ES2331015T3

ES2331015T3 - Proceso para la preparacion de un glatiramero.

Info

Publication number: ES2331015T3
Application number: ES05824006T
Authority: ES
Inventors: Anup Kumar Ray; Hiren Kumar V. Patel; Johannes Ludescher; Mariappan Anbazhagan; Mahendra R. Patel; Ingolf Macher
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 2004-10-29
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2009-12-18
Anticipated expiration: 2025-10-27
Also published as: US20100234566A1; US20080021200A1; DE602005016292D1; JP2008518930A; TW200634051A; CN101044188A; EP1807467A1; IL233618A0; WO2006050122A1; AU2005302500A1; SI1807467T1; US20100234272A1; AU2005302500B2; CA2583589A1; US20100174048A1; US20060154862A1; ATE440888T1; TWI307349B; AR052321A1; IL182581A0

Abstract

Un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamina y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende: (i) la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de N-t-butoxicarbonil L-lisina, en solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un polipéptido protegido, en donde el Lglutamato protegido se selecciona del grupo que consiste de gamma-p-metoxibencil L-glutamato, gamma-bencil Lglutamato y mezclas de los mismos; y (ii) la adición de un ácido al polipéptido protegido formado en la Etapa (i) para formar un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho ácido escinde al grupo gamma-p-metoxibencilo de la fracción de glutamato y al grupo N-t-butoxicarbonilo de la fracción de lisina.

Description

Proceso para la preparación de un glatirámero.

Campo de la invención

La presente invención proporciona procesos para la preparación de un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Más específicamente, la invención proporciona procesos para la preparación de acetato de glatirámero.

Antecedentes de la invención

COPAXONE® es el nombre comercial del acetato de glatirámero, un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de esclerosis múltiple. COPAXONE® es conocido también como Copolímero-1. La etiqueta de COPAXONE® describe que COPAXONE® consiste de las sales de acetato de polipéptidos sintéticos, que contienen cuatro aminoácidos naturales: ácido L-glutámico, L-alanina, L-tirosina y L-lisina con una fracción molar promedio de 0,141, 0,427, 0,095 y 0,338, respectivamente, y tiene un peso molecular promedio de 4,7 - 11,0 kilodaltons (kDa). COPAXONE® incluye una mezcla de polipéptidos que tienen diferentes pesos moleculares y secuencias. La fórmula estructural de COPAXONE® es:

(Glu, Ala, Lys, Tyr)_{x} \cdot xCH_{3}COOH

(C_{5}H_{9}NO_{4} \cdot C_{3}H_{7}NO_{2} \cdot C_{6}H_{14}N_{2}O_{2} \cdot C_{9}H_{11}NO_{3})_{x} \cdot xC_{2}H_{4}O_{2}

COPAXONE® es un polvo de color entre blanco y blanquecino, liofilizado, estéril que contiene 20 mg de acetato de glatirámero y 40 mg de manitol. Se suministra en viales para un solo uso para administración subcutánea después de reconstituirlo con agua estéril.

El proceso para la preparación del Copolímero-1 o acetato de glatirámero ha sido descrito en las patentes estadounidenses Nos. 3.849.550; 5.800.808; 5.981.589; 6.048.898; 6.054.430; 6.342.476; y 6.362.161. El proceso para la síntesis de acetato de glatirámero se basa en la polimerización de N-carboxianhídridos de tirosina, alanina, \gamma-bencil glutamato y N-trifluoroacetil lisina en dioxano anhidro a temperatura ambiente utilizando dietilamina como iniciador, para formar un polipéptido protegido. El desbloqueo de los grupos \gamma-bencilo (primera desprotección) se logra agitando el polipéptido protegido en bromuro de hidrógeno/ácido acético a temperatura ambiente. Estas condiciones también facilitan la escisión del copolímero. La siguiente etapa es la remoción de los grupos N-trifluoroacetilo (segunda desprotección) del copolímero por tratamiento con piperidina 1 M. En las etapas finales, se obtiene el acetato de glatirámero por purificación del copolímero a través de diálisis, seguido por tratamiento con ácido acético para formar la sal de acetato y por medio de otra purificación por diálisis contra agua. De este modo, estos procesos del estado del arte involucran la polimerización de cuatro N-carboxianhídridos, dos etapas de desprotección, dos etapas de purificación y una etapa de formación de sal de acetato.

La patente estadounidense No. 6.620.847 describe un proceso para preparar Copolímero-1 que involucra tratar el trifluoroacetilo del Copolímero-1 con piperidina acuosa para formar una solución de Copolímero-1 y la purificación del Copolímero-1.

La Publicación de la Solicitud de Patente Estadounidense No. 2004/0091956 describe un proceso en tres etapas para la preparación de acetato de glatirámero. El proceso involucra la polimerización de una mezcla de los N-carboxianhídridos de L-alanina, L-tirosina, L-glutamato protegido y L-lisina protegida, para obtener un polipéptido protegido o una sal del mismo; y desprotección del polipéptido protegido o una sal del mismo ya sea por hidrogenación por transferencia catalítica sobre paladio o hidrogenación catalítica sobre paladio bajo presión de
hidrógeno.

Resumen de la invención

La invención proporciona un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamato y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende:

(i): la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de L-glutamato protegido, y N-carboxianhídrido de N-t-butoxicarbonilo de L-lisina, en un solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un polipéptido protegido, en donde el L-glutamato protegido se selecciona del grupo que consiste de \gamma-p-metoxibencil L-glutamato, \gamma-bencil L-glutamato y mezclas de los mismos, y

(ii): la adición de un ácido al polipéptido protegido formado en la Etapa (i) para formar un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho ácido escinde al grupo \gamma-p-metoxibencilo de la fracción de glutamato y al grupo N-t-butoxicarbonilo de la fracción de lisina.

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La invención proporciona un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamato y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde dicho proceso comprende el tratamiento de un polipéptido protegido con una solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo para formar un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La invención proporciona un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamato y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde dicho proceso comprende:

(a)^{2}: la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de un L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de una L-lisina protegida, en solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un polipéptido protegido;

(b)^{2}: la mezcla de un ácido con el polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{2} en un solvente, para formar un producto; y

(c)^{2}: la mezcla de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoniaco y mezclas de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{2}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, para formar un polipéptido desprotegido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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(a)^{3}: la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de un L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de una L-lisina protegida, en solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un polipéptido protegido;

(b)^{3}: la mezcla de un ácido con el polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{3} en un solvente, para formar un producto; y

(c)^{3}: la mezcla de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o e metal alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{3}, y un solvente o una mezcla de un solvente y agua, para formar un polipéptido desprotegido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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Descripción de la invención

La presente invención se relaciona con procesos para la preparación de un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamato y L-lisina. El polipéptido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo es preferiblemente acetato de glatirámero.

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I. Proceso de Hidrólisis Ácida

En una modalidad de la invención, el proceso comprende:

(i): la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de N-t-butoxicarbonil L-lisina, en solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un polipéptido protegido, en donde el L-glutamato protegido se selecciona del grupo que consiste de \gamma-p-metoxibencil L-glutamato, \gamma-bencil L-glutamato y mezclas de los mismos; y

(ii): la adición de un ácido al polipéptido protegido formado en la Etapa (i) para formar un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho ácido escinde al grupo \gamma-p-metoxibencilo de la fracción de glutamato y al grupo N-t-butoxicarbonilo de la fracción de lisina.

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En una modalidad de la invención, el proceso comprende:

(a): la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de N-t-butoxicarbonil L-lisina, en solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un glatirámero protegido, en donde el L-glutamato protegido se selecciona del grupo que consiste de \gamma-p-metoxibencil L-glutamato, \gamma-bencil L-glutamato, y mezclas de los mismos;

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(b): la adición de un ácido al glatirámero protegido formado en la Etapa (a) para formar un glatirámero, en donde dicho ácido escinde al grupo \gamma-p-metoxibencilo de la fracción de glutamato y al grupo N-t-butoxicarbonilo de la fracción de lisina; y

(c): el tratamiento del glatirámero formado en la Etapa (b) con ácido acético para formar acetato de glatirámero.

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En la etapa de polimerización de los procesos de la invención, Etapa (i), Etapa (a), Etapa (a)^{1}, Etapa (a)^{1'}, Etapa (a)^{2},
Etapa (a)^{2'}, Etapa (a)^{3} y Etapa (a)^{3'}, la mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de N-t-butoxicarbonil L-lisina, es preferiblemente polimerizada a una temperatura aproximadamente desde 10ºC hasta aproximadamente 40ºC, más preferiblemente aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 30ºC. La reacción de polimerización tiene lugar preferiblemente durante un período aproximadamente desde 2 horas hasta aproximadamente 80 horas, más preferiblemente aproximadamente desde 20 horas hasta aproximadamente 50 horas. Lo más preferible, la reacción de polimerización tiene lugar durante un período de aproximadamente 24 horas a una temperatura de aproximadamente 25ºC.

El solvente aprótico polar se lo selecciona preferiblemente entre tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetil furano, dimetilformamida, dioxano, dimetoxietano, 1,2-dicloroetileno, dimetilsulfóxido y diclorometano. Más preferiblemente, el solvente aprótico polar es 1,4-dioxano. También se puede utilizar una mezcla de solventes apróticos polares.

El iniciador utilizado en la Etapa (i), Etapa (a), Etapa (a)^{1}, Etapa (a)^{1'}, Etapa (a)^{2}, Etapa (a)^{2'}, Etapa (a)^{3} y Etapa (a)^{3'}, el proceso de la invención puede ser cualquier iniciador de alquilamina, tal como una dialquil o trialquilamina. Cada uno de los grupos alquilo tiene preferiblemente 1 - 6 átomos de carbono. Un iniciador preferido de alquilamina es dietilamina. Preferiblemente, la dietilamina está presente en una cantidad aproximadamente desde 0,001 por ciento en peso (% en peso) hasta aproximadamente 2% en peso, más preferiblemente aproximadamente desde 0,01% en peso hasta aproximadamente 0,02% en peso, con base en el peso de la mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de N-t-butoxicarbonil L-lisina.

En una modalidad de la invención, se añade agua a la mezcla de polimerización después de la polimerización. La adición de agua trae como resultado la precipitación del polipéptido protegido. Se remueve preferiblemente el agua de la mezcla que contiene agua de la mezcla que contiene agua y al polipéptido protegido por medio de filtración al vacío y se seca el polipéptido protegido recuperado. Los métodos de secado son conocidos por aquellos capacitados en el arte, tal como el secado al vacío.

En la etapa de desprotección, Etapa (ii), del proceso de la invención, se añade un ácido al polipéptido protegido que se forma en la Etapa (i) para formar un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El ácido escinde al grupo \gamma-p-metoxibencilo o al grupo \gamma-bencilo de la fracción de glutamato y al grupo N-t-butoxicarbonilo de la fracción de lisina. Además, el ácido escinde los enlaces amida del polipéptido o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo formando fragmentos heterogéneos de polipéptido.

En la etapa de desprotección, Etapa (b), del proceso de la invención, se añade un ácido al glatirámero protegido formado en la Etapa (a) para formar un glatirámero. El ácido escinde al grupo \gamma-p-metoxibencilo o al grupo \gamma-bencilo de la fracción de glutamato y al grupo N-t-butoxicarbonilo de la fracción de lisina. Además, el ácido escinde los enlaces amida del glatirámero formando fragmentos heterogéneos de glatirámero.

Los ácidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido clorhídrico, bromuro de hidrógeno, fluoruro de hidrógeno, ácido metano sulfónico, ácido trifluorometano sulfónico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético y ácido sulfúrico. Se puede utilizar también una mezcla de ácidos. Los ácidos preferidos se seleccionan entre ácido trifluoroacético, una mezcla de ácido acético y ácido clorhídrico, una mezcla de ácido acético y bromuro de hidrógeno y una mezcla de ácido acético y ácido sulfúrico. Se puede añadir el ácido en la forma de una solución acuosa.

El ácido está preferiblemente presente en una cantidad aproximadamente desde 0,1% en peso hasta aproximadamente 100% en peso, más preferiblemente aproximadamente desde 1% en peso hasta aproximadamente 10% en peso, con base en el peso del polipéptido protegido o del glatirámero protegido. Lo más preferible, el ácido está presente en una cantidad aproximadamente desde 2% en peso hasta aproximadamente 6% en peso, con base en el peso el polipéptido protegido o glatirámero protegido.

La temperatura del medio de reacción durante la adición del ácido está preferiblemente aproximadamente entre 10ºC y aproximadamente 40ºC, más preferiblemente 15ºC y aproximadamente 30ºC. Se añade preferiblemente el ácido durante un período de tiempo aproximadamente desde 1 hora hasta aproximadamente 30 horas, con agitación. Lo más preferible, se añade el ácido al polipéptido preferido o glatirámero protegido a una temperatura aproximadamente de 25ºC durante un período aproximadamente desde 1 hora hasta aproximadamente 8 horas, con agitación.

Se remueve preferiblemente el exceso de ácido de la mezcla de reacción vertiendo la mezcla de reacción con nitrógeno, liofilización, o por medio de un evaporador rotatorio al vacío para obtener un polipéptido desprotegido en forma sólida. Sin embargo, se pueden utilizar también otras técnicas de separación conocidas por aquellos capacitados en el arte.

El polipéptido desprotegido o glatirámero desprotegido en la forma de una base libre o una sal de adición ácida se disuelve preferiblemente en agua o en una solución acuosa de ácido acético. Los fragmentos no deseados de polipéptido o glatirámero de bajo peso molecular, es decir, aproximadamente menores a 2 kDa, y los fragmentos de polipéptido o glatirámero de alto peso molecular, es decir, aproximadamente mayores a 40 kDa, preferiblemente se remueven por medio de métodos tales como diálisis o diafiltración. Las membranas preferidas incluyen a las membranas de celulosa parcialmente permeables, Visking, tal como la membrana Tamaño 6 que tiene un corte de peso molecular de 12 - 14 kDa, que se puede adquirir con Medicell International Ltd., y membranas de filtración de flujo tangencial (TFF), tales como Pellicon XL PLCCC 10 (50 cm^{2}) o PLCCC 5 (50 cm^{2}), de Millipore. En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido desprotegido o el glatirámero desprotegido se disuelve en agua y se lo someta a diálisis, seguido por una diálisis en solución acuosa de ácido acético.

Los presentes inventores han determinado que el polipéptido del peso molecular deseado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se pueden controlar por dilución, concentración del ácido añadido en la Etapa (ii) o en la Etapa (b), y/o por tiempo.

En una modalidad de la invención, se remueve el agua del polipéptido desprotegido. Un método preferido de remoción es por liofilización. En la liofilización, se congela la solución y se la lleva a vacío de tal manera que se vaporice el agua (hielo) al vacío (sublime) sin fundirse, quedando atrás los componentes no acuosos (polipéptido desprotegido y sal residual) sin ninguna alteración, es decir, sin descomposición química. El producto seco obtenido por liofilización contiene al polipéptido desprotegido y sal residual.

En una modalidad de la invención, se trata el polipéptido desprotegido con ácido acético glacial para formar sal acetato de glatirámero. Se recoge preferiblemente la sal acetato de glatirámero por liofilización para producir un producto de la sal acetato de glatirámero.

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II. Proceso de Transferencia de Fase

En una modalidad de la invención, el proceso para preparar un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamato y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, comprende el tratamiento de un polipéptido protegido con una solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo para formar un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una modalidad de la invención, el proceso comprende:

(a)^{1}: la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de un L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de una L-lisina protegida, en solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un polipéptido protegido; y

(b)^{1}: la adición de una solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo al polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{1} para formar un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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En una modalidad de la invención, el proceso comprende:

(a)^{1'}: la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de un \gamma-bencil L-glutamato y N-carboxianhídrido de N^{\varepsilon}-trifluoroacetil L-lisina, en solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un glatirámero protegido;

(b)^{1'}: la adición de una solución acuosa de un hidróxido alcalino o alcalinotérreo al glatirámero protegido formado en la Etapa (a)^{1'} para formar un glatirámero; y

(c)^{1'}: el tratamiento del glatirámero con ácido acético para formar acetato de glatirámero.

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En las etapas de desprotección, Etapa (b)^{1} y Etapa (b)^{1'}, del proceso de la invención, se añade una solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo al polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{1} o al glatirámero protegido formado en la Etapa (a)^{1'}. En la Etapa (b)^{1} y en la Etapa (b)^{1'}, se remueven los grupos de protección sobre la fracción de ácido glutámico, es decir, el grupo \gamma-bencilo, y los grupos de protección sobre la fracción de lisina, es decir, el grupo N^{\varepsilon}-trifluoroacetilo. Además, el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo escinde los enlaces amida del polipéptido o glatirámero formando fragmentos heterogéneos de polipéptido o de glatirámero.

Aunque no se desea estar atado por ninguna teoría particular, los presentes inventores creen que la remoción de los grupos de protección del polipéptido protegido o glatirámero protegido da como resultado una transferencia de fase del polipéptido desprotegido o glatirámero desprotegido de la fase orgánica desde la fase orgánica hasta la fase
acuosa.

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En ausencia de un amortiguador en la Etapa (b)^{1} o en la Etapa (b)^{1'}, el pH durante la Etapa (b)^{1} y la Etapa (b)^{1'}, es generalmente aproximadamente de 13 hasta aproximadamente 14 después de la adición de la solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo. En presencia de un amortiguador en la Etapa (b)^{1} o en la Etapa (b)^{1'}, el pH es generalmente aproximadamente de 8 hasta aproximadamente 12. Se puede añadir el amortiguador o se lo puede formar in situ. Un amortiguador preferido es un amortiguador de acetato tal como acetato de sodio.

El hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo es seleccionado preferiblemente entre hidróxido e calcio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de potasio e hidróxido de sodio. Más preferiblemente, el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo es hidróxido de sodio. Se puede utilizar también una combinación de hidróxidos de metal alcalino o alcalinotérreo.

El hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo está presente preferiblemente en una cantidad aproximadamente desde 0,1% en peso hasta aproximadamente 400% en peso, más preferiblemente aproximadamente desde 10% en peso hasta aproximadamente 300% en peso, con base en el peso del polipéptido protegido o glatirámero protegido. Lo más preferible, el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo está presente en una cantidad aproximadamente desde 140% en peso hasta aproximadamente 260% en peso, con base en el peso del polipéptido protegido o glatirámero protegido.

Se añade una solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo al polipéptido protegido o glatirámero protegido preferiblemente a una temperatura aproximadamente desde -78ºC hasta aproximadamente 40ºC, más preferiblemente -25ºC hasta aproximadamente 30ºC, durante un período de tiempo preferiblemente aproximadamente desde 1 hora hasta aproximadamente 30 horas. Lo más preferible, se añade una solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo al polipéptido protegido o glatirámero protegido preferiblemente a una temperatura aproximadamente desde -10ºC hasta aproximadamente 10ºC, por ejemplo, 0ºC, durante un período aproximadamente desde 1 hora hasta aproximadamente 8 horas, con agitación. La adición de una solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo da como resultado una separación de fase en donde se forman una fase orgánica y una fase acuosa.

La fase orgánica contiene sustancialmente el solvente aprótico polar y el polipéptido protegido o glatirámero protegido. La fase acuosa contiene sustancialmente agua, al hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, y al polipéptido desprotegido o glatirámero desprotegido en la forma de una base libre. La fase acuosa y la fase orgánica se separan preferiblemente por medio del uso de una centrífuga y decantación de la fase orgánica.

Una ventaja adicional del proceso de la invención es que la adición del hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo causa desprotección del polipéptido protegido para formar un polipéptido desprotegido, o desprotección del glatirámero protegido para formar un glatirámero desprotegido. Además, el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo causa la escisión de los enlaces amida en el polipéptido desprotegido o glatirámero desprotegido para formar fragmentos de polipéptido o glatirámero.

La fase acuosa es tratada preferiblemente con un ácido orgánico o mineral para lograr un pH aproximadamente de 7 hasta aproximadamente 8. Tales ácidos orgánicos o minerales para ajustar el pH son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte e incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido fórmico, ácido oxálico y ácido clorhídrico. Se prefiere el ácido clorhídrico diluido. La cantidad de ácido orgánico o mineral utilizada es preferiblemente una cantidad equivalente con base en la cantidad del hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo añadida durante la Etapa (b)^{1} o la Etapa (b)^{1'} que sea suficiente para producir un pH aproximadamente de 7 hasta aproximadamente 8.

Los fragmentos no deseados de polipéptido o de glatirámero de bajo peso molecular, es decir, aproximadamente menores a 2 kDa, y los fragmentos de polipéptido o de glatirámero de alto peso molecular, es decir, aproximadamente superiores a 40 kDa, preferiblemente son removidos por métodos tales como diálisis o diafiltración. Las membranas preferidas incluyen a las membranas de celulosa parcialmente permeables, Visking, tal como la membrana Tamaño 6 que tiene un corte de peso molecular de 12 - 14 kDa, que se puede adquirir con Medicell International Ltd., y membranas de filtración de flujo tangencial (TFF), tales como Pellicon XL PLCCC 10 (50 cm^{2}) o PLCCC 5 (50 cm^{2}), de Millipore. En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido desprotegido o el glatirámero desprotegido es sometido a diálisis en agua, seguido por diálisis en solución acuosa de ácido acético.

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III. Proceso Utilizando una Amina o Amoníaco

En una modalidad de la invención, el proceso comprende:

(b)^{2}: la mezcla de un ácido con el polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{2} y un solvente, para formar un producto, preferiblemente, se mezcla el ácido con una solución o suspensión que contiene al polipéptido protegido y solvente; y

(c)^{2}: la mezcla de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoniaco, y mezclas de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{2}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, para formar un polipéptido desprotegido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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En una modalidad de la invención, el proceso comprende:

(a)^{2'}: la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de un L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de una L-lisina protegida, en solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un glatirámero protegido, en donde dicho L-glutamato protegido es seleccionado del grupo que consiste de \gamma-p-metoxibencil L-glutamato, \gamma-bencil L-glutamato y mezclas de los mismos;

(b)^{2'}: la mezcla de un ácido con el glatirámero protegido formado en la Etapa (a)^{2'} y un solvente, para formar un producto;

(c)^{2'}: la mezcla de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoniaco, y mezclas de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{2'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, para formar un glatirámero desprotegido; y

(d)^{2'}: el tratamiento del glatirámero desprotegido formado en la Etapa (c)^{2'} con ácido acético para formar acetato de glatirámero.

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En la primera etapa de desprotección, Etapa (b)^{2} y Etapa (b)^{2'} del proceso de la invención, se mezcla un ácido con el polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{2} o el glatirámero protegido formado en la Etapa (a)^{2'}, y un solvente para formar un producto. Preferiblemente, se añade el ácido a una mezcla, es decir, una solución o suspensión, que contiene al polipéptido protegido o al glatirámero protegido y un solvente. En la Etapa (b)^{2} y en la Etapa (b)^{2'}, se remueven los grupos de protección sobre la fracción de ácido glutámico, es decir, el grupo \gamma-p-metoxibencilo y/o el grupo \gamma-bencilo. Aunque no se desea estar ligado a ninguna teoría particular, los presentes inventores creen que el ácido también escinde enlaces amida del polipéptido protegido o glatirámero protegido formando fragmentos heterogéneos de polipéptido o glatirámero.

Los ácidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido acético, ácido clorhídrico, bromuro de hidrógeno, fluoruro de hidrógeno, ácido metano sulfónico, ácido trifluorometano sulfónico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético y ácido sulfúrico. También se puede utilizar una mezcla de ácidos. Los ácidos preferidos se seleccionan entre ácido trifluoroacético, una mezcla de ácido acético y ácido clorhídrico, una mezcla de ácido acético y bromuro de hidrógeno y una mezcla de ácido acético y ácido sulfúrico. Se puede añadir el ácido en la forma de una solución acuosa.

El ácido está presente preferiblemente en una cantidad aproximadamente desde 0,1% en peso hasta aproximadamente 100% en peso, más preferiblemente aproximadamente desde 1% en peso hasta aproximadamente 10% en peso, con base en el peso del polipéptido protegido o del glatirámero protegido. Más preferiblemente, el ácido está presente en una cantidad aproximadamente desde 2% en peso hasta aproximadamente 6% en peso, con base en el peso del polipéptido protegido o del glatirámero protegido.

La temperatura del medio de reacción durante la adición del ácido está preferiblemente aproximadamente entre 10ºC hasta aproximadamente 40ºC, más preferiblemente 15ºC hasta aproximadamente 30ºC. Se añade preferiblemente el ácido durante un período de tiempo aproximadamente entre 1 hora y aproximadamente 30 horas, con agitación. Más preferiblemente, se añade el ácido al polipéptido protegido o al glatirámero protegido a una temperatura aproximadamente de 25ºC durante un período aproximadamente entre 1 hora hasta aproximadamente 8 horas, con agitación.

El solvente utilizado en la primera etapa de desprotección, Etapa (b)^{2} y Etapa (b)^{2'}, se selecciona entre solventes próticos polares y solvente apróticos polares. Preferiblemente, el solvente utilizado en la Etapa (b)^{2} y en la Etapa (b)^{2'}, se selecciona entre ácido acético, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetil furano, dimetilformamida, 1,4-dioxano, dimetoxietano, 1,2-dicloroetileno, dimetilsulfóxido y diclorometano. También se puede utilizar una mezcla de solventes. Más preferiblemente, el solvente utilizado en la Etapa (b)^{2} y en la Etapa (b)^{2'} es tetrahidrofurano o ácido acético.

La cantidad de solvente utilizada en la Etapa (b)^{2} y en la Etapa (b)^{2'} es preferiblemente aproximadamente desde 1 vez (en peso) hasta aproximadamente 1000 veces (en peso), más preferiblemente, aproximadamente desde 10 veces (en peso) hasta aproximadamente 500 veces (en peso), con base en la cantidad de polipéptido protegido o de glatirámero protegido que es utilizada en la Etapa (b)^{2} y en la Etapa (b)^{2'}.

En la segunda etapa de desprotección, Etapa (c)^{2} y en la Etapa (c)^{2'} de los procesos de la invención, se mezcla una sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoníaco y mezcla de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{2} y en la Etapa (b)^{2'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, para formar un polipéptido desprotegido o glatirámero desprotegido.

Preferiblemente, se añade la sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoníaco y mezclas de los mismos, a una mezcla, es decir, una solución o suspensión, que contiene al producto formado en la Etapa (b)^{2} o en la Etapa (b)^{2'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua. El amoníaco está en la forma de NH_{3} (acuoso) o NH_{3} (gaseoso). Preferiblemente, se utiliza una solución acuosa de amoníaco que tiene un pH de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 14. La adición de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoníaco y mezclas de los mismos, al producto formado en la Etapa (b)^{2} y en la Etapa (b)^{2'} remueve preferiblemente al grupo de protección, tal como el grupo N^{\varepsilon}-trifluoroacetilo, de la fracción de lisina. Preferiblemente, el polipéptido desprotegido es un glatirámero desprotegido en la forma de una base libre.

La sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoníaco y mezclas de los mismos, está presente preferiblemente en una cantidad aproximadamente desde 1 vez (en peso) hasta aproximadamente 1000 veces (en peso), más preferiblemente, aproximadamente desde 10 veces (en peso) hasta aproximadamente 500 veces (en peso), con base en el peso total del producto de la Etapa (b)^{2} o la Etapa (b)^{2'} que se utiliza en la Etapa (c)^{2} o en la Etapa (c)^{2'}. Más preferiblemente, la sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoníaco y mezclas de los mismos, está presente preferiblemente en una cantidad aproximadamente desde 50 veces (en peso) hasta aproximadamente 150 veces (en peso).

La sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoníaco y mezclas de los mismos, se mezcla preferiblemente con una solución o suspensión que contiene al producto formado en la Etapa (b)^{2}
o en la Etapa (b)^{2'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, a una temperatura aproximadamente desde 10ºC hasta aproximadamente 60ºC, más preferiblemente 15ºC hasta aproximadamente 40ºC, durante un período de tiempo preferiblemente aproximadamente desde 1 minuto hasta aproximadamente 60 horas, para formar un polipéptido desprotegido o glatirámero desprotegido. Los solventes adecuados incluyen, pero no se limitan a, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetil furano, dimetilformamida, 1,4-dioxano, dimetoxietano, 1,2-dicloroetileno, dimetilsulfóxido y diclorometano. Un solvente preferido es tetrahidrofurano.

Más preferiblemente, la sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoníaco y mezclas de los mismos, se mezcla con una solución o suspensión que contiene al producto formado en la Etapa (b)^{2} o en la Etapa (b)^{2'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, a una temperatura aproximadamente desde 20ºC hasta aproximadamente 30ºC, durante un período aproximadamente desde 1 hora hasta aproximadamente 30 horas, para formar un polipéptido desprotegido o un glatirámero desprotegido. Se remueve preferiblemente la diisopropi-
lamina o el amoníaco no reaccionados, o cualquier solvente o agua por medio de evaporación o destilación al vacío.

Los fragmentos no deseados de polipéptido o glatirámero de bajo peso molecular, es decir, aproximadamente menores a 2 kDa, y los fragmentos de polipéptido o glatirámero de alto peso molecular, es decir, aproximadamente mayores a 40 kDa, preferiblemente se remueven por medio de métodos tales como diálisis o diafiltración. Las membranas preferidas incluyen a las membranas de celulosa parcialmente permeables, Visking, tal como la membrana Tamaño 6 que tiene un corte de peso molecular de 12 - 14 kDa, que se puede adquirir con Medicell International Ltd., y membranas TFF, tales como Pellicon XL PLCCC 10 (50 cm^{2}) o PLCCC 5 (50 cm^{2}), de Millipore. En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido desprotegido o el glatirámero desprotegido es sometido a diálisis en agua, seguido por una diálisis en solución acuosa de ácido acético.

IV. Proceso que Utiliza un Hidróxido de Metal Alcalino o Alcalinotérreo, Carbonato o Hidrógenocarbonato

En una modalidad de la invención, el proceso comprende:

(b)^{3}: la mezcla de un ácido con el polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{3} y un solvente, para formar un producto, preferiblemente, se mezcla el ácido con una solución o suspensión que contiene al polipéptido protegido y solvente; y

(c)^{3}: la mezcla de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{3}, y un solvente o una mezcla de un solvente y agua, para formar un polipéptido desprotegido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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En una modalidad de la invención, el proceso comprende:

(a)^{3'}: la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de un L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de N^{\varepsilon}-trifluoroacetil L-lisina, en un solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un glatirámero protegido, en donde dicho L-glutamato protegido es seleccionado del grupo que consiste de \gamma-p-metoxibencil L-glutamato, \gamma-bencil L-glutamato y mezclas de los mismos;

(b)^{3'}: la mezcla de un ácido con una mezcla que contiene al glatirámero protegido formado en la Etapa (a)^{3} y un solvente, para formar un producto;

(c)^{3'}: la mezcla de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, con una mezcla que contiene al producto formado en la Etapa (b)^{3'}, y un solvente o una mezcla de un solvente y agua, para formar un glatirámero desprotegido; y

(d)^{3'}: el tratamiento del glatirámero desprotegido formado en la Etapa (c)^{3'} con ácido acético para formar acetato de glatirámero.

\vskip1.000000\baselineskip

En la primera etapa de desprotección, Etapa (b)^{3} y Etapa (b)^{3'} del proceso de la invención, se mezcla un ácido con el polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{3} o el glatirámero protegido formado en la Etapa (a)^{3'}, y un solvente para formar un producto. Preferiblemente, se añade el ácido a una mezcla, es decir, una solución o suspensión, que contiene al polipéptido protegido o al glatirámero protegido y un solvente. En la Etapa (b)^{3} y en la Etapa (b)^{3'}, se remueven los grupos de protección sobre la fracción de ácido glutámico, es decir, el grupo \gamma-p-metoxibencilo y/o el grupo \gamma-bencilo. Aunque no se desea estar ligado a ninguna teoría particular, los presentes inventores creen que el ácido también escinde enlaces amida del polipéptido protegido o glatirámero protegido formando fragmentos heterogéneos de
polipéptido.

El solvente utilizado en la primera etapa de desprotección, Etapa (b)^{3} y Etapa (b)^{3'}, se selecciona entre solventes próticos polares y solvente apróticos polares. Preferiblemente, el solvente utilizado en la Etapa (b)^{3} y en la Etapa (b)^{3'}, se selecciona entre ácido acético, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetil furano, dimetilformamida, 1,4-dioxano, dimetoxietano, 1,2-dicloroetileno, dimetilsulfóxido y diclorometano. También se puede utilizar una mezcla de solventes. Más preferiblemente, el solvente utilizado en la Etapa (b)^{2} y en la Etapa (b)^{2'} es tetrahidrofurano o ácido acético.

La cantidad de solvente utilizada en la Etapa (b)^{3} y en la Etapa (b)^{3'} es preferiblemente aproximadamente desde 1 vez (en peso) hasta aproximadamente 1000 veces (en peso), más preferiblemente, aproximadamente desde 10 veces (en peso) hasta aproximadamente 500 veces (en peso), con base en la cantidad de polipéptido protegido o de glatirámero protegido que es utilizada en la Etapa (b)^{3} y en la Etapa (b)^{3'}.

En la segunda etapa de desprotección, Etapa (c)^{3} y en la Etapa (c)^{3'}, de los procesos de la invención, se mezcla una sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezcla de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{3} y en la Etapa (b)^{3'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, para formar un polipéptido desprotegido o un glatirámero desprotegido.

Preferiblemente, se añade la sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, a una mezcla, es decir, una solución o suspensión, que contiene al producto formado en la Etapa (b)^{3} o en la Etapa (b)^{3'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua. La adición de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, al producto formado en la Etapa (b)^{3}
y en la Etapa (b)^{3'} remueve preferiblemente al grupo N^{\varepsilon}-trifluoroacetilo, de la fracción de lisina. Preferiblemente, el polipéptido desprotegido es un glatirámero desprotegido en la forma de una base libre.

Se selecciona la sustancia del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato y un hidrógenocarbonato, e incluye hidróxido de calcio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de potasio, hidróxido de bario, hidróxido de sodio, carbonato de calcio, carbonato de litio, carbonato de magnesio, carbonato de potasio, carbonato de sodio, hidrógeno carbonato de calcio, hidrógenocarbonato de litio, hidrógeno carbonato de magnesio, hidrógenocarbonato de potasio e hidrógenocarbonato de sodio. Más preferiblemente, la sustancia utilizada en la Etapa (c)^{3} o en la Etapa (c)^{3'} se selecciona del grupo que consiste de hidróxido de sodio, hidróxido de litio e hidróxido de potasio.

La sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, está presente preferiblemente en una cantidad aproximadamente desde 1 vez (en peso) hasta aproximadamente 1000 veces (en peso), más preferiblemente, aproximadamente desde 10 veces (en peso) hasta aproximadamente 500 veces (en peso), con base en la cantidad total del producto de la Etapa (b)^{3} o de la Etapa (b)^{3'} que es utilizada en la Etapa (c)^{3} o de la Etapa (c)^{3'}. Más preferiblemente, la sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, está presente en una cantidad aproximadamente desde 50 vez (en peso) hasta aproximadamente 150 veces (en peso).

La sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, se mezcla preferiblemente con una solución o suspensión que contiene al producto formado en la Etapa (b)^{3} o en la Etapa (b)^{3'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, a una temperatura aproximadamente desde 10ºC hasta aproximadamente 60ºC, más preferiblemente 15ºC hasta aproximadamente 40ºC, durante un período de tiempo preferiblemente aproximadamente desde 1 minuto hasta aproximadamente 60 horas, para formar un polipéptido desprotegido o glatirámero desprotegido. Los solventes adecuados incluyen, pero no se limitan a, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetil furano, dimetilformamida, 1,4-dioxano, dimetoxietano, 1,2-dicloroetileno, dimetilsulfóxido y diclorometano. Un solvente preferido es tetrahidrofurano.

Más preferiblemente, la sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, se mezcla con una solución o suspensión que contiene al producto formado en la Etapa (b)^{3} o en la Etapa (b)^{3}', y agua o una mezcla de un solvente y agua, a una temperatura aproximadamente desde 20ºC hasta aproximadamente 30ºC, durante un período aproximadamente desde 1 hora hasta aproximadamente 30 horas, para formar un polipéptido desprotegido o un glatirámero desprotegido. Se remueve preferiblemente el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, carbonato, hidrógenocarbonato o cualquier solvente o agua, por medio de evaporación o destilación al vacío.

La cantidad de solvente o una mezcla de un solvente y agua que se utiliza en la Etapa (c)^{3} o en la Etapa (c)^{3'}
es preferiblemente aproximadamente desde 1 vez (en peso) hasta aproximadamente 1000 veces (en peso), más preferiblemente, aproximadamente desde 10 veces (en peso) hasta aproximadamente 500 veces (en peso), con base en la cantidad total del producto de la Etapa (b)^{3} o de la Etapa (b)^{3'} que es utilizada en la Etapa (c)^{3} o de la Etapa (c)^{3'}.

Después de la segunda etapa de desprotección, Etapa (c)^{3} y Etapa (c)^{3'}, cualquiera de las capas se separa preferiblemente en un embudo de separación, o se remueve preferiblemente el solvente por evaporación o destilación al vacío. El polipéptido desprotegido o glatirámero desprotegido se obtiene preferiblemente como una solución en
agua.

Los fragmentos no deseados de polipéptido o de glatirámero de bajo peso molecular, es decir, aproximadamente menores a 2 kDa, y los fragmentos de polipéptido o de glatirámero de alto peso molecular, es decir, aproximadamente superiores a 40 kDa, preferiblemente son removidos por métodos tales como diálisis o diafiltración. Las membranas preferidas incluyen a las membranas de celulosa parcialmente permeables, Visking, tal como la membrana Tamaño 6 que tiene un corte de peso molecular de 12 - 14 kDa, que se puede adquirir con Medicell International Ltd., y membranas TFF, tales como Pellicon XL PLCCC 10 (50 cm^{2}) o PLCCC 5 (50 cm^{2}), de Millipore. En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido desprotegido o el glatirámero desprotegido es sometido a diálisis en agua, seguido por diálisis en solución acuosa de ácido acético.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran otros aspectos de la invención.

Los Ejemplos 1 - 7 se relacionan con un proceso de hidrólisis ácida para la preparación de acetato de glatirámero.

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Ejemplo 1 Preparación de un Polipéptido Protegido

Se colocan en un balón de tres bocas N-carboxianhídrido de L-alanina (860 mg, 7,5 mmol), N-carboxianhídrido de \gamma-bencil L-glutamato (600 mg, 2,3 mmol), N-carboxianhídrido de N-t-butoxicarbonil L-lisina (1410 mg, 5,2 mmol) y N-carboxianhídrido de L-tirosina (300 mg, 1,4 mmol). Se añade dioxano anhidro destilado (57 mL). Se añade dietilamina (3,4 \muL). Se agita mecánicamente la mezcla resultante durante 24 horas a una temperatura aproximadamente de 22 - 25ºC. Se vierte lentamente la mezcla en 100 mL de agua desionizada y se filtra al vacío. Se mantiene al sólido al vacío durante 12 horas.

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Ejemplo 2 Preparación de un Polipéptido Protegido

Se colocan en un balón de tres bocas N-carboxianhídrido de L-alanina (430 mg, 3,75 mmol), N-carboxianhídrido de \gamma-bencil L-glutamato (300 mg, 1,15 mmol), N-carboxianhídrido de N-t-butoxicarbonil L-lisina (705 mg, 2,6 mmol) y N-carboxianhídrido de L-tirosina (150 mg, 0,7 mmol). Se añade dioxano anhidro destilado (28,5 mL). Se añade dietilamina (1,7 \muL). Se agita mecánicamente la mezcla resultante durante 24 horas a una temperatura aproximadamente de 22-25ºC. Se vierte lentamente la mezcla en 100 mL de agua desionizada y se filtra al vacío. Se mantiene al sólido al vacío durante 12 horas.

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Ejemplo 3 Desprotección del Polipéptido Protegido Preparado en el Ejemplo 1 con HBr/Ácido Acético

Se suspende el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 1 (200 mg) en 7 mL de bromuro de hidrógeno al 33% en ácido acético. Se disuelve lentamente el material de partida formando una solución de color marrón rojizo. Se agita la mezcla durante 17 horas a una temperatura aproximadamente de 22ºC. Se evapora la solución de HBr/ácido acético hasta sequedad utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida. A este residuo, se le añaden 100 mL de agua para disolver el sólido. Se coloca la solución en una membrana de celulosa parcialmente permeable, Visking, que está en la forma de un tubo, Tamaño 6, que tiene un corte de peso molecular de 12 - 14 kDa. El tubo Tamaño 6 tiene un diámetro de 27/32 pulgadas, 21,5 mm y un ancho de 32 - 34 mm. Se puede obtener el tubo con Medicell International Ltd. Se agita el tubo que contiene la solución en un vaso de precipitados con agua. Se remueven los fragmentos de polipéptido que tienen un peso molecular aproximadamente menor a 2 kDa por ósmosis del tubo de diálisis. Se remueve el tubo del agua y se agita en un vaso de precipitados que contiene ácido acético al 0,3% en agua. Se remueve el producto resultante del tubo y se lo liofiliza para obtener acetato de glatirámero como un sólido puro de color blanco.

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Ejemplo 4 Desprotección del Polipéptido Protegido Preparado en el Ejemplo 1 con HCl/Ácido Acético

Se suspende el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 1 (200 mg) en 20 mL de una mezcla preparada a partir de 9,4 mL de ácido clorhídrico concentrado ajustada hasta 20 mL con ácido acético glacial. Se disuelve lentamente el material de partida formando una solución ligeramente turbia. Se agita la mezcla durante 17 horas a una temperatura aproximadamente de 22ºC. Se evapora la solución de HCl/ácido acético hasta sequedad utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida. A este residuo se le añaden 100 mL de agua para disolver el sólido. Se coloca la solución en una membrana de celulosa parcialmente permeable, Visking, que está en la forma de un tubo, Tamaño 6, que tiene un corte de peso molecular de 12 - 14 kDa. El tubo Tamaño 6 tiene un diámetro de 27/32 pulgadas, 21,5 mm y un ancho de 32 - 34 mm. Se puede obtener el tubo con Medicell International Ltd. Se agita el tubo que contiene la solución en un vaso de precipitados con agua. Se remueven los fragmentos de polipéptido que tienen un peso molecular aproximadamente menor a 2 kDa por ósmosis del tubo de diálisis. Se remueve el tubo del agua y se agita en un vaso de precipitados que contiene ácido acético al 0,3% en agua. Se remueve el producto resultante del tubo y se lo liofiliza para obtener acetato de glatirámero como un sólido puro de color blanco.

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Ejemplo 5 Desprotección del Polipéptido Protegido Preparado en el Ejemplo 2 con HCl/Ácido Acético

Se suspende el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 2 (200 mg) en 20 mL de una mezcla preparada a partir de 9,4 mL de ácido clorhídrico concentrado ajustada hasta 20 mL con ácido acético glacial. Se disuelve lentamente el material de partida formando una solución ligeramente turbia. Se agita la mezcla durante 17 horas a una temperatura aproximadamente de 22ºC. Se evapora la solución de HCl/ácido acético hasta sequedad utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida. A este residuo se le añaden 100 mL de agua para disolver el sólido. Se coloca la solución en una membrana de celulosa parcialmente permeable, Visking, que está en la forma de un tubo, Tamaño 6, que tiene un corte de peso molecular de 12 - 14 kDa. El tubo Tamaño 6 tiene un diámetro de 27/32 pulgadas, 21,5 mm y un ancho de 32 - 34 mm. Se puede obtener el tubo con Medicell International Ltd. Se agita el tubo que contiene la solución en un vaso de precipitados con agua. Se remueven los fragmentos de polipéptido que tienen un peso molecular aproximadamente menor a 2 kDa por ósmosis del tubo de diálisis. Se remueve el tubo del agua y se agita en un vaso de precipitados que contiene ácido acético al 0,3% en agua. Se remueve el producto resultante del tubo y se lo liofiliza para obtener acetato de glatirámero como un sólido puro de color blanco.

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Ejemplo 6 Determinación del peso molecular relativo por GPC utilizando un Detector de UV Condiciones del Detector de UV de GPC

Eluyente:: Amortiguador de fosfato 0,05 M, pH 7,4, 5,6 g de Na_{2}HPO_{4}, 116 g NaCl/4L de agua

Columna:: PSS Suprema, 10 \mum, 100 \ring{A}, 8 x 300 mm.

Temperatura:: 23ºC

Bomba:: TSP AS 3000 automuestreadora

Vol. de inyección:: 50 \muL

Concentración:: aproximadamente 2,0 mg/mL

Detector:: TSP UV2000 a 276 nm

Software del GPC:: PSS WinGPC Versión 7.2

Muestras:: COPAXONE® (Lote # 5308036) en donde el manitol ha sido removido por diálisis.

\quad: COPAXONE® (Lote # 8040341) en donde el manitol ha sido removido por diálisis.

\quad: La muestra A es acetato de glatirámero preparado en el Ejemplo 4 de acuerdo con el proceso de la invención.

\quad: La muestra B es acetato de glatirámero preparado en el Ejemplo 5 de acuerdo con el proceso de la invención.

Preparación de la Muestra:: Se dispersan las muestras pesadas en el eluyente y se deja reposar para una hidratación completa a temperatura ambiente aproximadamente durante 12 horas. Se filtra la solución de la muestra a través de una unidad de filtro 1.0 (Schleicher & Schuell)

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Los resultados del análisis por GPC están resumidos en la Tabla I.

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TABLA I

1

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Los resultados del análisis en la Tabla I muestran claramente que el peso molecular promedio del acetato de glatirámero preparado por medio del proceso de la invención, Muestras A y B, es de 8,551 kDa y 7,689 kDa, respectivamente, y el peso molecular promedio de COPAXONE® es de 7,923 kDa y 9,524 kDa, dependiendo del número del lote.

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Ejemplo 7 Determinación del peso molecular relativo por medio de cromatografía de permeación en gel (GPC) utilizando un detector de índice de refracción Condiciones del Detector de IR de GPC

Columna:: PSS Suprema, 10 \mum, 100 \ring{A}, 8 x 300 mm.

Temperatura:: 23ºC

Bomba:: TSP AS 3000 automuestreadora

Vol. de inyección:: 50 \muL

Concentración:: aproximadamente 2,0 mg/mL

Detector:: Shodex RI 71

Software del GPC:: PSS WinGPC Versión 7.2

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Los resultados del análisis por GPC con detector IR están resumidos en la Tabla II.

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TABLA II

2

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Los resultados del análisis en la Tabla I muestran claramente que el peso molecular promedio del acetato de glatirámero preparado por medio del proceso de la invención, Muestras A y B, es de 9,581 kDa y 8,224 kDa, respectivamente, y el peso molecular promedio del COPAXONE® es de 8,663 kDa y 9,641 kDa, dependiendo del número del lote.

Los Ejemplos 8 - 17 se relaciona con un proceso de transferencia de fase para preparar acetato de glatirámero.

Los presentes inventores han establecido una escala de 1 (baja) hasta 5 (alta) para cuantificar la influencia del compuestos alcalino (hidróxido de sodio) sobre la formación del glatirámero. Los resultados del análisis están resumidos en la Tabla III

TABLA III

3

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Los resultados en la Tabla III muestran claramente que se pueden utilizar soluciones de hidróxido de sodio 0,1 - 1,0 N para preparar los productos del polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la invención. Los resultados en la Tabla III también muestran que se prefiere el uso de una concentración de hidróxido de sodio de al menos 0,25 N para facilitar la separación de fase de la fase orgánica y de la fase acuosa.

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Ejemplo 8 Etapa de Polimerización (a)

Se colocan N-carboxianhídrido de tirosina (30 mg, 0,010 mm), N-carboxianhídrido de alanina (62 mg, 0,054 mm), N-carboxianhídrido de \gamma-bencil glutamato (42 mg, 0,016 mm) y N-carboxianhídrido de E-N-trifluoroacetil lisina (100 mg, 0,037 mm), en un balón de una sola boca con un agitador magnético. A esta mezcla se le añaden 20 mL de tetrahidrofurano seco. Se obtiene una solución clara. Se añade dietilamina (10 \muL). Se agita la mezcla resultante durante 48 horas. Se remueve el tetrahidrofurano por medio de evaporación. Se añade agua (150 mL) al residuo y se continúa la agitación. Se obtiene un sólido de color blanco. Se filtra el sólido y se lo seca en un desecador al vacío.

Se determina que el rendimiento es de 154 mg.

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Ejemplo 9 Etapa de Desprotección (b)

Se transfiere acetato de glatirámero protegido, 75 mg, preparado en el Ejemplo 8 a un balón de una sola boca equipado con un agitador magnético. Se añade tetrahidrofurano (15 mL) al balón y se agita. Se obtiene una solución clara. Se añade una solución acuosa de hidróxido de sodio (8 mL) 0,5 N. La adición de la solución de hidróxido de sodio hace que la mezcla se vuelva brumosa. Se agita la mezcla durante 1 hora a 24 - 26ºC. Se observa la formación de dos fases. Se separa la capa inferior y se acidula utilizando una solución acuosa diluida de HCl 1 N hasta pH = 6,0 con agitación. Se filtra la solución base cruda libre de glatirámero utilizando un filtro de nylon (Nylon Acrodisk de 0,2 micras).

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Ejemplo 10

Se transfiere el acetato de glatirámero protegido, 75 mg, preparado en el Ejemplo 8 a un balón de una sola boca equipado con un agitador magnético. Se añade tetrahidrofurano (15 mL) al balón y se agita. Se obtiene una solución clara. Se añade solución acuosa de hidróxido de sodio (10 mL) 0,25 N. La adición de solución de hidróxido de sodio hace que la mezcla se vuelva brumosa. Se agita la mezcla durante 16 horas a 25 - 26ºC. Se centrifuga la mezcla de reacción durante 15 minutos. Se observa la formación de dos fases. Se separa la capa inferior y se acidula utilizando una solución acuosa diluida de HCl 1 N hasta pH = 7 - 7,5 con agitación. Se continúa la agitación durante 30 minutos adicionales y se determina que el pH es de pH = 8,0. Se filtra la solución base cruda libre de glatirámero.

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Ejemplo 11 Etapa de Polimerización

Se colocan N-carboxianhídrido de tirosina (30 mg, 0,010 mm), N-carboxianhídrido de alanina (62 mg, 0,054 mm), N-carboxianhídrido de \gamma-bencil glutamato (42 mg, 0,016 mm) y N-carboxianhídrido de E-N-trifluoroacetil lisina (100 mg, 0,037 mm), en un balón de una sola boca con un agitador magnético. A esta mezcla se le añaden 20 mL de dioxano seco. Se obtiene una solución clara. Se añade dietilamina (10 \muL). Se agita la mezcla resultante durante 48 horas. A ésta se le añade agua (150 mL) lentamente con agitación. Se obtiene un sólido de color blanco. Se filtra el sólido y se lo seca en un desecador al vacío. Se determina que el rendimiento es de 170 mg.

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Ejemplo 12 Etapa de Desprotección

Se transfiere el acetato de glatirámero protegido, 75 mg, preparado en el Ejemplo 11 a un balón de una sola boca equipado con un agitador magnético. Se añade dioxano (15 mL) al balón y se agita. Se obtiene una solución clara. Se añade una solución acuosa de hidróxido de sodio (10 mL) 0,5 N. La adición de solución de hidróxido de sodio hace que la mezcla se vuelva brumosa. Se agita la mezcla durante 16 horas a 25 - 26ºC. Se centrifuga la mezcla de reacción durante 15 minutos. Se observa la formación de dos fases. Se separa la capa inferior y se acidula utilizando una solución acuosa diluida de HCl 1 N hasta pH = 7 - 7,5 con agitación. Se continúa la agitación durante 30 minutos adicionales y se determina que el pH es un pH = 8,0. Se filtra la solución base cruda libre de glatirámero.

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Ejemplo 13 Etapa de Desprotección Realizada a Menor Temperatura

Se transfiere el acetato de glatirámero protegido, 75 mg, preparado en el Ejemplo 12 a un balón de una sola boca equipado con un agitador magnético. Se añade tetrahidrofurano (15 mL) al balón y se reduce la temperatura de la solución a 0ºC. Se añade una solución acuosa de hidróxido de sodio (10 mL) 0,5 N, a la solución manteniendo una temperatura de 0ºC. La adición de solución de hidróxido de sodio hace que la mezcla se vuelva brumosa. Se agita la solución durante 3 horas a 0ºC. Se observa la formación de dos fases. Se separa la capa inferior y se acidula utilizando solución acuosa diluida de HCl hasta pH = 7 - 7,5 con agitación a 0ºC. Se continúa la agitación durante 30 minutos adicionales y se determina que el pH es aproximadamente un pH = 8,0. Se filtra la solución base cruda libre de glatirámero.

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Ejemplo 14 Etapa de Desprotección con Amortiguador de Acetato

Se transfiere el acetato de glatirámero protegido, 75 mg, preparado en el Ejemplo 12 a un balón de una sola boca equipado con un agitador magnético. Se añade tetrahidrofurano (15 mL) al balón y se reduce la temperatura de la solución a 0ºC. Se añade una solución acuosa de hidróxido de sodio (10 mL) 0,5 N, y ácido acético (2 mL) a la solución manteniendo una temperatura de 0ºC y un pH = 12. La adición de solución de hidróxido de sodio y ácido acético hace que la mezcla se vuelva brumosa. Se agita la solución durante 3 horas a 0ºC. Se observa la formación de dos fases. Se separa la capa inferior y se acidula utilizando solución acuosa diluida de HCl hasta pH = 7 - 7,5 con agitación a 0ºC. Se continúa la agitación durante 30 minutos adicionales y se determina que el pH es aproximadamente un pH = 8,0. Se filtra la solución base cruda libre de glatirámero.

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Ejemplo 15

Se transfiere el acetato de glatirámero protegido, 75 mg, preparado en el Ejemplo 8 a un balón de una sola boca equipado con un agitador magnético. Se añade dioxano (15 mL) al balón y se agita. Se obtiene una solución clara. Se añade una solución acuosa de hidróxido de sodio (10 mL) 0,25 N. La adición de la solución de hidróxido de sodio hace que la mezcla se vuelva brumosa. Se agita la mezcla durante 16 horas a 25 - 26ºC. Se centrifuga la mezcla de reacción durante 15 minutos. Se observa la formación de dos fases. Se separa la capa inferior y se acidula utilizando solución acuosa diluida de HCl hasta pH = 7 - 7,5 con agitación. Se continúa la agitación durante 30 minutos adicionales y se determina que el pH es un pH = 8,0. Se filtra la solución base cruda libre de glatirámero.

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Ejemplo 16 Diafiltración (Filtración de Flujo Tangencial)

Se diluye la solución base cruda libre de glatirámero en el Ejemplo 9 hasta 120 con agua. Se filtra primero la solución diluida a través de una membrana de diafiltración de 10 K, Pellicon XL, PLCCC 10 (50 cm^{2}), de Millipore, y luego, se filtra a través de una membrana de diafiltración de 10 K, Pellicon XL, PLCCC 5 (50 cm^{2}), de Millipore. Se liofiliza la solución concentrada obtenida. Se obtiene un polvo de color blanco.

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Ejemplo 17 Método Cromatográfico de Purificación de Acetato de Glatirámero

Se somete la solución base cruda libre de glatirámero prepara en el Ejemplo 9 a separación cromatográfica. Se prepara una columna para filtración por gel, FRACTOGEL TSK HW55 (600 x 26 mm) en un cartucho Superformance 26 de Merck de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se equilibra la columna con amortiguador de acetato de amonio 0,2 M pH 5,0, se cargan 30 mL de muestras de solución base libre de glatirámero (20 mg/mL, en acetato de amonio 0,2 M pH 5,0) sobre la columna y se recolectan fracciones cada 10 minutos. Se aísla una fracción que tiene un peso molecular promedio de 7 - 8 KDa.

Los Ejemplos 18 - 25 se relacionan con un proceso para la preparación de acetato de glatirámero utilizando un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, carbonato, o un hidrógenocarbonato.

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Ejemplo 18 Preparación de un Polipéptido Protegido

Se colocan N-carboxianhídrido de L-tirosina (207,19 mg, 1,0 mM), N-carboxianhídrido de L-alanina (620 mg, 5,4 mM), N-carboxianhídrido de \gamma-bencil L-glutamato (430 mg, 1,6 mM) y N-carboxianhídrido de N^{\varepsilon}-trifluoroacetil L-lisina (1,01 g, 3,73 mM), en un balón de una sola boca (100 mL) equipado con un agitador magnético. A esta mezcla se le añaden 40 mL de tetrahidrofurano. Se añade dietilamina (10 \muL). Se agita la mezcla resultante durante 24 horas a una temperatura aproximadamente de 25ºC. Se vierte lentamente la mezcla en 100 mL de agua mientras se agita. Se precipita un sólido. Se filtra el sólido después de 2 horas de agitación y se lava con agua. Se resuspende el sólido en 100 mL de agua y se filtra. Se mantiene el sólido al vacío aproximadamente durante 12 horas.

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Ejemplo 19 Preparación de un Polipéptido Protegido

Se colocan N-carboxianhídrido de L-tirosina (207,19 mg, 1,0 mM), N-carboxianhídrido de L-alanina (620 mg, 5,4 mM), N-carboxianhídrido de \gamma-bencil L-glutamato (430 mg, 1,6 mM) y N- N-carboxianhídrido de N^{\varepsilon}-trifluoroacetil L-lisina (1,01 g, 3,73 mM), en un balón de una sola boca (100 mL) equipado con un agitador magnético. A esta mezcla se le añaden 40 mL de dioxano. Se añade dietilamina (10 \muL). Se agita la mezcla resultante durante 48 horas a una temperatura aproximadamente de 25ºC. Se vierte lentamente la mezcla en 100 mL de agua mientras se agita. Se precipita un sólido. Se filtra el sólido y se lava con agua. Se resuspende el sólido en 100 mL de agua y se filtra. Se mantiene el sólido al vacío aproximadamente durante 12 horas.

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Ejemplo 20 Escisión de la Fracción de \gamma-Bencilo del Polipéptido Preparado en el Ejemplo 2

Se suspende el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 19, 100 mg, en tetrahidrofurano (20 mL) y se enfría en un baño de agua con hielo. Se añade ácido sulfúrico concentrado, 4 mL. Se agita la solución clara resultante durante 20 horas a una temperatura aproximadamente de 25ºC. Se remueve el solvente, tetrahidrofurano, por evaporación a 25ºC para formar un líquido viscoso. Se añade agua, 50 mL, al líquido viscoso con agitación. Se forma un precipitado de color blanco que se filtra al vacío y se seca sobre pentóxido de fósforo al vacío a 25ºC aproximadamente durante 12 horas en la oscuridad. Se obtiene un sólido de color blanco. Se filtra el sólido y se seca en un desecador al vacío. Se determina que el rendimiento es de 75 mg.

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Ejemplo 21 Escisión de la Fracción de N^{\varepsilon}-trifluoroacetilo del Polipéptido Preparado en el Ejemplo 20

Se dispersa el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 20, 75 mg, en 12 mL de tetrahidrofurano, se añaden 4 mL de hidróxido de sodio acuoso 0,5 M con agitación. Se agita la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC). Se separa la capa acuosa inferior y se acidula con ácido acético hasta pH = 6,0.

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Ejemplo 22 Escisión de la Fracción de \gamma-Bencilo del Polipéptido Preparado en el Ejemplo 19

Se suspende el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 19, 1 g, en 50 mL de una mezcla preparada a partir de 47 mL de HCl concentrado ajustado hasta 100 mL con ácido acético glacial. Se disuelve lentamente el material de partida formando una solución ligeramente turbia. Se agita la mezcla durante 18 horas a una temperatura aproximadamente de 22ºC. Se vierte la solución en 1.000 mL de agua agitada. Se forma un precipitado de color blanco. Se agita la suspensión durante otras 3 horas y luego se filtra. Se lava el producto con agua y se seca al vacío a 50ºC aproximadamente durante 17 horas.

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Ejemplo 23 Escisión de la Fracción de N^{\varepsilon}-trifluoroacetilo del Polipéptido Preparado en el Ejemplo 22

Se dispersa el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 22, 300 mg, en 45 mL de tetrahidrofurano, se añaden 25 mL de hidróxido de sodio acuoso 0,5 M con agitación. Se agita la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC). Se forma un sistema líquido claro en dos fases. Se separa la capa acuosa inferior y se acidula con ácido acético hasta pH = 6,0. Se coloca la solución incolora clara, en bolsas para diálisis y se dializa a temperatura ambiente una vez contra ácido acético acuoso al 0,3%, y luego contra agua hasta que se alcance un pH de 5.5. Se filtra esta solución y se liofiliza para producir acetato de glatirámero como un sólido de color blanco.

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Ejemplo 24 Diafiltración (Filtración de Flujo Tangencial)

Se ajusta la solución de acetato de glatirámero preparada en el Ejemplo 21 hasta 120 mL con agua hasta tener una concentración de 0,5 - 0,6 mg/mL del acetato de glatirámero. Se filtra primero la solución diluida a través de una membrana de diafiltración de 30 K, Pellicon XL, PLCCC 10 (50 cm^{2}), de Millipore, y luego, se filtra a través de una membrana de diafiltración de 3 K, Pellicon XL, PLCCC 5 (50 cm^{2}), de Millipore. Se liofiliza la solución concentrada obtenida para obtener acetato de glatirámero en forma sólida.

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Ejemplo 25 Método Cromatográfico de Purificación de Acetato de Glatirámero

Se concentra el glatirámero como extracto de pH = 6 preparado en el Ejemplo 23 al vacío hasta sequedad y se lo someta a separación cromatográfica. Se prepara una columna para filtración por gel, FRACTOGEL TSK HW55 (600 x 26 mm) en un cartucho Superformance 26 de Merck de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se equilibra la columna con amortiguador de acetato de amonio 0,2 M pH 5,0, se cargan 30 mL de muestras de solución base libre de glatirámero (20 mg/mL, en acetato de amonio 0,2 M pH 5,0) sobre la columna y se recolectan fracciones. Se aísla una fracción que tiene un peso molecular promedio de 7 - 10 KDa.

Los Ejemplos 26 - 33 se relacionan con un proceso para la preparación de acetato de glatirámero utilizando una amina o amoníaco.

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Ejemplo 26 Preparación de un Polipéptido Protegido

Se colocan N-carboxianhídrido de L-tirosina (207,19 mg, 1,0 mM), N-carboxianhídrido de L-alanina (620 mg, 5,4 mM), N-carboxianhídrido de \gamma-bencil L-glutamato (430 mg, 1,6 mM) y N-carboxianhídrido de N^{\varepsilon}-trifluoroacetil L-lisina (1,01 g, 3,73 mM), en un balón de una sola boca (100 mL) con un agitador magnético. A esta mezcla se la añaden 40 mL de tetrahidrofurano. Se añade dietilamina (10 \muL). Se agita la mezcla resultante durante 24 horas a una temperatura aproximadamente de 25ºC. Se vierte lentamente la mezcla en 100 mL de agua con agitación. Se precipita un sólido. Se filtra el sólido después de 2 horas de agitación y se lava con agua. Se resuspende el sólido en 100 mL agua y se filtra. Se mantiene el sólido al vacío aproximadamente durante 12 horas.

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Ejemplo 27 Preparación de un Polipéptido Protegido

Se colocan N-carboxianhídrido de L-tirosina (207,19 mg, 1,0 mM), N-carboxianhídrido de L-alanina (620 mg, 5,4 mM), N-carboxianhídrido de \gamma-bencil L-glutamato (430 mg, 1,6 mM) y N-carboxianhídrido de N^{\varepsilon}-trifluoroacetil L-lisina (1,01 g, 3,73 mM), en un balón de una sola boca (100 mL) con un agitador magnético. A esta mezcla se la añaden 40 mL de dioxano. Se añade dietilamina (10 \muL). Se agita la mezcla resultante durante 48 horas a una temperatura aproximadamente de 25ºC. Se vierte lentamente la mezcla en 100 mL de agua con agitación. Se precipita un sólido. Se filtra el sólido y se lava con agua. Se resuspende el sólido en 100 mL agua y se filtra. Se mantiene el sólido al vacío aproximadamente durante 12 horas.

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Ejemplo 28 Escisión de la Fracción de \gamma-Bencilo del Polipéptido Preparado en el Ejemplo 27

Se suspende el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 27, 100 mg, en tetrahidrofurano (20 mL) y se enfría en un baño de agua con hielo. Se añade ácido sulfúrico concentrado, 4 mL. Se agita la solución clara resultante durante 20 horas a una temperatura aproximadamente de 25ºC. Se remueve el solvente, tetrahidrofurano, por evaporación a 25ºC para formar un líquido viscoso. Se añade agua, 50 mL, al líquido viscoso con agitación. Se forma un precipitado de color blanco que se filtra al vacío y se seca sobre pentóxido de fósforo al vacío a 25ºC aproximadamente durante 12 horas en la oscuridad. Se obtiene un sólido de color blanco. Se filtra el sólido y se seca en un desecador al vacío. Se determina que el rendimiento es de 75 mg.

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Ejemplo 29 Escisión de la Fracción de \gamma-Bencilo del Polipéptido Preparado en el Ejemplo 27

Se suspende el polipéptido protegido preparado en el Ejemplo 27, 1 g, en 50 mL de una mezcla preparada a partir de 47 mL de HCl concentrado ajustado hasta 100 mL con ácido acético glacial. Se disuelve lentamente el material de partida formando una solución ligeramente turbia. Se agita la mezcla durante 18 horas a una temperatura aproximadamente de 22ºC. Se vierte la solución en 1.000 mL de agua agitada. Se forma un precipitado de color blanco. Se agita la suspensión durante otras 3 horas y luego se filtra. Se lava el producto con agua y se seca al vacío a 50ºC aproximadamente durante 17 horas.

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Ejemplo 30 Evaluación de Aminas que son Utilizadas para Escindir a la Fracción de N^{\varepsilon}-trifluoroacetilo del Polipéptido Preparado en el Ejemplo 28

Se suspende el polipéptido preparado en el Ejemplo 28, 75 mg, en 15 mL de agua. Se añade una amina, 7 mL, a la suspensión para obtener una concentración de amina de 3 M. Se suministra una lista de aminas en la Tabla IV. Ya que un polipéptido desprotegido es soluble en agua, se monitorea la reacción por medio de la claridad de la solución. Los resultados para cada una de las aminas se resumen en la Tabla IV.

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TABLA IV

4

Los resultados en la Tabla IV muestran claramente que se forma una forma de base libre del polipéptido preparado en el Ejemplo 28 únicamente después de diisopropilamina o isopropilamina. Los resultados en la Tabla I también muestran que dipropilamina, morfolina, N-metil-piperazina, diciclohexilamina, di-sec-butilamina, pirrolidina, y metilamina no producen una forma de base libre del polipéptido.

Por lo tanto, los solicitantes determinaron inesperadamente que en la segunda etapa de desprotección del proceso de la invención, Etapa (b), la diisopropilamina y la isopropilamina fueron las únicas aminas que removieron exitosamente al grupo N^{\varepsilon}-trifluoroacetilo de la fracción de lisina.

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Ejemplo 31 Escisión de la Fracción de N^{\varepsilon}-trifluoroacetilo del Polipéptido Preparado en el Ejemplo 28

Se suspende el polipéptido preparado en el Ejemplo 28, 75 mg, en 15 mL de agua. Se añade diisopropilamina, 7 mL, a la suspensión para obtener una concentración de amina de 3 M. Una solución lechosa se torna clara aproximadamente en 1 hora y se agita la solución clara a 25ºC durante 20 horas. Se evapora la mezcla de reacción aproximadamente a 25ºC para formar una base cruda libre de glatirámero en la forma de un líquido viscoso. Se añade ácido acético al cincuenta por ciento (50%) ácido acético (15 mL) a la mezcla y se agita durante 30 minutos para formar una solución de acetato de glatirámero.

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Ejemplo 32 Diafiltración (Filtración de Flujo Tangencial)

Se diluye la solución de glatirámero preparada en el Ejemplo 31 hasta 120 con agua. Se filtra primero la solución diluida a través de una membrana de diafiltración de 30 K, Pellicon XL, PLCCC 10 (50 cm^{2}), de Millipore, y luego, se filtra a través de una membrana de diafiltración de 3 K, Pellicon XL, PLCCC 5 (50 cm^{2}), de Millipore. Se liofiliza la solución concentrada obtenida para producir acetato de glatirámero en forma sólida.

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Ejemplo 33 Método Cromatográfico de Purificación de Acetato de Glatirámero

Se concentra la solución de acetato de glatirámero preparada en el Ejemplo 31 al vacío hasta sequedad y se la someta a separación cromatográfica. Se prepara una columna para filtración por gel, FRACTOGEL TSK HW55 (600 x 26 mm) en un cartucho Superformance 26 de Merck de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se equilibra la columna con amortiguador de acetato de amonio 0,2 M pH 5,0, se cargan 30 mL de muestras de solución base libre de glatirámero (20 mg/mL, en acetato de amonio 0,2 M pH 5,0) sobre la columna y se recolectan fracciones. Se aísla una fracción que tiene un peso molecular promedio de 7 - 10 KDa.

Aunque la invención ha sido descrita con referencia particular a ciertas modalidades de la misma, se entenderá que aquellos capacitados en el arte pueden hacer cambios y modificaciones dentro del alcance y el espíritu de las siguientes reivindicaciones.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 3849550 A [0004]: \bullet US 6342476 A [0004]

\bullet US 5800808 A [0004]: \bullet US 6362161 A [0004]

\bullet US 5981589 A [0004]: \bullet US 6620847 B [0005]

\bullet US 6048898 A [0004]: \bullet US 20040091956 A [0006]

\bullet US 6054430 A [0004]

Claims

1. Un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamina y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende:

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2. Un proceso para la preparación de acetato de glatirámero que comprende:

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3. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 1, en donde se selecciona al ácido del grupo que consiste de ácido acético, ácido clorhídrico, bromuro de hidrógeno, fluoruro de hidrógeno, ácido metano sulfónico, ácido trifluorometano sulfónico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido sulfúrico y mezclas de los mismos.

4. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 3, en donde el ácido es ácido trifluoroacético, o en donde el ácido es una mezcla de ácido acético y ácido clorhídrico, o en donde el ácido es una mezcla de ácido acético y bromuro de hidrógeno, o en donde el ácido es una mezcla de ácido acético y ácido sulfúrico.

5. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 2, en donde el acetato de glatirámero tiene un peso molecular promedio aproximadamente de 2 kDa hasta aproximadamente 30 kDa, o aproximadamente de 4,7 kDa hasta aproximadamente 11 kDa, o aproximadamente de 7 kDa hasta aproximadamente 10 kDa.

6. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 1, en donde el polipéptido está sustancialmente libre de fragmentos de polipéptido que tienen un peso molecular aproximadamente superior a 40 kDa, o está sustancialmente libre de fragmentos de polipéptido que tienen un peso molecular aproximadamente de menos de 2 kDa.

7. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 1, en donde la Etapa (ii) es llevada a cabo a una temperatura aproximadamente de 10ºC hasta aproximadamente 40ºC, o a una temperatura aproximadamente desde 15ºC hasta aproximadamente 30ºC, o a una temperatura aproximadamente desde 22ºC hasta aproximadamente 250ºC.

8. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 1, en donde el iniciador es dietilamina.

9. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 1, en donde se selecciona el solvente aprótico polar del grupo que consiste de tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetil furano, dimetilformamida, 1,4-dioxano, dimetoxietano, 1,2-dicloroetileno, dimetilsulfóxido, diclorometano y mezclas de los mismos, o el solvente aprótico polar es 1,4-dioxano, o el solvente aprótico polar es tetrahidrofurano.

10. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 1, en donde el ácido está presente en una cantidad aproximadamente desde 0,1 por ciento en peso (% en peso) hasta aproximadamente 100% en peso, con base en el peso total del polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

11. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 10, en donde el ácido está presente en una cantidad aproximadamente desde 1% en peso hasta aproximadamente 10% en peso, con base en el peso total del polipéptido o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o el ácido está presente en una cantidad aproximadamente desde 2% en peso hasta aproximadamente 6% en peso, con base en el peso total del polipéptido o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

12. Un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamina y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende el tratamiento de un polipéptido protegido con una solución acuosa de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo para formar un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

13. Un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamina y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende:

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14. Un proceso para la preparación de acetato de glatirámero que comprende:

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15. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 13, en donde la Etapa (b)^{1} es llevada a cabo a una temperatura aproximadamente desde -78ºC hasta aproximadamente 40ºC, o es llevado a cabo a una temperatura aproximadamente desde -25ºC hasta aproximadamente 30ºC, o es llevado a cabo a una temperatura aproximadamente desde -10ºC hasta aproximadamente 130ºC, o es llevado a cabo a una temperatura aproximadamente desde 0ºC.

16. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 12 en donde el pH es aproximadamente de 13 hasta aproximadamente 14.

17. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 12 que comprende adicionalmente un amortiguador.

18. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 17, en donde el amortiguador es un amortiguador de acetato y el pH es aproximadamente de 8 hasta aproximadamente 12.

19. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 12, en donde se selecciona el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo del grupo que consiste de hidróxido de calcio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de potasio, hidróxido de sodio y mezclas de los mismos.

20. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 12, en donde el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo está presente en una cantidad aproximadamente desde 0,1% en peso hasta aproximadamente 400% en peso, con base en el peso total del polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo está presente en una cantidad aproximadamente desde 10% en peso hasta aproximadamente 300% en peso, con base en el peso del polipéptido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o el hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo está presente en una cantidad aproximadamente desde 140% en peso hasta aproximadamente 260% en peso, con base en el peso total del polipéptido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

21. Un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamina y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende:

(b)^{2}: la mezcla de un ácido con el polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{2} y un solvente, para formar un producto; y

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22. Un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamina y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende:

(b)^{2}: la mezcla de un ácido con una solución o suspensión que contiene al polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{2} y un solvente, para formar un producto; y

(c)^{2}: la mezcla de una sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoniaco, y mezclas de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{2'}, y agua o una mezcla de un solvente y agua, para formar un polipéptido desprotegido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

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23. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 21, en donde la L-lisina protegida es N^{\varepsilon}-trifluoroacetil L-lisina.

24. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 21, en donde se selecciona al L-glutamato protegido del grupo que consiste de \gamma-p-metoxibencil L-glutamato, \gamma-bencil L-glutamato y mezclas de los mismos.

25. Un proceso para la preparación de acetato de glatirámero que comprende:

(a)^{2'}: la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de un L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de una L-lisina protegida, en un solvente aprótico polar en presencia de un iniciador, para formar un glatirámero protegido, en donde dicho L-glutamato protegido es seleccionado del grupo que consiste de \gamma-p-metoxibencil L-glutamato, \gamma-bencil L-glutamato y mezclas de los mismos;

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26. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 21, en donde se selecciona al solvente utilizado en la Etapa (b)^{2} del grupo que consiste de solventes próticos polares, solventes apróticos polares y mezclas de los mismos.

27. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 25, en donde se selecciona al solvente del grupo que consiste de ácido acético, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetil furano, dimetilformamida, 1,4-dioxano, dimetoxietano, 1,2-dicloroetileno, dimetilsulfóxido y diclorometano.

28. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 21, en donde la sustancia seleccionada del grupo que consiste de diisopropilamina, isopropilamina, amoníaco y mezclas de los mismos, está presente en una cantidad aproximadamente desde 1 vez (en peso) hasta aproximadamente 1000 veces (en peso), con base en el peso total del producto de la Etapa (b)^{2} que se utiliza en la Etapa (c)^{2}, o está presente en una cantidad aproximadamente desde 10 veces (en peso) hasta aproximadamente 500 veces (en peso), o está presente en una cantidad aproximadamente desde 50 veces (en peso) hasta aproximadamente 150 veces (en peso).

29. Un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamina y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende:

(a)^{3}: la polimerización de una mezcla de N-carboxianhídrido de L-tirosina, N-carboxianhídrido de L-alanina, N-carboxianhídrido de un L-glutamato protegido y N-carboxianhídrido de una L-lisina protegida, en un solvente aprótico polar en la presencia de un iniciador, para formar un polipéptido protegido;

(b)^{3}: la mezcla de un ácido con el polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{3} y un solvente, para formar un producto; y

(c)^{3}: la mezcla de un sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, con el producto formado en la Etapa (b)^{3}, y un solvente o una mezcla de un solvente y agua, para formar un polipéptido desprotegido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

30. Un proceso para la preparación de un polipéptido que contiene L-tirosina, L-alanina, L-glutamina y L-lisina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho proceso comprende:

(b)^{3}: la mezcla de un ácido con una mezcla que contiene al polipéptido protegido formado en la Etapa (a)^{3} y un solvente, para formar un producto; y

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31. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 29, en donde la L-lisina protegida es N^{\varepsilon}-trifluoroacetil L-lisina.

32. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 29, en donde el L-glutamato protegido es seleccionado del grupo que consiste de \gamma-p-metoxibencil L-glutamato, \gamma-bencil L-glutamato y mezclas de las mismas.

33. Un proceso para la preparación de acetato de glatirámero que comprende:

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34. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 29, en donde el solvente utilizado en la Etapa (b)^{3} es seleccionado del grupo que consiste de solventes próticos polares, solventes apróticos polares y mezclas de los mismos.

35. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 34, en donde el solvente es seleccionado del grupo que consiste de ácido acético, tetrahidrofurano, acetato de etilo, dimetil furano, dimetilformamida, 1,4-dioxano, dimetoxietano, 1,2-dicloroetileno, dimetilsulfóxido y diclorometano.

36. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 29, en donde la sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, está presente en una cantidad aproximadamente desde 0,1% en peso hasta aproximadamente 10% en peso, con base en el peso total de solvente o mezcla de un solvente y agua, que es utilizado en la Etapa (c)^{3}.

37. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 36, en donde la sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, está presente en una cantidad aproximadamente desde 0,1% en peso hasta aproximadamente 5% en peso, con base en el peso total de solvente o mezcla de un solvente y agua, que es utilizado en la Etapa (c)^{3}, o está presente en una cantidad aproximadamente desde 1 vez (en peso) hasta aproximadamente 1000 veces (en peso), con base en el peso total del producto de la Etapa (b)^{3}, que se utiliza en la Etapa (c)^{3}, o está presente en una cantidad aproximadamente desde 10 veces (en peso) hasta aproximadamente 500 veces (en peso), con base en el peso total del producto de la Etapa (b)^{3}, que se utiliza en la Etapa (c)^{3}.

38. El proceso de acuerdo a la Reivindicación 36, en donde la sustancia seleccionada del grupo que consiste de un hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo, un carbonato, un hidrógenocarbonato y mezclas de los mismos, es seleccionada del grupo que consiste de hidróxido de calcio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de potasio, hidróxido de bario, hidróxido de sodio, carbonato de calcio, carbonato de litio, carbonato de magnesio, carbonato de potasio, carbonato de sodio, hidrógeno carbonato de calcio, hidrógenocarbonato de litio, hidrógenocarbonato de magnesio, hidrógenocarbonato de potasio e hidrógenocarbonato de sodio.