ES2332484T3 - Resistencia al estres inducida por un inductor de respuesta hipersensible. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para conferir a las plantas resistencia al estrés que comprende: aplicar una proteína o un polipéptido inductor de la respuesta hipersensible en una forma no infecciosa a una planta o semilla de planta bajo condiciones eficaces para conferir resistencia frente al estrés por contaminación del aire, estrés químico, estrés nutricional o frente al estrés relacionado con el clima seleccionado del grupo constituido por las heladas, la temperatura fría, la temperatura elevada, la luz excesiva y la luz insuficiente.
Description
Resistencia al estrés inducida por un inductor
de respuesta hipersensible.
La presente invención se refiere a conferir a
las plantas resistencia al estrés con un inductor de respuesta
hipersensible.
Bajo condiciones naturales y de agricultura, las
plantas están expuestas a diversas formas de estrés ambiental. El
estrés se mide principalmente con respecto al crecimiento (es decir
la acumulación de biomasa) o con respecto a los principales
procedimientos de asimilación (es decir la captación de dióxido de
carbono y minerales). El déficit de agua de la tierra, las
temperaturas subóptimas y supraóptimas, la salinidad y la mala
aireación de las tierras pueden causar algunas restricciones del
crecimiento durante la estación de crecimiento, de manera que el
rendimiento de las plantas al final de la estación expresa solamente
una pequeña fracción de su potencial genético. De hecho, se estima
que en los Estados Unidos el rendimiento de los cultivos en los
campos cultivados es sólo del 22% del potencial genético. Los mismos
factores fisicoquímicos pueden volverse extremos en algunos
hábitats, tales como desiertos o pantanos, y solamente la vegetación
especialmente adaptada puede completar su ciclo vital en las
condiciones inusualmente hostiles. En los entornos menos extremos,
las plantas individuales pueden aclimatarse a los cambios en el
agua potencial, la temperatura, la salinidad y la carencia de
oxígeno de manera que mejore su aptitud para esos entornos. Algunas
especies son más capaces de adaptarse que otras, y diversos
mecanismos anatómicos, estructurales y bioquímicos explican la
aclimatación.
Bajo condiciones naturales y de agricultura, las
plantas deben soportar constantemente el estrés. Algunos factores
ambientales pueden volverse estresantes en un período de tiempo muy
corto (por ejemplo, la temperatura alta o baja) o pueden tardar
períodos de tiempo prolongados en provocar estrés en las plantas
(por ejemplo, el contenido de agua o nutrientes minerales en la
tierra). En general, el estrés ambiental que afecta a las plantas
puede estar en la forma de estrés relacionado con el clima, estrés
de la contaminación del aire, estrés químico y estrés nutricional.
Los ejemplos de estrés relacionado con el clima incluyen la sequía,
el agua, la escarcha, la temperatura baja, la temperatura alta, la
luz excesiva y la luz insuficiente. El estrés de la contaminación
del aire puede estar en la forma de dióxido de carbono, monóxido de
carbono, dióxido de azufre, NOx, hidrocarburos, ozono, radiación
ultravioleta y lluvia ácida. El estrés químico puede ser el
resultado de la aplicación de insecticidas, fungicidas, herbicidas
y de metales pesados. El estrés nutricional puede estar causado por
los fertilizantes, los micronutrientes y los macronutrientes.
Para la mayoría de las plantas, el agua es
esencial para el crecimiento. Algunas plantas son capaces de
conservar algo de agua en la tierra para uso más tardío, mientras
que otras completan sus ciclos vitales durante una estación húmeda
antes del comienzo de cualquier sequía. Otras plantas son capaces de
consumir agresivamente el agua para protegerse provocando la
privación del agua para otras plantas en esa ubicación. Las plantas
que carecen de cualquiera de estas capacidades quedan seriamente
impedidas por la ausencia de agua.
Las lesiones por heladas aparecen en las
especies sensibles a temperaturas que son demasiado bajas para el
crecimiento normal pero no suficientemente bajas para formar hielo.
Tales lesiones aparecen típicamente en especies de origen tropical
o subtropical. Cuando tiene lugar la helada, aparece decoloración o
lesiones en las hojas que les dan un aspecto empapado de agua. Si
se hielan las raíces, las plantas pueden marchitarse. Por otra
parte, las temperaturas de congelación y la formación asociada de
cristales de hielo pueden ser letales para las plantas si los
cristales de hielo se extienden en los protoplastos o permanecen
durante períodos largos.
El estrés también es causado por los otros
extremos de temperatura con pocas plantas capaces de resistir las
temperaturas altas. Cuando las células o los tejidos de las plantas
superiores se deshidratan o no están creciendo, pueden resistir
temperaturas más elevadas que las células que están hidratadas, son
vegetativas y están en crecimiento. Los tejidos que están creciendo
activamente rara vez pueden resistir a temperaturas superiores a
45ºC.
Las altas concentraciones de sal son otra forma
de estrés ambiental que puede afectar a las plantas. En condiciones
naturales, tales concentraciones altas de sal se encuentran cerca de
la orilla del mar y en los estuarios. Más tierra adentro, la sal
natural puede filtrar desde los depósitos geológicos adyacentes a
las áreas agrícolas. Además, la sal puede acumularse en el agua de
riego cuando el agua pura se evapora o transpira desde la tierra.
Aproximadamente 1/3 de todas las tierras de labranza irrigadas están
afectadas por concentraciones elevadas de sal. El alto contenido de
sal no sólo daña las plantas sino que degrada la estructura de la
tierra disminuyendo la porosidad y la permeabilidad del agua.
La contaminación del aire en la forma de ozono,
dióxido de carbono, monóxido de carbono, dióxido de azufre,
NO_{X} e hidrocarburos pueden tener efectos adversos en el
crecimiento de las plantas al crear niebla tóxica y el
calentamiento ambiental.
El documento WO98/32844 se refiere a un
procedimiento para mejorar el crecimiento de las plantas. Esto
implica aplicar un polipéptido o proteína que induce la respuesta
hipersensible en una forma no infecciosa a una planta o semilla de
planta bajo condiciones eficaces para mejorar el crecimiento de la
planta o plantas producidas a partir de semillas de plantas.
La presente invención está dirigida a superar
diversas formas de estrés ambiental y a conferir resistencia en las
plantas frente a tal estrés.
La presente invención se refiere al uso de una
proteína o un polipéptido que induce la respuesta hipersensible
para conferir resistencia al estrés a las plantas, en la que el
estrés abarca factores ambientales que tienen efectos adversos en
la fisiología y el desarrollo de la planta que son el estrés
relacionado con el clima (es decir, escarcha, temperatura baja,
temperatura alta, luz excesiva y luz insuficiente), el estrés de la
contaminación del aire (por ejemplo, dióxido de carbono, monóxido de
carbono, dióxido de azufre, NO_{X}, hidrocarburos, ozono,
radiación ultravioleta, lluvia ácida), de los productos químicos
(por ejemplo, insecticidas, fungicidas, herbicidas, metales
pesados), y el estrés nutricional (por ejemplo, fertilizantes,
micronutrientes, macronutrientes). En una forma de realización de
la presente invención, la proteína o el polipéptido que induce la
respuesta hipersensible se aplica a las plantas o semillas de
plantas bajo condiciones eficaces para conferir resistencia al
estrés. Como alternativa, la resistencia al estrés se confiere
proporcionando una planta o semilla de planta transgénica
transformada con una molécula de ADN que codifica una proteína o un
polipéptido que induce la respuesta hipersensible y cultivando la
planta o plantas transgénicas producidas a partir de semillas
transgénicas de plantas bajo condiciones eficaces para conferir
resistencia al estrés.
Los solicitantes han encontrado que el uso de
inductores de respuesta hipersensible según la presente invención
confiere resistencia a las plantas contra tales formas de estrés
ambiental.
La presente invención se refiere al uso de una
proteína o un polipéptido que induce la respuesta hipersensible
para conferir resistencia al estrés a las plantas. En una forma de
realización de la presente invención, el polipéptido o proteína que
induce la respuesta hipersensible se aplica a las plantas o a las
semillas de plantas bajo condiciones eficaces para conferir
resistencia al estrés. Como alternativa, la resistencia al estrés
se confiere proporcionando una planta o semilla de planta
transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica una
proteína o un polipéptido inductor de respuesta hipersensible y
cultivando la planta transgénica o las plantas producidas a partir
de las semillas transgénicas de la planta bajo condiciones eficaces
para conferir resistencia al estrés.
Los polipéptidos o proteínas que inducen la
respuesta hipersensible según la presente invención derivan de
proteínas o polipéptidos inductores de respuesta hipersensible de
una amplia diversidad de patógenos fúngicos y bacterianos. Tales
polipéptidos o proteínas son capaces de inducir la necrosis local en
el tejido vegetal en contacto con el inductor. Los ejemplos de
fuentes bacterianas adecuadas de polipéptidos o proteínas inductores
incluyen especies de Erwinia, Pseudomonas y
Xanthamonas (por ejemplo, las siguientes bacterias:
Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia
stewartii, Erwinia carotovora, Pseudomonas
syringae, Pseudomonas solancearum, Xanthomonas
campestris, y sus mezclas). Además de los inductores de
respuesta hipersensible de estas bacterias gram negativas, es
posible usar inductores de bacterias gram positivas. Un ejemplo es
Clavibacter michiganensis subespecie sepedonicus.
Un ejemplo de una fuente fúngica de proteína o
polipéptido inductor de respuesta hipersensible es
Phytophthora. Las especies adecuadas de Phytophthora
incluyen Phytophthora parasitica, Phytophthora cryptogea,
Phytophthora cinnamomi, Phytophthora capsici, Phytophthora
megasperma y Phytophthora citrophthora.
El polipéptido o la proteína que induce la
respuesta hipersensible de Erwinia chrysanthemi tiene una
secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEC. ID Nº 1
siguiente:
\newpage
Este polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible tiene un peso molecular de 34 kDa, es
termoestable, tiene un contenido de glicina mayor del 16%, y no
contiene sustancialmente cisteína. El polipéptido o proteína que
induce la respuesta hipersensible de Erwinia chrysanthemi
está codificado por una molécula de ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos que corresponde a la SEC. ID Nº 2 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible de Erwinia amylovora tiene una
secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEC. ID Nº 3
siguiente:
\newpage
Este polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible tiene un peso molecular de aproximadamente
39 kDa, tiene un pI de aproximadamente 4,3, y es termoestable a
100ºC durante al menos 10 minutos. Este polipéptido o proteína que
induce la respuesta hipersensible no tiene sustancialmente cisteína.
El polipéptido o proteína que induce la respuesta hipersensible
derivado de Erwinia amylovora se describe más detalladamente en Wei,
Z.-M., R. J. Laby, C. H. Zumoff, D. W. Bauer, S.-Y. He, A. Collmer,
and S. V. Beer, "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response
Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovola", Science
257: 85-88 (1992). La molécula de ADN que codifica
este polipéptido o proteína tiene una secuencia de nucleótidos que
corresponde a la SEC. ID Nº 4 siguiente:
\newpage
Otro inductor de respuesta hipersensible
potencialmente adecuado de Erwinia amylovora se da a conocer
en la Solicitud de Patente de EEUU Nº de serie 09/120.927. La
proteína está codificada por una molécula de ADN que tiene una
secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Nº 5 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Véase GenBank Nº de acceso U94513. La molécula
de ADN aislada de la presente invención codifica una proteína o un
polipéptido inductor de respuesta hipersensible que tiene una
secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Nº 6 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Este polipéptido o proteína es ácido, rico en
glicina y serina, y carece de cisteína. También es termoestable,
sensible a la proteasa, y es suprimido por inhibidores del
metabolismo de la planta. La proteína o el polipéptido de la
presente invención tienen un tamaño molecular predicho de ca. 4,5
kDa.
Otro inductor de respuesta hipersensible
potencialmente adecuado de Erwinia amylovora se da a conocer
en la Solicitud de Patente de EEUU Nº de serie 09/120.663. La
proteína está codificada por una molécula de ADN que tiene una
secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Nº 7 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Esta molécula de ADN se conoce como el gen dspE
para Erwinia amylovora. Esta molécula de ADN aislada de la
presente invención codifica una proteína o un polipéptido que
inducen una respuesta hipersensible de un patógeno de la planta que
tiene una secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 8 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Esta proteína o polipéptido tiene
aproximadamente 198 kDa y tiene un pI de 8,98.
\newpage
La presente invención se refiere a una molécula
de ADN aislada que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID
Nº 9 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Ésta se conoce como el gen dspF. Esta molécula
de ADN aislada de la presente invención codifica una proteína o un
polipéptido que inducen la respuesta hipersensible que tiene una
secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Nº 10 siguiente:
Esta proteína o polipéptido tiene
aproximadamente 16 kDa y tiene un pI de 4,45.
El polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible derivado de Pseudomonas syringae
tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEC. ID Nº
11 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Este polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible tiene un peso molecular de
34-35 kDa. Es rico en glicina (aproximadamente
13,5%) y carece de cisteína y tirosina.
Más información sobre el inductor de la
respuesta hipersensible derivado de Pseudomonas syringae se
encuentra en, S. Y., H. C. Huang, and A. Collmer, "Pseudomonas
syringae pv. syringae HarpinPss: a Protein that is Secreted via the
Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants",
Cell 73: 1255-1266 (1993). La molécula de ADN que
codifica los inductores de respuesta hipersensible de Pseudomonas
syringae tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a
la SEC. ID Nº 12 siguiente:
\newpage
Otro inductor de la respuesta hipersensible
potencialmente adecuado de Pseudomonas syringae se da a
conocer en la Solicitud de Patente de EEUU Nº de serie 09/120.817.
La proteína tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID Nº 13
siguiente;
\newpage
Esta molécula de ADN se conoce como el gen dspE
para Pseudomonas syringae. Esta molécula de ADN aislada de
la presente invención codifica una proteína o un polipéptido que
induce la respuesta hipersensible de un patógeno de la planta que
tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Nº 14
siguiente:
Esta proteína o polipéptido tiene
aproximadamente 42,9 kDa.
El polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible derivado de Pseudomonas solanacearum
tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEC. ID Nº
15 siguiente:
\newpage
Está codificado por una molécula de ADN que
tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la SEC. ID Nº
16 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Más información con respecto al polipéptido o
proteína que induce la respuesta hipersensible derivado de
Pseudomonas solanacearum se presenta en Arlat, M., F. Van
Gijsegem, J. C. Huet, J. C. Pemollet, and C. A. Boucher, "PopA1,
a Protein which Induces a Hypersensitive-like
Response in Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp
Pathway of Pseudomonas solanacearum", EMBO J. 13:
543-533 (1994).
El polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible de Xanthomonas campestris pv.
glicinas tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a la
SEC. ID Nº 17 siguiente:
Esta secuencia es una secuencia amino terminal
que tiene solamente 26 residuos del polipéptido o proteína que
induce la respuesta hipersensible de Xanthomonas campestris
pv. glicinas. Coincide con las proteínas de subunidades fimbriales
determinadas en otros patovares de Xanthomonas
campestris.
\newpage
El polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible de Xanthomonas campestris pv.
pelagonii es termoestable, sensible a proteasas, y tiene un
peso molecular de 20 kDa. Incluye una secuencia de aminoácidos que
correspondiente a la SEC. ID Nº 18 siguiente:
El aislamiento de la proteína o polipéptido que
induce la respuesta hipersensible de Erwinia carotovora está
descrito en Cui y col., "The RsmA Mutants of Erwinia carotovora
subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress hrp NEcc and Elicit a
Hypersensitive Reaction-like Response in Tobacco
Leaves", MPMI, 9(7): 565-573 (1996). La
proteína o el polipéptido que induce la respuesta hipersensible de
Erwinia stewartii se presenta en Ahmad y col., "Harpin is
Not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on
Maize", 8th Int'l. Cong. Molec. Plant-Microobe
Interact., 14-19 de julio, 1996 y Ahmad, y col.,
"Harpin is Not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia
stewartii on Maize", Ann. Mtg. Am, Phytopath. Soc.,
27-31 de julio, 1996.
Las proteínas o polipéptidos que inducen la
respuesta hipersensible de Phytophthora parasitica, Phytophthora
cryptogea, Phytophthora cinnamoni, Phytophthora capsici,
Phytophthora megasperma y Phytophora citrophthora están
descritos en Kaman, y col., "Extracellular Protein Elicitors from
Phytophtora: Most Specificity and Induction of Resistance to
Bacterial and Fungal Phytopathogens", Molec.
Plant-Microbe Interact., 6(1):
15-25 (1993), Ricci y col., "Structure and
Activity of Protein from Pathogenic Fungi Phytophtora Eliciting
Necrosis and Acquired Resistance in Tobacco", Eur. J. Biochem.,
183: 555-563 (1989), Ricci y col., "Differential
Production of Parasiticein, and Elicitor of Necrosis and Resistance
in Tobacco, by Isolates of Phytophthera parasitica", Plant Path.
41: 298-307 (1992), Baillreul y col., "A New
Elicitor of the Hypersensitive Response in Tobacco: A Fungal
Glycoprotein Elicit Cell Death, Expression of Defence Genes,
Production of Salicylic Acid, and Induction of Systemic Acquired
Resistance", Plant J., 8(4): 551-560
(1995), y Bonnet y col., "Acquired Resistance Triggered by
Elicitors in Tobacco and Other Plants", Eur. J, Plant Path., 102:
181-192 (1996).
Otro inductor de la respuesta hipersensible
según con la presente invención es de Clavibacter
michiganensis subsp. sepedonicus que se describe en
detalle en la Solicitud de Patente de EEUU Nº de serie
09/136.625.
Los inductores anteriores son de ejemplo. Pueden
identificarse otros inductores cultivando hongos o bacterias que
inducen una respuesta hipersensible bajo condiciones en que se
expresan los genes que codifican los inductores. La actividad de
inductor (es decir, necrosis local) de las preparaciones libres de
células de sobrenadantes de cultivos se prueba usándolas para
infiltrar tejidos adecuados de plantas.
Los fragmentos de los polipéptidos o proteínas
que inducen la respuesta hipersensible así como los fragmentos de
los inductores de longitud total de otros patógenos están abarcados
por el procedimiento de la presente invención.
Pueden producirse fragmentos adecuados por
varios medios. En el primero, se producen subclones del gen que
codifica una proteína inductora conocida por medio de manipulación
genética molecular convencional subclonando los fragmentos del gen.
A continuación se expresan los subclones in vitro o in
vivo en células bacterianas para dar una proteína o polipéptido
más pequeño en el que puede probarse la actividad inductora según el
procedimiento que se describe a continuación.
Como una alternativa, pueden producirse
fragmentos de una proteína inductora por digestión de una proteína
inductora de longitud total con enzimas proteolíticas como
quimotripsina o proteinasa A de Staphylococcus, o tripsina.
Las diferentes enzimas proteolíticas tienen posibilidad de escindir
las proteínas inductoras en diferentes sitios en base a la
secuencia de aminoácidos de la proteína inductora. Algunos de los
fragmentos que surgen como resultado de la proteolisis pueden ser
inductores activos de resistencia.
En otro enfoque, en base al conocimiento de la
estructura primaria de la proteína, pueden sintetizarse fragmentos
del gen de la proteína inductora usando la técnica de PCR junto con
series específicas de cebadores elegidos para representar las
porciones particulares de la proteína. Estos se clonarán a
continuación en un vector adecuado para la expresión de un péptido
o proteína truncado.
Un ejemplo de fragmentos adecuados de un
inductor de respuesta hipersensible que no inducen una respuesta
hipersensible incluye fragmentos de Erwinia. Los fragmentos
adecuados incluyen un fragmento del extremo C terminal de la
secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 3, un fragmento del extremo N
terminal de la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 3, o un
fragmento interno de la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 3. El
fragmento del extremo C terminal de la secuencia de aminoácidos de
SEC. ID Nº 3 puede abarcar los siguientes aminoácidos de la SEC. ID
Nº 3: 169 y 403, 210 y 403, 267 y 403, ó 343 y 403. El fragmento
interno de la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 3 puede
abarcar los siguientes aminoácidos de SEC. ID Nº 3: 105 y 179, 137 y
166, 121 y 150, ó 137 y 156. Pueden identificarse otros fragmentos
adecuados según la presente invención.
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Otro ejemplo de fragmentos adecuados de un
inductor de respuesta hipersensible que no inducen una respuesta
hipersensible son fragmentos de Erwinia amylovora que
incluyen un fragmento del extremo C terminal de la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº 3, un fragmento del extremo N terminal de
la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 3, o un fragmento interno
de la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 3. El fragmento del
extremo C terminal de la secuencia de aminoácidos de SEC. ID Nº 3
puede abarcar los aminoácidos 105 y 403 de la SEC. ID Nº 3. El
fragmento del extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos de
SEC. ID Nº 3 puede abarcar los siguientes aminoácidos de SEC. ID Nº
3: 1 y 98, 1 y 104, 1 y 122, 1 y 168, 1 y 218, 1 y 266, 1 y 342, 1
y 321, y 1 y 372. El fragmento interno de la secuencia de
aminoácidos de SEC. ID Nº 3 puede abarcar los siguientes
aminoácidos de SEC. ID Nº 3: 76 y 209, 105 y 209, 99 y 209, 137 y
204, 137 y 200, 109 y 204, 109 y 200, 137 y 180, y 105 y 180.
Las moléculas de ADN adecuadas son las que
hibridan a la molécula de ADN que comprende una secuencia de
nucleótidos de SEC. ID Nº 2, 4, 5, 7, 9, 12, 13 y 16 bajo
condiciones rigurosas. Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad
adecuadas es cuando la hibridación se realiza a 65ºC durante 20
horas en un medio que contiene NaCl 1M, Tris-HCl 50
mM, pH 7,4, EDTA 10 mM, dodecilsulfato de sodio al 0,1%, ficoll al
0,2%, polivinilpirrolidona al 0,2%, albúmina sérica de ternera al
0,2%, ADN de E. coli 50 \mumg/ml.
Las variantes pueden generarse, por ejemplo, por
deleción o adición de aminoácidos que tengan mínima influencia en
las propiedades, la estructura secundaria y la naturaleza
hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido puede
conjugarse a una secuencia señal (o líder) en el extremo N terminal
de la proteína que de manera cotraduccional o postraduccional
dirige la transferencia de la proteína. El polipéptido puede también
conjugarse a un conector o a otra secuencia para facilitar la
síntesis, la purificación, o la identificación del polipéptido.
El inductor de la respuesta hipersensible de la
presente invención está de preferencia en una forma aislada (es
decir, separado del organismo huésped) y de más preferencia se
produce en forma purificada (de preferencia al menos
aproximadamente al 60%, de más preferencia al 80% de pureza) por
medio de técnicas convencionales. Típicamente, el inductor de la
respuesta hipersensible de la presente invención se produce pero no
se secreta en el medio de cultivo de las células huésped
recombinantes. Como alternativa, la proteína o el péptido de la
presente invención se secreta en el medio de cultivo. En el caso de
la proteína no secretada, para aislar la proteína, se propaga la
célula huésped (por ejemplo, E. coli) que porta un plásmido
recombinante, se lisa por medio de ultrasonido, calor o tratamiento
químico, y el homogeneizado se centrifuga para retirar los residuos
celulares. A continuación, se somete el sobrenadante a tratamiento
con calor y el inductor de la respuesta hipersensible se separa por
centrifugación. La fracción del sobrenadante que contiene el
inductor de la respuesta hipersensible se somete a una filtración
en gel en una columna de dextrano o poliacrilamida del tamaño
adecuado para separar los fragmentos. Si es necesario, la fracción
de proteínas puede purificarse más por intercambio iónico o por
HPLC.
La molécula de ADN que codifica el polipéptido o
proteína inductor de la respuesta hipersensible puede introducirse
en las células usando la tecnología de ADN recombinante
convencional. Generalmente, esto implica insertar la molécula de
ADN en un sistema de expresión heterólogo respecto a la molécula de
ADN (es decir, que normalmente no está presente). La molécula de
ADN heterólogo se inserta en el vector o sistema de expresión
orientada en el sentido apropiado y en el marco de lectura
correcto. El vector contiene los elementos necesarios para la
transcripción y la traducción de las secuencias insertadas que
codifican la proteína.
La Patente de EEUU Nº 4.237.224 de Cohen y Boyer
describe la producción de sistemas de expresión en la forma de
plásmidos recombinantes utilizando escisión con enzimas de
restricción y unión con ADN ligasa. Posteriormente, estos plásmidos
recombinantes se introducen por medio de una transformación y se
replican en cultivos unicelulares que incluyen los organismos
procariotas y las células eucariotas que crecen en cultivos de
tejidos.
Los genes recombinantes también pueden
introducirse en virus, tales como el virus vacunal. Los virus
recombinantes pueden generarse por medio de la transfección de los
plásmidos en las células infectadas con el virus.
Los vectores adecuados incluyen, pero no se
limitan a, los siguientes vectores virales tales como los sistemas
vectores de lambda gt11, gt WES.tB, Charon 4 y vectores plasmídicos
tales como pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18,
pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC101, SV 40, pBluescript II SK +/- o
KS +/- (véase el catálogo de "Sistemas de clonación de
Stratagene" de Stratagene, La Jolla, California), pQE, pIH821,
pGEX, la serie pET (véase F. W. Studier y col., "Use of T7 RNA
Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes", Gene Expression
Technology vol. 185 (1990)) y cualquiera de sus derivados. Las
moléculas recombinantes pueden introducirse en las células a través
de la transformación, particularmente de la transducción,
conjugación, movilización o electroporación. Las secuencias de ADN
se clonan en el vector usando procedimientos de clonación
convencionales conocidos en la técnica, como está descrito por
Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, Nueva York (1989).
Para expresar la(s) secuencia(s)
que codifican proteína(s) puede utilizarse una diversidad de
sistemas vector-huésped. En primer lugar, el
sistema vector debe ser compatible con la célula huésped utilizada.
Los sistemas vector-huésped incluyen, pero no se
limitan a, los siguientes: bacterias transformadas con ADN de
bacteriófagos, ADN de plásmidos o ADN de cósmidos; microorganismos
tales como levaduras que contienen vectores de levaduras; sistemas
de células de mamíferos infectadas con virus (por ejemplo, virus
vacunal, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos
infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); y células vegetales
infectadas por bacterias. Los elementos de expresión de estos
vectores varían en su intensidad y su especificidad. Según el
sistema vector-huésped utilizado, puede usarse uno
cualquiera de una serie de elementos de transcripción y traducción
adecuados.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Diferentes acontecimientos de señales genéticas
y procesamiento controlan en muchos niveles la expresión genética
(por ejemplo, la transcripción del ADN y la traducción del ARN
mensajero (ARNm)).
La transcripción del ADN es dependiente de la
presencia de un promotor que es una secuencia de ADN que dirige la
unión de la ARN polimerasa y, por consiguiente, promueve la síntesis
del ARNm. Las secuencias de ADN de los promotores eucariotas
difieren de las de los promotores procariotas. Además, los
promotores eucariotas y las señales genéticas que los acompañan
pueden no ser reconocidas o pueden no funcionar en un sistema
procariota y, además, los promotores procariotas no son reconocidos
y no funcionan en las células eucariotas.
De manera similar, la traducción del ARNm en los
procariotas depende de la presencia de las señales procariotas
adecuadas, que difieren de las de los eucariotas. La traducción
eficaz del ARNm en los procariotas requiere un sitio de unión al
ribosoma, denominado secuencia de Shine-Dalgarno
("SD"), en el ARNm. Esta secuencia es una secuencia de
nucleótidos corta del ARNm que está localizada antes del codón de
inicio, usualmente AUG, que codifica la metionina del extremo amino
terminal de la proteína. Las secuencias de SD son complementarias
al extremo 3' del ARNr (ARN ribosómico) 16S y, probablemente,
promueven la unión de un ARNm a los ribosomas mediante la formación
de una doble cadena con el ARNr para permitir la colocación correcta
del ribosoma. Para una revisión sobre la maximización de la
expresión genética, véase Roberts and Lauer, Methods in Enzymology,
68: 473 (1979).
Los promotores varían por su "fuerza" (es
decir, su capacidad para promover la transcripción). Para los
propósitos de expresar un gen clonado, es deseable usar promotores
fuertes para obtener un nivel elevado de transcripción y, por
consiguiente, de expresión del gen. Según el sistema de célula
huésped utilizado, puede usarse uno cualquiera de una serie de
promotores adecuados. Por ejemplo, cuando se clona en E.
coli, los promotores de sus bacteriófagos, o plásmidos, tales
como el promotor del fago T7, el promotor de lac, el promotor
de trp, el promotor de recA, el promotor del ARN
ribosómico, los promotores P_{R} y P_{L} del colifago lambda y
otros, incluidos, pero no limitados a, lacUV5, ompF,
bla, lpp y similares, pueden usarse para dirigir un
nivel elevado de transcripción de los segmentos de ADN adyacentes.
Además, puede usarse un promotor híbrido
trp-lacUV5 (tac) u otros promotores de
E. coli producidos por medio de ADN recombinante u otras
técnicas de ADN sintético para proporcionar la transcripción del gen
insertado.
Las cepas bacterianas de células huésped y los
vectores de expresión pueden escogerse para inhibir la acción del
promotor a menos que se induzca específicamente. En determinadas
operaciones, es necesaria la adición de inductores específicos para
la transcripción eficaz del ADN insertado. Por ejemplo, el operón
lac se induce por la adición de lactosa o IPTG
(isopropiltio-beta-D-galactósido).
Una diversidad de otros operones, tales como trp o
pro, etc. se encuentran bajo controles diferentes.
Las señales específicas de iniciación también
son necesarias para la transcripción y la traducción genética
eficaces en las células procariotas. Estas señales de iniciación de
la transcripción y la traducción pueden variar en "fuerza" en
función de la medición de la cantidad de ARN mensajero específico
del gen y la cantidad de proteína sintetizada, respectivamente. El
vector de expresión del ADN, que contiene un promotor, también
puede contener una combinación de varias diversas señales
"fuertes" de iniciación de la transcripción y/o traducción.
Por ejemplo, la traducción eficaz en E. coli requiere una
secuencia de SD de aproximadamente 7-9 bases en
posición 5' del codón de iniciación ("ATG") para proporcionar
un sitio de unión al ribosoma. Por consiguiente, puede usarse
cualquier combinación SD-ATG que pueda ser utilizada
por los ribosomas de la célula huésped. Tales combinaciones
incluyen, pero no se limitan a, la combinación
SD-ATG derivada del gen cro o el gen
N del colifago lambda, o derivados de los genes E, D, C, B o
A del triptofano de E. coli. Además, puede usarse cualquier
combinación SD-ATG producida por ADN recombinante u
otras técnicas que implican la incorporación de nucleótidos
sintéticos.
Una vez que se ha clonado en un sistema de
expresión, la molécula de ADN aislada que codifica el polipéptido o
proteína que induce la respuesta hipersensible está lista para ser
incorporada en una célula huésped. Tal incorporación puede llevarse
a cabo por medio de las diversas formas de transformación indicadas
anteriormente, dependiendo del sistema vector/célula huésped. Las
células huésped adecuadas incluyen, pero no se limitan a,
bacterias, virus, levaduras, células de mamíferos, de insectos,
vegetales y similares.
El procedimiento de la presente invención de
conferir resistencia al estrés a las plantas puede implicar la
aplicación del polipéptido o proteína inductor de la respuesta
hipersensible en una forma no infecciosa a toda o parte de una
planta o semilla de planta bajo condiciones eficaces para que el
inductor confiera resistencia al estrés. Como alternativa, la
proteína o el polipéptido inductor de la respuesta hipersensible
puede aplicarse a las plantas de manera tal que las semillas
recuperadas de tales plantas son por sí mismas capaces de conferir
resistencia al estrés en las plantas.
Como una alternativa para aplicar el polipéptido
o proteína que induce la respuesta hipersensible a las plantas o
semillas de plantas para conferir resistencia al estrés en las
plantas o plantas cultivadas a partir de las semilla, pueden
utilizarse plantas o semillas de plantas transgénicas. Cuando se
utilizan plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta
transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un
polipéptido o proteína que induce la respuesta hipersensible y
cultivar la planta bajo condiciones eficaces para permitir que la
molécula de ADN confiera resistencia al estrés a las plantas. Como
alternativa, puede suministrarse y plantarse en la tierra una
semilla de planta transgénica con una molécula de ADN que codifica
un polipéptido o proteína que induce la respuesta hipersensible.
Posteriormente, se propaga una planta a partir de la semilla
plantada bajo condiciones eficaces para permitir que la molécula de
ADN confiera resistencia al estrés a las plantas.
La forma de realización de la presente invención
en la que se aplica un polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible a la planta o semilla de planta puede
llevarse a cabo en una serie de manera, que incluyen: 1) aplicación
de un inductor de la respuesta hipersensible aislado o 2) aplicación
de bacterias que no causan enfermedad y que están transformadas con
genes que codifican el inductor. En la última forma de realización,
el inductor puede aplicarse a las plantas o semillas de plantas
aplicando las bacterias que contienen la molécula de ADN que
codifica un polipéptido o proteína que induce la respuesta
hipersensible. Tal bacteria debe ser capaz de secretar o exportar
el inductor de manera que el inductor pueda contactar las células
de la planta las semillas de la planta. En estas formas de
realización, el inductor es producido por las bacterias in
planta o en las semillas o justo antes de la introducción de las
bacterias a las plantas o semillas de plantas.
Los procedimientos de la presente invención
pueden utilizarse para tratar una gran diversidad de plantas o sus
semillas para conferir resistencia al estrés. Las plantas adecuadas
incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas. Más particularmente,
las plantas de cultivo útiles pueden incluir: alfalfa, arroz, trigo,
cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuete, maíz, patata,
boniato, judía, guisante, achicoria, lechuga, endivia, col, col de
Bruselas, remolacha, chirivía, coliflor, brécol, nabo, rábano,
espinaca, cebolla, ajo, berenjena, pimiento, apio, zanahoria,
calabacín, calabaza, calabacín zucchini, pepino, manzana, pera,
melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, tabaco, tomate,
sorgo y caña de azúcar. Los ejemplos de plantas ornamentales
adecuadas son: Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunia,
pelargonio, flor de pascua, crisantemo, clavel y zinnia.
Según la presente invención, el término
"estrés" se refiere a sal, temperaturas frías (por ejemplo,
helada), tratamiento químico (por ejemplo, insecticidas,
fungicidas, herbicidas, fertilizantes), luz excesiva, y luz
insuficiente.
El procedimiento de la presente invención que
implica la aplicación del polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible puede llevarse a cabo a través de una
diversidad de procedimientos cuanto se trata toda o parte de la
planta, incluidas las hojas, los tallos, las raíces, los propágulos
(por ejemplo, esquejes), etc. Estos pueden (pero no necesariamente)
implicar la infiltración del polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible en la planta. Los procedimientos de
aplicación adecuados incluyen la pulverización a presión alta o
baja, la inyección, y la abrasión de la hoja próxima cuando tiene
lugar la aplicación del inductor. Cuando se tratan semillas de
plantas o propágulos (por ejemplo, esquejes), según la forma de
realización de aplicación de la presente invención, la proteína o
el polipéptido que induce la respuesta hipersensible, según la
presente invención, puede aplicarse por pulverización a presión baja
o alta, recubrimiento, inmersión o inyección. Los expertos en la
técnica pueden imaginar otros procedimientos de aplicación adecuados
con la condición de que sean capaces de contactar el inductor con
las células de la planta o semillas de la planta. Una vez tratadas
con el inductor de la respuesta hipersensible de la presente
invención, las semillas pueden plantarse en tierra natural o
artificial y cultivarse usando procedimientos convencionales para
producir plantas. Una vez que las plantas se hayan propagado a
partir de semillas tratadas según la presente invención, las
plantas pueden tratarse con una o más aplicaciones de la proteína o
el polipéptido que induce la respuesta hipersensible para conferir
a las plantas resistencia al estrés.
El polipéptido o proteína que induce la
respuesta hipersensible, según la presente invención, puede
aplicarse a las plantas o semillas de plantas solo o en una mezcla
con otros materiales. Como alternativa, el polipéptido o proteína
que induce la respuesta hipersensible puede aplicarse por separado a
las plantas con otros materiales a aplicar en diferentes
momentos.
Una composición adecuada para tratar plantas o
semillas de plantas según la forma de realización de aplicación de
la presente invención contiene un polipéptido o proteína que induce
la respuesta hipersensible en un vehículo. Los vehículos adecuados
incluyen agua, disoluciones acuosas, suspensiones o polvos secos. En
esta forma de realización, la composición contiene más de 500 nM
del inductor.
Aunque no es necesario, esta composición puede
contener otros aditivos, incluidos fertilizantes, insecticidas,
fungicidas, nematicidas y sus mezclas. Los fertilizantes adecuados
incluyen (NH_{4})_{2}NO_{3}. Un ejemplo de un
insecticida adecuado es Malathion. Los fungicidas útiles incluyen el
Captan.
Otros aditivos adecuados incluyen agentes
tamponadores, agentes humectantes, agentes de recubrimiento y
agentes abrasivos. Estos materiales pueden usarse para facilitar el
proceso de la presente invención. Además, el inductor de la
respuesta hipersensible puede aplicarse a las semillas de plantas
con otra formulación y materiales de tratamiento convencionales,
incluidos arcillas y polisacáridos.
En la forma de realización alternativa de la
presente invención que implica el uso de plantas transgénicas y de
semillas transgénicas, no es necesario aplicar de manera tópica un
inductor de la respuesta hipersensible a las plantas o semillas. En
su lugar, se producen plantas transgénicas transformadas con una
molécula de ADN que codifica uno de tales inductores según los
procedimientos bien conocidos en la técnica.
El vector descrito anteriormente puede
microinyectarse directamente en las células vegetales por medio de
micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante.
Crossway, Mol. Gen. Genetics, 202: 179-185 (1985).
El material genético puede también transferirse a la célula vegetal
usando polietilenglicol. Krens, y col., Nature, 296:
72-74 (1982).
\newpage
Otro enfoque para transformar las células
vegetales con un gen es el bombardeo de partículas (también conocido
como transformación biolística) de la célula huésped. Este puede
realizarse en una de varias maneras. La primera implica propulsar
partículas inertes o biológicamente activas en las células. Esta
técnica se da a conocer en las Patentes de EEUU Nº 4.945.050,
5.036.006 y 5.100.792, todas de Sanford y col.
En general, este procedimiento implica propulsar
partículas inertes o biológicamente activas en las células bajo
condiciones eficaces para penetrar la superficie exterior de la
célula y para quedar incorporadas en el interior de las mismas.
Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede introducirse
en la célula recubriendo las partículas con el vector que contiene
el ADN heterólogo. Como alternativa, la célula diana puede ser
rodeada por el vector de modo que el vector es llevado dentro de la
célula por la estela de la partícula. Las partículas biológicamente
activas (por ejemplo, células bacterianas secadas que contienen el
vector y el ADN heterólogo) también pueden propulsarse en las
células vegetales.
Aún otro procedimiento de introducción es la
fusión de protoplastos con otras entidades, ya sea minicélulas,
células, lisosomas, u otros cuerpos con superficie de lípidos
fusionables. Fraley, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:
1859-1863 (1982).
La molécula de ADN puede introducirse también en
las células vegetales por electroporación. Fromm y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5824 (1985). En esta técnica, los
protoplastos de la planta se electroporan en presencia de los
plásmidos que contienen la casete de expresión. Los impulsos
eléctricos de intensidad de campo elevada permeabilizan de manera
reversible las biomembranas permitiendo la introducción de los
plásmidos. Los protoplastos de la planta electroporados reforman la
pared celular, se dividen y regeneran.
Otro procedimiento para introducir la molécula
de ADN en las células vegetales es infectar una célula de la planta
con Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes
transformados previamente con el gen. Bajo condiciones adecuadas
conocidas en la técnica, las células de la planta transformadas se
cultivan para formar brotes o raíces, y se desarrollan más formando
plantas. En general, este procedimiento implica inocular el tejido
de la planta con una suspensión de bacterias e incubar el tejido
durante 48 a 72 horas en medio de regeneración sin antibióticos a
25-28ºC.
El Agrobacterium es un género representativo de
la familia gram negativa Rhizobiaceae. Sus especies son responsable
de la enfermedad de los tumores en el cuello (A. tumefaciens)
y de la raíz vellosa (A. rhizogenes). Las células vegetales
en los tumores del cuello y las raíces vellosas son inducidas a
producir derivados de aminoácidos conocidos como opinas, que son
catabolizados solamente por las bacterias. Los genes bacterianos
responsables de la expresión de opinas son una fuente conveniente de
elementos de control para las casetes de expresión quiméricas.
Además, el análisis de la presencia de opinas puede usarse para
identificar el tejido transformado.
La secuencia genética heteróloga puede
introducirse en las células vegetales adecuadas por medio del
plásmido Ti de A. tumefaciens o el plásmido Ri de A.
rhizogenes. El plásmido Ti o Ri se transmite a las células de
la planta en la infección por Agrobacterium y se integra de manera
estable en el genoma de la planta. J. Schell, Science, 237:
1176-1183 (1987).
Después de la transformación, las células de la
planta transformada deben regenerarse.
La regeneración de la planta a partir de
protoplastos cultivados está descrita en Evans y col., Handbook of
Plant Cell Cultures, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co., Nueva York,
1983); y Vasil I. R. (ed.), Cell Culture and Somatic Genetics of
Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. 1, 1984, y Vol. III (1986).
Se sabe que prácticamente todas las plantas
pueden regenerarse a partir de las células o los tejidos cultivados,
incluidos pero no limitados a, todas las especies principales de
caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, árboles frutales y
legumbres.
El medio para la regeneración varía entre las
especies de plantas, pero por lo general se proporciona primero una
suspensión de protoplastos transformados o una placa de petri que
contiene explantes transformados. Se forma el tejido del callo y
los brotes pueden inducirse del callo y posteriormente formar
raíces. Como alternativa, puede inducirse la formación de embriones
en el tejido del callo. Estos embriones germinan como embriones
naturales para formar las plantas. El medio de cultivo contiene
generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y
citocininas. Es también ventajoso añadir ácido glutámico y prolina
al medio, especialmente para las especies tales como el maíz y la
alfalfa. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y
de la historia del cultivo. Si se controlan estas tres variables,
entonces la regeneración es usualmente reproducible y
repetible.
Una vez que la casete de expresión queda
incorporada de manera estable en las plantas transgénicas, puede
transferirse a otras plantas por cruzamiento sexual. Puede usarse
cualquiera de una serie de técnicas de reproducción convencionales,
dependiendo de las especies a cruzar.
Una vez producidas las plantas transgénicas de
este, las mismas plantas pueden cultivarse de acuerdo con los
procedimientos convencionales con la presencia del gen que codifica
el inductor de la respuesta hipersensible dando como resultado para
la planta la resistencia al estrés. Como alternativa, se recuperan
las semillas transgénicas o propágulos (por ejemplo, los esquejes)
de las plantas transgénicas. Las semillas pueden plantarse entonces
en la tierra y cultivarse usando los procedimientos convencionales
para producir plantas transgénicas. Las plantas transgénicas se
propagan a partir de las semillas transgénicas plantadas bajo
condiciones eficaces para impartir resistencia al estrés a las
plantas. Sin tener la intención de estar ligados a la teoría, tal
resistencia al estrés puede estar mediada por el ARN o puede ser el
resultado de la expresión del polipéptido o proteína inductor.
Cuando se usan plantas y semillas de plantas
transgénicas según la presente invención, éstas pueden tratarse
además con los mismos materiales que se usan para tratar las plantas
y las semillas a las que se aplica un inductor de la respuesta
hipersensible según la presente invención. Estos otros materiales,
incluido un inductor de la respuesta hipersensible según la
presente invención, pueden aplicarse a las plantas transgénicas y a
las semillas de plantas por medio de los procedimientos indicados
anteriormente, incluidos la vaporización a presión alta o baja, la
inyección, el recubrimiento y la inmersión. De manera similar,
después de que las plantas se hayan propagado a partir de las
semillas de la planta transgénica, las plantas pueden tratarse con
una o más aplicaciones del inductor de la respuesta hipersensible
según la presente invención para conferir resistencia al estrés.
Tales plantas pueden también tratarse con agentes convencionales de
tratamiento de plantas (por ejemplo, insecticidas, fertilizantes,
etc.).
Los áfidos (Aphids gossypii) infectan el
algodón durante toda la estación de crecimiento. El daño de la
infección por los áfidos varía desde el depósito de melaza que
contamina la pelusa y reduce el valor del cultivo hasta el deshoje
que reduce o destruye los cultivos. Para proteger las plantas de la
infección por áfidos, el algodón se pulveriza por lo general con
insecticidas, por ejemplo Asana XL cuando la presión de la infección
no es muy alta, y Admire cuando la presión de la infestación es
alta. El efecto de un inductor de respuesta hipersensible sobre los
áfidos en el algodón se estudió por medio de un ensayo que incluía
un diseño de bloque completo aleatorizado. Éste implicaba el
tratamiento con el inductor de respuesta hipersensible de Erwinia
amylovora (es decir, HP-1000^{TM}) a 20, 60 y
80 ppm y un insecticida químico, Asana XL, a 561 g/ha (8 oz./ac).
Cada tratamiento incluía la aplicación foliar comenzando en el
cotiledón hasta tres hojas verdaderas y a partir de entonces en
intervalos de 14 días usando un pulverizador de mochila. Se
realizaron los recuentos de áfidos y el crecimiento global del
algodón inmediatamente antes de la aplicación de la pulverización a
los 14, 28, 35 y 42 días después del primer tratamiento ("DAT
1"). Se recogieron veinticinco hojas seleccionadas
aleatoriamente por parcela en las primeras tres fechas de muestreo y
las hojas por parcela en la fecha final de muestreo.
1. Control de áfidos: El número de áfidos en el
algodón tratado con inductor de respuesta hipersensible se redujo
significativamente con respecto al algodón tratado químicamente
(véase Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
A los 14 días tras DAT 1, los recuentos de
áfidos fueron relativamente bajos a través de todos los
tratamientos, pero a los 28 días tras DAT 1 (momento en el que se
habían aplicado dos pulverizaciones), el número de áfidos por hoja
fue significativamente mayor en las plantas tratadas con Asana XL
comparado con los algodones tratados con inductor de respuesta
hipersensible. A los 35 días tras DAT 1 (momento en el que se habían
aplicado tres pulverizaciones), los recuentos de áfidos habían
subido para todos los tratamientos, con todo, los recuentos de
áfidos por hoja todavía eran significativamente más bajos para el
algodón tratado con inductor de respuesta hipersensible comparado
con el tratamiento con Asana XL. Finalmente, a los 42 días tras DAT
1 (momento en el que se habían aplicado cuatro pulverizaciones), el
número de áfidos por hoja había aumentado hasta un nivel que
amenazaba vencer a las plantas incluso cuando se trataban con el
insecticida químico convencional. Para salvar el ensayo, se aplicó
otro producto químico, Pravado (Admire), a todas las parcelas para
erradicar los áfidos del campo.
2. El algodón tratado con inductor de respuesta
hipersensible fue más resistente al daño causado por Pravado
(Admire) y Asana. Después de la segunda pulverización química, se
observó que las plantas de algodón sufrían estrés por los
insecticidas. Las plantas de algodón tratadas previamente con Asana
y las de control no tratadas quedaron deshojadas. En la mayoría de
las plantas de algodón tratadas con producto químico, no había
hojas, o había muy pocas hojas, en la parte más baja de las
plantas. Sin embargo, las plantas tratadas con el inductor de
respuesta hipersensible, especialmente en la parcela donde el
inductor de respuesta hipersensible se aplicó a 80 ppm, no tenían
deshoje y las plantas de algodón eran vigorosas y sanas. Por el
recuento del número de bolas maduras, se mostró claramente que las
plantas tratadas con el inductor de respuesta hipersensible (a 80
ppm) tenían más grupos de bolas que las tratadas con producto
químico y las de control sin tratar (Tabla 2), indicando que las
plantas tratadas con el inductor de respuesta hipersensible eran más
tolerantes al estrés provocado por el insecticida.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se creó un ensayo de campo de pepinos para
probar el efecto del inductor de respuesta hipersensible de
Erwinia amylovora en el control de la enfermedad, la
tolerancia al estrés por la sequía y el rendimiento. Se probaron
tres diferentes tasas, a 15, 30 y 60 \mug/ml. Además del
tratamiento con el inductor de respuesta hipersensible, había un
control sin tratamiento. Cada tratamiento contenía tres parcelas por
duplicado. Al brotar la primera hoja verdadera, se pulverizó el
inductor de respuesta hipersensible con un pulverizador de mochila.
La segunda pulverización se aplicó diez días después de la primera
pulverización. La tercera aplicación fue justo después de la
recuperación de las plántulas de pepino después del trasplante en el
campo. El tratamiento individual se asignó aleatoriamente en el
campo.
Cuando brotó la primera hoja verdadera (Día 0),
se pulverizó una primera aplicación. Usualmente, las plántulas del
pepino se trasplantan cuando las plántulas muestran dos hojas
verdaderas. Se ha sabido que la tasa de recuperación después del
trasplante está estrechamente relacionada con los tamaños de las
plántulas. Debido a la sequía, las plántulas se mantuvieron en el
vivero durante diez días más y la segunda pulverización se aplicó
en el Día 10. Dos días después de la segunda pulverización, las
plantas se trasplantaron en los campos y se cubrieron con láminas
de plástico. Las plantas tenían 4-5 hojas
verdaderas.
La tasa de recuperación de las plántulas de
pepino trasplantadas fue más alta para las plantas tratadas con el
inductor de respuesta hipersensible que para el control sin tratar.
Más del 80% de las plántulas de pepino tratadas con el inductor de
respuesta hipersensible sobrevivieron, mientras que sólo sobrevivió
el 57% de las plantas no tratadas.
A lo largo de la estación de crecimiento hubo un
serio problema de sequía. Las visitas tempranas a los campos
indicaron que las plantas tratadas con el inductor de respuesta
hipersensible tenían más masa de raíces y mejor crecimiento global.
El pepino tratado con el inductor de respuesta hipersensible comenzó
a florecer 14 días antes que el pepino de control no tratado. La
floración temprana dio como resultado una cosecha más temprana. En
la primera cosecha, se recogieron más de 0,4 kilogramos de frutos de
pepino por planta de los pepinos tratados con el inductor de
respuesta hipersensible; sin embargo, virtualmente no se recogieron
frutos de los controles no tratados. Al final de la estación, las
plantas no tratadas murieron por la sequía grave, pero las plantas
tratadas con el inductor de respuesta hipersensible aún estaban
vivas y tuvieron una cosecha más.
El rendimiento final fue significativamente
diferente entre las plantas tratadas con el inductor de respuesta
hipersensible y las plantas sin tratar. El inductor de respuesta
hipersensible administrado en una tasa de 30 ppm produjo un
rendimiento tres veces mayor que las plantas de control (Tabla
3).
\vskip1.000000\baselineskip
El mayor rendimiento se atribuyó parcialmente a
la mejora del crecimiento inducida por el inductor de respuesta
hipersensible y resultó parcialmente de una mayor tolerancia del
pepino tratado con el inductor de respuesta hipersensible a la
sequía, porque usualmente el aumento del rendimiento por la mejora
del crecimiento inducida por el inductor de respuesta hipersensible
es de entre 10 y 40%.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plántulas de pimiento se empaparon con
inductor de respuesta hipersensible a 20 ppm siete días antes del
trasplante, se pulverizaron siete días después del trasplante, y a
continuación, se pulverizaron cada catorce días. Se usaron los
productos químicos convencionales, Brave, Maneb, Kocide y Admire,
para el resto del tratamiento. Además de la mejora temprana del
crecimiento, que dio como resultado un rendimiento más alto, un
fruto más grande, y resistencia a varias enfermedades, el pimiento
tratado con inductor de respuesta hipersensible fue más tolerante
al daño por herbicidas. El campo de pimientos recibió la aplicación
del herbicida SENCOR que no está etiquetado para el pimiento. Se
sabe que este herbicida provoca daño foliar grave al pimiento en
plantas tratadas con productos químicos pero no con las plantas
tratadas con inductor de respuesta hipersensible.
La diferencia entre el efecto adverso del
herbicida en las plantas tratadas con inductor de respuesta
hipersensible y en las plantas no tratadas con inductor de
respuesta hipersensible es espectacular. Véase Tabla 4 a
continuación. Treinta y nueve de las 60 plantas tratadas con
inductor mostraron solamente daños menores por el herbicida, las
hojas dañadas fueron menos del 20%. En cambio, 53 de las 60 plantas
de pimiento tratadas con productos químicos tuvieron daños graves,
el 40-57% de las hojas estaban dañadas, y 20 plantas
murieron. La capacidad del inductor de respuesta hipersensible para
ayudar a los cultivos a resistir los efectos fitotóxicos de un
herbicida es una ventaja muy importante en la industria
agrícola.
Clasificación de daños: 1. Sin
daños; 2. 0-20% de las hojas dañadas; 3.
20-40% de las hojas dañadas; 4.
40-50% de las hojas dañadas; 6. Más del 75% de las
hojas dañadas o planta completa
muerta.
Índice de daño = suma de cada
clasificación por el número de plantas bajo la escala de
clasificación, dividido por el número total de plantas por
6.
Índice de daño para plantas
tratadas con inductor de respuesta hipersensible = 1x1 + 2x38 +
3x17 + 4x3 + 5x1 + 6x0 x 100% =
41%
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un ensayo de campo para probar si el
pimiento tratado con inductor de respuesta hipersensible sería más
tolerante al estrés por herbicidas. El ensayo contiene 6
tratamientos y 4 repeticiones para cada tratamiento. Los
tratamientos se describen de la siguiente manera:
1. Control, los pimientos no se trataron ni con
un inductor de respuesta hipersensible ("HR") ni con el
herbicida LEXONE^{TM} (DuPont Agricultural Products, Wilmington,
Delaware).
2. Pimiento de control con aplicación de 0,168
kg/ha (0,15 libras/acre) del herbicida LEXONE^{TM}.
3. Pimiento de control con aplicación de 0,336
kg/ha (0,3 libras/acre) del herbicida LEXONE^{TM}.
4. Se usó el tratamiento con inductor de HR sin
la aplicación del herbicida LEXONE^{TM} usando un producto
formulado conocido como biopesticida MESSENGER^{TM} (Eden
Bioscience Corporation, Bothell, Washington) que contiene proteína
inductora HR al 3%.
5. Tratamiento con inductor HR con la aplicación
de 0,168 kg/ha (0,15 libras/acre) del herbicida LEXONE^{TM}.
6. Tratamiento con inductor HR con la aplicación
de 0,336 kg/ha (0,3 libras/acre) del herbicida LEXONE^{TM}.
LEXONE^{TM} contiene los mismos compuestos
activos que el herbicida SENCOR^{TM} (Bayer, Kansas City,
Missouri) usado en el Ejemplo 3. Las plántulas de pimiento se
empaparon con disolución de MESSENGER^{TM} a la concentración de
la proteína inductora de HR de aproximadamente 20 ppm siete días
antes de transplantarlas en el campo y a continuación se
vaporizaron cada 14 días después del transplante. Se aplicó LEXONE
en niveles altos (0,336 kg/ha (0,3 libras/acre)) y a niveles bajos
(0,168 kg/ha (0,15 libras/acre)). Se introdujeron 190 litros (50
galones) de agua y 100 ml de la disolución del herbicida en la zona
de la raíz de cada planta en el tratamiento respectivo cinco
semanas después del transplante en el campo.
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Se evaluó el porcentaje de clorosis de los
tratamientos causado por la aplicación del herbicida LEXONE^{TM}
y se evaluó el rendimiento de pimiento. Las plantas tratadas con
inductor de HR expuestas a altas tasas de herbicida tuvieron
significativamente menos clorosis y produjeron 108% más fruto
comparado con las plantas tratadas con inductor de respuesta no
hipersensible expuestas a la misma cantidad de herbicida. Véanse
Tablas 5 y 6 a continuación. No hubo diferencias significativas en
la reducción de clorosis en la tasa de herbicida baja entre los
pimientos tratados con el inductor de HR y los sin tratar con el
inductor de HR. Sin embargo, las plantas tratadas con el inductor
de HR produjeron 15% más de fruto que las plantas de control
correspondientes expuestas a la misma cantidad de herbicida. No
hubo clorosis ni en las plantas de control ni en las plantas
tratadas con inductor de HR que no recibieron el tratamiento con el
herbicida LEXONE^{TM}.
Las plantas tratadas con inductor de HR fueron
vieron afectadas con mucho menor gravedad por la aplicación del
herbicida que las plantas de control respectivas en la tasa de
herbicida alta. Sin embargo, la cantidad de clorosis visual fue
similar en la tasa baja tanto para las plantas de control como para
las tratadas con inductor de HR. De manera importante, los
rendimientos tanto de los tratamientos de herbicidas en tasa alta
como baja de plantas tratadas con inductor de HR se vieron afectados
con menor gravedad por el herbicida que los controles. Estos
hallazgos confirman además que los inductores de HR pueden ayudar a
que los cultivos resistan los efectos fitotóxicos de los herbicidas
y son muy ventajosos para la industria agrícola.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Un ensayo de algodón sin riego experimentó 26
días consecutivos de sequía. El índice de calor diario medio era de
aproximadamente 37,8ºC (100 grados F) o superior, que se añadía al
estrés que soportaban las plantas en el campo.
Las observaciones en el campo indicaban que las
plantas tratadas con inductor de HR a la concentración de 15 ppm
(62,4 g (2,2 onzas) de producto formulado, MESSENGER^{TM}
conteniendo el componente activo, proteína inductora de HR, al 3%)
eran más vigorosas y tenían menos deshoje que las plantas de control
como resultado del estrés por el calor y la sequía. Se recogieron
cuidadosamente cantidades iguales de plantas de las parcelas
tratadas con MESSENGER^{TM} y sin tratamiento con MESSENGER^{TM}
del campo y se analizó el mapa del número de nodos y cápsulas por
posición. También se pesaron las plantas en una balanza analítica
Metler para determinar el peso de la planta completa, la raíz y los
brotes.
Las plantas tratadas con MESSENGER^{TM}
sobrevivieron al estrés del calor y la sequía mucho mejor que las
plantas sin tratar. Las plantas tratadas con MESSENGER^{TM} tenían
una masa de raíz y brotes 37,6% mayor que las plantas de control
(Tabla 7). Las plantas tratadas con MESSENGER^{TM} también tenían
significativamente más cápsulas de algodón que las plantas de
control (Tabla 8). El número de cápsulas de algodón de las
posiciones 1 y 2 tiene una contribución significativa al
rendimiento global. La Tabla 8 mostró que las plantas tratadas con
MESSENGER^{TM} tenían 47% más cápsulas en las posiciones 1 y 2 y
57% más cápsulas de una planta completa comparado con el
rendimiento alcanzado usando un tratamiento de crecimiento
convencional (es decir sin tratamiento con MESSENGER^{TM}). Una
reacción común al estrés en el algodón es que la planta aborte las
cápsulas. Los resultados indican que las plantas tratadas con
MESSENGER^{TM} son más tolerantes al estrés por la sequía.
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\vskip1.000000\baselineskip
El calcio es un elemento importante para la
fisiología y el desarrollo de la planta. Una carencia de calcio
puede provocar varias enfermedades en las plantas. Por ejemplo, la
podredumbre apical tiene como causa una carencia localizada de
calcio en el extremo distal del fruto del tomate. Como el calcio no
es un elemento muy móvil, puede aparecer una carencia con una
fluctuación en el suministro de agua. En el pasado, los cultivadores
del tomate experimentaban niveles más elevados de podredumbre
apical durante períodos de condiciones ambientales secas cuando las
tormentas de lluvias infrecuentes descargaban mucha agua y
posteriormente se volvía con rapidez a una condición de sequedad y
calor. Disminuir o aumentar el nivel freático de riego de manera
irregular durante una estación de crecimiento seca y caliente
también puede aumentar la enfermedad.
Se diseñó un ensayo de campo para probar si el
tomate tratado con proteína inductora de HR podía ser más tolerante
a la carencia de calcio bajo una estación de crecimiento seca y
caliente. Para el ensayo se usó MESSENGER^{TM}, el producto
formulado que contiene inductor de HR al 3%. La tasa de aplicación
del MESSENGER^{TM} fue de 159 g/ha (2,27 oz. por acre). La
primera pulverización de MESSENGER^{TM} se realizó 7 días antes
del trasplante y posteriormente cada 14 después de trasplantar. Se
compararon los tomates tratados con MESSENGER^{TM} con un
tratamiento de crecimiento convencional sin utilizar
MESSENGER^{TM}. Cada tratamiento tuvo 4 repeticiones.
Se contó la cantidad de frutos infectados de un
campo de 9,29 metros cuadrados (100 pies cuadrados). La podredumbre
comienza típicamente con lesiones de color canela claro empapadas de
agua, que posteriormente aumentan, y a continuación se vuelven
negras. En un sondeo, aproximadamente el 20% de los frutos estaban
infectados. En el tratamiento convencional aparecieron síntomas de
podredumbre apical grave; sin embargo, un promedio de solamente
2,5% de los frutos estaban infectados en las plantas tratadas con
MESSENGER^{TM}. Los datos de la cosecha mostraron que las plantas
tratadas con MESSENGER^{TM} tenían 8% más de fruto comercializable
(Tabla 9). Los resultados de la prueba demostraron que el
tratamiento con MESSENGER^{TM} puede reducir el estrés resultante
de la carencia de calcio y aumentar la resistencia de la planta a la
podredumbre apical.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Eden Bioscience Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> RESISTENCIA AL ESTRÉS INDUCIDA POR
UN INDUCTOR DE RESPUESTA HIPERSENSIBLE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21829/42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/107.243
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
05-11-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia chrysanthemi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 2141
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia chrysanthemi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Erwinia amylovora
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 1288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia amylovora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Erwinia amylovora
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 447
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Erwinia amylovora
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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<210> 7
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<211> 5517
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia amylovora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1838
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia amylovora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0.8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Erwinia amylovora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Erwinia amylovora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 341
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas syringae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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<210> 12
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<211> 1026
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas syringae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 1729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas syringae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 424
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas syringae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas solanacearum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1035
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas solanacearum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xanthomonas campestris pv.
glycines
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xanthomonas campestris pv.
pelargonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
Claims (18)
1. Un procedimiento para conferir a las plantas
resistencia al estrés que comprende:
- aplicar una proteína o un polipéptido inductor de la respuesta hipersensible en una forma no infecciosa a una planta o semilla de planta bajo condiciones eficaces para conferir resistencia frente al estrés por contaminación del aire, estrés químico, estrés nutricional o frente al estrés relacionado con el clima seleccionado del grupo constituido por las heladas, la temperatura fría, la temperatura elevada, la luz excesiva y la luz insuficiente.
2. Un procedimiento para conferir a las plantas
resistencia al estrés que comprende:
- suministrar una planta o semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica una proteína o un polipéptido inductor de la respuesta hipersensible y
- cultivar la planta o plantas transgénicas producidas a partir de las semillas de plantas transgénicas bajo condiciones eficaces para conferir resistencia frente estrés por contaminación del aire, estrés químico, estrés nutricional o frente al estrés relacionado con el clima seleccionado del grupo constituido por las heladas, la temperatura fría, la temperatura elevada, la luz excesiva y la luz insuficiente.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que dicho suministro se lleva a cabo suministrando una planta
transgénica.
4. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que dicho suministro se lleva a cabo suministrando una
semilla de planta transgénica, comprendiendo dicho procedimiento
además:
- plantar las semillas transgénicas en tierra natural o artificial y
- propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en la tierra.
5. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el estrés es estrés químico
donde el producto químico se selecciona del grupo constituido por
insecticidas, fungicidas, herbicidas y metales pesados.
6. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el estrés es estrés relacionado
con el clima seleccionado del grupo constituido por heladas,
temperatura fría, temperatura elevada, luz excesiva y luz
insuficiente.
7. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el estrés es estrés por
contaminación del aire seleccionado del grupo constituido por
dióxido de carbono, monóxido de carbono, dióxido de azufre,
NO_{x}, hidrocarburos, ozono, radiación ultravioleta y lluvia
ácida.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el estrés es estrés nutricional
donde el estrés nutricional está causado por fertilizantes,
micronutrientes o macronutrientes.
9. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la proteína o el polipéptido
inductor de la respuesta hipersensible deriva de Erwinia,
Pseudomonas, Xanthomonas, Phytophthora o Clavibacter.
10. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la proteína o el polipéptido
inductor de la respuesta hipersensible deriva de Erwinia
amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi y
Erwinia stewartii.
11. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteína o el polipéptido
inductor de la respuesta hipersensible deriva de Pseudomonas
syringae o Pseudomonas solancearum.
12. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteína o el polipéptido
inductor de la respuesta hipersensible deriva de una especie de
Xanthomonas.
13. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteína o el polipéptido
inductor de la respuesta hipersensible deriva de una
Phytophthora.
14. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteína o el polipéptido
inductor de la respuesta hipersensible deriva de Clavibacter
michiganensis subsp. sepedonicus.
15. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha aplicación se lleva a
cabo aplicando la proteína o el polipéptido inductor de la respuesta
hipersensible a la planta en una forma no infecciosa.
16. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha aplicación se lleva a cabo
aplicando la proteína o el polipéptido inductor de la respuesta
hipersensible a una semilla de planta en una forma no infecciosa,
comprendiendo dicho procedimiento además:
- plantar las semillas tratadas con la proteína o el polipéptido inductor de la respuesta hipersensible en tierra natural o artificial y
- propagar las plantas a partir de las semillas plantadas en la tierra.
17. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la planta se selecciona del
grupo constituido por alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno,
algodón, girasol, cacahuete, maíz, patata, boniato, judía,
guisante, achicoria, lechuga, endivia, col, col de Bruselas,
remolacha, chirivía, coliflor, brécol, nabo, rábano, espinaca,
cebolla, ajo, berenjena, pimiento, apio, zanahoria, calabacín,
calabaza, calabacín zucchini, pepino, manzana, pera, melón,
cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, tabaco, tomate, sorgo
y caña de azúcar.
18. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que la planta se selecciona del
grupo constituido por Arabidopsis thaliana, Saintpaulia,
petunia, pelargonio, flor de pascua, crisantemo, clavel y
zinnia.
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