ES2331109T3 - Proteinas fluorescentes. - Google Patents

Abstract

Una proteína fluorescente derivada de la Proteína Fluorescente Verde (GFP), que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido de la posición que se corresponde con la posición 65 del Identificador de Secuencia núm.: 4 ha sido sustituida por un aminoácido alifático y en la que el ácido glutámico de la posición que se corresponde con la posición 223 del Identificador de Secuencia núm.: 4 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de G, A, V, I, F, S, T, N y Q, que se caracteriza porque dicha GFP mutada tiene un máximo de excitación a una longitud de onda mayor y la fluorescencia se incrementa cuando la GFP mutada se expresa en células incubadas a una temperatura de 30ºC o superior en comparación con la GFP de tipo natural.

Description

Proteínas fluorescentes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas variantes de la proteína fluorescente GFP que tienen propiedades de fluorescencia mejoradas.

Antecedentes

El descubrimiento de que la Proteína Fluorescente Verde (GFP) obtenida de la medusa A. victoria conserva sus propiedades fluorescentes cuando se expresa en células heterólogas ha propiciado una investigación biológica con una nueva, única y potente herramienta (Chalfie y asociados (1191) Science 263:802; Prasher (1995) Trends in genetics 11:320; WO 95/07463). Un aspecto muy importante del uso de las proteínas fluorescentes recombinantes en el estudio de las funciones celulares es la naturaleza no invasiva del ensayo. Esto permite la detección de eventos celulares en células vivas intactas.

El espectro de excitación de la proteína fluorescente verde obtenida de la Aequorea victoria muestra dos picos: un pico principal a 396 nm, que está en la banda de los UV potencialmente dañinos para las células, y un pico menor a 475 nm, que está en una banda de excitación mucho menos peligrosa para las células.

Para mejorar la GFP de tipo natural, se ha descrito una gama de mutaciones. Heim (GFP (Heim y colaboradores (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:12501) describió el descubrimiento de una variante fluorescente azul que aumenta enormemente las potenciales aplicaciones de uso de sondas recombinantes fluorescentes para monitorizar eventos o funciones celulares ya que la capacidad de las sondas de tener diferentes espectros de excitación y emisión permite la monitorización simultanea de más de un proceso. Sin embargo, la variante fluorescente azul descrita por Heim y colaboradores, Y66H-GFP, sufre de ciertas limitaciones: La fluorescencia azul es débil (máximo de emisión a 448 nm), haciendo así difícil la detección y necesitándose la excitación prolongada de las células que expresan la Y66H-GFP. Además, el periodo prolongado de excitación es dañino para las células, especialmente a causa de que la longitud de onda de excitación está en la banda de los UV, 360 nm - 390 nm.

Heim y colaboradores (1995) Nature, Vol. 373, pág. 663 - 4, presentan una mutación Ser65Thr de la GFP (S65T) que tiene longitudes de onda de excitación y emisión, 490 nm y 510 nm, respectivamente, mayores que la GFP de tipo natural y en la que la formación de fluoróforos avanza aproximadamente el cuádruple de rápido que en la GFP de tipo natural.

Ehrig y colaboradores (1995) FEBS Letters 367, 163 - 166, presentan un mutante E222G de la proteína fluorescente verde de la Aequorea. Esta mutación tiene un máximo de excitación de 481 nm y un máximo de emisión a 506 nm.

La expresión de la GFP o de sus variantes fluorescentes en células vivas proporciona una herramienta valiosa para estudiar eventos celulares y es bien conocido que muchas células, incluyendo células de mamíferos, se incuban a aproximadamente 37ºC para asegurar un crecimiento óptimo y/o fisiológicamente relevante. Las líneas de células que se originan de organismos o tejidos diferentes pueden tener temperaturas relevantes que oscilan desde aproximadamente 35ºC para los fibroblastos hasta a aproximadamente 38º - 39ºC para las células \beta del ratón. Sin embargo, la experiencia ha demostrado que la señal fluorescente de las células que expresan GFP es débil o ausente cuando dichas células se incuban a temperaturas por encima de la temperatura ambiente véase Webb, C.D. y colaboradores, Journal of Bacteriology, octubre 1995, pág. 5906 - 5911; Ogawa H. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pág. 11899 - 11903, diciembre 1995, y Lim y colaboradores J. Biochem, 118, 13 - 17 (1995). La variante S65T fluorescente mejorada descrita por Heim y asociados (1995) ut supra también muestra una fluorescencia muy baja cuando se incuba bajo condiciones de cultivo normales (37ºC), véase Kaether y Gerdes FEBS Letters 369 (1995) pág. 267 - 271. Muchos procedimientos que comprenden el estudio del metabolismo celular dependen de la posibilidad de incubar las células a temperaturas fisiológicamente relevantes, es decir, temperaturas de aproximadamente 37ºC.

Trastrup y asociados (1997) EP 0 851 874 describen proteínas fluorescentes que exhiben alta fluorescencia en las células que las expresan cuando dichas células se incuban a una temperatura de 30ºC o superior. Esto se obtiene mutando el aminoácido en la posición 1 que precede al cromóforo. Ejemplos de tales mutaciones son F64L, F641, F64V, F64A y F64G.

Varios autores han experimentado con combinaciones de mutaciones. Una de tales combinaciones es la GFP F64L, S65T (EGFP). La EGFP exhibe alta fluorescencia cuando se expresa a 30ºC o más y tiene un máximo de excitación a 488 nm.

Resumen de la invención

La presente invención suministra nuevas proteínas fluorescentes, tales como F64L - E222G - GFP que dan como resultado una fluorescencia celular que excede de lejos la fluorescencia celular cuando se expresan a 37ºC y cuando se excitan a entre 450 y 500 nm en comparación con las proteínas padres, es decir, la GFP, la variante azul Y66H-GFP, la variante S65T-GFP y la F64L-GFP. Esto mejora enormemente la utilidad de las proteínas fluorescentes en el estudio de las funciones celulares en células vivas.

Se muestra que la GFP mutada en la posición 64 entre F y L (F64L) y en la posición 222 entre E y G (E222G) tiene propiedades remarcables. Primero se muestra que la F64L,E222G-GFP tiene un espectro completamente diferente al de la F64L,S65T-GFP (ejemplo 2). En contraste, no hay diferencia substancial entre las características de pliegue (medidas como el momento cuando se observa la fluorescencia entre dos GP (ejemplo 3)). De forma similar, no había diferencias entre la sensibilidad al pH de las dos GFP (ejemplo 4). El brillo observado de la E222G frente a las F64L-GFP mutadas en S65T depende de las condiciones de prueba (ejemplo 5).

Descripción detallada de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere a una proteína fluorescente derivada de la proteína fluorescente verde (GFP) o a cualquier análogo funcional, en el que el aminoácido de la posición 1 que precede al cromóforo se ha mutado y en el que el ácido glutámico de la posición 222 se ha mutado, dicha GFP mutada tiene un máximo de excitación a una longitud de onda mayor en comparación con la F64L-GFP y la fluorescencia aumenta cuando la GFP mutada se expresa en células incubadas a una temperatura de 30ºC o superior en comparación con la GFP de tipo natural.

Las características de excitación y emisión de la F64L,E222G-GFP se diferencia significativamente de la GFP de tipo natural y de la EGFP. Las proteínas fluorescentes existentes han demostrado su utilidad en aplicaciones de investigación tales como la microscopía de fluorescencia cuantitativa (Patterson, G.H. y colaboradores (1997). Biophysical J. 73:2782 - 2790; Piston, D.W. y colaboradores (1999) Meth. Cell Biol. 58:31 - 48). Sin embargo, ahora está claro que las características óptimas de las proteínas fluorescentes para las aplicaciones de selección de alto rendimiento (HTS) en la búsqueda de medicamentos se diferencian un tanto de aquellas para las aplicaciones de investigación (Kain, S. R. (1999) Drug Discovery Today 4:304 - 312). Por ejemplo, factores tales como una óptima relación de señal/ruido son más importantes para las aplicaciones de HTS en la investigación de medicamentos que el brillo absoluto de sondas tales como las proteínas fluorescentes. La F64L,E222G-GFP descrita en esta solicitud de patente tiene un máximo de excitación a 470 nm y un máximo de emisión a 505 nm (consulte la figura 3), en comparación con los respectivos máximos de excitación y emisión de 490 nm y 510 nm para la EGFP. Esto da como resultado un desplazamiento de Stokes de 35 nm para la F64L,E222G-GFP, en comparación con los 20 nm para la EGFP. Esto da como resultado un aumento significativo de la banda de excitación - emisión para la F64L,E222G-GFP con relación a la EGFP con varias implicaciones para el uso de la F64L,E222G-GFP en la selección de alto rendimiento. Algunos de estos factores se relacionan a continuación:

1.

El desplazamiento de Stokes incrementado para la F64L,E222G-GFP da como resultado una resolución espectral mayor de sus picos de excitación y emisión. Esto hace posible una separación de banda más completa usando un divisor de rayo dicroico convencional, y una señal de fondo menor para ensayos que incorporen la F64L,E222G-GFP con relación a los ensayos basados en la EGFP.

2.

La fluorescencia de la F64L,E222G-GFP puede excitarse mediante fuentes de luz convencionales usando filtros de banda estrecha o líneas de producción láser comercialmente disponibles a 472 nm. En cualquier caso, el mayor desplazamiento de Stokes de la F64L,E222G-GFP da como resultado menores interferencias de la luz de excitación para el vértice del espectro de emisión.

3.

El máximo de excitación para la F64L,E222G-GFP cae a medio camino entre la variante de la proteína fluorescente cian (ECFP, máximo de excitación a aproximadamente 433 nm) y la variante de la proteína fluorescente amarilla (EYFP, máximo de excitación a aproximadamente 513 nm). A causa de ello, permitirá una separación de banda más limpia cuando se use junto con esas sondas y se optimiza para aplicaciones de ensayo en las cuales serán multiplexados varios componentes etiquetados con GFP.

\vskip1.000000\baselineskip

Existen muchas fuentes de GFP. Son ejemplos la GFP derivada de la Aequorea victoria y la GFP derivada de la Renilla. Se han aislado diferentes GFP a partir de la Renilla, son ejemplos la reniformis y la mulleri. Tal como se describe en los ejemplos y en los de Identificadores de Secuencias Núm. 3 y 4, el cromóforo en la Aequorea victoria está en la posición 65 - 67 de la secuencia de aminoácidos primaria predicha de la GFP. Así, en una realización preferida, la GFP se deriva de la Aequorea victoria.

Es preferible que la mutación en F64 sea una mutación en un aminoácido alifático. Son ejemplos la F64L, F641, F64V, F64A y F64G, de las que la preferida es la sustitución F64L. Sin embargo, en la invención también se incluyen otras mutaciones, por ejemplo deleciones, inserciones o modificaciones post-traduccionales que preceden de forma inmediata al cromóforo, teniendo en cuenta que dan como resultado propiedades de fluorescencia mejoradas de las diferentes proteínas fluorescentes. Debe observarse que las deleciones extensivas pueden dar como resultado la pérdida de las propiedades de fluorescencia de la GFP.

Se prefieren las sustituciones E222G, E222A, E222V, E222L, E2221, E222F, E222S, E222T, E222N, E222Q, siendo la preferida la sustitución E222G (que es una sustitución para la glicina).

\newpage

Una secuencia preferida del gen que codifica la GFP derivada de la Aequorea victoria se presenta en el Identificador de Secuencia Núm. 3 (mejorada) y en el Identificador de Secuencia Núm. 7 (medusa). El Identificador de Secuencia Núm. 1 muestra la secuencia de nucleótidos de la F64L-GFP con codón humanizado. El Identificador de Secuencia Núm. 5 muestra la secuencia de nucleótidos de la F64L-GFP con codón de medusa. Además, las nuevas proteínas fluorescentes también pueden derivarse de otras proteínas fluorescentes tal como se mencionó anteriormente.

De aquí en adelante las abreviaturas usadas para los aminoácidos son aquellas establecidas en J. Biol. Chem. 243 (1968), 3558.

Un aspecto de la invención se refiere a una secuencia que codifica la proteína fluorescente F64L-E222G-GFP. Un ejemplo de dicha F64L-E222G-GFP se muestra en la lista 2. En un aspecto preferido la secuencia de nucleótidos tiene la forma de una secuencia de ADN.

El constructo de ADN de la invención que codifica las nuevas proteínas fluorescentes puede prepararse sintéticamente mediante procedimientos estándar establecidos, por ejemplo el procedimiento de las fosfoamiditas descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869, o el procedimiento descrito por Matthes y colaboradores, EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. De acuerdo con el procedimiento de las fosfoamiditas, se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se hibridizan, se ligan y se clonan en vectores adecuados.

El constructo de ADN también puede prepararse mediante la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo tal como se describe en el documento US 4.683.202 o por Saiki y colaboradores, Science 239 (1988), 487 - 491. Una revisión más reciente de los procedimientos de la PCR pueden encontrarse en PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, EE.UU.

El constructo de ADN de la invención puede insertarse dentro de un vector recombinante que puede ser cualquier vector que pueda exponerse de forma adecuada a procedimientos recombinantes de ADN. La selección del vector depende a menudo de la célula anfitriona dentro de la cual tiene que introducirse. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación depende de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce dentro de una célula anfitriona, se integra dentro del genoma de la célula anfitriona y se replica junto con los cromosomas dentro de los cuales se ha integrado.

El vector es preferiblemente un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica la proteína fluorescente de la invención está operativamente enlazada con segmentos adicionales necesarios para la transcripción del ADN. En general, la expresión vector se deriva de ADN plásmido o viral o puede contener elementos de ambos. El término "operativamente enlazado" indica que los segmentos están dispuestos de manera que funcionan de acuerdo con los propósitos previstos, por ejemplo la transcripción se inicia en un promotor y continúa a través de la secuencia de ADN que codifica la proteína fluorescente de la invención.

El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula anfitriona de elección y puede derivarse de los genes que codifican proteínas bien homólogas o bien heterólogas para la célula anfitriona, incluyendo los genes nativos de la GFP de la Aequorea.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica la proteína fluorescente de la invención en células de mamíferos son el promotor SV40 (Subramani y colaboradores, Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 - 864), el promotor MT-1 (gen de la metalotioneina) (Palmiter y colaboradores, Science 222 (1983), 809 - 814) o el principal promotor tardío del adenovirus 2.

Un ejemplo de un promotor adecuado para su uso en células de insectos es el promotor de la polihedrina (US 4.745.051; Vasuvedan y colaboradores, FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), el promotor del P10 (J.M. Vlak y colaboradores, J. Gen. Virology 69 1998, pág. 765 - 776), el promotor de la proteína básica del virus de la polihedrosis, Autographa californica (EP 397 485), el promotor del gen 1 temprano inmediato del baculovirus (US 5.155.037; US 5.162.222) o el promotor del gen retrasado - temprano 39K del baculovirus (US 5.155.037; US 5.162.222).

Ejemplos de promotores adecuados en células anfitrionas de levadura incluyen promotores de los genes glicolíticos de la levadura (Hitzeman y colaboradores, J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen 1 (1982), 419 - 434) o los genes de la dehidrogenasa del alcohol (Young y colaboradores, en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender y colaboradores, eds.), Plenum Press, Nueva York, 1982) o los promotores del TP11 (US 4.599.311) o del ADH2-4c (Russell y colaboradores, Nature 304 (1983), 652 - 654).

Ejemplos de promotores adecuados para su uso en células anfitrionas de hongos filamentosos son, por ejemplo, el promotor del ADH3 (McKnight y colaboradores, the EMBO J.4 (1985), 2093 - 2099) o el promotor del tpiA. Ejemplos de otros promotores adecuados son aquellos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa del A. oryzae, la proteinasa aspártica del Rhizomucor miehei, la \alpha-amilasa neutra del A. Níger, la \alpha-amilasa estable al ácido del A. Níger, la glucoamilasa (gluA) del A. Níger o del A. awamori, la lipasa del Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina del A. oryzae, la isomerasa de fosfato de triosa del A. oryzae o la acetamidasa del A. nidulans. Se prefieren los promotores de la TAKA amilasa y de la gluA.

Ejemplos de promotores adecuados para su uso en células anfitrionas bacterianas incluyen el promotor del gen de la amilasa maltogénica del Bacillus stearothermopohilus, el gen de la \alpha-amilasa del Bacillus licheniformis, el gen de la BAN - amilasa del Bacillus amyloliquefaciens, el gen de la proteasa alcalina del Bacillus subtilis, o el gen de la xilosidasa del Bacillus pumilus o por los promotores Lambda P_{R} o P_{L} del fago o los promotores lac, trp o tac del
E. coli.

La secuencia de ADN, que codifica las nuevas proteínas fluorescentes de la invención, si fuera necesario, puede estar también operativamente conectada con un terminador adecuado, tal como un terminador de la hormona humana del crecimiento (Palmiter y colaboradores, obra citada) y (para anfitriones fungales) los terminadores TPl1 (Alber y Kawasaki, obra citada) o ADH3 (McKnight y colaboradores, obra citada). El vector puede comprender además elementos tales como señales de poliadenilación (por ejemplo a partir de SV40 o de la región Elb del adenovirus 5), secuencias potenciadoras transcripcionales (por ejemplo el potenciador del SV40) y secuencias potenciadoras traduccionales (por ejemplo las que codifican ARN del adenovirus VA).

El vector recombinante puede comprender además una secuencia de ADN que posibilite la replicación del vector en la célula anfitriona en cuestión. Un ejemplo de dicha secuencia (cuando la célula anfitriona es una célula de mamífero) es el origen SV40 de replicación.

Cuando la célula anfitriona es una célula de levadura, las secuencias adecuadas que posibilitan la replicación del vector son los genes REP 1 - 3 de replicación de plásmidos 2\mu de la levadura y el origen de la replicación.

El vector también puede comprender un marcador selectivo, por ejemplo un gen cuyo producto complemente un defecto en la célula anfitriona, tal como el gen que codifica la reductasa de dihidrofolato (DHFR) o el gen TPI del Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene 40, 1985, pág. 125 - 130) o uno que confiera resistencia a un medicamento, por ejemplo la ampicilina, la kanamicina, la tetraciclina, el cloramfenicol, la neomicina o la higromicina. Para los hongos filamentosos, los marcadores selectivos incluyen amdS, pyrG, argB, niaD, sC.

Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican la proteína fluorescente de la invención, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia de la señal secretora, respectivamente, y para insertarlas dentro de vectores adecuados que contengan la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por las personas expertas en la materia (consulte, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, obra citada).

La célula anfitriona dentro de la cual se introduce el constructo de ADN o el vector recombinante de la invención puede ser cualquier célula que sea capaz de expresar el presente constructo de ADN e incluye bacterias, levaduras, hongos y células eucarióticas mayores.

Ejemplos de células anfitrionas bacterianas que, mediante cultivo, son capaces de expresar el constructo de ADN de la invención son las bacterias gram positivas, por ejemplo cepas de Bacillus, tales como B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. cirulans, B. lautus, B. megatherium o B. thurigiensis, cepas del Streptomyces, tal como el S. lividans o S. murinus, o bacterias gram negativas tales como el Scherichia coli. La transformación de la bacteria puede efectuarse mediante transformación de protoplastos o mediante el uso de células competentes de una manera conocida per se (consulte, Sambrook y colaboradores, supra).

Ejemplos de líneas de células de mamíferos adecuadas son la HEK293 y las líneas de células primarias y las líneas de células COS (por ejemplo ATCC CRL 1650), BHK (por ejemplo, ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL (por ejemplo, ATCC CCL39) o CHO (por ejemplo, ATCC CCL 61). Procedimientos para transfectar células de mamíferos y expresar secuencias de ADN introducidas en las células se describen, por ejemplo en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet, 1 (1982), 327 - 341; Loyter y colaboradores, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426, Wigler y colaboradores, Cell 14 (1978), 725; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham y van der Eb, Virology 52 (1973), 456; y Neumann y colaboradores, EMBO J. 1 (1982), 841 - 845.

Ejemplos de células de levadura adecuadas incluyen las células del Saccharomyces spp. O Schizosaccharomyces spp., en particular cepas del Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri. Procedimientos para transformar células de levadura con ADN heterólogo y producir polipéptidos heterólogos a partir de las mismas se describen, por ejemplo, en los documentos US 4.599.311, US 4.931.373, US 4.870.008, US 5.037.743 y US 4.845.075, todos los cuales se incorporan aquí por referencia. Las células transformadas se seleccionan mediante un fenotipo determinado mediante un marcador seleccionable, comúnmente resistente a los medicamentos o mediante la habilidad de crecer en la ausencia de un nutriente en particular, por ejemplo la leucina. Un vector preferido para su uso en la levadura es el POT1 desvelado en el documento US 4.931.373. La secuencia de ADN que codifica la proteína fluorescente de la invención puede estar precedida por una secuencia de señal y opcionalmente una secuencia guía, por ejemplo según se ha descrito anteriormente. Además, ejemplos de células de levadura adecuadas son las cepas del Kluveromyces, tal como K. lactis, de la Hansenula, por ejemplo la H. polymorpha, o del Pichia, por ejemplo P. patoris (Consulte Gleeson y colaboradores, J. Gen. Microbiol. 132. 1986, pág. 3459 - 3465, y el documento
US 4.882.279).

\newpage

Ejemplos de otras células fungales son las células de hongos filamentosos, por ejemplo el Aspergillus spp., el Neurospora spp., el Fusarium spp. o el Trichoderma spp., en particular cepas del A. oryzae, del A. nidulans o del A. Níger. El uso del Aspergillus spp. para la expresión de proteínas se describe, por ejemplo, en los documentos EP 272 277, EP 230 023, EP 184 438.

Cuando se usa un hongo filamentoso como célula anfitriona, puede estar transformado con el constructo de ADN de la invención, de forma adecuada integrado el constructo de ADN en el cromosoma anfitrión para obtener una célula anfitriona recombinante. Generalmente esta integración se considera una ventaja ya que la secuencia de ADN probablemente se mantendrá estable en la célula. La integración de los constructos de ADN dentro del cromosoma anfitrión puede realizarse de acuerdo con procedimientos convencionales, por ejemplo mediante recombinación homóloga o heteróloga.

La transformación de células de insectos y la producción de polipéptidos heterólogos en las mismas pueden realizarse según se describe en los documentos US 4.745.051, US 4.879.236, US 5.155.037, 5.162.222, EP 397.485, todos los cuales se incorporan aquí por referencia. La línea de células de insectos utilizada como anfitriona puede ser de forma adecuada una línea de células del Lepidoptera tales como células del Spodoptera frugiperda o células del Trichoplusia ni (consulte el documento US 5.077.214). Las condiciones de cultivo pueden ser de forma adecuada como las descritas, por ejemplo, en los documentos WO 89/01029 o WO 89/01028 o en cualquiera de las referencias antes mencionadas.

Un aspecto de la invención se refiere a un anfitrión transformado con un constructo de ADN de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes. La célula anfitriona transformadas o transfectada descrita anteriormente se cultiva entonces en un medio nutriente adecuado bajo condiciones que permitan la expresión del constructo de ADN presente, después de lo cual las células pueden utilizarse en el procedimiento de selección de la invención. Alternativamente, las células pueden ser alteradas después de lo cual los extractos y/o los sobrenadantes de células pueden utilizarse para el análisis de fluorescencia.

El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células anfitrionas, tal como un medio mínimo o complejo que contenga suplementos adecuados. Medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con las fórmulas publicadas (por ejemplo en catálogos de la American Type Culture Collection).

En el procedimiento de la invención, la fluorescencia de las células transformadas o transfectadas con el constructo de ADN de la invención pueden detectarse de forma adecuada en un espectrómetro o en un microscopio de fluorescencia donde pueden determinarse las propiedades espectrales de las células en el cultivo líquido como estudios de excitación y emisión de luz.

Un aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fusión que consta de una proteína fluorescente (F64L-E222G-GFP), en el que la F64L-E222G-GFP está enlazada con un polipétido. Un Ejemplo de dicho polipéptido es la quinasa, preferiblemente la subunidad catalítica de la proteína quinasa A o de la proteína quinasa C o de la Erk1, o de un elemento citoesquelético.

La invención se refiere además a un proceso para preparar un polipéptido, que comprende el cultivo de un anfitrión de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes y la obtención a partir del mismo del polipéptido expresado por dicha secuencia de nucleótidos.

Los diferentes aspectos de la invención tienen gran cantidad de usos. Algunos de los cuales se describe a continuación:

Uso de la F64L- 222G-GFP en un ensayo in vitro para la medición de la actividad de la proteína quinasa o de la actividad de desfosforilación o para la medición de la redistribución de proteínas.

Uso de la F64L-E222G-GFP como una etiqueta de proteínas en células vivas y fijadas. Debido a la fuerte fluorescencia, las nuevas proteínas son etiquetas adecuadas para proteínas presentes en bajas concentraciones. Ya que no se necesita un substrato y la visualización de las células no daña a la células, pueden realizarse análisis dinámicos.

Uso como una etiqueta de orgánulos. Puede etiquetarse más de un orgánulo y visualizarse simultáneamente en células vivas, por ejemplo el retículo endoplásmico y el citoesqueleto.

Uso como marcador de secreción. Mediante la fusión de la F64L-E222G-GFP con un péptido señal o un péptido a ser secretado, puede seguirse en línea la secreción en células vivas. Una condición previa para ello es que la maduración de un número detectable de moléculas de la nueva proteína fluorescente se produzca más rápido que la secreción.

Uso como indicador genético o etiqueta de proteínas en animales transgénicos. Debido a la fuerte florescencia de las nuevas proteínas, son adecuadas como etiquetas para proteínas y para la expresión genética, ya que la relación señal/ruido está significativamente mejorada en relación con las proteínas de la técnica anterior, tales como las GFP de tipo natural.

Uso como un marcador de la integridad de una célula o de un orgánulo. Mediante la coexpresión de dos de las nuevas proteínas, una etiquetada en un orgánulo y la otra expresada en el citosol, es posible calcular la pérdida relativa de la proteína citosilíca y utilizar esto como una medición de la integridad de la célula.

Uso como marcador de cambios en la morfología celular. La expresión de las nuevas proteínas en las células permite la fácil detección de cambios en la morfología de las células, por ejemplo la vesiculación, provocada por agentes citotóxicos o la apoptosis. Dichos cambios morfológicos son difíciles de visualizar en células intactas sin el uso de sondas fluorescentes.

Uso como marcador de transfección y como un marcador a utilizar en combinación con la clasificación FACS. Debido al incremento de brillo de las nuevas proteínas, puede mejorarse significativamente la calidad de la detección y clasificación de las células.

Uso como sonda en tiempo real que funciona en concentraciones casi fisiológicas. Ya que la F64L-E222G-GFP es significativamente más brillante que la GFP de tipo natural y que la F64L-GFP cuando se expresa en células a aproximadamente 37ºC y se excita con luz a aproximadamente 490 nm, puede disminuirse la concentración necesaria para la visualización. Los sitios diana para enzimas genéticamente modificadas dentro de las nuevas proteínas, por ejemplo la F64L-E222G-GFP, pueden estar por lo tanto presentes en la célula a bajas concentraciones en células vivas. Esto es importante por dos razones: (1) la sonda debe interferir lo menos posible con el proceso intracelular que está siendo estudiado; (2) debe estresarse mínimamente el aparato traduccional y transcripcional.

Las nuevas proteínas pueden utilizarse como marcadores para monitorizar la biomasa viva/muerta de organismos, tales como los hongos. Mediante la expresión constitutiva de la F64L-E222G-GFP en los hongos, puede alumbrarse la biomasa viable.

Puede realizarse la mutagénesis de vectores de transposón usando las nuevas proteínas como marcadores en fusiones transcripcionales y traduccionales.

Los transposones pueden utilizarse en microorganismos que codifican las nuevas proteínas. Los transposones pueden construirse mediante fusiones traduccionales y transcripcionales. Se utilizan para la selección de promotores.

Los vectores de transposones que codifican las nuevas proteínas, tales como la F64L-E222G-GFP, pueden utilizarse para etiquetar plásmidos y cromosomas.

Uso como marcador para la detección bacteriana mediante la introducción de las nuevas proteínas dentro del genoma de bacteriófagos.

Modificando genéticamente las nuevas proteínas, por ejemplo la F64L-E222G-GFP, dentro del genoma de un fago puede diseñarse una herramienta de diagnóstico. La F64L-E222G-GFP se expresará solamente una vez efectuada la transfección del genoma dentro de un anfitrión vivo. La especificidad del anfitrión viene definida por el bacteriófago.

La invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos con referencia a las relaciones de secuencias adjuntas.

TABLA 1 Relación de secuencias

1

Leyenda para las figuras

Los códigos PS se explican en la Tabla 2.

Figura 1

Espectro de excitación de PS1189 (máximo de excitación a 492 nm), PS1191 (máximo de excitación a 468 nm), PS1185 (máximo de excitación a 490 nm) y PS1186 (máximo de excitación a 473 nm). Las emisiones se grabaron a 560 nm. Las muestras de PS1189 y PS1191 fueron diluidas dos veces y las muestras de PS1185 y PS1186 fueron diluidas diez veces.

Figura 2

Espectro de emisión de PS1189 (máximo de de emisión a 509 nm), PS1191 (máximo de emisión a 505 nm), PS1185 (máximo de emisión a 510 nm) y PS1186 (máximo de emisión a 506 nm). La excitación estaba a 430 nm. Las muestras de PS1189, PS1191 y PS1185 se diluyeron dos veces y la muestra de PS1186 se diluyó 10 veces. Las curvas para PS1189 y PS1191 se relacionan con el eje y primario mientras que las curvas para PS1185 y PS1186 se relacionan con el eje y secundario.

Figura 3

Superposición de espectros de excitación (Ex) y emisión (Em) de PS1189 (panel A), PS1191 (panel B), PS1185 (panel C)y PS1186 (panel D). La curva de excitación a la izquierda y la curva de excitación a la derecha se relacionan con los ejes y primario y secundario, respectivamente.

Figura 4

Esta figura muestra las imágenes recogidas después de la transfección con Lipofectamine 2000. La eF64L,E222G (PS699) está en la parte superior de la columna de la derecha denominada E222G, la eF64L,S65T-GFP (PS279) está en la parte superior de la columna de la izquierda denominada EGFP.

Figura 5

Comparación de la sensibilidad al pH de la EGFP (PS279) y la eF64L,E222G-GFP (PS699).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de plásmidos de la GFP

Los plásmidos pEGFP-M1 (núm. de acceso del GenBank U55762) y pEGFP-C1 (núm. de acceso del GenBank U55763) contienen ambos un derivado de la GFP en el cual se ha añadido un aminoácido extra en la posición dos para administrar una mejor secuencia de inicio traduccional (una secuencia Kozak) y así el número total de aminoácidos aumenta en uno hasta 239 en vez de los 238 hallados en la GFP de tipo natural. Por lo tanto, la denominación de las mutaciones en la GFP en estos plásmidos de forma estricta debe denominarse, por ejemplo, F65L en vez de F64L. Sin embargo, para evitar esta fuente de confusión y a causa de que la GFP habitualmente ha adoptado el sistema de numeración de la GFP de tipo natural en sus comunicaciones, los números aquí utilizados se adaptan a la denominación comúnmente usada de las mutaciones de la GFP de tipo natural. Mutaciones relevantes a este respecto son F64L, F65T y E222G.

Los plásmidos pEGFP-N1 y pEGFP-C1 contienen las siguientes mutaciones en el cromóforo: F64L y F65T. El uso del codón de la secuencia de ADN de la GFP se ha optimizado para la expresión en células de mamífero. N1 y C1 se refieren a la posición de múltiples sitios de clonación con relación a la secuencia de la GFP.

Para construir un plásmido combinando F64L y E222G, pEGFP-N1 y pEGFP-C1 primero se expusieron a la PCR con los cebadores 9859 y 9860 descritos a continuación. Los cebadores son complementarios de la secuencia de ADN alrededor de la región del cromóforo e introducen un punto de mutación que cambia la treonina en la posición 65 por serina. Además, los cebadores introducen un único sitio de restricción Spe1 mediante mutación silenciosa. Los productos de la PCR de 4,7 kb fueron digeridos con Spe1, religados y transformados dentro del E. colli. Los plásmidos resultantes se denominaron PS399 (contexto N1) y PS401 (contexto C1). Estos plásmidos contienen la secuencia de cromóforo 64-LSYG-67. Los plásmidos PS399 y PS401 se expusieron a una mutagénesis QuickChange (Stratagene) empleando PCR con los cebadores 0225 y 0226 descritos posteriormente. Estos cebadores son complementarios de las secuencias cercanas al terminal C de la GFP y cambian el glutamato en la posición 222 por glicina y además introducen un sitio de restricción Avr2 mediante mutación silenciosa. Los plásmidos resultantes se denominan PS699 (contexto N1) y PS701 (contexto C1). Combinan un cromóforo de LSYG con E222G con codón humanizado y se denomina eF64L,E222G (consulte el listado de secuencias 2) 9859-superior: 5'-TG
TACTAGTGACCACCCTGTCTTACGGCGTGCA-3' 9860-inferior: 5'-CTGACTAGTGTGGGCCAGGGCACGGG
CAGC-3' 0225-inferior: 5'-CCCGGCGGCGGTCACGAACCCTAGGAGGACCATGTGATCGCG-3' 0226-superior: 5'-CGCGATCACATGGTCCTCCTAGGGTTCGTGACCGCCGCCGGG-3'

Un plásmido que codifica una GFP directamente derivada de la medusa con F64L (desvelado en la figura 4 del documento WO 97/11094) se expuso a la PCR con los cebadores 9840 y 9841 posteriormente descritos. El producto de la PCR fue digerido con las enzimas de restricción Age1 y Acc65 y se ligó dentro del pEGFP-N1 digerido con Age y BsrG1. Esto sustituye la EGFP con F61L-GFP y se introduce un cambio en el aminoácido L236G cerca del terminal C como consecuencia de unir los sitios Acc65 y BsrG1. Este plásmido se denomina PS350.

\newpage

Un plásmido que codifica una GFP derivada directamente de la medusa con F64L, 65T (desvelado en la figura 5 del documento WO 97/11094) se expuso a la PCR con los cebadores 9840 y 9841 posteriormente descritos. El producto de la PCR fue digerido con las enzimas de restricción Age1 y Acc65 y se ligó dentro del pEGFP-N1 digerido con Age1 y BsrG1. Esto sustituye la EGFP con F61L,S65T-GFP e introduce un cambio en el aminoácido L236G cerca del terminal C como consecuencia de unir los sitios Acc65 y BsrG1. Este plásmido se denomina PS351.

El plásmido PS350 se expuso a una PCR QuickChange (Stratagene) con los cebadores 0317 y 0318 posteriormente descritos. Esto introduce E222G por mutación y un sitio de restricción Avr2 mediante mutación silenciosa. Este plásmido se denomina PS832.

El plásmido PS832 se expuso a una PCR QuickChange (Stratagene) con los cebadores 0325 y 0326 posteriormente descritos. Esto introduce L64F por mutación y un sitio de restricción Psp1406 mediante mutación silenciosa. Este plásmido se denomina PS845.

Un plásmido que codifica una GFP directamente derivada de la medusa (desvelado en la figura 2a del documento WO 97/11094) se expuso a una PCR con los cebadores 9840 y 9841 posteriormente descritos. El producto de la PCR fue digerido con las enzimas de restricción Age1 y Acc65 y se ligó dentro del pEGFP-N1 digerido con Age1 y BsrG1. Esto sustituye la EGFP con GFP de tipo natural e introduce un cambio en el aminoácido L236G cerca del terminal C como consecuencia de unir los sitios Acc65 y BsrG1. Este plásmido se denomina PS854.

El plásmido PS399 se expuso a una PCR QuickChange (Stratagene) con los cebadores 0327 y 0328 posteriormente descritos. Esto introduce L64F mediante mutación y un sitio de restricción Psp1406 mediante mutación silenciosa. Este plásmido se denomina PS844.

El plásmido PS699 se expuso a una PCR QuickChange (Stratagene) con los cebadores 0327 y 0328 posteriormente descritos. Esto introduce L64F por mutación y un sitio de de restricción Psp1406 mediante mutación silenciosa. Este plásmido se denomina PS846.

2

Plásmidos que codifican las GFP en un contexto de codón de medusa (PS350, PS351, PS832, PS845, PS854) se expusieron a la PCR con los cebadores 1259 y 1260 posteriormente descritos. Los productos de la PCR de 0,8 kb se cortaron con las enzimas de restricción BspH1 y BamH1 y se ligaron dentro del vector de expresión del E. coli pTrcHis (de Invitrogen) cortado con Nco1 y BamH1. Esto coloca las GFP bajo el control del promotor inducible por ITPG en el vector. El cebador inferior 1260 cambia también la glicina en la posición 236 de nuevo a leucina. Los plásmidos resultantes son denominados PS1184 (jf-F64L-E222G), PS1185 (jf-F64L,S65T-GFP), PS1186 (jf-F64L,E222G-GFP), PS1187 (jf-E222G-GFP) y PS (jf-GFP).

Los plásmidos que codifican las GFP en un contexto de codón humanizado mejorado (PS279 = pEGFP-N1 (Clontech), PS399, PS699, PS844, PS846) se expusieron a una PCR con los cebadores 1261 y 1262 posteriormente descritos. Los productos de la PCR de 0,8 kb se cortaron con enzimas de restricción Nco1 y BamH1 y se ligaron dentro del vector de expresión del E. Coli pTrcHis (de Invitrogen) cortado con Nco1 y BamH1. Esto sitúa las GFP bajo el control del promotor inducible por ITPG en el vector. Los plásmidos resultantes son denominados PS1189 (e-F64L,S65T-GFP = EGFP), PS1190 (e-E222G-GFP), PS1191 (e-F64L,E222G-GFP), PS1192 (e-GFP) yPS1193 (e-E222G-GFP).

200

Los plásmidos anteriormente descritos se transformaron en la cepa del E. coli DH5alfa (Life Technologies). Se recogieron colonias simples y se hicieron crecer a lo largo de la noche a 37ºC en un medio LB que contenía 1 mM de IPTG. Se granularon 0,5 ml de células y se almacenaron a 20ºC hasta que fueron analizadas.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Tabla resumen de los plásmidos que codifican GFP con los aminoácidos indicados en las posiciones 64, 65 y 222

3

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Determinación de las propiedades espectrales de las proteínas EGFP y eF64L,E222G

Se transfectaron plásmidos que expresan EGFP a partir del plásmido pEGP-N1 (también denominado PS279) y eF64L,E222G a partir del plásmido PS699 dentro de células TOP10 (Invitrogen) de E. Coli usando Lipofectamine 2000 (de Life Technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Pasados 5 días se recogieron las células y se resuspendieron en 5 nM de una solución neutralizante de extracción TRIS (pH 8,0) con 1 nM de DTT. Las células fueron lisadas mediante 3 ciclos de congelación - descongelación. Se centrifugaron los deshechos celulares a 10.000 g en un centrifugador refrigerado. Se añadió NaCl hasta 100 nm.

Los gránulos de células se resuspendieron en 1.000 \mul de H_{2}O cada uno (el doble de dilución con relación a los volúmenes de los cultivos granulados) y se transfirieron a cubetas de plástico de 1,0 x 0,5 cm y se grabaron los siguientes espectros de excitación y emisión sobre un espectrómetro de luminiscencia Perkin Elmer LS50B:

Espectro de excitación:

\quad

Excitación a 350 - 525 nm (ancho de segmento 5 nm). Los datos se presentan en la Figura 1. Emisión 560 nm (ancho de segmento 10 nm).

\quad

Espectro de emisión a 430 nm (ancho de segmento 10 nm). Los datos se presentan en la Figura 2. Emisión 450 - 550 nm (ancho de segmento 5 nm).

Utilizando los mismos ajustes, se registraron los espectros de excitación y emisión de células diluidas dos veces (200 \mul de células diluidas dos ves mezcladas con 800 \mul de agua) para las muestras fuertemente fluorescentes expresadas a partir de ADNc con esqueleto de medusa (PS1185 y PS1186).

En contraste con los niveles de expresión, las propiedades de fluorescencia de las sondas fueron independientes del uso del codón. Los espectros registrados para las sondas con Thr65:E222G (PS1185 y PS1189) fueron muy similares (máximos de excitación y emisión a 490 - 492 nm y 509 – 510 nm, respectivamente) y con desplazamientos de Strokes de 17 - 20 nm. De forma similar, los espectros registrados para las sondas con Ser65:G222 (PS1186 y PS1191) fueron muy similares (máximos de excitación y emisión a 468 - 473 nm y 505 - 506, respectivamente) y con desplazamientos de Strokes de 33 - 37 nm.

Ejemplo 3 Determinación del tiempo para la fluorescencia de la EGFP y la eF64L,E222G en células CHO

Tres cámaras de dos alvéolos con células CHOhIR se transfectaron con plásmido PS279 que expresa EGFP y plásmido PS699 que expresa eF64L,E222G usando el procedimiento de trasfección de Lipofectamine.

A intervalos regulares, se comprobó la fluorescencia de las células después de la transfección.

Se usó el procedimiento de transfección Lipofectamine 2000 para transfectar EGFp y F64L,E222G en una cámara de 8 alvéolos con células CHOhIR. A intervalos regulares, se comprobó la fluorescencia de las células después de la transfección, según se describió anteriormente. Se tomaron imágenes desde los mismos campos de células en cada intervalo. Se observaron tres campos diferentes para cada plásmido. Los ajustes del microscopio y de la cámara fueron iguales para cada imagen. Se tomó un tiempo de exposición óptimo a partir de cada cámara de células con expresión de EGFP completa (transfectada 24 horas antes) para asegurarse de que la exposición no se saturaba. Las primeras imágenes se tomaron entre 45 minutos y 1 hora después de la transfección, posteriormente con un intervalo de 30 minutos durante las primeras 7,5 horas después de la transfección y se recogió una imagen 26,5 horas después de la transfección. Se observaron cinco campos diferentes para cada plásmido. Se detectó fluorescencia no más tarde de 4 horas después de la transfección. Se detectó fluorescencia en eF64L,E222G en un campo 2,5 horas después de la transfección. En los campos restantes, se detectó fluorescencia no más tarde de 4 horas después de la transfección (Figura 4).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Comparación de la sensibilidad al pH sobre una banda de entre pH 4,0 y pH 12,0 entre la EGFP y la F64L,E222G

Se comprobó la sensibilidad al pH de muestras de EGFP semipurificada a partir de PS279 y F64L,E222G a partir de proteínas PS699 producidas en expresión de células COS7 sobre una banda de entre pH 4,0 y pH 12,5 con intervalos de 0,5 puntos. Se realizaron estudios de excitación y emisión de cada proteína en valores de pH entre 4,0 y 12,5. Los estudios dieron como resultado que el máximo de excitación se obtuvo a 490 nm y el máximo de emisión se obtuvo a 540 nm para la EFGP y el máximo de excitación se obtuvo a 475 nm y el máximo de emisión se obtuvo a 504 nm para la F64L,E222G. Los diferentes valores del pH no afectaron a los máximos de excitación y emisión. Se realizaron lecturas simples con excitación a 470 nm, emisión a 510 nm y con segmentos de 10 nm. Los resultados no muestran diferencias claras entre la EFFP y la F64F,E222G con respecto a su sensibilidad al pH, excepto las que pudieran deberse a fluctuaciones aleatorias (Figura 5). Este experimento se ha repetido esencialmente con los mismos resultados.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Comparación del brillo relativo de las GFP

Se construyeron 10 plásmidos que combinan algunas de las siguientes características:

-

F o L en la posición 64.

-

S o T en la posición 65.

-

E o G en la posición 222.

-

Esqueleto de la GFP de "medusa" o "humanizado mejorado".

Los plásmidos se transfectaron dentro de células CHO. Uno, dos o cuatro días más tarde las células fueron visualmente inspeccionadas en un microscopio de fluorescencia por dos personas. La excitación fue 475/40 = luz azul y la emisión 510 - 560 = luz verde. Las células se calificaron sobre una escala de "verdes" oscilando entre básicamente negro y extremadamente brillante (Tabla 3). Los resultados no variaron mucho con el tiempo.

TABLA 3

4

\vskip1.000000\baselineskip

Los plásmidos también fueron transfectados dentro de células HeLa. Después de una transfección de 24 horas, las células se dispusieron sobre un citómetro de flujo Calibur FACS para la caracterización de la totalidad de la fluorescencia de las células, con excitación a 488 nm y emisión observada con filtro de fluorescencia fijado en 530/30 nm (entre 515 y 545 nm). Se recopilaron 10.000 eventos para cada transfección y se llevaron a cabo 2 replicas para cada constructo. Se obtuvieron las intensidades medias de la fluorescencia a partir del análisis FACS como media geométrica (fluorescencia media en escala logarítmica) y los resultados se muestran en la Tabla 4.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

6

\vskip1.000000\baselineskip

Queda claro a partir de la tabla anterior que, cuando se expresan en la célula HeLa de mamífero, las GFP con codón humanizado son mucho más brillantes que las GFP con codón de medusa, siendo las más brillantes la EGFP y la e-BioE222G. No sorprende que la EGFP sea aproximadamente el doble de brillante que la E-BioE222G bajo estas condiciones. La excitación en FACS está en 488 nm, muy cerca del máximo de excitación de la EGFP en 490 nm. Según se ilustra en la Tabla 5, se captará por debajo del 97% de la emisión de la EGFP, mientras que sólo el 86% de la e-BioE222G. Además, la diferencia entre la intensidad de la EGFP y la e-BioE222G cuando se excitan en el máximo de excitación de la e-BioE222G de 470 nm, no es tan pronunciada.

TABLA 5

7

En células de mamífero las GFP mejoradas fueron más brillantes que las GFP de medusa. En el E. Coli, las GFP de la medusa fueron más brillantes que las GFP mejoradas. Así, merece la pena seleccionar con cuidado el esqueleto de la GFP de acuerdo con el subsiguiente anfitrión.

<110> Biolmage A/S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Nuevas proteínas fluorescentes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 25158PC1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows versión 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 720

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aequoria Victoria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(717)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

8

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aequoria Victoria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 720

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aequoria Victoria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(717)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

11

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aequoria Victoria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 717

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aequoria Victoria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(714)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aequoria Victoria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 717

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aequovia Victoria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(717)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

17

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aequovia Victoria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

18

Claims (15)

1. Una proteína fluorescente derivada de la Proteína Fluorescente Verde (GFP), que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido de la posición que se corresponde con la posición 65 del Identificador de Secuencia núm.: 4 ha sido sustituida por un aminoácido alifático y en la que el ácido glutámico de la posición que se corresponde con la posición 223 del Identificador de Secuencia núm.: 4 ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado entre el grupo que consta de G, A, V, I, F, S, T, N y Q, que se caracteriza porque dicha GFP mutada tiene un máximo de excitación a una longitud de onda mayor y la fluorescencia se incrementa cuando la GFP mutada se expresa en células incubadas a una temperatura de 30ºC o superior en comparación con la GFP de tipo natural.

2. La proteína fluorescente de la reivindicación 1, derivándose dicha proteína de la Aequoria victorea o Renilla.

3. La proteína fluorescente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el aminoácido F de la posición 65 de la GFP ha sido sustituido por un aminoácido seleccionado por el grupo que consta de L, I, V, A y G.

4. La proteína fluorescente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el aminoácido F de la posición 65 de la GFP ha sido sustituido por L.

5. La proteína fluorescente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el aminoácido E de la posición 223 de la GFP ha sido sustituido por G.

6. La proteína fluorescente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el aminoácido F de la posición 65 de la GFP ha sido sustituido por L y el aminoácido E de la posición 223 de la GFP ha sido sustituido por G.

7. La proteína fluorescente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene la secuencia de aminoácido desvelada en el Identificador de Secuencia núm.: 4.

8. Un compuesto de fusión que consta de una proteína fluorescente (GFP) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la GFP está enlazada con un polipéptido.

9. El compuesto de fusión de la reivindicación precedente, en el que el polipéptido es una quinasa, preferiblemente la subunidad catalítica de la proteína quinasa A o Erk1 o un elemento citoesquelético.

10. Una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína fluorescente de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

11. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación precedente, mostrada en el Identificador de Secuencia núm.: 3.

12. La secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en forma de una secuencia de ADN.

13. Un anfitrión transformado con un constructo de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. Un procedimiento para preparar un polipéptido, que comprende el cultivo de un anfitrión de acuerdo con la reivindicación 13 y la obtención a partir del mismo del polipéptido expresado por dichas secuencias de nucleótidos.

15. El uso de la proteína fluorescente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9 en un ensayo in vitro para medir la actividad de la proteína quinasa o la actividad de la fosforilación o para medir la redistribución de proteínas.