ES2332025T3 - Nuevos receptores de mamiferos acoplados a la proteina g que tienen regiones extracelulares de repeticion ricas en leucina. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico aislado que codifica una proteína humana, en el que dicha proteína de mamífero comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:

Description

Nuevos receptores de mamíferos acoplados a la proteína G que tienen regiones extracelulares de repetición ricas en leucina.

Campo de la invención

El campo de esta invención es la familia de proteínas receptoras acopladas a la proteína G.

Antecedentes

Las gonadotropinas (hormona luteinizante, LH; hormona de estimulación de folículos, FSH; gonadotropina coriónica, CG) y la tirotropina (TSH)) son esenciales para el crecimiento y la diferenciación de las gónadas y la glándula tiroides, respectivamente. Estas hormonas de glicoproteína se unen a receptores celulares diana específicos sobre la membrana de plasma para activa la trayectoria de proteína cAMP quinasa A.

Los receptores para LH, FSH y TSH a la gran familia de proteínas de siete transmembranas acopladas con proteína G, pero son únicos en tener un gran dominio extracelular de terminal N (ecto-) que contienen repeticiones ricas en leucina importantes para la interacción con grandes ligandos de glicoproteínas. Los estudios sugieren que en estos receptores, la región de repetición extracelular rica en leucina sirve como un "guante de béisbol" que recoge de manera eficiente su correspondiente gran ligando de hormona y lo orienta para su interacción con el dominio de siete transmembranas helicoidales del receptor.

Como las hormonas y los receptores juegan un papel prominente en una variedad de procesos fisiológicos, hay un interés continuado en la identificación de receptores nuevos y sus ligandos, así como los genes que los codifican.

Literatura Relevante

Las referencias de interés incluyen: el Tayar, N, "Advances in the Molecular Understanding of Gonadotropins-Receptors Interactions", Mol. Cell. Endocrinol. (20 diciembre 1996).125: 65-70; Bhowmick et al., "Determination of Residues Important in Hormone Binding to the Extracellular Domain of the Luteinizing Hormone/Chorionic Gonadotropin Receptor by Site-Directed Mutagenesis and Modeling", Mol. Endocrinol. (Septiembre 1996) 10: 1147-1159; Thomas et al., "Mutational Analyses of the Extracellular Domain of the Full-Length Lutropin/Choriogonadotropin Receptor Suggest Leucine-Rich Repeats 1-6 are Involved in Hormone Binding", Mol. Endocrinol. (Junio 1996) 10:760-768; Segaloff & Ascoli, "The Gonadotropin Receptors: Insights from the Cloning of their cDNAs", Oxf. Rev. Reprod. Biol. (1992) 14: 141-168; Braun et al., "Amino-Terminal Leucine-Rich Repeats in Gonadotropin Receptors Determine Hormone Selectivity", EMBO J (Julio 1991) 10: 1885-1890; and Segaloff et al., "Structure of the Lutropin/Choriogonadotropin Receptor", Recent Prog. Horn. Res. (1990) 46: 261-301. La patente US-A-5614363 describe una proteína que tiene la actividad biológica de un receptor de hormona de estimulación de la tiroides (TSH). Las siguientes dos entradas de bases de datos se refieren a secuencias de ADNc también se citan en la técnica:

Acceso base de datos no. T73957 (yc54f09.r1 Hígado Stratagene (#937224) Clon ADNc Homo sapiens IMAGEN:84521) Acceso Base de datos no. AA678095 (zi13h07.s1. Bazo hígado fetal Soares 1NFLS S1. Clon ADNc Homo sapiens 430717).

Descripción de la invención

La invención se refiere a un nuevo receptor de mamífero acoplado a proteína G que tiene dominios de repetición extracelulares ricos en leucina, es decir, LGR4 (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2), y sus composiciones de polipéptidos, así como composiciones de nucleótidos que los codifican.

Así, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de mamífero, en el que dicha proteína de mamífero comprende una secuencia de aminoácido con por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

La invención también proporciona un ácido nucleico aislado, en el que la secuencia de nucleótido de dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos un 75% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1 o su secuencia complementaria, y un ácido nucleico aislado que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o su secuencia complementaria.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2.

En otro aspecto, la invención proporciona un animal transgénico no humano, en el que dicho animal en su forma nativa comprende un gen que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2, y dicho gen se modifica en el animal transgénico mediante una inserción o eliminación de ácido nucleico introducida en dicho gen.

Las proteínas, el polipéptido y las composiciones de ácido nucleico objetivo encuentran uso en una variedad de diferentes aplicaciones, incluyendo la identificación de genes homólogos o relacionados; la producción de composiciones que modulan la expresión o función de las proteínas objetivo; en la identificación de ligandos endógenos para los receptores huérfanos objetivos; en la generación de proteínas de unión funcional para la neutralización de las acciones de los ligandos endógenos; en la terapia génica; en el mapeado de las regiones funcionales de la proteína; y en el estudio de trayectorias fisiológicas asociadas. Además, la modulación de la actividad génica in vivo puede ser útil para propósitos profilácticos y terapéuticos, y similares.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 proporciona el nucleótido y la secuencia de aminoácidos para LGR4 humano.

La figura 2 proporciona una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de LGR4 y 5 ADNcs y los que codifican los receptores FSH y LH.

Descripción de las realizaciones específicas

Se proporciona un nuevo receptor acoplado a proteína G de mamífero que tiene regiones de repetición extracelulares ricas en leucina (es decir, LGR4) y composiciones de polipéptido relacionadas con las mismas, así como composiciones de ácido nucleico que codifican los mismos. Las composiciones de polipéptido y/o ácido nucleico objetivo encuentran uso en una variedad de diferentes aplicaciones, incluyendo la identificación de genes homólogos o diferentes, incluyendo la identificación de genes homólogos o relacionados; para la identificación de ligandos endógenos para estos nuevos receptores; la producción de composiciones que modulan la expresión o función de los receptores; para terapia génica; para mapeado de las regiones funcionales de los receptores; en el estudio de trayectorias fisiológicas asociadas; para propósitos profilácticos y terapéuticos in vivo; como inmunogenes para producir anticuerpos; en el cribado de agentes biológicamente activos; y similares.

Antes de describir más la invención, debe entenderse que la invención no está limitada a las realizaciones particulares de la invención descritas a continuación, ya que se puede hacer variaciones de las realizaciones particulares y estar todavía dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. También debe entenderse que la terminología utilizada es para el propósito de describir realizaciones particulares, y no está pensada para ser limitativa. Por el contrario, el alcance de la presente invención se establecerá mediante las reivindicaciones adjuntas.

En esta memoria y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencia plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado que los entendidos comúnmente por parte de un experto en la materia a la cual pertenece la invención.

Caracterización de LGR4

El LGR4 es un nuevo receptor de mamífero de la familia de proteínas de siete transmembranas acoplado a la proteína G, específicamente la subfamilia de proteínas de siete transmembranas acoplada a la proteína G que se caracterizan por la presencia de regiones de repetición extracelulares ricas en leucina. Como tal, esta proteína tiene segmentos de transmembrana y regiones extracelulares similares a las encontradas en los receptores LH, FSH, y TSH conocidos. En otras palabras, esta proteína tiene una región de siete transmembranas acoplada a la proteína G y un dominio extracelular de repetición rico en leucina. Los dominios extracelulares de terminal N de estas proteínas también muestran alta homología con proteínas Slit y Toll Drosophila que tienen repeticiones ricas en leucina. Esta proteína se expresa en diversos tejidos.

El gen LGR4 gene tiene una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO:01. El producto del gen LGR4 humano tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO:02. LGR4 se expresa en una pluralidad de diferentes tipos de tejidos, incluyendo ovario, testículos, adrenal, placenta, hígado, riñón e intestino.

El gen LGR5 humano tiene una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO:03. El producto del gen LGR5 tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO:04.

El gen de forma corta LGR7 humano tiene una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO:05. EL producto del gen de forma corta LGR7 tiene una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID NO:07. El producto del gen de forma larga LGR7 tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID
NO:08.

Identificación de LGR4

Homólogos de LGR4 se identifican mediante cualquier de una serie de procedimientos. Un fragmento del ADNc previsto se puede usar como sonda de hibridación contra una librería de ADNc a partir del organismo diana de interés, donde se utilizan condiciones de baja estringencia. La sonda puede ser un fragmento grande, o uno o más primeros cortos degenerados.

Los ácidos nucleicos que tienen similitud de secuencia se detectan mediante hibridación bajo condiciones de bajo estringencia, por ejemplo, a 50ºC y 6xSSC (0,9 M cloruro de sodio/0,09 M citrato de sodio) y permanecen unidos cuando se someten a lavado a 55ºC en 1xSSC (0,15 M cloruro de sodio/0,015 M citrato de sodio). La identidad de secuencia se puede determinar mediante hibridación bajo condiciones estringentes, por ejemplo a 50ºC o más y 0,1xSSC (15 mM cloruro de sodio/01,5 mM citrato de sodio). Los ácidos nucleicos que tienen una región de identidad substancial con el LGR4, secuencia, por ejemplo, variantes alélicas, versiones genéticamente alteradas del gen, etc., previstas se unen a las secuencias previstas bajo condiciones estringentes de hibridación. Mediante la utilización de sondas, particularmente sondas marcadas de secuencias de ADN, uno puede aislar genes homólogos o relacionados. La fuente de los genes homólogos puede ser cualquier especie, por ejemplo, especies de primates, particularmente humanas; roedores, tales como ratas y ratones; caninos; felinos; bovinos; ovinos; equinos; levadura; nematodos; etc.

Entre las especies de mamíferos, por ejemplo, humanos y ratones, los homólogos tienen una similitud de secuencia substancial, por ejemplo, por lo menos una identidad de secuencia del 75%, usualmente por lo menos del 90%, más usualmente por lo menos del 95% entre las secuencias de nucleótidos. La similitud de secuencia se calcula basada en una secuencia de referencia, que puede ser una subserie de una secuencia mayor, tal como un motivo conservado, región de codificación, región de flanqueo, etc. Una secuencia de referencia tendrá usualmente por lo menos una longitud de 18 nt, más usualmente por lo menos una longitud de 30 nt aproximadamente, y puede extenderse a la secuencia completa que se compara. Los algoritmos para el análisis de secuencia son conocidos en la técnica, tal como BLAST, descrito en Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. A menos que se especifique lo contrario, todos los números de análisis de secuencia aquí proporcionados son tal como se determinan con el programa BLAST usando ajustes por defecto. Las secuencias aquí provistas son esenciales para el reconocimiento de proteínas relacionadas con LGR4, LGR5 y LGR7 y homólogas en búsquedas de bases de datos.

Composiciones de ácido nucleico LGR4

Los ácidos nucleicos que codifican LGR4 pueden ser ADNc o ADN genómico o un fragmento de los mismos. El término "gen LGR4" se pretende que signifique el marco de lectura abierto que codifica el polipéptido LGR4 específico, e intrones LGR4, así como secuencias de nucleótidos de no codificación 5' y 3' adyacentes implicadas en la regulación de la expresión, hasta aproximadamente 20 kb más allá de la región de codificación, pero posiblemente también en cualquier dirección. El gen se puede introducir en un vector apropiado para mantenimiento cromosómico extra o para integración en un genoma huésped.

El término "ADNc" tal como se usa aquí se pretende que incluya todos los ácidos nucleicos que comparten la disposición de los elementos de la secuencia encontrados en las especies de ARNm maduro nativo, donde los elementos de la secuencia son exones y regiones de no codificación 3' y 5'. Normalmente, las especies ARNm tiene exones contiguos, con los intrones de intervención, cuando están presentes, retirados mediante separación de ARN nuclear, para crear un marco de lectura abierta continuo que codifica una proteína LGR4.

Una secuencia genómica de interés comprende el ácido nucleico presente entre el codón de iniciación y el codón de terminación, tal como se define en las secuencias listadas, incluyendo todos los intrones que están normalmente presentes en un cromosoma nativo. También puede incluir las regiones de no translación 3' y 5' encontradas en el ARNm maduro. También puede incluir secuencias regulatorias transcripcionales y translacionales, tales como promotores, mejoradores, etc., que incluyen aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más, de ADN genómico de flanqueo en el extremo 5' o 3' de la región transcrita. El ADN genómico se puede aislar como un fragmento de 100 kbp o menor; y substancialmente libre de secuencia cromosómica de flanqueo. El ADN genómico que flanquea la región de codificación, 3' o 5', o secuencias regulatorias internas como se encuentran a veces en intrones, contiene secuencias requeridas para el tejido adecuado y la expresión de etapa específica.

La secuencia de la región de flanqueo 5' se puede utilizar para los elementos promotores, incluyendo sitios de unión de mejorador, que prevén la regulación del desarrollo en tejidos donde se expresa el LGR4. La expresión específica del tejido es útil para determinar el diseño de expresión, y para proporcionar promotores que imitan el diseño nativo de la expresión. Los polimorfismos que se producen naturalmente en la región del promotor son útiles para determinar las variaciones naturales en la expresión, particularmente aquellas que se pueden asociar con el trastorno.

Alternativamente, se pueden introducir mutaciones en la región del promotor para determinar el efecto de la expresión de alteración en sistemas definidos experimentalmente. Los procedimientos para la identificación de los motivos de ADN específicos implicados en la unión de factores transcripcionales son conocidos en la técnica, por ejemplo, similitud de secuencia en motivos de unión conocidos, estudios de retardo de gel, etc. Para ejemplos, ver Blackwell et al. (1995), Mol. Med. 1:194-205; Mortlock et al. (1996), Genome Res. 6:327-33; y Joulin and Richard-Foy (1995), Eur. J. Biochem. 232:620-626.

Las secuencias regulatorias se pueden usar para identificar secuencias de acción cis requeridas para la regulación transcripcional o translacional de expresión de LGR4, especialmente en diferentes tejidos o etapas de desarrollo, y para identificar secuencias de acción cis y factores de acción trans que regulan o median la expresión de LGR4. Estas regiones de control de transcripción o translacionales se pueden enlazar de manera operativa con un gen LGR4 para promover la expresión de LGR4 de tipo salvaje o alterado u otras proteínas de interés en células cultivadas, o en tejidos embriónicos, fetales o adultos, y para terapia génica.

Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención pueden codificar todos o una parte de los polipéptidos del objeto. Se pueden obtener fragmentos de cadena doble o simple de la secuencia de ADN mediante el sintetizado químico de oligonucleótidos según procedimientos convencionales, mediante digestión de enzimas de restricción, mediante amplificación PCR, etc. Para la mayor parte, los fragmentos de ADN serán de por lo menos 15 nt, usualmente por lo menos 18 nt o 25 nt, y puede ser por lo menos de 50 nt aproximadamente. Estos pequeños fragmentos de ADN son útiles como primeros para PCR, sondas de cribado de hibridado, etc. Los fragmentos de ADN mayores, es decir, mayor de 100 nt son útiles para la producción del polipéptido codificado. Para su uso en reacciones de amplificación, tal como PCR, se utilizarán un par de primeros. La composición exacta de las secuencias de primeros no es crítica en la invención, pero para la mayoría de aplicaciones los primeros se hibridarán en la secuencia objeto bajo condiciones estringentes, como es conocido en la técnica. Es preferible elegir un par de primeros que generarán un producto de amplificación de por lo menos 50 nt, preferiblemente por lo menos 100 nt aproximadamente. Los algoritmos para la selección de las secuencias de primeros son generalmente conocidos, y están disponibles en paquetes de software comerciales. Los primeros de amplificación hibridan en cadenas de ADN complementarias, y primarán entre sí.

El gen LGR4 se aísla y obtiene en pureza substancial, generalmente como otros que un cromosoma intacto. Usualmente, el ADN se obtendrá substancialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico que no incluyen una secuencia LGR4 o fragmento de la misma, siendo generalmente por lo menos del 50%, usualmente por lo menos un 90% pura aproximadamente y son típicamente "recombinantes", es decir, flanqueadas por uno o más nucleótidos con los que no está normalmente asociada en un cromosoma que se produce de manera natural.

El ADN también se puede usar para la expresión de identificación del gen en un espécimen biológico. La manera en la cual unas células de sonda para la presencia de secuencias de nucleótidos particulares, como ADN o ARN genómico, está bien establecida en la literatura y no requiere aquí elaboración. El ADN o ARNm se aísla de una muestra celular. EL ARNm se puede amplificar mediante RT-PCR, usando transcriptasa inversa para formar una cadena de ADN complementario, seguido por amplificación de reacción de la cadena de polimerasa usando primeros específicos para las secuencias de ADN de objeto. Alternativamente, la muestra de ARNm se separa mediante electroforesis con gel, se transfiere a un soporte adecuado, por ejemplo, nitrocelulosa, nylon, etc., y a continuación se sonda con un fragmento del ADN de objeto como una sonda. Otras técnicas, tales como ensayos de ligado de oligonucleótidos, hibridaciones in situ, e hibridación en sondas de ADN dispuestas en una porción sólida también pueden encontrar uso. La detección de ARNm que se híbrida a la secuencia del objeto es indicativa de la expresión del gen LGR4 en la muestra.

La secuencia de un gen LGR4, incluyendo las regiones promotoras de flanqueo y regiones de codificación, se puede mutar de diferentes maneras conocidas en la técnica para generar cambios marcados en la resistencia del promotor, la secuencia de la proteína codificada, etc. La secuencia de ADN o producto de la proteína de esta mutación será usualmente substancialmente similar a las secuencias aquí previstas, es decir, diferirán en por lo menos un nucleótido o aminoácido, respectivamente, y pueden diferir en por lo menos dos pero no más de aproximadamente diez nucleótidos o aminoácidos. Los cambios de la secuencia pueden ser sustituciones, inserciones, eliminaciones, o una combinación de los mismos. Las eliminaciones también pueden incluir cambios mayores, tal como eliminaciones de un dominio o exón. Otras modificaciones de interés incluyen marcado de epítopes, por ejemplo con el sistema FLAG, HA, etc. Para estudios de localización subcelular, se pueden usar proteínas de fusión con proteínas de fluorescencia verde (GFP).

Se conocen técnicas para la mutagénesis in vitro de genes clonados. Ejemplos de protocolos para mutagénesis específica del sitio se pueden encontrar en Gustin et al. (1993), Biotechniques 14:22; Barany (1985), Gene 37:111-23; Colicelli et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199:537-9; and Prentki et al. (1984), Gene 29:303-13. Procedimientos para mutagénesis específica del sitio se pueden encontrar en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15.3-15.108; Weiner et al. (1993), Gene 126:35-41; Sayers et al. (1992), Biotechniques 13:592-6; Jones y Winistorfer (1992), Biotechniques 12:528-30; Barton et al. (1990), Nucleic Acids Res 18:7349-55; Marotti y Tomich (1989), Gene Anal. Tech. 6:67-70; y Zhu (1989), Anal Biochem 177:120-4. Estos genes mutados se pueden usar para estudiar relaciones entre la estructura y la función del LGR4 o para alterar las propiedades de la proteína que afectan a su función o regulación.

Polipéptidos LGR4

También se proporcionan mediante la presente invención composiciones de polipéptidos LGR4. El término composición de polipéptidos tal como se usa aquí se refiere a las proteínas de longitud completa y a porciones o fragmentos de las mismas. También se incluyen en este término las variaciones de las proteínas que se producen naturalmente, donde estas variaciones son homólogas o substancialmente similares a la proteína que se produce naturalmente, ser la proteína que se produce naturalmente proteína humana, proteína de ratón, o proteína de alguna otra especie que expresa naturalmente una proteína LGR4, usualmente una especie de mamífero. Una proteína homóloga candidata es substancialmente similar a una proteína LGR4 de la presente invención, y por lo tanto es una proteína LGR4 de la presente invención, si la proteína candidata tiene una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente un 80%, usualmente por lo menos un 90% aproximadamente y más usualmente por lo menos un 98% de identidad de secuencia con una proteína LGR4, tal como se mide mediante BLAST, supra. En la siguiente descripción de la invención, el término "proteína LGR4" se utiliza para referirse no solamente a la proteína LGR4 humana, sino también a homólogos de la misma expresados en especies no humanas, por ejemplo murina, rata y otras especies de mamíferos.

El gen del objeto se puede utilizar para producir todos o porciones de los polipéptidos LGR4. Mediante "polipéptido/proteína LGR4" se indica una secuencia de aminoácido codificada mediante un marco de lectura abierta (ORF) de genes LGR4, incluyendo el polipéptido nativo de longitud completa y fragmentos del mismo, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales, por ejemplo regiones extracelulares; e incluyendo fusiones de los polipéptidos del objeto en otras proteínas o partes de los mismos, por ejemplo proteínas quiméricas. Para la expresión, se puede utilizar un casete de expresión. El vector de expresión proporcionará una región de iniciación transcripcional y translacional, que puede ser inducible o constitutiva, donde la región de codificación está operativamente enlazada bajo el control transcripcional de la región de iniciación transcripcional, y una región de terminación transcripcional y translacional. Estas regiones de control pueden ser nativas en un gen LRG4, o se pueden derivar de fuentes exógenas.

Los vectores de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes situados cerca de la secuencia promotora para prever la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas heterólogas. Un marcador seleccionable operativo en el huésped de expresión puede estar presente. Los vectores de expresión se pueden usar para la producción de proteínas de fusión, donde el péptido de fusión exógeno proporciona una funcionalidad adicional, es decir, síntesis de proteína mejorada, estabilidad, reactividad con antisueros definidos, un marcador de enzima, por ejemplo \beta-galactosidasa, etc.

Se pueden preparar casetes de expresión que comprenden una región de iniciación de la transcripción, el gen o fragmento del mismo, y una región de terminación transcripcional. De particular interés es la utilización de secuencias que permiten la expresión de epítopes o dominios funcionales, usualmente por lo menos con 8 aminoácidos de longitud, más usualmente por lo menos aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, a aproximadamente 25 aminoácidos, y hasta el marco de lectura abierta completo del gen. Después de la introducción del ADN, las células que contienen la construcción se pueden seleccionar mediante un marcador seleccionable, las células expandidas y a continuación utilizadas para la expresión.

Los polipéptidos de LGR4 se pueden expresar en procariotas o eucariotas según maneras convencionales, dependiendo del propósito de la expresión. Para la producción a gran escala de la proteína, un organismo unicelular, tal como E. coli. B. subtilis, S. cerevisiae, se pueden usar células de insecto en combinación con vectores de baculovirus, o células de un organismo superior tal como vertebrados, particularmente mamíferos, por ejemplo, células COS 7, como células huésped de expresión. En algunas situaciones, es deseable expresar el LGR4, gen en células eucarióticas, donde la proteína LGR4 se beneficiará del plegamiento nativo y las modificaciones post-translacionales. También se pueden sintetizar pequeños péptidos en el laboratorio. Se pueden usar polipéptidos que son subseries de la secuencia LGR4 completa para identificar e investigar partes de la proteína importantes para la función o elevar los anticuerpos dirigidos contra estas regiones.

Para la producción del dominio extracelular del receptor LGR4, se puede usar la aproximación del receptor anclado tal como se describe en Osuga et al, Mol. Endocrinol. (1997) 11: 1659-1668. De una manera similar, se puede usar la aproximación del receptor quimérico descrito en Kudo et al, J Biol. Chem. (1996) 271; 22470-22478.

Estos péptidos encuentran uso en la identificación de ligandos endógenos y en cribado de fármacos para agonistas y antagonistas usando procedimientos descritos en Osuga, supra. Los dominios extracelulares solubilizados encuentran uso como agentes terapéuticos, por ejemplo, en la neutralización de la acción de los ligandos endógenos.

Con la disponibilidad de la proteína o fragmentos de la misma en grandes cantidades, mediante la utilización de un huésped de expresión, la proteína se puede aislar y purificar según maneras convencionales. Un lisato se puede preparar del huésped de expresión y el lisato purificar usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis de gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de purificación. La proteína purificada será generalmente por lo menos un 80% pura aproximadamente, preferiblemente por lo menos un 90% pura aproximadamente, y puede ser de hasta e incluyendo un 100% pura. Pura se pretende que signifique libre de otras proteínas, así como suciedad celular.

Los polipéptidos LGR4 expresados son útiles para la producción de anticuerpos, donde los fragmentos cortos proporciona anticuerpos específicos para el polipéptido particular, y fragmentos mayores o la proteína entera permiten la producción de anticuerpos sobre la superficie del polipéptido. Se pueden producir anticuerpos de tipo salvaje o formas variantes de LGR4. Se pueden producir anticuerpos para aislar péptidos correspondientes a estos dominios, o en la proteína nativa.

Los anticuerpos se preparan según maneras convencionales, donde el polipéptido o la proteína expresada se usa como un inmunogen, por sí mismo o conjugado en portadores inmunogénicos conocidos, por ejemplo KLH, pre-S HBsAg, otras proteínas virales o eucarióticas, o similares. Se pueden utilizar varios adyuvantes, con una serie de inyecciones, tal como sea apropiado. Se pueden producir anticuerpos policlonales y monoclonales. Para los anticuerpos monoclonales, después de una o más inyecciones de activación, el bazo se aísla, los linfocitos se inmortalizan mediante fusión celular, y a continuación se criban para unión de anticuerpo de alta afinidad. Las células inmortalizadas, es decir, hibridomas, que producen los anticuerpos deseados se pueden expandir a continuación. Para más descripción, ver Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1988. Si se desea, el ARNm que codifica las cadenas pesadas y ligeras se puede aislar y mutagenizar mediante clonación en E. coli, y mezclar las cadenas pesadas y ligeras para mejorar más la afinidad del anticuerpo. Alternativas a inmunización in vivo como procedimiento de producir anticuerpos incluyen unión a librerías de "visualización" de fagos, usualmente en conjunción con maduración de afinidad in vitro.

Usos de diagnóstico

Las composiciones de ácido nucleico y/o polipéptido del objeto se pueden usar para analizar una muestra del paciente para la presencia de polimorfismos asociados con un estado de trastorno o predisposición genética a un estado de trastorno. Los estudios bioquímicos se pueden realizar para determinar si un polimorfismo de secuencia en una región de codificación LGR4 o regiones de control está asociado con un trastorno. Los polimorfismos asociados con trastornos pueden incluir la eliminación o el truncado del gen, mutaciones que alteran el nivel de expresión, que afecta la actividad de la proteína, y similares.

Los cambios en la secuencia promotora o mejoradora que pueden afectar los niveles de expresión del LGR4 se pueden comparar con los niveles de expresión de alelo normal mediante varios procedimientos conocidos en la técnica. Los procedimientos para determinar la resistencia del promotor o mejorador incluyen la cuantificación de la proteína natural expresada; la inserción del elemento de control variante en un vector con un gen reportero tal como \beta-galactosidasa, luciferasa, cloramfenicol acetiltransferasa, etc., que proporciona la cuantificación conveniente; y similares.

Están disponibles una pluralidad de procedimientos para analizar ácidos nucleicos para la presencia de una secuencia específica, por ejemplo un polimorfismo asociado a un trastorno. Cuando está disponibles grandes cantidades de ADN, se utiliza directamente ADN genómico. Alternativamente, la región de interés se clona en un vector adecuado y crece en cantidad suficiente para su análisis. Las células que expresan LGR4, LGR5 o LGR7 se pueden usar como fuente de ARNm, que se puede ensayar directamente o transcribir inversa en ADNc para su análisis. El ácido nucleico se puede amplificar mediante técnicas convencionales, tal como la reacción de cadena de polimerasa (PCR), para proporcionar cantidades suficientes para el análisis. La utilización de la reacción de cadena de polimerasa se describe en Saiki, et al. (1985), Science 239:487, y una revisión de técnicas se puede encontrar en Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 14.2-14.33. Alternativamente, varios procedimientos son conocidos en la técnica que utilizan ligado de oligonucleótidos como medios de detección de polimorfismos, por ejemplo ver Riley et al. (1990), Nucl. Acids Res. 18:2887-2890; y Delahunty et al. (1996), Am. J. Hum. Genet. 58:1239-
1246.

Se puede incluir una marca detectable en una reacción de amplificación. Las marcas adecuadas incluyen fluorocromos, por ejemplo fluoresceína isotiocianato (FITC), rodamina, Texas Red, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM) o N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), marcas radiactivas, por ejemplo ^{12}P, ^{35}S, ^{3}H; etc. La marca puede ser un sistema de dos etapas, donde el ADN amplificado se conjunta en biotina, haptenos, etc. que tienen un socio de unión de alta afinidad, por ejemplo avidina, anticuerpos específicos, etc., donde el socio de unión se conjuga en una marca detectable. La marca se puede conjugar en uno o dos de los primeros. Alternativamente, se marca la reserva de nucleótidos utilizada en la amplificación, para incorporar la marca en el producto de amplificación.

La muestra de ácido nucleico, por ejemplo un fragmento amplificado o clonado, se analiza mediante uno de una pluralidad de procedimientos conocidos en la técnica. El ácido nucleico se puede secuenciar mediante dideoxi u otros procedimientos, y la secuencia de bases comparada con una secuencia LGR4 de tipo salvaje. La hibridación con la secuencia variante también se puede usar para determinar su presencia, mediante Southern blots, dot blots, etc. El patrón de hibridación de una secuencia de control y variante en una disposición de sondas de oligonucleótidos inmovilizadas sobre un soporte sólido, tal como se describe en la patente US 5.445.934, o en la patente WO 95/35505 (cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia), también se pueden usar como medios de detección de la presencia de secuencias variantes. El análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP), electroforesis de gel de gradiente de desnaturalización (DGGE), y análisis heterodúplex en matrices de gel se utilizan para detectar cambios conformacionales creados por la variación de la secuencia de ADN como alteraciones en la movilidad electroforética. Alternativamente, si un polimorfismo crea o destruye un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción, la muestra se digiere con esa endonucleasa, y se fracciona el tamaño de los productos para determinar si el fragmento se ha digerido. El fraccionamiento se realiza mediante electroforesis de gel o capilar, particularmente geles de acrilamida o agarosa.

El cribado para las mutaciones en LGR4 se puede basar en las características funcionales o antigénicas de la proteína. Los ensayos de truncado de proteínas son útiles en la detección de eliminaciones que pueden afectar la actividad biológica de la proteína. Varios inmunoensayos diseñados para detectar polimorfismos en proteínas LGR4 se pueden usar en el cribado. Cuando muchas mutaciones genéticas diversas producen un fenotipo de trastorno particular, los ensayos de proteínas funcionales se han probado herramientas efectivas de cribado. La actividad de la proteína LGR4 codificada se puede determinar mediante comparación con la proteína de tipo salvaje.

Los anticuerpos específicos para proteínas LGR4 se pueden usar en teñido o en inmunoensayos. Las muestras, tal como se usan aquí, incluyen fluidos biológicos tales como semen, sangre, fluido cerebroespinal, lágrimas, saliva, linfa, fluido de diálisis y similares; fluidos derivados de cultivo de órganos o tejido; y fluidos extraídos de tejidos fisiológicos. También se incluyen en el término son derivados y fracciones de estos fluidos. Las células se pueden disociar, en el caso de tejidos sólidos, o se pueden analizar secciones de tejido. Alternativamente, se puede preparar un
lisato.

El diagnóstico se puede realizar mediante una pluralidad de procedimientos para determinar la ausencia o presencia o cantidades alteradas de LGR4 normal o anormal en células de pacientes. Por ejemplo, la detección puede utilizar el teñido de células o secciones histológicas, realizada según procedimientos convencionales. Las células se permeabilizan para teñir moléculas citoplásmicas. Los anticuerpos de interés se añaden a la muestra celular, y se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión al epítope, usualmente por lo menos 10 minutos aproximadamente. El anticuerpo se puede marca con radioisótopos, enzimas, fluorescedores, quemiluminescedores, u otras marcas para la detección directa. Alternativamente, se utiliza un anticuerpo o reactivo de segunda etapa para amplificar la señal. Estos reactivos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo primario se puede conjugar a biotina, con avidina conjugada de peroxidasa de rábano picante añadida como reactivo de segunda etapa. Alternativamente, el anticuerpo secundario conjugado en un compuesto fluorescente, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, etc. La detección final usa un substrato que sufre un cambio de color en presencia de la peroxidasa. La ausencia o presencia de la unión del anticuerpo se puede determinar mediante varios procedimientos, incluyendo citometría de flujo de células disociadas, microscopio, radiografía, contaje de escintilación, etc.

También se puede realizar un cribado de diagnóstico para polimorfismos que están genéticamente vinculados con una predisposición a un trastorno, particularmente a través del uso de marcadores microsatélite o polimorfismos de núcleotidos simples. Frecuentemente, el propio polimorfismo microsatellite no se expresa de manera fenotípica, sino que está enlazado con secuencias que producen una predisposición a trastornos. Sin embargo, en algunos casos la propia secuencia microsatélite puede afectar a la expresión génica. El análisis del enlace microsatélite se puede realizar en solitario o en combinación con la detección directa de polimorfismos, tal como se describe anteriormente. La utilización de marcadores microsatélite para genotipo está bien documentada. Por ejemplo, ver Mansfield et al. (1994), Genomics 24:225-233; Ziegle et al. (1992), Genomics 14:1026-1031; Dib et al., supra.

Modulación de la expresión génica LGR4

Los genes LGR4, fragmentos de gen, o la proteína LGR4 o los fragmentos de proteínas, son útiles en la terapia génica para tratar desórdenes asociados con defectos LGR4. Los vectores de expresión se pueden usar para introducir el gen LGR4 en una célula. Estos vectores generalmente tienen sitios de restricción convenientes situados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de las secuencias de ácido nucleico. Se pueden preparar casetes de transcripción que comprenden una región de iniciación de la transcripción, el gen diana o un fragmento del mismo, y una región de terminación transcripcional. Los casetes de transcripción se pueden introducir en una variedad de vectores, por ejemplo plásmido; retrovirus, por ejemplo lentivirus; adenovirus; y similares, donde los vectores pueden mantenerse de manera transitoria o estable en las células, usualmente durante un periodo de por lo menos un día aproximadamente, más usualmente durante un periodo de por lo menos varios días a varias semanas aproximadamente.

El gen o la proteína LGR4 se puede introducir en tejidos o células huésped mediante cualquier número de rutas, incluyendo infección viral, microinyección, o fusión de vesículas. También se puede usar inyección de chorro para administración intramuscular, tal como se describe por parte de Furth et al. (1992), Anal Biochem 205:365-368. El ADN se puede recubrir sobre micropartículas de oro, y suministrarse de manera intradermal mediante un dispositivo de bombardeo de partículas, o "pistola de genes" tal como se describe la literatura (ver, por ejemplo, Tang et al. (1992), Nature 356:152-154), donde microproyectiles de oro están recubiertos con el ADN LGR4, LGR5 o LGR7, y a continuación se bombardean en células de la piel.

Se pueden usar moléculas antisentido para regular de manera descendente la expresión del LGR4 en células. El reactivo antisentido puede ser oligonucleótidos antisentido (ODN), particularmente ODN sintético que tiene modificaciones químicas respecto a los ácidos nucleicos nativos, o construcciones de ácido nucleico que expresan estas moléculas antisentido como ARN. La secuencia antisentido es complementaria al ARNm del gen diana, e inhibe la expresión de los productos del gen diana. Las moléculas antisentido inhiben la expresión génica a través de varios mecanismos, por ejemplo, reduciendo la cantidad de ARNm disponible para la traducción, a través de la activación de ARNse H, o impedimento estérico. Se puede administrar una o una combinación de moléculas antisentido, donde una combinación por comprender diferentes secuencias múltiples.

Las moléculas antisentido se pueden producir mediante la expresión de toda una parte de la secuencia del gen diana en un vector apropiado, donde la iniciación transcripcional está orientada de manera que se produce una cadena antisentido como una molécula de ARN. Alternativamente, la molécula antisentido es un oligonucleótido sintético. Los oligonucleótidos antisentido generalmente tendrán una longitud de por lo menos 7 aproximadamente, usualmente por lo menos 12 aproximadamente, más usualmente por lo menos 20 nucleótidos, y una longitud de no más de 500 aproximadamente, usualmente no más de 50 aproximadamente, más usualmente no más que aproximadamente 35 nucleótidos, donde la longitud está gobernada por la eficiencia de inhibición, especificidad, incluyendo la ausencia de reactividad transversal, y similares. Se ha encontrado que los oligonucleótidos cortos, de entre 7 a 8 bases de longitud, pueden ser inhibidores fuertes y selectivos de la expresión génica (ver Wagner et al. (1996), Nature Biotechnol. 14:840-844).

Una región o regiones específicas de la secuencia de ARNm de cadena de sentido endógeno se eligen para ser complementadas mediante la secuencia antisentido. La selección de una secuencia específica para el oligonucleótido puede utilizar un procedimiento empírico, donde varias secuencias candidatas se ensayan para la inhibición de la expresión del gen diana en un modelo in vitro o animal. También se puede utilizar una combinación de secuencias, donde varias regiones de la secuencia de ARNm se seleccionan para la complementación antisentido.

Los oligonucleótidos antisentido se pueden sintetizar químicamente mediante procedimientos conocidos en la técnica (ver Wagner et al. (1993), supra, and Milligan et al., supra.). Los oligonucleótidos preferidos se modifican químicamente a partir de la estructura fosfodiéster nativa, para aumentar su estabilidad intracelular y afinidad de unión. Una serie de estas modificaciones se han descrito en la literatura, que alteran la química del esqueleto, azúcares o bases heterocíclicas.

Entre los cambios útiles en la química del esqueleto hay fosforotioatos; fosforoditioatos, donde los dos oxígenos que no son puentes están sustituidos con azufre; fosforoamiditas; alquil fosfotriésteres y boranofosfatos. Los derivados de fosfato aquirales incluyen 3'-O'-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-O-fosforotioato, 3'-CH_{2}-5'-O-fosfonato y 3'-NH-S'-O-fosforoamidato. Los ácidos nucleicos del péptido reemplazan todo el esqueleto de ribosa fosfodiéster con un enlace del péptido. También se utilizan modificaciones de azúcar para mejorar la estabilidad y la afinidad. Se puede utilizar el \alpha-anómero de deoxiribosa, donde la base se invierte respecto al \beta-anómero natural. El 2'-OH del azúcar de ribosa se puede alterar para formar azúcares 2'-O-metilo o 2'-O-alilo, que proporcionan resistencia a la degradación sin comprender afinidad. La modificación de las bases heterocíclicas debe mantener un emparejado de base adecuado. Algunas sustituciones útiles incluyen deoxiuridina para deoxitimidina; 5-metil-2'-deoxicitidina y 5-bromo-2'-deoxicitidina para deoxicitidina. 5-propinil-2'-deoxiuridina y 5-propinil-2'-deoxicitidina han mostrado que aumentan la afinidad y la actividad biológica cuando se sustituyen por deoxitimidina y deoxicitidina, respectivamente.

Como alternativa a los inhibidores antisentido, se pueden utilizar compuestos de ácido nucleico catalítico, por ejemplo, ribozimas, conjugados antisentido, etc. para inhibir la expresión génica. Las ribozimas se pueden sintetizar in vitro y administrar al paciente, o se pueden codificar en un vector de expresión, a partir del cual la ribozima se sintetiza en la célula diana (por ejemplo, ver la solicitud de patente internacional WO 9523225, y Beigelman et al. (1995), Nucl. Acids Res. 23:4434-42). Ejemplos de oligonucleótidos con actividad catalítica se describen en el documento WO 9506764. Conjugados de ODN antisentido con un complejo de metal, por ejemplo terpiridilCu(II), capaz de mediar en la hidrólisis del ARNm se describen en Bashkin et al. (1995), Appl. Biochem. Biotechnol. 54:43-56.

Células genéticamente alteradas o modelos de animales no humanos para función LGR4

Los ácidos nucleicos del objeto se pueden utilizar para generar animales no humanos transgénicos o modificaciones génicas específicas del sitio en líneas celulares. Los animales transgénicos se pueden hacer a través de la recombinación homóloga, donde se altera el locus LGR4 normal. Alternativamente, la construcción del ácido nucleico se integra de manera aleatoria en el genoma. Los vectores para la integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, YACs y similares.

Las células o animales modificados son útiles en el estudio de la función y la regulación del LGR4. Por ejemplo, se puede realizar una serie de pequeñas eliminaciones y/o sustituciones en el gen LGR4 nativo del huésped para determinar el papel de diferentes exones. De interés es la utilización de LGR4 para construir modelos de animales transgénicos para estados de trastornos. Las construcciones específicas de interés incluyen LGR4 antisentido que bloqueara la expresión del LGR4, la expresión de las mutaciones LGR4 negativas dominantes, y la sobreexpresión de los genes LGR4. Si se introduce una secuencia LGR4, la secuencia producida puede ser una secuencia completa o parcial de un gen LGR4 nativo del huésped, o puede ser una secuencia LGR4 completa o parcial que es exógena al animal huésped, por ejemplo, una secuencia LGR4 humana. Un marcador detectable, tal como lac Z se puede introducir en el locus LGR4, donde la regulación trascendente de la expresión del LGR4 resulta en un cambio fácilmente detectado en el fenotipo.

También se puede prever la expresión del gen LGR4 o variantes del mismo los tejidos donde no se expresan normalmente, en niveles no normalmente presentes en estas células o tejidos, o en momentos de desarrollo anormales. Mediante la provisión de la expresión de la proteína LGR4 en células en las cuales no se produce normalmente, se pueden inducir cambios en el comportamiento celular, por ejemplo, a través de la actividad mediada con LGR4.

Las construcciones de ADN para la recombinación homóloga comprenderán por lo menos una porción del gen LGR4, que puede ser nativo o no con las especies del animal huésped, en el que el gen tiene las modificaciones genéticas deseadas, e incluye regiones de homología en el locus diana. Las construcciones de ADN para la integración aleatoria no necesitan incluir regiones de homología para mediar en la recombinación. Convenientemente, se incluyen marcadores para selección positiva y negativa. Procedimientos para generar células que tienen modificaciones génicas diana a través de recombinación homóloga son conocidos en la técnica. Para varias técnicas de transfectar células de mamífero, ver Keown et al. (1990), Meth. Enzymol. 185:527-537.

Para células madre embriónicas (ES), se puede utilizar una línea celular ES no humana, o se pueden obtener de manera nueva células embriónicas a partir de huésped humano, por ejemplo, ratón, rata, cobaya, etc. estas células crecen en una capa de alimentación de fibroblastos apropiada o crecen en presencia de un factor de inhibición de leucemia (LIF). Cuando se han transformado células ES o embriónicas, se pueden utilizar para producir animales transgénicos. Después de la transformación, las células se colocan en placas sobre una capa de alimentación en un medio apropiado. Las células contienen la construcción se pueden detectar utilizando un medio selectivo. Después de un tiempo suficiente para el crecimiento de las colonias, se recogen y se analizan para la presencia de recombinación o integración homóloga de la construcción. Las colonias que son positivas se pueden utilizar a continuación para la manipulación de embriones e inyección de blastocistos. Los blastocistos se obtienen a partir de hembras superovuladas con una edad de cuatro a seis semanas. Las células ES se tripsinizan, las células modificadas se inyectan en el blastocelo del blastocisto. Después de la inyección, los blastocistos vuelven a cada cuerpo uterino de las hembras pseudoembarazadas. Las hembras se dejan a continuación que lleguen a término y la descendencia resultante se escriba para la construcción. Proporcionando un fenotipo diferente del blastocisto y las células genéticamente modificadas, se puede detectar fácilmente la progenie quimérica.

Los animales quiméricos se criban para la presencia del gen modificado y los machos y las hembras que tienen la modificación se cruzan para producir progenie homocigótica. Si las alteraciones genéticas provocan letalidad en algún punto del desarrollo, los tejidos u órganos se puede mantener como injertos o trasplantes alogénicos o congénicos, con cultivo in vitro. Los animales transgénicos puede ser cualquier mamífero no humano, tal como animales de laboratorio, animales domésticos, etc. Los animales transgénicos se pueden utilizar en estudios funcionales, cribado de fármacos, etc., por ejemplo para determinar el efecto de un fármaco candidato en LGR4 o activación génica relacionada, etc.

Modelos in vitro para función LGR4

La disponibilidad de una pluralidad de componentes en la familia del receptor acoplado de la proteína G, como se ha descrito anteriormente, permite la reconstrucción in vitro de los procesos sistemas en los cuales operan los elementos de esta familia. Dos o más de los componentes, tal como el receptor aislado y un ligando potencial por lo tanto, se pueden combinar in vitro, y el comportamiento se determina en términos de activación de la transcripción de secuencias diana específicas; la modificación de los componentes de la proteína, por ejemplo, procesamiento proteolítico, fosforilación, metilación, etc.; disponibilidad de diferentes componentes de la proteína para unirse entre sí. Los componentes se pueden modificar mediante eliminación de secuencia, sustitución, etc. para determinar el papel funcional de dominios específicos.

El privado de fármacos se puede realizar utilizando un modelo in vitro, una célula o animal alterado genéticamente, una proteína LGR4 purificada, así como fragmentos o porciones de la misma, por ejemplo, un dominio extracelular solubilizado o proteínas de receptor quimérico que comprenden el dominio extracelular LGR4. Se pueden identificar ligando los sustratos que se unen al y modulan la acción del LGR4. Las áreas de investigación incluyen el desarrollo de agentes que contrarrestan de manera beneficiosa anormalidades relacionadas con el LGR4 y la utilización de estos agentes en la terapia.

El cribado de fármacos identifica agentes que modulan la actividad de la función LGR4 en células anormales. De particular interés son los ensayos de cribado para agentes que tienen una baja toxicidad para células humanas. Una amplia variedad de ensayos se pueden utilizar para este propósito, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína in vitro marcadas, ensayos de cambio de movilidad electroforética, inmunoensayos para la unión de proteínas, y similares. La proteína purificada también se puede utilizar para la determinación de la estructura cristalina tridimensional, que se puede utilizar para interacciones entre moleculares de modelaje, tal como unión GTP, etc.

El término "agente" tal como se usa aquí describe cualquier molécula, por ejemplo proteína o farmacéutica, con la capacidad de alterar o imitar la función fisiológica del LGR4. Generalmente, se realizan una pluralidad de mezclas de ensayo en paralelo con diferentes concentraciones de agentes para obtener una respuesta diferencial a las diferentes concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, en concentración cero o por debajo del nivel de detección.

En algunas realizaciones, los agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferiblemente pequeños compuestos orgánicos que tienen un peso molecular mayor de 50 y menos de 2500 daltons aproximadamente. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente unión de hidrógeno, y típicamente incluyen por lo menos un grupo amina, carbonil, hidroxil o carboxil, preferiblemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos a menudo comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

Los agentes candidatos se obtienen a partir de una amplia variedad de fuentes, incluyendo librerías de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria o directa de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorios. Alternativamente, están disponibles o se producen fácilmente librerías de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, de plantas y animales. Además, las librerías y compuestos naturales o producidos de manera sintética se puede modificar fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y se pueden usar para producir librerías combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas directas o aleatorias, tal como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc. para producir análogos estructurales.

De particular interés en ciertas realizaciones son los agentes peptídicos basados en LGR4, por ejemplo proteínas del dominio extracelular solubilizado o receptor quimérico que comprenden el dominio extracelular LGR4, donde estos agentes neutralizan la actividad de ligandos LGR4 endógenos, por ejemplo hormonas.

Si el ensayo de cribado es un ensayo de unión, una o más de las moléculas se pueden unir a una marca, donde la marca puede proporcionar de manera directa o indirecta una señal detectable. Varias marcas incluyen radioisótopos, fluorescedores, quemiluminescedores, enzimas, moléculas de unión específicas, partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, y similares. Las moléculas de un específicas incluyen padres, tal como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los elementos de unión específicos, el elemento complementario se marcará normalmente con una molécula que proporciona la detección, según procedimientos conocidos.

Una variedad de otros reactivos se pueden incluir en el ensayo de cribado. Éstos incluyen reactivos tales como sales, proteínas neutras, por ejemplo a albúmina, detergentes, etc., que se utilizan para facilitar la unión óptima proteína-proteína y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. Se pueden usar reactivos que mejoran la eficiencia del ensayo, tal como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc. La mezcla de componentes se añade en cualquier orden que proporciona la unión requerida. Las inculpaciones se realizan a cualquier temperatura adecuada, típicamente entre 4 y 40ºC. Los periodos de incubación se seleccionan para una actividad óptima, pero también se puede utilizar para facilitar un rápido cribado de alto rendimiento. Típicamente, será suficiente entre 0,1 y una hora.

Otros ensayos de interés detectan los agentes que imitan la función del LGR4. Por ejemplo, una construcción de expresión que comprende un gen LGR4 se puede introducir en una línea celular bajo condiciones que permiten la expresión. El nivel de actividad del LGR4 se determina mediante un ensayo funcional, tal como se ha descrito anteriormente. En un ensayo de cribado, se determina la capacidad de los agentes candidatos inhibieron mejorar la función del LGR4. Alternativamente, se añaden agentes candidatos a una célula que le falta LGR4 funcional, y se criban por la capacidad de reproducir la actividad LGR4 en un ensayo funcional.

Los compuestos que tienen la actividad farmacológica deseada se pueden administrar en un portador fisiológicamente aceptable a un huésped para tratamiento, etc. Los compuestos también se pueden utilizar para mejorar la función LGR4. Los agentes inhibitorios se pueden administrar en una variedad de maneras, oralmente, tópicamente, parenteralmente, por ejemplo, de manera subcutánea, intraperitoneal, mediante infección viral, intravascular, etc. Los tratamientos tópicos son de particular interés. Dependiendo de la manera de introducción, los compuestos se pueden formular en una variedad de maneras. La concentración del compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar entre un 0,1-100% en peso.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar en varias formas, tales como gránulos, tabletas, píldoras, supositorios, cápsulas, suspensiones, ungüentos, los sillones y similares. Se pueden utilizar portadores y/o diluyentes orgánicos o inorgánicos de grado farmacéutico para formar las composiciones que contienen los compuestos terapéuticamente activos. Los diluyentes conocidos en la técnica incluyen medio acuoso, aceites vegetales y animales y grasas. Agentes de estabilización, agentes humectantes y de emulsión, sales para variar la presión osmótica o tampones para fijar un valor de pH adecuado, y mejoradores de la penetración en la piel se pueden utilizar como agentes
auxiliares.

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Experimental

Los siguientes ejemplos se indican para proporcionar a los expertos en la materia una exposición y descripción completa de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance en lo que se refiere a la invención. Sean realizados cortos para asegurar la precisión respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.) pero deben permitirse algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, las temperaturas en grados centígrados, y la presión es a o cerca de la presión atmosférica.

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Ejemplo 1

Identificación del LGR4 y LGR5

Se identificaron secuencias humanas relacionadas con la anémona de mar y receptores de hormonas de glicoproteína Drosophila a partir de la base de datos de marcas de secuencia de expresión (dbEST) en el centro nacional de información de biotecnología mediante la utilización del servidor BLAST con la matriz de comparación de proteínas BLOSUM62 (Altschul SF et al, Nucleic Acids Res (1997) 25:3389-3402). Se identificaron ESTs que mostraban alta homología en dos regiones no solapadas de los receptores de gonadotropina. Se encontraron que los clones AA312798 y AA298810 modifican la transmembrana cuatro a cinco del LGR4 receptor putativo, mientras que los AA460529 y AA424098 codifican la transmembrana dos a tres del LGR5 receptor curativo. Utilizando estos ESTs para buscar más en la base de datos de la división GenBank EST, se alinearon secuencias EST solapadas para obtener el marco de lectura abierta (ORF) más largo para estos receptores.

Basado en el ORF humano más largo, se designaron primeros específicos para amplificación PCR de fragmentos de ADNc LGR4 y LGR5 ADNc de ovarios de rata y placenta humana, respectivamente. Después de la hibridación con clones EST marcado signo y la confirmación de secuencias de ADN mediante secuenciado de ADN dideoxi, se utilizaron fragmentos de receptor específico aislados para diseñar los primeros para preparar las librerías de sub-ADNc enriquecidas con ADNcs receptores específicos. Para la extensión 5', se realizó transcripción inversa utilizando preparaciones de ARNm de ovarios de rata y placenta humana y primeros específicos del receptor. Después de la segunda síntesis de cadenas, la porción de ADNc enriquecido se unió en los extremos 5' consecuencias de adaptador específico para permitir una amplificación PCR adicional. Para la extensión 3', se transcribieron de manera inversa ARNms de ovarios de rata o placenta humana utilizando oligo-dT, seguido por una segunda síntesis de cadenas utilizando primeros específicos del receptor y unión del adaptador. Estas mini librerías también se utilizaron como plantillas para la amplificación PCR de ADNcs ascendente o descendente específicos para cada receptor que utiliza primeros internos. Los productos PCR con una fuerte señal de hibridación en cada fragmento de ADNc receptor se subclonaron en los vectores pUC18 o pcDNA3. Después de cribado de estas sublibrerías basadas en hibridación de colonias utilizando sondas de receptor específico, se identificaron y aislaron los clones con las secuencias 5'- o 3'- de los receptores putativos para secuenciado de ADN. Como sea necesario, el procedimiento se repitió hasta tres veces para generar ADNcs que codifican el ORF completo de cada receptor putativo para análisis de secuencia para la expresión de las proteínas del receptor en células eucarióticas. Todas las secuencias de codificación que cada gen también simplificaron con primeros específicos que flanquean todo el ORF en experimentos independientes. Se secuencian por lo menos tres clones PCR independientes para verificar la autenticidad de las secuencias de codificación. La secuencia de nucleótidos de LGR4, así como la secuencia de aminoácidos del producto codificado mediante su ORF, se proporciona en la figura 1. La secuencia de nucleótidos de LGR5, así como la secuencia de aminoácidos del producto codificado mediante su ORF, se proporciona en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO:4.

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Ejemplo 2

Comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de LGR4 y 5 ADNcs y los que codifican receptores FSH y LH

Se realizó la eliminación de la secuencia de LGR4 y LGR5 con receptores de hormonas de glicoproteínas humanas y los resultados se muestran en la figura 2. Los residuos sombreados son idénticos en por lo menos dos de las cuatro proteínas receptoras mostradas.

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Ejemplo 3

Patrón de expresión de LGR4 y 5 ARNm transcripciones en diferentes tejidos

Para análisis northern blot, ARN seleccionado poli (A)+-selected de diferentes tejidos humanos se hibridó con una sondas de ADNc marcadas ^{32}P. después de lavado, los blots se expusieron a películas de rayos X a - 70ºC durante cinco días. La hibridación posterior con unas sondas de ADNc de beta-actina se realizó para estimar la carga de ácido nucleico (exposición de 8 horas). El LGR4 se mostró que se expresaba en la placenta, ovario, testículos, adrenal, médula espinal, tiroides, estómago, tráquea, corazón, páncreas, riñón, próstata y bazo, mientras que el LGR5 se mostró que se expresaba en el músculo esquelético, placenta, médula espinal, cerebro, adrenal, colon, estómago, ovario y médula ósea.

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Ejemplo 4

Localización cromosómica del LGR4 y 5 en humanos

Utilizando fragmentos genómicos de LGR4 (> 100 Kb) y LGR5 (> 100 Kb) como sondas, se detectó la localización cromosómica de estos genes utilizando el procedimiento FISH para agrupar ADN en los cromosomas 5q34-35.1 y 12q15, respectivamente.

Es evidente a partir de la descripción anterior y los resultados que los receptores acoplados a la proteína G de mamífero LGR4, así como los ácidos núcleos que la codifican, se proporcionan mediante la presente invención. Las inversiones descritas anteriormente encuentran usó en una variedad de aplicaciones, incluyendo la investigación y aplicaciones terapéuticas.

Las publicaciones aquí descritas se proporcionan solamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5614363 A [0005]

\bullet US 5445934 A [0048]

\bullet WO 9535505 A [0048]

\bullet WO 9523225 A [0060]

\bullet WO 9506764 A [0060]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

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<110> Hsueh, Aaron

\hskip1cm

Hsu, Yu Sheau

\hskip1cm

Liang, Shan-Guang

\hskip1cm

van der Spek, Petrus Johannes

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<120> Nueva Proteína G de Mamífero Acoplada Receptores que Tienen Regiones de Repetición Extracelulares Ricas en Leucina

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<130> SUN-84PCT

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<160> 8

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<170> FastSEQ for Windows Version 3.0

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<210> 1

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<211> 2856

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<212> DNA

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<213> human

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<400> 1

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\hskip0,8cm

1

\hskip0,8cm

100

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<210> 2

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<211> 951

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<212> PRT

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<213> human

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<400> 2

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\hskip0,8cm

2

\hskip0,8cm

3

\hskip0,8cm

4

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 2082

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<212> ADN

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<213> humano

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<400> 3

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\hskip0,8cm

5

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<210> 4

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<211> 693

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<212> PRT

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0,8cm

6

\hskip0,8cm

7

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 2467

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<212> ADN

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<213> humano

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<400> 5

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\hskip0,8cm

8

\hskip0,8cm

80

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 757

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<212> PRT

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip0,8cm

9

\hskip0,8cm

10

\hskip0,8cm

11

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 3584

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<212> ADN

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\hskip0,8cm

12

\hskip0,8cm

120

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<210> 8

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<211> 722

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<212> PRT

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<213> humano

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<400> 8

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\hskip0,8cm

13

\hskip0,8cm

14

\hskip0,8cm

15

Claims (21)

1. Ácido nucleico aislado que codifica una proteína humana, en el que dicha proteína de mamífero comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

2. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de mamífero tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de mamífero tiene una secuencia de aminoácidos con por lo menos un 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

4. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de mamífero tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

5. Ácido nucleico aislado, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 75% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1 o su secuencia complementaria.

6. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1 o su secuencia complementaria.

7. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1 o su secuencia complementaria.

8. Ácido nucleico aislado que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o su secuencia complementaria.

9. Casete de expresión que comprende una región de iniciación transcripcional funcional en un huésped de expresión, un ácido nucleico que tiene una secuencia del ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 bajo la regulación transcripcional de dicha región de iniciación transcripcional, y una región de terminación transcripcional funcional en dicho huésped de expresión.

10. Célula in vitro que comprende un casete de expresión según la reivindicación 9 como parte de un elemento extracromosomal o integrado en el genoma de dicha célula como resultado de la introducción de dicho casete de expresión en dicha célula.

11. Célula no humana que comprende un casete de expresión según la reivindicación 9 como parte de un elemento extracromosomal o integrado en el genoma de dicha célula como resultado de la introducción de dicho casete de expresión en dicha célula.

12. Progenie celular de una célula según la reivindicación 10 u 11, en la que dicha progenie celular comprende dicho casete de expresión como parte del elemento extracromosomal o integrado en el genoma de dicha progenie celular.

13. Procedimiento para producir una proteína de mamífero que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, comprendiendo dicho procedimiento:

crecer una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, con lo cual dicha proteína de mamífero se expresa; y

aislar dicha proteína substancialmente libre de otras proteínas.

14. Composición de polipéptido purificada que comprende por lo menos un 50% en peso de proteína presente como proteína de mamífero, en el que dicha proteína de mamífero comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos un 80% de identidad de secuencia de SEQ ID NO: 2.

15. Anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2.

16. Anticuerpo según la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

\newpage

17. Animal transgénico no humano, en el que dicho animal en su forma nativa comprende un gen que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2, y dicho gen se modifica en el animal transgénico mediante una inserción o eliminación de ácido nucleico introducido en dicho gen.

18. Animal transgénico no humano según la reivindicación 17, en el que dicho animal es heterocigótico para dicha inserción o eliminación de ácido nucleico introducido.

19. Animal transgénico no humano según la reivindicación 17, en el que dicho animal es homocigótico para dicha inserción o eliminación de ácido nucleico introducido.

20. Animal transgénico no humano según la reivindicación 17, en el que dicha inserción o eliminación de ácido nucleico introducido es un knock-out de expresión endógena de un gen que codifica una proteína de mamífero que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

21. Procedimiento de cribado de una muestra para la presencia de un ligando para un receptor, en el que dicho receptor es una proteína de mamífero que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, comprendiendo dicho procedimiento:

contactar dicha muestra con un receptor que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y

detectar la presencia de un evento de unión entre dicho receptor y dicho ligando en dicha muestra.