ES2331884T3

ES2331884T3 - Vesiculas extracelulares de amebas no patogenicas utiles para la transferencia de una molecula de interes a una celula eucariotica.

Info

Publication number: ES2331884T3
Application number: ES04743927T
Authority: ES
Inventors: Irene Tatischeff; Annette Alfsen; Francoise Lavialle
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie
Priority date: 2003-07-15
Filing date: 2004-07-13
Publication date: 2010-01-19
Anticipated expiration: 2024-07-13
Also published as: WO2005004925A1; US20070104738A1; CA2531865A1; EP1644045A1; US7722855B2; ATE439865T1; CA2531865C; EP1644045B1; DE602004022676D1; EP1498144A1; US7790196B2; DK1644045T3; US20100178702A1

Abstract

Método para preparar una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés seleccionada de entre el grupo que consiste de una molécula terapéutica, un agente de formación de imágenes y un agente diagnóstico, comprendiendo las etapas que consisten de: a) cultivar una ameba no patogénica en un medio de cultivo que comprende dicha molécula exógena de interés, bajo condiciones suficientes para permitir que la célula ameba no patogénica libere vesículas, b) recuperar una vesícula liberada por dicha célula, conteniendo la vesícula dicha molécula exógena de interés, con la condición de que dicha vesícula no sea una vesícula de Dictyostelium discoideum que contiene Hoechst 3334

Description

Vesículas extracelulares de amebas no patogénicas útiles para la transferencia de una molécula de interés a una célula eucariótica.

La invención se refiere a vesículas membranales de amebas no patogénicas, en particular de Dictyostelium discoideum (Dd), que contienen una molécula de interés, a un método de preparación de dichas vesículas y a los usos de dichas vesículas como vehículo para transferir la molécula de interés a una célula eucariótica.

Recientemente se ha demostrado que diferentes procesos celulares comunes a los organismos multicelulares dependen del tráfico activo de vesículas dirigidas, y que por lo tanto se encuentran relacionados con la dinámica y composición de la membrana celular. Las vesículas sinápticas del sistema nervioso central, las vesículas denominadas "exosomas" en el sistema inmunológico, así como la gemación vírica a partir de células infectadas, son todos ejemplos de rutas de transmisión de información de una célula a otra. Se ha demostrado que los exosomas se originan a partir de endosomas tardíos o de cuerpos multivesiculares (MVB) (Kobayashi et al., 1998). La fusión de exosomas con las células del sistema inmunológico induce la estimulación de las mismas (Kobayashi et al., 2002). La composición de proteínas de estos exosomas aparentemente es dependiente de la célula, con algunos componentes comunes, tales como Tetraspan CD63 y CD82, que desempeñan un papel importante en el transporte de los exosomas.

Los inventores han demostrado anteriormente que las células de Dictyostelium discoideum (Dd), un microorganismo eucariótico, cultivadas en presencia del pigmento de ADN específico de (A-T) Hoechst 33342 (HO342) expulsan eficientemente material fluorescente hacia el medio de cultivo de las mismas. En efecto, las células Dd vivas, que son altamente resistentes a los xenobióticos, no muestran núcleos vitalmente teñidos, mientras que estas células Dd fijadas en metanol al 70% muestran núcleos aparentemente altamente fluorescentes, debido a la permeabilización de la membrana nuclear y a la tinción adicional de los núcleos por el HO342 restante asociado a las células (Tatischeff et al., 1998). La microscopía electrónica y el análisis de lípidos ha demostrado la naturaleza vesicular del material fluorescente externalizado y la presencia de HO342 asociado a dichas vesículas se ha confirmado mediante espectroscopía de fluorescencia. También se ha demostrado que las células Dd vivas liberan vesículas hacia el medio externo de las mismas, tanto durante su crecimiento como bajo condiciones de ayuno (Tatischeff et al., 1998; Tatischeff et al., 2001).

Los inventores han postulado que las vesículas Dd externalizadas podrían participar en la comunicación intercelular entre células Dd. Para mejorar la comprensión de la función de las vesículas Dd, se prepararon vesículas a partir del medio de crecimiento de células Dd cultivadas en presencia de HO342, o a partir de medio de ayuno de las mismas células sometidas a ayuno durante 22 horas en tampón sin HO342. HO342, una molécula hidrofóbica bis-benzimidazol cargada positivamente que es una tinción de ADN específica de (A-T), muestra características de fluorescencia que dependen de su ambiente y del estado de asociación. Estas características se han utilizado para realizar el seguimiento del estado de HO342 en el interior de las vesículas Dd. Los inventores han demostrado la capacidad de las vesículas que contienen pigmento de mediar en la transferencia del pigmento fluorescente a núcleos de células Dd vivas no expuestas, y más importante, dirigen eficientemente el pigmento a los núcleos de las células humanas, tanto sensibles como resistentes a múltiples fármacos. Resulta interesante que la eficiencia de transferencia de HO342 a las células por parte de las vesículas Dd se encontró que era mejor que la transferencia mediada por liposomas que contienen el pigmento. Estos resultados identifican a las vesículas Dd como mediadores de la comunicación intercelular.

Debido a que se ha demostrado que otras amebas liberan vesículas extracelulares, estos resultados indican adicionalmente que las vesículas de ameba no patogénica resultan útiles como nuevas vesículas para el transporte de una molécula de interés, en particular una molécula terapéutica, a células eucarióticas, tales como células de mamífero. Además, estas vesículas presentan una membrana plasmática cuya composición es similar a la de las células de mamífero y carece de factores de virulencia. Esta falta de carácter patogénico permite un uso seguro de las vesículas, evitando simultáneamente efectos secundarios, tales como el choque séptico que podría producirse con vesículas originadas en otros microorganismos, tales como bacterias. De esta manera, las vesículas según la invención podrían encontrar aplicaciones en la vacunación, la terapia génica o cualquier otro tratamiento terapéutico o profiláctico en el que pueda resultar necesaria la transferencia de una molécula de interés a una célula eucariótica.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "ameba no patogénica" se refiere a un protozoo que pertenece a la clase ameba, que no resulta patogénica para una célula eucariótica viva o para un organismo vivo. Entre los ejemplos de ameba no patogénica se incluyen, por ejemplo, Dictyostelium amoebae, tal como Dictyostelium discoideum, o amebas del género Acanthamoeba, tal como Acanthamoeba royreba, o del género Entamoeba, tal como Entamoeba histolytica. Preferentemente, la ameba no patogénica según la invención es Dictyostelium discoideum.

"Dictyostelium discoideum", también denominado "D. discoideum" o "Dd", es un protozoo no patogénico del suelo que crece en forma de células independientes separadas. Tras la exposición a condiciones adversas, por ejemplo el ayuno, la ameba D. discoideum interacciona mediante quimiotaxis, mediante la liberación y transporte de AMPc, formando estructuras multicelulares y agregándose para formar una masa circundada por una matriz extracelular. Las células de D. discoideum comprenden o muestras muchos rasgos característicos de las células eucarióticas superiores, por ejemplo la citoquinesis, la motilidad, la fagocitosis, la quimiotaxis, la transducción de señales, así como procesos de biología del desarrollo, tal como separación celular, formación de patrones y determinación de tipo celular. Bajo condiciones de crecimiento, la ameba permanece en una célula no diferencia y se multiplica mediante mitosis. Tras el ayuno severo, las células de D. discoideum se agregan en masas multicelulares y se diferencian en dos tipos celulares principales.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "vesículas de ameba no patogénica" se refiere a vesículas extracelulares que son liberadas por células de ameba no patogénica. En particular, la expresión "vesículas de D. discoideum" se refiere a vesículas redondas extracelulares, según se observa mediante microscopía electrónica, que son liberadas por células Dd vivas hacia el medio externo de las mismas durante el crecimiento o el ayuno. El tamaño de dichas vesículas es generalmente inferior a 500 nm; preferentemente está comprendido entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 500 nm, todavía preferentemente de entre 100 y 300 nm. Dichas vesículas están compuestas de una bicapa lipídica que contiene una fracción citosólica. La bicapa lipídica de las vesículas de D. discoideum contiene habitualmente fosfolípidos (fosfatidilcolina (PC), ácido fosfatídico (PA), fosfoatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG), difosfatidilglicerol (DPG)), esfingomielina (Sph), así como el lisofosfolípido ácido liso-bisfosfatídico (LBPA).

La expresión "molécula de interés" se refiere a cualquier molécula, tal como una molécula terapéutica, o una molécula de marcaje, para la que puede desearse la transferencia a una célula eucariótica. Además, dicha molécula de interés puede ser un agente de formación de imágenes útil en el diagnóstico médico, tal como un agente de contraste de formación de imágenes de resonancia magnética, un agente de formación de imágenes de ultrasonidos, o un agente formación de imágenes nuclear. Preferentemente, la molécula de interés es exógena a la ameba no patogénica. El término "exógeno" tal como se utiliza en la presente invención es sinónimo de "heterólogo", es decir, se refiere a una molécula que no se encuentra naturalmente en las vesículas de ameba no patogénica, o a una molécula que no expresan las células de ameba no patogénica en crecimiento. Dicha molécula puede ser un péptido, polipéptido, proteína, ácido nucleico (oligonucleótidos o polinucleótidos de ADN o ARN), lípido, o más generalmente, cualquier molécula química, biológica o sintética. Preferentemente, dependiendo del objetivo de la invención, dicha molécula de interés no es Hoechst 33342 (también denominada HO342). La molécula de interés puede ser transportada sobre (es decir, en la membrana) o dentro (es decir, en el lumen) de las vesículas de la invención.

En el contexto de la invención, la expresión "molécula terapéutica" se refiere a cualquier molécula activa capaz de invertir, aliviar, inhibir el progreso o evitar un trastorno o condición patológica, o un síntoma de dicho trastorno o condición. Entre las moléculas terapéuticas pueden incluirse una proteína/péptido terapéutico pequeño (interleuquinas, factores de crecimiento, quimoquinas), una hormona, una proteína tal como un enzima o un receptor, un ácido nucleico tal como un oligodesoxinucleótido, o un ADN (en particular en la forma de un plásmido de ADN) o ARN codificante de un péptido o proteína farmacológico, así como un ácido nucleico antisentido, ribozima o "ARNs interfirientes pequeños" (siARNs) que bloquean la traducción de un ARNm específico. Entre las moléculas terapéuticas más generalmente se incluye cualquier molécula biológica, química o sintética que es conocido que consigue un efecto terapéutico in vitro y/o in vivo, tal como agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de cánceres,
infecciones, etc.

El término "transferencia" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a la introducción de la molécula de interés en células.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "célula eucariótica" se refiere a una célula que presenta un núcleo que contiene un cromosoma circundado por la membrana apropiada del mismo, que aísla el núcleo del citoplasma. Dicha expresión se aplica a una célula de cualquier microorganismo unicelular (eucariótico), hongo, así como plantas, animales y seres humanos. Preferentemente dicha célula eucariótica es heteróloga respecto a la ameba no patogénica, en particular dicha célula es una célula de mamífero, por ejemplo una célula humana, de ratón, de oveja o de mono. Todavía preferentemente, dicha célula de mamífero, en particular una célula humana, es, de manera natural o inducida, resistente a múltiples fármacos.

Las expresiones "farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción no deseada al administrarse en un animal, o en un ser humano, según resulte apropiado.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares. La utilización de dichos medios y agentes para las sustancias activas farmacéuticas es bien conocida de la técnica. Excepto en los casos en que cualquier medio o agente convencional resulte incompatible con el ingrediente activo, la utilización del mismo en las composiciones terapéuticas se encuentra contemplada. También pueden incorporarse en las composiciones ingredientes activos suplementarios.

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Preparación de vesículas de ameba no patogénica

La invención proporciona un método para preparar vehículos vesiculares útiles para transferir una o más moléculas de interés a una célula eucariótica, siendo dichos vehículos una vesícula de ameba no patogénica, preferentemente una vesícula de Dictyostelium discoideum, que contiene dichas moléculas de interés.

De esta manera, la invención se refiere a un método para preparar una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula de interés, comprendiendo dicho método etapas que consisten en:

a) cultivar una célula de ameba no patogénica en un medio de cultivo que comprende dicha molécula de interés, bajo condiciones suficientes para permitir que la célula de ameba no patogénica libere vesículas,

b) recuperar una vesícula liberada por dicha célula, vesícula que contiene dicha molécula de interés.

Preferentemente dicha molécula de interés es exógena a la ameba no patogénica. También preferentemente, dicha molécula de interés no es Hoechst 33342.

Debido a que las vesículas de la presente pueden utilizarse para administrar una amplia diversidad de composiciones farmacéuticas y fármacos, la molécula de interés preferentemente es un ácido nucleico, un compuesto orgánico o inorgánico pequeño, tal como un agente bioactivo. Entre los ejemplos de agentes farmacéuticos o bioactivos se incluyen, aunque sin limitación, agentes antimicrobianos, antibióticos, agentes antimicobacterianos, antifúngicos o antivíricos, agentes que afectan a la respuesta inmunológica, reguladores del calcio sanguíneo, agentes útiles en la regulación de la glucosa, anticoagulantes, antitrombóticos, antihiperlipidémicos, fármacos cardiacos, fármacos tiromiméticos y antitiroideos, adrenérgicos, agentes antihipertensivos, colinérgicos, anticolinérgicos, antiespasmódicos, agentes antiulcerativos, relajantes de músculos esqueléticos y lisos, prostaglandinas, inhibidores generales de la respuesta alérgica, antihistamínicos, anestésicos locales, analgésicos, antagonistas narcóticos, antitusivos, agentes sedativos-hipnóticos, anticonvulsivos, antipsicóticos, agentes antiansiedad, agentes antidepresivos, anorexigénicos, agentes antiinflamatorios antiesteroideos, agentes antiinflamatorios esteroideos, antioxidantes, agentes vasoactivos, agentes osteoactivos, agentes antiartríticos y agentes antineoplásicos.

En particular, la molécula de interés puede ser un agente antineoplásico, tal como vincristina, doxorubicina, hipericina, mitoxantrona, camptotecina, cisplatino, bleomicina, ciclofosfamida, metotrexato, estreptozotocina y similares.

La molécula de interés también puede ser un agente de formación de imágenes o un agente diagnóstico que debe dirigirse, por ejemplo, a un tejido neoplásico. En particular, el agente diagnóstico puede ser un agente de formación de imágenes para seguir la progresión de una enfermedad. Entre los agentes de formación de imágenes se incluyen, por ejemplo, quelatos de radionucleidos, tales como tecnecio-99 o yodo-125.

Según una primera realización, las vesículas extracelulares se recuperan directamente de un medio de cultivo en el que se cultivaron células de ameba no patogénica en presencia de la molécula de interés. Dichas vesículas pueden recuperarse, por ejemplo, tras alcanzar la etapa de crecimiento exponencial tardía (o el final de la misma).

Según una segunda realización, pueden cultivarse y crecer células de ameba no patogénica, por ejemplo hasta la etapa de crecimiento exponencial tardía (o el final de la misma), en un primer medio de cultivo apropiado para sostener el crecimiento celular y en presencia de la molécula de interés. A continuación, pueden transferirse las células de ameba no patogénica a un segundo medio de cultivo, opcionalmente en presencia de la molécula de interés, bajo condiciones suficientes para que las células de ameba no patogénica liberen vesículas extracelulares. En particular, dicho segundo medio de cultivo puede privarse totalmente de los nutrientes necesarios para sostener el crecimiento celular ("medio de ayuno"). Las vesículas de ameba no patogénica seguidamente se recuperan de dicho segundo medio de cultivo "de ayuno".

Las condiciones adecuadas para cultivar amebas no patogénicas son conocidas por el experto ordinario en la materia.

Ventajosamente, la ameba no patogénica de la invención es Dictyostelium discoideum. Las vesículas de D. discoideum son naturalmente liberadas de las células de D. discoideum, sin necesidad de exponer dichas células a un estímulo de estrés, tal como un estrés químico o un estrés térmico, por ejemplo. Además, se reconoce en la técnica que las células de D. discoideum resultan particularmente fáciles de cultivar. Las amebas crecen sobre un cultivo bacteriano confluyente o en cultivos líquidos de medio semidefinido o completamente definido con tiempos de duplicación de entre 3 y 12 horas. Pueden cultivarse más de 10^{10} células de D. discoideum en unos cuantos días sin equipos sofisticados. Las cantidades superiores a dicha cantidad de células requieren el cultivo en biorreactores y ya han sido experimentadas (Poppenborg et al., 1997). De esta manera, el experto en la materia podrá definir fácilmente las condiciones de cultivo apropiadas. Dichas condiciones pueden comprender, por ejemplo, cultivar las células en suspensión en un medio de cultivo, por ejemplo medio semidefinido HL5, que contenga una fuente de carbono adecuada, tal como extracto de levadura, tal como describen Sussman (1987) y Watts y Ashworth (1970). El cultivo de células de D. discoideum se detalla más exhaustivamente en los ejemplos siguientes. El periodo de cultivo puede ser variable, por ejemplo comprendido entre 24 y 96 horas, preferentemente entre 48 y 72 horas. La duración del cultivo puede ser fácilmente ajustada por el experto en la materia en dependencia del número de células inoculadas en el medio de cultivo y de la cantidad de vesículas que deben recolectarse.

La invención ventajosamente utiliza la resistencia elevada a los xenobióticos mostrada por las células de D. discoideum. De hecho, las células de D. discoideum expuestas a una molécula de interés, en particular a una molécula exógena, presentan la capacidad de incorporar dicha molécula y de expulsarla al medio de cultivo mediante las vesículas liberadas al espacio extracelular. Las vesículas de D. discoideum pueden encapsular grandes cantidades de moléculas de interés, tales como moléculas terapéuticas, dentro de sus interiores acuosos o disueltas en las regiones hidrocarburadas de sus bicapas lipídicas.

La molécula de interés puede añadirse a las células en cultivo, preferentemente al iniciar el cultivo o durante la etapa de crecimiento exponencial. La concentración de la molécula de interés en el medio de cultivo puede ser ajustada por el experto en la materia de manera que dicha molécula no muestre toxicidad hacia las células de ameba no patogénica. El experto en la materia podrá determinar fácilmente las concentraciones adecuadas mediante experimentación rutinaria, por ejemplo mediante comparación de la tasa de crecimiento o la proliferación de células de ameba no patogénica cultivadas en presencia o no de la molécula de interés. Resulta importante que los inventores han encontrado que la concentración de la molécula de interés en el lumen de las vesículas se correlaciona con la concentración de la molécula de interés en el medio de cultivo. De esta manera, el método de la invención permite modular la concentración de la molécula de interés encapsulada dentro de las vesículas mediante el ajuste de la concentración de dicha molécula en el medio de cultivo.

Las vesículas de ameba no patogénica se separan de las células de ameba no patogénica, se aíslan del medio de cultivo y opcionalmente se concentran. Con este fin, las células cultivadas pueden eliminarse mediante centrifugación (por ejemplo a 700 g durante 5 minutos) y el sobrenadante resultante seguidamente puede clarificarse mediante otra etapa de centrifugación (por ejemplo 2.000 g durante 10 minutos). Las vesículas pueden peletizarse mediante ultracentrifugación de 12.000 a 105.000 g. Sin embargo, la recuperación de las vesículas extracelulares no debe considerarse limitada por la presente realización y se entenderá que cualquier medio apropiado que permita aislar las vesículas se encuentra comprendido dentro del alcance de la invención. Puede mencionarse, por ejemplo, la ultrafiltración, la nanofiltración, la separación biomagnética y la cromatografía, tal como la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de afinidad, etc.

Las vesículas obtenidas de esta manera pueden almacenarse durante varias semanas a 4ºC. Son muy estables y pueden resistir varios ciclos de congelación/descongelación en nitrógeno líquido.

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Células y vesículas de ameba no patogénica

Asimismo, la invención se refiere a una célula de ameba no patogénica, en particular a una célula de D. discoideum, que ha sido cultivada en presencia de una molécula de interés y a las vesículas extracelulares obtenidas mediante un método tal como el descrito anteriormente.

Más específicamente, la vesícula según la invención es una vesícula procedente de una ameba no patogénica que contiene una molécula de interés, con la condición de que dicha vesícula no sea una vesícula de D. discoideum que contenga Hoechst 33342. Preferentemente, dicha vesícula es una vesícula de D. discoideum. También preferentemente, dicha molécula de interés es exógena a la ameba no patogénica.

Los inventores han demostrado que las vesículas de D. discoideum transfieren eficientemente HO342 a células humanas resistentes a múltiples fármacos. Debido a que HO342 es un sustrato conocido de Pgp, una proteína implicada en la resistencia celular a múltiples fármacos, este resultado apoya que las vesículas de D. discoideum, y más generalmente las vesículas de ameba no patogénica, constituyan un vehículo útil para la administración de moléculas terapéuticas en células, en particular aquéllas que muestran resistencia a múltiples fármacos.

De esta manera, preferentemente dicha molécula de interés puede ser una molécula terapéutica, tal como un agente antitumoral. Los agentes antitumorales pueden ser fármacos quimioterapéuticos que inician citotoxicidad mediante interacciones con una diversidad de dianas moleculares. Entre los fármacos quimioterapéuticos pueden incluirse, por ejemplo, inhibidores de topoisomerasa, agentes alquilantes que forman compuestos con los centros nucleofílicos de ADN y proteínas, compuestos de platino, antimetabolitos piridimidina y purina o fármacos con diana en microtúbulos. La mayoría de fármacos contra el cáncer inducen la muerte celular, por lo menos parcialmente, mediante sucesos corriente abajo que conducen a la muerte celular programada, o apóptosis. Además, dicho agente antitumoral puede ser un citoquina, capaz de incrementar la respuesta inmunológica inducida por un antígeno tumoral y, de esta manera, estimular las defensas del huésped frente a un tumor. Dicha molécula también puede ser un compuesto Mr pequeño, tal como un fármaco antitumoral o el factor inductor de diferenciación (DIF) de D. discoideum, que se encuentra estructuralmente relacionado con el fármaco antitumoral llamado diferanisol A.

La resistencia de novo y adquirida a múltiples agentes antitumorales puede resultar de varios factores y procesos alternativos. Sin embargo, los patrones de resistencia a múltiples fármacos (MDR) con frecuencia se encuentran asociados a una acumulación reducida de fármaco, habitualmente debida a un flujo de salida incrementado del fármaco, principalmente mediado por transportadores ABC, por ejemplo la glucoproteína P (MDR1, P-170) o los miembros recientemente identificados de la familia de la proteína de resistencia a múltiples fármacos (MRP, P-180). Otra proteína relacionada con la resistencia a múltiples fármacos, la proteína de resistencia pulmonar (LRP), se identificó como una proteína "vault" mediante comparación con la secuencia de proteínas de Dictyostelium (Izquierdo et al., 1996). En lo sucesivo, dichas proteínas y genes codificantes se denominan conjuntamente proteínas y genes "MDR", respectivamente. De acuerdo con lo anterior, una molécula terapéutica según la invención puede ser además una molécula que silencie la expresión de una proteína MDR o que evite la proteína MDR. Tal como se ha indicado anteriormente este enfoque puede utilizar, por ejemplo, ácidos nucleicos antisentido o ribozimas que bloquean la traducción de un ARNm específico, enmascarando este ARNm con un ácido nucleico antisentido o cortándolo con un ribozima. Para un comentario general de la tecnología antisentido ver, por ejemplo, "Antisense DNA and ARN" (Cold Spring Harbor Laboratory, D. Melton, editor, 1988). La inhibición breve reversible de la transcripción del gen MDR también puede resultar útil. Dicha inhibición puede conseguirse mediante la utilización de siARNs. La tecnología de ARNs de interferencia (ARNi) evita la expresión de los genes mediante la utilización de moléculas pequeñas de ARN, tales como "ARNs interfirientes pequeños" (siARNs). Esta tecnología, a su vez, aprovecha el hecho de que el ARNi es un mecanismo biológico natural para silenciar genes en la mayoría de células de muchos organismos vivos, de plantas, insectos y mamíferos (Sharp, 2001). El ARNi evita que un gen produzca una proteína funcional al garantizar que el intermediario molecular, la copia de ARN mensajero del gen, resulte destruida. Podrían utilizarse los siARNs en una forma desnuda e incorporarse en una vesícula según la invención.

Sin embargo, otras moléculas terapéuticas se encuentran contempladas y la invención no debe limitarse al campo de la terapia del cáncer. Entre las moléculas terapéuticas potenciales, pueden mencionarse moléculas útiles para el tratamiento de una infección, en particular una infección bacteriana, vírica o parasitaria. Dichas moléculas pueden ser un péptido antigénico, un anticuerpo, un antibiótico, un agente antivírico, tal como interferón, un agente antiproteasa, etc. Por ejemplo, en el caso de que la vesícula de la invención esté destinada a la vacunación, la molécula de interés ventajosamente puede ser un péptido antigénico asociado a un adyuvante, tal como un lipopolisacárido (LPS), adyuvante de Freund, o cualquier otro adyuvante conocido de la técnica. Además, las vesículas de la invención pueden utilizarse para transportar inmunoglobulinas A (IgA) a células epiteliales intestinales de manera que se consiga la vacunación mucosal.

Además, la estrategia de silenciación de MDR dada a conocer anteriormente puede encontrar aplicación adicional en el contexto del tratamiento de la mucoviscidosis. De hecho, la eficacia del tratamiento quimioterapéutico de la mucoviscidosis, que está destinado al tratamiento y a la prevención de la infección bacteriana de los bronquios obstruidos, puede resultar comprometida por la aparición de resistencias a fármacos tras la administración de los mismos. Por lo tanto, los medios que contengan vesículas de ameba no patogénica (cadenas antisentido, siARN, etc.) para silenciar la expresión del transportador o transportadores responsables de la resistencia a fármacos, o los compuestos químicos capaces de evitar las proteínas de resistencia a fármacos, podrían demostrar su utilidad para incrementar la eficacia del tratamiento de la mucoviscidosis.

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Las vesículas de ameba no patogénica como vehículos de administración y usos de las mismas

Las vesículas de ameba no patogénica anteriormente indicadas comprenden vehículos útiles para transportar una molécula de interés a una célula diana. Tras resultar incorporadas por una célula diana, las vesículas de ameba no patogénica facilitan la liberación citoplasmática y/o nuclear de una molécula encapsulada de interés, tal como una molécula terapéutica, mediante la fusión con las membranas endosómicas y/o nucleares.

Además, tal como se demuestra en los ejemplos siguientes, las vesículas de ameba no patogénica D. discoideum demostraron ser más eficientes que los liposomas en la transferencia de HO342 a las células vivas de D. discoideum. Sin respaldo teórico, se cree que esta eficiencia mejorada de transferencia puede deberse a que la composición de la bicapa lipídica de las vesículas de D. discoideum es más similar a la de las membranas celulares citoplasmáticas y endosómicas. Esta similitud podría facilitar que las vesículas de ameba no patogénica, y en particular las vesículas de D. discoideum, se fusionasen con las membranas celulares y de esta manera liberasen el material contenido en su interior o en la bicapa lipídica.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la invención se refiere además a un vehículo útil para la transferencia in vitro y/o in vivo de una molécula de interés en una célula eucariótica, en particular una célula de mamífero, consistiendo o comprendiendo dicho vehículo una vesícula de D. discoideum tal como se ha indicado anteriormente. Dicho vehículo puede consistir o comprender una vesícula de D. discoideum que contiene Hoechst 33342.

La invención también se refiere a la utilización de una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula de interés, tal como se ha indicado anteriormente, incluyendo una vesícula de D. discoideum que contiene Hoechst 33342, como vehículo útil para la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo de una molécula de interés a una célula eucariótica, en particular a una célula de mamífero.

Preferentemente dicha ameba no patogénica es D. discoideum.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se proporciona un método para la transferencia in vitro y/o ex vivo de una molécula de interés en una célula eucariótica, comprendiendo dicho método la etapa consistente en poner en contacto una célula eucariótica con un vehículo según la invención, es decir, una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula de interés, incluyendo una vesícula de D. discoideum que contiene Hoechst 33342, bajo condiciones suficientes para permitir que la vesícula de ameba no patogénica se fusione con la célula eucariótica, de manera que se transfiera la molécula de interés a la célula eucariótica. Dicho contacto puede llevarse a cabo por ejemplo mediante el cultivo de dicha célula eucariótica en presencia de vesículas de ameba no patogénica. Preferentemente dicha molécula de interés es exógena a la ameba no patogénica. Preferentemente dicha ameba no patogénica es Dictyostelium discoideum.

Se proporciona adicionalmente un método para la transferencia in vivo de una molécula de interés a una célula eucariótica, comprendiendo dicho método la etapa que consisten en poner en contacto una célula eucariótica con un vehículo según la invención, es decir una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula de interés, incluyendo una vesícula de D. discoideum que contiene Hoechst 33342, bajo condiciones suficientes para permitir que la vesícula de ameba no patogénica se fusione con la célula eucariótica, de manera que la molécula de interés se transfiera a la célula eucariótica. Más específicamente, dicho método puede comprender administrar en un mamífero una vesícula de ameba no patogénica que contenga una molécula de interés, bajo condiciones adecuadas para permitir que la vesícula de ameba no patogénica se fusione con una célula de dicho mamífero, de manera que la molécula de interés se transfiera a dicha célula. Preferentemente, dicha molécula de interés es exógena a la ameba no patogénica. Preferentemente dicha ameba no patogénica es Dictyostelium discoideum.

La vesícula de ameba no patogénica puede administrarse, por ejemplo, siguiendo cualquier vía adecuada habitualmente utilizada en la técnica, en la que deba administrarse un liposoma u otro medio de administración de vesículas membranales. Por ejemplo, puede contemplarse la administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.

La vesícula de ameba no patogénica según la invención puede administrarse sólo o en forma de una composición, mezclada con un portador fisiológicamente aceptable (tal como solución salina fisiológica o tampón fosfato) seleccionado de acuerdo con la vía de administración y la práctica farmacéutica estándar. La composición puede contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según resulte necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponadoras, agentes ajustadores de la tonicidad y similares, por ejemplo acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, etc. Además, la composición puede incluir agentes lipoprotectores, que protegen a los lípidos frente a radicales libres y a daños peroxidativos de los lípidos durante el almacenamiento. Los protectores lipofílicos libres de radicales, tales como el tocoferol y los quelantes hidrosolubles específicos del hierro, tales como ferrioxamina, resultan adecuados.

De esta manera, una composición farmacéutica que comprende una vesícula de ameba no patogénica, en particular una vesícula de D. discoideum, que contiene una molécula terapéutica conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable se encuentra comprendido dentro del alcance de la invención. De hecho, mediante la utilización de dichas vesículas de ameba no patogénica, la invención proporciona un método para el tratamiento de enfermedades que pueden mejorar mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de las vesículas de ameba no patogénica que contienen la molécula terapéutica. Éstas pueden ser, por ejemplo, enfermedades caracterizadas por la expresión aberrante de un gen en un sujeto mamífero, incluyendo tumores. Dicha molécula terapéutica puede ser, en particular, un componente ácido nucleico antisentido que se hibride específicamente con el gen aberrantemente expresado. Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico. Para los oligonucleótidos antisentido, lo anterior significa generalmente entre 0,5 y 50 mg/kg de peso corporal, aunque, administrados en una formulación de partículas lipídicas, debe utilizarse una cantidad de lípidos inferior a la tóxica.

Preferentemente, dichas vesículas pueden utilizarse para la terapia de trastornos patológicos en los que puede surgir un fenotipo de resistencia a múltiples fármacos, tal como cáncer, mucoviscidosis, etc. Además, dichas vesículas también pueden utilizarse para suplementar un gen mutado defectivo.

La solicitud se entenderá más completamente a partir de las figuras y ejemplos siguientes.

Figuras

La figura 1 es una representación del análisis de espectros de emisión de fluorescencia de Hoechst 33342 excitado a 350 nm, libre o acomplejado con ADN, lípidos o detergente SDS. (a) El pico de emisión a 475 nm era de muy baja intensidad (a.u.) para HO342 libre (4 a 44 \mug/ml en tampón A). (b) Para HO342 (8 \mug/ml) añadido a ADN(Cp) a una proporción [pb]/[pigmento]\approx2, el pico de emisión a 450 nm fue de una intensidad mucho más alta (x100). HO342 asociado a LUV, que explica la difusión de segundo orden más elevada a 700 nm, mostró las mismas características espectrales. (c) En presencia de SDS al 2%, los espectros de emisión de HO342 (4 a 44 \mug/ml) alcanzaron un pico en 470 nm, aunque la intensidad fue mucho más alta (x170) que la de HO342 libre en tampón A. (d) Se comparó la adición de SDS al 2% a complejo de ADN-HO342 (tal como en b) con adición de SDS al 2% a HO342 8 \mug/ml en tampón A. Todos los espectros de emisión alcanzaron un pico aproximadamente en 470 nm, aunque no se produjo ningún incremento de intensidad para lípido-HO342 y únicamente un incremento \approx2 para ADN-HO342, en comparación con un factor de 170 para HO342 libre.

La figura 2 ilustra los espectros de emisión de fluorescencia de vesículas extracelulares de Dictyostelium. (a) Espectros de emisión de vesículas Dd A1 "12.000" y "105.000" en comparación con los espectros de las vesículas C1 correspondientes, excitadas a 350 nm: ambos espectros A1, de intensidad muy débil, alcanzaron un pico en 452 nm, mientras que los espectros C1 mostraron únicamente un fondo de fluorescencia entre 400 y 500 nm. Todos los picos de difusión de segundo orden a 700 nm fueron relativamente elevados. (b) Espectros de emisión de vesículas Dd A2 "12.000" y "105.000", en comparación con los espectros de las vesículas C2 correspondientes, excitadas a 350 nm: los picos de difusión elevados a 350 nm enmascaraban los espectros de emisión de intensidad baja. (c) Espectros de emisión de vesículas Dd A1 y C1 tal como en (a), tras la adición de SDS (concentración final: 2%): para las vesículas A1 tanto "12.000" como "105.000", el máximo de fluorescencia se desplazó hacia 470 nm y la intensidad se incrementó en un factor de \approx25 (observar que la escala para I_{f} en (c) es 10x la escala en (a). Por el contrario, los espectros de las vesículas C1 no resultaron modificados por la adición de SDS. (d) Espectros de emisión de vesículas Dd A2 y C2 tal como en (b), tras la adición de SDS (concentración final: 2%). Para las vesículas A2 tanto "12.000" como "105.000", el máximo de fluorescencia se desplazó hacia 470 nm y la intensidad se incrementó en un factor de \approx10 (la escala para I_{f} en (d) es 2x la escala en (b)). Los picos de difusión de segundo orden a 700 nm se redujeron en gran parte. Los espectros de fluorescencia de las vesículas C2 no resultaron modificados por la adición de SDS, aunque también se observó la reducción de los picos de difusión.

La figura 3 representa los espectros de emisión de fluorescencia de vesículas extracelulares Dd A1 "12.000" como función de la concentración de Hoechst 33342 y el tiempo de incubación con células de Dictyostelium durante el crecimiento. (a) Curva de crecimiento de las células Dd, mantenidas continuamente con HO342 (10 \mug/ml) desde el inicio del cultivo a una densidad de 3x10^{6} células/ml. Las imágenes de células Dd fijadas en MeOH al 70% como función del tiempo (72 a 216 horas), muestran el aspecto de las células y los núcleos de las mismas teñidos con HO342 durante la etapa meseta estacionaria. (b) Espectros de emisión de vesículas A1 "12.000" concentradas (x20) preparadas en diferentes tiempos (24 horas a 165 horas) en los medios de crecimiento correspondientes de (a). Se muestran los espectros de emisión excitados a 350 nm con y sin la adición de SDS al 2%, tal como se describe en la figura 2 (observar la doble escala Y). (c) Se muestran los espectros de emisión, excitados a 350 nm, de una suspensión (5x10^{6} células/ml en tampón A) de células Dd fijadas, en t'_{95} con y sin adición de SDS al 2%, para la comparación con los espectros de emisión correspondientes de las vesículas A1 "12.000" en t'_{95} de (b). (d) Espectros de emisión obtenidos bajo las mismas condiciones que en (b) para vesículas A1 "12.000" concentradas (x20), purificadas a partir de diferentes medios de cultivo de células Dd cultivadas en paralelo durante 24 horas en presencia de concentraciones crecientes de HO342 (concentración final: 2,2 a 17,4 \mug/ml).

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Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y métodos Células de Dictyostelium \bulletCrecimiento y tinción vital con HO342

Se cultivaron células Dd, cepa Ax-2 clonada, en suspensión en medio semidefinido HL5 (Sussman, 1987; Watts y Ashworth, 1970) en un agitador giratorio (150 rpm) a 22ºC. Para la correcta oxigenación, cada suspensión se cultivó en un Erlenmeyer con una capacidad cinco veces superior al volumen de suspensión, con adición de antibióticos (Biomedia) (penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 U/ml)). Las células Dd fueron capaces de crecer y dividirse a expensas de nutrientes solubles o particulados, produciendo células vegetativas, que se utilizaron generalmente en la etapa exponencial tardía de crecimiento para el ayuno.

En el presente trabajo, las células se cultivaron tal como anteriormente (control) o en presencia de HO342 (Molecular Probes). Se preparó solución madre de HO342 (\approx1 mg/ml) en agua desionizada, se esterilizó mediante filtración (0,22 \mum), se almacenó a -20ºC, y se diluyó hasta la concentración apropiada (4 a 44 \mug/ml) al iniciar el cultivo con HO342. Para la mayoría de experimentos, las células se incubaron con HO342 durante 24 horas. En algunos experimentos, las células se incubaron con HO342 (10 \mug/ml) durante periodos de tiempo comprendidos entre 24 horas y 216 horas. Las células, cultivadas con o sin HO342, se utilizaron adicionalmente para la preparación de vesículas y, ocasionalmente, para el ayuno antes de la preparación de las vesículas, sin adición de HO342 durante el periodo de ayuno.

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\bulletAyuno

Para iniciar el ayuno celular, las células al final del crecimiento exponencial (con o sin HO342) se recolectaron mediante centrifugación a 700 g durante 5 minutos, se lavaron dos veces en tampón de fosfato de potasio helado (17 mM, pH 6,8) (tampón A) y se resuspendieron en este tampón a una densidad de 4x10^{7} células/ml en el tiempo 0 (t_{0}). Las células se sometieron a ayuno durante 22 horas en un agitador giratorio (150 rpm) a 22ºC bajo condiciones de oxigenación apropiada.

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\bulletFijación celular

En unos cuantos experimentos, se prepararon células Dd cultivadas en presencia de HO342 tal como se ha indicado para el ayuno, aunque se resuspendieron a una densidad de 2x10^{7} células/ml en metanol frío (-20ºC):tampón A (70:30 v/v). La fijación se consiguió tras 10 minutos a -20ºC y las células se mantuvieron a 4ºC hasta su utilización.

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\bulletPreparación de vesículas

Al final del periodo de crecimiento de las células con HO342 o después del mismo periodo para las células cultivadas sin HO342, las células se recolectaron y se prepararon ambos medios de crecimiento libres de células mediante centrifugación a 700 g durante 5 minutos y se mantuvieron a 4ºC. El medio de ayuno t_{22} se preparó de la misma manera. Para la preparación de las vesículas, cada medio se clarificó mediante centrifugación a 2.000 g durante 10 minutos (4ºC), dando lugar a un sobrenadante S/2.000. Se prepararon vesículas "12.000" a partir de S/2.000 mediante centrifugación a 12.000 g durante 20 minutos (4ºC). Las vesículas "105.000" se obtuvieron a partir de S/12.000 mediante centrifugación a 105.000 g durante 45 minutos (4ºC). Los pellets P/12.000 y P/105.000 se resuspendieron y se concentraron (x50) en Tris-HCl 40 mM, pH 7,4, sacarosa 250 mM, ditiotreitol 5 mM, EDTA 2 mM (tampón B) y antiproteasas. Todos los reactivos químicos eran de Sigma. Las vesículas se denominaron, respectivamente, A1 en el caso de la preparación con medio de crecimiento con HO342, y C1 sin HO342 (control). Las vesículas preparadas a partir de medio de ayuno t_{22} se denominaron, respectivamente, A2 (HO342) y C2 (control).

Todas las vesículas, almacenadas a 4ºC, eran altamente estables y pudieron almacenarse hasta 6 semanas hasta su utilización.

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Líneas celulares leucémicas humanas K562

Se mantuvieron células K562 de eritroleucemia (ATCC nº CCL-243) en suspensión en un matraz de 25 cm^{2} (Corning) para el cultivo de tejidos utilizando medio RPMI 1640 suplementado con suero de feto bovino al 10% (Biomedia), glutamina (2 mM) y antibióticos (Biomedia) (penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 U/ml)). Las células se cultivaron en una atmósfera de 5% de CO_{2} y humidificada al 95%, a 37ºC. La línea celular K562r resistente, que expresa la glucoproteína P resistente a múltiples fármacos, se seleccionó a partir de la línea celular K562 sensible normal tal como ha sido descrito (Loetchutinat et al., 2003). Con el fin de mantener la expresión de la glucoproteína P, el medio de las células K562r se suplementó con colchicina 60 ng/ml.

Para los experimentos, se recolectaron las células K562 a una densidad aproximada de 10^{6} células/ml. Tras el recuento celular en un hemocitómetro Bürker, las células se ccentrifugaron (5 minutos, 300 g) y se resuspendieron a una densidad de 10^{7} células/ml en medio RPMI 1640 con suero de feto bovino al 10%.

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SDS-PAGE

Tras la cuantificación de las concentraciones de proteína de las vesículas Dd mediante el método de Peterson (Peterson et al., 1977), se llevó a cabo SDS-PAGE (8% o 12%) según Laemmli (1970). Se utilizó tinción SYPRO-red (Molecular Probes) (sensibilidad similar a la tinción de plata) para visualizar los patrones electroforéticos.

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Preparación de liposomas

Se ha utilizado fosfatidilcolina y colesterol de huevo (Sigma) para la preparación de vesículas unilamelares grandes (LUV) y pequeñas (SUV) según Olson (Olson et al., 1979).

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Video-microscopio óptico

Se controlaron los cambios morfológicos de las células Dd en crecimiento y/o agregantes mediante microscopía de contraste de fases con un microscopio de transmisión BHA de Olympus (Scop, Rungis, Francia) y mediante estereomicroscopía de baja magnificación (Olympus STZ). Se utilizó microscopía de fluorescencia UV con el mismo microscopio BHA de Olympus, dotado de una lámpara de mercurio de 100 W y un bloque de excitación de fluorescencia ultravioleta-azul.

Se registraron imágenes de células incubadas con vesículas Dd mediante video-microscopía óptica con el mismo microscopio BHA. El montaje del dispositivo de vídeo era de los presentes inventores, con los componentes adicionales siguientes: un adaptador C en el microscopio BHA (Olympus, Rungis, Francia), una cámara CCD analógica en blanco y negro y un monitor de vídeo en blanco y negro (Optophotonics, Eaubonne, Francia), un convertidor DV-Bridge Dazzle Hollywood para la conversión analógica-digital (New Edge, Boulogne Billancourt, Francia) y un Apple iMag G3 con una entrada FireWire (Computer Bench, Villejuif, Francia). La captura de datos se realizó utilizando NIH Image 1.62.

Se observó la transferencia de HO342 de las vesículas Dd a su diana intracelular, es decir los núcleos de Dd o las células K562 vivas, de la manera siguiente: se depositaron 10 \mul de células (\approx10^{7} células/ml, recolectadas directamente para las células Dd o tras la concentración mediante centrifugación para las células K562) y 10 \mul de vesículas Dd concentradas en un portaobjetos de microscopía bajo un cubreobjetos de vidrio de 20x20 mm y se observaron mediante video-microscopía de fluorescencia de UV como función del tiempo. Para las observaciones nocturnas, los cubreobjetos
de vidrio se sellaron sobre los portaobjetos de microscopía con barniz de uñas para evitar la evaporación de la muestra.

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Microscopía electrónica

Se observaron montajes completos de vesículas Dd mediante microscopía electrónica de tinción negativa. Los pellets obtenidos tras la centrifugación a 12.000 g o a 105.000 g se cargaron durante 30 segundos en rejillas de níquel recubiertas de formvar. Las rejillas se tiñeron durante 10 segundos con una gota de acetato de uranilo acuoso al 0,2% (p/v) y se secaron. Las rejillas se observaron con un microscopio electrónico Phillips CM12 a un voltaje acelerado de 80 kV.

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Espectroscopía de absorción

Se registraron los espectros de absorción en un espectrofotómetro DMS 70 de Varian de UV-luz visible. Antes de preparar las soluciones diluidas de solución madre de HO342 (\approx1 mg/ml), se comprobó la concentración con una dilución 1/20 en tampón A. La medición de absorbancia se llevó a cabo en una cubeta de cuarzo de 2x10 mm (1=2 mm) utilizando una absorbancia molar de \varepsilon=42.000 M^{-1}cm^{-1} a 340 nm. Las concentraciones habitualmente se proporcionan en \mug/ml (Mr=616).

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Espectrofluorimetría de fluorescencia

Se obtuvieron los espectros de emisión y de excitación de fluorescencia de estado estacionario en un espectrofluorímetro con el montaje experimental descrito en Klein et al., 1987, aunque automatizado con un ordenador MacIIci y software Labview para la captura de los datos. Se utilizó Kaleidagraph para el tratamiento de los datos. Se situaron las cubetas de cuarzo de 3x3 mm utilizando dos micrómetros perpendiculares. Las anchuras de las ranuras eran de 2 y 2 mm para el monocromador de excitación (McPherson) y de 2 y 1,8 mm para el monocromador de emisión (Bausch & Lomb). Todas las mediciones de fluorescencia se realizaron a 22ºC.

Para los estudios fotofísicos, se prepararon diluciones de la solución madre de HO342 en tampón A. La interacción de Ho342 y el ADN se estudió mediante la adición de HO342 (14,3 \muM, concentración final) en tampón A a ADN (33 \muM en pares de bases, Mr=610, concentración final). La proporción [pb]/[pigmento] era \sim2. Se seleccionó el ADN de Clostridium perfringens (Cp) (Sigma) por su composición de bases (A/T) similar a la del ADN de Dd. Se estudió la interacción con los lípidos mediante la incorporación de HO342 (100 \mug/ml, concentración inicial en tampón A) en vesículas unilamelares grandes (LUV), seguido de la filtración por una columna PD-10, y la sonicación posterior de la fracción LUV para preparar vesículas unilamelares pequeñas (SUV) que contenían HO342. A modo de control, también se preparó SUV sin el pigmento y se añadió HO342 (40 \mug/ml, concentración final en tampón A) a la preparación SUV. Se realizó el seguimiento de la interacción con un detergente aniónico espectrofluorométricamente, mediante la adición de dodecilsulfato sódico (SDS) a una concentración final de 2%, es decir, superior a la concentración micelar crítica (cmc=8,1 mM), a HO342 en un intervalo de concentraciones de entre 4 y 44 \mug/ml en tampón A. En algunos experimentos se añadió SDS al 2% a HO342 unido a ADN y a HO342 unido a lípidos. Los espectros (no corregidos) se registraron entre 360 y 720 nm, utilizando una longitud de onda de excitación de 350 nm. La absorbancia de las muestras en esta longitud de onda de excitación habitualmente era inferior a 0,1 con el fin de eliminar los efectos de filtro interno.

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Ejemplo 2 Características morfológicas de vesículas expulsadas por células Dd al medio extracelular durante el crecimiento y el ayuno

Se purificaron adicionalmente vesículas extracelulares Dd (Tatischeff et al., 1998; Tatischeff et al., 2001) a partir de medio de cultivo de células vegetativas (t_{0}) y de medio condicionado t_{22}, tal como se detalla en la sección Materiales y métodos. Las diferentes vesículas A1 y A2 purificadas, así como las vesículas C1 (vesículas de control) se analizaron mediante microscopía electrónica de tinción negativa. Contuviesen o no HO342, la mayoría de las vesículas mostraba una estructura redonda, limitada por una membrana bicapa de tipo lipídico. Sin embargo, las vesículas A2 "105.000" mostraban numerosas estructuras ovoides. En la preparación de las C1 "12.000" de control, podían observarse algunas estructuras fibrilares electrodensas aparte de las vesículas. El tamaño de las vesículas era heterogéneo, con diámetros comprendidos entre 57 nm y 500 nm.

Se observaron algunos detalles interesantes en las preparaciones de vesículas a magnificación más alta. Las vesículas A1 y A2 "12.000" mostraban tamaños variables. Las vesículas redondas más pequeñas contenían material electrodenso, de posición excéntrica próxima a la membrana, mientras que las más grandes aparentemente se encontraban vacías, con la membrana plegada. De las vesículas A1 y A2 "105.000" las características más notables fueron la aparición de estructuras de forma lunular y de estructuras ovoides con una membrana plegada. Las vesículas C1 "12.000" y "105.000" de control, de apariencia homogéneamente redonda y menos electrodensas, aparentemente se encontraban vacías. Algunas vesículas se caracterizaban por una invaginación membranal bastante grande.

Ejemplo 3 Análisis bioquímico de las vesículas Dd

Las vesículas preparadas y concentradas (x50) a partir de medio de crecimiento (A1, C1) en primer lugar se analizaron para su contenido de proteínas. La Tabla 1 indica que, bajo condiciones de control, es decir en ausencia de HO342 durante el crecimiento, la cantidad de proteínas en las vesículas C1 "105.000" era mucho mayor que en las vesículas C1 "12.000". Por el contrario, el contenido de proteínas de las vesículas A1 "12.000" purificadas a partir de medio de crecimiento de células cultivadas con HO342 era significativamente más elevado que el de las vesículas A1 "105.000" preparadas bajo las mismas condiciones experimentales.

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TABLA 1 Contenido de proteínas de vesículas A1 y C1 de Dictyostelium

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El análisis SDS-PAGE (12%) realizado bajo condiciones reductoras demuestra que las vesículas C1 tanto "12.000" como "105.000" mostraban patrones electroforéticos cualitativamente comparables a los polipéptidos de 97, 66-60, 45 y 35-30 kDa. Sin embargo, se observaron diferencias de intensidad de señal para los polipéptidos de 66-60 y de 45 kDa entre la vesículas C1 "12.000" y "105.000" (intensidades superior e inferior para los polipéptidos de 60 kDa y 45 kDa de las vesículas C1 "12.000", respectivamente, en comparación con las vesículas C1 "105.000"). Al utilizar geles de acrilamida al 8%, se detectó una señal fuerte a 205 kDa en ambas muestras, concordando con datos anteriores de los presentes inventores (Tatischeff et al., 1998). Las vesículas A1 "12.000" y "105.000", externalizadas por células cultivadas con HO342, mostraron patrones electroforéticos cualitativamente similares a los observados para las vesículas C1 de control.

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Ejemplo 3 Espectros de emisión de fluorescencia de HO342 en tampón y asociados a ADN, a lípidos y/o a detergente aniónico SDS

Con el fin de analizar la presencia de HO342 en vesículas Dd y el posible estado de asociación de las mismas, en primer lugar se estudiaron las características de fluorescencia de HO342, libre en tampón A o asociado a ADN, a lípidos y/o a detergente.

Una solución de HO342 en el intervalo de concentraciones de 4 a 44 \mug/ml en tampón A mostró una emisión de fluorescencia muy débil, lineal como función de la concentración, con un máximo en la longitud de onda de 475 nm bajo excitación a una longitud de onda de 350 nm (fig. 1a). Al interaccionar con ADN (Cp), a una proporción [pb]/[pigmento](\approx2) baja, HO342 mostró una intensidad de fluorescencia más alta (x100) con un pico de emisión desplazado hacia el azul a 452 nm (fig. 1b), tal como se ha descrito anteriormente (Gorner et al., 2001; Cosa et al., 2001).

La interacción de HO342 con lípidos se estudió mediante la encapsulación del pigmento en liposomas. En las SUV que contenían HO342, se observó un incremento de la intensidad de fluorescencia y un pico de emisión desplazado hacia el azul a 447 nm (fig. 1b). La interacción de HO342 con lípidos ha sido mencionada anteriormente, aunque sin proporcionar características espectrales (Shapiro et al., 1995; Shapiro et al., 1997). SDS, un detergente aniónico, también se conoce que interacciona con HO342, principalmente a concentraciones superiores a su cmc, de 8,1 mM (Gorner et al., 2001). En efecto, se observó un incremento muy elevado de la intensidad de fluorescencia de HO342 (x170) en presencia de SDS al 2% (concentración final en tampón A, muy superior a la cmc) (figs. 1a, c), con la misma longitud de onda de excitación de 350 nm. El máximo de emisión se observó a 470 nm y no a 475 nm para HO342 libre, es decir, con un desplazamiento al azul muy pequeño. La adición de SDS al 2% a HO342 que interaccionaba con ADN indujo un incremento mucho menor de la intensidad de fluorescencia (x2,5) (fig. 1d), aunque la emisión alcanzó un pico a 470 nm, que representa un importante desplazamiento al rojo desde 452 nm. Se observó un comportamiento espectral comparable con SDS al 2% añadido a liposomas que contenían HO342, es decir, un desplazamiento significativo de 447 a 470 nm del pico de emisión, aunque sin ningún incremento de la intensidad de fluorescencia (fig. 1d). Estos datos indican que se produce competencia entre SDS y el ADN o entre SDS y los lípidos para la unión con HO342.

Ejemplo 4 Espectros de emisión de fluorescencia de HO342 en vesículas extracelulares de Dd

Se estudiaron las vesículas A1 y C1 "12.000" y "105.000" mediante espectrofluorimetría. Las vesículas A1 tanto "12.000" como "105.000", excitadas a 350 nm, mostraron espectros de emisión de intensidad débil entre 360 y 720 nm (fig. 2a), con un máximo a una longitud de onda aproximada de 450 nm, próxima a la observada para los complejos de HO342-ADN o de HO342-lípido. Los espectros de emisión de las vesículas A2 "12.000" y "105.000", al excitarlas a 350 nm, eran de menor intensidad (fig. 2b). Con las vesículas C1 y C2 de control, únicamente se observó una fluorescencia de fondo muy pequeña entre 390 y 500 nm (figs. 2a, b). Resulta conveniente subrayar el componente de difusión de segundo orden relativamente grande en 700 nm (figs. 2a, b), relacionado con la naturaleza vesicular de los materiales.

Para evaluar el estado de HO342 en el interior de las vesículas Dd, se añadió SDS al 2% para romper la membrana vesicular. En todos los tipos de vesícula, el efecto detergente de SDS quedó claramente demostrado por la gran reducción del pico de difusión de segundo orden a 700 nm (figs. 2c, d).

El pigmento HO342 contenido en las vesículas A1 y A2 mostró, en presencia de SDS al 2%, un pico de emisión de fluorescencia en 470 nm (figs. 2c, d). Además, la intensidad se incrementó en un factor \approx25 (+/-3) para HO342 en las vesículas A1 "12.000" y "105.000" y en un factor \approx10 (+/-0,5) para HO342 en las vesículas A2 "12.000" y "105.000". Tal como se ha mostrado anteriormente, la fluorescencia de HO342 en interacción con SDS al 2% se caracterizó por una intensidad mucho más alta (fig. 1c) en comparación con HO342 libre (fig. 1a). Al añadir SDS al 2% a los complejos HO342-ADN o HO342-lípido, se observó un desplazamiento de la longitud de onda del máximo en 450 nm hacia la misma longitud de onda, de 470 nm, aunque sin cambios importantes de la intensidad (figs. 1b, d). El incremento de intensidad observado mediante la rotura de las membranas vesiculares con SDS al 2%, en comparación con las características de fluorescencia de HO342 en diferentes estados de asociación (fig. 1) sugiere que HO342 contenido en las vesículas Dd podría estar parcialmente asociado a ADN y/o lípidos y parcialmente libre en el interior de las vesículas. En contraste, no se observó ningún efecto del SDS al 2% sobre los espectros de fluorescencia de las vesículas C1 y C2 "12.000" y "105.000", indicando que las características de fluorescencia de las vesículas Dd estaban relacionadas con su contenido de HO342.

Ejemplo 5 Influencia sobre la externalización vesicular de HO342 de la concentración de pigmento en el medio de cultivo celular y del tiempo de incubación de las células Dd

Los experimentos siguientes proporcionan una mejor comprensión de la falta de citotoxicidad de HO342 durante la incubación con células Dd en el medio de cultivo y de la eficiencia de su externalización vesicular como función de las condiciones experimentales utilizadas. En la figura 3a se muestra la curva de crecimiento de las células Dd, mantenidas continuamente con HO342 (10 \mug/ml) desde el inicio del cultivo a una densidad de 3x10^{6} células/ml. Las imágenes de las células Dd, fijadas en MeOH al 70% en diferentes tiempos (entre 72 horas y 216 horas), muestran el aspecto de las células y de sus núcleos teñidos con HO342. La apóptosis podría incrementarse como función del tiempo durante la etapa meseta estacionaria (Tatischeff et al., 2001) y el característico tamaño pequeño de las células apoptóticas era predominante en las células Dd fijadas en t'_{216} (fig. 3a).

Se prepararon vesículas A1 "12.000" concentradas (x20) tras diferentes tiempos de incubación (24 horas a 165 horas) y se estudiaron mediante espectroscopía de fluorescencia, con o sin adición de SDS al 2%, tal como se ha indicado anteriormente. La fluorescencia de HO342 asociado a las vesículas, excitadas a 350 nm, se incrementó entre las 24 y las 72 horas (fig. 3b), tiempo en que las células Dd alcanzaron la etapa estacionaria de crecimiento (fig. 3a). Una suspensión (5x10^{6} células/ml en tampón A) de células Dd fijadas en t'_{95} (fig. 3a) mostraba espectros de fluorescencia con o sin SDS al 2% característicos de los complejos de HO342-ADN (fig. 3c). Los espectros de emisión de fluorescencia correspondientes de las vesículas A1 "12.000" concentradas (x20) liberadas por dichas células t'_{95} (fig. 3b) mostraban el mismo máximo en 450 nm, desplazado hasta 470 nm en presencia de SDS. Sin embargo, el incremento observado de la intensidad de fluorescencia debido a la interacción con SDS era \approx11 para las vesículas y únicamente de 2,3 para los núcleos teñidos con HO342 en células fijadas. Este valor debe compararse con el incremento (x2,5) de intensidad de fluorescencia observado al añadirse SDS al 2% al complejo HO342-ADN(Cp) (figs. 1b, d).

La influencia de la concentración de HO342 (2,2 a 17,4 \mug/ml, concentración final) en el medio de concentración se muestra en la fig. 3d. Los espectros de emisión de fluorescencia de las vesículas A1 "12.000", purificadas a partir de diferentes medios de crecimiento de cultivos de células Dd, iniciados a la misma densidad (3x10^{6} células/ml) y cultivados en paralelo durante 24 horas en presencia de concentraciones crecientes de HO342, no mostró ninguna variación significativa. Sin embargo, la disrupción con SDS (al 2%) de las vesículas originadas en las células Dd incubadas con la concentración más alta de HO342 demostró la presencia de una cantidad más alta de HO342 libre. En este caso, el incremento observado de intensidad de fluorescencia debido a la interacción con SDS era \approx20, comparado con un incremento de \approx10 para las demás concentraciones de HO342. Al comparar los espectros mostrados en las figuras 3b y d, la cantidad de vesículas liberadas en el medio extracelular, medido por los picos de segundo orden en 700 nm, aparentemente era más importante únicamente tras 72 horas de incubación con HO342, es decir, en la etapa estacionaria de crecimiento.

Ejemplo 6 Vesículas Dd A1 median en la transferencia de HO342 a los núcleos de las células Dd vivas

Los núcleos de las células Dd cultivadas sin HO342 se tiñeron intensamente con el pigmento tras aproximadamente 1/2 hora de incubación con vesículas Dd A1 "12.000" concentradas (x50). Se observaron tres campos diferentes mediante microscopía óptica en diferentes tiempos tras iniciar la incubación, con luz blanca para controlar la apariencia celular, o bajo luz UV excitatoria para la observación de la fluorescencia de los núcleos. Tras 6 minutos, aparecían muy pocas estructuras fluorescentes, pero tras 34 y 67 minutos prácticamente la totalidad de los núcleos se encontraban intensamente teñidos dentro de las células vivas. Como control, las células Dd también se incubaron con el medio de crecimiento celular utilizado para la preparación de las vesículas A1 y que contenía las vesículas antes de la concentración mediante centrifugación. Tras 55 minutos, únicamente una célula Dd multinucleada, que había perdido su refringencia membranal, mostraba tinción de los núcleos. Esta primera observación muestra que las vesículas A1 "12.000" concentradas (x50) son eficientes en la mediación de la transferencia de HO342 a los núcleos de las células Dd vivas cultivadas sin HO342. En contraste, al incubar las SUV que contenían HO342 y que habían sido estudiadas mediante espectrofluorimetría (fig. 1b), durante \approx1 hora con células Dd bajo las mismas condiciones, no se observó tinción de los núcleos.

Las vesículas Dd A1 "105.000", aunque contenían menos HO342 que las vesículas A1 "12.000", tal como muestra la espectroscopía de fluorescencia (figs. 2a, c) también pudieron mediar en la transferencia de HO342 hacia los núcleos de las células Dd. Se realizaron observaciones de un único campo que presentaba unas cuantas células Dd normales y una célula más grande, como función del tiempo que habían sido incubadas con vesículas A1 "105.000" concentradas (x50). Un marcaje débil de los núcleos por HO342 en las células mononucleadas o binucleadas apareció únicamente tras aproximadamente 2 horas de incubación y no se consiguió el marcaje completo de los núcleos en la célula Dd multinucleada antes de las 3 horas 36 minutos, que es más tarde que las vesículas A1 "12.000". La observación del mismo campo mediante microscopía de contraste de fases al inicio (5 minutos) y al final (3 horas 51 minutos) de las observaciones de UV mostró una modificación de las células vivas, aunque sin ninguna de las características de la necrosis celular durante el prolongado periodo en que las células se mantuvieron bajo un cubreobjetos, sin oxigenación correcta. Lo anterior sugiere un posible efecto protector de las vesículas Dd frente a procesos de estrés celular, en comparación con las células incubadas bajo las mismas condiciones sin vesículas concentradas.

Ejemplo 7 Las vesículas Dd A1 median en la transferencia de HO342 a los núcleos de células K562 leucémicas humanas vivas, resistentes o sensibles a múltiples fármacos

Se incubaron células K562 leucémicas humanas, sensibles (s) o resistentes a múltiples fármacos (r) (Loetchutinat et al., 2003) con vesículas Dd concentradas, con el fin de controlar la capacidad de dichas vesículas de transferir HO342 a núcleos de otras células vivas que no fuesen células Dd. Con las vesículas A1 "105.000" concentradas (x50), a una escala temporal comparable a la utilizada con las células Dd, los núcleos mucho mayores de las células K562r adquirieron visibilidad mediante fluorescencia de UV. Algunas de las células presentaba una apariencia bastante normal tras permanecer \approx4 horas bajo un cubreobjetos, mientras que otras células presentaban algunas protuberancias citoplasmáticas; sin embargo, las células todavía eran refringentes en la microscopía de contraste de fases y sus núcleos teñidos eran claramente visibles dentro de las células, según observación simultánea con luz blanca y microscopía de UV.

Se llevaron a cabo observaciones comparativas de células K562r y K562s incubadas durante la noche con vesículas A1 "12.000" menos concentradas (x20). Los núcleos nuevamente se encontraban fuertemente teñidos con HO342, aunque aparentemente ocupaban prácticamente la totalidad de la célula, en comparación células K562r observadas durante un tiempo de incubación más corto. Esta reducción del tamaño celular podría relacionarse con el inicio de un proceso apoptótico para las células K562r, que permanecieron un tiempo prolongado sin oxigenación correcta.

Las vesículas Dd A2 "12.000" y "105.000" concentradas (x25), obtenidas a partir de células en ayuno en t22, también fueron capaces de mediar en al transferencia de HO342 a los núcleos de las células K562s en una incubación durante una noche. Los núcleos de las células K562r también se tiñeron en una incubación durante una noche con las vesículas Dd A2 "12.000" concentradas (x25). Se tiñeron poco con las vesículas Dd A2 "105.000".

Tras la incubación de la noche con vesículas Dd A2 "12.000" y "105.000" concentradas (x25), los núcleos de Dd mucho más pequeños también se tiñeron con HO342 en el interior de las células Dd.

El presente estudio mediante videomicroscopía óptica demuestra que las vesículas Dd externalizadas también son capaces de interaccionar con otras células vivas, dirigiendo su contenido de HO342 a los núcleos de células Dd o de células leucémicas humanas K562, y ello con independencia de las enormes diferencias de tamaño de sus núcleos y genomas. Las vesículas Dd que contenían o no HO342 aparentemente protegieron a las células frente a la necrosis ligada a una falta de oxigenación durante aproximadamente 4 horas. Sin embargo, una incubación de una noche probablemente fue excesivamente larga y sí indujo algunos cambios morfológicos apoptóticos, tales como una reducción del tamaño celular y la formación de protuberancias citoplasmáticas en la célula, especialmente en las células K562r.

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Ejemplo 8 Las vesículas de D. discoideum constituyen un eficiente vehículo de transporte para la transferencia de moléculas exógenas a células humanas

Los resultados anteriores demostraron que las vesículas de D. discoideum que contienen HO342 transportan eficientemente el pigmento a los núcleos de las células K562 humanas, sean sensibles o resistentes a múltiples fármacos.

Las células leucémicas K562 anteriormente se ha encontrado (Asahi et al., 1995) que se diferencian y recuperan la capacidad de sintetizar hemoglobina tras la exposición a un factor inductor de diferenciación de D. discoideum (DIF, Morris et al., 1987). El factor DIF es una molécula de pequeño peso molecular que muestra analogía estructural con el compuesto antitumoral diferanisol A.

De acuerdo con lo anterior, las células de D. discoideum se cultivaron en presencia de DIF, de manera que encapsulasen el factor de diferenciación dentro de las vesículas extracelular. Debe indicarse que las células de D. discoideum en crecimiento no sintetizan DIF, que de esta manera puede considerarse una molécula exógena a las células de D. discoideum durante la etapa de crecimiento.

Dichas vesículas se aislaron y concentraron adicionalmente y se pusieron en contacto nuevamente con células K562, tal como se ha indicado para las vesículas que contenían HO342, con el fin de evaluar si las células K562 adquirían la capacidad de sintetizar hemoglobina, es decir, si el fenotipo diferenciado de las células K562 resultaba revertido por las vesículas Dd que contenían DIF.

Los presentes datos demuestran que las células del microorganismo eucariótico unicelular D. discoideum externalizan vesículas que contienen moléculas endógenas y exógenas. Las células Dd pueden cultivarse o mantenerse en ayuno en suspensiones bastante grandes, permitiendo de esta manera el fácil aislamiento respecto del medio de crecimiento o de ayuno de una gran cantidad de dichas vesículas.

La purificación de las vesículas, externalizadas de células cultivadas en presencia o no de la tinción vital de ADN HO342, o expulsadas por las mismas células tras un periodo de ayuno de 22 horas en tampón A, condujo a aislar diferentes tipos de vesículas. Se separaron en dos grupos mediante centrifugación, a 12.000 g y a 105.000 g.

Los estudios de microscopía electrónica y los análisis bioquímicos pusieron de manifiesto la naturaleza vesicular del material, así como algunas características comunes a las vesículas secretadas por algunas células de mamífero y denominadas "exosomas" (Denzer et al., 2000a; Kobayashi et al., 2002). La microscopía electrónica de los diferentes tipos de vesículas Dd purificadas, estudiadas mediante tinción negativa a alta magnificación, proporcionó una indicación de similitudes con la microscopía electrónica de exosomas originadas de las MVBs de muchas células de mamífero (Kobayashi et al., 1998; Denzer et al., 2000a; Blanchard et al., 2002). Para confirmar dichas similitudes, resultaría necesario controlar, mediante microscopía inmunoelectrónica, la presencia en las vesículas Dd de algunos marcadores específicos de los exosomas de mamífero, es decir las proteínas tetraspan CD82 y CD63, que se sugiere desempeñan una función en su transporte dirigido celular (Denzer et al., 2000a).

El análisis de proteínas de las vesículas Dd indicó la presencia de polipéptidos de 97, 66-60, 45 y 35-30 kDa. Lo anterior debe compararse con las proteínas asociadas a las vesículas endocíticas Dd purificadas (Rodriguez-Paris et al., 1993; Nolta et al., 1994; Adessi et al., 1995). Entre las proteínas principales, identificadas mediante análisis de secuencias, deben considerarse, además de la actina y una GTPasa similar a Rab-7, las muchas subunidades de la ATPasa-H^{+} vacuolar de D. discoideum (p110, p66, p59, p41 y p29) y a una nueva cisteína proteasa de 34 kDa (Adessi et al., 1995). La comprobación de que alguno de los polipéptidos en la región de masa molecular de 60 a 66 kDa es tetraspan CD63 requeriría un control mediante análisis de transferencia western utilizando los anticuerpos específicos.

Un análisis de lípidos anterior de las vesículas mediante cromatografía en capa fina bidimensional (ver la fig. 5 en Tatischeff et al., 1998) indicó la presencia de los fosfolípidos membranales habituales (PC, PE, PI, PS) y esfingomielina. Además, se observó un lisofosfolípido, con la R_{f} característica de LBPA. Dicho análisis adquiere ahora su importancia, debido a que el análisis de lípidos de los exosomas celulares de mamífero ha descrito LBPA como un marcador específico de los MVBs y de los exosomas derivados (Kobayashi et al., 1998; Kobayashi et al., 2002). Resulta interesante recordar la observación de la presencia de un estereoisómero de LBPA en las células Dd (Ellingson et al., 1980). Estudios más recientes sobre los lisosomas Dd informan de la presencia de fosfato de bis(monoacilglicerol) (BMP) (otro nombre para LBPA), que constituye hasta la mitad de los lípidos totales en las vacuolas lisosómicas. La presencia en un protista filogenéticamente distante de este lípido característico de los lisosomas en las células animales ha sugerido que dicho fosfolípido sirve a una función universal y esencial en la endocitosis (Rodriguez-Paris et al., 1993; Nolta et al., 1994). La presencia común de LBPA tanto en vesículas Dd externalizadas como en exosomas de mamífero podría sugerir, por lo tanto, una función esencial de dicho lípido en la formación y fusión de las vesículas que median en la comunicación intercelular.

En el presente estudio, las propiedades de fluorescencia de HO342 se utilizaron para demostrar mediante espectrofluorimetría que las vesículas externalizadas de las células Dd cultivadas en presencia de HO342 realmente contenían el pigmento. Lo anterior era cierto tanto para las vesículas "12.000" como las "105.000" purificadas directamente del medio de cultivo celular (A1) o del medio de ayuno t_{22} de las mismas células (A2). Las características de fluorescencia de HO342 en tampón A (pH=6,8), comparadas con las de HO342 unido a ADN(Cp) o a lípidos, y/o a un detergente aniónico, en general concuerdan con estudios anteriores sobre la fotofísica de este pigmento (Gorner et al., 2001; Cosa et al., 2001; Shapiro et al., 1995; Shapiro et al., 1997). En efecto, se observó un desplazamiento batocrómico en los espectros de absorción del pigmento, así como una emisión de fluorescencia desplazada al azul al acomplejar HO342 con ADN. Estas modificaciones se asociaron a un incremento de la intensidad de fluorescencia. Dichas características espectrales resultan de cambios en el momento dipolar de la molécula al excitarse o al desintegrarse hasta el estado fundamental, y su interacción con el medio ambiente. Debido a la estructura del pigmento bis-benzimida HO342 (fig. 1a), la desactivación de la fluorescencia del mismo depende de la configuración de las dos unidades benzimidazol. En solvente acuoso (\approxpH 7), la unión entre las dos unidades benzimidazol es flexible y se produce una desintegración de la excitación sin producirse radiación por la rotación en torno al eje bis-benzimida. En contraste, al unirse HO342 a ADN, los desplazamientos de los espectros de absorción y de la emisión de fluorescencia, así como la magnitud del incremento del rendimiento cuántico de fluorescencia, dependen de la localización del pigmento en la estructura del ADN. El HO342 unido en el surco pequeño del ADN se encuentra únicamente protegido parcialmente, resultando en una configuración más plana de la molécula. Lo anterior debería ser la conformación más predominante en el ADN, a una proporción [pb]/[pigmento] elevada, debido a una unión bastante fuerte del pigmento en el surco del ADN, que es responsable del componente de vida más larga, es decir, del desplazamiento al azul y de la intensidad más elevada del complejo de HO342-ADN. Sin embargo, a la baja proporción [pb]/[pigmento] del presente estudio, la distancia media entre dos moléculas de pigmento debería ser de \approx1-2 pb, pudiéndose producir un impedimento estérico que favoreciese la conformación torsionada a expensas de la plana. Por lo tanto, la magnitud del incremento de fluorescencia es inferior
a una proporción [pb]/[pigmento] mayor y sigue siendo muy sensible al pH del medio ambiente (Cosa et al., 2001).

Los estudios anteriores sobre la interacción de HO342 con lípidos presentan menos documentación espectroscópica (Shapiro et al., 1995; Shapiro et al., 1997) que aquellos sobre la interacción con ADN. Algún mecanismo similar de protección de la parte hidrofóbica del pigmento frente al ambiente polar podría explicar el incremento observado de intensidad de fluorescencia de HO342, así como la presencia de un desplazamiento al azul del máximo de emisión, si una configuración plana del pigmento fuera impuesta por su interacción con las cadenas de acilo graso de los lípidos. El fuerte incremento de la intensidad de fluorescencia con un minúsculo desplazamiento al azul al interaccionar HO342 con el detergente aniónico SDS a una concentración superior a la cmc, podría explicarse por la entrada parcial del pigmento en el núcleo apolar de las micelas, conduciendo a un ambiente menos polar en torno a por lo menos una parte de los anillos de benzimidazol. La carga negativa de SDS en la superficie de las micelas probablemente interacciona con la carga positiva del pigmento, estabilizando la configuración de los dos anillos. La adición de SDS a los complejos de HO342-ADN o de HO342-lípido que conducen a un fuerte desplazamiento al rojo hacia 470 nm, aunque sin ningún incremento importante de intensidad de fluorescencia podría explicarse por un cambio del ambiente en torno a la parte del pigmento todavía expuesta al solvente.

Dicho estudio fotofísico permitió proporcionar información más detallada sobre el estado del pigmento en las vesículas Dd. En las vesículas intactas que contenían HO342, la intensidad de la emisión de fluorescencia era aproximadamente 10 veces el máximo de la concentración mediad más alta del pigmento en tampón A (44 \mug/ml). Este máximo se encuentra desplazado al azul, tal como con el complejo de HO342-ADN o de HO342-lípido. Este conjunto de datos indica que el pigmento dentro de las vesículas se encuentra acomplejado tanto con ADN como con lípidos o con únicamente una de dichas macromoléculas, presentes dentro de las vesículas Dd o asociadas a las mismas (Tatischeff et al., 1998). La adición de SDS a más de la cmc claramente rompe las membranas vesiculares, tal como indica la reducción de intensidad de los picos de difusión de segundo orden. También incrementa la intensidad de fluorescencia de HO342 en un factor bastante elevado (x25 y x10 para las vesículas A1 y A2, respectivamente), indicando la presencia de pigmento libre en el interior de las vesículas. La presencia de HO342 libre contenido en las vesículas Dd concuerda con la observación anterior de los presentes inventores de una mancha fluorescente de HO342 claramente diferente de cualquiera de los fosfolípidos, en la migración TLC bidimensional de fosfolípidos extraídos de vesículas Dd tras la tinción vital con HO342 de la células (ver la fig. 5 en Tatischeff et al., 1998).

Finalmente, un estudio de videomicroscopía óptica de las células Dd, cultivadas en ausencia de HO342 y mantenidas en presencia de diversas vesículas que contenía HO342, demostró la capacidad de dichas vesículas de dirigir la tinción específica de ADN al núcleo de las células Dd vivas. Un estudio similar con células leucémicas humanas K562, sensibles (s) o resistentes a múltiples fármacos (r), puso de manifiesto la capacidad de las vesículas Dd que contenían HO342 de transferir también el pigmento al interior de los núcleos de las células humanas. El transporte eficiente de HO342 a los núcleos de las células vivas se atribuye, de esta manera, al transporte mediado por vesículas Dd de HO342 libre. Debe indicarse que, bajo estas condiciones, únicamente los núcleos de las células presentaban tinción y no la membrana ni ningún otro compartimiento celular, es decir, se mantuvo para toda la célula la bien conocida especificidad de HO342 para el ADN.

En la presente memoria se ha observado la diferencia entre los dos tipos de vesícula aislados del medio de cultivo de células Dd, A1 "12.000" y A1 "105.000". En el caso de que ambos tipos sean capaces de transferir el pigmento a los núcleos celulares, el tiempo requerido para una tinción eficiente de los núcleos interiores a las células Dd
era \approx7 veces más largo con las vesículas A1 "105.000" que con las vesículas A1 "12.000". El tiempo bastante largo (\approx3 horas 30 minutos) necesario para una tinción total de los núcleos Dd en el interior de las células Dd con las vesículas "105.000" era comparable al necesario para la tinción de los núcleos en el interior de las células K562r bajo las mismas condiciones. Con respecto a la transferencia simultánea de HO342 a los núcleos de las células K562r y K562s mediada por vesículas A1 "12.000", tras una incubación de una noche, debe indicarse que la eficiencia de la tinción aparentemente era comparable para ambos tipos celulares. Resulta conveniente indicar que, tras un tiempo de incubación tan prolongado sin oxigenación apropiada, las células K562 observadas no se habían lisado, sugiriendo la existencia de una influencia protectora de las vesículas Dd sobre las membranas celulares humanas. Sin embargo, en comparación con el tiempo de incubación más corto utilizado con las vesículas "105.000", la mayoría de los núcleos teñidos aparentemente ocupaban las células K562 llenas, sugiriendo una posible reducción pre-apoptótica de tamaño tras la incubación de la noche.

La eficiencia de la transferencia de HO342 mediada por vesículas A2 "12.000" y "105.000" aisladas del medio de ayuno t_{22} se comparó simultáneamente en los tres tipos celulares incubados durante la noche. Los núcleos de las células K562s se encontraban mucho más teñidos con las vesículas A2 "12.000" que con las vesículas A2 "105.000". Los núcleos de las células K562r se tiñeron con las vesículas A2 "12.000" a una eficiencia mucho menor que los núcleos de las células K562s. La tinción de los núcleos de K562r con las vesículas A2 "105.000" era muy débil. Las células Dd también se tiñeron más eficientemente con las vesículas A2 "12.000" que con las vesículas A2 "105.000".

La muerte apoptótica unicelular de las células Dd inducida por ayuno en tampón condicionado t_{22} ha sido descrita anteriormente (Tatischeff et al., 2001). Mediante ayuno de las células Dd en el medio de ayuno t_{22} utilizado para purificar las vesículas A2, se observó una muerte inducida-apoptótica según criterios morfológicos. Sin embargo, el ayuno de las células Dd en el mismo sobrenadante clarificado a 105.000 g, del que se habían extraído todas las vesículas A2, no indujo la muerte celular (datos no mostrados). Lo anterior sugiere un papel directo de las vesículas A2 en la inducción de la muerte apoptótica de las células Dd.

La externalización de las vesículas podría ser una propiedad general de muchos tipos celulares, mencionada por primera vez en 1981 (Trams et al., 1981). Sin embargo, aparentemente existe una importante heterogeneidad de origen, naturaleza, composición de proteínas y funciones fisiológicas (la mayoría todavía desconocidas) de las vesículas extracelulares descritas. Se liberan dos tipos de vesículas membranales de las plaquetas activadas y se han discriminado a partir de su tamaño: las microvesículas (diámetro de entre 100 nm y 1 \mum) se externalizan mediante gemación superficial, y los exosomas (diámetro de entre 40 y 100 nm), que se secretan tras la fusión de MVBs con las membranas plasmáticas (Heijnen et al., 1999). Durante la muerte celular apoptótica, las células también forman protuberancias citoplasmáticas y expulsan cuerpos apoptóticos de diferentes tamaños, que se mezclan con las demás vesículas externalizadas (Thery et al., 2001).

Por lo tanto, las células nuevas en todo momento se encuentran "bañadas" por muchas vesículas expulsadas por células anteriores, que representan un tipo de "memoria" celular con todas las impresiones de la vida celular anterior. Potencialmente son una fuente general de comunicación intercelular, que sólo se está empezando a desenmarañar. La mayoría de trabajos se han centrado en las vesículas más pequeñas, denominadas exosomas (Thery et al., 2002; Stoorvogel et al., 2002), que pueden estimular el sistema inmunológico mediante la transmisión de señales a las células del linaje hematopoyético (Denzer et al., 2000a; Blanchard et al., 2002; Thery et al., 2002; Thery et al., 2001; Stoorvogel et al., 2002; Denzer et al., 2000b; Skokos et al., 2001). Las vesículas externalizadas por las células tumorales también pueden utilizarse para la detección de tumores (Bergsmedh et al., 2001; Anker et al., 2003) o para la inmunización frente a tumores (Wolfers et al., 2001; Andre et al., 2002).

La presente memoria corrobora los estudios anteriores de los inventores sobre las vesículas Dd externalizadas (Tatischeff et al., 1998; Tatischeff et al., 2001), y con independencia de los orgánulos celulares de origen, probablemente diferentes según su heterogeneidad de tamaños (57 a 500 nm), son el destino de un tráfico membranal muy eficiente en el interior de las células Dd (Rodriguez-Paris et al., 1993; Nolta et al., 1994; Adessi et al., 1994; Aguado-Velasco et al., 1999; Neuhaus et al., 2002; Seastone et al., 2001). La externalización de las mismas y su capacidad de comunicar información a otras células indican que dicho protista filogenéticamente distante podría utilizarse como un modelo valioso que ayudase a clarificar la complejidad de las comunicaciones intercelulares mediadas por vesículas, en gran parte desconocidas.

Es conocido que las células Dd son tan móviles como los leucocitos y tan eficientes para la fagocitosis como los macrófagos. El intenso tráfico membranal mostrado por estas amebas no patogénicas también muestra similitudes inesperadas con el tráfico membranal de las células de mamífero.

El proceso de externalización de las vesículas, compartido por las células Dd con muchas células humanas, de esta manera proporciona aparentemente un importante vehículo para la comunicación intercelular. Debe indicarse que dicho papel ha sido suficientemente eficiente para sobrevivir evolutivamente durante 1.000 millones de años. Debido a la notable conservación de muchas funciones esenciales desde Dd hasta el ser humano, las vesículas Dd proporcionan, de esta manera, vectores de fármaco útiles que presentan su diana en células humanas, opcionalmente asociados a un transporte dirigido muy específico a un destino intracelular. El transporte dirigido eficiente de fármacos en el interior de células patológicas efectivamente es un problema general, tanto en el tratamiento de tumores resistentes como en la aplicación eficiente de terapia antigénica o antisentido.

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Ejemplo 9 La internalización de una molécula exógena y su liberación en vesículas es un proceso general en las células de D. discoideum

Se estudio la capacidad de las células Dd de internalizar diferentes moléculas exógenas. Además, se evaluó su capacidad de liberar vesículas, en particular las vesículas "12.000", que portan un amplio espectro de moléculas de interés. Se utilizó citometría de flujo y micro-espectrofluorimetría para medir, respectivamente, la internalización celular y la liberación mediada por vesículas de la molécula cargo fluorescente como función del tiempo de incubación en el medio de cultivo. Las células Dd en crecimiento se incubaron durante diferentes periodos de tiempo hasta 72 horas en presencia de la molécula exógena. Se fijaron fracciones de las células en paraformaldehído al 2% tras cada uno de dichos tiempos de incubación. Simultáneamente, se prepararon las vesículas "12.000" externalizadas a partir de alícuotas del medio de cultivo y se concentraron (x20). Como controles, se cultivaron células Dd en paralelo sin la molécula transportada y se manipularon de la misma manera. Además, el recuento celular durante el cultivo permitió comprobar la existencia de toxicidad de la molécula estudiada como función del tiempo. Las muestras de células y de vesículas se mantuvieron a 4ºC hasta que se realizaron las mediciones.

Se estudiaron diferentes moléculas de potencial interés terapéutico como moléculas transportadas:

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a) Hipericina

En presencia de hipericina (25 \muM), una molécula extremadamente hidrofóbica propuesta para la fototerapia dinámica antitumoral, las células Dd se tiñeron rápidamente sin ninguna toxicidad aparente. Tras una incubación de 4 horas, las células teñidas habían liberado sólo unas cuantas vesículas al medio de cultivo de las mismas. Tras una incubación de 24 horas, las células habían perdido parte de su contenido de hipericina, mientras que se recogió una cantidad significativa de vesículas cargadas de hipericina. Tras una incubación de 48 horas, las células habían perdido la mayor parte de la tinción y se encontró la hipericina asociada a la gran cantidad de vesículas liberada al medio de cultivo. Se realizó un seguimiento de la molécula fluorescente roja endógena protoporfirina PPIX, ya puesta de manifiesto en vesículas Dd (Arnoult et al., 2001), a partir de su espectro de emisión característico en las vesículas que contenían hipericina, así como en las vesículas de control.

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b) Doxorubicina (también denominada adriamicina)

Este compuesto pertenece a la familia de la antraciclina, ampliamente utilizada en la quimioterapia antitumoral. El estudio demostró que esta molécula emisora en rojo también se libera en vesículas "12.000". De acuerdo con lo anterior, las vesículas Dd que transportan uno de los numerosos compuestos antraciclina relacionados y de hidrofobicidad bastante diferente, permiten solucionar la cuestión de la influencia de la hidrofobicidad sobre la eficiencia de la transferencia de la antraciclina a células leucémicas humanas que expresan resistencia a múltiples fármacos contra la quimioterapia antitumoral.

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c) Oligodesoxinucleótido marcado con fluoresceína (ODN)

Para evaluar si las vesículas Dd podían utilizarse como soporte para la terapia génica, se comprobó si un ODN fluorescente, ya utilizado como control para la silenciación de la resistencia a múltiples fármacos (mdr), también podía ser transportado por las vesículas Dd. Se encontró que, al contrario que experimentos similares con células de mamífero, este ODN sí penetró en las células Dd y escapó a la rápida degradación de las nucleasas.

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d) Plásmido informador (peroxidasa o GFP)

Se llevaron a cabo experimentos para comprobar si las vesículas Dd podrían transportar plásmido de ADN de tamaño elevado (aproximadamente 2,5 a 5 kb), utilizando un plásmido marcado fluorescentemente, con el fin de seguir la internalización en las células Dd y la externalización mediada por vesículas.

Conjuntamente, estos resultados demuestran que la internalización de una molécula exógena en células de Dictyostelium seguido de su liberación mediada por vesículas de las células es un proceso general, con independencia de la naturaleza de la molécula exógena.

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Claims

1. Método para preparar una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés seleccionada de entre el grupo que consiste de una molécula terapéutica, un agente de formación de imágenes y un agente diagnóstico, comprendiendo las etapas que consisten de:

a) cultivar una ameba no patogénica en un medio de cultivo que comprende dicha molécula exógena de interés, bajo condiciones suficientes para permitir que la célula ameba no patogénica libere vesículas,

b) recuperar una vesícula liberada por dicha célula, conteniendo la vesícula dicha molécula exógena de interés,

con la condición de que dicha vesícula no sea una vesícula de Dictyostelium discoideum que contiene Hoechst 33342.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha ameba no patogénica es Dictyostelium discoideum.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha molécula exógena de interés es una molécula terapéutica seleccionada de entre el grupo que consiste de un antibiótico, un agente antimicrobiano, un agente antimicobacteriano, antifúngico o antivírico, un agente que afecte a la respuesta inmunológica, un regulador del calcio sanguíneo, un agente útil en la regulación de la glucosa, un anticoagulante, un antitrombótico, un agente antihiperlipidémico, un fármaco cardíaco, un fármaco tiromimético o antitiroideo, un adrenérgico, un agente antihipertensivo, un colinérgico, un anticolinérgico, un antiespasmódico, un agente antiulcerativo, un relajante muscular esquelético y liso, una prostaglandina, un inhibidor general de la respuesta alérgica, un antihistamínico, un anestésico local, un analgésico, un antagonista narcótico, un antitusivo, un gente sedante-hipnótico, un anticonvulsivo, un antipsicótico, un agente anti-ansiedad, un agente antidepresivo, un anorexigénico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente antiinflamatorio esteroideo, un antioxidante, un agente vasoactivo, un agente osteoactivo, un agente antiartrítico y un agente antineoplásico.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha molécula exógena de interés es un agente antineoplásico.

5. Vesícula aislada de ameba no patogénica, que contiene una molécula exógena de interés seleccionada de entre el grupo que consiste de una molécula terapéutica, un agente formador de imágenes y un agente diagnóstico, con la condición de que dicha vesícula no es una vesícula de Dictyostelium discoideum que contiene Hoechst 33342.

6. Vesícula según la reivindicación 5, en la que dicha ameba no patogénica es Dictyostelium discoideum.

7. Vesícula según la reivindicación 5 ó 6, en la que dicha molécula exógena de interés es una molécula terapéutica seleccionada de entre el grupo que consiste de un antibiótico, un agente antimicrobiano, un agente antimicobacteriano, antifúngico o antivírico, un agente que afecta a la respuesta inmunológica, un regulador del calcio sanguíneo, un agente útil en la regulación de la glucosa, un anticoagulante, un antitrombótico, un agente antihiperlipidémico, un fármaco cardiaco, un fármaco tiromimético o antitiroideo, un adrenérgico, un agente antihipertensivo, un colinérgico, un anticolinérgico, un antiespasmódico, un agente antiulcerativo, un relajante muscular esquelético y liso, una prostaglandina, un inhibidor general de la respuesta alérgica, un antihistamínico, un anestésico local, un analgésico, un antagonista narcótico, un antitusivo, un agente sedante-hipnótico, un anticonvulsivo, un antipsicótico, un agente antiansiedad, un agente antidepresivo, un anorexigénico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente antiinflamatorio esteroideo, un antioxidante, un agente vasoactivo, un agente osteoactivo, un agente antiartrítico y un agente antineoplásico.

8. Vesícula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que dicha molécula exógena de interés es un agente antineoplásico.

9. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés, como vehículo útiles para la transferencia in vitro y/o ex vivo de dicha molécula exógena de interés a una célula de mamífero.

10. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés, para la preparación de un vehículo útil para la transferencia in vivo de dicha molécula exógena de interés a una célula de mamífero.

11. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica según cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en la que dicha molécula exógena de interés es un agente antineoplásico.

12. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha célula de mamífero es una célula humana.

13. Utilización de una vesícula de ameba no patogénica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que dicha célula de mamífero es resistente a múltiples fármacos.

14. Método para la transferencia in vitro y/o ex vivo de una molécula de interés a una célula de mamífero, comprendiendo dicho método la etapa que consiste de poner en contacto una célula de mamífero con una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula exógena de interés, bajo condiciones suficientes para permitir que la vesícula se fusione con la célula de mamífero, de manera que dicha molécula exógena de interés se transfiere a la célula de mamífero.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la ameba no patogénica es Dictyostelium discoideum.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en el que dicha molécula exógena de interés es un agente antineoplásico.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que dicha célula de mamífero es una célula humana.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que dicha célula de mamífero es resistente a múltiples fármacos.

19. Composición farmacéutica que comprende una vesícula de ameba no patogénica que contiene una molécula terapéutica conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en la que dicha molécula terapéutica es un agente antineoplásico.