanda).

El éxito de la toxina botulínica de tipo A para tratar una diversidad de dolencias clínicas ha llevado a interesarse en otros serotipos de toxinas botulínicas. Adicionalmente, la toxina botulínica pura se ha usado para tratar a seres humanos. Véase por ejemplo Kohl A., y col., Comparison of the effect of botulinum toxin A (BOTOX (R)) with the highly-purified Clostridial toxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15(Supl. 3):165. De ahí que pueda prepararse una composición farmacéutica usando una toxina botulínica pura.

Se sabe que la toxina botulínica de tipo A es soluble en soluciones acuosas diluidas a pH de 4 a 6,8. A un pH por encima de 7 aproximadamente, las proteínas no tóxicas estabilizadoras se disocian de la toxina clostridial, para dar como resultado una pérdida gradual de toxicidad, especialmente cuando el pH y la temperatura aumentan. Schantz E. J., y col. Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (en particular páginas 44-45), siendo el capítulo 3 de Jankovic, J., y col., Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc (1994).

La molécula de toxina botulínica (aproximadamente 150 kDa), así como los complejos de toxina botulínica (aproximadamente de 300 a 900 kDa), como el complejo de toxina de tipo A, son también extremadamente susceptibles a desnaturalización debido a desnaturalización de superficie, calor y condiciones alcalinas. La toxina inactivada forma proteínas toxoides que pueden ser inmunógenas. Los anticuerpos resultantes pueden volver a un paciente refractario a la inyección de toxinas.

Los estudios in vitro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por catión potasio de acetilcolina y norepinefrina de cultivos de células primarios de tejido del tronco del encéfalo. Adicionalmente, se ha comunicado que la toxina botulínica inhibe la liberación evocada de glicina y glutamato en cultivos primarios de neuronas de la médula espinal y que en preparaciones de sinaptosomas encefálicas la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina (Habermann E., y col., Tetanus Toxin and Botulinum A and C Clostridial toxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J Neurochem 51(2); 522-527:1988), CGRP, sustancia P y glutamato (Sanchez-Prieto, J., y col., Botulinum toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem 165; 675-681:1987). Así, cuando se usan concentraciones adecuadas, la liberación evocada por estímulo de la mayoría de los neurotransmisores es bloqueada por la toxina botulínica. Véase por ejemplo Pearce, L. B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine, Toxicon 35(9); 1373-1412 en 1393; Bigalke H., y col., Botulinum A Clostridial toxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture, Brain Research 360; 318-324:1985; Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the release of [^{3}H]Noradrenaline and [^{3}H]GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44; 224-226:1988, Bigalke H., y col., Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 316; 244-251:1981, y; Jankovic J. y col., Therapy With Botulinum toxin, Marcel Dekker, Inc., (1994), página 5.

La toxina botulínica de tipo A puede obtenerse estableciendo y cultivando cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador y después recolectando y purificando la mezcla fermentada de acuerdo con métodos conocidos. Todos los serotipos de toxinas botulínicas se sintetizan inicialmente como proteínas de cadena única inactivas que deben segmentarse o cortarse mediante proteasas para volverse neuroactivas. Las cepas bacterianas que forman serotipos de toxinas botulínicas A y G poseen proteasas endógenas y, por tanto, los serotipos A y G pueden recuperarse de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. En contraste, los serotipos de las toxinas botulínicas C_{1}, D y E son sintetizados por cepas no proteolíticas y, por tanto, normalmente se inactivan cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F son producidos por cepas proteolíticas y no proteolíticas y por tanto pueden recuperarse en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de toxina botulínica de tipo B sólo segmentan una parte de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas cortadas o no cortadas depende de la duración de incubación y de la temperatura del cultivo. Por tanto, es probable que un cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, la toxina botulínica de tipo B esté inactivo, lo que explica posiblemente la potencia significativamente menor conocida de toxina botulínica de tipo B en comparación con la toxina botulínica de tipo A. La presencia de moléculas de toxina botulínica inactiva en una preparación clínica contribuirá a la carga global de proteínas de la preparación, que se ha vinculado con un aumento de la antigenicidad, sin contribuir a su eficacia clínica. Adicionalmente, se sabe que la toxina botulínica de tipo B tiene, en inyección intramuscular, una duración de actividad más breve y es también menos potente que la toxina botulínica de tipo A en el mismo nivel de dosis.

Puede producirse toxina botulínica de tipo A cristalina de alta calidad a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con características de \geq 3\times10^{7} U/mg, una A_{260}/A_{278} de menos de 0,60 y un patrón diferenciado de formación de bandas en electroforesis en gel. Puede usarse el procedimiento de Schantz conocido para obtener toxina botulínica cristalina de tipo A, según se expone en Schantz, E. J., y col., Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Clostridial toxins in Medicine, Microbiol Rev. 56; 80-99:1992. Generalmente, el complejo de toxina botulínica de tipo A puede aislarse y purificarse a partir de una fermentación anaerobia mediante cultivo de Clostridium botulinum de tipo A en un medio adecuado. También puede usarse el procedimiento conocido, tras la separación de las proteínas no toxinas, para obtener toxinas botulínicas puras, como por ejemplo: toxina botulínica purificada de tipo A con un peso molecular de 150 kD aproximadamente con una potencia específica de 1-2 \times 10^{8} DL_{50} U/mg o superior; toxina botulínica purificada de tipo B con un peso molecular de 156 kD aproximadamente con una potencia específica de 1-2 \times 10^{8} DL_{50} U/mg o superior, y; toxina botulínica purificada de tipo F con un peso molecular de 155 kD aproximadamente con una potencia específica de 1-2 \times 10^{7} DL_{50} U/mg o superior.

Puede usarse la toxina botulínica pura (es decir, la molécula de toxina botulínica de 150 kilodalton) o el complejo de toxinas para preparar una composición farmacéutica. Tanto la molécula como el complejo son susceptibles de desnaturalización debido a desnaturalización de superficie, calor y condiciones alcalinas. La toxina inactivada forma proteínas toxoides que pueden ser inmunógenas. Los anticuerpos resultantes pueden volver a un paciente refractario a la inyección de toxinas.

Como en las enzimas en general, las actividades biológicas de las toxinas botulínicas (que son peptidasas intracelulares) dependen, por lo menos en parte, de su conformación tridimensional. Así, la toxina botulínica de tipo A se destoxifica por calor, diversos estiramientos superficiales de productos químicos y secado de superficie. Adicionalmente, se sabe que la dilución del complejo de toxinas obtenido por el cultivo, fermentación y purificación conocidos para las concentraciones muy, muy inferiores usadas para formulación de composición farmacéutica produce una rápida destoxificación de la toxina a menos que esté presente un agente adecuado de estabilización. La dilución de la toxina a partir de cantidades de miligramos para una solución que contenga nanogramos por mililitro presenta dificultades importantes debido a la rápida pérdida de toxicidad específica para una dilución tan importante. Como la toxina puede usarse meses o años después de que se formule la composición farmacéutica que contiene la toxina, la toxina puede estabilizarse con un agente de estabilización como albúmina y gelatina.

Existe una composición farmacéutica, disponible comercialmente, que contiene toxina botulínica y se vende bajo la marca comercial BOTOX® (disponible en Allergan, Inc., de Irvine, Calif.). BOTOX® consiste en un complejo de toxinas botulínicas purificadas de tipo A, albúmina y cloruro de sodio empaquetado en forma estéril secada al vacío. La toxina botulínica de tipo A está hecha de un cultivo de la cepa de Hall de Clostridium botulinum cultivado en un medio que contiene amina N-Z y extracto de levadura. El complejo de toxina botulínica de tipo A se purifica a partir de la solución de cultivo mediante una serie de precipitaciones ácidas hasta un complejo cristalino que consiste en la proteína de toxina activa de alto peso molecular y una proteína de hemaglutinina asociada. El complejo cristalino se vuelve a disolver en una solución que contiene suero salino y albúmina y se filtra de forma estéril (0,2 micrómetros) antes de secado al vacío. El producto secado al vacío se almacena en un congelador a o por debajo de -5ºC. El BOTOX® puede reconstituirse con solución salina estéril sin conservantes para inyección intramuscular. Cada vial de BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de toxina clostridial purificada de toxina de Clostridium botulinum de tipo A, 0,5 miligramos de albúmina de suero humano y 0,9 miligramos de cloruro de sodio en una forma estéril secada al vacío sin conservante.

Para reconstituir BOTOX® secado al vacío, se usa solución salina normal estéril sin conservante (inyección de cloruro de sodio al 0,9%) mediante extracción de la cantidad apropiada de diluyente en la jeringuilla de tamaño apropiado. Como el BOTOX® puede desnaturalizarse mediante burbujeo o agitación violenta similar, el diluyente se inyecta suavemente en el vial. Por motivos de esterilidad, el BOTOX® se administra preferentemente en un plazo de cuatro horas después de que el vial se retire del congelador y se reconstituya. Durante estas cuatro horas, el BOTOX® reconstituido puede almacenarse en un refrigerador a entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC. Se ha comunicado que el BOTOX® en refrigerador constituido conserva su potencia durante por lo menos dos semanas aproximadamente. Neurology, 48:249-53:1997.

Las toxinas botulínicas se han usado en instalaciones clínicas para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. La toxina botulínica de tipo A (BOTOX®) fue aprobada por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento de blefarospasmo esencial, estrabismo y espasmo hemifacial en pacientes de más de doce años. En 2000 la FDA aprobó preparaciones comerciales de serotipos de toxina botulínica de tipo A (BOTOX®) y tipo B (MyoBloc^{TM}) para el tratamiento de distonía cervical, y en 2002 la FDA aprobó una toxina botulínica de tipo A (BOTOX®) para el tratamiento cosmético de ciertas arrugas faciales hipercinéticas (glabelares). Los efectos clínicos de la toxina botulínica de tipo A intramuscular periférica se aprecian habitualmente dentro de una semana desde la inyección y a veces en un plazo de unas horas. La duración típica del alivio sintomático (es decir, parálisis muscular flácida) a partir de una inyección intramuscular única de toxina botulínica de tipo A puede ser de aproximadamente tres meses, aunque en algunos casos se ha comunicado que los efectos de una desnervación de una glándula, por ejemplo una glándula salivar, inducida por toxina botulínica duran varios años. Por ejemplo, se sabe que la toxina botulínica de tipo A puede tener una eficacia de hasta 12 meses (Naumann M., y col., Botulinum toxin type A in the treatment of focal, axillary and palmar hyperhidrosis and other hyperhidrotic conditions, European J. Neurology 6 (Supl. 4):S111-S115:1999), y en algunas circunstancias durante hasta 27 meses. Ragona, R. M., y col., Management of parotid sialocele with botulinum toxin, The Laryngoscope 109:1344-1346:1999. Sin embargo, la duración habitual de una inyección intramuscular de BOTOX® es normalmente de aproximadamente 3 a 4 meses.

Se ha comunicado que se ha usado una toxina botulínica de tipo A en diversas instalaciones clínicas, incluyendo por ejemplo lo siguiente:

(1) aproximadamente 75-125 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (músculos múltiples) para tratar distonía cervical;

(2) 5-10 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular para tratar líneas glabelares (surcos en las cejas) (5 unidades inyectadas intramuscularmente en el músculo procero y 10 unidades inyectadas intramuscularmente en cada músculo corrugador superciliar);

(3) aproximadamente 30-80 unidades de BOTOX® para tratar estreñimiento por inyección intraesfintérica del músculo puborrectal;

(4) aproximadamente 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado intramuscularmente para tratar blefarospasmo por inyección del músculo ocular orbicular pretarsiano lateral del párpado superior y el ocular orbicular pretarsiano lateral del párpado inferior;

(5) para tratar estrabismo, se ha inyectado intramuscularmente en músculos extraoculares con entre aproximadamente 1-5 unidades de BOTOX®, con la cantidad inyectada variable basándose en el tamaño del músculo en el que se inyectará y la extensión de la parálisis muscular deseada (es decir, cantidad de corrección de dioptrías
deseada);

(6) para tratar espasticidad de extremidades superiores después de accidente cerebrovascular por inyecciones intramusculares de BOTOX® en cinco músculos flexores diferentes de las extremidades superiores, del modo siguiente:

(a): flexor profundo de los dedos: 7,5 U a 30 U

(b): flexor superficial de los dedos: 7,5 U a 30 U

(c): flexor cubital del carpo: 10 U a 40 U

(d): flexor radial del carpo: 15 U a 60 U

(e): braquial del bíceps: 50 U a 200 U. En cada uno de los cinco músculos indicados se ha inyectado la misma sesión de tratamiento, de manera que el paciente reciba de 90 U a 360 U de BOTOX® en músculos flexores de las extremidades superiores en cada sesión de tratamiento;

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(7) para tratar migrañas, la inyección inyectada pericranealmente (inyectada simétricamente en los músculos glabelar, frontal y temporal) de 25 U de BOTOX® ha demostrado un beneficio importante como tratamiento profiláctico de migraña en comparación con el vehículo según se mide con medidas reducidas de frecuencia de las migrañas, gravedad máxima, vómitos asociados y uso agudo de la medicación durante un período de tres meses después de la inyección de 25 U.

Adicionalmente, la toxina botulínica intramuscular se ha usado en el tratamiento de temblores en pacientes con enfermedad de Parkinson, aunque se ha comunicado que los resultados no han sido extraordinarios. Marjama-Lyons, J., y col., Tremor-Predominant Parkinson's Disease, Drugs & Aging 16(4); 273-278:2000.

Se conoce el tratamiento de ciertos trastornos gastrointestinales y de los músculos lisos con una toxina botulínica. Véanse por ejemplo las patentes de EE.UU. nº 5.427.291 y 5.674.205 (Pasricha). Adicionalmente, se conoce la inyección transuretral de una toxina botulínica en un esfínter de vejiga para tratar un trastorno de la micción (véase por ejemplo Dykstra, D. D., y col., Treatment of detrusor-sphincter dyssynergia with botulinum A toxin: A double-blind study, Arch Phys Med Rehabil 1990 Enero; 71:24-6), al igual que la inyección de una toxina botulínica en la próstata para tratar hiperplasia prostática. Véase por ejemplo la patente de EE.UU. nº 6.365.164 (Schmidt).

La patente de EE.UU. nº 5.766.605 (Sanders) propone el tratamiento de varios trastornos autónomos, como secreción excesiva de ácidos en el estómago, hipersalivación, rinitis, con una toxina botulínica. Adicionalmente, se sabe que la hipersecreción nasal es causada predominantemente por sobreactividad de las glándulas nasales, que están principalmente bajo control colinérgico y se ha demostrado que la aplicación de toxina botulínica de tipo A a tejido mucoso nasal de mamíferos de los turbinados del seno maxilar puede inducir una apoptosis temporal en las glándulas nasales. Rohrbach S., y col., Botulinum toxin type A induces apoptosis in nasal glands of guinea pigs, Ann Otol Rhinol Laryngol 2001 Noviembre; 110(11):1045-50. Además, la aplicación local de toxina botulínica A a una paciente humana con rinitis intrínseca produjo una clara disminución de la hipersecreción nasal en cinco días. Rohrbach S., y col., Minimally invasive application of botulinum toxin type A in nasal hypersecretion, J Oto-Rhino-Laryngol 2001 Noviembre-Diciembre; 63(6):382-4.

Se exponen varias dolencias, como hiperhidrosis y cefalea, tratables con una toxina botulínica en el documento WO-95/17.904 (PCT/US94/14.717) (Aoki). El documento EP-0.605.501-B1 (Graham) expone el tratamiento de parálisis cerebral con una toxina botulínica y la patente de EE.UU. nº 6.063.768 (First) expone el tratamiento de inflamación neurógena con una toxina botulínica.

Además de tener acciones farmacológicas en la localización periférica, las toxinas botulínicas también pueden tener efectos en el sistema nervioso central. El trabajo de Weigand y col., (^{125}I-labelled botulinum A Clostridial toxin: pharmacokinetics in cats after intramuscular injection, Nauny-Schmiedeberg's. Arch. Pharmacol. 1976; 292,161-165) y Habermann, (^{125}I-labelled Clostridial toxin from Clostridium botulinum A: preparation, binding to synaptosomes and ascent to the spinal cord, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56) demostró que la toxina botulínica es capaz de ascender a la zona espinal por transporte retrógrado. De esta forma, una toxina botulínica inyectada en una localización periférica, por ejemplo intramuscularmente, puede ser transportada de forma retrógrada a la médula espinal.

Los estudios in vitro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por catión potasio de acetilcolina y norepinefrina desde cultivos de células primarios de tejido del tronco del encéfalo. Adicionalmente, se ha comunicado que la toxina botulínica inhibe la liberación evocada de glicina y glutamato en cultivos primarios de neuronas de la médula espinal y que en preparaciones de sinaptosomas encefálicos la toxina botulínica inhibe la liberación de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP y glutamato.

La patente de EE.UU. nº 5.989.545 desvela que puede usarse una toxina clostridial modificada o un fragmento de la misma, preferentemente una toxina botulínica, conjugada químicamente o fusionada de forma recombinante a una fracción objetivo en particular para tratar el dolor por administración del agente a la médula espinal.

También se ha propuesto una toxina botulínica para el tratamiento de hiperhidrosis (sudoración excesiva, patente de EE.UU. 5.766.605), cefalea (patente de EE.UU. 6.458.365), cefalea con migraña (patente de EE.UU. 5.714.468), dolor postoperatorio y dolor visceral (patente de EE.UU. 6.464.986), dolor por administración intraespinal (patente de EE.UU. 6.113.915), enfermedad de Parkinson por administración intracraneal (patente de EE.UU. 6.306.403), conservación del cabello y crecimiento del cabello (patente de EE.UU. 6.299.893), psoriasis y dermatitis (patente de EE.UU. 5.670.484), lesiones musculares (patente de EE.UU. 6.423.319), diversos cánceres (patente de EE.UU. 6.139.845), trastornos pancreáticos (patente de EE.UU. 6.143.306), trastornos de los músculos lisos (patente de EE.UU. 5.437.291, incluyendo inyección de una toxina botulínica en los esfínteres esofágicos superior e inferior, pilórico y anal), trastornos de la próstata (patente de EE.UU. 6.365.164), inflamación, artritis y gota (patente de EE.UU. 6.063.768), parálisis cerebral juvenil (patente de EE.UU. 6.395.277), trastornos del oído interno (patente de EE.UU. 6.265.379), trastornos tiroideos (patente de EE.UU. 6.358.513), trastornos paratiroideos (patente de EE.UU. 6.328.977). Adicionalmente, se conocen implantes de toxinas de liberación controlada (patentes de EE.UU. 6.306.423 y 6.312.708).

Cakmak y col. (2003) Urol Res 31:352-354 comunicaron una inyección de una toxina botulínica en un músculo cremáster (que envuelve al testículo) para tratar un testículo retráctil. Westhoff y col. (2002) Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 365(Supl.) 2:R 48 comunicaron una inyección de una toxina botulínica en un músculo iliopsoas (el músculo que nace en la parte inferior de la espalda y se inserta en el hueso del muslo (fémur)) para tratar síntomas como dolor en la ingle. Sin embargo, ni Cakmak ni Westhoff enseñan o sugieren que pueda administrarse una toxina botulínica al testículo o a los tejidos conectados con el testículo para tratar un dolor testicular.

La toxina tetánica, así como sus derivados (es decir, con una fracción objeto no nativa), fragmentos, híbridos y quimeras de la misma también puede tener utilidad terapéutica. La toxina tetánica comporta muchas semejanzas con las toxinas botulínicas. Así, tanto la toxina tetánica como las toxinas botulínicas son polipéptidos formados por especies estrechamente emparentadas de Clostridium (Clostridium tetani y Clostridium botulinum, respectivamente). Adicionalmente, tanto la toxina tetánica como las toxinas botulínicas son proteínas de doble cadena compuestas por una cadena ligera (peso molecular de aproximadamente 50 kD) unida covalentemente por un enlace de disulfuro simple a una cadena pesada (peso molecular de aproximadamente 100 kD). Por ello, el peso molecular de la toxina tetánica y de cada una de las siete toxinas botulínicas (sin complejos) es de aproximadamente 150 kD. Además, para la toxina tetánica y las toxinas botulínicas, la cadena ligera comporta el dominio que exige actividad biológica intracelular (proteasa), mientras que la cadena pesada comprende la unión a receptores (inmunógena) y los dominios translocacionales de membranas celulares.

Además, tanto la toxina tetánica como las toxinas botulínicas muestran una alta afinidad específica para receptores de gangliósidos en la superficie de neuronas colinérgicas presinápticas. La endocitosis mediada por receptores de toxina tetánica por neuronas colinérgicas periféricas produce transporte axonal retrógrado, bloqueo de la liberación de neurotransmisores inhibidores de sinapsis centrales y una parálisis espástica. Por el contrario, la endocitosis mediada por receptores de toxina botulínica por neuronas colinérgicas periféricas produce un transporte retrógrado escaso, si es que existe, inhibición de exocitosis de acetilcolina desde las neuronas motoras periféricas intoxicadas y una parálisis flácida.

Finalmente, la toxina tetánica y las toxinas botulínicas se asemejan entre sí en su biosíntesis y su arquitectura molecular. Así, existe una identidad global del 34% entre las secuencias proteínicas de la toxina tetánica y la toxina botulínica de tipo A, y una identidad de secuencia de hasta el 62% para algunos dominios funcionales. Binz T. y col., The Complete Sequence of Botulinum Clostridial toxin Type A and Comparison with Other Clostridial toxins, J Biological Chemistry 265(16); 9153-9158:1990.

Acetilcolina

Normalmente sólo se libera un único tipo de neurotransmisor de moléculas pequeñas por cada tipo de neurona en el sistema nervioso de mamíferos. El neurotransmisor acetilcolina es secretado por neuronas en muchas áreas del encéfalo, pero específicamente por las células piramidales grandes de la corteza motora, por varias neuronas diferentes en los ganglios basales, por las neuronas motoras que inervan los músculos esqueléticos, por las neuronas preganglionares del sistema nervioso autónomo (simpático y parasimpático), por las neuronas posganglionares del sistema nervioso parasimpático y por algunas de las neuronas posganglionares del sistema nervioso simpático. Esencialmente, sólo las fibras nerviosas simpáticas posganglionares para las glándulas sudoríparas, los músculos piloerectores y algunos vasos sanguíneos son colinérgicos, ya que la mayoría de las neuronas posganglionares del sistema nervioso simpático secretan el neurotransmisor norepinefrina. En la mayoría de los casos, la acetilcolina tiene un efecto excitador. Sin embargo, se sabe que la acetilcolina tiene efectos inhibidores en algunas de las terminaciones nerviosas parasimpáticas periféricas, como inhibición de la frecuencia cardiaca por el nervio vago.

Las señales eferentes del sistema nervioso autónomo son transmitidas al cuerpo a través del sistema nervioso simpático o del sistema nervioso parasimpático. Las neuronas preganglionares del sistema nervioso simpático se extienden desde los cuerpos celulares de las neuronas simpáticas preganglionares situados en el cuerno intermediolateral de la médula espinal. Las fibras nerviosas simpáticas preganglionares, que se extienden desde el cuerpo celular, realizan sinapsis con las neuronas posganglionares situadas en un ganglio simpático paravertebral o en un ganglio prevertebral. Como las neuronas preganglionares del sistema nervioso simpático y parasimpático son colinérgicas, la aplicación de acetilcolina a los ganglios excitará a las neuronas posganglionares simpáticas y parasimpáticas.

La acetilcolina activa dos tipos de receptores, receptores muscarínicos y nicotínicos. Los receptores muscarínicos se encuentran en todas las células efectoras estimuladas por las neuronas posganglionares del sistema nervioso parasimpático así como en las estimuladas por las neuronas colinérgicas posganglionares del sistema nervioso simpático. Los receptores nicotínicos se encuentran en la médula suprarrenal, así como dentro de los ganglios autónomos, es decir, en la superficie celular de la neurona posganglionar en la sinapsis entre las neuronas preganglionares y posganglionares de los sistemas simpático y parasimpático. Los receptores nicotínicos se encuentran también en muchas terminaciones nerviosas no autónomas, por ejemplo en las membranas de las fibras musculoesqueléticas en la unión neuromuscular.

La acetilcolina se libera desde las neuronas colinérgicas cuando las vesículas intracelulares, pequeñas y claras, se funden con la membrana celular neuronal presináptica. Una amplia variedad de células secretoras no neuronales, como las células de la médula suprarrenal (así como la línea celular PC12) y de los islotes pancreáticos, liberan catecolaminas y hormona paratiroidea, respectivamente, desde vesículas grandes de núcleo denso. La línea celular PC12 es un clon de células de feocromocitoma de rata usado extensamente como un modelo de cultivo tisular para estudios de desarrollo simpatosuprarrenal. La toxina botulínica inhibe la liberación de los dos tipos de compuestos de los dos tipos de células in vitro, permeabilizada (por ejemplo, por electroporación) o por inyección directa de la toxina en la célula desnervada. Se sabe también que la toxina botulínica bloquea la liberación del neurotransmisor glutamato de cultivos celulares de sinaptosomas corticales.

Se forma una unión neuromuscular en músculo esquelético por la proximidad de axones a células musculares. Una señal transmitida a través del sistema nervioso produce un potencial de acción en el axón terminal, con activación de canales de iones y liberación resultante del neurotransmisor acetilcolina desde las vesículas sinápticas intraneuronales, por ejemplo en la placa terminal motriz de la unión neuromuscular. La acetilcolina cruza el espacio extracelular para unirse con proteínas receptoras de acetilcolina en la superficie de la placa terminal muscular. Una vez que se ha producido una unión suficiente, un potencial de acción de la célula muscular provoca cambios específicos en los canales iónicos de membrana, produciendo una contracción de las células musculares. A continuación se libera acetilcolina desde las células musculares y es metabolizada por colinesterasas en el espacio extracelular. Los metabolitos se reciclan de nuevo en el axón terminal para su reprocesamiento en más acetilcolina.

Según se expone anteriormente, los procedimientos convencionales para tratar el dolor testicular tienen una baja tasa de éxito para aliviar el dolor.

Lo que se necesita, por tanto, es un método mejorado para aliviar el dolor testicular.

Resumen

La presente invención satisface esta necesidad y proporciona métodos mejorados para aliviar un dolor testicular. Específicamente, la presente invención proporciona una toxina botulínica para su uso en un método para aliviar el dolor testicular, según se define en las reivindicaciones. En algunas formas de realización, los métodos comprenden la etapa de administrar localmente una toxina botulínica (por ejemplo, una toxina botulínica de tipo A y/u otros tipos) a por lo menos un sitio anatómico seleccionado entre el grupo que consiste en un testículo y un tejido asociado con el testículo. Según se define en la presente memoria descriptiva, un "tejido asociado con el testículo" es un tejido que está conectado físicamente con el testículo o un tejido que puede afectar funcionalmente al testículo. Un "tejido asociado con el testículo" puede ser un tejido conjuntivo, un tejido muscular o un tejido nervioso. Por ejemplo, un tejido asociado con el testículo comprende por lo menos uno entre un conducto deferente, un epidídimo o un cordón espermático.

En algunas formas de realización, un tejido asociado con el testículo comprende por lo menos un tejido nervioso seleccionado entre el grupo que consiste en un nervio que inerva el testículo y un plexo nervioso que inerva el testículo. Por ejemplo, un tejido asociado con el testículo comprende por lo menos un tejido nervioso seleccionado entre el grupo que consiste en una rama del nervio ilioinguinal del plexo lumbar, una rama del nervio lumboinguinal del plexo lumbar, una rama del nervio perineal superficial del nervio pudendo interno, una rama del nervio pudendo del nervio cutáneo femoral posterior y un filamento de plexo espermático.

En algunas formas de realización, el dolor testicular que se alivia es un dolor testicular crónico. En algunas formas de realización, el dolor presente es causado por orquitis. En algunas formas de realización, el dolor es causado por una epididimitis. En algunas formas de realización, el dolor es causado por una obstrucción del conducto deferente. En algunas formas de realización, el dolor es causado por un espasmo del conducto deferente. En algunas formas de realización, el dolor es causado por una cirugía (por ejemplo, síndrome de dolor postvasectomía).

En algunas formas de realización, la toxina botulínica se administra a un músculo cremáster para aliviar un dolor testicular que no es causado por una retracción del testículo. En algunas formas de realización, la presente invención excluye la administración de una toxina botulínica a un músculo cremáster para aliviar un dolor testicular debido a testículo retráctil.

En algunas formas de realización, la dosis de toxina botulínica que se administrará es equivalente a aproximadamente de 1 unidad a aproximadamente 500 unidades de una toxina botulínica de tipo A.

El término "toxina botulínica" empleado en la presente memoria descriptiva se refiere a una o más de una toxina fabricada por una bacteria, por ejemplo, una Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede ser una toxina botulínica de tipo A (incluyendo A_{1} o A_{2}), tipo B, tipo C_{1}, tipo D, tipo E, tipo F o tipo G. En algunas formas de realización, la toxina botulínica es una toxina botulínica de tipo A. A menos que se indique lo contrario, la dosis de la toxina botulínica referenciada en la presente memoria descriptiva es equivalente a la de una toxina botulínica de tipo A. Los ensayos requeridos para determinar la equivalencia con la eficacia terapéutica de la toxina botulínica de tipo A en una cierta dosificación están bien establecidos.

Además, la toxina botulínica de la presente invención puede comprender un primer elemento que comprende un elemento de unión capaz de unirse específicamente a un receptor de superficie celular neuronal en condiciones fisiológicas; un segundo elemento que comprende un elemento de translocación capaz de facilitar la transferencia de un polipéptido a través de una membrana celular neuronal, y un tercer elemento que comprende un elemento terapéutico capaz, cuando está presente en el citoplasma de una neurona, de inhibir la exocitosis de acetilcolina desde la neurona. El elemento terapéutico puede segmentar una proteína SNARE, con lo que inhibe la exocitosis de acetilcolina desde la neurona. La proteína SNARE puede seleccionarse entre el grupo que consiste en sintaxina, SNAP-25 y VAMP.

Definiciones

En la presente memoria descriptiva se aplican las siguientes definiciones.

"Aproximadamente" significa más o menos el 10% del valor así calificado.

"Aliviar" según se aplica al dolor significa una reducción del dolor. En algunas formas de realización, la reducción del dolor se reduce en más del 25%. En algunas formas de realización, la reducción de dolor es de más del 50%. La reducción del dolor es medida por el paciente que refiere el grado de dolor después del tratamiento con la toxina botulínica en comparación con el grado de dolor antes del tratamiento.

"Cantidad eficaz" según se aplica a la toxina botulínica significa la cantidad de la toxina botulínica suficiente generalmente para efectuar un cambio deseado en el sujeto. Por ejemplo, cuando el efecto deseado es disminuir el espasmo de un conducto deferente, una cantidad eficaz del compuesto es la cantidad que causa por lo menos una disminución en el espasmo del conducto deferente de más del 30%. En algunas formas de realización, la toxina botulínica puede administrarse en una cantidad entre aproximadamente 0,01 U/kg y aproximadamente 35 U/kg y el dolor tratado puede aliviarse sustancialmente durante entre aproximadamente 1 mes y aproximadamente 27 meses, por ejemplo durante entre aproximadamente 1 mes y aproximadamente 6 meses.

"Administrar localmente" o "administración local" significa inyección directa a un órgano (por ejemplo, testículo) y/o un tejido (por ejemplo, tejido asociado con un testículo, definido más adelante). La administración local excluye las rutas sistémicas de administración, como administración intravenosa u oral.

Un "tejido asociado con el testículo" es un tejido que está conectado físicamente al testículo o un tejido que puede afectar funcionalmente al testículo. Un "tejido asociado con el testículo" puede ser un tejido conjuntivo, un tejido muscular o un tejido nervioso.

Dibujos

La fig. 1 muestra el escroto. En el lado izquierdo, la cavidad de la tunica vaginalis se ha abierto. En el lado derecho, sólo se han retirado las capas superficiales en el cremáster;

la fig. 2 muestra un escroto en el que el pene se ha girado hacia arriba, y se ha retirado la pared anterior del escroto. En el lado derecho se muestran el cordón espermático, la fascia infundibuliforme y el músculo cremáster. En el lado izquierdo, la fascia infundibuliforme se ha dividido por una incisión longitudinal que pasa a lo largo de la parte anterior del cordón y el testículo, y una parte de la capa parietal de la tunica vaginalis se ha retirado para mostrar el testículo y una parte de la cabeza del epidídimo, que están cubiertas por la capa visceral de la tunica vaginalis;

la fig. 3 muestra el testículo derecho, expuesto al extenderse abierta la tunica vaginalis;

la fig. 4 muestra una técnica de tres dedos para aislamiento del conducto deferente.

Descripción

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento sorprendente de que una administración de una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica de tipo A u otros tipos, a un testículo o un tejido asociado con un testículo puede aliviar un dolor que el paciente experimenta en el testículo.

En algunas formas de realización, la toxina botulínica se administra localmente a por lo menos un sitio anatómico seleccionado entre el grupo que consiste en un testículo y un tejido asociado con el testículo. Según se define en la presente memoria descriptiva, un "tejido asociado con el testículo" es un tejido que está conectado al testículo o un tejido que puede afectar funcionalmente al testículo. Un "tejido asociado con el testículo" puede ser un tejido conjuntivo, un tejido muscular o un tejido nervioso. Por ejemplo, un tejido asociado con el testículo comprende por lo menos uno entre un conducto deferente, un epidídimo o un cordón espermático.

Los presentes métodos son eficaces para tratar un dolor testicular crónico, es decir, un dolor que dura más de tres meses. Por ejemplo, una cirugía como, por ejemplo, una vasectomía puede causar un dolor que dure más de tres meses, por ejemplo, síndrome de dolor postvasectomía. En algunas formas de realización, el síndrome de dolor postvasectomía puede tratarse mediante la administración de una toxina botulínica (por ejemplo, toxina botulínica de tipo A, u otros tipos) a un cordón espermático. Sin desear limitar la invención a ninguna teoría o mecanismo de operación, se cree que la administración de una toxina botulínica al cordón espermático puede disminuir la transmisión de señal de dolor, aliviando así el dolor testicular.

Los presentes métodos son eficaces para tratar un dolor que es causado por una inflamación del testículo (orquitis) o el epidídimo (epididimitis). En algunas formas de realización, el dolor puede aliviarse mediante una administración local de una toxina botulínica (por ejemplo, toxina botulínica de tipo A, u otros tipos) al testículo y/o el epidídimo (fig. 2). En algunas formas de realización, la toxina botulínica se administra al lado posterior del testículo. Además, la toxina botulínica puede administrarse a múltiples sitios en el testículo, por ejemplo, sitios que están separados aproximadamente 1 cm. En algunas formas de realización, la toxina botulínica se administra al epidídimo. Por otra parte, la toxina botulínica puede administrarse a múltiples sitios en el epidídimo, por ejemplo, sitios que están separados aproximadamente 1 cm. Sin desear limitar la invención a ninguna teoría o mecanismo de operación, se cree que la toxina botulínica administrada es eficaz para inhibir la liberación de citocinas proinflamación, reduciendo así el
dolor.

En ciertos casos, el dolor testicular se debe a un espasmo del conducto deferente. En algunas formas de realización, puede administrarse una toxina botulínica al conducto deferente para tratar el dolor testicular.

En algunas formas de realización, la dosis de una toxina botulínica administrada es equivalente a entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 500 unidades de una toxina botulínica de tipo A. En algunas formas de realización, la dosis de una toxina botulínica administrada es equivalente a entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 300 unidades de una toxina botulínica de tipo A. En algunas formas de realización, la dosis de una toxina botulínica administrada es equivalente a entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 150 unidades de una toxina botulínica de tipo A. En algunas formas de realización, la dosis de una toxina botulínica administrada es equivalente a entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 75 unidades de una toxina botulínica de tipo A. En algunas formas de realización, la dosis de una toxina botulínica administrada es equivalente a entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 40 unidades de una toxina botulínica de tipo A. En algunas formas de realización, la dosis de una toxina botulínica administrada está en una cantidad de entre aproximadamente 0,1 unidades y aproximadamente 5 unidades.

En algunas formas de realización, una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica de tipo A u otros tipos, puede administrarse localmente de acuerdo con los presentes métodos desvelados en cantidades de entre aproximadamente 10^{-3} U/kg y aproximadamente 10 U/kg. En algunas formas de realización, una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica de tipo A u otros tipos, puede administrarse localmente de acuerdo con los presentes métodos desvelados en cantidades de entre aproximadamente 10^{-2} U/kg y aproximadamente 1 U/kg. En algunas formas de realización, una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica de tipo A u otros tipos, puede administrarse localmente de acuerdo con los presentes métodos desvelados en cantidades de entre aproximadamente 10^{-1} U/kg y aproximadamente 1 U/kg. Significativamente, el efecto de alivio del dolor de los presentes métodos desvelados puede persistir durante entre aproximadamente 2 meses y aproximadamente 6 meses.

Los métodos para determinar la ruta de administración y la dosificación apropiadas se determinan generalmente caso por caso por parte del médico responsable. Dichas determinaciones son rutinarias para un experto en la materia (véase por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), editado por Anthony Fauci y col., 14ª edición, publicado por McGraw Hill).

En algunas formas de realización, la toxina botulínica se administra a un "paciente necesitado de la misma", lo que significa que se ha diagnosticado específicamente que el paciente tiene un dolor en el testículo y la toxina botulínica se administra para el fin concreto de aliviar el dolor testicular.

Preferentemente, una toxina botulínica usada para aplicar un método dentro del ámbito de la presente invención es una entre las toxinas botulínicas de serotipos A (incluyendo A_{1} y A_{2}), B, C, D, E, F o G. Preferentemente, la toxina botulínica usada es toxina botulínica de tipo A, debido a su alta potencia en seres humanos, pronta disponibilidad y uso seguro y eficaz conocido para el tratamiento de trastornos de los músculos esqueléticos y los músculos lisos cuando se administran localmente por inyección intramuscular.

La presente invención incluye dentro de su ámbito: (a) complejo de toxina clostridial así como toxina clostridial pura obtenida o procesada por cultivo bacteriano, extracción de toxinas, concentración, conservación, secado por congelación y/o reconstitución y; (b) toxina clostridial modificada o recombinante, que es toxina clostridial que ha tenido uno o más aminoácidos o secuencias de aminoácidos sometidos a deleción, modificados o redesplegados deliberadamente por métodos conocidos químicos/bioquímicos de modificación de aminoácidos o por el uso de tecnologías conocidas de células hospedadoras/vectores recombinantes, así como derivados o fragmentos de toxinas clostridiales así preparadas, e incluye toxinas clostridiales con una o más fracciones objeto anexas para un receptor de superficie celular presente en una célula.

Las toxinas botulínicas, para su uso de acuerdo con la presente invención, pueden almacenarse en forma liofilizada o secada al vacío en recipientes a presión de vacío. Antes de liofilización, la toxina botulínica puede combinarse con excipientes, estabilizadores y/o soportes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo albúmina. El material liofilizado o secado al vacío puede reconstituirse con suero salino o agua.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos exponen métodos específicos comprendidos por la presente invención y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención.

Ejemplo 1

Métodos para aliviar el dolor testicular por administración a un testículo

La administración de una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica de tipo A u otros tipos, a un testículo puede ser eficaz para aliviar, por ejemplo, un dolor causado por orquitis.

La orquitis es una inflamación de uno o los dos testículos, acompañada por inflamación, dolor, fiebre y una sensación de pesadez en la zona afectada.

Las paperas víricas son la causa más común de orquitis. Las infecciones bacterianas asociadas con el trastorno son tuberculosis, sífilis, gonorrea y clamidia. Una lesión mecánica en la ingle también puede causar orquitis. Entre el 15 y el 25% de varones con paperas que han pasado la edad de la pubertad desarrollan orquitis. La epididimo-orquitis (inflamación del testículo y parte del conducto espermático) es el tipo bacteriano más común de orquitis. Esta forma de la dolencia tiene lugar con la máxima frecuencia en varones sexualmente activos de quince años y más, y en hombres de más de 45 años con próstatas agrandadas.

Las personas más susceptibles a orquitis son aquellas con inoculación de paperas inadecuada y, en el caso de orquitis transmitida sexualmente, las que practican sexo inseguro o tienen una historia de enfermedad de transmisión sexual. La protección inadecuada del área de las ingles durante deportes de contacto u otras actividades físicas potencialmente dañinas puede producir lesiones que conduzcan a orquitis.

Un paciente varón de veinte años se presenta con orquitis del testículo izquierdo. Sus síntomas incluyen tumefacción del testículo izquierdo, hipersensibilidad en la zona de la ingle, fiebre, cefalea, náuseas, secreción con sangre desde el pene y dolor durante la micción, el coito o la eyaculación. El análisis de sangre muestra que la causa de la orquitis es infección bacteriana (gonorrea). El paciente comunica que tiene dolor en el testículo durante más de cuatro meses, y que ha debido ausentarse muchos días del trabajo.

El médico que lo trata le administra aproximadamente de 0,10 a aproximadamente 10 unidades de una toxina botulínica (por ejemplo, toxina botulínica de tipo A) directamente en el testículo izquierdo del paciente. Sin desear limitar la invención a ninguna teoría o mecanismo de operación, se cree que una administración de la toxina botulínica al testículo reduce la liberación de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, interleucina 6 y interleucina 8, dentro de la región del testículo. Se cree además que la reducción de estos factores de inflamación puede aliviar el dolor. Alternativamente, o adicionalmente, el médico puede administrar también de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 10 unidades de una toxina botulínica (por ejemplo, toxina botulínica de tipo A) al epidídimo del paciente.

Aproximadamente cinco días después de la administración de la toxina botulínica, el paciente comunica que el dolor en el testículo se alivia en aproximadamente el 30%. El paciente también comunica una mejoría en los demás síntomas de orquitis.

Ejemplo 2 Métodos para aliviar el dolor testicular por administración a un tejido conectado con un testículo

Una administración de una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica de tipo A u otros tipos, a un tejido conectado con un testículo puede ser eficaz para aliviar, por ejemplo, un dolor causado por cirugía (por ejemplo, síndrome de dolor postvasectomía).

El síndrome de dolor postvasectomía representa una causa muy específica de dolor testicular crónico. La etiología es desconocida con causas citadas comúnmente como espasmo del conducto deferente, dilatación del túbulo epididímico, inflamación, fibrosis perineural, extravasación de espermatozoides o un proceso todavía sin identificar. El síndrome de dolor postvasectomía ocurre en aproximadamente del 15 al 19% de los pacientes que han tenido una vasectomía (Granitsiotis y col., European Urology (2004) 45:430-436, en página 431).

A un paciente varón de 35 años se le diagnostica que tiene un síndrome de dolor postvasectomía en el testículo derecho. El médico que lo trata administra de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 10 unidades de una toxina botulínica (por ejemplo, toxina botulínica de tipo A) directamente al conducto deferente del paciente para aliviar el dolor.

El método de administración de la toxina botulínica comienza con el aislamiento del conducto deferente usando la técnica de los tres dedos (fig. 4). Empezando en el lado derecho del paciente, se coloca el dedo medio de la mano izquierda del médico debajo del escroto y se tira de las estructuras del cordón espermático desde la línea media lateralmente hasta que el conducto deferente queda atrapado entre el dedo medio, el pulgar y el dedo índice. La posición del pulgar está justo debajo del sitio óptimo para la herida de punción. El dedo medio eleva y aísla el conducto. El dedo índice estabiliza el conducto. Una vez que el conducto se fija firmemente usando la técnica de los tres dedos, el médico administra la toxina botulínica al conducto, preferentemente a la pared del conducto.

Sin desear limitar la invención a ninguna teoría o mecanismo de operación, se cree que la administración de una toxina botulínica al conducto deferente reduce el espasmo del conducto deferente para aliviar el dolor.

Aproximadamente una semana después de la administración de la toxina botulínica, el paciente comunica que el dolor en el testículo se alivia aproximadamente en el 50%. Un mes después de la administración, el paciente comunica que el dolor se alivia en más del 75%.

Ejemplo 3

Métodos para aliviar el dolor testicular por administración a un nervio que inerva el testículo

Una administración de una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica de tipo A u otros tipos, a un nervio que inerva el testículo puede ser eficaz para aliviar, por ejemplo, un dolor referido.

Un dolor testicular crónico puede ser un dolor referido. Cualquier órgano que comparta la misma ruta nerviosa con el contenido escrotal puede presentar dolor en la región testicular. El dolor que nace en el uréter, la cadera, el prolapso de un disco intervertebral y neuropatías de atrapamiento del nervio ilioinginal o genitofemoral, debido a menudo a hernias inguinales o después de su reparación, son algunas de las causas secundarias de dolor testicular crónico.

Se diagnostica a un paciente que tiene un dolor testicular crónico referido, resultante de un prolapso de disco intervertebral. El médico que lo trata administra de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 10 unidades de una toxina botulínica (por ejemplo, toxina botulínica de tipo A) directamente al cordón espermático del paciente para aliviar el dolor. La administración puede conseguirse usando una técnica similar a la técnica de los tres dedos del Ejemplo 3, en la que el médico aísla el cordón espermático y administra al mismo la toxina botulínica.

Preferentemente, el médico administra la toxina botulínica específicamente a un filamento nervioso de un nexo espermático dentro del cordón espermático (fig. 2) para tratar el dolor.

Ejemplo 4

Métodos para aliviar el dolor testicular por administración a un plexo nervioso que inerva el testículo del paciente

La administración de una toxina botulínica, por ejemplo una toxina botulínica de tipo A u otros tipos a un plexo nervioso que inerva el testículo puede ser eficaz para aliviar, por ejemplo, un dolor causado por traumatismo en el testículo.

El traumatismo testicular es relativamente infrecuente, a pesar de la posición expuesta de los testículos en el perineo masculino. Las lesiones testiculares pueden dividirse en 3 grandes categorías basadas en el mecanismo de la lesión. Estas categorías incluyen (1) traumatismo romo, (2) traumatismo penetrante y (3) traumatismo al desenguantar. Las lesiones ocurren normalmente en hombres de 15 a 40 años.

Son esenciales una historia cuidadosa y una exploración física detallada para un diagnóstico preciso. Los estudios escrotales de ecografía con Doppler son especialmente útiles para determinar la naturaleza y la extensión de la lesión. El traumatismo testicular penetrante requiere habitualmente exploración escrotal para determinar la gravedad de la lesión testicular, para evaluar la integridad estructural del testículo y para controlar la hemorragia intraescrotal. Si se viola la tunica albuginea, son necesarios la exploración quirúrgica precoz, el desbridamiento y el cierre de la tunica albuginea.

Los pacientes se presentan normalmente en el departamento de urgencias con una historia bastante directa de lesión (por ejemplo, lesión deportiva, patada en la ingle, herida de bala) poco después de que se produzca el episodio.

Se diagnostica a un paciente dolor testicular debido a traumatismo romo en el testículo. El paciente muestra síntomas de dolor escrotal grave, náuseas y vómitos. La exploración física revela un testículo tumefacto, gravemente hipersensible con hematoma visible. Puede estar presente equimosis escrotal o perineal.

El médico que lo trata administra de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 10 unidades de una toxina botulínica (por ejemplo, toxina botulínica de tipo A) directamente al nexo espermático del paciente (fig. 2) para aliviar el dolor.

En la presente invención puede usarse con eficacia una amplia variedad de toxinas botulínicas. Adicionalmente, la presente invención incluye formulaciones en las que se administran dos o más toxinas botulínicas de forma concurrente o consecutiva. Por ejemplo, puede administrarse toxina botulínica de tipo A hasta una pérdida de respuesta clínica o hasta que se desarrollen anticuerpos de neutralización, seguido por administración también de una toxina botulínica de tipo B o E. Alternativamente, puede administrarse localmente una combinación de dos cualesquiera o más de los serotipos botulínicos A-G para controlar el inicio y la duración del resultado terapéutico deseado. Además, pueden administrarse compuestos de toxinas no clostridiales antes de, concurrentemente con o después de administración de la toxina botulínica de manera que se proporcione un efecto auxiliar como un inicio potenciado o más rápido de desnervación antes de que la toxina clostridial, por ejemplo una toxina botulínica, empiece a ejercer su efecto terapéutico.

Claims

1. Una toxina botulínica para uso en un método para aliviar un dolor testicular, comprendiendo el método la etapa de administrar localmente la toxina botulínica a por lo menos un sitio anatómico seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a): un testículo; y

(b): un tejido asociado con el testículo;

aliviando así el dolor testicular.

2. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que el tejido asociado con el testículo comprende un tejido conjuntivo, un tejido muscular o un tejido nervioso.

3. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que el tejido asociado con el testículo comprende un conducto deferente, un epidídimo y un cordón espermático.

4. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que la toxina botulínica se administra a un conducto deferente, un epidídimo o un cordón espermático.

5. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que el tejido asociado con el testículo comprende por lo menos un tejido nervioso seleccionado entre el grupo que consiste en un nervio que inerva el testículo y un plexo nervioso que inerva el testículo.

6. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que el tejido asociado con el testículo comprende por lo menos un tejido nervioso seleccionado entre el grupo que consiste en una rama del nervio ilioinguinal del plexo lumbar, una rama del nervio lumboinguinal del plexo lumbar, una rama del nervio perineal superficial del nervio pudendo interno, una rama del nervio pudendo del nervio cutáneo femoral posterior y un filamento de plexo espermático.

7. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que el tejido asociado con el testículo comprende un plexo espermático.

8. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que la toxina botulínica se selecciona entre el grupo que consiste en toxinas botulínicas de tipos A, B, C_{1}, D, E, F y G.

9. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que la toxina botulínica es una toxina botulínica de tipo A.

10. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que la toxina botulínica es una toxina botulínica de tipo A_{1}
o A_{2}.

11. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que el dolor es un dolor testicular crónico.

12. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que el dolor está

(i): causado por orquitis, o

(ii): causado por una epididimitis, o

(iii): causado por una obstrucción del conducto deferente, o

(iv): causado por un espasmo del conducto deferente.

13. La toxina botulínica de la reivindicación 1 en la que el dolor es un síndrome de dolor postvasectomía.

14. La toxina botulínica de cualquiera de las reivindicaciones 1, 8, 9 y 10, en la que el método es para aliviar un dolor testicular postvasectomía, comprendiendo el método la etapa de administrar localmente una toxina botulínica a un cordón espermático.

15. La toxina botulínica de cualquiera de las reivindicaciones 1, 8, 9 y 10, en la que el método comprende la etapa de administrar entre aproximadamente 1 unidad y aproximadamente 500 unidades de una toxina botulínica a por lo menos un sitio anatómico seleccionado entre el grupo que consiste en un testículo y un tejido asociado con el testículo.