ES2331255T3 - Metodo para producir teicoplanina altamente pura. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir teicoplanina, que comprende: (a) ultrafiltración de un caldo de cultivo de una cepa de Actinoplanes teichomyceticus capaz de producir la teicoplanina; (b) la elución con alcohol del filtrado fruto de la ultrafiltración, adsorbido en una resina porosa de adsorción, para producir a partir de la resina porosa de adsorción un líquido purificado en forma tosca, que contiene teicoplanina; en donde la resina porosa de adsorción, utilizada en la elución de la teicoplanina a partir de la resina porosa de adsorción, incluye de 40 a 90% (v/v) de alcohol C1 a C4 miscible en agua con pH de 6,0 a 8,0, o de 40 a 90% (v/v) de cetona C3 a C6 miscible en agua con pH de 6,0 a 8,0; y (c) el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando un carbón activado para recuperar la teicoplanina altamente pura, en donde el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando el carbón activado incluye la adición directa del carbón activado dentro del líquido del proceso con un pH de 6 a 8 pasando a través de la resina porosa de adsorción, o añadiendo el carbón activado dentro del líquido del proceso diluido con agua.
Description
Método para producir teicoplanina altamente
pura.
La presente invención se relaciona con un método
para cultivar microorganismos, que es capaz de producir
teicoplanina, y de producir teicoplanina altamente pura utilizando
un caldo de cultivo. Más particularmente, la presente invención se
relaciona con un método para producir económicamente teicoplanina
altamente pura, en el cual se produce teicoplanina en una región
estable de pH neutro.
Actualmente se considera como un problema serio
que se propague un microorganismo resistente a los antibióticos
debido al abuso de los mismos. Con respecto a esto, la teicoplanina
que es un antibiótico glicopeptídico, actúa contra bacterias gram
positivas. Particularmente, la teicoplanina, un antibiótico
glicopeptídico, que actúa contra bacterias gram positivas, tales
como el Estafilococo aureus resistente a la meticilina (MRSA),
Estafilococo negativo a la coagulasa, Clostridium y Enterococos, es
llamada la última línea de defensa contra las enfermedades
infecciosas. La teicoplanina es un complejo de cinco tipos de
componentes A2, que tienen diferentes cadenas ramificadas de ácidos
grasos, y A3, que tiene una estructura de aglicona en la cual se
remueve una fracción de azúcar de
N-acil-\beta-D-glucosamina,
incluida la cadena ramificada de ácido graso, de una estructura
básica de A2. En esta descripción detallada, se designa a la
teicoplanina por medio del complejo A2 de teicoplanina que actúa
como un componente efectivo.
Generalmente, se adopta un proceso de síntesis
química o un proceso de biosíntesis que utiliza el cultivo del
microorganismo para producir antibióticos en cantidades comerciales.
Los antibióticos glicopeptídicos tienen una estructura química
complicada, en la cual se enlaza el azúcar a un esqueleto peptídico.
Por lo tanto, la teicoplanina y los antibióticos glicopeptídicos
comercializados como compuestos farmacéuticos son producidos de
acuerdo al proceso de biosíntesis denominado proceso de
fermentación. En el proceso de biosíntesis, se producen diferentes
impurezas, tales como componentes del medio y productos metabólicos,
concomitantemente con el antibiótico. Por lo tanto, se requieren
una cantidad de procesos de separación y de purificación para la
purificación de los antibióticos, que son factores críticos para la
producción en forma económica del antibiótico altamente puro.
La teicoplanina, un antibiótico glicopeptídico
producido a partir de Actinoplanes teichomyceticus, fue
reportado primero en "The Journal of Antibiotics (Vol. 31;
170-177, 1978)". Se han hecho una cantidad de
esfuerzos para separar la teicoplanina de un caldo de cultivo del
microorganismo y la purificación de la teicoplanina utilizando
diferentes procesos con el fin de producir teicoplanina grado
farmacéutico. De acuerdo con la revista anterior la con la patente
estadounidense No. 4.239.751, se divide un caldo de cultivo en una
torta de micelio y en un filtrado. Se extrae la torta de micelio
con acetona y se extrae nuevamente el extracto con butanol a un pH
ácido. Se extrae el filtrado, liberado de la masa de micelio por
filtración, con butanol a pH ácido. Posteriormente, se concentran
las capas de butanol por medio de destilación al vacío para formar
un precipitado. Se mezclan los precipitados entre sí, y se purifica
la mezcla con una columna de Sefadex LH20. Se purifica
adicionalmente el eluato de la columna de Sefadex LH20 con una
resina de intercambio iónica ácida, tal como IR-120
y Dowex 50, y luego, se precipita la teicoplanina a 4ºC. Sin
embargo, la patente estadounidense No. 4.239.751 tiene desventajas
ya que la purificación es muy complicada. Además, es difícil porque
la columna de Sefadex LH20 es muy costosa para la aplicación en una
producción a gran escala. Otra desventaja es que la recuperación y
la purificación de la teicoplanina son muy pobres.
La patente coreana No. 367890 describe un
proceso para extraer directamente teicoplanina a partir de un caldo
de cultivo, en el cual se añade un solvente orgánico miscible en
agua, tal como acetona, n-propanol y acetonitrilo
sin la separación del micelio. Además, la patente coreana No. 118034
describe un proceso para producir teicoplanina por medio de la
adición directa de una resina de intercambio catiónico fuertemente
ácida, tal como Dow XFS-43278.00 y Diaion
SK-102, a un caldo de cultivo. Sin embargo, las
patentes coreanas Nos. 367890 y 118034 tienen el inconveniente de
que, a pesar de tratarse de un proceso de extracción directa de
teicoplanina del caldo de cultivo que es más sencillo que en el
caso de la patente estadounidense No. 4.239.751, es difícil de
emplear en el proceso de producción debido a que la gran cantidad
de solvente orgánico que inevitablemente se utiliza para extraer
teicoplanina puede ocasionar polución ambiental. Además, es difícil
de producir teicoplanina de alta pureza modificando únicamente el
proceso de extracción.
Se han llevado a cabo muchos estudios para la
purificación de la teicoplanina por medio de procesos
cromatográficos en columna utilizando resinas sintéticas, como lo
sugieren Heydorn y colaboradores, "J. of Biochem. Vol. 275;
6201-6206, 2000", y como se describe en la
patente europea No. 241.758, la patente coreana No. 321304, la
publicación de la patente coreana abierta a inspección pública No.
2003-0017067, y la publicación de la patente
coreana abierta a inspección pública No.
2003-0034949. Adicionalmente, la patente europea No.
241.758 describe un proceso de purificación de teicoplanina que
utiliza una resina de poliamida. Además, la patente coreana No.
184644 describe un proceso de extracción de teicoplanina a partir de
micelio con pH alcalino, simplificando así un proceso complicado de
extracción de la patente estadounidense No. 4.239.751. En la patente
coreana No. 184644, después de la extracción de la teicoplanina, se
neutraliza el caldo de cultivo básico, y luego se lo purifica
utilizando la resina de poliamida de acuerdo a un procedimiento de
la patente europea No. 241.758. Sin embargo, cuando se analizó la
teicoplanina purificada por medio de HPLC (cromatografía líquida de
alto rendimiento), la purificación de la teicoplanina no fue
superior al 85% y la decoloración fue pobre. Por lo tanto, se puede
observar que se requiere llevar a cabo un proceso adicional de
purificación con el fin de producir teicoplanina altamente pura.
Con el propósito de estudiar una ruta de biosíntesis de
teicoplanina, Heydom y colaboradores han separado y purificado
teicoplanina de acuerdo a un proceso cromatográfico utilizando una
resina de intercambio iónico (Amberlita IRA958) y una resina
hidrófoba de adsorción (Diaion HP2MGL). Sin embargo, este método
sugerido por Heydom y colaboradores es desventajoso ya que hay que
añadir continuamente ácido acético a la solución básica pasando a
través de la resina para neutralizarlo y evitar una epimerización.
Adicionalmente, cuando se analiza la pureza de la teicoplanina por
medio de HPLC después de desalinizar, concentrar y liofilizar la
solución purificada para producir teicoplanina en polvo, la pureza
es apenas del 50 al 60% (p/p). Por lo tanto, no es deseable
utilizar la teicoplanina en polvo así producida como ingrediente
farmacéutico.
Mientras tanto, se han utilizado frecuentemente
resinas porosas de adsorción para purificar antibióticos
glicopeptídicos, incluida teicoplanina. La patente coreana No.
321304 describe en detalle un proceso para purificar teicoplanina,
que incluye una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba
utilizando una resina neutra de adsorción y una etapa de
cromatografía de afinidad inmovilizada de lecitina. En ese momento,
se selecciona la resina de adsorción neutra del grupo que consiste
de XAD 16, HP 20, gel de sílice y carbón activado. En esta patente,
se purifica directamente un caldo de cultivo filtrado por medio de
cromatografía de adsorción hidrófoba utilizando
HP-20 y similares, y así, es conveniente llevar a
cabo el proceso. Sin embargo, en caso de que el caldo de cultivo
filtrado extraído de una solución básica se adsorba en una resina,
tal como HP 20, de acuerdo con el proceso de la patente coreana No.
321304, se pierde una gran cantidad de teicoplanina en una etapa de
adsorción, y la pureza de la teicoplanina eluida por medio de un
gradiente de concentración de metanol es muy baja. Además, es
necesario remover el metanol con el propósito de aplicar la solución
a una resina inmovilizada de lecitina. Además, no es deseable la
aplicación en una producción a gran escala debido al costo de las
resinas inmovilizadas de lecitina.
De acuerdo con la publicación de la patente
coreana abierta a inspección pública No.
2003-0017067, después de que se adsorbe la
teicoplanina de un caldo de cultivo en una resina porosa de
adsorción, se lava la resina porosa de adsorción con ácido
clorhídrico diluido y se desorbe la teicoplanina de la resina de
adsorción utilizando una solución mezclada de agua y acetona. Se
concentra la solución que eluye que contiene teicoplanina por
medio de destilación al vacío, se la trata con un carbón activado, y
se la somete a un proceso de precipitación, y así se purifica la
teicoplanina. Sin embargo, la publicación de la patente coreana
abierta a inspección pública No. 2003-0017067 no es
conveniente ya que disminuyen la estabilidad y la actividad de la
teicoplanina debido a que se cambia continuamente el pH de un
líquido en proceso a ácido o a básico. Otras desventajas son que se
acortan el tiempo de vida y el ciclo de intercambio de la resina y
el rendimiento y la pureza de la recuperación de teicoplanina son
pobres debido a que se adsorben irreversiblemente fracciones dentro
de la resina. Mientras tanto, la publicación de la patente coreana
abierta a inspección pública No. 2003-0034949
describe un método para producir teicoplanina, que incluye la
purificación preliminar de teicoplanina a partir de un caldo de
cultivo a través de un proceso en dos etapas que utiliza resinas
porosas de adsorción, y la precipitación de teicoplanina a bajas
temperaturas y pH ligeramente ácido. Sin embargo, este método tiene
desventajas ya que el uso de una gran cantidad de solvente orgánico,
tal como n-propanol, isopropanol, y metanol, puede
ocasionar contaminación, y esa precipitación a baja temperatura y
pH ligeramente ácido reduce la solubilidad y la actividad de la
teicoplanina.
Además, es difícil la purificación de
teicoplanina del 95% o superior a través únicamente de un proceso de
purificación utilizando resinas porosas de adsorción. Por lo tanto,
se han llevado a cabo muchos estudios con resinas de fase inversa
para separar y purificar teicoplanina del caldo de cultivo. Por
ejemplo, se puede hacer referencia a un proceso sugerido por Riva y
colaboradores (Chromatographia Vol. 24; 295-301,
1987), y por la patente coreana No. 40453, y la publicación de las
patentes coreanas abiertas a inspección pública Nos.
2003-0092504 y
10-2004-0008745. Riva y
colaboradores propusieron un proceso para la purificación de
teicoplanina utilizando una columna Lichrosorb
RP-18. La patente coreana No. 40453 describe un
proceso para la separación de cada componente individual del
complejo A2 de teicoplanina utilizando una columna silanizada de gel
de sílice. En este momento, en el caso de utilizar la resina de
fase inversa, es posible producir teicoplanina más pura que en el
caso de un proceso de separación que utiliza una combinación de una
extracción, una resina de intercambio iónico, y una resina porosa
de adsorción. Sin embargo, la patente coreana No. 40453 es
problemática por la eficiencia económica ya que la resina en fase
inversa y el sistema de cromatografía de alta presión son ambos
costosos. Particularmente, se utiliza acetonitrilo, tóxico para el
sistema nervioso humano, en la elución de teicoplanina de la resina
en fase inversa en la patente coreana No. 40453. Además, la
publicación de la patente coreana abierta a inspección pública No.
2003-0092504 proporciona un método para purificar
teicoplanina, en el cual el caldo de cultivo libre de micelio pasa
directamente a través de una resina de fase inversa, tal como gel
de YMC ODS-A, o en el cual un líquido purificado en
forma tosca, pretratado con una resina de intercambio catiónico,
una resina de intercambio aniónico, o una resina de adsorción, pasa
a través de un gel de YMC ODS-A. Sin embargo, este
método no es conveniente ya que se utiliza acetonitrilo para la
elución, y por lo tanto, se debe controlar la cantidad residual de
acetonitrilo. Otra desventaja es que los costos de producción se
incrementan inevitablemente debido a que la resina de fase inversa
es frecuentemente reemplazada con una nueva. Igualmente, la
publicación de la patente coreana abierta a inspección pública No.
10-2004-0008745 describe un proceso
para purificación de teicoplanina a partir de un caldo de cultivo de
un microorganismo capaz de producir teicoplanina, que incluye una
etapa primaria de purificación que utiliza un adsorbente sintético,
una purificación secundaria que utiliza una resina de intercambio
catiónico, una resina catalítica, o una resina de quelato, una
etapa de purificación terciaria que utiliza una resina de fase
inversa, y una etapa final de liofilización. Sin embargo, la
publicación de la patente coreana abierta a inspección pública No.
10-2004-0008745 es desventajosa pues
a pesar de que se produce teicoplanina de alta pureza, el proceso es
muy complicado pues incluye una cantidad de etapas, y el
rendimiento de teicoplanina es muy bajo. Además, la publicación de
la patente coreana abierta a inspección pública No.
10-2004-0008745 tiene las mismas
desventajas, relacionadas con el uso de la resina en fase inversa,
que la publicación de la patente coreana abierta a inspección
pública No. 2003-0092504. La EP 241758 describe un
método para la purificación de teicoplanina que utiliza resina de
adsorción e incluye adsorción sobre carbón activado en la etapa de
aislamiento y ultrafiltración.
En consecuencia, las tecnologías convencionales
para la purificación de teicoplanina a partir del caldo de cultivo
son problemáticas porque no se produce una teicoplanina altamente
purificada que no contenga impurezas y fracciones coloreadas, no se
mantiene la estabilidad de la teicoplanina, se utilizan solventes
orgánicos tóxicos para los humanos durante la purificación, el
rendimiento es relativamente bajo y los costos de producción son
relativamente altos. Por lo tanto, subsiste la necesidad de
desarrollar una tecnología mejorada para purificar
teicoplanina.
Por lo tanto, la presente invención ha tenido en
cuenta las anteriores desventajas que se presentan en el estado del
arte, y un objetivo de la presente invención es el de proporcionar
un método para producir en forma económica y segura teicoplanina de
alta pureza. En este momento se lleva a cabo la producción de
teicoplanina en un pH neutro, estable.
Se puede lograr el objetivo anterior a través de
un método para producir teicoplanina de acuerdo con un primer
aspecto de la presente invención. Con el término "caldo de
cultivo" como se lo utiliza en lo sucesivo se quiere indicar el
caldo de cultivo filtrado elaborado a partir del micelio. El método
incluye (a) la elución de un caldo de cultivo de una cepa de
Actinoplanes teichomyceticus capaz de producir la
teicoplanina, adsorbida en una resina porosa de adsorción, la
producción a partir de la resina porosa de adsorción de un líquido
purificado en forma tosca que contiene teicoplanina, y (b) el
tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando un
carbón activado para recuperar la teicoplanina altamente pura.
En este momento, el método también incluye
ultrafiltración del líquido tratado con el carbón activado después
de la etapa (b).
El objetivo anterior se puede lograr a través de
un método para producir teicoplanina de acuerdo a un segundo
aspecto de la presente invención. El método incluye (a) la elución
de un caldo de cultivo de una cepa de Actinoplanes
teichomyceticus capaz de producir la teicoplanina, adsorbida en
una resina porosa de adsorción, la producción a partir de la resina
porosa de adsorción de un líquido purificado en forma tosca que
contiene teicoplanina, y (b) ultrafiltración del líquido purificado
en forma tosca para recuperar la teicoplanina altamente pura.
En este sentido, el método también incluye el
tratamiento del filtrado fruto de la ultrafiltración utilizando un
carbón activado después de la etapa (b).
El objetivo anterior se puede lograr a través de
un método para producir teicoplanina de acuerdo a un tercer aspecto
de la presente invención. El método incluye (a) ultrafiltración de
un caldo de cultivo de una cepa de Actinoplanes
teichomyceticus capaz de producir la teicoplanina, (b) la
elución del filtrado fruto de la ultrafiltración, adsorbido en una
resina porosa de adsorción, para producir a partir de la resina
porosa de adsorción un líquido purificado en forma tosca que
contiene teicoplanina, y (c) el tratamiento del líquido purificado
en forma tosca utilizando un carbón activado para recuperar la
teicoplanina altamente pura.
En este sentido, el método también
ultrafiltración del líquido tratado con el carbón activado después
de la etapa (c).
El objetivo anterior se puede lograr a través de
un método para producir teicoplanina de acuerdo a un cuarto aspecto
de la presente invención. El método incluye (a) ultrafiltración de
un caldo de cultivo de una cepa de Actinoplanes
teichomyceticus capaz de producir la teicoplanina, (b) la
elución del filtrado fruto de la ultrafiltración, adsorbido en una
resina porosa de adsorción, para producir a partir de la resina
porosa de adsorción un líquido purificado en forma tosca que
contiene teicoplanina, y (c) ultrafiltración del líquido purificado
en forma tosca para recuperar la teicoplanina altamente pura.
En este sentido, el método también incluye el
tratamiento del filtrado producto de la ultrafiltración utilizando
un carbón activado después de la etapa (c).
Adicionalmente, la cepa de Actinoplanes
teichomyceticus incluye a la cepa DKB 53 de Actinoplanes
teichomyceticus.
Además, un agente de elución para eluir
teicoplanina a partir de la resina porosa de adsorción incluye de
40 a 90% (v/v) de alcohol C1 a C4 miscible en agua con pH de 6,0 a
8,0, o de 40 a 90% (v/v) de cetona C3 a C6 miscible en agua con pH
de 6,0 a 8,0.
Alternativamente, un agente de elución para
eluir teicoplanina a partir de la resina porosa de adsorción puede
incluir una sal neutra.
Además, una sal neutra incluye una sal sódica o
una sal de potasio de 0,05 a 0,5 M.
Igualmente, la resina porosa de adsorción tiene
un radio de poro de 20 a 300 \ring{A}, y es al menos una
seleccionada del grupo que consiste de DOWEX OPTIPORE L493, DOWEX
OPTIPORE L323, DOWEX OPTIPORE SD-2, DIAION HP20,
DIAION HP2MG, DIAION HP20SS, SEPABEADS SP825, SEPABEADS SP 850,
SEPABEADS SP 700, SEPABEADS SP207, SEPABEADS SP20SS, AMBERLITE
XAD4, AMBERLITE XAD7, AMBERLITE XAD16, y AMBERLITE XAD1600T.
Se añade el carbón activado dentro del líquido
purificado en forma tosca en una proporción de 0,2 a 5 veces más en
peso que de teicoplanina entre 10 y 40ºC en el lapso de 12
horas.
Además, se añade el carbón activado dentro del
líquido purificado en forma tosca en una proporción de 0,5 a 3
veces más peso que de teicoplanina entre 18 y 36ºC en el lapso de
0,5 a 3 horas.
Además, el tratamiento del líquido purificado en
forma tosca utilizando el carbón activado incluye añadir
directamente el carbón activado en un líquido de proceso con un pH
de 6 a 8 pasando a través de la resina porosa de adsorción, o
añadiendo el carbón activado en el líquido de proceso diluido con
agua.
Adicionalmente, el carbón activado es al menos
uno seleccionado del grupo que consiste de AQUA NUCHAR, NUCHAR SA,
NUCHAR SA-20, NUCHAR SA-30, NUCHAR
SN, NUCHAR SN-20, NORIT A SUPRA EUR, NORIT B
SUPRA EUR, NORIT C EXTRA USP, NORIT CN 1, NORIT CN 3, DARCO
G 60, DARCO KB, DARCO KB-B, NORIT E SUPRA
USA, NORIT GBG, NORIT PN2, NORIT ROX 0.8, NORIT SX 1, NORIT SX 1G,
NORIT SX 2, NORIT SX PLUS, NORIT SX SUPRA E 153, NORIT SX
ULTRA, CAL 12X40, y GW 12X40.
Se remueve el carbón activado por medio de
filtración. Igualmente, se purifica adicionalmente el líquido
purificado en forma tosca por medio del método de adsorber el
líquido filtrado dentro de la resina porosa de adsorción, lavando
la resina porosa de adsorción usando agua, y eluyendo la
teicoplanina utilizando de 40 a 90% (v/v) de solvente orgánico C1 a
C4 miscible en agua.
Además, la resina porosa de adsorción que es
removida y que es utilizada después del carbón activado, tiene un
radio de poro de 20 a 300 \ring{A} y es al menos una seleccionada
del grupo que consiste de DOWEX OPTIPORE L493, DOWEX OPTIPORE L323,
DOWEX OPTIPORE SD-2, DIAION HP20, DIAION HP2MG,
DIAION HP20SS, SEPABEADS SP825, SEPABEADS SP 850, SEPABEADS SP 700,
SEPABEADS SP207, SEPABEADS SP20SS, AMBERLITE XAD4, AMBERLITE XAD7,
AMBERLITE XAD16, y AMBERLITE XAD1600T.
Una membrana, utilizada en la ultrafiltración
del caldo de cultivo o del líquido purificado en forma tosca, tiene
un corte de peso molecular de 3000 a 100000 Da.
Además, se lleva a cabo la ultrafiltración a una
temperatura de 8 a 30ºC, una presión de entrada de 0 a 4 bares y
una presión de retentado de 0 a 3,5 bares.
Alternativamente, se puede llevar a cabo la
ultrafiltración a una temperatura de 12 a 18ºC, una presión de
entrada de 0 a 4 bares y una presión de retentado de de 0 a 3,5
bares.
Igualmente, se elabora la membrana de
ultrafiltración de poliéter sulfona o celulosa regenerada, y es al
menos una seleccionada del grupo que consiste de Biomax, Ultracel,
PT y PL de módulo Prostak, Helicon, Sartocon, Ultrasart, OMEGA,
ALPHA, REGEN, SUPOR, Filmtec, y Kvick.
Como se describió anteriormente, la presente
invención es ventajosa ya que se lleva a cabo la producción de
teicoplanina dentro de una región de pH neutro, asegurando así la
alta estabilidad y mejorando la pureza de la teicoplanina. Otras
ventajas son que impurezas, tales como componentes coloreados son
claramente removidos, y es posible su aplicación en una producción
a gran escala de teicoplanina.
La presente invención ha sido descrita de una
manera ilustrativa, y se debe entender que la terminología utilizada
corresponde a la naturaleza de la descripción en vez de ser una
limitante. Son posibles muchas modificaciones y variaciones de la
presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo
tanto, se entiende que permaneciendo dentro del alcance de las
reivindicaciones anexas, se pude practicar la invención de otra
manera diferente a la específicamente descrita aquí.
\newpage
El anterior y otros objetivos, características y
otras ventajas de la presente invención se entenderán más
claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada
junto con los dibujos acompañantes, en los cuales:
La Fig. 1 ilustra resultados relacionados con un
análisis de teicoplanina por HPLC.
En lo sucesivo, se ofrecerá una descripción
detallada de la presente invención.
En la presente invención, se puede utilizar
cualquier cepa como microorganismo para producir teicoplanina
altamente pura siempre y cuando la cepa sea capaz de producir
teicoplanina. Con respecto a esto, los ejemplos de microorganismos
incluyen Actinoplanes teichomyceticus, tales como la cepa
DKB53 de Actinoplanes teichomyceticus (KCTC 10587BP) y el
Actinoplanes teichomyceticus ATCC31121 sugerido por la
patente estadounidense No. 4.239.751. Preferiblemente, se utiliza
la cepa DKB53 de Actinoplanes teichomyceticus (KCTC 10587BP)
para producir teicoplanina. Adicionalmente, se puede cultivar
opcionalmente el microorganismo bajo las siguientes
condiciones.
En otras palabras, una fuente de carbono
utilizada en un medio de cultivo para fermentación es ejemplificada
por glucosa, maltosa, sacarosa, y galactosa. En consideración a los
costos de las materias primas, es preferible utilizar almidón en el
medio para cultivo de semillas y se utiliza maltosa en un medio de
cultivo, para el cultivo de producción.
En caso de utilizar maltosa como fuente de
carbono, se prefiere que el medio de cultivo para la producción de
teicoplanina incluya de 40 a 100 g/l de maltosa, de 3 a 5 g/l de
extracto de levadura, de 5 a 10 g/l de harina de soja, de 5 a 10
g/l de harina de semilla de algodón, de 3 a 5 g/l de licor de
macerado de maíz (CSL), de 0,1 a 5 g/l de cloruro de sodio, y de
0,1 a 10 mg/l de elementos metálicos en trazas.
Cuando se cultiva la cepa DKB53 de
Actinoplanes teichomyceticus, se prefiere un rango óptimo de
pH de 6,8 \pm 0,2. En este momento, se prefiere que la
temperatura del cultivo sea de 28 a 34ºC.
Las condiciones óptimas de cultivo de la cepa
DKB53 de Actinoplanes teichomyceticus para producir
teicoplanina con alto rendimiento son las siguientes.
En una etapa temprana de la fermentación, es
preferible realizar el cultivo con una velocidad de flujo de aire
de 1,0 a 1,5 vvm, se mantiene la presión en un dispositivo de
fermentación entre 0,2 y 0,3 bares, la temperatura de fermentación
es de 28 a 34ºC, y se lleva a cabo la fermentación con una velocidad
de agitación de 140 a 200 rpm.
En una etapa intermedia de la fermentación, es
preferible incrementar gradualmente la velocidad de agitación hasta
un rango de 200 a 400 rpm en el lapso de 48 a 90 horas ya que se
inicia la fermentación. La razón para esto es que es preferible un
incremento gradual de la velocidad de agitación en vista de la tasa
de utilización del oxígeno (OUR). Más preferiblemente, después de
incrementar gradualmente la velocidad de agitación, se controla la
velocidad de flujo de aire entre 0,4 y 0,8 vvm mientras se mantiene
la presión en el dispositivo de fermentación entre 0,1 y 0,2 bares,
lo que conduce a un control apropiado de la presión parcial de
oxígeno.
De acuerdo con la presente invención, un método
para producir teicoplanina incluye una etapa de purificación
preliminar utilizando una resina porosa de adsorción bajo una
condición selectiva de elución y una etapa de recuperación de
teicoplanina altamente pura utilizando un carbón activado y/o
ultrafiltración. En este sentido, el método puede incluir además
una etapa de ultrafiltración como etapa previa de tratamiento antes
de que el caldo de cultivo sea adsorbido en la resina porosa de
adsorción con el fin de incrementar la pureza de la
teicoplanina.
Después de la fermentación, se controla el pH
del caldo de cultivo, en el cual se cultiva el microorganismo capaz
de producir teicoplanina, y a partir del cual se remueve el micelio,
hasta una región neutra de 6 a 8. En este sentido, se pueden
utilizar hidróxido de sodio o ácido clorhídrico para controlar el pH
del caldo de cultivo hasta la región neutra. Después de controlar
el pH del caldo de cultivo clarificado como se describió
anteriormente, no es necesario llevar a cabo un proceso adicional
para controlar el pH. Más preferiblemente, el pH del caldo de
cultivo clarificado como material de partida en la etapa de
purificación preliminar que utiliza la resina porosa de adsorción
es de 6,5 a 7,5. En este punto, se debe entender que el término
"resina porosa de adsorción" como se lo utiliza aquí pretende
incluir un adsorbente sintético con un radio de poro de 20 a 300
\ring{A}, que incluye un polímero que tiene grupos no iónicos de
intercambio, tales como un polímero de estireno y divinil benceno,
un polímero alifático o aromático entrecruzado y un adsorbente
metacrílico. En forma detallada, los ejemplos de la resina porosa
de adsorción incluyen DOWEX OPTIPORE L493, DOWEX OPTIPORE L323, y
DOWEX OPTIPORE SD-2, fabricada por Dow Chemical Co.,
DIAION HP20, DIAION HP2MG, DIAION HP20SS, SEPABEADS SP825,
SEPABEADS SP850, SEPABEADS SP700, SEPABEADS SP207, y SEPABEADS
SP20SS, fabricada por Mitsubishi Chemical Co., y AMBERLITE XAD4,
AMBERLITE XAD7, AMBERLITE XAD16, y AMBERLITE XAD1600T, fabricada por
Rohm & Haas Co.
Después de empacar la resina porosa de adsorción
en una columna, se aplica el caldo de cultivo sobre la columna, o
se añade la resina porosa de adsorción dentro del caldo de cultivo
en un recipiente y se agita la mezcla para adsorber teicoplanina
dentro de la resina porosa de adsorción. En este sentido, se puede
añadir alcohol C1 a C4 miscible con agua al caldo neutro de cultivo
preferiblemente en una cantidad menor al 40% (v/v), y más
preferiblemente, en una cantidad del 5 al 20% (v/v) para evitar la
adsorción de impurezas dentro de la resina porosa de adsorción y
para evitar la desnaturalización de la teicoplanina debido a una
enzima contenida en el caldo de cultivo. Se lava la resina porosa
de adsorción, incluida la teicoplanina adsorbida allí dentro, con
un líquido mezclado de 10 a 40% (v/v) de alcoholes C1 a C4 o cetonas
C3 a C6 y agua para remover la mayor parte de las impurezas o
componentes coloreados
de allí.
de allí.
Se puede eluir selectivamente la teicoplanina de
la resina porosa de adsorción controlando la concentración de sal
en el agente eluyente. El agente eluyente, utilizado para eluir la
teicoplanina adsorbida en la resina porosa de adsorción, incluye
una sal neutra de 0,05 a 0,5 M, y un líquido mezclado de alcohol C1
a C4 o cetona C3 a C6, y agua. La sal neutra está ejemplificada por
una sal de sodio, tal como cloruro de sodio y fosfato de sodio, y
una sal de potasio, tal como cloruro de potasio. Preferiblemente,
una concentración añadida de sal al agente eluyente es de 0,1 a 0,3
M. En el caso de utilizar el agente eluyente que contiene la sal, se
produce teicoplanina con una pureza relativamente alta en
comparación con el caso donde se utiliza el líquido mezclado de
solvente orgánico miscible en agua y agua, que no contiene sal, como
agente eluyente. Además, ya que se mantiene neutro el pH de un
líquido de proceso añadido a la resina porosa de adsorción, se evita
una epimerización de teicoplanina, que se presenta cuando el
líquido del proceso es básico, y la reducción de la actividad de la
teicoplanina, que se presenta cuando el líquido del proceso
es ácido.
es ácido.
La teicoplanina purificada en forma preliminar
que pasa a través de la resina porosa de adsorción puede ser
altamente purificada de acuerdo con un proceso de tratamiento con
carbón activado, un proceso de ultrafiltración, o un proceso
combinado de tratamiento con carbón activado y procesos de
ultrafiltración.
Se ha utilizado carbón activado para remover
diferentes impurezas, tales como componentes colorados y sustancias
con olores ofensivos, durante la producción de compuestos químicos,
productos alimenticios y compuestos farmacéuticos durante un largo
período de tiempo. Los ejemplos de carbón comercial activado
utilizado en la presente invención incluyen AQUA NUCHAR, NUCHAR SA,
NUCHAR SA-20, NUCHAR SA-30, NUCHAR
SN, y NUCHAR SN-20, fabricado por MeadWestvaco Co.,
NORIT A SUPRA EUR, NORIT B SUPRA EUR, NORIT C EXTRA
USP, NORIT CN 1, NORIT CN 3, DARCO G 60, DARCO KB, DARCO
KB-B, NORIT E SUPRA USA, NORIT GBG, NORIT PN
2, NORIT ROX 0.8, NORIT SX 1, NORIT SX 1G, NORIT SX 2, NORIT SX
PLUS, NORIT SX SUPRA E 153, y NORIT SX ULTRA, fabricado por
NORIT Nederland B.V., y CAL 12X40 y GW 12X40, fabricado por Calgon
Carbon Co.. Adicionalmente, se puede añadir carbón activado
directamente al líquido purificado en forma tosca pasándolo a
través de la resina porosa de adsorción o añadiéndolo después de la
dilución con agua. En otras palabras, el método de la presente
invención es ventajoso porque se puede añadir directamente el
carbón activado al líquido purificado en forma tosca que pasa a
través de la resina porosa de adsorción, o se lo puede añadir al
líquido purificado en forma tosca después de reducir la
concentración del solvente orgánico miscible en agua o de la sal
por medio de la adición de agua, y por lo tanto, se pueden obviar
la remoción del solvente orgánico, de la sal y los procesos de
concentración.
Después de medir el contenido de teicoplanina en
el líquido de proceso que pasa a través de la resina porosa de
adsorción utilizando HPLC (cromatografía líquida de alto
rendimiento) de acuerdo a un método como el descrito en la
Farmacopea Japonesa, se añade preferiblemente el carbón activado al
líquido del proceso en una cantidad 0,2 a 5 veces mayor que la
teicoplanina medida. Más preferiblemente, se añade el carbón
activado al líquido del proceso en una cantidad 0,5 a 3 veces mayor
que la teicoplanina medida. Después de añadir el carbón activado al
líquido del proceso, se revisa si el pH del líquido del proceso está
entre 6 y 8, o no. Se agita luego el líquido del proceso entre 10 y
40ºC en el lapso de 12 horas. Más preferiblemente, se trata el
líquido del proceso con el carbón activado entre 18 y 36ºC durante
0,5 a 3 horas, evitando así que la teicoplanina sea
irreversiblemente adsorbida en el carbón activado y promoviendo la
adsorción de la impurezas, tales como componentes coloreados, en el
carbón
activado.
activado.
Después de tratar el líquido del proceso con el
carbón activado, se filtra el líquido del proceso utilizando un
filtro KS 80 (fabricado por Pall Co.) o papel filtro número 4 de
Whatman (fabricado por Whatman International Ltd.) para remover el
carbón activado del líquido del proceso, y luego se lo pasa a través
de la columna, en la cual está empacada la resina porosa de
adsorción, o es adsorbida dentro de la resina porosa de adsorción
en un recipiente. Posteriormente, se lava la resina porosa de
adsorción con agua, y se eluye la teicoplanina de la resina porosa
de adsorción utilizando el agente de elución en el cual se mezcla
cualquiera de los alcoholes C1 a C4 miscibles en agua con agua en
una cantidad de 40 a 90% (v/v). Con respecto a esto, se selecciona
la resina porosa de adsorción del grupo que consiste de DOWEX
OPTIPORE L493, DOWEX OPTIPORE L323, DOWEX OPTIPORE
SD-2, DIAION HP20, DIAION HP2MG, DIAION HP20SS,
SEPABEADS SP825, SEPABEADS SP850, SEPABEADS SP700, SEPABEADS SP207,
SEPABEADS SP20SS, AMBERLITE XAD4, AMBERLITE XAD7, AMBERLITE XAD16, y
AMBERLITE XAD1600T.
Se aplica el proceso de ultrafiltración para
separar unas de otras las sustancias con diferentes pesos
moleculares de acuerdo a un corte de peso molecular de una membrana
de filtración. Los procesos de ultrafiltración de tipo continuo o
por lotes se llevan a cabo de acuerdo a las estructuras de la
membrana de filtración y un dispositivo de filtración. En la
presente invención, el término "ultrafiltración" significa
preferiblemente un tipo de ultrafiltración de flujo cruzado
continuo. De acuerdo con la presente invención, las impurezas en el
líquido del proceso que contiene teicoplanina purificada, utilizando
la resina porosa de adsorción y carbón activado, consisten
principalmente de macromoléculas tales como lípidos, proteína y
polisacáridos, o los componentes coloreados combinados con las
macromoléculas o están incluidos en las macromoléculas. Por lo
tanto, las impurezas tienen un peso molecular mayor que la
teicoplanina. La razón de por qué las impurezas consisten
principalmente de macromoléculas es que los productos metabólicos
con bajos pesos moleculares y componentes que resultan del medio de
cultivo, son removidos principalmente por la resina porosa de
adsorción y el carbón activado. El proceso de ultrafiltración no se
limita a un proceso para el tratamiento del líquido del proceso
purificado utilizando la resina porosa de adsorción y el carbón
activado. En otras palabras, se puede llevar a cabo el proceso de
ultrafiltración como un proceso de tratamiento previo antes de
tratar el líquido del proceso con la resina porosa de adsorción, y
se puede tratar luego el líquido del proceso purificado a través
del proceso de ultrafiltración con la resina porosa de adsorción y
carbón activado, pudiendo producir así teicoplanina altamente pura.
En caso de que el líquido del proceso purificado en forma tosca
tratado con la resina porosa de adsorción sea sometido al proceso
de ultrafiltración sin ser tratado con el carbón activado, la
pureza de la teicoplanina es del 90% (p/v) o más.
La membrana de ultrafiltración útil en el
proceso de ultrafiltración de la presente invención puede estar
elaborada con poliéter sulfona o celulosa regenerada, y tiene un
corte de peso molecular de 3.000 a 100.000 Da. Más preferiblemente,
el corte de peso molecular de la membrana de ultrafiltración es de
5.000 a 50.000 Da. La membrana de ultrafiltración es al menos una
seleccionada del grupo que consiste de membranas de ultrafiltración
Biomax y Ultracel del módulo de Pellicon, membranas de
ultrafiltración PT y PL del módulo de Prostak, PT, PL, y membranas
de ultrafiltración Helicon del módulo de filtración de Spiral Wound
Ultra, fabricadas por Millipore Co., membranas de ultrafiltración
Sartocon®, y Ultrasart®, fabricadas por Sartorius AG, membranas de
ultrafiltración OMEGATM, ALPHATM, REGENTM, SUPOR®, fabricadas por
Pall Co., membranas de ultrafiltración FilmtecTM, fabricadas por
Dow Chemical Co., y membranas de ultrafiltración KvickTM, fabricadas
por Amersham Pharmacia Biotech
Inc..
Inc..
Después de añadir el agua en el líquido del
proceso, de tratarlo con la resina porosa de adsorción, o de
tratarlo con el carbón activado y la resina porosa de adsorción,
para reducir el contenido de alcohol en el líquido del proceso
hasta un 20% (v/v) o menos, se lleva a cabo el proceso de
ultrafiltración entre 8 y 30ºC, más preferiblemente entre 12 y
18ºC, y con una presión de entrada (Pin) de 0 a 4 bares y una
presión de retentado de (Pret) de 0 a 3,5 bares. Más
preferiblemente, la presión de entrada es de 0 a 2,5 bares, y la
presión de retentado es de 0 a 2 bares. En el caso de que se
concentre el líquido del proceso hasta que el volumen del retentado
sea de 1/10 o menor del volumen del líquido del proceso antes de
someterlo al proceso de ultrafiltración, se puede utilizar un
proceso de ultrafiltración, en el cual se alimenta continuamente el
agua purificada en el retentado manteniendo un volumen constante.
En ese momento, el volumen del agua purificada es 0,5 a 5 veces
mayor que aquel del líquido del proceso antes de ser sometido al
proceso de ultrafiltración, y más preferiblemente, el volumen del
agua purificada es 1 a 2 veces mayor que aquel del líquido del
proceso antes de ser sometido al proceso de ultrafiltración.
El líquido del proceso, del cual se remueven las
impurezas poliméricas y los componentes coloreados por medio de la
membrana de ultrafiltración, y que contiene teicoplanina, es
concentrado utilizando un sistema de evaporación de película
delgada, un sistema de ósmosis inversa, o un sistema de destilación
al vacío. Después de añadir acetona al concentrado por medio de un
volumen de 3 a 10 veces mayor que el del concentrado para precipitar
teicoplanina durante una hora o más, se filtra el precipitado y
luego se lo seca para producir teicoplanina en polvo.
Habiendo descrito generalmente esta invención,
se puede obtener una mejor comprensión haciendo referencia a
ejemplos y ejemplos comparativos que se suministran aquí para
propósitos de ilustración únicamente y no pretenden constituirse en
limitantes a menos que se especifique otra cosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se filtraron 160 L del caldo de cultivo de la
cepa DKB 53 de Actinoplanes teichomyceticus utilizando un
filtro de tambor para remover un micelio de allí, y se obtuvieron
120 L de filtrado. Se analizó el filtrado por medio de una columna
de HPLC OPTIMAPAK® C18 (4,6 X 250 mm, RStech Co.). Se utilizó el 1er
Estándar Internacional de Teicoplanina (National Institute for
Biological Standards and Control, Hertfordshire, RU) como estándar
de referencia para cuantificación. Con respecto a eso, un contenido
y una cantidad total de teicoplanina en el filtrado fueron 4.2 g/L
y 504 g, respectivamente. Adicionalmente, el pH del filtrado fue de
6,8. Se añadieron 4 L de metanol a 20 L de filtrado (84 g de
teicoplanina), y se aplicó la mezcla resultante sobre una columna
(15 X 50 cm) empacada con 4 L de DOWEX OPTIPORE SD-2
con una velocidad de flujo de 2 BV (volumen de lecho)/h sin
controlar el pH de la mezcla resultante. Posteriormente, se cargaron
4 BV (16 L) de metanol al 30% (v/v) con una velocidad de flujo de 4
BV/h en la columna para lavar la resina empacada en la columna.
Además, se cargaron 8 BV (32 L) de metanol al 60% (v/v), que
contenía cloruro de sodio 0,15 M, en la columna con una velocidad
de flujo de 4 BV/h para eluir la teicoplanina. Se confirmó por medio
de un análisis de un eluato utilizando HPLC que un área de pico de
teicoplanina A2 era el 84,8% del área total del pico, y se produjo
una sustancia purificada en forma preliminar con una pureza
relativamente alta. Además, una cantidad de teicoplanina fue de
72,2 g, lo que significa que la recuperación de teicoplanina fue del
85,9% (consulte la Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 2 L de isopropanol a 20 L de caldo
de cultivo filtrado (84 g de teicoplanina) de acuerdo al ejemplo 1,
y se aplicó la mezcla resultante sobre una columna (15 X 50 cm)
empacada con 4 L de DOWEX OPTIPORE SD-2 con una
velocidad de flujo de 2 BV/h. Posteriormente, se cargaron 4 BV (16
L) de isopropanol al 15% (v/v) con una velocidad de flujo de 4 BV/h
dentro de la columna para lavar la resina empacada en la columna.
Además, se cargaron 8 BV (32 L) de isopropanol al 40% (v/v), que
contenía cloruro de sodio 0,15 M, en la columna con una velocidad
de flujo de 4 BV/h para eluir la teicoplanina. Se confirmó por medio
de un análisis de un eluato utilizando HPLC que un área de pico de
teicoplanina A2 era el 81,7% del área total del pico. Además, una
cantidad de teicoplanina era de 73,6 g, lo que significa que la
recuperación de teicoplanina fue del 87,6% (consulte la Tabla
1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 4 L de metanol a 20 L de caldo de
cultivo filtrado de acuerdo al ejemplo 1, y se aplicó la mezcla
resultante sobre una columna (15 X 50 cm) empacada con 4 L de Diaion
HP 20 con una velocidad de flujo de 2 BV/h. Posteriormente, se
cargaron 4 BV (16 L) de una solución al 30% (v/v) de metanol con una
velocidad de flujo de 4 BV/h en la columna para lavar la resina
empacada en la columna. Además, se cargaron 8 BV (32 L) de una
solución de metanol al 60% (v/v), que contiene cloruro de sodio 0,15
M, en la columna con una velocidad de flujo de 4 BV/h para eluir
teicoplanina. Fue confirmado por medio de un análisis de un eluato
utilizando HPLC que un área de pico de teicoplanina A2 era el 83,4%
de un área total de pico. Además, una cantidad de teicoplanina era
de 70,7 g, lo que significa que la recuperación de teicoplanina fue
del 84,2% (consulte la Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
1
Después de ajustar el pH del caldo de cultivo
filtrado del ejemplo 1 en 11 utilizando NaOH 1 N, se aplicaron 20 L
del filtrado sobre una columna (15 X 50 cm) empacada con 4 L de
Diaion HP 20 con una velocidad de flujo de 2 BV/h de acuerdo con un
proceso como el descrito en la patente coreana No. 321304.
Posteriormente, se cargaron metanol al 30% (v/v), al 50% (v/v), y
al 80% (v/v) con una velocidad de flujo de 2 BV/h dentro de la
columna. En este momento, una cantidad de cada solución de metanol
cargada en la columna fue de 4 BV (16 L). Se recolectaron todos los
eluatos que pasaron a través de la columna por medio de metanol al
50% (v/v) y al 80% (v/v) que contenían teicoplanina. Con respecto
a esto, se confirmó por medio de un análisis de eluatos mezclados
utilizando HPLC que un área de pico de teicoplanina A2 era el 67,4%
del área total del pico. Además, una cantidad de teicoplanina era
de 53,74 g, lo cual significa que la recuperación de teicoplanina
fue tan relativamente baja como 63,9% (consulte la Tabla 1). Los
contenidos de teicoplanina en una porción de la solución que pasa a
través de la columna sin ser adsorbida en Diaion HP 20 cuando se
aplicó el filtrado con un pH de 11 a la columna, y en eluato de
metanol al 30% (v/v) fueron del 11,8% y 21,7% del contenido de
teicoplanina en el caldo de cultivo filtrado, respectivamente. Por
lo tanto, se puede observar que se redujo el rendimiento de
teicoplanina debido al pH básico del caldo de cultivo filtrado
durante un proceso de adsorción utilizando la resina porosa de
adsorción y un proceso de lavado de la resina porosa de
adsorción.
adsorción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
2
Se mezclaron 20 L del caldo de cultivo filtrado
de acuerdo al ejemplo 1 con 4 L de metanol, y se aplicó la mezcla
resultante sobre una columna (15 X 50 cm) empacada con 4 L de Diaion
HP 20 con una velocidad de flujo de 1,2 BV/h. Posteriormente, se
cargaron 4 BV (16 L) de agua destilada con una velocidad de flujo de
2 BV/h dentro de la columna, y se cargaron luego 5 BV de
isopropanol al 20% (v/v) dentro de la columna para lavar la resina
empacada en la columna de acuerdo con un proceso como el descrito en
la publicación de la patente coreana abierta a inspección pública
No. 2003-0034949. Después de completar el lavado, se
cargaron 4,5 BV de isopropanol al 40% (v/v) dentro de la columna
para eluir teicoplanina de la columna. Se confirmó por medio de un
análisis de un eluato utilizando HPLC que un área de pico de
teicoplanina A2 era el 63,3% del área total del pico. Además, una
cantidad de teicoplanina fue de 71,2 g, lo cual significa que la
recuperación de teicoplanina fue del 84,8% (consulte la Tabla 1). A
partir de la comparación de los ejemplos 1, 2, y 3 con el ejemplo
comparativo 2, puede observarse que se produjo un líquido purificado
en forma tosca que tenía un contenido relativamente alto de
teicoplanina a partir de la resina porosa de adsorción en el caso de
utilizar al eluyente que contiene una sal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcló una porción de 32 L de líquido
purificado en forma tosca, que contenía teicoplanina, es decir, 8 L
de líquido purificado en forma tosca (18 g de teicoplanina), de
acuerdo con el ejemplo 1 con 8 L de agua destilada en un recipiente
con un volumen de 20 L. Se ajustó el pH de la mezcla en 7,0
utilizando NaOH 0,1 N. Posteriormente, se añadieron 18 g de Darco
KB-B como carbón activado a la mezcla, y se agitó la
mezcla resultante utilizando un agitador mecánico. En este momento,
la cantidad de carbón activado fue la misma que aquella de
teicoplanina en el líquido purificado en forma tosca.
Adicionalmente, se agitó la mezcla resultante a 28ºC durante 2
horas, y luego se filtró a través de un filtro KS 80 para remover el
carbón activado de la mezcla resultante. Se aplicó el líquido
filtrado sobre una columna (15 X 50 cm) empacada con 4 L de DOWEX
OPTIPORE SD-2 con una velocidad de flujo de 2 BV/h.
Posteriormente, se cargaron 4 BV (16 L) de agua destilada con una
velocidad de flujo de 4 BV/h en la columna para lavar la resina
empacada en la columna. Después de completar el lavado, se cargaron
2 BV (8 L) de metanol al 70% (v/v) en la columna para eluir la
teicoplanina de la columna. Se confirmó por medio de un análisis de
un eluato utilizando HPLC que la pureza de teicoplanina era del
94,7%, y una cantidad de teicoplanina fue del 13,1 g.
Se cargaron 20 L de agua destilada al eluato
para diluirlo de modo que se redujo una concentración de metanol
hasta el 20% (v/v) o menos. Se filtró el eluato diluido por medio de
una membrana de ultrafiltración Biomax 2 con un corte de peso
molecular de 50.000 Da y un área de filtración de 0,1 m^{2} con
una Pin de 1 bar y una Pret de 0,5 bares. Cuando el volumen del
retentado era de 2 L o menor, se alimentó el agua destilada
continuamente dentro del retentado con la misma velocidad de flujo
de la ultrafiltración. De este modo, se mantuvo un volumen del
retentado en 1,8 a 2 L durante el proceso de diafiltración. Un
volumen total del filtrado, incluida la etapa de diafiltración, fue
de 42 L. Se concentró el filtrado por medio de una membrana de
filtración para osmosis inversa (Nanomax-50,
Millipore Co.) con una Pin de 1,5 bares y una Pret de 0 bares, y el
volumen de un concentrado fue de 500 D. Se continuó la
concentración mientras se alimentaban 2 L de agua destilada al
concentrado manteniendo el volumen y se recuperaron 420 L del
concentrado. Con respecto a esto, se confirmó por medio de un
análisis del concentrado utilizando HPLC que la cantidad de
teicoplanina en el concentrado era de 11,8 g. Igualmente, se
añadieron lentamente 3,36 L de acetona al concentrado mientras se
agitaba el concentrado para precipitar teicoplanina durante 12
horas, y se filtró el concentrado resultante a través de papel
filtro Whatman No. 4 para recuperar un precipitado. Se secó el
precipitado en un secador al vacío a 40ºC durante 6 horas para
recuperar 10,2 g de teicoplanina en polvo.
Se disolvió la teicoplanina en polvo en el agua
destilada en tal forma que una concentración de la teicoplanina en
el agua destilada era de 50 mg/L, y se comparó una suspensión de
teicoplanina con teicoplanina que contenía Targocid® (Aventis) en
la misma concentración que la suspensión de teicoplanina para
evaluar la remoción de los componentes coloreados. En forma
detallada, se dispensaron la suspensión de teicoplanina y Targocid®
en pozos de una placa de 96 pozos, y se midieron sus absorbancias
con una longitud de onda de 405 nm utilizando un lector de
Microplacas THERMOmax (Molecular Devices Corp.). En consecuencia, la
teicoplanina en polvo de la presente invención tenía una
absorbancia menor que Targocid®. Por lo tanto, se puede observar que
se produjo teicoplanina con excelente decoloración de acuerdo con
la presente invención (consultar la Tabla 2). Con referencia a la
Fig. 1, se ilustran los resultados con relación al análisis de
teicoplanina, producida de acuerdo al ejemplo 4, utilizando una
columna OPTIMAPAK® C18. En este momento, la pureza de la
teicoplanina era del 97.8% (p/p).
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcló una porción de 32 L de líquido
purificado en forma tosca, que contenía teicoplanina, es decir, 8 L
de líquido purificado en forma tosca (18,4 g de teicoplanina), de
acuerdo con el ejemplo 2 con 8 L de agua destilada en un recipiente
con un volumen de 20 L. Se ajustó el pH de la mezcla en 7,0
utilizando NaOH 0,1 N. Posteriormente, se añadieron 18,4 g de
NUCHAR SN-20 como carbón activado a la mezcla. En
este momento, la cantidad de carbón activado era la misma que
aquella de la teicoplanina en el líquido purificado en forma tosca.
Adicionalmente, se agitó la mezcla resultante utilizando un agitador
mecánico a 28ºC durante 2 horas, y luego se filtró a través de un
filtro KS 80 para remover el carbón activado de la mezcla
resultante. Se aplicó el líquido filtrado sobre una columna (15 X
50 cm) empacada con 4 L de un DOWEX OPTIPORE SD-2
con una velocidad de flujo de 2 BV/h. Posteriormente, se cargaron 4
BV (16 L) de agua destilada con una velocidad de flujo de 4 BV/h en
la columna para lavar la resina empacada en la columna. Después de
completar el lavado, se cargaron 2 BV (8 L) de isopropanol al 40%
(v/v) en la columna para eluir la teicoplanina de la columna. Se
confirmó por medio de un análisis de un eluato utilizando HPLC que
la pureza de la teicoplanina era del 93,6%, y la cantidad de
teicoplanina fue de 13,4 g.
Se añadieron 24 L de agua destilada al eluato
para diluirlo de modo que se redujo la concentración de isopropanol
hasta un 10% (v/v) o menos. Se filtró el eluato diluido a través de
una membrana de ultrafiltración Sartocon con un corte de peso
molecular de of 30.000 Da y un área de filtración de 0,1 m^{2} con
una Pin de 1 bar y una Pret de 0,5 bares. Cuando el volumen del
retentado era de 2 L o menor, se alimentó continuamente el agua
destilada dentro del retentado con la misma velocidad de flujo de la
ultrafiltración. De este modo, se mantuvo el volumen del retentado
entre 1,8 y 2 L durante la diafiltración. El volumen total del
filtrado, incluida el agua destilada utilizada en la diafiltración,
fue de 48 L. Se concentró el filtrado por medio de una membrana de
filtración de ósmosis inversa (Nanomax-50, Millipore
Co.) con una Pin de 1,5 bares y una Pet de 0 bares, y el volumen
del concentrado fue de 480 L. Se continuó la concentración mientras
que 2 L de agua destilada eran alimentados al concentrado para
mantener el volumen y se recuperaron 460 L de concentrado. Con
relación a esto, se confirmó por medio del análisis del concentrado
utilizando HPLC que la cantidad de teicoplanina en el concentrado
era de 11,9 g. Igualmente, se añadieron lentamente 3,68 L de acetona
al concentrado mientras se lo agitaba para precipitar la
teicoplanina durante 12 horas, y se filtró el concentrado resultante
por medio de un papel filtro Whatman No. 4 para recuperar el
precipitado. Se secó el precipitado en un secador al vacío a 40ºC
durante 6 horas para recuperar teicoplanina en polvo. Se analizó la
teicoplanina en polvo utilizando HPLC, y la pureza y la cantidad de
la teicoplanina en polvo eran del 97,1% (v/v) y 10,7 g,
respectivamente. Como en el caso del ejemplo 4, se disolvió la
teicoplanina en polvo en el agua destilada en tal forma que la
concentración de la teicoplanina en el agua destilada era de 50
mg/L, y se midió la absorbancia de la suspensión de teicoplanina
con una longitud de onda de 405 nm (consultar la Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron 20 L de caldo de cultivo filtrado
de acuerdo con el ejemplo 1 a un proceso de ultrafiltración antes
de que fuera adsorbido dentro de una resina porosa de adsorción. En
forma detallada, se sometieron 20 L del caldo de cultivo filtrado
de acuerdo al ejemplo 1 a una ultrafiltración por medio de una
membrana de ultrafiltración Biomax 2 montada en un sistema
ETU-11 para MF/UF (Millipore Co.), que tiene un
corte de peso molecular de 50.000 Da y un área de filtración de 0,5
m^{2}, a una Pin de 2,0 bares y una Pret de 1,0 bar sin controlar
el pH del caldo de cultivo. En este momento, cuando el volumen del
retentado era de 2 L o menos, se alimentó agua destilada al
retentado con la misma velocidad de flujo de la ultrafiltración. El
volumen total del filtrado, incluida la diafiltración, era de 50 L.
Se analizó el filtrado por medio de HPLC con el uso de una columna
OPTIMAPAK® C18 (4,6 X 250 mm, RStcch Co.). Con respecto a esto, el
contenido y la cantidad total de teicoplanina en el filtrado fueron
de 1.58 g/ L y 79 g, respectivamente. Por lo tanto, el rendimiento
en la recuperación de teicoplanina fue del 94%. Se aplicó el
filtrado sobre una columna (15 X 50 cm) empacada con 4 L de DOWEX
OPTIPORE SD-2 con una velocidad de flujo de 2 BV
(volumen de lecho)/h. Posteriormente, se cargaron 4 BV (16 L) de
metanol al 30% (v/v) con una velocidad de flujo de 4 BV/h dentro de
la columna para lavar la resina empacada en la columna. Además, se
cargaron 8 BV (32 L) de metanol al 60% (v/v), que contenían
cloruro de sodio 0,15 M, en la columna con una velocidad de flujo de
4 BV/h para eluir la teicoplanina. Se confirmó por medio del
análisis de un eluato utilizando HPLC que el área de pico de la
teicoplanina A2 era del 87,4% del área total del pico. Igualmente,
la cantidad de teicoplanina era de 70 g, lo que significa que la
recuperación de teicoplanina fue del 88,6%.
Se añadieron 17,5 g de Darco
KB-B como carbón activado en una porción de 32 L de
eluato pasando a través de la resina porosa de adsorción, es decir,
8 L de eluato (que contenían 17,5 g de teicoplanina), y se agitó la
mezcla resultante utilizando un agitador mecánico a 28ºC durante 2
horas. Se filtró la mezcla agitada por medio de un filtro KS 80
para remover el carbón activado de la mezcla. Se aplicó el líquido
filtrado sobre una columna (5 X 30 cm) empacada con 0,4 L de DOWEX
OPTIPORE SD-2 con una velocidad de flujo de 4 BV/h.
Posteriormente, se cargaron 4 BV (1,6 L) de agua destilada con una
velocidad de flujo de 4 BV/h dentro de la columna para lavar la
resina empacada en la columna. Después de completar el lavado, se
cargaron 2 BV (800 L) de metanol al 70% (v/v) en la columna para
eluir la teicoplanina de la columna. Se concentró el metanol al 70%
(v/v), que fue eluido de la resina y contenía teicoplanina, por
medio de destilación al vacío hasta que su volumen fue de 200 L. Se
añadieron lentamente 1,6 L de acetona al concentrado mientras se lo
agitaba para precipitar la teicoplanina durante 8 horas, y se
filtró la mezcla resultante por medio de papel filtro Whatman No. 4
para recuperar el precipitado. Se secó el precipitado en un secador
al vacío a 40ºC durante 6 horas para recuperar 10,9 g de
teicoplanina en polvo. Se suspendió luego la teicoplanina en polvo
en agua destilada de modo que la concentración de la teicoplanina
era de 1 mg/L. Se confirmó por medio de un análisis utilizando HPLC
que la pureza de la teicoplanina era del 95,8% (p/p).
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcló una porción de 32 L de líquido
purificado en forma tosca, que contenía teicoplanina, y se la pasó
a través de una resina porosa de adsorción, es decir, 8 L de líquido
purificado en forma tosca (18 g de teicoplanina), de acuerdo con el
ejemplo 1 con 16 L de agua destilada. La mezcla fue sometida a
ultrafiltración con una membrana de ultrafiltración Biomax 2
montada en un sistema ETU-11 para MF/UF (Millipore
Co.), que tiene un corte de peso molecular de 50.000 Da y un área
de filtración de 0,5 m^{2}, a una Pin de 2,0 bares y una Pret de
1,0 bar. En este momento, cuando el volumen del retentado era de 2
L o menos, se alimentó agua destilada al retentado con la misma
velocidad de flujo de la ultrafiltración. El volumen total del
filtrado, incluida la diafiltración, era de 36 L. Se concentró el
filtrado por medio de una membrana de ósmosis inversa
(Nanomax-50, Millipore Co.) a una Pin de 1,5 bares
y una Pret de 0 bares, y el volumen del concentrado fue de 500 L.
Posteriormente, se continuó el proceso de concentración mientas se
alimentaban 4 L de agua destilada al concentrado con la misma
velocidad de flujo de la ósmosis inversa y se recuperaron 380 L de
concentrado. Se añadieron lentamente 3 L de acetona al concentrado
mientras se agitaba el concentrado para precipitar teicoplanina
durante 12 horas, y se filtró la mezcla resultante a través de
papel filtro Whatman No. 4 para recuperar un precipitado. Se secó
el precipitado en un secador al vacío a 40ºC durante 6 horas para
recuperar 12,9 g de teicoplanina en polvo. Se disolvió luego la
teicoplanina en polvo en agua destilada de tal manera que la
concentración de teicoplanina fue de 1 mg/L. Se confirmó por medio
de un análisis utilizando HPLC que la pureza de la teicoplanina era
del 90,2% (p/p).
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
\bullet US 4239751 A [0004] [0004] [0005]
[0006] [0040]
\bullet KR 36780 [0005]
\bullet KR 118034 [0005] [0005]
\bullet KR 367890 [0005]
\bullet EP 241758 A [0006] [0006] [0006]
[0009]
\bullet KR 321304 [0006] [0007] [0007]
[0067]
\bullet KR 20030017067 [0006] [0008]
[0008]
\bullet KR 20030034949 [0006] [0008]
[0069]
\bullet KR 184644 [0006] [0006]
\bullet KR 40453 [0009] [0009] [0009]
[0009]
\bullet KR 20030092504 [0009] [0009]
[0009]
\bullet KR 1020040008745 [0009] [0009] [0009]
[0009]
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletThe Journal of Antibiotics,
1978, vol. 31, 170-177 [0004]
\bulletHeydorn y colaboradores, J.
of Biochem., 2000, vol. 275, 6201-6206
[0006]
\bulletRiva y colaboradores,
Chromatographia, 1987, vol. 24,
295-301 [0009].
Claims (15)
1. Un método para producir teicoplanina, que
comprende:
- (a)
- ultrafiltración de un caldo de cultivo de una cepa de Actinoplanes teichomyceticus capaz de producir la teicoplanina;
- (b)
- la elución con alcohol del filtrado fruto de la ultrafiltración, adsorbido en una resina porosa de adsorción, para producir a partir de la resina porosa de adsorción un líquido purificado en forma tosca, que contiene teicoplanina; en donde la resina porosa de adsorción, utilizada en la elución de la teicoplanina a partir de la resina porosa de adsorción, incluye de 40 a 90% (v/v) de alcohol C1 a C4 miscible en agua con pH de 6,0 a 8,0, o de 40 a 90% (v/v) de cetona C3 a C6 miscible en agua con pH de 6,0 a 8,0; y
- (c)
- el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando un carbón activado para recuperar la teicoplanina altamente pura, en donde el tratamiento del líquido purificado en forma tosca utilizando el carbón activado incluye la adición directa del carbón activado dentro del líquido del proceso con un pH de 6 a 8 pasando a través de la resina porosa de adsorción, o añadiendo el carbón activado dentro del líquido del proceso diluido con agua.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método como el expuesto en la
reivindicación 1, que comprende además la ultrafiltración del
líquido tratado con el carbón activado después de la etapa (c).
3. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la cepa de Actinoplanes
teichomyceticus incluye a la cepa DKB 53 de Actinoplanes
teichomyceticus.
4. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el agente de elución, utilizado
en la elución de la teicoplanina a partir de la resina porosa de
adsorción, incluye una sal neutra.
5. El método como el expuesto en la
reivindicación 4, en donde una sal neutra incluye una sal sódica o
una sal de potasio de 0,05 a 0,5 M.
6. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la resina porosa de adsorción
tiene un radio de poro de 20 a 300 \ring{A}, y es al menos una
seleccionada del grupo que consiste de DOWEX OPTIPORE L493, DOWEX
OPTIPORE L323, DOWEX OPTIPORE SD-2, DIAION HP20,
DIAION HP2MG, DIAION HP20SS, SEPABEADS SP825, SEPABEADS SP 850,
SEPABEADS SP 700, SEPABEADS SP207, SEPABEADS SP20SS, AMBERLITE XAD4,
AMBERLITE XAD7, AMBERLITE XAD16, y AMBERLITE XAD1600T.
7. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se añade el carbón activado en
el líquido purificado en forma tosca en una proporción de 0,2 a 5
veces más en peso que de teicoplanina para adsorber al líquido
purificado en forma tosca entre 10 y 40ºC en el lapso de 12
horas.
8. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se añade el carbón activado en
el líquido purificado en forma tosca en una proporción de 0,5 a 3
veces más en peso que de teicoplanina para adsorber al líquido
purificado en forma tosca entre 18 y 36ºC en el lapso de 0,5 a 3
horas.
9. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el carbón activado es al menos
uno seleccionado del grupo que consiste de AQUA NUCHAR, NUCHAR SA,
NUCHAR SA-20, NUCHAR SA-30, NUCHAR
SN, NUCHAR SN-20, NORIT A SUPRA EUR, NORIT B
SUPRA EUR, NORIT C EXTRA USP, NORIT CN 1, NORIT CN 3, DARCO G
60, DARCO KB, DARCO KB-B, NORIT E SUPRA USA,
NORIT GBG, NORIT PN2, NORIT ROX 0.8, NORIT SX 1, NORIT SX 1G, NORIT
SX 2, NORIT SX PLUS, NORIT SX SUPRA E 153, NORIT SX ULTRA,
CAL 12X40, y GW 12X40.
10. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el tratamiento del líquido
purificado en forma tosca utilizando el carbón activado comprende la
filtración del líquido purificado en forma tosca para remover el
carbón activado del líquido purificado en forma tosca, la adsorción
del líquido filtrado dentro de la resina porosa de adsorción,
lavando la resina porosa de adsorción usando agua, y eluyendo la
teicoplanina utilizando de 40 a 90% (v/v) de solvente orgánico C1 a
C4 miscible en agua.
11. El método como el expuesto en la
reivindicación 10, en donde la resina porosa de adsorción tiene un
radio de poro de 20 a 300 \ring{A}, y es al menos una
seleccionada del grupo que consiste de DOWEX OPTIPORE L493, DOWEX
OPTIPORE L323, DOWEX OPTIPORE SD-2, DIAION HP20,
DIAION HP2MG, DIAION HP20SS, SEPABEADS SP825, SEPABEADS SP 850,
SEPABEADS SP 700, SEPABEADS SP207, SEPABEADS SP20SS, AMBERLITE XAD4,
AMBERLITE XAD7, AMBERLITE XAD16, y AMBERLITE XAD1600T.
\newpage
12. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la membrana de ultrafiltración,
utilizada cuando se ultrafiltra el caldo de cultivo o el líquido
purificado en forma tosca, tiene un corte de peso molecular de
3.000 a 100.000 Da.
13. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se lleva a cabo la
ultrafiltración a una temperatura de 8 a 30ºC, una presión de
entrada de 0 a 4 bares y una presión de retentado de 0 a 3,5
bares.
14. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se lleva cabo la
ultrafiltración a una temperatura de 12 a 18ºC, una presión de
entrada de 0 a 4 bares y una presión de retentado de 0 a 3,5
bares.
15. El método como el expuesto en cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en donde se elabora la membrana de
ultrafiltración de poliéter sulfona o celulosa regenerada, y es al
menos una seleccionada del grupo que consiste de Biomax, Ultracel,
PT y PL de módulo Prostak, Helicon, Sartocon, Ultrasart, OMEGA,
ALPHA, REGEN, SUPOR, Filmtec, y Kvick.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020040026354A KR100474653B1 (ko) | 2004-04-16 | 2004-04-16 | 타이코플라닌의 고순도 생산방법 |
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