ES2331025T3 - Hexosilceramidas como adyuvantes y sus usos en composiciones farmaceuticas. - Google Patents

Abstract

Conjugado de alfa-hexosilceramida (alfa-HexCer) según la fórmula (I) **(Ver fórmula)** en la que A es CH2 o CO; B representa R4, OR4, NHR4, PO3R4 o SO3R4; en los que R4 es un resto de conjugado que es un polímero tolerado fisiológicamente y soluble en agua; R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes y son independientemente grupos alquenilo y/o alquilo C10-C30 lineales o ramificados; D representa CH2 o CH(OH); R3 representa hidrógeno u OH; R5 y R6 son sustituyentes en los que o bien R5 representa hidrógeno y R6 representa hidrógeno, OH, O-alquilo C1-C6, NH2, NHCO-alquilo C1-C6 o bien R6 es hidrógeno y R5 representa hidrógeno, OH, O-alquilo C1-C6, NH2, NHCO-alquilo C1-C6; R7 y R8 son sustituyentes en los que o bien R7 representa hidrógeno y R8 representa hidrógeno, OH, O-alquilo C1- C6, NH2, NHCO-alquilo C1-C6 o bien R8 es hidrógeno y R7 representa hidrógeno, OH, O-alquilo C1-C6, NH2, NHCOalquilo C1-C6; R9 y R10 son sustituyentes en los que o bien R9 representa hidrógeno y R10 representa hidrógeno, OH, O-alquilo C1-C6, NH2, NHCO-alquilo C1-C6 o bien R10 es hidrógeno y R9 representa hidrógeno, OH, O-alquilo C1-C6, NH2, NHCO-alquilo C1-C6; o sales o solvatos del mismo.

Description

Hexosilceramidas como adyuvantes y sus usos en composiciones farmacéuticas.

Campo de la presente invención

La presente invención se refiere a nuevos adyuvantes y a los usos en composiciones farmacéuticas, como en vacunas. En particular, la presente invención proporciona nuevos compuestos útiles como adyuvantes para la vacunación profiláctica y/o terapéutica en el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, tumores, alergias así como para el control de la fertilidad en poblaciones humanas o animales. Los compuestos son particularmente útiles no sólo como adyuvantes sistémicos, sino preferiblemente como adyuvantes mucosales. Además, la invención se refiere a sus usos como principios activos en composiciones farmacéuticas.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades infecciosas son la principal causa de morbilidad y mortalidad, representando un tercio de las muertes que se producen en el mundo cada año. Además, los agentes infecciosos son directamente responsables de al menos el 15% de nuevos cánceres, y también parecen estar implicados en la fisiopatología de varias enfermedades crónicas (por ejemplo, enfermedades inflamatorias, vasculares y degenerativas). Las enfermedades infecciosas tradicionales son también sumamente caras en cuanto a los costes sanitarios de los pacientes infectados y las pérdidas de productividad en el trabajo.

Las principales estrategias usadas para prevenir las enfermedades infecciosas son el tratamiento y la profilaxis. La vacunación se ha convertido en la medida más rentable para prevenir infecciones. Sin embargo, hay todavía muchas enfermedades para las que todavía no están disponibles vacunas o las vacunas disponibles no son completamente satisfactorias debido a su baja eficacia, alta reactogenicidad, escasa estabilidad y/o alto coste. Por tanto, hay todavía una urgente necesidad de vacunas tanto nuevas como mejoradas.

A pesar del hecho de que se han usado tradicionalmente vacunas para la profilaxis de enfermedades infecciosas, hallazgos recientes sugieren que son también una herramienta poderosa para la inmunoterapia de enfermedades transmisibles (por ejemplo, hepatitis viral, infecciones por Helicobacter pylori, infecciones por virus del herpes, etc.). Además, pueden usarse vacunas para la inmunoterapia o inmunoprofilaxis de enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, tumores, alergias y para el control de la fertilidad en poblaciones humanas y/o animales. En particular, la última aplicación parece requerir la producción de respuestas eficaces en la mucosa al nivel de las vías respiratorias.

La mayoría de las enfermedades infecciosas o bien están restringidas a las membranas mucosas o bien los agentes etiológicos necesitan transitar por la mucosa durante las etapas tempranas de la infección. Por tanto, es deseable obtener no sólo una respuesta inmunitaria sistémica, sino también una respuesta inmunitaria en la mucosa local como resultado de la vacunación, bloqueando de ese modo tanto la infección (es decir, la colonización) como el desarrollo de la enfermedad. Esto puede dar como resultado una protección más eficaz frente a la infección, facilitando también la erradicación de enfermedades para las que los seres humanos son el único reservorio (es decir, bloqueando la transmisión a huéspedes propensos). Las vacunas administradas por vía parenteral estimulan principalmente respuestas sistémicas, mientras que las vacunas administradas mediante una vía de la mucosa imitan la respuesta inmunitaria producida por infecciones naturales y pueden conducir a respuestas sistémicas y en la mucosa eficaces. Debido a la aparente compartimentalización del sistema inmunitario sistémico y de la mucosa, las vacunas administradas por vía parenteral son menos eficaces en la protección frente a patógenos de la mucosa (McGhee, J.R., Mestecky, J., Dertzbaugh, M.T., Eldridge, J.H., Hirasawa, M. y Kiyono, H. (1992) The mucosal immune system: from fundamental concepts to vaccine development. Vaccine 10, 75-88). Por tanto, se requiere la administración de inmunógenos a través de la vía de la mucosa para lograr una protección completa. Sin embargo, la mayoría de las vacunas disponibles se administran a través de la vía parenteral, produciendo de ese modo una inmunidad sistémica en el individuo.

La administración de vacunas por medio de la vía de la mucosa ofrece varias ventajas con respecto a la vacunación parenteral. Estas ventajas incluyen una facilidad de administración, la posibilidad de autoadministración (por ejemplo, mediante aplicación intranasal, rectal u oral), la eliminación de la posibilidad de infección cruzada no deseada debido al uso de agujas infectadas o trabajo no estéril, tasas inferiores de efectos secundarios, mayor aceptación por el público, mejor cumplimiento de los protocolos de vacunación (es decir, aumento de la eficacia global), logística de administración más sencilla y costes de administración inferiores, siendo particularmente adecuada para programas de inmunización en masa. Sin embargo, ha de tenerse en cuenta la compartimentalización al nivel del sistema inmunitario de la mucosa. De hecho, las respuestas inmunitarias que pueden observarse tras la vacunación intranasal pueden no producirse necesariamente tras la inmunización oral o intrarectal. Por ejemplo, la vacunación oral puede no estimular respuestas eficaces en los aparato genitourinario y/o vías respiratorias.

Desafortunadamente, la administración de antígenos mediante la vía de la mucosa está asociada con un problema importante, concretamente que los antígenos administrados mediante esta vía son generalmente poco inmunogénicos. Este es el resultado de diferentes mecanismos, tales como (i) eliminación acelerada de antígenos mediante los mecanismos de aclaramiento del huésped no específicos (por ejemplo, actividad ciliar, peristaltismo), (ii) degradación de antígenos mediante enzimas locales, (iii) alteración de antígenos y/o modificación estructural como resultado de un pH extremo (por ejemplo, ácido en el estómago, alcalino en el intestino), (iv) escasa penetración del antígeno a través de la mucosa, (v) acceso limitado de los antígenos de la vacuna a células presentadoras de antígenos y (vi) tolerancia periférica local.

Para superar estos problemas, se han usado diferentes estrategias, tales como atrapamiento de antígenos o asociación con partículas físicas o biológicas (por ejemplo micropartículas, nanopartículas, fantasmas bacterianos), el uso de virosomas o partículas similares a virus, el uso de liposomas o ISCOMS, el uso de plantas transgénicas, la producción de antígenos mediante portadores bacterianos o virales atenuados que actúan o bien como vectores convencionales o bien como portadores para vacunas de ácido nucleico y/o su administración con adyuvantes mucosales. Sin embargo, a pesar del abundante conjunto de pruebas experimentales generadas en estudios preclínicos durante los últimos años, casi no se han transferido candidatos al canal de desarrollo de vacunas.

El uso de adyuvantes óptimos desempeña un papel crucial en la vacunación. Los antígenos administrados sin adyuvante sólo median una respuesta inmunitaria adecuada pocas veces. Además, no sólo importa la fuerza sino también la calidad de la respuesta inmunitaria provocada. La estimulación de un patrón de inmunización incorrecto puede conducir a reacciones inmunopatológicas y a una exacerbación de los síntomas de la infección. En este contexto, el adyuvante puede ayudar a que se produzca la respuesta inmunitaria deseada. En otras palabras, un adyuvante puede modular la respuesta inmunitaria o redirigir la respuesta inmunitaria para equilibrar la respuesta inmunitaria en la dirección deseada.

Las sustancias denominadas "adyuvantes" son aquéllas que se añaden y/o se formulan conjuntamente en una inmunización frente al antígeno real (es decir, la sustancia que provoca la respuesta inmunitaria deseada) con el fin de potenciar la respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células ("Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie", 1. Band, Spektrum, Akademischer Verlag 1995). Es decir, los adyuvantes son compuestos que tienen propiedades de inmunopotenciación, en particular, cuando se administran conjuntamente con antígenos. El uso de muchos adyuvantes se basa únicamente en la experiencia, y el efecto no puede ni explicarse ni predecirse de manera precisa. Los siguientes grupos de adyuvantes se usan tradicionalmente en particular: hidróxido de aluminio, emulsiones de aceites minerales, saponinas, detergentes, compuestos de silicio, tiourea, endotoxinas de bacterias Gram-negativas, exotoxinas de bacterias Gram-positivas, bacterias vivas atenuadas o muertas o partes de las mismas.

Se facilita una visión general de los sistemas de administración y adyuvantes mucosales conocidos actualmente, por ejemplo las partículas mencionadas anteriormente, ICOMS, liposomas y partículas similares a virus, para vacunas a base de proteínas, ADN y ARN en Vajdy et al., Immunol. Cell Biol., 2004, 82, 617-627. En el mismo se tratan los enfoques actualmente disponibles en la inmunopotenciación de vacunas mucosales.

Es decir, se han descrito diversos adyuvantes mucosales que deben servir como alternativa para los adyuvantes útiles para la administración sistémica, por ejemplo, véase Vajdy et al., citado anteriormente. Estos adyuvantes mucosales incluyen enterotoxina termolábil y mutantes detoxificados de la misma. En particular, se han desarrollado mutantes genéticamente detoxificados de enterotoxina termolábil de E. coli como adyuvantes mucosales útiles. Además, se conoce la toxina del cólera de Vibrio cholera como adyuvante útil para vacunación de la mucosa. Además, se ha descrito la aplicación de dinucleótidos de CpG no metilados. Se mostró que los CpG pueden desviar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta Th1 y pueden modular respuestas inmunitarias preexistentes. Se describen también las saponinas como sustancias inmunomoduladoras, predominantemente mediante la inducción de citocinas específicas que entonces modulan y/o activan la respuesta inmunitaria.

Además, como adyuvantes que pueden ser útiles en la vacunación de la mucosa se han descrito los siguientes:

Se sabe que la molécula MALP-2 y conjugados de bisaxciloxipropilcisteína de la misma, por ejemplo una molécula de bispalmitoiloxipropilcisteína-PEG representan potentes estimulantes para los macrófagos. Se demostró anteriormente la utilidad de MALP-2 como adyuvante, véanse por ejemplo los documentos WO2004/009125 y WO2003/
084568. En particular, se demostró que MALP-2 puede actuar como adyuvante mucosal eficaz que potencia la respuesta inmunitaria de la mucosa, por ejemplo fomentando una expresión potenciada de anticuerpos de IgA específicos de antígeno.

Además, se demostró que MALP-2 puede activar células dendríticas y células B, que desempeñan ambas un papel importante en la inducción de una respuesta inmunitaria humoral específica. Además, estudios preliminares demuestran que una combinación de MALP-2 sintética y proteína tat de VIH-1 biológicamente activa puede ser una vacuna prometedora con el componente de MALP-2 como adyuvante mucosal eficaz.

Desafortunadamente, la mayoría de los compuestos descritos anteriormente que son útiles como adyuvantes mucosales no son utilizables debido a su toxicidad intrínseca, por ejemplo, transporte retrógrado hacia tejidos neuronales de toxinas y/o toxoides bacterianos en los derivados tras vacunación nasal.

Por tanto, ninguno de estos adyuvantes mucosales descritos anteriormente se han aprobado todavía, aunque, actualmente, sólo dos adyuvantes sistémicos recibieron aprobación para administrarse a seres humanos y, por tanto, se usan para la preparación de vacunas humanas. Estos adyuvantes son Alum y MF59. Sin embargo, no son eficaces como adyuvantes mucosales.

Ha habido una intensa investigación en los últimos años para buscar adyuvantes novedosos, incluyendo aquellos para la vía de administración en la mucosa. Sólo se han encontrado unas pocas sustancias que pueden potenciar las respuestas de la mucosa. Entre éstas, algunas actúan como portadores a los que los antígenos deben unirse o fusionarse. Se han encontrado muy pocos adyuvantes "verdaderos" que puedan emplearse universalmente que se mezclen con los antígenos, tal como se explicó de manera resumida anteriormente.

Normalmente, las membranas celulares están compuestas, entre otros, por lípidos, como fosfolípidos. En líneas generales, los fosfolípidos pueden dividirse en fosfoglicéridos y esfingolípidos. La estructura principal de un esfingolípido es la esfingosina. En todos los esfingolípidos, el grupo amino de la esfingosina está acilado para formar una ceramida (N-acilesfingosina). El grupo hidroxilo terminal también está sustituido. Por tanto, dependiendo del sustituyente, se forma una esfingomielina, un cerebrósido o un gangliósido. En los cerebrósidos, una glucosa o galactosa está unida al grupo hidroxilo terminal de la ceramida mientras que en gangliósidos un oligosacárido está unido a la ceramida mediante un residuo de glucosa.

La alfa-galactosilceramida (alfa-Galcer) como ejemplo de alfa-hexosilceramida (alfa-HexCer) se aisló originalmente de la esponja marina Agelas mauritianus (Morita M., et al, J. Med. Chem., 1995, 38(12), 2176-2187). En particular, el compuesto Agelasphin-9b, (2S,3S,4R)-1-O-(alfa-D-galactopiranosil)-16-metil-2-[N-((R)-2-hidroxitetracosanoil)-amino]-1,3,4-heptadecanetriol, se describe como un potente agente antitumoral. Se sabe que alfa-GalCer puede potenciar la inmunidad protectora y presenta funciones inmunomoduladoras. Además, se describe en la técnica que la administración in vivo de alfa-GalCer conduce a una potente activación de células NKT en ratones, iniciándose así la secreción de citocinas, la regulación por incremento de receptores de la superficie y la activación adicional de diversas células de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa. Adicionalmente, se especula que alfa-GalCer tiene actividad terapéutica frente a tumores, infecciones y enfermedades autoinmunitarias.

La alfa-galactosilceramida puede unirse a la molécula CD1d presente en un subconjunto de linfocitos. Tras la unión a CD1d, se demostró que alfa-GalCer activaba células NKT murinas y humanas mediante el reconocimiento por medio de receptores de antígenos expresados sobre dichas células. Además, se demostró que el truncamiento casi completo de la cadena de acilo de alfa-GalCer desde 24 hasta 2 carbonos no afecta significativamente a la respuesta de células NKT de ratón. Por tanto, el resto glicosilo parece ser importante para el reconocimiento de receptores de antígenos y CD1d/GalCer y es probable que la modificación de dicho resto influya en la actividad de activación y unión de alfa-GalCer.

Recientemente, se ha descrito que las glicosilceramidas son útiles como adyuvantes para vacunas frente a infecciones y cáncer, documento WO03/009812. En este documento, se ha usado la administración subcutánea de alfa-galactosilceramidas para demostrar la potenciación y prolongación de respuestas de células T específicas de malaria. Además, en el documento WO2004/028475 se muestra el uso de análogos de glicosilceramida. Se describe que estos análogos pueden inmunomodular la respuesta inmunitaria, es decir, pueden activar o estimular la respuesta inmunitaria o, por otra parte, pueden tener actividad inmunoinhibidora.

Sin embargo, el uso de alfa-GalCer u otras glicosilceramidas está limitado en vista de su estabilidad y su tolerancia hacia el individuo. Además, la solubilidad de alfa-GalCer en disolventes acuosos es escasa y la degradación debida a escisión enzimática se produce rápidamente. Además, la excreción de estos compuestos es rápida y, por tanto, es necesaria una dosificación superior de dichos compuestos.

La PEGilación (es decir, la unión de polietilenglicol a proteínas y fármacos) es una metodología de próxima aparición para el desarrollo de fármacos y tiene el potencial de revolucionar la medicina mejorando drásticamente las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del fármaco administrado [documentos WO 2004/009125; WO 99/52549; EP 510 356; Parveen S, Sahoo SK. Clin Pharmacokinet 2006; 45(10):965-88.]. Desde hace varios años se usa ya el polietilenglicol como marcador no absorbible [Isenberg JI, Hogan DL, Koss MA, Selling JA. H, Gastroenterology 1986; 91(2):370-8], para el control de la permeabilidad pasiva de la mucosa (evaluada con una sustancia PEG 200 de bajo peso molecular) [Ventura U, Ceriani T, Moggio R., Scand J Gastroenterol Suppl 1984; 92:55-8] o como marcador de peso molecular (es decir, PEG 4000, FITC-dextran 10.000). Se demostró que el PEG mostraba sólo irritación intranasal baja en seres humanos [documento EP 0532546] y también se encontró baja toxicidad en conejos o en ovejas tras 1 aplicación nasal repetida (tres veces al día) de PEG puro. El uso de inmunonanopartículas pegiladas sintetizadas con derivados de PEG bifuncionales mostró que estos componentes pueden unir la nanopartícula con el AcM de direccionamiento [Olivier JC, Huertas R, Lee HJ, Calon F, Pardridge WM., Pharm Res 2002; 19(8):1137-43].

Sin embargo, el uso de compuestos pegilados, tal como el actual tratamiento convencional para el VHC, interferón alfa pegilado en combinación con ribavirina, tiene sus limitaciones. La eficacia limitada en pacientes con el genotipo 1 del virus de la hepatitis C y el perfil de efectos secundarios necesitarán el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos [Manns MP, Wedemeyer H, Cornberg M, Gut, 2006; 55(9), 1350-9]. Además, la conjugación de un inmunomodulador con PEG no importa, que el compuesto pegilado todavía puede actuar como adyuvante. Estudios con derivados de Malp-2 pegilados mostraron una disminución en la proliferación celular y también en la secreción de título de IgG específico de antígeno en comparación con Malp-2. Hasta ahora, no se ha demostrado que un derivado pegilado de un compuesto químico activo pueda estimular y activar una respuesta inmunitaria específica de antígeno por medio de la vía de administración intranasal. El uso de los conjugados según la presente invención, por ejemplo el nuevo compuesto \alphaGalCerMPEG como adyuvante sistémico, pero también como adyuvante mucosal, mostró que dichos conjugados pueden potenciar respuestas inmunitarias específicas de antígeno sin efectos secundarios adversos.

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Por tanto, hay todavía una necesidad en la técnica de proporcionar nuevos compuestos útiles como adyuvantes, particularmente como adyuvantes mucosales y/o como vacunas que superen los inconvenientes mencionados anteriormente, en particular, que tengan buena estabilidad y tolerancia en el individuo mientras que son solubles en disolventes acuosos, están protegidos frente a la degradación en el individuo y tienen buena vida útil de almacenamiento. En particular, hay una necesidad de adyuvantes mucosales que puedan producir una fuerte respuesta inmunitaria que represente una respuesta inmunitaria equilibrada o ajustada que implique tanto componentes humorales como celulares, por tanto, que permita un tratamiento o una profilaxis eficaces de diversas enfermedades y estados, específicamente de enfermedades infecciosas o cáncer.

Por tanto, el objeto de la presente invención es la provisión de adyuvantes mucosales que puedan producir y/o potenciar y/o modular la respuesta inmunitaria (preexistente) en un individuo o sujeto. En particular, la invención se basó en el objeto de desarrollar una gama de adyuvantes novedosos, sumamente activos, particularmente adyuvantes mucosales que no son tóxicos para seres humanos y que pueden emplearse con una amplia variedad de principios activos para ayudar en vacunas convencionales o novedosas tales como, en particular, vacunas profilácticas o terapéuticas, incluyendo vacunas de ADN y contra el cáncer.

Descripción de la invención

Este problema técnico se resuelve mediante la provisión de las realizaciones tal como se caracterizan en las reivindicaciones.

La presente invención se refiere en general a la provisión de nuevos conjugados tal como se representa en la fórmula (I) o sales o solvatos de los mismos, útiles como adyuvantes, preferiblemente como adyuvantes mucosales. Además, la presente invención se refiere a nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de los conjugados según fórmula (I) tal como se describe en el presente documento con portador(es) farmacéuticamente aceptable(s), opcionalmente junto con principios activos adicionales.

Es decir, la presente invención se refiere a la provisión del uso de conjugados específicos útiles como adyuvantes en la vacunación terapéutica o profiláctica. Dichos conjugados son útiles como adyuvantes sistémicos y son particularmente útiles como adyuvantes mucosales que se aplican a través de la mucosa del individuo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "adyuvante" significa sustancias que se añaden y/o formulan conjuntamente en una inmunización con el principio activo, es decir, la sustancia que provoca la respuesta inmunitaria deseada, con el fin de potenciar o producir o modular la respuesta inmunitaria mediada por células (celular) y/o humoral frente al antígeno activo. Preferiblemente, el adyuvante según la presente invención también puede potenciar o producir la respuesta inmunitaria innata.

El término "terapia" o "tratamiento" se refiere a un proceso que pretende producir un cambio beneficioso en el estado de un individuo como un mamífero, por ejemplo, un ser humano, denominado a menudo paciente, o animal. Un cambio beneficioso puede incluir, por ejemplo, uno o más de: restauración de la función, reducción de síntomas, limitación o retardo de la evolución de una enfermedad, un trastorno, o un estado o la prevención, la limitación o el retardo del deterioro de un estado, una enfermedad o un trastorno de un paciente. Tal tratamiento abarca habitualmente la administración de un fármaco, entre otros.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "sistema de administración" se refiere a un sistema que es más inerte y tiene menos efectos inmunomoduladores que los adyuvantes y que puede proteger y administrar la vacuna en el sitio de interés a través del sitio de administración. En particular, el sistema de administración permite una presentación más eficaz del antígeno al sistema inmunitario. Ejemplos de sistemas de administración son virus o par-
tículas similares a virus, ISCOM, nanopartículas, micropartículas, liposomas, virosomas y partículas similares a virus.

Tal como se usa en el presente documento, el término "pegilado" se refiere a la conjugación de un resto de compuesto con resto(s) de conjugado que contienen al menos una unidad de polialquileno. En particular, el término pegilado se refiere a la conjugación del resto de compuesto con un resto de conjugado que tiene al menos una unidad de polietilenglicol.

Tal como se usa en el presente documento, el término "mucosal" se refiere a una superficie de mucosa del cuerpo tal como la mucosa nasal, oral, gastroentérica, rectal, urinaria, conjuntiva, glandular, por ejemplo la glándula mamaria, epitelial.

Tal como se usa en el presente documento, el término "conjugado" se refiere compuestos que comprenden un resto de conjugado y un resto de compuesto. La expresión "resto de conjugado" se refiere a un sustituyente R_{4} de la fórmula general (I). El resto de conjugado tiene como objetivo aumentar la aplicabilidad del compuesto residual. En cambio, la expresión "compuesto según la fórmula (I)" o "resto de compuesto" se refiere a un compuesto de fórmula general (I) sin sustituyente B.

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Tal como se usa en el presente documento, la expresión "estructura antigénica" o "antígeno" se refiere a una estructura que puede provocar una respuesta inmunitaria celular o humoral. La estructura antigénica, también conocida como epítopo, es parte del antígeno, que se presenta por el CMH o moléculas similares al CMH. Además, el epítopo o la estructura antigénica representa la parte de un antígeno reconocida por anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "modular una respuesta inmunitaria" se refiere a cualquier cambio del presente estado de la respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria puede modularse en cuanto que la respuesta está provocada o una respuesta inmunitaria preexistente está potenciada, lo que puede incluir la disminución de aspectos específicos de la respuesta inmunitaria, por ejemplo la respuesta inmunitaria puede modularse cambiando la respuesta inmunitaria desde una respuesta inmunitaria más humoral hasta más celular o viceversa. Además, la respuesta inmunitaria puede modularse cambiando o redireccionando la respuesta desde una respuesta Th1 hasta TH2 o Th3 o viceversa. Además, la modulación de la respuesta inmunitaria puede abarcar la activación o potenciación de la respuesta inmunitaria innata.

Tal como se usa en el presente documento, el término "individuo" o "sujeto" que se usa en el presente documento de manera intercambiable se refiere a un individuo o sujeto que necesita un tratamiento o una profilaxis. Preferiblemente, el sujeto o individuo es un vertebrado, incluso se prefiere más un mamífero, se prefiere particularmente un ser humano.

Tal como se usa en el presente documento, el término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo.

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Por tanto, según la primera realización, la presente invención se refiere a un conjugado de alfa-hexosilceramida (alfa-HexCer) según la fórmula (I)

1

en la que

A es CH_{2} o CO;

B representa R_{4}, OR_{4}, NHR_{4}, PO_{3}R_{4} o SO_{3}R_{4};

en los que R_{4} es un resto de conjugado, que es un polímero tolerado fisiológicamente y soluble en agua;

R_{1} y R_{2} pueden ser iguales o diferentes y son independientemente un grupo alquenilo y/o alquilo C_{10}-C_{30} lineal o ramificado;

D representa CH_{2} o CH(OH);

R_{3} representa H u OH;

R_{5} y R_{6} son sustituyentes en los que o bien R_{5} representa hidrógeno y R_{6} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6} o bien R_{6} es hidrógeno y R_{5} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6};

R_{7} y R_{8} son sustituyentes en los que o bien R_{7} representa hidrógeno y R_{8} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6} o bien R_{8} es hidrógeno y R_{7} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6};

R_{9} y R_{10} son sustituyentes en los que o bien R_{9} representa hidrógeno y R_{10} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6} o bien R_{10} es hidrógeno y R_{9} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6}; o sales o solvatos del mismo.

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Preferiblemente, en la fórmula (I) R_{5}, R_{8} y R_{10} son cada uno un hidrógeno y R_{6} es preferiblemente hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6}, R_{7} y R_{9} son cada uno OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}. Preferiblemente de manera particular, R_{5}, R_{8} y R_{10} son hidrógeno y R_{6}, R_{7} y R_{9} son grupos hidroxilo.

R_{1} y R_{2} pueden ser idénticos o pueden ser diferentes y son independientemente un grupo alquilo o grupo alquenilo que tiene residuos de C_{9} a C_{29}. Preferiblemente, R_{1} es de C_{19} a C_{29}, particularmente C_{24}, y R_{2} es de C_{10} a C_{20}, particularmente C_{14}.

Como conjugado de fórmula (I), se prefieren particularmente conjugados de alfa-galactosilceramidas, es decir, en los que R_{5}, R_{8} y R_{10} son un átomo de hidrógeno y R_{6}, R_{7} y R_{9} son un grupo hidroxilo, como (2S,3S,4R)-1-(alfa-D-galactopiranosiloxi)-2-hexacosanoilamino-3,4-octadecanodiol. Preferiblemente son conjugados de estas galactosilceramidas en los que dicho conjugado tiene al menos una unidad de polietilenglicol.

El resto de conjugado del conjugado según la presente invención es un resto de conjugado covalentemente unido, fisiológicamente tolerado, que es adecuado para convertir la hexosilceramida en una forma más soluble en agua. El resto de conjugado es un polímero soluble en agua, por ejemplo un dextrano, un azúcar, una polivinilpirrolidona, un alginato, una pectina o colágeno. El resto de conjugado se caracteriza porque proporciona buena solubilidad en agua y no es inmunogénico.

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El resto de conjugado del conjugado de hexosilceramida reivindicado en el presente documento es en una realización preferida un resto de conjugado que contiene al menos una unidad de polialquilenglicol de la fórmula:

X_{1}-[(CHR_{11})_{x}-O]_{n}-(Z)_{y}-

en la que

X_{1} es hidrógeno o un hidrocarburo que puede contener heteroátomo(s), por ejemplo grupo alcoxilo de C_{1} a C_{6};

Z es un grupo de enlace divalente, tal como C=O o CHR_{11};

R_{11} es independientemente uno cualquiera de hidrógeno, OH, OR_{12} o CO-R_{13};

R_{12} es independientemente uno cualquiera de hidrógeno o grupo alquilo C_{1}-C_{6};

R_{13} es independientemente uno cualquiera de hidrógeno, OH, OR_{12} o NR_{14}R_{15};

R_{14} y R_{15} son independientemente uno cualquiera de hidrógeno o hidrocarburo que puede contener heteroátomo(s)
{}\hskip0.45cm y que puede formar un anillo;

n es un número entero de 1 a 100;

x es independientemente un número entero de 1 a 10;

y es un número entero de 0 a 10.

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Preferiblemente, n es un número entero de 2 a 50, como de 2 a 10, en particular de 3 a 5.

x es preferiblemente un número entero de 2, 3 ó 4, en particular 2.

y es preferiblemente un número entero de 1 a 5, en particular, de 1 a 3, en otra realización preferida, y es 0.

X_{1} es preferentemente OR_{16}, N(R_{16})_{2}, SR_{16} o COOR_{16}, en los que cada R_{16} es individualmente hidrógeno, bencilo o grupo alquilo C_{1}-C_{6}, preferiblemente un grupo alcoxilo C_{1}-C_{6}, como un grupo metoxilo, etoxilo o propoxilo.

R_{11} es preferiblemente un átomo de hidrógeno.

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Por tanto, la unidad de polialquilenglicol mencionada anteriormente puede contener preferiblemente subunidades -[(CHR_{11})x-O]_{n} de etilenglicol, propilenglicol o butilenglicol o combinaciones de los mismos. La longitud de cadena de cada una de las unidades de polialquilenglicol puede estar en el intervalo de 1 a 100 subunidades, preferiblemente, de 2 a 50 subunidades, como de 2 a 10 subunidades, particularmente en el intervalo de 3 a 5 subunidades.

De manera particularmente preferida R_{4} es un residuo de metoxipolialquilenglicol-carbonilo en el que el resto de alquileno es un resto de etileno o propileno.

Por tanto, preferiblemente los conjugados están en forma pegilada para aumentar la solubilidad en disolventes hidrófilos y un entorno hidrófilo. Además, el resto de conjugado permite proteger el resto de compuesto, es decir, el resto de adyuvante mucosal activo, frente a la degradación enzimática, la modificación estructural debida al cambio del pH, la eliminación mecánica, etc. Por tanto, se aumenta principalmente la estabilidad del compuesto. Otro efecto beneficioso de la conjugación es aumentar el tiempo de retención en el individuo, por ejemplo, para retrasar la excreción renal, mientras que se tolera bien, por ejemplo no siendo inmunogénico, por dicho organismo.

De manera sorprendente, el conjugado mantiene su actividad de unión a CD1d mientras que muestra una estabilidad mejorada y una actividad superior. Los datos demuestran que incluso una concentración 10 veces inferior del resto activo, concretamente el resto de alfa-HexCer, de conjugados mantiene sus actividades estimuladoras en comparación con el compuesto alfa-HexCer puro. Además, se mejora la solubilidad en agua del compuesto alfa-HexCer. Además, tal como se muestra en los ejemplos, el conjugado según la presente invención, como el alfaGalCerMPEG que es un conjugado en el que un residuo de metil-PEG-CO está unido al sustituyente R_{4}, ejerce propiedades de adyuvante más fuertes que el compuesto original alfaGalCer que es un inductor superior de respuestas TH_{2} y sIgA en sitios efectores de la mucosa tanto remotos como locales.

Por último, la vida útil de almacenamiento del compuesto alfa-HexCer aumentó tras la conjugación con el polímero soluble en agua. Es decir, las capacidades estimuladoras de alphGalCerMPEG sobre células inmunitarias se mantuvieron intactas durante al menos dos meses tras la incubación de una disolución madre (10 \mug/ml en agua estéril/Ampuwa) a o bien 4ºC o bien 25ºC.

Específicamente, el resto de conjugado comprende al menos dos cadenas que tienen unidades de polialquilenglicol. Es decir, el conjugado puede ser un compuesto ramificado en el que cada rama contiene una unidad de polialquilenglicol. Se prefieren particularmente restos de conjugado en los que la unidad de polialquilenglicol es una unidad de polietilenglicol, polipropilenglicol o polibutilenglicol.

En una realización particularmente preferida, el resto de conjugado es un resto ramificado en el que al menos dos ramas contienen unidades de polietilenglicol que tienen de 3 a 5 subunidades de etilenglicol y un grupo metoxilo en el extremo libre del grupo polietileno. En particular, el resto ramificado comprende 4 ó 6 ramas que tienen cada una 3 subunidades de etilenglicol y un grupo metoxilo en el extremo libre del grupo polietileno.

En particular, el conjugado de alfa-HexCer se caracteriza porque el R_{4} del conjugado es PEG de 4 ramas ((S)-10-amino-6,9,13,16-tetraoxo-N,N',8,14-tetrakis(3,6,9,12-tetraoxatridec-1-il)-5,8,14,17-tetraazahenicosano-1,21-diami-
da), PEG de 6 ramas o PEG de 8 ramas, véase también http://ww.celares.com. Otros restos de conjugado adecuados que comprenden al menos una unidad de polietileno pueden obtenerse por ejemplo de Celares GmbH, Berlín, véase http://www.celares.com.

Los conjugados de fórmula (I) pueden estar en forma de sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las sales de los conjugados de fórmula (I) incluyen sales de adición de ácido, tales como sales con ácidos inorgánicos (por ejemplo ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y ácido fosfórico) o con ácidos orgánicos (por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido maleico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido glutámico, ácido pantoténico, ácido laurilsulfónico, ácido metanosulfónico y ácido ftálico).

Los conjugados de fórmula (I) pueden estar en forma de solvatos de los mismos (por ejemplo, hidratos).

La presente invención no se limita a los compuestos y conjugados de alfa-hexosilceramidas, sino que también abarca los compuestos y conjugados de beta-hexosilceramida así como las sales y solvatos de los mismos.

La síntesis de los conjugados puede realizarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, un grupo hidroxilo puede convertirse en un residuo de halógeno, por ejemplo Cl, Br, I y puede hacerse reaccionar este residuo con conjugados modificados que tienen un grupo amino libre. Por ejemplo, la síntesis de conjugados pegilados se describe en Veronese F.M., Biomaterials 22 (2001), 405-417 y Kodera Y., et al., Prog. Polim. Sci. (1998), 23, 1233-1271 que se incorporan al presente documento como referencia.

Además, la síntesis de alfa-glicosilceramidas y alfa-galactosilceramidas se describe generalmente en por ejemplo los documentos WO93/05055, WO94/02168, WO94/06020, WO94/24142 y Morita M., et al., Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 1995, 5(7), 699-704 que se incorporan todos al presente documento como referencia.

En una realización preferida, el/los conjugados(s) según la fórmula (I) o las sales o los solvatos del/de los mismo(s)
es/son útiles como adyuvante(s) mucosal(es), en particular, para administración intranasal, intra-NALT, oral, intrarrectal, en la conjuntiva, intravaginal, intratecal, intrabronquial, intrapulmonar o intrauretral, administración en los conductos lácteos o mediante inhalación.

Se prefiere particularmente la administración intranasal o la administración mediante inhalación usando formulaciones de aerosol adecuadas. Se conocen en la técnica formulaciones de aerosol útiles para la administración de vacunas.

Los conjugados según la fórmula (I) o las sales o los solvatos de los mismos son también adecuados como adyuvante(s) sistémico(s). Por tanto, los adyuvantes descritos en el presente documento también pueden aplicarse como adyuvante(s) parenteral(es), en particular, en la administración subcutánea, intravenosa, intradérmica, tópica o intramuscular.

El adyuvante de la invención puede unirse mediante todos los métodos conocidos por el experto al antígeno o la molécula activa prevista para la vacunación, incorporarse junto con la última en partículas físicas (por ejemplo micropartículas, nanopartículas, liposomas, ISCOMS, polímeros) o biológicas (bacterias, partes bacterianas) o virosomas o puede mezclarse con el antígeno. Para la unión a portadores, también es posible proporcionar moléculas de transporte o proteínas de transporte como portadores.

El/los conjugado(s) según la fórmula (I) o las sales o los solvatos del/de los mismo(s) se presenta(n) preferiblemente en una preparación con el componente de vacunación activo (por ejemplo el antígeno) que es adecuada y está prevista para la administración intranasal, intra-NALT (tejido linfoide asociado a la nariz), en aerosol, oral, intrarrectal, en la conjuntiva, intravaginal, intrauretral o para la administración en los conductos lácteos de la mama. Particularmente, la preparación se proporciona en una formulación adecuada para tomarse a través de las vías respiratorias o el aparato digestivo. Alternativamente, el adyuvante mucosal de la invención puede presentarse en un kit para su administración conjunta con una vacuna mediante una de las vías mencionadas anteriormente y puede adaptarse por tanto cuando se apropiado. Es decir, la vacuna puede administrarse de manera simultánea, secuencial o por separado con el componente de vacunación activo.

En otra realización, la presente invención se refiere a métodos de tratamiento de individuos aquejados de una enfermedad o estado que puede tratarse mediante la modulación de la respuesta inmunitaria que comprenden administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende los conjugados según la fórmula (I), las sales y los solvatos de los mismos tal como se definen en el presente documento como adyuvante, particularmente como adyuvantes mucosales junto con un componente de vacunación activo, y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

Preferiblemente, el método se refiere al tratamiento de individuos aquejados de una enfermedad infecciosa en el que la enfermedad infecciosa se produce por un agente infeccioso seleccionado de aquellos que provocan una enfermedad humana o animal al nivel de las vías respiratorias, el tubo digestivo, el aparato genitourinario, el sistema osteoarticular, la piel o la mucosa.

Los conjugados o las sales o los solvatos de los mismos tal como se definen en el presente documento son particularmente útiles como adyuvantes mucosales para activar o potenciar in vitro y/o in vivo la función de presentación de antígenos de células presentadoras de antígeno para una intervención terapéutica o profiláctica. Esto significa que los adyuvantes pueden estimular macrófagos, pueden estimular o potenciar la respuesta inmunitaria humoral, por ejemplo potenciar o estimular la producción de anticuerpos. Además, los adyuvantes también pueden potenciar o estimular la respuesta inmunitaria celular, por ejemplo aumentando la proliferación de células T. Además, los conjugados de fórmula (I) no sólo pueden activar o estimular componentes del sistema inmunitario adaptativo sino también del sistema inmunitario innato, como activar células NK o NKT. Además, es posible usar el/los adyuvante(s) para la estimulación ex vivo en cultivo celular, por ejemplo para la producción de células dendríticas, etc. Estas células obtenidas mediante estimulación ex vivo pueden usarse para la transferencia de células autólogas en trasplante o como una vacuna a base de células frente a enfermedades o estados, como las enfermedades y los estados mencionados anteriormente, incluyendo cáncer, enfermedad autoinmunitaria o alergias.

Por tanto, en el caso del uso de los conjugados o las sales o los solvatos de los mismos tal como se definen en el presente documento como adyuvantes, la composición farmacéutica según la presente invención es preferiblemente una vacuna, que comprende dichos compuestos o conjugados o sales o solvatos de los mismos como adyuvante(s) farmacéuticamente aceptable(s) junto con el componente de vacunación activo (por ejemplo el antígeno) y, opcionalmente, un portador, diluyente, conservante, adyuvante distinto del adyuvante según la presente invención, inmunomodulador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El componente de vacunación activo puede ser cualquier componente adecuado para producir, potenciar o modular una respuesta inmunitaria en un individuo. El componente de vacunación activo es adecuado particularmente para la administración intranasal, intra-NALT, oral, intrarrectal, en la conjuntiva, intravaginal, en aerosol o intrauretral, o la administración en los conductos lácteos de la mama.

Por ejemplo, el componente de vacunación activo, el principio activo de la composición farmacéutica, comprende al menos uno o más antígenos diferentes en forma de péptidos, proteínas, polisacáridos, glicolípidos o ADN que codifica para los mismos o fantasmas bacterianos, virosomas o vacunas atenuadas.

Preferentemente, el/los antígeno(s) son antígeno(s) tumoral(es) o antígeno(s) derivado(s) de agentes infecciosos. Los agentes infecciosos incluyen aquellos agentes que normalmente entran en el organismo del individuo cruzando la membrana mucosa.

La composición farmacéutica que comprende adyuvante(s) según la presente invención, un componente de vacunación activo, opcionalmente un portador, diluyente, conservante, adyuvante distinto del adyuvante según la presente invención, inmunomodulador o excipiente adicionales, puede contener adicionalmente componentes, como compuestos como una o más moléculas antiinflamatorias, moléculas antiangiogénicas, moléculas citotóxicas, moléculas inmunomoduladoras, preferiblemente quimiocinas, citocinas, ligando CD40, moléculas coestimuladoras o anticuerpos o mezclas de los mismos.

Sin embargo, los conjugados según la fórmula (I), las sales y los solvatos de los mismos tal como se definen en el presente documento para el uso como adyuvantes también pueden ser un componente de una composición farmacéutica proporcionada en una formulación adecuada para la administración parenteral, en particular, en la administración subcutánea, intravenosa, intradérmica o intramuscular.

Además, los conjugados según la presente invención son útiles en la terapia tumoral incluyendo la generación in vitro o el cebado in vitro de células autólogas para la transferencia adoptiva de células en transplante y terapia tumoral. Además, los adyuvantes son útiles para la inducción de tolerancia cruzada frente a componentes microbianos, como endotoxinas, para proteger frente al choque septicémico u otras formas graves de enfermedades inducidas por componentes microbianos.

Además, los propios conjugados tal como se definen en el presente documento pueden presentar una actividad farmacéutica, por ejemplo van a ser útiles en la profilaxis y el tratamiento de diversas enfermedades y estados, como cáncer, enfermedades infecciosas, choque septicémico, procesos inflamatorios y crónicos, enfermedades autoinmunitarias, alergias, etc.

Por tanto, los conjugados según la fórmula (I) o las sales o los solvatos de los mismos son también útiles para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades infecciosas, choque septicémico, cáncer, tumores, enfermedades autoinmunitarias, alergias o procesos inflamatorios crónicos o agudos.

Los conjugados según la presente invención y las sales o los solvatos de los mismos, particularmente, los conjugados pegilados, pueden usarse como principios activos en composiciones farmacéuticas útiles para la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas, choque septicémico, tumores, enfermedades autoinmunitarias, alergias o procesos inflamatorios crónicos o agudos. En particular, los conjugados o las sales o los solvatos de los mismos están contenidos en composiciones farmacéuticas útiles para prevenir o tratar cáncer y/o tumores, tales como melanoma, cáncer de próstata, de mama, colorrectal, de estómago, de garganta y cuello, pancreático, de cuello uterino, de ovario, óseo, leucemia y de pulmón; infecciones virales, tales como hepatitis B, hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana, Helicobacter pylori, virus del herpes, etc.; infecciones bacterianas, tales como tuberculosis, lepra y listeriosis, e infecciones parasitarias tales como malaria.

Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados según la fórmula (I) o sales o solvatos de los mismos, en particular, conjugados que contienen al menos un resto de conjugado que comprende una unidad de polialquilenglicol, tal como se define en el presente documento o sales o solvatos de los mismos y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de los conjugados y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede administrarse con un portador fisiológicamente aceptable a un paciente, tal como se describe en el presente documento. En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "portador" se refiere se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse disoluciones salinas y disoluciones de glicerol y dextrosa acuosas como portadores líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o de emulsificación, o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con portadores y aglutinantes tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, magnesio, carbonato, etc. Se describen ejemplos de portadores farmacéuticos apropiados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin (18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)). Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz de los conjugados anteriormente mencionados según la fórmula (I), las sales o los solvatos de los mismos, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador de modo que proporcionen la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

Normalmente, el portador farmacéutica o terapéuticamente aceptable es un medio portador que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos y que no es tóxico para el huésped o el paciente.

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En realización preferida, la composición se formula según procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para la administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local tal como lidocaína para calmar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los componentes se suministran o bien por separado o bien mezclados juntos en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición va a administrarse mediante infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene solución salina o agua estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición va a administrarse mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de solución salina o agua estéril para inyección de modo que los componentes pueden mezclarse antes de la administración.

La composición farmacéutica para su uso en relación con la invención puede formularse como formas de sal o neutras. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

"Cantidad terapéutica o farmacéuticamente eficaz" tal como se aplica a las composiciones de la presente invención se refiere a la cantidad de composición suficiente para inducir un resultado biológico deseado. Ese resultado puede ser el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En la presente invención, el resultado normalmente implicará un aumento en las respuestas inmunológicas a la infección o una supresión de las respuestas a procesos inflamatorios.

Opcionalmente, pueden emplearse ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que ha de emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o el trastorno, y debe decidirse según la opinión del médico y las circunstancias de cada paciente. Pueden extrapolarse dosis eficaces de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelo animal o in vitro. Preferiblemente, la composición farmacéutica se administra directamente o en combinación con un adyuvante.

El término "administrado" significa la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica mencionada anteriormente que comprende los conjugados según la fórmula (I), sales y solvatos de los mismos tal como se definen en el presente documento a un individuo. Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se quiere decir una dosis que produce los efectos por los que se administra. La dosis exacta dependerá del fin del tratamiento, y se determinará por un experto en la técnica usando técnicas conocidas. Tal como se sabe en la técnica y se describió anteriormente, pueden ser necesarios ajustes para la administración sistémica frente a la localizada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la interacción farmacológica y la gravedad del estado, y podrán determinarse con experimentación de rutina por los expertos en la técnica.

Todavía en otra realización, la presente invención se refiere a métodos de tratamiento de individuos que padecen enfermedades infecciosas, choque septicémico, tumores, enfermedades autoinmunitarias, alergias o procesos inflamatorios crónicos o agudos que comprenden la etapa de administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un conjugado según la fórmula (I) o sales o solvatos del mismo como principio activo y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable. En particular, el método es útil para prevenir o tratar cáncer y/o tumores, tales como, melanoma, cáncer de próstata, de mama, colorrectal, de estómago, de garganta y cuello, pancreático, de cuello uterino, de ovario, óseo, leucemia y de pulmón; infecciones virales, tales como, hepatitis B, hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana, Helicobacter pylori, virus del herpes, etc.; infecciones bacterianas, tales como tuberculosis, lepra y listeriosis, y infecciones parasitarias tales como malaria.

Además, la composición farmacéutica puede contener adicionalmente componentes, por ejemplo compuestos como una o más moléculas anti-inflamatorias, moléculas anti-angiogénicas, moléculas citotóxicas, moléculas inmunomoduladoras, preferiblemente quimiocinas, citocinas, ligando de CD40, moléculas coestimuladoras o anticuerpos o mezclas del mismo.

Además, la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede caracterizarse porque los componentes de la composición farmacéutica están asociados y/o incorporados y/o recubiertos en una partícula física, preferiblemente micropartícula, nanopartícula, liposoma, ISCOM, copolímero y/o partícula biológica, preferiblemente fantasmas bacterianos.

Los métodos son aplicables tanto a tratamiento de seres humanos como aplicaciones veterinarias. Los compuestos descritos en el presente documento que tienen la actividad terapéutica deseada pueden administrarse en un portador fisiológicamente aceptable a un paciente, tal como se describe en el presente documento. Dependiendo de la manera de introducción, los compuestos pueden formularse de una variedad de maneras tal como se trata a continuación. La concentración de compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede varias desde aproximadamente 0,1-100% en peso. Los agentes pueden administrarse solos o en combinación con otros tratamientos.

La administración de la composición farmacéutica puede realizarse de una variedad de maneras tal como se trató anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a, por vía oral, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intra-arterial, por vía intranodal, por vía intramedular, por vía intratecal, por vía intraventricular, por vía intranasal, por vía conjuntival, por vía intrabronquial, por vía transdérmica, por vía intrarrectal, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía intrapulmonar, por vía vaginal, por vía rectal o por vía intraocular. En algunos casos, por ejemplo, en el tratamiento de heridas e inflamación, el agente terapéuticamente eficaz puede aplicarse directamente como una disolución secada por pulverización.

El médico encargado y los factores clínicos determinarán el régimen de dosificación. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 \mug por kg de peso corporal; sin embargo, están previstas dosis por debajo o por encima de este intervalo a modo de ejemplo, considerando especialmente los factores mencionados anteriormente.

Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del/de los compuesto(s) o sales o solvatos del/de los mismos tal como se define en el presente documento en un preparación farmacéutica para controlar la fertilidad en poblaciones humanas o animales.

Finalmente, la presente invención se refiere a kits que comprenden el conjugado de hexosilceramida según la presente invención o sales o solvatos del mismo. En particular, el kit es útil para la preparación de composiciones farmacéuticas. Opcionalmente, el kit contiene instrucciones para preparar la composición farmacéutica.

En una realización preferida del mismo, el kit contiene el compuesto o conjugado de hexosilceramida según la presente invención o sales o solvatos del mismo como adyuvante y un antígeno que comprende una estructura antigénica y, opcionalmente, un portador, diluente, conservante, adyuvantes distintos de los conjugados según la presente invención, inmunomoduladores o excipiente farmacéuticamente aceptables e instrucciones para preparar una vacuna.

Estas y otras realizaciones se dan a conocer y están abarcadas en la descripción y ejemplos de la presente invención. Puede recuperarse bibliografía adicional referente a uno cualquiera de los métodos, usos y compuestos que van a emplearse según la presente invención puede recuperarse de bibliotecas públicas, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos pública "Medline" que está disponible en Internet, por ejemplo en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. El experto en la técnica conoce bases de datos y direcciones adicionales, tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http: //www.infobiogen.fr/, http://www.tigr.org/, y también pueden obtenerse usando, por ejemplo, http://www.google.de. Se facilita una visión general de la información de patentes en biotecnología y un informe de las fuentes relevantes de información de patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y para el conocimiento actual en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: la figura 1 muestra un esquema para la síntesis de alfaGalCerMPEG según la presente invención.

Figura 2: la figura 2 muestra la determinación citométrica de diversas moléculas incluyendo moléculas coestimuladoras en la superficie de células dendríticas murinas tras estimulación con alfa-GalCer, alfaGalCerMPEG y PEG solos.

Figura 3: la figura 3 proporciona una comparación de expresión de anticuerpo de IgG específico de antígeno \beta-Gal en suero de animales inmunizados. En (A) se muestra los resultados de la administración intranasal (i.n.). (B) proporciona los niveles séricos de expresión IgG específico de antígeno tras la administración parenteral. Se muestra una comparación de ratones inmunizados con \beta-gal solo, \beta-gal + alfaGalCer (10 \mug/dosis) y \beta-gal + alfaGalCerMPEG (1 \mug/ml de resto activo/dosis).

Figura 4: la figura 4 muestra una comparación de la expresión de IgA secretora específica de \beta-Gal en la nariz, el pulmón y la vagina de animales inmunizados.

Figura 5: la figura 5A y B ilustra la estimulación de células de bazo con diversas cantidades de alfaGalCerMPEG y alfa-GalCer y en diferentes puntos de tiempo tras la administración i.n. (figura 5B).

Figura 6: la figura 6 demuestra que alfa GalCerMPEG es un adyuvante eficaz para la estimulación de células de bazo en vacunación i.n. y s.c..

Figura 7: la figura 7 muestra la expresión de los isotipos de IgG que son específicos para el antígeno \beta-gal en ratones tras la administración i.n. y s.c. de \beta-gal, \beta-gal/alfa-GalCer, y \beta-gal/alfa-GalCerMPEG, respectivamente.

Figura 8: la figura 8 ilustra la expresión y secreción de citocinas Th1 y Th2 de células de bazo tras reestimulación con el antígeno \beta-gal tras vacunación i.n. previa con \beta-gal solo, \beta-gal/alfa-GalCer y \beta-gal/alfa-GalCerMPEG, respectivamente.

Figura 9: la figura 9 ilustra la expresión y secreción de citocinas Th1 y Th2 de células de bazo tras reestimulación con el antígeno \beta-gal tras vacunación s.c. previa con \beta-gal solo, \beta-gal/alfa-GalCer y \beta-gal/alfa-GalCerMPEG, respectivamente.

Figura 10: la figura 10A y B demuestra la capacidad de las células de bazo para secretar IFN\gamma y IL-4, respectivamente, tras vacunación i.n. y s.c. con \beta-gal solo, \beta-gal/alfa-GalCer y \beta-gal/alfa-GalCerMPEG, respectivamente.

Figura 11: la figura 11 ilustra la estimulación in vitro de la actividad lítica mediante alfaGalCerMPEG. Se recuperaron células de bazo de ratones a los que se les inyectó alfaGalCer (10 \mug), alfaGalCerMPEG (10 \mug) o CpG (100 Mg) tras 48 h y se usaron como efectoras en un ensayo de liberación de 51Cr con dianas de células YAC-1. Los resultados se expresan como el tanto por ciento de lisis y son el promedio por triplicado.

Figura 12: la figura 12 demuestra el efecto de la coadministración de alfaGalCerMPEG sobre respuestas de CTL medidas mediante el ensayo VITAL (CTL in vivo).

La presente invención se describe adicionalmente con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.

Ejemplos Abreviaturas usadas en el presente documento

alfa-GalCer:

alfa-galactosilceramida

PEG:

Polietilenglicol

DCM:

Diclorometano

BPPcysPEG:

2,3-Bis(palmitoiloxi)-propil-L-cisteinilcarboxi-polietilenglicol

DIC:

Diisopropilcarbodiimida

HexCer:

Hexosilceramida

MPEG:

Metoxipolietilenglicol

HOBt:

Hidroxibenzotriazol

1. Síntesis de alfa-GalCer-MPEG

La síntesis del alfa-GalCer-MPEG según la presente invención se muestra en la figura 1. En resumen, se disolvieron 150 mg (75 \muMoles) de R-PEG-COOH (R = metil abreviándose con M) en 2 ml de DCM anhidro y se añadieron 10,1 mg (75 \muMoles) de hidroxibenzotriazol (HOBt) y 12 \mul (77 \muMoles) de diisopropilcarbodiimida (DIC). Tras 30 min. se añadieron 56,4 mg (50 \muMoles) del compuesto 1 mostrado en la figura 1, por ejemplo sintetizado mediante el método descrito en Zhou, X-T., et al. organic letters, 2002, 4(8), 1267-1270, en 5 ml de diclorometano anhidro (DCM) y se hicieron reaccionar mediante agitación en ausencia de humedad durante aproximadamente 15 h a temperatura ambiente. Tras la concentración hasta sequedad, se redisolvió el residuo en pequeñas cantidades de cloroformo y se purificó por medio de cromatografía en gel de sílice (20 x 1,5 cm) usando cloroformo y cloroformo/metanol (95:5) como eluyentes. Tras la concentración de la fracción que contenía el compuesto 2, se obtuvieron aproximadamente 150 mg de compuesto 2 tal como se muestra en la figura 1.

Escisión de los grupos de protección de O-benceno mediante hidrogenación

Se disolvieron aproximadamente 150 mg de compuesto 2 obtenido anteriormente en 12 ml de una mezcla de acetato de etilo/metanol (1:1) y se hidrogenó con hidrógeno usando 50 mg paladio/carbón (10%) durante aproximadamente 9 h a 40ºC. Tras la separación del catalizador y la filtración usando sílice y el lavado con una mezcla de los disolventes mencionados anteriormente, se concentró la fracción hasta sequedad y se obtuvieron aproximadamente 120 mg de compuesto 3 de la figura 1. Tras la purificación mediante cromatografía en gel de sílice usando una mezcla de cloroformo y metanol en razones de 95:5/90:10/85:15 y 80:20, respectivamente, como eluyente, la evaporación del disolvente y la liofilización a partir de agua se obtuvieron aproximadamente 100 mg de compuesto 3. Se sometió a prueba la estructura del nuevo alfa-GalCerMPEG soluble en agua (compuesto 3) mediante ^{1}H y ^{13}C-RMN y espectro de MALDI-EM (figura 1 D).

2. Estimulación in vitro de células dendríticas murinas derivadas de médula ósea primarias con alfaGalCer-MPEG

Protocolo experimental: se obtuvieron cultivos de células dendríticas derivadas de médula ósea primarias de ratones BALB/c tras la maduración in vitro de precursores en presencia de GM-CSF recombinante (5 x 10^{4} U/ml), según protocolos establecidos. Se estimularon células dendríticas maduras con 10 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) de E. coli, 10 ng/ml de alfa-GalCer o alfaGalCerMPEG, tras 12 h y 24 h, respectivamente, se analizó la estimulación de células mediante citometría de flujo para evaluar la expresión de marcadores de superficie que son relevantes para su capacidad de presentación de antígenos.

Con el fin de identificar compuestos que pueden tener potencial como adyuvantes para aplicaciones in vivo en el campo de las vacunas, se estableció una primera exploración in vitro basándose en el uso de cultivos primarios de células dendríticas derivadas de médula ósea. Se seleccionaron células dendríticas puesto que representan las células presentadoras de antígenos más eficaces y desempeñan un papel clave en respuestas inmunitarias primarias. De hecho, representan el único tipo de célula que puede activar T células en reposo iniciando respuestas inmunitarias primarias in vivo. Por tanto, se trataron cultivos de células dendríticas con los compuestos del título sometidos a prueba o LPS, que se usó como control positivo. En intervalos de tiempo diferentes, se tomaron muestras, se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia específicos para marcadores celulares críticos para las capacidades de presentación de antígenos de células dendríticas, y se analizaron mediante citometría de flujo.

Los resultados obtenidos (figura 2) demostraron que al contrario que el control, el grupo que recibió alfa-GalCer, la expresión de CD40 y la molécula coestimuladora CD86 y CD80 estaba regulada por incremento en las células dendríticas tratadas con alfaGalCerMPEG. Además, se aumenta la expresión de la molécula CD1d tras la estimulación con alfaGal-CerMPEG.

Las moléculas coestimuladoras suministran señales que, además de la presentación de los epítopos procesados en el contexto de las moléculas del CMH de clase II, son esenciales para la activación eficaz de T células. Se ha notificado anteriormente que la capacidad de adyuvante de adyuvantes mucosales bien establecidos, tales como toxina del cólera, implica la regulación por incremento selectiva de la expresión de moléculas coestimuladoras. Por tanto, estos resultados in vitro sugieren fuertemente el alto potencial de alfaGalCerMPEG como adyuvantes mucosales.

3. La coadministración intranasal y subcutánea de alfaGalCerMPEG con un antígeno soluble estimula respuestas humorales sistémicas eficaces

Protocolo experimental: se adquirieron ratones BALB/c (H-2d) hembra de seis-ocho semanas de edad de Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemania) y se trataron según las directrices locales y de la Comunidad Europea. Se inmunizaron grupos de 5 ratones cada uno en el día 1, 14 y 28 con 30 \mug de \beta-gal (Boehringer, Mannheim, Alemania), solo o con 10 \mug de alfaGalCerMPEG. Para la inmunización intranasal (i.n.), se aplicaron 10 \mul a cada narina, mientras que para la inyección s.c. se resuspendió \beta-gal con o sin alfaGalCerMPEG en un volumen de 20 \mul de PBS por animal. Se recogieron muestras séricas en el día 38 tras la inmunización y se almacenaron a -20ºC antes de la determinación de anticuerpos específicos frente a \beta-gal. Se recubrieron placas de ensayo de 96 pocillos de Nunc-Immuno MaxiSorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 100 \mul de \beta-gal (Boehringer, Mannheim, Alemania) a 5 \mug/ml en tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6) por pocillo. Se añadieron diluciones de dos veces en serie de sueros o lavados en PBS con BSA al 1% y Tween 20 al 0,05% (100 \mul/pocillo), y se incubaron las placas durante 16 h a 37ºC. Tras el lavado, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón específico de la cadena \gamma biotinilado (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemania), y se incubaron las placas durante 1 h adicional a 37ºC. Tras cuatro lavados, se añadieron 100 \mul de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pharmingen) a las células y se incubaron las placas a 37ºC durante 30 min. Tras cuatro lavados, se desarrollaron las reacciones con ABTS en tampón citrato-fosfato 0,1 M (pH 4,35) que contenía H_{2}O_{2} al 0,01%. Se expresaron los títulos de punto final como el log2 recíproco de la última dilución, que proporcionó una densidad óptica a 405 nm de 0,1 unidades por encima de los valores de los controles negativos tras de 15 a 30 min. de incubación.

En vista de los resultados in vitro anteriores, se han realizado estudios in vivo adicionales. En detalle, se determinaron las respuestas inmunitarias usando alfaGalCerMPEG como adyuvante aplicado mediante las dos vías más eficaces, concretamente s.c. e i.n. Por tanto, se evaluó la capacidad de alfaGalCerMPEG para estimular respuestas inmunitarias humorales eficaces, determinando los títulos séricos de anticuerpos específicos frente a \beta-gal en ratones vacunados.

Tal como se muestra en la figura 3A, la administración i.n. de \beta-gal solo (30 \mug/dosis) dio como resultado la inducción de títulos de anticuerpo muy bajos, incluso tras el segundo refuerzo (día 28). En cambio, en presencia de alfaGalCerMPEG, la administración i.n. de \beta-gal indujo títulos muy altos de IgG específica en todos los ratones ya tras una dosis, y al final del protocolo de inmunización, los títulos eran 32 veces superiores que en los animales vacunados con \beta-Gal solo. La vacunación por la vía parenteral (figura 3B) dio como resultado títulos de IgG similares a la vacunación usando \beta-Gal solo. La cinética y la eficacia global del las respuestas de anticuerpo obtenidas usando de 5 a 10 \mug de alfaGalCerMPEG por dosis eran similares a las observadas administrando \beta-gal junto con BPPcysPEG (0,5 \mug de agente activo en ebullición por animal), que se sabe que funciona bien como adyuvante mucosal. La reducción de la dosificación hasta 1 \mug por animal dio como resultado en una disminución de la respuesta inmunitaria de una manera dependiente de la dosis.

Además, tal como puede observarse a partir de la figura 3A y la figura 3B, la inducción de una respuesta inmunitaria de IgG fuerte es independiente de la vía de administración. También se observó una capacidad de adyuvante significativa cuando se administró alfaGalCerMPEG mediante la vía s.c. (figura 3B).

4. La coadministración intranasal de alfaGalCerMPEG con un antígeno soluble estimula respuestas de anticuerpos de la mucosa eficaces

Protocolo experimental: en el día 38, se sacrificaron los ratones y se realizó el muestreo final. Se obtuvieron lavados nasales, vaginales y pulmonares lavando con chorro de agua los órganos con 1 ml de PBS complementado con EDTA 50 mM, BSA al 0,1% y PMSF 10 mM. Entonces se centrifugaron los lavados para eliminar residuos (10 min. a 3000 x g), y se almacenaron los fluidos sobrenadantes a -20ºC. Para determinar la concentración de IgA total presente en los lavados pulmonares y vaginales, se incubaron diluciones en serie de las muestras correspondientes en placas de microtitulación que se recubrieron previamente con anticuerpo de cabra anti-IgA de ratón (Sigma Chemie), como anticuerpos de captura (100 \mul/pocillo). Se usaron diluciones en serie de IgA de ratón purificada (Sigma Chemie) para generar una curva patrón.

Para investigar la capacidad de alfaGalCerMPEG para estimular respuestas de la mucosa frente a antígenos coadministrados mediante la vía i.n., se analizó la producción de IgA específica de \beta-gal en pulmón (figura 4) a partir de animales inmunizados, inmunizados según el protocolo descrito en el ejemplo 3. Mientras que la inmunización i.n. con \beta-gal solo dio como resultado una producción débil de niveles detectable de IgA específica de \beta-gal en, por ejemplo, lavados de pulmón, se detectó un aumento significativo en los niveles de IgA específica de antígeno en animales inmunizados con \beta-gal y alfaGalCerMPEG (figura 4).

Los animales vacunados mediante la vía parenteral revelaron que la coadministración de alfaGalCerMPEG da como resultado la producción de anticuerpos de IgA específicos de \beta-gal en el pulmón. Los niveles de IgA específica de antígeno aumentaron significativamente en comparación con el control (\beta-Gal solo) y el control positivo (\beta-Gal coadministrado con BPPcysPEG), véase la figura 4B).

5. AlfaGalCerMPEG estimula respuestas proliferativas mediadas por células T eficaces cuando se coadministra con antígenos solubles

Protocolo experimental: Se extirparon bazos de ratones BALB/c (H-2d, Harlan Winkelmann) o CD1d-/- (Jackson Laboratories) hembra de 6 semanas de edad y se agruparon para el análisis de respuestas inmunitarias celulares. Se hicieron crecer células en RPMI 1640 complementado con suero de ternero fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y L-glutamina 1 mM (GIBCO BRL, Karlsruhe, Alemania) y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada con el 5% de CO_{2}. Se ajustaron las suspensiones celulares de bazo a 5 x 10^{6} células/ml en medio completo, se sembraron las células con 100 \mul por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Nunc) y se incubaron las placas durante 4 días. Se incubaron células de bazo no estimuladas en presencia de diferentes concentraciones de los nuevos adyuvantes para analizar la capacidad de estimulación in vitro de alfaGalCerMPEG. Se investigaron respuestas inmunitarias mediadas por células T en el día 38 midiendo la proliferación de células recuperadas de los bazos tras reestimulación in vitro con \beta-Gal. Se obtuvieron dichas células de bazo de ratones vacunados (dichos ratones se inmunizaron tal como se describió en el ejemplo 3) y se incubaron en presencia de diferentes concentraciones del antígeno \beta-Gal soluble. Se sometió a prueba cada concentración por triplicado. Durante las 18 h finales del cultivo, se añadió 1 \muCi de [3H]timidina (Amersham International, Freiburg, Alemania) a cada pocillo. Entonces se recogieron las células en filtros de papel (Filtermat A; Wallac, Freiburg, Alemania) usando un colector de células (Inotech, Wohlen, Suiza), y se determinó la cantidad de [3H]timidina incorporada en el ADN de células en proliferación mediante un contador de centelleo \beta (Wallac 1450, Micro-Trilux). Los resultados se expresan como la media aritmética de la captación de [3H]timidina en cpm.

Las células de bazo no estimuladas incubadas con diferentes concentraciones de alfaGalCerMPEG mostraron una estimulación aumentada en respuesta a una concentración potenciada del nuevo compuesto (figura 5) en comparación con el control. Además, las células de bazo incubadas con diferentes concentraciones de alfaGalCer no mostraron aumento dependiente de la dosis en la estimulación de células de bazo.

Treinta y ocho días tras la vacunación i.n. o s.c., respectivamente, se purificaron células de bazo, se reestimularon in vitro en presencia de diversas cantidades de \beta-galactosidasa y se estimó su capacidad proliferativa midiendo la incorporación de [3H]timidina en su ADN usando un contador de centelleo \beta. Las células de bazo de animales inmunizados mediante inyección s.c. de \beta-gal solo, que se eligieron como control, mostraron una respuesta proliferativa significativa en comparación con el grupo no inmunizado (figura 6). Se observó un aumento adicional en la proliferación en células de bazo de animales a los que se les coadministró alfaGalCerMPEG y antígeno. Mientras que la administración i.n. de \beta-gal solo falló en la inducción de la proliferación celular detectable, la coadministración de alfaGalCerMPEG desencadenó la inducción de una respuesta proliferativa eficaz a cantidades aún bajas de antígeno (véase la figura 6).

De importancia, se observó la respuesta proliferativa de células T con células de bazo de ratones inmunizados con alfaGal-CerMPEG y \beta-gal administrados mediante la vía i.n. y s.c., respectivamente (véase la figura 6A y B).

En todos los casos se observó un efecto dependiente de la dosis cuando se aumentó la concentración de \beta-gal en el experimento de reestimulación. Por tanto, el uso del nuevo adyuvante alfaGalCerMPEG dio como resultado un aumento estadísticamente significativo de la proliferación de células T tras la administración i.n. y s.c. Estos resultados demuestran que el alfaGalCerMPEG puede aumentar la respuesta inmunitaria celular.

6. Análisis de los patrones de células T cooperadoras estimuladas usando alfa-GalCerMPEG como adyuvante

Protocolo experimental:

ELISA de isotipo: se recubrieron placas de ensayo Nunc-Immuno MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 100 \mul de \beta-gal (Boehringer, Mannheim, Alemania) a 5 \mug/ml en tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6) por pocillo. Se añadieron diluciones de dos veces en serie de sueros o lavados en PBS con BSA al 1% y Tween 20 al 0,05% (100 \mul/pocillo), y se incubaron la placas durante 2 h a 37ºC. Tras el lavado, se añadieron anticuerpos de rata anti-IgG1 o IgG2a de ratón conjugados con biotina (Pharmingen, Hamburg, Alemania) para determinar las subclases de IgG. Se incubaron las placas durante una 1 h adicional a 37ºC. Tras cuatro lavados, se añadieron 100 \mul de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Pharmingen) a las células y se incubaron las placas a 37ºC durante 30 min. Tras cuatro lavados, se desarrollaron las reacciones con ABTS en tampón citrato-fosfato 0,1 M (pH 4,35) que contenía H_{2}O_{2} al 0,01%. Para determinar la concentración de subclases de IgG en suero, se obtuvieron curvas patrón recubriendo los pocillos con un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón específico de isotipo, e incubando entonces con anticuerpos IgG1 o IgG2 de ratón purificados (Dianova, Hamburg, Alemania).

Se muestra el patrón de las diferentes subclases de los isotipos de IgG específicos de antígeno \beta-gal presentes en los sueros de ratones vacunados en la figura 7. La figura 7A muestra los resultados para la administración intranasal de \beta-Gal solo, b-Gal y alfa-GalCer y alfaGalCerMPEG. El protocolo de vacunación era idéntico al protocolo descrito en el ejemplo 3. Tal como puede determinarse a partir de la figura 7A, la cantidad de anticuerpos específicos de antígeno del subtipo IgG1 (24 veces) aumentó fuertemente tras la administración intranasal del antígeno usando alfaGalCerMPEG como adyuvante mucosal. Además, también en el caso de la administración sistémica, en este caso administración subcutánea, la expresión del isotipo IgG1 aumentó fuertemente (4 veces), véase la figura 7B. Los datos representan el título promedio de un grupo de 5 animales.

Por tanto, el uso de alfaGalCerMPEG permite producir una fuerte respuesta de anticuerpos específica de antígeno. Puede observarse el desencadenamiento no solamente tras la administración intranasal sino también tras la administración parenteral.

Para caracterizar el tipo de respuesta Th estimulada tras la inmunización, se midió el contenido en IFN-\gamma, IL-2, IL-6, IL-10, MCP-1 y TNF\alpha en sobrenadantes de células de bazo reestimuladas in vitro (figuras 8 y 9) mediante la técnica Cytometric Bead Array. Se recogieron sobrenadantes de cultivo de células en proliferación en los días 2 y 4, y se almacenaron a -70ºC. Se analizaron determinaciones de IFN-\gamma, TNF\alpha, IL-2, IL-6, IL-10 y MCP-1 mediante análisis de Cytometric Bead Array usando el kit comercial de BectonDickinson, según las instrucciones del fabricante. Se generó una curva patrón para cada citocina usando las citocinas murinas recombinantes correspondientes (Pharmingen). Se incubaron sondas a temperatura ambiente durante 2 h adicionales. Se analizaron las sondas posteriormente mediante citometría de flujo tal como se describió en el protocolo de BD.

Tal como se muestra en la figura 8, se secretaron de hecho IFNgamma y IL-2 por células de bazo de ratones vacunados. De manera interesante, la concentración de las citocinas Th1 secretadas por células recuperadas de ratones vacunados por vía intranasal con alfaGaCerMPEG era significativamente inferior a la observada en animales que recibieron alfaGalCer. Esto sugiere la inducción de una respuesta de tipo Th2 más fuertemente polarizada cuando se usó el derivado pegilado de alfaGalCer. La secreción de las citocinas proinflamatorias TNFalfa y IL-6 era similar usando ambos compuestos. Sin embargo, se secretaron niveles significativamente superiores de la citocina anti-inflamatoria IL-10 por células derivadas de ratones que recibieron alfaGalCerMPEG. Esto puede sugerir que el derivado pegilado es farmacológicamente más aceptable en comparación con el compuesto alfaGalCer no derivatizado.

La administración parenteral (s.c.) de \beta-Gal con alfaGalCerMPEG o alfaGalCer demuestra que la utilización de estos adyuvantes indujo una secreción potenciada significativa de TNFalfa, IL-10 e IFNgamma. Al contrario de los animales vacunados con el derivado de alfaGalCer original, los ratones vacunados con beta-Gal coadministrada con alfaGalCerMPEG mostraron niveles significativamente superiores de IL-10 e IFNgamma y una disminución en la secreción de MCP-1, tal como se muestra en la figura 9. Esto sugiere que el derivado pegilado es farmacológicamente más activo en comparación con el compuesto de alfaGalCer no derivatizado.

7. Análisis de los patrones de células T cooperadoras estimuladas usando alfa-GalCerMPEG como adyuvante mediante Elispot

Protocolo experimental: se extirparon bazos de ratones vacunados y se agruparon para el análisis de respuestas inmunitarias celulares. El protocolo para vacunación era idéntico al protocolo descrito en el ejemplo 3. Se hicieron crecer las células en RPMI 1640 complementado con suero de ternero fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y L-glutamina 1 mM (GIBCO BRL, Karlsruhe, Alemania) y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada con el 5% de CO_{2}. Se ajustaron las suspensiones celulares de ganglios linfáticos y bazos a 5 x 10^{6} células/ml en medio completo, se sembraron las células con 100 \mul por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Nunc) y se incubaron las placas durante 24 h (IFNgamma) o 48 h (IL-2 y IL-4) en ausencia o presencia de un péptido de beta-Gal (TPHARIGL) que abarcaba un epítopo peptídico restringido por el CMH de clase I (para IFNgamma) o la proteína beta-Gal (para IL-2 y IL-4), a una concentración de 10 \muM. Entonces, se separaron las células y se procesaron las placas según las instrucciones del fabricante. Se contaron los puntos coloreados con un lector de C.T.L. Elispot y se analizaron usando el software de análisis de imágenes ImmunoSpot v3.2.

Por tanto, para caracterizar adicionalmente las respuestas de células T cooperadoras, se determinó el número de células que secretaban IFNgamma, IL-2 y IL-4 específicas de beta-Gal presentes en bazos de ratones vacunados. Según los resultados anteriores para isotipos de IgG, se detectaron altos números de células que secretaban IL-4 en ratones que recibieron alfaGalCerMPEG o alfaGalCer (figura 10). En cambio, el número de células que secretaban IFNgamma e IL-2 aumentó hasta un grado significativo menor en respuesta a la estimulación con péptido restringido por el CMH de clase I y la proteína \beta-Gal, respectivamente.

8. Análisis de la estimulación de células NK y NKT murinas usando alfaGalCerMPEG como adyuvante

Protocolo experimental: los ratones recibieron 10 \mug de alfaGalCer o alfaGalCerMPEG por vía s.c., mientras que se inyectaron a los animales control por vía intraperitoneal 100 \mug de CpG. Tras 2 días, se sacrificaron y se usaron sus esplenocitos como células efectoras en un ensayo de liberación de 51Cr convencional usando células YAC-1 como dianas para las células NK.

Se lavaron las células efectoras y se ajustó su concentración hasta 1x10^{6}/ml. En paralelo, se incubaron células diana en medio RPMKI sin FCS que contenía 100 \muCi de 51Cr durante 2 h. Entonces, se lavaron exhaustivamente las células diana con medio RPMI que contenía FCS y se incubaron conjuntamente por triplicado con células efectoras a diferentes razones de célula efectora:diana (E:D). Tras 4 h, Se centrifugaron las células y se midió la radioactividad presente en los sobrenadantes mediante recuento de centelleo. Se determinó la lisis máxima tras la lisis con Tween X-100 al 5%, mientras que se midió la lisis espontánea en sobrenadantes de células diana no tratadas. Se expresan los resultados como el porcentaje de células lisadas, según la fórmula: (muestra - lisis espontánea)/(lisis máxima - lisis espontánea) x 100.

Para analizar la influencia in vivo de \alphaGalCerMPEG sobre la actividad citotóxica de células NK, se inyectaron a los ratones diferentes adyuvantes, es decir \alphaGalCer, \alphaGalCerMPEG y CpG. Tras 2 días, se usaron esplenocitos como células efectoras en un ensayo de liberación de 51Cr con células YAC-1, una diana bien conocida para células NK. Tras estimulación in vivo usando la \alphaGalCer hidrófoba (10 \mug) o el adyuvante CpG, se observó un potencial citotóxico similar de esplenocitos frente a la línea de células tumorales YAC-1 (el 37-36% y el 34-27% a razones de célula efectora:diana de 100:1 y 50:1 respectivamente). Por otra parte, cuando se usó \alphaGalCerMPEG (es decir, 10 \mug que corresponden a 1 \mug de \alphaGalCer), las células de bazo mediaron las lisis del 56 y el 46% de células YAC-1 a una razón de célula efectora con respecto a diana de 100:1 y 50:1, respectivamente (figura 11). También se evaluó la citotoxicidad en poblaciones de células de bazo singénicas marcadas con fluorescencia administradas mediante inyección i.v. en grupos de ratones.

9. Análisis de la actividad citolítica de células T citotóxicas usando alfaGalCerMPEG como adyuvante

Protocolo experimental: se adquirieron ratones C57Bl6 hembra de seis a ocho semanas de edad de Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemania) y se trataron según las directrices locales y de la Comunidad Europea. Se inmunizaron grupos de 5 ratones cada uno en el día 1, 14 y 28 con 50 \mug de ovalbúmina (Sigma, Alemania) solo o con 10 \mug de alfaGalCerMPEG o alfaGalCer. Para inmunización intranasal, se aplicaron 10 ml a cada narina, mientras que para la inyección s.c. se resuspendió ovoalbúmina (ova) con o sin alfaGalCerMPEG o alfaGalCer en un volumen de 50 \mul de PBS por animal. La determinación de la citotoxicidad mediada por linfocitos in vivo siguió un protocolo descrito por Hermans et al. (Herman, I.F., et al., 2004, The vital assay, J Immunol Methods, 285, 25-40). Se drenaron los glóbulos rojos de una suspensión de esplenocitos de ratones sin tratar y se dividieron en dos porciones iguales. Se marcó las preparación de células diana con una alta concentración (1 \muM) de CFSE (Molecular Probes) y se pulsó durante 1 h a 37ºC con péptido OVA dominante (aa 257-264) a una concentración de 15 \mug/ml. Se marcó la población control con una baja concentración (0,1 \muM) de CFSE y se incubó adicionalmente durante 1 h a 37ºC sin péptido. Se mezclaron números iguales de cada población de células. Se transfirió de manera adoptiva una cantidad total de 2 x 10^{7} células mediante inyección intravenosa en los ratones inmunizados. Se analizaron células de los bazos mediante citometría de flujo tras 16 h y 40 h, con el aparato FACScalibur usando el software BD cell Quest Pro. Se distinguió la lisis específica mediante la pérdida de la población de CFSE^{hi} pulsada con péptido en comparación con la población CFSElo control. Se usó la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de lisis específica: 100 - ({(% de CFSEhi en ratones inmunizados/% de CFSElo en ratones inmunizados)/(% de CFSEhi en ratones control/% de CFSElo en ratones control)] x 100). Se calculó la actividad citotóxica con cualquier variabilidad en la proporción de células en las diferentes poblaciones diana evaluadas en un grupo control no inmunizado para ensayos de CTL. Tal como se muestra en la figura 12, con alfaGalCer hidrófoba (10 \mug), se observó un aumento de 6,4 veces (30%) del potencial citotóxico de esplenocitos con respecto a esplenocitos recuperados de animales que recibieron el antígeno OVA solo (5%). Sin embargo, cuando se usó alfaGalCerMPEG (es decir, 10 \mug que corresponden a 1 \mug de alfaGal-Cer) las células de bazo mediaron la lisis de casi el 60% de las células diana recubiertas con péptido y mostraron un aumento de 12 veces del potencial citotóxico con respecto a esplenocitos recuperados de animales que recibieron el antígeno solo (5%).

Claims (25)

1. Conjugado de alfa-hexosilceramida (alfa-HexCer) según la fórmula (I)

2

en la que

A es CH_{2} o CO;

B representa R_{4}, OR_{4}, NHR_{4}, PO_{3}R_{4} o SO_{3}R_{4};

en los que R_{4} es un resto de conjugado que es un polímero tolerado fisiológicamente y soluble en agua;

R_{1} y R_{2} pueden ser iguales o diferentes y son independientemente grupos alquenilo y/o alquilo C_{10}-C_{30} lineales o ramificados;

D representa CH_{2} o CH(OH);

R_{3} representa hidrógeno u OH; R_{5} y R_{6} son sustituyentes en los que o bien R_{5} representa hidrógeno y R_{6} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6} o bien R_{6} es hidrógeno y R_{5} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6};

R_{7} y R_{8} son sustituyentes en los que o bien R_{7} representa hidrógeno y R_{8} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6} o bien R_{8} es hidrógeno y R_{7} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6};

R_{9} y R_{10} son sustituyentes en los que o bien R_{9} representa hidrógeno y R_{10} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6} o bien R_{10} es hidrógeno y R_{9} representa hidrógeno, OH, O-alquilo C_{1}-C_{6}, NH_{2}, NHCO-alquilo C_{1}-C_{6}; o sales o solvatos del mismo.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Conjugado de alfa-HexCer según la reivindicación 1, caracterizado porque R_{4} contiene al menos una unidad de polialquilenglicol de fórmula:

X_{1}-[(CHR_{11})x-O]n-(Z)y-

en la que

X_{1} es hidrógeno o un hidrocarburo que puede contener heteroátomo(s);

Z es un grupo de enlace divalente, tal como C=O o CHR_{11};

R_{11} es independientemente uno cualquiera de hidrógeno, OH, OR_{12} o CO-R_{13};

R_{12} es independientemente uno cualquiera de hidrógeno o grupo alquilo C_{1}-C_{6};

R_{13} es independientemente uno cualquiera de hidrógeno, OH, OR_{12} o NR_{14}R_{15};

R_{14} y R_{15} son independientemente uno cualquiera de hidrógeno o hidrocarburo que puede contener heteroátomo(s) y que puede formar un anillo;

n es un número entero de 1 a 100;

x es independientemente un número entero de 1 a 10;

y es un número entero de 0 a 10.

3. Conjugado de alfa-HexCer según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque R_{4} comprende al menos dos cadenas que tienen unidades de polialquilenglicol.

4. Conjugado de alfa-HexCer según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque las unidades de polialquilenglicol son unidades de polietileno, unidades de polipropileno y/o unidades de polibutileno.

5. Conjugado de alfa-HexCer según la reivindicación 1 a 4, caracterizado porque R_{4} es un residuo de metoxipolietilenglicolcarbonilo.

6. Conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el R_{4} de conjugado es (S)-10-amino-6,9,13,16-tetraoxo-N,N',8,14-tetrakis(3,6,9,12-tetraoxatridec-1-il)-5,8,14,17-tetraazahenicosano-1,21-diamida.

7. Conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque R_{1} es un grupo alquilo C_{19}-C_{29} y R_{3} es hidrógeno.

8. Conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque R_{2} es un grupo alquilo C_{10}-C_{20}.

9. Conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque cada uno de R_{6}, R_{7} y R_{9} es un grupo hidroxilo.

10. Conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{1} es un grupo alquilo C_{24}, R_{2} es un grupo alquilo C_{14}, R_{3} es hidrógeno y cada uno de R_{6}, R_{7} y R_{9} es un grupo hidroxilo.

11. Composición farmacéutica que comprende un conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador, diluyente, conservante, adyuvantes, inmunoduladores y/o excipiente farmacéuticamente aceptables.

12. Uso de un conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades infecciosas, choque septicémico, cáncer, tumores, enfermedades autoinmunitarias, alergias, procesos inflamatorios crónicos o agudos, o para controlar la fertilidad en poblaciones humanas o animales.

13. Uso según reivindicación 12, en el que la enfermedad infecciosa se produce mediante un agente infeccioso seleccionado entre aquellos que provocan una enfermedad infecciosa humana o animal al nivel de las vías respiratorias, tubo digestivo, aparato genitourinario, sistema osteoarticular, sistema cardiovascular, sistema neuronal, piel o mucosa.

14. Uso del conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la preparación de una composición farmacéutica para activar o potenciar in vitro y/o in vivo la función de presentación de antígenos de células presentadoras de antígenos para una intervención terapéutica o profiláctica.

15. Uso del conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la preparación de una composición farmacéutica para estimular macrófagos, células dendríticas, células NK y NK/T y la producción de anticuerpos, o la preparación de vacunas a base de células como inmunoestimulantes.

16. Composición farmacéutica que comprende un conjugado de alfa-HexCer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como adyuvante, un principio farmacéuticamente activo y un portador, diluyente, conservante, adyuvantes distintos de los conjugados tal como se definieron en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, inmunomoduladores o excipiente farmacéuticamente aceptables.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, caracterizada porque la composición farmacéutica es una vacuna.

18. Composición farmacéutica según reivindicación 16 ó 17, en la que el/los principio(s) activo(s) comprende(n)
al menos uno o más antígenos en forma de péptidos, proteínas, polisacáridos, glicolípidos o ADN que codifica para los mismos o sistemas de administración de antígenos tales como virosomas, partículas físicas, preferiblemente micropartículas, nanopartículas, liposomas, ISCOM, copolímeros y/o partículas biológicas, preferiblemente fantasmas bacterianos, partículas similares a virus (VLP) PLP o vacunas atenuadas.

19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque los antígenos son antígeno(s) tumoral(es) o antígeno(s) derivado(s) de agentes infecciosos para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas, choque septicémico, cáncer, tumores, enfermedades autoinmunitarias, alergias o procesos inflamatorios crónicos o agudos.

20. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, que comprende además una o más moléculas antiinflamatorias, moléculas antiangiogénicas, moléculas citotóxicas, moléculas inmunomoduladoras, preferiblemente quimiocinas, citocinas, ligando de CD40, moléculas coestimuladoras o anticuerpos o mezclas de los mismos.

21. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, proporcionada en una formulación adecuada para administración en la mucosa, en particular, para administración intranasal, intra-NALT, oral, intrarrectal, intrapulmonar, intrabronquial, intratecal, en la conjuntiva, intravaginal o intrauretral, administración en los conductos lácteos de la mama o mediante inhalación.

22. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, proporcionada en una formulación adecuada para administración parenteral, en particular, en administración subcutánea, intravenosa, intradérmica o intramuscular.

23. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, como composición combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas, cánceres, tumores, enfermedades autoinmunitarias o alergias, o procesos inflamatorios crónicos o agudos o para controlar la fertilidad en poblaciones humanas o animales.

24. Conjugado de alfa-GalCer según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como adyuvante sistémico o mucosal.

25. Kit que comprende la hexosilceramida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como adyuvante y una estructura antigénica y, opcionalmente, un portador, diluyente, conservante, adyuvantes distintos de los conjugados tal como se definieron en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, inmunomoduladores o excipiente farmacéuticamente aceptables.