ES2331075T3 - Vectores virales. - Google Patents

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ES2331075T3 ES04743547T ES04743547T ES2331075T3 ES 2331075 T3 ES2331075 T3 ES 2331075T3 ES 04743547 T ES04743547 T ES 04743547T ES 04743547 T ES04743547 T ES 04743547T ES 2331075 T3 ES2331075 T3 ES 2331075T3
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Abstract

Un herpesvirus que carece de un gen codificante de ICP34.5 funcional y que comprende: (i) un gen heterólogo que codifica una enzima conversora de profármaco; y (ii) un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula.

Description

Vectores virales.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a cepas de herpesvirus con actividad antitumoral mejorada en comparación con cepas anteriormente conocidas.
Antecedentes de la invención
Se ha demostrado que los virus tienen utilidad en una diversidad de aplicaciones en biotecnología y medicina en muchas ocasiones. Cada una se debe a la capacidad única de los virus de introducirse en células con gran eficacia. Esto viene seguido en dichas aplicaciones de la expresión de genes de virus y de la replicación y/o expresión de un gen heterólogo insertado. Por lo tanto, los virus pueden suministrar y expresar genes virales u otros genes en células que pueden ser útiles, por ejemplo, en terapia génica o en el desarrollo de vacunas, o pueden ser útiles en la destrucción selectiva de células por replicación lítica o por la acción de un gen suministrado, por ejemplo, en el
cáncer.
Se ha sugerido que el virus herpes simple (HSV) es de utilidad para el tratamiento oncolítico del cáncer. Sin embargo, un virus para el uso en el tratamiento del cáncer debe incapacitarse de modo que ya no sea patógeno, es decir, que no se replique en y destruya células no tumorales, pero de modo que todavía pueda introducirse en y destruir células tumorales. Para el tratamiento oncolítico del cáncer, que también puede incluir el suministro de un gen o genes que aumenten el efecto terapéutico, se han identificado varias mutaciones en HSV que todavía permiten que el virus se replique en cultivo y en células activamente en división in vivo (por ejemplo, en tumores), pero que evitan una replicación significativa en tejido normal. Dichas mutaciones incluyen la alteración de los genes que codifican ICP34.5, ICP6 y timidina quinasa. De estos, los virus con mutaciones en ICP34.5 o ICP34.5 junto con la mutación de, por ejemplo, ICP6, han demostrado hasta ahora el perfil de seguridad más favorable. Se ha demostrado que los virus en los que se ha realizado una deleción solamente en el factor de neurovirulencia ICP34.5 se replican en muchos tipos de células tumorales in vitro y se replican selectivamente en tumores cerebrales inducidos artificialmente en ratones al tiempo que evitan el tejido circundante. Los ensayos clínicos de fase temprana también han demostrado su seguridad en seres humanos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona virus con capacidades mejoradas para la destrucción de células tumorales in vivo. Los virus proporcionados por la presente invención comprenden una mutación inactivante en el gen que codifica ICP34.5 y son capaces de suministrar dos genes que, en combinación, aumentan el efecto terapéutico. El virus comprende los dos tipos de gen siguientes:
Un gen heterólogo que codifica una enzima activadora de profármaco capaz de convertir un profármaco inactivo o escasamente activo en la forma activa o más activa. El tratamiento de tumores con el virus se acompaña por lo tanto de la administración del profármaco; y
Un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de fusionar células (es decir, provocar la formación de sincitios). Esto proporciona por sí mismo efectos antitumorales que pueden estar mediados por la inducción de una respuesta inmune. Sin embargo, en combinación con la activación de profármaco este efecto antitumoral se aumenta. Dichos genes fusogénicos incluyen lipoproteínas de la envuelta retroviral modificadas tales como las procedentes del virus de la leucemia del mono gibón o retrovirus endógeno humano W, las proteínas F y H fusogénicas del virus del sarampión o la proteína G del virus de la estomatitis vesicular, pero también pueden usarse otros genes que codifican proteínas capaces de causar fusión celular.
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El virus puede comprender además un gen heterólogo que codifique una proteína inmunomoduladora. La proteína inmunomoduladora promueve una respuesta inmune antitumoral. Dicho gen o genes incluyen inmunomoduladores tales como GM-CSF, TNF\alpha, CD40L u otras citocinas o moléculas co-estimuladoras. La proteína inmunomoduladora aumenta los efectos del gen activador de profármaco y/o la proteína capaz de causar la fusión de célula con célula en solitario.
La presente invención proporciona por lo tanto virus capaces de la destrucción oncolítica de células tumorales en los que, cuando se administran a un paciente, opcionalmente en combinación con un profármaco, las propiedades anti-tumorales del virus se aumentan por las acciones combinadas del profármaco activado y la proteína fusogénica y, opcionalmente, la proteína inmunomoduladora expresada a partir del genoma viral.
\newpage
Por consiguiente, la invención proporciona:
-
un herpesvirus que carece de un gen codificante de ICP34.5 funcional y que comprende:
(i)
un gen heterólogo que codifica una enzima conversora de profármaco; y
(ii)
un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula.
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La invención también proporciona:
-
un herpesvirus de la invención para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia;
-
uso de un herpesvirus de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer; y
una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un herpesvirus de acuerdo con la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa los plásmidos usados para construir los virus de la invención e ilustra cómo se construyen los plásmidos. Los plásmidos codifican un gen de citosina desaminasa o una glicoproteína fusogénica de leucemia del mono gibón (GALV), o ambos genes flanqueados por secuencias de HSV1 que flanquean el gen codificante de ICP34.5. Los plásmidos pueden usarse para recombinación homóloga en el gen de HSV1 para sustituir el gen codificante de ICP34.5 con el gen de la citosina desaminasa, el gen de la glicoproteína de GALV o ambos genes. Estos plásmidos se usan después para construir los virus que se muestran en la Figura 2.
La Figura 1a muestra la subclonación del gen Fcy:Fur a partir de pORF Fcy:Fur (Invitrogen) en pRcRSV (Invitrogen). El gen Fcy:Fur se eliminó por digestión de restricción (Nhe I y Nco I (enromado con polimerasa T^{4}). Este fragmento se ligó después en pRcRSV (Invitrogen) cortado con Xba I y Hind III (enromado con polimerasa T^{4}).
La Figura 1b muestra la subclonación del casete RSV Fcy:Fur pA de pRcRSV en p-34.5 mediante digestión de restricción (Pvu II, NruI). Este fragmento se ligó después en el vector lanzadera p-34.5 cortado con NotI (enromado con polimerasa T^{4}). El plásmido p-34.5 se basa en pSP72 (Promega) y contiene dos regiones flanqueantes a cualquier lado del gen de ICP34.5 de HSV-1 (basado en la cepa 17+ del HSV-1 (123462-124958 pb, 125713-126709 pb)) Genbank X14112).
La Figura 1c muestra la envuelta truncada (env) del virus de la leucemia del mono gibón (Genbank NC_001885, 5552-7555 pb) que se obtuvo por RT-PCR a partir de una línea celular productora de virus (MLV 144, Rangan et al., 1979). La envuelta (GALV envR-) se clonó en pcDNA3 (Invitrogen) (mediante digestión de restricción con EcoRI y Not I), un vector de expresión de mamíferos, y se ensayaron tres de los clones para determinar la producción de sincitios.
La Figura 1d muestra la anulación de un sitio Not-1 en pcDNA3 GALV env R- por digestión usando Not I y enromado con polimerasa T^{4}, seguido de religación.
La Figura 1e muestra la subclonación de virus GALV env R-menos (Genbank NC_001885, 5552-7555 pb) de pcDNA3 (Invitrogen) en pGEM T Easy por PCR (Promega).
La Figura 1f muestra la subclonación de GALV env R de pGEM T Easy (Promega) en p-34.5 mediante digestión de restricción (NotI). El plásmido p-34.5 se basa en pSP72 (Promega) y contiene dos regiones flanqueantes a cualquier lado del gen de ICP 34.5 de HSV-1 (basado en la cepa 17+ del HSV-1 (123462-124958 pb, 125713-126790 pb)) Genbank X14112).
La Figura 1g muestra el vector lanzadera final que contiene regiones flanqueantes de ICP34.5 (basadas en la cepa 17+ del HSV-1 (123462-124958 pb, 125713-126790 pb) Genbank X14112) y que expresa la envuelta truncada (env) del virus de la Leucemia del Mono Gibón (Genbank NC_001885, 5552-7555 pb) bajo un promotor de CMV y poli A de BGH (Invitrogen).
La Figura 1h muestra la subclonación del casete RSV Fcy:Fur pA de pRcRSV en p-34.5 GALV (**) mediante digestión de restricción (Pvu II, NruI). Este fragmento se ligó después en el vector lanzadera p-34.5 GALV cortado con Nru I. El plásmido p-34.5 se basa en pSP72 (Promega) y contiene dos regiones flanqueantes a cualquier lado del gen de ICP 34.5 del HSV-1 (basado en la cepa 17+ del HSV-1 (123462-124958 pb, 125713-126790 pb) Genbank X14112) y que expresa la envuelta truncada (env) del virus de la Leucemia del Mono Gibón (Genbank NC_001885, 5552-7555 pb) bajo un promotor de CMV y poli A de BGH (Invitrogen).
La Figura 2 es una representación esquemática de los vectores virales usados en este estudio. La cepa JS1 del HSV-1 se aisló tomando un hisopo de una calentura de un voluntario de otro modo sano (Liu et al 2003). El JS1/34.5-/47- tiene dos deleciones. La primera implica la eliminación de la región codificante del gen de ICP34.5 (nucleótidos 124948-125713 basándose en la secuencia de la cepa 17+ del HSV-1). El segundo implica una deleción de 280 pb de ICP47 (nucleótidos 145570-145290 basándose en la secuencia de la cepa 17+ del HSV-1) (Liu et al 2003). El JS1/34.5-/GALenv R-/47- expresa la envuelta retroviral del virus de la leucemia del mono gibón -el péptido R (Genbank NC_001885, 5552-7555 pb) (Bateman et al 2000, Galanis et al 2001) bajo el promotor de CMV. El JS/34.5-/RSV/Fcy:Fur/47- expresa la fusión del activador de profármaco enzimático citosina desaminasa de levadura con uracil fosforribosiltransferasa (Invivogen) para el promotor de RSV. El JS1/34.5-/GALV/env R-/Fyc:Fur/47- combina tanto la envuelta retroviral fusogénica como el activador de profármaco enzimático.
La Figura 3 muestra la fusión de células tumorales por GALV en R-. Se muestra una placa de JS1/34.5-/47- (A) y JS1/34.5-/47-/GALV (B) después de la infección de células RG2 de rata y tinción con cristal violeta.
La Figura 4 muestra el efecto del sobrenadante de células HT1080 48 horas después de la infección con el virus de control JS1/34.5-/47-, JS 1/34.5-/47-/Fcy:Fur o JS 1/34.5-/47-/GALV/Fcy:Fur, en presencia o ausencia de 5-fluorocitosina (5-FC). Después estos sobrenadantes se inactivaron por calor y después se añadieron a células HT1080 recién preparadas durante 72 horas. Los dos paneles de más abajo a la derecha muestran una muerte celular casi completa indicando que la 5-fluorocitosina se había convertido en 5-fluorouracilo por los virus que contienen Fcy:Fur.
La Figura 5 muestra el efecto de los virus JS1/34.5-/47, JS1/34.5-/47-GALV, JS1/34.5-/47-/Fcy:Fur sobre el encogimiento de tumores implantados en ratas. Se implantaron células tumorales 9L de rata en el flanco de ratas Fischer y se dejó que se desarrollaran para dar un diámetro tumoral de aproximadamente 4-5 mm. Después se les inyectó a grupos de cinco ratas 50 \mul de 1 x 10esp8 ufp/ml del virus indicado, por vía intratumoral, los días 7, 10, 13, 17 y 20. Se administraron 500 mg/kg de 5-fluorocitosina por la vía intraperitoneal los días 9, 11, 12, 14, 16, 18, 19, 21, 23, 24, 25, 26 y se midieron los diámetros tumorales. Las barras de error representan la desviación típica.
Descripción detallada de la invención A. Virus
Un herpesvirus de la invención es capaz de infectar eficazmente células tumorales diana. Los genes que codifican ICP34.5 están inactivados en el virus. La mutación de ICP34.5 permite una actividad oncolítica selectiva. Se describen mutaciones adecuadas en los genes de ICP34.5 en Chou et al 1990 y Maclean et al 1991, aunque puede usarse cualquier mutación que vuelva a ICP34.5 no funcional. Los genes que codifican ICP47, ICP6 y/o timidina quinasa pueden inactivarse adicionalmente, así como otros genes si dicha inactivación reduce significativamente el efecto oncolítico o si dicha deleción aumenta la oncolisis u otras propiedades deseables del virus. Cuando el gen que codifica ICP47 se muta puede mutarse de tal forma que el gen de US11 cercano se exprese en momentos más tempranos de lo habitual en el ciclo de replicación del HSV. Dicha mutación se describe en Liu et al 2003. Los virus de la invención codifican además dos o más de una enzima activadora de profármaco, una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula y una proteína inmunomoduladora.
La terminología usada en este documento para los genes de herpesvirus es la usada comúnmente para genes de HSV. Cuando los herpesvirus de la invención son de un herpesvirus que no es HSV, se inactiva el equivalente funcional de cada uno de los genes de HSV mencionados. Un gen que no es de HSV que es un equivalente funcional de un gen de HSV realiza la misma función que el gen de HSV y comparte un grado de homología de secuencia con el gen de HSV. El equivalente funcional puede tener una homología de al menos el 30%, por ejemplo de al menos el 40% o de al menos el 50% con el gen de HSV. La homología puede determinarse como se describe a continuación.
Las regiones virales modificadas para los fines descritos anteriormente pueden eliminarse (completamente o parcialmente) o hacerse no funcionales o sustituirse por otras secuencias, en particular por un gen que codifique una enzima conversora de profármaco, un gen que codifique una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula o un gen que codifique una proteína inmunomoduladora.
El virus de la invención puede proceder de una cepa de HSV de virus herpes simple. La cepa de HSV puede ser una cepa de HSV1 o HSV2, o un derivado de la misma y preferiblemente es de HSV-1. Los derivados incluyen recombinantes intertipo que contienen ADN de cepas de HSV1 y HSV2. Dichos recombinantes intertipo se describen en la técnica, por ejemplo, en Thompson et al 1998 y Meignier et al 1988. Los derivados tienen preferiblemente una homología de secuencia de al menos el 70% con el genoma de HSV1 o HSV2, más preferiblemente de al menos el 80%, aún más preferiblemente de al menos el 90% o 95%. Más preferiblemente, un derivado tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con el genoma de HSV1 o HSV2, más preferiblemente una identidad de al menos el 80%, aún más preferiblemente una identidad de al menos el 90%, 95%, 98%.
Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo, usarse en sus ajustes por defecto) (Devereux et al. (19849, Nucleic Acids Research, 12, págs. 387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la homología o alinear secuencias (típicamente en sus ajustes por defecto), por ejemplo como se describe en Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10.
El programa informático para realizar análisis de BLAST está disponible públicamente a través del National Centre of Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.Hov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) por identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coincidan o cumplen cierta puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., 1990). Estas coincidencias de palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que las contengan. Las coincidencias de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que pueda aumentarse la puntuación de alineamiento acumulativa. Las extensiones para las coincidencias de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa se hace cero o inferior debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, alineamientos de la matriz de puntuación BLOSUM62 (B) (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) de 50, un valor esperado (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma menor (P(N)) que proporciona una indicación de la probabilidad por la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se produciría por azar. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma menor en la comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y, más preferiblemente, menor de aproximadamente 0,001.
Un derivado puede tener la secuencia de un genoma de HSV1 o HSV2 modificada por sustituciones de nucleótidos, por ejemplo, de 1, 2 ó 3 a 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El genoma de HSV1 o HSV2 puede modificarse como alternativa o además mediante una o más inserciones y/o deleciones y/o mediante una extensión en cualquiera o ambos extremos.
Las cepas de virus de la invención pueden ser cepas "que no sean de laboratorio". Estas también pueden denominarse cepas "clínicas". Un especialista en la técnica será capaz de distinguir fácilmente entre una cepa de laboratorio y una cepa que no es de laboratorio o cepa clínica. Se proporcionan a continuación orientaciones adicionales sobre las propiedades que probablemente presentarán las cepas de virus.
La distinción clave entre una cepa de laboratorio y una cepa que no es de laboratorio es que las cepas de laboratorio actualmente en uso común se han mantenido durante periodos prolongados, muchos años en algunos casos, en cultivo. Todas las cepas de HSV de laboratorio se han aislado originariamente a partir de individuos infectados y de este modo proceden de cepas clínicas. El cultivo de virus tales como HSV implica una técnica conocida como pase en serie. Para cultivar y mantener virus, se infectan células adecuadas con el virus, el virus se replica en el interior de la célula y después se recoge el virus; después se reinfectan células recién preparadas, constituyendo este proceso un ciclo del pase en serie. Cada ciclo de este tipo puede llevar, por ejemplo, unos pocos días en el caso del HSV. Como se ha analizado anteriormente, dicho pase en serie puede conducir a cambios en las propiedades de la cepa de virus en el sentido de que tiene lugar una selección para propiedades que favorezcan el desarrollo en cultivo (por ejemplo, replicación rápida) en oposición a propiedades útiles para aplicaciones prácticas, por ejemplo, mantenimiento de la capacidad para viajar a lo largo de axones en el caso del HSV o para infectar células humanas.
Las cepas de laboratorio en uso actualmente incluyen cepa F de HSV-1, cepas 17+ de HSV-1 y cepa KOS de HSV-1. Las cepas que no son de laboratorio útiles en la presente invención tienen típicamente una actividad oncolítica mejorada en comparación con las cepas de HSV-1 F, 17+ y cepas KOS con modificaciones equivalentes.
Una cepa que no es de laboratorio es una que se ha aislado recientemente a partir de un individuo infectado. Una cepa que no es de laboratorio de la presente invención es una cepa recientemente aislada que se ha modificado para que el gen que codifica ICP34.5 se inactive de modo que no puede expresarse una proteína ICP34.5 funcional y para incluir un gen que codifica una proteína activadora de profármaco, un gen que codifica una proteína capaz de causar fusión celular y/o una proteína inmunomoduladora. Un virus de la invención habrá pasado cierto tiempo en cultivo para permitir que se realicen las modificaciones necesarias pero cualquier tiempo que haya pasado en cultivo será comparativamente corto. El aislado clínico puede haberse congelado para almacenamiento antes de la modificación o puede congelarse después de que se hayan realizado las modificaciones. Se preparan de la invención de tal forma que se conserven sustancialmente las propiedades deseables de los aislados clínicos originales de los que proceden.
Una cepa de virus de la invención procede una cepa de virus parental si la cepa de virus parental se muta para producir el virus. Por ejemplo, un virus de la invención puede proceder del aislado clínico JS1. La cepa parental de dicho virus procedente de JS1 puede ser JS1 u otra cepa de HSV procedente de JS1. Por lo tanto, un virus de la invención puede ser un virus JS1 que carece de un gen codificante de ICP34.5 funcional y que comprende dos o más de un gen que codifica una enzima conversora de profármaco, un gen que codifica una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula y un gen que codifica una proteína inmunomoduladora. Además, dicho virus puede contener cualquier otra mutación, por ejemplo, como se menciona en este documento.
Un virus de la invención es capaz de infectar eficazmente células cancerosas humanas diana. Cuando dicho virus es una cepa que no es de laboratorio o clínica se habrá aislado recientemente de un individuo infectado por HSV y después se habrá explorado para determinar la capacidad deseada de replicación, infección o destrucción aumentada de células tumorales y/o de otras células in vitro y/o in vivo en comparación con cepas de laboratorio convencionales tales como cepas F, KOS y 17+ de HSV-1. Dichos virus de la invención con propiedades mejoradas en comparación con cepas de virus de laboratorio se modifican después por ingeniería genética de modo que carezcan de un gen de ICP34.5 funcional y codifiquen dos o más de los siguientes genes: un gen para una enzima activadora de profármaco, un gen para una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula y un gen que codifique una proteína inmunomoduladora, donde dichos genes están bajo el control de un promotor o promotores adecuados. Una cepa de virus se ha aislado recientemente si se ha sometido a tres años o menos de cultivo desde el aislamiento de la cepa parental clínica no modificada a partir de su hospedador. Más preferiblemente, la cepa se ha sometido a un año o menos de cultivo, por ejemplo, nueve meses o menos, seis meses o menos, tres meses o menos, dos meses o menos, un mes o menos, dos semanas o menos o una semana o menos. Mediante estas definiciones de tiempo en cultivo, se entiende tiempo realmente pasado en cultivo. Por lo tanto, por ejemplo, una práctica común es congelar cepas de virus para conservarlas. Evidentemente, la conservación por congelación o de una forma equivalente no se califica de mantenimiento de la cepa en cultivo. Por lo tanto, el tiempo pasado congelado o conservado de otro modo no se incluye en las definiciones anteriores de tiempo pasado en cultivo. El tiempo pasado en cultivo es típicamente el tiempo realmente pasado some-
tiéndose a pase en serie, es decir, tiempo durante el que se puede suceder la selección de características no deseables.
Preferiblemente, una cepa de virus que no es de laboratorio se ha sometido a 1.000 o menos ciclos o pase en serie desde el aislamiento de su cepa precursora clínica no modificada a partir de su hospedador. Más preferiblemente, se ha sometido a 500 o menos, 100 o menos, 90 o menos, 80 o menos, 70 o menos, 60 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 10 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 ó 1 de dichos ciclos.
Preferiblemente, un virus que no es de laboratorio tiene una mayor capacidad, medida mediante ensayos estadísticos convencionales, que una cepa de laboratorio de referencia con las modificaciones equivalentes para realizar ciertas funciones útiles en la aplicación a mano. En el caso de un virus oncolítico para tratamiento de tumores, una cepa de virus que no es de laboratorio de la invención tendrá preferiblemente una mayor capacidad que una cepa de laboratorio de referencia con modificaciones equivalentes para infectar o replicarse en células tumorales, destruir células tumorales o propagarse entre células en tejido. Más preferiblemente, dicha mayor capacidad es una capacidad estadísticamente significativamente superior. Por ejemplo, de acuerdo con la invención, una cepa que no es de laboratorio de la invención puede tener hasta 1,1 veces, 1,2 veces, 1,5, veces, 2 veces, 5, veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces la capacidad de la cepa de referencia en lo que se refiere a la propiedad que se esté ensayando. Preferiblemente, la cepa de referencia se selecciona de la cepa 17+ de HSV-1, HSV-1(F) y HSV-1 KOS.
El análisis estadístico de las propiedades descritas en este documento puede realizarse mediante ensayos convencionales, por ejemplo, pruebas t, ANOVA o pruebas de Chi cuadrado. Típicamente, la significación estadística se mediará a un nivel de p = 0,005 (5%), más preferiblemente p = 0,01p, p = 0,001, p = 0,0001, p = 0,000001.
Los virus de la invención infectan y se replican en células tumorales, destruyendo posteriormente las células tumorales. Por lo tanto, dichos virus son competentes para la replicación. Preferiblemente, son competentes para la replicación selectivamente en células tumorales. Esto significa que se replican en células tumorales y no en células no tumorales o que se replican más eficazmente en células tumorales que en células no tumorales. Por ejemplo, cuando se usa el virus para tratar un tumor en el sistema nervioso central, el virus es capaz de replicarse en las células tumorales pero no en las células neuronales circundantes. Las células en las que el virus es capaz de replicarse son células permisivas. La medición de la competencia para replicación selectiva puede realizarse mediante los ensayos descritos en este documento para medición de la capacidad de replicación y destrucción de células tumorales y también se analiza mediante las técnicas estadísticas mencionadas en este documento si se desea.
Las propiedades de la cepa de virus respecto a las células tumorales pueden medirse de cualquier forma conocida en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de un virus para infectar una célula tumoral puede cuantificarse midiendo la dosis de virus necesaria para medir un porcentaje dado de células, por ejemplo, el 50 u 80% de células. La capacidad para replicarse en una célula tumoral puede medirse por mediciones del desarrollo tales como las realizadas en los Ejemplos, por ejemplo, por medición del desarrollo de virus en células durante un periodo de 6, 12, 24, 36, 48 ó 72 horas o durante más tiempo.
La capacidad de un virus para destruir células tumorales puede cuantificarse aproximadamente a ojo o cuantificarse más exactamente por recuento del número de células vivas que quedan con el tiempo para un punto de tiempo y MOI dados para un tipo celular dado. Por ejemplo, pueden realizarse comparaciones a lo largo de 24, 48 ó 72 horas y usarse cualquier tipo de célula tumoral conocido. En particular, pueden usarse células de adenocarcinoma colorrectal HT29, adenocarcinoma de próstata LNCaP.FGC, adenocarcinoma de mama MDA-MB-231, melanoma maligno SK-MEL-28 o astrocitoma glioblastoma U-87 MG. Puede usarse cualquiera de estos tipos celulares o cualquier combinación de estos tipos celulares, así como otros tipos celulares tumorales. Puede ser deseable construir un panel convencional de tipos de células tumorales para este fin. Para realizar un recuento del número de células vivas que quedan en un punto de tiempo dado, puede contarse el número de células que excluyen tripán azul (es decir, células vivas). La cuantificación también puede realizarse mediante separación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo de MTT. La capacidad para destruir células tumorales también puede medirse in vivo, por ejemplo, por medición de la reducción en el volumen del tumor engendrada por un virus particular.
Para determinar las propiedades de virus de la invención, generalmente será deseable usar una cepa de referencia de laboratorio convencional para comparación. Puede usarse cualquier cepa de referencia de laboratorio convencional adecuada. En el caso de HSV, se prefiere usar una o más de la cepa 17+ de HSV-1, cepa F de HSV1 o cepa KOS de HSV1. La cepa de referencia tendrá típicamente modificaciones equivalentes a las de la cepa de la invención que se esté ensayando. Por lo tanto, la cepa de referencia tendrá típicamente modificaciones equivalentes tales como deleciones de genes e inserciones de genes heterólogos. En el caso de un virus de la invención, en el que los genes codificantes de ICP34.5 se han vuelto no funcionales, los genes codificantes de ICP34.5 también se habrán vuelto no funcionales en la cepa de referencia. Las modificaciones realizadas en la cepa de referencia pueden ser idénticas a las realizadas en la cepa de la invención. Mediante esto, se entiende que las alteraciones de genes en la cepa de referencia serán en posiciones exactamente equivalentes a las de la cepa de la invención, por ejemplo, las deleciones serán del mismo tamaño y en el mismo lugar. De forma similar, en estas realizaciones, se insertarán genes heterólogos en el mismo lugar, dirigidos por el mismo promotor, etc. Sin embargo, no es esencial que se realicen modificaciones idénticas. Lo que es importante es que el gen de referencia tenga modificaciones funcionalmente equivalentes, por ejemplo, que los mismos genes se vuelvan no funcionales y/o se inserte el mismo gen o genes heterólogos.
B. Métodos de Mutación
Los diversos genes a los que se hace referencia pueden volverse funcionalmente inactivos mediante varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden volverse funcionalmente inactivos por deleción o deleciones, sustitución o sustituciones o inserción o inserciones, preferiblemente por deleción. Las deleciones pueden eliminar una o más porciones del gen o el gen completo. Por ejemplo, puede realizarse la deleción de un solo nucleótido, dando como resultado un cambio de la fase de lectura. Sin embargo, preferiblemente se realiza una deleción o deleciones de mayor tamaño, por ejemplo, de al menos el 25%, más preferiblemente de al menos el 50% de la secuencia codificante y no codificante total (o como alternativa, en términos absolutos, al menos 10 nucleótidos, más preferiblemente al menos 100 nucleótidos, más preferiblemente al menos 1000 nucleótidos). Se prefiere particularmente eliminar el gen completo y algunas de las secuencias flanqueantes. Cuando están presentes dos o más copias del gen en el genoma viral, se prefiere que ambas copias del gen se vuelvan funcionalmente inactivas.
Se realizan mutaciones en los herpesvirus mediante métodos de recombinación homóloga bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, el ADN genómico del HSV se transfecta junto con un vector preferiblemente un vector plasmídico, que comprende la secuencia mutada flanqueada por secuencias de HSV homólogas. La secuencia mutada puede comprender una deleción o deleciones, sustitución o sustituciones o inserción o inserciones, pudiendo todas construirse mediante técnicas de rutina. Las inserciones pueden incluir genes marcadores de selección, por ejemplo, lacZ o proteína verde fluorescente (GFP), que pueden usarse para explorar virus recombinantes, por ejemplo, actividad \beta-galactosidasa o fluorescencia.
C. Genes heterólogos y promotores
Los virus de la invención llevan un gen heterólogo que codifica una enzima activadora de profármaco y un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de causar una fusión de célula con célula y opcionalmente un gen heterólogo que codifica una proteína inmunomoduladora. La proteína fusogénica también puede funcionar como proteína inmunomoduladora.
Preferiblemente, la proteína activadora de profármaco es una enzima citosina desaminasa. Los genes de citosina desaminasa son capaces de convertir el profármaco inactivo 5-fluorocitosina en el fármaco activo 5-fluorouracilo. Están disponibles diversos genes de citosina desaminasa incluyendo los de origen bacteriano y de origen de levadura. Puede usarse un segundo gen, típicamente un gen que codifica una segunda enzima para aumentar la actividad de conversión de profármaco del gen de citosina desaminasa. Por ejemplo, el segundo gen puede codificar una uracil fosforribosiltransferasa como los virus descritos en la Figura 2.
Puede usarse cualquier gen fusogénico adecuado que codifica una proteína capaz de causar una fusión de célula con célula. Preferiblemente, la proteína capaz de causar una fusión de célula con célula se selecciona de una glicoproteína de envuelta retroviral modificada, tal como una glicoproteína de la envuelta procedente del virus de la leucemia del mono gibón (GALV) o retrovirus endógeno humano W, una proteína F o H fusogénica del virus del sarampión y la proteína G del virus de la estomatitis vesicular. Más preferiblemente, la proteína capaz de causar la fusión de célula con célula es una glicoproteína fusogénica de GALV.
El gen inmunomodulador puede ser cualquier gen que codifique una proteína que sea capaz de modular una respuesta inmune. La proteína capaz de modular una respuesta inmune puede ser una citocina, tal como GM-CSF, TNF-\alpha, una interleucina (por ejemplo IL12), una quimiocina tal como RANTES o una proteína inflamatoria de macrófagos (por ejemplo MIP-3) u otra molécula inmunomoduladora tal como B7.1, B7.2 o CD40L. La proteína capaz de causar una fusión de célula con célula también puede ser capaz de modular una respuesta inmune. Por ejemplo, GALV es capaz de modular una respuesta inmune.
Los virus de la invención pueden usarse por lo tanto para suministrar los genes a una célula in vivo donde se expresarán.
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El gen activador de profármaco, el gen que codifica una proteína capaz de causar una fusión de célula con célula y/o el gen que codifica una proteína inmunomoduladora pueden insertarse en el genoma viral por cualquier técnica adecuada tal como recombinación homóloga de cepas de HSV con, por ejemplo, vectores plasmídicos que lleven el gen flanqueado por secuencias de HSV. Los genes pueden insertarse en el mismo sitio en el genoma de HSV, por ejemplo, para sustituir el gen codificante de ICP34.5 o en sitios diferentes. Los genes pueden expresarse a partir de promotores separados, por ejemplo, un promotor de CMV y un promotor de RSV o a partir de un solo promotor. Cuando los genes se expresen a partir de un solo promotor, los genes pueden separarse mediante un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES). Los genes también pueden expresarse como una fusión traduccional de modo que la proteína fusionada conserve las dos actividades de los genes separados (es decir, activación de profármaco y fusión de célula con célula, actividad de profármaco y actividad inmunomoduladora o fusión de célula con célula y actividad inmunomoduladora) de modo que las proteína fusionadas se escindan después de la expresión mediante una proteasa en cis o en trans con la proteína fusionada. En una realización preferida, las dos proteínas o dos de las tres proteínas se expresan a partir de un promotor de RSV y de CMV respectivamente, colocados en una orientación contigua el uno respecto al otro, e insertarse en el genoma de HSV para sustituir los genes que codifican ICP34.5. Dicho virus se describe en la Figura 2. Sin embargo, el gen puede insertarse en el genoma viral en cualquier localización o localizaciones con tal de que se conserven las propiedades oncolíticas.
Las secuencias transcritas de los genes insertados están preferiblemente unidas operativamente a secuencias de control que permiten la expresión de los genes en una célula tumoral. La expresión "unida operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que los permite funcionar de la forma deseada. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de tal modo que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con la secuencia de control.
Una secuencia de control comprende típicamente un promotor que permite la expresión del gen unido operativamente a la misma y una señal para la terminación de la transcripción. El promotor se selecciona de promotores que son funcionales en células de mamífero, preferiblemente células tumorales humanas. El promotor puede proceder de secuencias promotoras de un gen eucariota. Por ejemplo, el promotor puede proceder del genoma de una célula en la que se produce la expresión del gen heterólogo, preferiblemente una célula tumoral de mamífero, más preferiblemente una célula tumoral humana. Con respecto a promotores eucariotas, pueden ser promotores que funcionen de una forma ubicua (tal como promotores de \beta-actina, tubulina) o, como alternativa, de una forma específica de tumor. También pueden ser promotores que respondan a estímulos específicos, por ejemplo, promotores que se unan a receptores de hormonas esteroideas. También pueden usarse promotores virales, por ejemplo, el promotor de la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR) u otros promotores retrovirales tales como los procedentes del virus de sarcoma de Rous (RSV), el promotor IE de citomegalovirus (CMV) humano o de ratón o promotores de genes de herpesvirus incluyendo los que dirigen la expresión de los transcritos asociados con latencia.
Los casetes de expresión y otras construcciones adecuadas que comprenden el gen codificante de la enzima conversora de profármaco, el gen que codifica una proteína capaz de promover la fusión de célula con célula y/o el gen inmunomodulador y secuencias de control pueden generarse usando técnicas de clonación de rutina conocidas por especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
También puede ser ventajoso que el promotor o promotores sean inducibles de modo que los niveles de expresión de los genes puedan regularse durante el tiempo de vida de la célula tumoral. Inducibles significa que pueden regularse los niveles de expresión obtenidos usando el promotor. Por ejemplo, un virus de la invención puede comprender además un gen heterólogo que codifique la proteína de fusión represor tet/activador de la transcripción VP16 bajo el control de un promotor fuerte (por ejemplo, el promotor IE de CMV) y el gen de conversión de profármaco, de fusión de célula con célula o inmunomodulador u otro gen pueden estar bajo el control de un promotor sensible a la proteína de fusión de represor tet/activador de la transcripción VP16 anteriormente descrito (Gossen y Bujard, 1992, Gossen et al., 1995). Por lo tanto, en este ejemplo, la expresión del gen o genes dependería de la presencia o ausencia de tetraciclina.
Los virus de la invención codifican múltiples genes heterólogos. Los virus de la invención pueden comprender uno o más genes adicionales, por ejemplo, de 1, 2 a 3, 4 ó 5 genes adicionales. El gen o genes adicionales pueden ser copias adicionales del gen conversor de profármaco, el gen fusogénico y/o el gen inmunomodulador. El gen o genes adicionales pueden codificar uno o más genes conversores de profármaco diferentes, uno o más genes fusogénicos diferentes y/o uno o más genes inmunomoduladores diferentes. El gen o genes adicionales pueden codificar otro gen o genes destinados a aumentar el efecto terapéutico.
Podría introducirse más de un gen y secuencias de control asociadas en una cepa de HSV particular en un solo sitio o en múltiples sitios en el genoma del virus. Como alternativa, pueden usarse pares de promotores (promotores iguales o diferentes) enfrentados en orientaciones opuestas entre sí, dirigiendo cada una la expresión de un gen.
D. Usos Terapéuticos
Los virus de la invención pueden usarse en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal. En particular, los virus de la invención pueden usarse en métodos de terapia del cáncer. Preferiblemente, los virus de la invención se usan en el tratamiento oncolítico del cáncer. Los virus de la invención pueden usarse en el tratamiento terapéutico de cualquier tumor sólido en un mamífero, preferiblemente un ser humano. Por ejemplo, los virus de la invención pueden administrarse a un sujeto con carcinoma de próstata, mama, pulmón, hígado, célula renal, endometrial, vejiga, colón o cervical; adenocarcinoma; melanoma; linfoma; glioma; sarcomas tales como sarcomas de tejidos blandos y óseos; o cáncer de cabeza y cuello.
E. Administración
Los virus de la invención pueden usarse en un paciente, preferiblemente un paciente humano, que necesite tratamiento. Un paciente que necesite tratamiento es un individuo que padece cáncer, preferiblemente un individuo con un tumor sólido. El objetivo del tratamiento terapéutico es mejorar el estado del paciente. Típicamente el tratamiento terapéutico usando un virus de la invención alivia los síntomas del cáncer. Un método de tratamiento del cáncer de acuerdo con la invención comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus de la invención a un paciente que padece cáncer. La administración de un virus oncolítico de la invención a un individuo que padece un tumor destruirá típicamente las células del tumor, disminuyendo por lo tanto el tamaño del tumor y/o evitando la propagación de células malignas desde el tumor.
Un método de terapia de administración implica combinar el virus con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.
El tratamiento terapéutico puede realizarse después de la inyección directa de la composición viral en el tejido diana. El tejido diana puede ser el tumor o un vaso sanguíneo que suministre sangre al tumor. La cantidad de virus administrado está en el caso del HSV en el intervalo de 10^{4} a 10^{10} ufp, preferiblemente de 10^{5} a 10^{8} ufp, más preferiblemente de aproximadamente 10^{6} a 10^{9} ufp. Típicamente, se usarían 1-4 ml, tal como de 2 a 3 ml de una composición farmacéutica que consiste esencialmente en el virus y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para inyección directa en un tumor individual. Sin embargo, para algunas aplicaciones de terapia oncolítica también pueden usarse volúmenes mayores de hasta 10 ml dependiendo del tipo tumoral, del tamaño tumoral y del sitio de inoculación. Asimismo, también pueden usarse volúmenes menores de menos de 1 ml.
Las vías de administración y dosificaciones descritas pretenden ser solamente orientativas puesto que un especialista será capaz de determinar fácilmente la vía de administración y dosificación óptimas. La dosificación puede determinarse de acuerdo con diversos parámetros, especialmente de acuerdo con la localización del tumor, el tamaño del tumor, la edad, el peso y el estado del paciente a tratar y la vía de administración. Preferiblemente, el virus se administra por inyección directa en el tumor. El virus también puede administrarse por vía sistémica o por inyección en un vaso sanguíneo que suministre sangre al tumor. La vía óptima de administración dependerá de la localización y del tamaño del tumor.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.
En un trabajo que tenía por objetivo producir HSV con ICP34.5 delecionado con potencial oncolítico y antitumoral aumentado, se han delecionado ICP47 e ICP34.5 a partir de la cepa JS1 del HSV1 y se han insertado los genes que codifican un gen activador de profármaco (un gen de fusión de citosina desaminasa/uracil fosforribosiltransferasa) y/o un gen para una glicoproteína fusogénica de GALV.
Ejemplo 1 Construcción de Virus (véanse las Figuras 1 y 2)
Los virus usados estaban basados en la cepa de HSV1 clínica o "no de laboratorio" JS1. Se delecionó completamente ICP34.5 e ICP47 de la cepa JS1. Este virus se describe en Lui et al 2003. El GALV env R- (Bateman et al 2000, Galanis et al 2001) y/o el gen de fusión de citosina desaminasa/uracil fosforribosiltransferasa (Fcy:Fur; Invitrogen) se insertaron después en lugar del gen codificante de ICP34.5 bajo el control del promotor de CMV y RSV respectivamente.
Las Figuras 1a-1h demuestran la construcción paso a paso de los plásmidos usados para construir los virus:
Etapa 1. (Figura 1a): El gen Fcy::Fur se escindió de pORF Fcy::Fur con Ncol y NheI y se insertó en pRCRSV después de la digestión con HindIII y XbaI;
Etapa 2 (Figura 1b): El casete de promotor de RSV/Fcy::Fur/BGH-pA de PRcRSV Fcy::Fur se insertó entre las regiones flanqueantes de ICP34.5 (Lui et al 2003) para generar p34.5 Fcy::Fur;
Etapa 3 (Figura 1c): El GALV env R- se amplificó mediante PCR a partir de células que contenían el provirus integrado y se clonó en pcDNA3 entre los sitios NotI y EcoRI para generar pcDNA3 kGALV env R-;
Etapa 4 (Figuras 1d-1e): Manipulación para eliminar los sitios de restricción que no eran necesarios;
Etapa 4 (Figura 1g); El casete de promotor de CMV/GALV R-BGH-pA se clonó en regiones flanqueantes de ICP34.5 para generar p34.5 CMV GALV env R-;
Etapa 5 (Figura 1h): Para generar un plásmido que permite la inserción en lugar de ICP34.5 y que contiene los genes tanto GALV env R- como Fcy::Fur, el casete de promotor de RSV/Fcy::Fur/pA de pRcRSV Fcy::Fur se escindió y se insertó en p-34.5 CMV GALV env R- para generar p-34.5 GALV FCY.
Los plásmidos p-34.5 Fcy::Fur, p-34.5 CMV GALV env R- y p-34.5 GALV FCY se insertaron en la cepa de virus JS1/34.5-/47- CMV GFP (Lui et al 2003) mediante recombinación homóloga para sustituir la secuencia de GFP que sustituye a ICP34.5. Se seleccionaron placas recombinantes que no expresaban GFP generando tres virus
(JS1/34.5-/47-/Fcy::Fur, JSI/34.5-/47-/GALV y JSI/34.5-/47-/Fcy::Fur). Estos se muestran en la Figura 2.
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Ejemplo 2 Los virus que expresan GALV env R- median la fusión de célula con célula
El virus que expresa GALV en solitario (i) causa la fusión de célula con célula de varias líneas de células tumorales humanas in vitro, incluyendo HT1080, Fadu y U87MG, mediada por la expresión de la proteína GALV y (ii) proporciona una actividad antitumoral aumentada in vivo en modelos de ratón (Fadu y HT1080) en comparación con el virus equivalente que no expresa la proteína GALV.
La fusión de célula con célula se demuestra en la Figura 3. Se infectaron células de glioma RG2 de rata con JS1/34.5-/47- o JS1/34.5-/47-/GALV y se observaron los efectos sobre la morfología de placas. Puede observarse que el virus que expresa GALV produce placas enormemente aumentadas, observándose signos de un efecto sincitial (fusión de célula con célula).
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Ejemplo 3 Los virus que expresa Fcy::Fur demuestran actividad citosina desaminasa
El virus que contiene el gen de fusión de citosina desaminasa/uracil fosforribosiltransferasa ha demostrado que dirige la conversión de 5-fluorocitosina en 5-fluorouracilo in vitro de modo que se produce la destrucción de células mediada por 5-fluorouracilo. Esto se muestra en la Figura 4 donde se infectaron células HT1080 con los tres virus en presencia en ausencia de 5-fluorocitosina. Después, los sobrenadantes de estas células se trataron térmicamente para inactivar el virus presente en los sobrenadantes. Estos sobrenadantes se usaron después para cubrir nuevas células. Si la 5-fluorocitosina se había convertido en el 5-fluorouracilo tóxico entonces se destruirían estas nuevas células. Puede observarse a partir de la Figura 4 que cuando los virus usados para infectar las células HT1080 originales contenían el gen Fcy::Fur, las células que se cubrieron con los sobrenadantes resultantes se destruyeron demostrando la actividad biológica del gen Fcy::Fur.
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Ejemplo 4 La combinación de la expresión de GALV env R- y Fcy::Fur combinada con la expresión de 5-fluorocitosina proporciona una actividad antitumoral aumentada in vivo en comparación con el uso de cualquier gen en solitario
La Figura 5 muestra los efectos de tres virus (JS1/34.5-/47-/GALV, JS1/34.5/47-/Fcy::Fur y JS1/34.5-/47-GALV/
Fcy::Fur) y un control de vector vacío (JS 1/34.5-/47-) sobre el encogimiento de tumores implantados en los francos de ratas. Los virus se administraron en combinación con 5-fluorocitosina. Puede observarse a partir de la Figura 5 que cada uno de los virus causa encogimiento de los tumores inyectados. Sin embargo, mientras que la administración de GALV env R- o Fcy::Fur en solitario proporciona encogimiento tumoral mejorado en comparación con el control de vector vacío, el suministro combinado tanto de GALV env R- como de Fcy::Fur proporciona efectos de encogimiento tumoral aún mejores, curándose en este caso todos los tumores. Puede concluirse por lo tanto que el cosuministro de un gen activador de profármaco y una glicoproteína fusogénica proporciona mejoras respecto a la terapia tumoral en comparación con cualquiera de las estrategias cuando se usan en solitario.
Información de Depósito
La cepa JS1 de HSV1 se ha depositado en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Sailsbury, Wiltshire SP40 0JG, Reino Unido, el 2 de enero de 2001 bajo el número de acceso 01010209.
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Claims (17)

1. Un herpesvirus que carece de un gen codificante de ICP34.5 funcional y que comprende:
(i)
un gen heterólogo que codifica una enzima conversora de profármaco; y
(ii)
un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula.
2. Un virus de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha enzima conversora de profármaco es una citosina desaminasa.
3. Un virus de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha proteína capaz de causar la fusión de célula con célula es una glicoproteína fusogénica de leucemia del mono gibón.
4. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende uno o más genes heterólogos adicionales capaces de aumentar el efecto terapéutico antitumoral del virus.
5. Un virus de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende un gen heterólogo que codifica una proteína inmunomoduladora.
6. Un virus de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la proteína inmunomoduladora es GM-CSF, TNF-\alpha o CD40L.
7. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que carece además de un gen funcional que codifique ICP47.
8. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que carece además de un gen funcional que codifica ICP6, glicoproteína H y/o timidina quinasa.
9. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que carece además de un gen que codifica una proteína funcional capaz de inhibir la función de células dendríticas.
10. Un virus de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho gen que codifica una proteína funcional capaz de inhibir la función de células dendríticas es UL43 o vhs.
11. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una cepa de virus herpes simple 1 ó 2.
12. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es una cepa de virus que no es de laboratorio.
13. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que procede de HSV1 JS1, como se depositó en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECAAC) bajo el número de acceso 01010209.
14. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
15. Uso de un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho medicamento es para inoculación intratumoral directa.
17. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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